ES2305257T3 - Plantas transgenicas que sintetizan almidon rico en amilosa. - Google Patents
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Abstract
Una célula de planta transgénica dicotiledónea que comprende una o más moléculas de ácido nucleico extraño cuya presencia y/o expresión conduce a la reducción de la actividad de una o más proteínas que catalizan la fosforilación del almidón en una reacción de tipo diquinasa (proteínas R1) que tiene lugar endógenamente en la célula de la planta, y a la reducción de la actividad de una o más proteínas de la enzima ramificadora isoforma I (BEI) que tiene lugar endógenamente en la célula de la planta, y a la reducción de la actividad de una o más proteínas de la enzima ramificadora isoforma II (BEII) que tiene lugar endógenamente en la célula de la planta en comparación con células de plantas correspondientes de plantas de tipo salvaje, cuyas células no han sido modificadas genéticamente, en donde dicha célula de planta transgénica sintetiza un almidón modificado que tiene un contenido de amilosa determinado de acuerdo con el método de Hovenkamp & Hermelink (Potato Research 31, (1988), 241-246) de al menos 75% y un contenido de fosfato que está reducido al menos en un 50% en comparación con el almidón de las células de plantas correspondientes de plantas de tipo salvaje, cuyas células no han sido modificadas genéticamente, y en donde dichas moléculas de ácido nucleico extraño cuyas presencia y/o expresión conducen a la reducción de la actividad de una o más proteínas R1 se seleccionan del grupo constituido por a) moléculas de DNA que codifican al menos un RNA antisentido que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína R1; b) moléculas de DNA que, por un efecto de cosupresión, conducen a la reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína R1; c) moléculas de DNA que codifican al menos una ribozima que escinde específicamente transcritos de genes endógenos que codifican proteínas R1; d) moléculas de ácido nucleico que se introducen por medio de mutagénesis in vivo y que conducen a una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga en los genes que codifican las proteínas R1 endógenas, en donde la mutación o inserción conduce a una reducción de la expresión de genes que codifican proteínas R1, o a la síntesis de R1 inactiva; y e) moléculas de DNA que codifican simultáneamente al menos un RNA antisentido y al menos un RNA de sentido, en donde dicho RNA antisentido y dicho RNA de sentido forman una molécula de RNA bicatenario que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde dicho RNA de sentido y dicho RNA antisentido contienen al menos parte de la secuencia de un gen endógeno que codifica proteína R1.
Description
Plantas transgénicas que sintetizan almidón rico
en amilosa.
La presente invención se refiere a células de
plantas y plantas dicotiledóneas modificadas genéticamente que
comprenden una o más moléculas de ácido nucleico extraño cuya
presencia y/o expresión conduce a la reducción de la actividad de
las proteínas R1 y BEI y BEII en comparación con células de plantas
correspondientes de plantas de tipo salvaje que no han sido
modificadas genéticamente. Adicionalmente, la presente invención se
refiere a medios y métodos para la producción de las mismas. Las
células de plantas y plantas de este tipo sintetizan un almidón
modificado caracterizado porque tiene un contenido de amilosa de al
menos 75% y - en comparación con el almidón de las plantas
correspondientes de tipo salvaje que no han sido modificadas
genéticamente - un contenido reducido de fosfato al menos en un
50%. Dicho almidón puede tener una distribución modificada de las
cadenas laterales y/o una fuerza de gel incrementada en el
analizador de textura y/o una morfología modificada de los gránulos
de almidón y/o un tamaño medio del gránulo de almidón modificado.
Así pues, la presente invención se refiere también a almidón que
puede ser sintetizado por las células de las plantas y las plantas
de la invención así como a métodos para la producción de dicho
almidón.
Con relación a la importancia creciente de los
ingredientes de las plantas como fuentes de materias primas
renovables en los últimos años, uno de los problemas de
investigación en el campo de la biotecnología consiste en
esforzarse en el ajuste de estas materias primas a los
requerimientos de la industria de procesamiento. Para permitir una
aplicación de materias primas renovables en tantos campos como sea
posible, es habitualmente necesario obtener una gran diversidad de
sustancias.
Aparte de aceites, grasas y proteínas, los
polisacáridos representan las materias primas renovables esenciales
de las plantas. Entre los polisacáridos, el almidón juega un papel
fundamental junto con la celulosa. Es una de las sustancias de
almacenamiento más importantes en las plantas superiores. Para
permitir una aplicación lo más extendida posible del almidón,
parece deseable proporcionar plantas que sean capaces de sintetizar
almidón modificado que es particularmente adecuado para diferentes
propósitos. Una posibilidad de proporcionar tales plantas es -
aparte del cultivo - la modificación genética intencionada del
metabolismo del almidón de las plantas productoras de almidón por
ingeniería genética.
El polisacárido almidón es un polímero de
bloques de construcción básicos químicamente uniformes - las
moléculas de glucosa. El mismo es, sin embargo, una mezcla muy
compleja de formas moleculares diferentes que difieren con relación
a su grado de polimerización y a la existencia de ramificaciones en
las cadenas de glucosa. Así pues, el almidón no es una materia
prima uniforme. Existen dos componentes químicamente diferentes del
almidón: la amilosa y la amilopectina. En las plantas utilizadas
típicamente para la producción de almidón, tales como v.g. maíz,
trigo o patata, el almidón sintetizado está constituido por
aproximadamente 20%-30% de almidón de amilosa y aproximadamente
70%-80% de almidón de amilopectina.
La amilosa se consideró como un polímero lineal
durante largo tiempo, constituido por monómeros de
\alpha-D-glucosa unidos por
enlaces \alpha-1,4-glicosídicos.
En estudios recientes, sin embargo, se ha demostrado la presencia
de aproximadamente 0,1% de puntos de ramificación
\alpha-1,6-glicosídicos (Hizukuri
y Takagl, Carbohydr. Res. 134, /1984), 1-10; Takeda
et al., Carbohydr. Res. 132, (1984),
83-92).
Como regla, la separación completa de la amilosa
de la amilopectina es muy difícil, por lo que la calidad de la
amilosa depende acusadamente del tipo del método de separación
seleccionado.
Existen métodos diferentes para la determinación
del contenido de amilosa. Algunos de estos métodos están basados en
la capacidad de fijación de yodo de la amilosa que puede
determinarse potenciométricamente (Banks & Greenwood, en W.
Banks & C.T. Greenwood, Starch and Its Components (páginas
51-56), Edimburgo, prensa de la Universidad de
Edimburgo), amperométricamente (Larson et al., Analytical
Chemistry 25(5), 1953, 802-804) o
espectrofotométricamente (Morrison & Laignelet, J. Cereal Sc. 1,
(1983), 9-20). La determinación del contenido de
amilosa puede llevarse a cabo también calorimétricamente por medidas
de DSC (calorimetría de barrido diferencial) (Kugimiya &
Donovan, Journal of Food Science 46, (1981),
765-770; Sievert & Holm, Starch/Starke
45(4), 1993, 136-139). Además, es posible
determinar el contenido de amilosa por utilización de la SEC
(cromatografía de exclusión de tamaños) del almidón nativo o
desramificado. Ese método fue particularmente recomendado para la
determinación del contenido
de amilosa de los almidones modificados genéticamente (Gérard et al., Carbohydrate Polymers 44, (2001), 19-27).
de amilosa de los almidones modificados genéticamente (Gérard et al., Carbohydrate Polymers 44, (2001), 19-27).
La elección del método de análisis utilizado
para la determinación del contenido de amilosa de un almidón tiene
una influencia crucial sobre el tamaño de las cifras de amilosa
determinadas como pudo demostrarse por diversos estudios (Shi et
al., J. Cereal Science 27, (1998), 289-299;
Gérard et al., Carbohydrate Polymers 44, (2001),
19-27).
En contraste con la amilosa, la amilopectina
está ramificada en mayor grado y exhibe aproximadamente 4% de
productos de ramificación que existen debido a la presencia de
enlaces \alpha-1,6-glicosídicos
adicionales. La amilopectina es una mezcla compleja de cadenas de
glucosa con diferentes ramificaciones.
Una diferencia esencial adicional entre amilosa
y amilopectina es el peso molecular. Mientras que la amilosa -
dependiendo del origen del almidón - tiene un peso molecular de
5x10^{5}-10^{6} Da, el peso molecular de la
amilopectina está comprendido entre 10^{7} y 10^{8} Da. Ambas
macromoléculas pueden diferenciarse unas de otras por su peso
molecular y sus diferentes propiedades
físico-químicas, que pueden hacerse aparentes de la
manera más simple por sus propiedades diferentes de fijación de
yodo.
Las propiedades funcionales del almidón están
fuertemente influenciadas - aparte de por la relación
amilosa/amilo-
pectina y el contenido de fosfato - por el peso molecular, el patrón de distribución de las cadenas laterales, el contenido de iones, el contenido de lípidos y proteínas, el tamaño medio del gránulo de almidón y la morfología del gránulo de almidón, etc. Propiedades funcionales importantes a mencionar son, por ejemplo, la solubilidad, el comportamiento de retrogradación, la capacidad de fijación de agua, las propiedades de formación de la película, la viscosidad, las propiedades de empastado, la estabilidad congelación-descongelación, la estabilidad en medio ácido, la fuerza de gel, etc. El tamaño de los gránulos de almidón, asimismo, puede ser importante para diferentes aplicaciones.
pectina y el contenido de fosfato - por el peso molecular, el patrón de distribución de las cadenas laterales, el contenido de iones, el contenido de lípidos y proteínas, el tamaño medio del gránulo de almidón y la morfología del gránulo de almidón, etc. Propiedades funcionales importantes a mencionar son, por ejemplo, la solubilidad, el comportamiento de retrogradación, la capacidad de fijación de agua, las propiedades de formación de la película, la viscosidad, las propiedades de empastado, la estabilidad congelación-descongelación, la estabilidad en medio ácido, la fuerza de gel, etc. El tamaño de los gránulos de almidón, asimismo, puede ser importante para diferentes aplicaciones.
La relación de amilopectina y amilosa tiene una
influencia acusada en las propiedades
físico-químicas de los almidones y, por tanto, en
las posibles aplicaciones de estos almidones. Dado que los métodos
para la separación de estos dos componentes consumen mucho tiempo y
son caros, tales métodos no se utilizan ya en escala industrial
(Young, A.H. en: Starch Chemistry and Technology. Compiladores R.R.
Whistler, J.M. BeMiller y E.F. Paschall. Academic Press, Nueva
York, 1984, 249-283). Para una pluralidad de
aplicaciones sería deseable tener a disposición almidones que
contengan solamente uno de los dos polímeros o al menos uno de los
dos componentes del almidón en una forma enriquecida.
Hasta ahora, han sido descritos tanto mutantes
como plantas producidas por ingeniería genética que, en comparación
con las plantas correspondientes de tipo salvaje, exhiben una
relación amilopectina/amilosa modificada.
Por ejemplo, el denominado mutante "céreo"
del maíz que exhibe una mutación en el gen que codifica la sintasa
I del almidón fijada al gránulo de almidón (abreviado: GBSSI)
(Akasuka y Nelson, J. Biol. Chem., 241, (1966),
2280-2285; Shure et al., Cell 35 (1983),
225-233) produce un almidón constituido
esencialmente por amilopectina. Para la patata, se produjeron
genotipos tanto por medio de mutagénesis química de una línea
haploide (Hovenkamp-Hermelink et al., Theor.
Appl. Genet., 225, (1987), 217-221) y por medio de
inhibición antisentido del gen GBSSI, cuyos almidones están
constituidos esencialmente por almidón de amilopectina. En
comparación con los almidones de las plantas correspondientes de
tipo salvaje, tales como almidones céreos de patata, no exhiben
diferencia alguna con relación al contenido de fosfato, la
morfología del gránulo del almidón o el contenido de iones (Visser
et al., Starch/Starke, 49, (1997),
438-443).
Adicionalmente, están disponibles comercialmente
mutantes de maíz que exhiben almidones con contenidos de amilosa de
aproximadamente 50% o aproximadamente 70% (contenido de amilosa
determinado por determinación potenciométrica de la capacidad de
fijación de yodo) y que se designan Hylon V® o Hylon VII® (National
Starch and Chemical Company, Bridgewater, NJ, EE.UU.). Además, se
han descrito también híbridos de maíz que sintetizan el denominado
"almidón pobre en amilopectina" (LAPS) y exhiben un contenido
de amilopectina de peso molecular alto ("peso mol alto") de
aproximadamente 2,5% y un contenido de amilosa de aproximadamente
90% (determinación potenciométrica de la capacidad de fijación de
yodo) (Shi et al., J. Cereal Science 27, (1998)
289-299).
Adicionalmente, se han descrito plantas
transgénicas de patata que, debido a la inhibición antisentido del
gen de la enzima de ramificación I (= BEI) y la enzima de
ramificación II (= BEII), sintetizan un almidón de patata que
exhibe un contenido de amilosa de hasta 75% por determinación
colorimétrica del contenido de amilosa de acuerdo con el método
descrito por Morrison y Laignelet (J. Cereal Sci. 1, (1983)
9-20) (Schwall et al., Nature Biotechn. 18,
(2000), 551-554). Estos almidones de patata se
caracterizan por un contenido de fosfato del almidón que es hasta 6
veces mayor en comparación con las plantas correspondientes de tipo
salvaje. Adicionalmente, la solicitud de Patente Internacional WO
97/11118 describe plantas transgénicas de patata que, debido a su
inhibición antisentido del gen R1 y el gen BEI sintetizan un almidón
con un contenido de amilosa mayor que 70%, habiendo sido
determinado en contenido de amilosa de acuerdo con el método de
Hovenkamp & Hermelink (Potato Research 31, (1988),
241-246).
Células de plantas de patata y plantas
transgénicas de patata que sintetizan un almidón que tiene un
contenido de amilosa mayor que 75% (determinación colorimétrica del
contenido de amilosa de acuerdo con Hovenkamp & Hermelink
(Potato Research 31, (1988), 241-246) y, al mismo
tiempo, un contenido reducido de fosfato en comparación con plantas
correspondientes de tipo salvaje no han sido descritas hasta ahora
en la técnica anterior. Esto mismo es aplicable a los almidones de
patata que pueden aislarse a partir de estas células de plantas y
plantas de patata y a métodos para la producción de tales
almidones. Sin embargo, la provisión de tales almidones es
deseable, dado que sus propiedades físico-químicas
puede esperarse que sean ventajosamente útiles para diversas
aplicaciones industriales.
Así pues, el problema técnico que subyace en la
presente invención consiste en proporcionar células de plantas y
plantas que sintetizan almidón que tiene un contenido de amilosa
mayor que 75% (determinación colorimétrica del contenido de
amilosa de acuerdo con Hovenkamp & Hermelink, Potato Research
31, (1988), 241-246) y un contenido reducido de
fosfato en comparación con el contenido de fosfato del almidón de
las células de plantas y plantas correspondientes de tipo salvaje
que no han sido modificadas genéticamente, así como proporcionar
dicho almidón que difiere de los almidones descritos en la técnica
anterior en sus propiedades estructurales y/o funcionales y es, por
tanto, más adecuado para propósitos generales y/o específicos.
Este problema técnico se ha resuelto
proporcionando las realizaciones caracterizadas en las
reivindicaciones.
Así pues, la presente invención se refiere a una
célula de planta transgénica dicotiledónea que comprende una o más
moléculas de ácido nucleico extraño cuya presencia y/o expresión
conduce a la reducción de la actividad de una o más proteínas que
catalizan la fosforilación del almidón en una reacción de tipo
diquinasa (proteínas R1) que tiene lugar endógenamente en la célula
de la planta, y a la reducción de la actividad de una o más
proteínas de la enzima ramificadora isoforma I (BEI) que tiene lugar
endógenamente en la célula de la planta, y a la reducción de la
actividad de una o más proteínas de la enzima ramificadora isoforma
I que tiene lugar endógenamente en la célula de la planta en
comparación con células de plantas o plantas correspondientes de
tipo salvaje, cuyas células sido modificadas genéticamente,
en donde dicha célula de planta transgénica
sintetiza un almidón modificado que tiene un contenido de amilosa
determinado de acuerdo con el método de Hovenkamp & Hermelink
(Potato Research 31, (1988), 241-246) de al menos
75% y un contenido de fosfato que está reducido al menos en un 50%
en comparación con el almidón de las células de plantas o plantas
correspondientes de tipo salvaje, cuyas células no han sido
modificadas genéticamente, y
en donde dichas moléculas de ácido nucleico
extraño cuyas presencia y/o expresión conducen a la reducción de la
actividad de una o más proteínas R1 se seleccionan del grupo
constituido por
- a)
- moléculas de DNA que codifican al menos un RNA antisentido que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína R1;
- b)
- moléculas de DNA que, por un efecto de cosupresión, conducen a la reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína R1;
- c)
- moléculas de DNA que codifican al menos una ribozima que escinde específicamente transcritos de genes endógenos que codifican proteínas R1;
- d)
- moléculas de ácido nucleico que se introducen por medio de mutagénesis in vivo y que conducen a una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga en los genes que codifican las proteínas R1 endógenas, en donde la mutación o inserción conduce a una reducción de la expresión de genes que codifican proteínas R1, o a la síntesis de R1 inactiva; y
- e)
- moléculas de DNA que codifican simultáneamente al menos un RNA antisentido y al menos un RNA de sentido, en donde dicho RNA antisentido y dicho RNA de sentido forman una molécula de RNA bicatenario que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde dicho RNA de sentido y dicho RNA antisentido contienen al menos parte de la secuencia de un gen endógeno que codifica proteína R1;
en donde dichas moléculas de ácido nucleico
extraño cuyas presencia y/o expresión conducen a la reducción de la
actividad de una o más proteínas BEI se seleccionan del grupo
constituido por
- i)
- moléculas de DNA que codifican al menos un RNA antisentido que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEI, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEI;
- ii)
- moléculas de DNA que, por un efecto de cosupresión, conducen a la reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEI, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEI;
- iii)
- moléculas de DNA que codifican al menos una ribozima que escinde específicamente transcritos de genes endógenos que codifican proteínas BEI;
- iv)
- moléculas de ácido nucleico que se introducen por medio de mutagénesis in vivo y que conducen a una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga en los genes que codifican las proteínas BEI, en donde la mutación o inserción conduce a una reducción de la expresión de las proteínas de los genes BEI, o a la síntesis de proteínas BEI inactivas; y
- v)
- moléculas de DNA que codifican simultáneamente al menos un RNA antisentido y al menos un RNA de sentido, en donde dicho RNA antisentido y dicho RNA de sentido forman una molécula de RNA bicatenario que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEI,
en donde dicho RNA de sentido y dicho RNA
antisentido contienen al menos parte de la secuencia de un gen
endógeno que codifica proteína BEI; y
en donde dichas moléculas de ácido nucleico
extraño cuyas presencia y/o expresión conducen a la reducción de la
actividad de una o más proteínas BEII se seleccionan del grupo
constituido por
- A)
- moléculas de DNA que codifican al menos un RNA antisentido que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEII, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEII;
- B)
- moléculas de DNA que, por un efecto de cosupresión, conducen a la reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEII, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEII;
- C)
- moléculas de DNA que codifican al menos una ribozima que escinde específicamente transcritos de genes endógenos que codifican proteínas BEII;
- D)
- moléculas de ácido nucleico que se introducen por medio de mutagénesis in vivo y que conducen a una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga en los genes que codifican proteínas BEII endógenas, en donde la mutación o inserción conduce a una reducción de la expresión de los genes que codifican proteínas BEII, o a la síntesis de proteínas BEII inactivas; y
- E)
- moléculas de DNA que codifican simultáneamente al menos un RNA antisentido y al menos un RNA de sentido, en donde dicho RNA antisentido y dicho RNA de sentido forman una molécula de RNA bicatenario que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEII, en donde dicho RNA de sentido y dicho RNA antisentido contienen al menos parte de la secuencia de un gen endógeno que codifica proteína BEII.
La modificación genética puede ser cualquier
modificación genética que implique el uso de las moléculas de ácido
nucleico arriba mencionadas, que conduce a una reducción de la
actividad de una o más proteínas R1 que se producen endógenamente
en la célula de la planta y a la reducción de la actividad de una o
más proteínas BEI que ocurre endógenamente en la célula de la
planta, y a la reducción de la actividad de una o más proteínas
BEII que ocurre endógenamente en la célula de la planta en
comparación con células de planta o plantas correspondientes de
tipo salvaje, células que no han sido modificadas genéticamente.
En este contexto, el término "transgénico"
significa que las células de las plantas de la invención difieren
en su información genética de células de plantas correspondientes
que no han sido modificadas genéticamente debido a una modificación
genética, implicando la introducción de una o más moléculas de ácido
nucleico extraño.
En este contexto, el término "modificada
genéticamente" significa que la célula de la planta está
modificada en su información genética debido a la introducción de
una o más moléculas de ácido nucleico extraño y que la presencia
y/o la expresión de la o las moléculas de ácido nucleico extraño
conduce(n) a una modificación fenotípica. En este contexto,
la modificación fenotípica se refiere preferiblemente a una
modificación medible de una o más funciones de las células. Las
células de plantas modificadas genéticamente de la invención exhiben
una reducción de la actividad de uno o más genes R1 que existen
endógenamente en la célula de la planta y una reducción de la
actividad de uno o más genes BEI que existen endógenamente en la
célula de la planta y una reducción de la actividad de uno o más
genes BEII que existen endógenamente en la célula de la planta en
comparación con células de plantas o plantas correspondientes de
tipo salvaje, células que no han sido modificadas genéticamente.
Dichas células de plantas pueden exhibir también una reducción de la
expresión de una o más proteínas R1 que existen endógenamente en la
célula de la planta y una reducción de la expresión de una o más
proteínas BEI que existen endógenamente en la célula de la planta y
una reducción de la expresión de una o más proteínas BEII que
existen endógenamente en la célula de planta en comparación con
células de plantas o plantas correspondientes de tipo salvaje,
células que no han sido modificadas genéticamente.
Dentro del significado de la presente invención,
el término "reducción de la actividad" significa una reducción
de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, BEI
y/o BEII y/o una reducción de la cantidad de proteínas R1, BEI y/o
BEII en las células y/o una reducción de la actividad enzimática de
las proteínas R1, BEI y/o BEII en las células.
En el contexto de la presente invención, el
término "reducción de la expresión" significa una reducción de
la cantidad de transcritos del gen endógeno respectivo en una célula
de planta de la invención en comparación con una célula de planta
de tipo salvaje correspondiente. La reducción de la expresión puede,
por ejemplo, determinarse por medida de la cantidad de transcritos
que codifican proteínas R1, BEI o BEII, v.g. por medio de análisis
por transferencia Northern o RT-PCR. En este
contexto, una reducción significa preferiblemente una reducción de
la cantidad de transcritos en comparación con células
correspondientes que no han sido modificadas genéticamente de al
menos un 50%, en particular al menos un 70%, y más preferiblemente
al menos un 85%, y muy preferiblemente al menos un 95%.
La reducción de la cantidad de proteínas R1, BEI
y/o BEII puede determinarse, por ejemplo, por medio de análisis
mediante transferencia Western. En este contexto, una reducción
significa preferiblemente una reducción de la cantidad de proteínas
R1, BEI y/o BEII en comparación con células correspondientes que no
se han modificado genéticamente al menos en un 50%, en particular
al menos en un 70%, más preferiblemente al menos en un 85% y muy
preferiblemente al menos en un 95%.
Métodos para determinación de la reducción de la
actividad enzimática en las proteínas R1, BEI y BEII son conocidos
por las personas expertas en la técnica y se describirán con mayor
detalle más adelante individualmente para cada proteína. En el
contexto de la presente invención, el término "proteína R1"
hace referencia a proteínas que han sido descritas, por ejemplo, en
Lorberth et al. (Nature Biotech. 16, (1998),
473-477) y en las solicitudes de Patente
Internacional WO 98/27212, WO 00/77229, WO 00/28052 y que tienen las
características siguientes. Características importantes de las
proteínas R1 son i) su secuencia de aminoácidos (véase, por ejemplo,
GenBank Acc. No. A61831, Y09533); ii) su localización en los
plástidos de las células de las plantas; iii) su capacidad para
influir en el grado de fosforilación del almidón en las plantas.
Adicionalmente, el término "proteína R1"
hace referencia a una proteína que cataliza la fosforilación de
almidón en una reacción de tipo diquinasa en la cual 3 sustratos,
un a-poliglucano, ATP y agua se convierten en tres
productos, un a-poliglucano-P, AMP y
ortofosfato (Ritte et al., PNAS 99(10) (2002),
7166-7171).
La inhibición del gen R1 que codifica una
proteína R1 de patata en plantas transgénicas de patata, por
ejemplo, conduce a una reducción del contenido de fosfato del
almidón que puede aislarse del tubérculo de patata. Además,
Lorberth et al. Demostraron que la proteína R1 de Solanum
tuberosum es capaz de fosforilar el glucógeno bacteriano cuando
el cDNA de R1 correspondiente se expresa en E. coli (Lorberth
et al., Nature Biotech. 16, (1998),
473-477).
Ritte et al. (Plant J. 21, (2000),
387-391) pudieron demostrar que la proteína R1 de
Solanum tuberosum en las plantas de patata se fija a los
gránulos de almidón de manera reversible, en donde la fuerza de
fijación al gránulo de almidón depende del estado metabólico de la
planta. En las plantas de patata, la proteína está presente
principalmente en forma unida a los gránulos de almidón en las hojas
que se han mantenido en la oscuridad. Después de exponer las hojas
a la luz, en cambio, la proteína está presente principalmente en la
forma soluble, que no está fijada al gránulo de almidón.
Adicionalmente, la inhibición de la expresión
del gen R1 de la patata en las plantas transgénicas de patata o en
los tubérculos de la misma conduce a una reducción de los
denominados "edulcorantes inducidos por frío" (Lorberth et
al., Nature Biotech. 16, (1998), 473-477).
En el contexto de la presente invención, el
término "proteína R1" se refiere también a proteínas que
exhiben una homología (identidad) significativa de al menos 60%,
preferiblemente de al menos 80%, más preferiblemente de al menos
90% con la secuencia de aminoácidos indicada bajo SEQ ID NO: 6 o
bajo el No. de Acceso a GenBank Y09533 o A61831, y que son capaces
de modificar el grado de fosforilación de polisacáridos tales como,
por ejemplo, almidón y/o glucógeno. Preferiblemente, la proteína R1
procede de la patata (No. de Acceso a GenBank Y09533 o A61831).
Preferiblemente, una proteína R1, tal como se
contempla en las realizaciones de la presente invención, es
codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibrida,
ventajosamente en condiciones severas, con la molécula de ácido
nucleico que tiene las secuencias de nucleótidos que se muestran
bajo SEQ ID NO: 5 y que codifica un polipéptido que tiene la
actividad de una proteína R1.
Dentro de la presente invención, el término
``hibridación significa hibridación en condiciones de hibridación
convencionales (a las que se hace referencia también como
"condiciones de baja severidad"), preferiblemente en
condiciones severas (a las que se hace referencia también como
"condiciones de alta severidad"), como se describen por
ejemplo en Sambrook y Russell (2001), Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbour, NY, EE.UU.
Dentro de una realización especialmente preferida, el término
"hibridación" significa que la hibridación ocurre en las
condiciones siguientes:
- Tampón de hibridación:
- 2 x SSC; 10 x solución Denhardt (Fikoll 400 + PEG + BSA; relación 1:1:1); 0,1% SDS; EDTA 5 mM; Na_{2}HPO_{4} 50 mM, 250 \mug/ml de DNA de esperma de arenque; 50 \mug/ml de tRNA; o 0,25M de tampón de fosfato de sodio, pH 7,2; EDTA 1 mM 7% SDS
- Temperatura de hibridación T
- = 60ºC
- Tampón de lavado:
- 2 x SSC; 0,1% SDS
- Temperatura de lavado T
- = 60ºC
Las moléculas de ácido nucleico que se hibridan
con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de
nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 5 pueden, en principio,
codificar una proteína R1 procedente de cualquier organismo que
exprese dicha proteína. Tales moléculas de ácido nucleico de
hibridación pueden aislarse por ejemplo a partir de genotecas
genómicas o genotecas de cDNA de plantas. Alternativamente, las
mismas se pueden preparar por ingeniería genética o por síntesis
química.
Tales moléculas de ácido nucleico pueden
identificarse y aislarse con el uso de una molécula de ácido
nucleico que codifica una proteína R1 como se describe en esta
memoria o partes de una molécula de este tipo o complementos
inversos de dicha molécula, por ejemplo por hibridación de acuerdo
con métodos estándar (véase por ejemplo Sambrook and Russell
(2001), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, CSH Press, Cold
Spring Harbor, NY, EE.UU.).
Las moléculas de ácido nucleico que poseen la
misma o sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos que se
indica en SEQ ID NO: 5 o partes de la misma pueden, por ejemplo,
utilizarse como sondas de hibridación. Los fragmentos utilizados
como sondas de hibridación pueden ser también fragmentos sintéticos
que se preparan por técnicas de síntesis usuales, y cuya secuencia
coincide sustancialmente con la de una molécula de ácido nucleico
descrita específicamente en esta memoria.
Las moléculas de ácido nucleico de hibridación
comprenden también fragmentos, derivados y variantes alélicas de la
molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos que
se muestra bajo SEQ ID NO: 5. En esta memoria, debe entenderse que
los fragmentos significan partes de las moléculas de ácido nucleico
que son suficientemente largas para codificar una proteína R1. En
este contexto, el término derivado significa que las secuencias de
estas moléculas de ácido nucleico difieren de la secuencia de una
molécula de ácido nucleico arriba descrita en una o más posiciones
y exhiben un alto grado de homología con dicha secuencia. En este
contexto, homología significa una identidad de secuencia de al menos
40%, en particular una identidad de al menos 60%, preferiblemente
de al menos 65%, más preferiblemente de al menos 70%, aún más
preferiblemente de al menos 80%, en particular de al menos 85%, de
modo adicionalmente preferido de al menos 90% y de modo
particularmente preferido de al menos 95%. Muy preferiblemente,
homología significa una identidad de secuencia de al menos n%,
donde n es un número entero entre 40 y 100, es decir, 40 \leq n
\leq 100. Las desviaciones de las moléculas de ácido nucleico
arriba descritas pueden haberse producido, v.g., por deleción,
sustitución, inserción y/o recombinación.
Preferiblemente, el grado de homología se
determina por comparación de la secuencia respectiva con la
secuencia de nucleótidos de la región codificante de SEQ ID NO: 5.
Cuando las secuencias que se comparan no tienen la misma longitud,
el grado de homología se refiere preferiblemente al porcentaje de
residuos de nucleótidos en la secuencia más corta que son idénticos
a los residuos de nucleótidos en la secuencia más larga. El grado
de homología puede determinarse convencionalmente utilizando
programas de ordenador conocidos tales como el programa ClustalW
(Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994),
4673-4680) distibuido por Julie Thompson (Thompson
@ EMBL-Heidelberg.DE) y Toby Gibson
([email protected]) en el Laboratorio
Europeo de Biología Molecular, Meyerhofstrasse 1, D69117
Heidelberg, Alemania. ClustalW puede descargarse también de varios
sitios de la web que incluyen IGBMC (Instituto de Genética y
Biología Molecular y Celular, B.P. 163, 67404 Illkirch Cedex,
Francia;
ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)
y EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/soft-ware/) y
todos los sitios con espejos al EBI (Instituto Europeo de
Bioinformática, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge
CB10 1SD, Reino Unido).
Cuando se utiliza la versión 1.8 del programa
ClustalW para determinar si una secuencia particular es, por
ejemplo, idéntica en un 90% a una secuencia de referencia de acuerdo
con la presente invención, se establecen los ajustes de la manera
siguiente para las alineaciones de secuencias de DNA:
KTUPLE=2, TOPDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMATRIX:IUB,
GAPOPEN=10, GAPEXT=5, MAXDIV=40,
TRANSICIONES: sin ponderar.
TRANSICIONES: sin ponderar.
Para alineaciones de secuencias de proteínas
utilizando la versión 1.8 del programa W, los ajustes son somo
sigue:
KTUPLE=1, TOPDIAG=5, WINDOW=5, PAIRGAP=3,
GAPOPEN=10, GAPEXTEND=0.05, GAPDIST=8,
MAXDIV=40, MATRIX=GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP.
MAXDIV=40, MATRIX=GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP.
La homología, además, significa que existe una
equivalencia funcional y/o estructural entre las moléculas de ácido
nucleico correspondientes o las proteínas codificadas por ellas. Las
moléculas de ácido nucleico que son homólogas a una de las
moléculas arriba descritas y representan derivados de estas
moléculas son generalmente variaciones de estas moléculas que
representan modificaciones que tienen la misma función biológica.
Las mismas pueden ser o bien variaciones existentes naturalmente,
por ejemplo secuencias de otros microorganismos, o mutaciones, y
dichas mutaciones pueden haberse formado naturalmente o pueden haber
sido producidas por mutagénesis deliberada. Adicionalmente, las
variaciones pueden ser secuencias producidas sintéticamente. Las
variantes alélicas pueden, v.g. ser variantes existentes
naturalmente o variantes producidas sintéticamente o variantes
producidas técnicas de DNA recombinante.
Las proteínas codificadas por las diferentes
variantes de la molécula de ácido nucleico que tienen la secuencia
de nucleótidos que se muestra bajo SEQ ID NO: 5 poseen ciertas
características que tienen todas ellas en común. Éstas incluyen por
ejemplo actividad enzimática, peso molecular, reactividad
inmunológica, conformación, etc., y propiedades físicas, tales como
por ejemplo el comportamiento de migración en las electroforesis en
gel, comportamiento cromatográfico, coeficientes de sedimentación,
solubilidad, propiedades espectroscópicas, estabilidad, pH óptimo,
temperatura óptima, etc.
En el contexto de la presente invención, el
término "gen R1" hace referencia a una molécula de ácido
nucleido (v.g. cDNA, DNA) que codifica una "proteína R1" como
se ha descrito arriba. Moléculas de ácido nucleico que codifican
proteínas R1 han sido descritas para diversas plantas tales como,
v.g. maíz (WO 98/27212A1), arroz (WO 00/28052A1) y trigo (WO
00/77229A1). Preferiblemente, el gen R1 procede de la patata, siendo
particularmente preferido un cDNA R1 de patata con la secuencia de
nucleótidos indicada bajo SEQ ID NO: 5 o el No. de Acceso a GenBank
Y09533 o A61831.
En el contexto de la presente invención, el
término "enzima ramificadora" o "proteína BE"
(\alpha-1,4-glucano:\alpha-1,4-glucano-6-glicosiltransferasa,
E.C. 2.4.1.18) se refiere a una proteína que cataliza una reacción
de transglicosilación, en donde los enlaces
\alpha-1,4 de un donante de
\alpha-1,4-glucano están
hidrolizados y las cadenas de
\alpha-1,4-glucano liberadas de
este modo se transfieren a una cadena aceptora de
\alpha-1,4-glucano y se convierten
de este modo en enlaces \alpha-1,6. Dentro del
significado de la presente invención, el término "gen BE" es un
gen que codifica una "proteína BE".
En el contexto de la presente invención, el
término "proteína BEI" hace referencia a una enzima
ramificadora (= BE) de la isoforma I, y preferiblemente la proteína
BEI se origina de plantas de patata.
La designación de las isoformas sigue la
nomenclatura sugerida por Smith-White y Preiss
(Smith-White and Preiss, Plant Mol. Biol. Rep. 12
(1994), 67-71; Larsson et al., Plant Mol.
Biol. 37, (1998), 505-511). Esta nomenclatura
supone que todas las enzimas ramificadoras que exhiben una homología
(identidad) mayor al nivel de aminoácidos a la proteína BEI de maíz
que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra bajo SEQ ID NO:
9 (No. de Acceso a GenBank D11081; Baba et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 181(1), (1991), 87-94;
Kim et al., Gene 216, (1998), 233-243) que a
la proteína BEII del maíz que tiene la secuencia de aminoácidos que
se muestra bajo SEQ ID NO: 10 (No. de Acceso a GenBank AF072725,
U65948) son enzimas ramificadoras designadas de la isoforma I o, en
forma abreviada, proteínas BEI.
En el contexto de la presente invención, el
término "gen BEI" hace referencia a una molécula de ácido
nucleico (v.g. cDNA, DNA) que codifica una "proteína BEI",
preferiblemente una proteína BEI de plantas de patata. Tales
moléculas de ácido nucleico han sido descritas para numerosas
plantas, por ejemplo para maíz (No. de Acceso a GenBank D11081,
AF072724), arroz (No. de Acceso a GenBank D11082), guisante (No. de
Acceso a GenBank X80010) y patata. Formas diferentes del gen BEI o
la proteína BEI de patata han sido descritas, por ejemplo, por
Khoshnoodi et al. (Eur. J. Biochem. 242(1) (1996),
148-155), No. de Acceso a GenBank Y08786 y por
Kossmann et al. (Mol. Gen. Genet. 230 (1991),
39-44). En las plantas de patata, el gen BEI se
expresa principalmente en los tubérculos y escasamente en las hojas
(Larsson et al., Plant Mol. Biol. 37, (1998),
505-511).
Preferiblemente, una proteína BEI, como se
contempla en las realizaciones de la presente invención, es
codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibrida,
ventajosamente en condiciones severas, con la molécula de ácido
nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra bajo
SEQ ID NO: 7 y que codifica un polipéptido que tiene actividad de
enzima ramificadora. La definición para el término
"hibridación" como se ha definido arriba en conexión con las
proteínas R1 se aplica igualmente para la definición de las
moléculas de ácido nucleico que se hibridan con la molécula de
ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO:
7. Preferiblemente, una proteína BEI tal como se hace referencia a
la misma en esta memoria, exhibe una identidad de secuencia de al
menos 60%, en particular de al menos 75%, preferiblemente de al
menos 85%, más preferiblemente al menos 90% y todavía más
preferiblemente al menos 95% con la secuencia de aminoácidos
representada bajo SEQ ID NO: 8.
En el contexto de la presente invención, el
término "proteína BEII" se refiere a una enzima ramificadora (=
BE) de la isoforma II, originándose preferiblemente de plantas de
patata. Dentro del significado de la presente invención, todas las
enzimas que exhiben una homología (identidad) mayor al nivel de
aminoácidos con la proteína BEII de maíz (No. de Acceso a GenBank
AF072725, U65948) que a la proteína BEI del maíz (No. de Acceso a
GenBank D11081, AF072724) deben designarse como proteína BEII.
En el contexto de la presente invención, el
término "gen BEII" hace referencia a una molécula de ácido
nucleico (v.g. cDNA, DNA) que codifica una "proteína BEI",
preferiblemente una proteína BEII de plantas de patata. Tales
moléculas de ácido nucleico han sido descritas para numerosas
plantas, por ejemplo, para patata (No. de Acceso a GenBank
AJ000004, AJ011888, AJ011889, AJ011885, AJ011890), maíz (AF072725,
U65948), cebada (AF064S61), arroz (D16201) y trigo (AF286319). En
las plantas de patata, el gen BEII se expresa principalmente en las
hojas y escasamente en los tubérculos (Larsson et al., Plant
Mol. Biol. 37, (1998), 505-511).
Preferiblemente, una proteína BEII, tal como se
contempla en las realizaciones de la presente invención, es
codificada por una molécula de ácido nucleico que se hibrida,
ventajosamente en condiciones severas, con la molécula de ácido
nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra bajo
SEQ ID NO: 9 y que codifica un polipéptido que tiene la actividad
de enzima ramificadora. La definición para el término
"hibridación" como se ha definido arriba en conexión con las
proteínas R1 es igualmente aplicable para la definición de las
moléculas de ácido nucleico que se hibridan con la molécula de ácido
nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3.
Preferiblemente, una proteína BEII tal como se hace referencia a la
misma en esta memoria exhibe una identidad de secuencia de al menos
60%, en particular de al menos 75%, preferiblemente de al menos
85%, más preferiblemente de al menos 90%, y todavía más
preferiblemente al menos 95% con la secuencia de aminoácidos
representada bajo SEQ ID NO: 4.
En una realización preferida de la presente
invención, la modificación genética de la célula de planta
transgénica dicotiledónea de la invención que es la introducción de
una o más moléculas de ácido nucleico extraño cuya presencia y/o
expresión conduce a una reducción de la actividad de las proteínas
R1 y BEI y BEII en comparación con células de plantas o plantas
correspondientes de tipo salvaje, células que no se han modificado
genéticamente, se consigue por inhibición de la expresión de los
genes endógenos que codifican proteínas R1, proteínas BEI y
proteínas BEII.
La producción de las células de plantas de la
invención puede realizarse por métodos diferentes conocidos por las
personas expertas en la técnica, v.g. por métodos que conducen a una
inhibición de la expresión de genes endógenos que codifican una
proteína R1, BEI o BEII. Éstas incluyen, por ejemplo, la expresión
de un RNA antisentido correspondiente, la provisión de moléculas o
vectores que median un efecto de co-supresión, la
expresión de una ribozima construida de acuerdo con ello que escinde
específicamente los transcritos que codifican una proteína R1, BEI
o BEII o la denominada "mutagénesis in vivo".
Adicionalmente, la reducción de la actividad de R1 y/o de BEI y/o
BEII en las células de las plantas puede estar causada también por
la expresión simultánea de moléculas de RNA de sentido y
antisentido del gen diana a reprimir, preferiblemente del gen R1
y/o el gen BEI y/o el gen BEII, una técnica a la que se hace
referencia comúnmente como interferencia de RNA (RNAi) (Bosher and
Labouesse, Nature Cell Biology 2, (2000), E31-E36;
Waterhouse et al., PNAS 95, (1998),
13959-13964). Se describe también en esta memoria
que, por el uso de moléculas de RNA bicatenarios que comprenden
secuencias promotoras, puede lograrse una desactivación de la
transcripción del promotor. Estos y otros métodos para reducir la
actividad de proteínas se describirán con mayor detalle más
adelante. Todos estos métodos están basados en la introducción de
una o más moléculas de ácido nucleico extraño en el genoma de las
células de las plantas.
Dentro del contexto de la presente invención,
debe entenderse que el término "molécula de ácido nucleico
extraño" es una molécula que o bien no existe naturalmente en
las células de las plantas correspondientes o que no existe
naturalmente en las células de las plantas en el orden espacial
concreto o que está localizada en una posición en el genoma de la
célula de la planta en la cual no se encuentra naturalmente. La
molécula de ácido nucleico extraño es preferiblemente una molécula
recombinante que está compuesta de varios elementos, cuya
combinación o cuyo orden espacial específico no se presenta
naturalmente en las células de las plantas.
La molécula de ácido nucleico extraño puede, por
ejemplo, ser un denominado "constructo triple" que debe
entenderse es un vector simple para transformación de plantas que
contiene a la vez la información genética para inhibir la expresión
de uno o más genes endógenos R1 y para inhibir la expresión de uno o
más genes BEI y BEII o la presencia o expresión de los cuales
conduce a la reducción de la actividad de una o más proteínas R1,
BEI, y BEII.
En otra realización, la molécula de ácido
nucleico extraño puede ser un denominado "constructo doble" que
debe entenderse es un vector para la transformación de plantas que
contiene la información genética para inhibir la expresión de dos
de los tres genes diana (gen R1, BEI y BEII) o cuya presencia o
expresión conduce a la reducción de la actividad de dos de las tres
proteínas diana (proteínas R1, BEI y BEII). En esta realización de
la invención, la inhibición de la expresión del tercer gen diana y/o
la reducción de la actividad de la tercera proteína diana tiene
lugar por medio de una molécula de ácido nucleico extraño separada
que contiene la información genética correspondiente para ejercer
este efecto inhibidor.
En otra realización de la invención, no es un
constructo triple el que se introduce en el genoma de la célula de
la planta sino varias moléculas de ácido nucleico extraño
diferentes, siendo una de estas moléculas de ácido nucleico extraño
por ejemplo una molécula de DNA que, verbigracia, es un constructo
de co-supresión que conduce a una reducción de la
expresión de uno o más genes endógenos R1, y una molécula de ácido
nucleico extraño adicional que es una molécula de DNA que codifica,
por ejemplo, un RNA antisentido que conduce a una reducción de la
expresión de uno o más genes BEI y/o BEII endógenos. En principio,
por lo que respecta a la construcción de las moléculas de ácido
nucleico extraño, es también adecuado utilizar cualquier combinación
de constructos antisentido, de co-supresión y de
ribozima o mutagénesis in vivo, todos los cuales conducen a
una reducción simultánea de la expresión génica de genes endógenos
que codifican una o más proteínas R1, BEI y BEII o que conducen a
una reducción simultánea de la actividad de una o más proteínas R1,
BEI y BEII.
En este caso, las moléculas de ácido nucleico
extraño pueden introducirse simultáneamente
("co-transformación") o consecutivamente, es
decir una tras otra ("super-transformación"),
en el genoma de la célula de la planta.
En otra realización de la invención, se expresa
al menos un RNA antisentido para reducir la actividad de una o más
proteínas R1 y/o proteínas BEI y/o proteínas BEII en células de las
plantas.
Para inhibir la expresión génica por medio de
tecnología antisentido o tecnología de co-supresión,
es posible utilizar por ejemplo una molécula de DNA que comprende
la secuencia entera que codifica una proteína R1 y/o BEI y/o BEII,
con inclusión de secuencias flanqueantes que pueden estar presentes
opcionalmente, así como moléculas de DNA que comprenden sólo partes
de la secuencia codificante y/o secuencias flanqueantes, en donde
estas partes deben ser suficientemente largas para conducir a un
efecto antisentido o un efecto de co-supresión en
las células. En general, secuencias que tienen una longitud mínima
de 15 pb, preferiblemente una longitud de 100 a 500 pb, en
particular secuencias que tienen una longitud mayor que 500 pb, son
adecuadas para una inhibición antisentido o de
co-supresión eficiente. Usualmente se utilizan
moléculas de DNA que son más cortas que 5000 pb, preferiblemente
secuencias que son más cortas que 2500 pb.
Para enfoques antisentido o de
co-supresión, se utilizan secuencias de DNA que
tienen un alto grado de homología con las secuencias que existen
endógenamente en la célula de la planta y que codifican proteínas
R1, BEI o BEII. El grado de homología mínimo debería ser mayor que
65%. Se prefiere utilizar secuencias que tengan una homología de al
menos 90%, en particular entre 95 y 100%.
Además, asimismo intrones, es decir regiones no
codificantes de genes que codifican proteínas R1, BEI y/o BEII, son
imaginables para uso con objeto de conseguir un efecto antisentido o
de co-supresión.
\global\parskip0.900000\baselineskip
El uso de secuencias de intrón para inhibir la
expresión génica de genes que codifican proteínas de la biosíntesis
del almidón ha sido descrito en las solicitudes de Patente
Internacional WO 97/04112, WO 97/04113, WO 98/37413, y WO 98/37214.
Las personas expertas en la técnica conocen el modo de conseguir un
efecto antisentido y un efecto de cosupresión. El método de
inhibición de la co-supresión fue descrito, por
ejemplo, en Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990),
340-344), Niebel et al. (Curr. Top.
Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91-103), Flavell
et al. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995),
43-46), Palaqui and Vaucheret (Plant. Moli Biol. 29
(1995, 149-159), Vaucheret et al. (Mol. Gen.
Genet. 248 (1995), 311-317), de Borne et al.
(Mol. Gen. Genet. 243 (1994), (613-621).
Las personas expertas están familiarizadas
también con la expresión de ribozimas para reducir la actividad de
ciertas enzimas en las células y se describe, por ejemplo, en
EP-B1 0321201. La expresión de ribozimas en células
de plantas ha sido descrita, por ejemplo, en Feyter et al.
(Mol. Gen. Genet. 250, (1996), 329-338).
Adicionalmente, la actividad de R1 y/o BEI y/o
BEII en células de plantas puede reducirse también por la denominada
"mutagénesis in vivo" en la cual un oligonucleótido
híbrido RNA-DNA ("quimeroplasto") se introduce
en las células por medio de la transformación de células (Kipp,
P.B. et al., Poster en el 5º Congreso Internacional de
Biología Molecular de las Plantas, 21-27, septiembre
1997, Singapur; R.A. Dixon y C.J. Arntzen, Informe del Congreso
para "Ingeniería Metabólica en Plantas Transgénicas", Keystone
Symphosia, Copper Mountain, CO, EE.UU., TIBTECH 15, (1997),
441-447; Solicitud de Patente Internacional WO
95/15972; Kren et al., Hepatology 25, (1997),
1462-1468; Cole-Strauss et
al., Science 273, (1996), 1386-1389).
Una parte del componente DNA del oligonucleótido
RNA-DNA es homóloga a una secuencia de ácido
nucleico de un gen endógeno R1, BEI y/o BEII; sin embargo, la misma
tiene una mutación en comparación con un gen endógeno R1, BEI y/O
BEII o contiene una región heteróloga que está abarcada por las
regiones homólogas.
Es posible transferir la región de mutación o
heteróloga contenida en el componente DNA de la molécula
RNA-DNA en el genoma de una célula de planta por
medio de apareamiento de bases de las regiones homólogas del
oligonucleótido RNA-DNA y la molécula de ácido
nucleico endógeno, seguido por recombinación homóloga. Como
resultado, se reduce la actividad de una o más proteínas R1, BEI
y/o BEII.
Adicionalmente, la reducción de la actividad de
R1 y/o BEI y/o BEII en las células de las plantas puede estar
causada también por la expresión simultánea de moléculas de RNA de
sentido y antisentido del gen diana que debe reprimirse,
preferiblemente del gen R1 y/o el gen BEI y/o el gen BEII.
Esto puede conseguirse, por ejemplo, utilizando
constructos quiméricos que contienen repeticiones invertidas del
gen diana respectivo o de partes del gen diana. En este caso, los
constructos quiméricos codifican moléculas de RNA de sentido y
antisentido del gen diana respectivo. Los RNA de sentido y
antisentido se sintetizan simultáneamente en las plantas como una
sola molécula de RNA, en donde el RNA de sentido y antisentido
pueden estar separados uno de otro por un espaciador y formar una
molécula de RNA bicatenario. Ha sido posible demostrar que la
introducción de constructos de DNA repetidos invertidos en el
genoma de las plantas es un método muy eficiente para reprimir los
genes que corresponden a los constructos de DNA con repeticiones
invertidas (Waterhouse et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
95, (1998), 13959-13964; Wang and Waterhouse, Plant
Mol. Biol. 43, (2000), 67-82; Singh et al.,
Biochemical Society Transactions vol. 28, parte 6 (2000),
925-927; Liu et al., Biochemical Society
Transactions vol. 28, parte 6 (2000), 927-929; Smith
et al., Nature 407, (2000), 319-320;
Solicitud de Patente Internacional WO 99/53050 A1). Las secuencias
de sentido y antisentido del gen diana o de los genes diana pueden
expresarse también por separado utilizando el mismo o diferentes
promotores (Nap, J.-P. et al., 6º Congreso Internacional de
Biología Molecular de las Plantas, Quebec, 18-24 de
junio de 2000; Poster S7-27, sesión de lectura
S7).
Así pues, es también posible reducir la
actividad de R1 y/o BEI y/o BEII en las células de las plantas por
la producción de moléculas de RNA bicatenario de los genes R1 y/o
BEI y/o BEII. Preferiblemente, las repeticiones invertidas de
moléculas de DNA de los genes R1 y/o BEI y/o BEII o cDNAs se
introducen en el genoma de las plantas para este propósito, en
donde las moléculas de DNA a transcribir (gen R1, BEI o BEII o cDNA
o fragmentos de estos genes o cDNAs) se encuentran bajo el control
de un promotor que controla la expresión de dichas moléculas de
DNA.
Adicionalmente, de acuerdo con la presente
exposición, se sabe que, en las plantas, la formación de moléculas
de RNA bicatenario de moléculas de DNA promotor en las plantas puede
conducir en trans a una metilación y una desactivación de la
transcripción de copias homólogas de estos promotores que se
denominan promotores diana en lo sucesivo (Mette et al.,
EMBO J. 19, (2000), 5194-5201).
Por consiguiente, es posible reducir la
expresión génica de un cierto gen diana (v.g. el gen R1, BEI o BEII)
por medio de la desactivación del promotor diana, estando
controlado naturalmente el gen diana por este promotor diana.
Esto significa que, en este caso, en contraste
con la función original, de los promotores en las plantas, las
moléculas de DNA que comprenden los promotores diana de los genes a
reprimir (genes diana) no se utilizan como elementos de control
para la expresión de genes o cDNAs sino como moléculas de DNA
transcribibles propiamente dichas.
Para la producción del promotor diana
bicatenario, moléculas de RNA en plantas que pueden estar presentes
en ellas como moléculas de horquilla de RNA, se prefieren utilizar
constructos que contienen repeticiones invertidas de la molécula de
DNA del promotor diana, encontrándose las moléculas de DNA del
promotor diana bajo el control de un promotor que controla la
expresión génica de dichas moléculas de DNA del promotor diana.
A continuación, se introducen estos constructos
en el genoma de las plantas. La expresión de las repeticiones
invertidas de dichas moléculas de DNA del promotor diana conduce a
la formación de moléculas de RNA del promotor diana bicatenarios en
las plantas (Matte et al., EMBO J. 19, (2000),
5194-5201). De este modo, es posible desactivar el
promotor diana.
Por consiguiente, la actividad de R1 y/o BEI y/o
BEII en las células de las plantas puede reducirse también por
generación de moléculas de RNA bicatenario de secuencias promotoras
de los genes R1 y/o BEI y/o BEII. A este propósito, se prefiere
introducir repeticiones invertidas de moléculas de DNA promotoras de
los promotores R1 y/o BEI y/o BEII en el genoma de las plantas,
encontrándose las moléculas de DNA promotoras diana a transcribir
(promotor R1, BEI y/o BEII) bajo el control de un promotor que
controla la expresión de dichas moléculas de DNA promotoras diana.
Las secuencias promotoras de los genes R1 y/o BEI y/o BEII
necesarios para la realización de la presente invención, pueden
proporcionarse por métodos conocidos por las personas expertas y
descritos en la bibliografía, por ejemplo en Sambrook y Russell
(2001), Molecular Cloning, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY,
EE.UU. Los métodos pueden incluir por ejemplo la preparación de una
genoteca genómica de la planta en la que la actividad de las
proteínas R1, BEI y BEII estará reducida, el cribado de la genoteca
para clones que contengan la secuencia flanqueante de la región
codificante del gen respectivo en dirección 5 con ayuda de una
sonda que comprende una secuencia codificante para la proteína R1 o
BEI o BEII como se ha descrito arriba, y finalmente la
secuenciación de clones positivos por técnicas convencionales.
Además, de acuerdo con la presente exposición,
las personas expertas saben que la reducción de actividad de una o
más proteínas R1, BEI y/o BEII puede conseguirse por medio de la
expresión de derivados no funcionales, en particular mutantes
trans-dominantes de dichas proteínas, y/o por medio
de la expresión de antagonistas/inhibidores de dichas
proteínas.
Antagonistas/inhibidores de dichas proteínas
comprenden, por ejemplo, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o
moléculas que tienen propiedades de fijación similares. Un
anticuerpo citoplasmático scFv, por ejemplo, se utilizó para mediar
la actividad de la proteína del fitocromo A en plantas de tabaco
modificadas genéticamente (Owen, Bio/Technology 10 (1992),
790-4; Revisión: Fanken, E., Teutschel, I.J. y Hain,
R., Current Opinion in Biotechnology 8, (1997),
411-416; Whitelam, Trends Plant Sci. 1 (1996),
268-272).
Las células de plantas transgénicas
dicotiledóneas de la invención sintetizan un almidón modificado que
está modificado en sus propiedades físico-químicas,
en particular en la relación amilosa/amilopectina, el contenido de
fosfato, el comportamiento de viscosidad, el tamaño de los gránulos
de almidón y/o la forma de los gránulos de almidón en comparación
con el almidón sintetizado en las plantas de tipo salvaje, por lo
que es más adecuado para propósitos de aplicación específicos.
Se ha encontrado, sorprendentemente, que la
composición del almidón está modificada en las células de las
plantas de la invención de tal manera que el mismo tiene un
contenido de amilosa de al menos 75% y un contenido reducido de
fosfato al menos en un 50% en comparación con el almidón de las
células de las plantas procedentes de plantas correspondientes de
tipo salvaje, por lo que dicho almidón es más adecuado para
propósitos de aplicación específicos.
En el contexto de la presente invención, el
contenido de amilosa se determina de acuerdo con el método de
Hovenkamp-Hermelink et al. descrito más
adelante en conexión con almidón de patata (Potato Research 31,
(1988), 241-246). Este método puede utilizarse
también para almidones aislados de otras especies de plantas. Las
personas expertas en la técnica están familiarizadas con métodos
para el aislamiento de almidones.
Dentro del significado de la presente invención,
el término "contenido de fosfato" hace referencia al contenido
de fosfato unido covalentemente en forma de monoésteres fosfato de
almidón.
En el contexto de la presente invención, la
expresión "contenido reducido de fosfato" significa que el
contenido global de fosfato unido covalentemente y/o el contenido
de fosfato en la posición C-6 del almidón
sintetizado en las células de las plantas de la invención está
reducido al menos en un 50%, preferiblemente al menos en un 80% en
comparación con el almidón de las células de plantas de las plantas
correspondientes de tipo salvaje, cuyas células no se han
modificado genéticamente.
Dentro del significado de la presente invención,
el término "contenido de fosfato en la posición
C-6" debe entenderse que es el contenido de
grupos fosfato que están unidos a la posición del átomo de carbono
"6" de los monómeros de glucosa del almidón. En principio, las
posiciones C2, C3 y C6 de las unidades glucosa pueden estar
fosforiladas en el almidón in vivo. En conexión con la
presente invención, el contenido de fosfato en la posición
C-6 (= contenido C6-P) puede
determinarse por la determinación de la
glucosa-6-fosfato por medio de un
test óptico-enzimático (Nielsen et al., Plant
Physiol. 105, (1994), 111-117) (véase más
adelante).
En el contexto de la presente invención, la
expresión "contenido global de fosfato" del almidón debe
entenderse que es el contenido de fosfato unido covalentemente en
forma de monoésteres de fosfato de almidón en la posición C2, C3 y
C6 de las unidades glucosa. De acuerdo con la invención, el
contenido de no-glucanos fosforilados tales como,
v.g. fosfolípidos, no se incluye en el término "contenido global
de fosfato". Así pues, los no-glucanos
fosforilados deben separarse cuantitativamente antes de determinar
el contenido global de fosfato. Las personas expertas conocen
métodos para separar los no-glucanos fosforilados
(v.g. fosfolípidos) del almidón. Métodos para determinar el
contenido global de fosfato son conocidos por las personas expertas
en la técnica y se describen más adelante.
\global\parskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida de la invención,
las células de plantas de la invención sintetizan un almidón que
tiene un contenido de fosfato en la posición C-6 de
los monómeros de glucosa de hasta 15 nmol C6-P
mg^{-1} de almidón, en particular de hasta 10 nmol
C-8-P mg^{-1} de almidón,
preferiblemente de hasta 7 nmol C6-P mg^{-1} de
almidón, más preferiblemente de hasta 4 nmol C6-P
mg^{-1} de almidón.
En otra realización preferida, las células de
plantas de acuerdo con la invención sintetizan un almidón
modificado, en donde el almidón modificado se caracteriza porque el
mismo tiene una distribución modificada de las cadenas laterales.
Se ha demostrado que el almidón modificado en las células de las
plantas de la invención se caracteriza no sólo por un contenido
incrementado de amilosa y un contenido reducido de fosfato comparado
con el almidón de las plantas correspondientes de tipo salvaje,
sino también por una distribución modificada de las cadenas
laterales.
En esta realización, el término "distribución
modificada de las cadenas laterales" debe entenderse que es un
aumento en la proporción de cadenas laterales cortas que tienen un
DP de 26 a 31 por al menos 50%, preferiblemente de al menos 100%,
más preferiblemente de al menos 150% y de modo especialmente
preferido de al menos 200% en comparación con la proporción de
cadenas laterales cortas que tienen un DP de 26 a 31 de amilopectina
procedente de las plantas de tipo salvaje. Además, el término
"distribución modificada de las cadenas laterales" significa
un aumento de la proporción de cadenas laterales cortas que tienen
un DP de 26 a 31, en donde el aumento de la proporción de cadenas
laterales cortas que tienen un DP de 26 a 31 no es mayor que 800%,
en particular no mayor que 500% comparado con la proporción de
cadenas laterales cortas que tienen un DP de 26 a 31 de amilopectina
de las plantas de tipo salvaje. La cantidad "DP" significa el
grado de polimerización.
La proporción de cadenas laterales cortas se
determina por la determinación de la proporción en porcentaje que
tiene cierta cadena lateral en la proporción global de todas las
cadenas laterales. La proporción global de todas las cadenas
laterales se determina por la determinación de la altura global de
los picos que representan los grados de polimerización de DP 6 a 40
en el cromatograma HPLC. La proporción en porcentaje que tiene una
cierta cadena lateral en la proporción global de todas las cadenas
laterales se determina por la determinación de la relación de la
altura del pico que representa esta cadena lateral en el
cromatograma HPLC a la altura total. El programa Chromeleon 6.20
por Dionex, EE.UU. puede utilizarse, por ejemplo, para determinar
las áreas de los picos.
En otra realización preferida, la presente
invención se refiere a células de plantas de la invención que
sintetizan un almidón modificado que forma un gel después de
empastado en una solución de CaCl_{2} al 60% (p/v), teniendo el
gel una fuerza de gel incrementada en comparación con el gel de
almidón de las células de plantas de tipo salvaje correspondientes
que no han sido modificadas genéticamente.
Dentro del significado de la presente invención,
el término "fuerza de gel incrementada" significa un aumento
en la fuerza de gel de al menos 1000%, en particular de al menos
2500%, preferiblemente de al menos 5000% y más preferiblemente de
al menos 10.000%, de 40.000% como máximo o de 30.000% como máximo en
comparación con la fuerza de gel del almidón de células de plantas
correspondientes de tipo salvaje que no han sido modificadas
genéticamente.
En el contexto de la presente invención, la
fuerza de gel debe determinarse por medio de un analizador de
textura en las condiciones descritas más adelante. En este caso, el
empastado del almidón se realiza en una solución acuosa al 60%
(p/v) de CaCl_{2}, dado que en un sistema puramente acuoso no es
posible conseguir el empastado del almidón a la presión normal.
En una realización preferida adicional, la
presente invención se refiere a células de plantas de la invención
que, además de las propiedades arriba mencionadas, tienen un almidón
que posee una morfología modificada de los gránulos de almidón. En
comparación con los almidones ricos en amilosa que se conocen hasta
ahora, en particular con los almidones de patata ricos en amilosa,
los almidones de las células de las plantas de la invención no
están sólo modificados en el contenido de amilosa, el contenido de
fosfato, la distribución de las cadenas laterales, el
comportamiento de viscosidad y el comportamiento de formación de
gel, sino también en una morfología modificada de los gránulos de
almidón, que hace estos gránulos más adecuados para ciertos
propósitos de aplicación. Estos almidones, en particular los
almidones de patata, podrían utilizarse, por ejemplo, en lugar de
almidones de arroz dado que, después de la fragmentación mecánica,
los almidones de la invención tienen un tamaño medio de los
gránulos de almidón que es similar al de los almidones de arroz.
Comparados con los almidones de arroz, los almidones de la
invención, en particular los almidones de patata, tienen sin
embargo la ventaja de que los mismos pueden sedimentarse en unidades
mayores que tienen la forma de un racimo de uvas (véase el Ejemplo
2) dado que los gránulos pequeños de almidón forman aglomeraciones
semejantes a racimos de uvas, lo cual puede ser ventajoso en la
extracción y el procesamiento del almidón y con lo cual pueden
reducirse los costes.
Preferiblemente, la morfología de los gránulos
de almidón contenidos en las células de las plantas de la invención
se caracteriza por una aglomeración de pequeños gránulos de almidón
que tienen la forma de un racimo de uvas.
En una realización preferida, los almidones
contenidos en las células de las plantas de la invención se
caracterizan porque el tamaño medio del gránulo está reducido en
comparación con el tamaño medio de los gránulos de células
correspondientes de plantas de tipo salvaje que no se han modificado
genéticamente.
\newpage
En el contexto de la presente invención, el
término "tamaño medio de gránulo" significa el tamaño de
gránulo que puede determinarse utilizando, por ejemplo, un
foto-sedimentómetro del tipo "Lumosed FS1" por
Retsch GmbH (véase más adelante).
En otra realización preferida de la invención,
un tamaño medio del gránulo reducido es una reducción del tamaño
medio del gránulo de al menos 20%, preferiblemente de al menos 40% y
más preferiblemente de al menos 60%.
En otra realización preferida, los almidones de
las células de las plantas de la invención se caracterizan por un
tamaño medio del gránulo menor que 20 \mum, en particular menor
que 18 \mum, preferiblemente menor que 16 \mum, y más
preferiblemente de 10-15 \mum.
En otra realización preferida de la invención,
los almidones de las células de las plantas de la invención se
caracterizan porque la proporción de gránulos que tienen un tamaño
medio del gránulo menor que 20 \mum es al menos 70%,
preferiblemente al menos 75% y más preferiblemente al menos 80%.
Después de la fragmentación mecánica del
almidón, que puede realizarse como se describe más adelante, los
almidones de las células de las plantas de la invención tienen una
proporción de gránulos que tienen un tamaño de gránulo menor que 20
\mum de al menos 80%, preferiblemente de al menos 90% y más
preferiblemente de al menos 95%.
Una pluralidad de técnicas está disponible para
introducir DNA en una célula hospedadora de plantas. Estas técnicas
comprenden la transformación de células de plantas con
T-DNA utilizando Agrobacterium tumefaciens o
Agrobacterium rhizogenes como medio de transformación, la
fusión de protoplastos, inyección, la electroporación de DNA, la
introducción de DNA por medio del enfoque biolístico, y otras
posibilidades.
El uso de la transformación mediada por
Agrobacterias de células de plantas ha sido investigado
intensivamente y descrito suficientemente en EP120516; Hoekema, in:
The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V.,
Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev.
Plant Sci. 4, 1-46 and An et al. EMBO J. 4,
(1985), 277-287. Para la transformación de la
patata véase, por ejemplo, Rocha-Sosa et al
(EMBO J. 8, (1989), 29-33).
La transformación de plantas monocotiledóneas
por medio de vectores basados en Agrobacterium ha sido también
descrita (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22, (1993),
491-506; Hiei et al., Plant J. 6, (1994)
271-282; Deng et al., Science in China 33,
(1990), 28-34; Wilmink et al., Plant Cell
Reports 11, (1992), 76-80; May et al.,
BiofTechnology 13, (1995), 486-492; Conner and
Domisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555;
Ritchie et al., Transgenic Res. 2, (1993),
252-265).
Un sistema alternativo para la transformación de
plantas monocotiledóneas es la transformación por el enfoque
biolístico (Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994),
37-48; Vasil et al., Bio/Technology 11
(1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol.
Biol. 24, (1994), 317-325; Spencer et al.,
Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625-631),
transformación de protoplastos, la electroporación de células
parcialmente permeabilizadas, y la introducción de DNA por medio de
fibras de vidrio. La transformación de maíz, en particular, ha sido
descrita repetidamente en la bibliografía (véase, por ejemplo, WO
95/06128, EP 0513849, EP0465875, EP0292435; Fromm et al.,
Biotechnology 8, (1990), 833-844;
Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2, (1990),
603-618; Koziel et al., Biotechnology 11
(1993), 194-200; Moroc et al., Theor. Appl.
Genet. 80, (1990), 721-726).
La transformación con éxito de otras especies de
cereales ha sido descrita también, por ejemplo en el caso de la
cebada (Wan and Lemaux, véase arriba; Ritala et al., véase
arriba; Krens et al., Nature 296, (1982),
72-74) y el trigo (Nehra et al., Plant J. 5,
(1994), 285-297). Para la expresión de la molécula
de ácido nucleico extraño (moléculas de ácido nucleico extraño), en
principio, puede utilizarse cualquier promotor que sea activo en
células de plantas. El promotor puede seleccionarse de tal manera
que la expresión en las plantas de acuerdo con la invención sea
constitutiva, o solamente en un tejido particular, en un punto
particular en el momento del desarrollo de la planta, o en un
momento determinado por factores externos. Con respecto a la planta,
el promotor puede ser homólogo o heterólogo. Ejemplos de promotores
adecuados son el promotor del RNA del virus del mosaico de la
coliflor 35S y el promotor ubiquitina del maíz para expresión
constitutiva, el promotor B33 del gen patatín
(Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989),
23-29), el promotor MCPI del gen inhibidor de
metalocarboxipeptidasa de la patata (Solicitud de Patente de
Hungría HU9801674) o el promotor GBSSI de la patata (Solicitud de
Patente Internacional WO 92/11376) para expresión específica del
tubérculo en las patatas, o un promotor que asegura la expresión
únicamente en tejidos fotosintéticamente activos, por ejemplo el
promotor ST-LS1 ((Stockhaus et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus
et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451), el
promotor Ca/b (véase, por ejemplo, US 5656496, US5639952, Bansal
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, (1992),
3654-3658) y el promotor SSU de Rubisco (véanse, por
ejemplo, los documentos US 5.034.322, US 4.962.028), o el promotor
glutelina para una expresión específica del endospermo (Leisy et
al., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng
et al., Plant j. 4, (1993), 357-366;
Yoshijara et al., FEBS Lett. 383, (1996),
213-218), el promotor contraído 1 (Werr et
al., EMBO J. 4, (1985), 1373-1380), el promotor
HMG del trigo, el promotor USP, el promotor faseolina o promotores
de genes de la zeína del maíz (Pedersen et al., Cell 29,
(1982) 1015-1026; Quatroccio et al., Plant
Mol. Biol. 15 (1990), 81-93)). La expresión de la
molécula de ácido nucleico extraño (las moléculas de ácido nucleico
extraño) es particularmente ventajosa en los órganos de la planta
que almacenan almidón. Tales órganos son, v.g., el tubérculo de la
planta de patata o las mazorcas o el endospermo de las plantas de
maíz, trigo o arroz. Así pues, se prefiere utilizar promotores que
medien la expresión en estos órganos.
No obstante, es posible también utilizar
promotores que se activan únicamente en un momento que está
determinado por factores externos (véase, por ejemplo WO 93/07279).
Los promotores de las proteínas del choque térmico, que permiten
inducción simple, pueden ser particularmente interesantes en este
contexto. Adicionalmente, pueden utilizarse promotores específicos
de semillas tales como, por ejemplo, el promotor USP de Vicia faba
que asegura la expresión específica de la semilla en Vicia faba y
otras plantas (Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22, (1993),
669-679; Bäumleim et al., Mol. Gen. Genet.
225, (1991), 451-467). Otros promotores que pueden
emplearse son promotores específicos de frutos, como se describe,
por ejemplo, en el documento WO 91/01373. Una secuencia de
terminación que sirve para la terminación correcta de la
transcripción y para la adición de una cola poli-A
al transcrito, que se entiende tiene una función en la
estabilización de los transcritos, puede estar presente
adicionalmente. Tales elementos han sido descritos en la
bibliografía (véase, por ejemplo, Gielen et al., EMBO J. 8
(1989), 23-29) y son intercambiables
libremente.
libremente.
Las células de plantas de acuerdo con la
invención pueden pertenecer a cualquier especie de planta
dicotiledónea. Las mismas son preferiblemente células de plantas
procedentes de plantas útiles en agricultura, es decir plantas que
son cultivadas por el hombre para los propósitos de nutrición o para
fines técnicos, en particular industriales. La invención se refiere
preferiblemente a plantas formadoras de fibras (por ejemplo lino,
cáñamo, algodón), plantas oleaginosas (por ejemplo colza, girasol,
soja), plantas que almacenan azúcar (por ejemplo remolacha
azucarera) y plantas que almacenan proteínas (por ejemplo plantas
leguminosas). En una realización preferida adicional, la invención
se refiere a plantas forrajeras, en particular alfalfa, trébol,
etc., y hortalizas (por ejemplo tomate, lechuga, escarola). En otra
realización preferida, la invención se refiere a células de plantas
procedentes de plantas que almacenan almidón (por ejemplo patata,
guisante, mandioca), prefiriéndose particularmente células de
plantas de patata.
Las células de plantas de la invención pueden
utilizarse para regeneración de plantas enteras.
Las plantas que pueden obtenerse por la
regeneración de las células de plantas transgénicas de la invención
son también materia que constituye el objeto de la presente
invención.
Adicionalmente, plantas que contienen las
células de plantas transgénicas de la invención son también materia
objeto de la invención.
Las plantas transgénicas pueden, en principio,
ser plantas pertenecientes a cualquier especie de plantas
dicotiledóneas.
Las mismas son preferiblemente plantas útiles,
es decir plantas que son cultivadas por el hombre para los
propósitos de nutrición o para fines técnicos, en particular
industriales. La invención se refiere preferiblemente a células de
plantas formadoras de fibras (por ejemplo, lino, cáñamo, algodón),
plantas oleaginosas (por ejemplo colza, girasol, soja), plantas que
almacenan azúcar (por ejemplo remolacha azucarera) y plantas que
almacenan proteínas (por ejemplo plantas leguminosas). En una
realización preferida adicional, la invención se refiere a plantas
forrajeras, en particular alfalfa, trébol, etc., y hortalizas (por
ejemplo tomate, lechuga, escarola). En otra realización preferida,
la invención se refiere a plantas que almacenan almidón (por ejemplo
patata, guisante, mandioca), prefiriéndose
particular-mente plantas de patata.
La presente invención se refiere también a un
método para la producción de células de plantas transgénicas
dicotiledóneas que sintetizan un almidón modificado, en donde una
célula de planta se modifica genéticamente por la introducción de
una o más moléculas de ácido nucleico extraño arriba definidas, cuya
presencia y/o expresión conduce a una reducción de la actividad de
las proteínas R1, BEI y BEII comparada con las células de plantas
correspondientes de las plantas de tipo salvaje, células que no
están modificadas genéticamente, en donde el almidón modificado se
caracteriza porque el mismo tiene un contenido de amilosa de al
menos 75% y un contenido reducido de fosfato al menos en un 50% en
comparación con almidón procedente de plantas correspondientes de
tipo salvaje que no han sido modificadas genéticamente.
La presente invención se refiere también a un
método para producir una planta transgénica dicotiledónea que
sintetiza almidón modificado, en donde
- I)
- una célula de la planta se modifica genéticamente por introducción de una o más moléculas de ácido nucleico extraño como se ha definido arriba cuya presencia y/o expresión conduce a una reducción de la actividad de proteínas R1, BEI y BEII comparada con células de plantas correspondientes de plantas de tipo salvaje, cuyas células no se han modificado genéticamente;
- II)
- se regenera una planta a partir de la célula producida de acuerdo con I); y
- III)
- opcionalmente se producen plantas adicionales a partir de la planta producida de acuerdo con el paso II),
en donde el almidón modificado se
caracteriza porque tiene un contenido de amilosa de al menos 75% y
un contenido reducido de fosfato al menos en un 50% comparado con
el almidón de plantas correspondientes de tipo salvaje que no han
sido modificadas
genéticamente.
\vskip1.000000\baselineskip
En otra realización del método de la invención,
los almidones modificados tienen además una distribución modificada
de las cadenas laterales y/o una morfología modificada de los
gránulos de almidón y/o un tamaño medio reducido de los gránulos de
almidón y/o forman un gel después de empastado en una solución
acuosa al 60% de CaCl_{2} (p/v), teniendo el gel una fuerza de
gel incrementada en comparación con un gel de almidón procedente de
plantas correspondientes de tipo salvaje que no se han modificado
genéticamente. Esto mismo ha sido ya dicho anteriormente en
conexión con las células de plantas de la invención, y es igualmente
aplicable a la modificación genética introducida de acuerdo con el
paso a).
La regeneración de plantas de acuerdo con el
paso b) puede realizarse utilizando métodos conocidos por las
personas expertas en la técnica. Plantas adicionales de los métodos
de la invención pueden producirse de acuerdo con el paso c) por
medio de propagación vegetativa (por ejemplo utilizando esquejes,
tubérculos, o por medio de cultivo de callo, y regeneración de
plantas enteras) o por propagación generativa. La propagación
generativa se realiza preferiblemente en condiciones controladas,
es decir plantas seleccionadas que tienen propiedades específicas
se cruzan entre sí y se propagan. Las personas expertas en la
técnica son evidentemente sabedoras de que, para la producción de
las células de plantas y plantas de la invención, pueden utilizarse
asimismo plantas transgénicas en las cuales la actividad de una o
dos de las proteínas mencionadas anteriormente ha sido ya reducida
y que, de acuerdo con el método de la invención, sólo tienen que
modificarse genéticamente de tal manera que se reduzca también la
actividad de la segunda o tercera proteína.
Adicionalmente, las personas expertas saben que
la super-transformación arriba mencionada no se
lleva a cabo necesariamente con transformantes primarios sino
preferiblemente con plantas transgénicas estables preseleccionadas
que han sido ya testadas ventajosamente respecto a, v.g. fertilidad,
expresión estable del gen extraño, hemicigosidad y heterocigosidad,
etc. en experimentos correspondientes.
La presente invención se refiere también a las
plantas que pueden obtenerse por los métodos de la invención.
La presente invención se refiere también a
material de propagación de plantas de la invención que contiene
células de plantas de la invención así como de las plantas
producidas de acuerdo con los métodos de la invención. Dentro del
significado de la presente invención, el término "material de
propagación" comprende partes de la planta que son adecuadas
para producir progenie por la ruta vegetativa o generativa. Ejemplos
que son adecuados para propagación vegetativa son esquejes,
cultivos de callo, rizomas o tubérculos. Otro material de
propagación comprende, por ejemplo, frutos, semillas, plantas de
semillero, protoplastos, cultivos de células y análogos. El
material de propagación está constituido preferiblemente por
semillas.
Adicionalmente, la presente invención se refiere
al uso de una o más moléculas de ácido nucleico extraño que
codifican proteínas que tienen la actividad enzimática de proteínas
R1, BEI y BEII y al uso de fragmentos de dichas moléculas de ácido
nucleico extraño para producir células de plantas o plantas de la
invención que sintetizan un almidón modificado.
En otra realización de la invención, las células
de plantas de la invención sintetizan un almidón modificado debido
al uso de acuerdo con la invención de una o más moléculas de ácido
nucleico extraño como se ha definido arriba, caracterizándose el
almidón modificado porque tiene un contenido de amilosa de al menos
75% y/o un contenido reducido de fosfato al menos en un 50%
comparado con el almidón de las plantas correspondientes de tipo
salvaje que no se han modificado genéticamente y/o una distribución
de las cadenas laterales y/o una morfología modificada de los
gránulos de almidón y/o un tamaño medio reducido de los gránulos de
almidón y/o un almidón modificado que forma un gel después de
empastado en una solución acuosa de CaCl_{2} al 60% (p/v),
teniendo el gel una fuerza de gel incrementada en comparación con un
gel de almidón procedente de células de plantas correspondientes de
tipo salvaje que no han sido modificadas genéticamente.
En otra realización, la presente invención se
refiere al uso de moléculas de ácido nucleico para la producción de
plantas de la invención, en donde las moléculas de ácido nucleico se
seleccionan de a) a e), desde (i) a (v) y desde (A) a (E), como se
ha definido arriba.
Como se ha explicado ya anteriormente, las
moléculas de ácido nucleico extraño pueden introducirse simultánea
o consecutivamente, es decir una tras otra, en el genoma de la
célula de la planta. La introducción simultánea de las moléculas de
ácido nucleico extraño ahorra tiempo y costes, es decir la
co-transformación en la cual, preferiblemente en un
experimento de transformación de acuerdo con los métodos de la
invención mencionados anteriormente, las moléculas de ácido
nucleico extraño se introducen en la célula de la planta, cuyas
presencia y opcionalmente expresión conducen a la reducción de la
actividad de una o más proteínas R1 existentes endógenamente en la
célula de la planta y a la reducción de la actividad de una o más
proteínas BEI que existen endógenamente en la célula de la planta y
a la reducción de la actividad de una o más proteínas BEII que
existen endógenamente en la célula de la planta en comparación con
células de plantas o plantas correspondientes de tipo salvaje,
cuyas células no se han modificado genéticamente.
Así pues, la presente invención se refiere
también a composiciones que contienen moléculas de ácido nucleico
como se han definido arriba seleccionadas de (a) a (e), de (i) a (v)
y de (A) a (E), siendo estas moléculas de ácido nucleico extraño
adecuadas para producir las células de plantas transgénicas y/o las
plantas transgénicas de la invención, en donde la presencia y/o
expresión de estas moléculas de ácido nucleico extraño en las
células de las plantas conduce a la reducción de la actividad de
las proteínas R1 y BEI y BEII comparada con las células de las
plantas o plantas correspondientes de tipo salvaje, cuyas células no
se han modificado genéticamente. En este caso, en la composición de
la invención, las moléculas de ácido nucleico cuya presencia y/o
expresión en la célula de la planta y/o la planta conduce a la
disminución de la actividad de las proteínas R1 y BEI y BEII
comparada con las células de plantas correspondientes de plantas de
tipo salvaje, cuyas células no se han modificado genéticamente,
puede estar contenida por separado o juntamente en una molécula de
ácido nucleico recombinante. En el primer caso, la composición de
la invención puede, por ejemplo, contener dos o más moléculas de
ácido nucleico recombinante y/o vectores cuya presencia conjunta en
la célula de la planta conduce a dicho fenotipo. En el último caso,
una molécula de ácido nucleico recombinante contiene la información
genética que conduce a la reducción de la actividad de las proteínas
R1 y BEI y BEII comparada con células de plantas correspondientes
de plantas de tipo salvaje, cuyas células no se han modificado
genéticamente.
En una molécula recombinante de este tipo, por
ejemplo, las moléculas de ácido nucleico extraño arriba descritas
cuya presencia y/o expresión en una planta conduce a la reducción de
la actividad de las proteínas R1 y BEI y BEII comparada con células
de plantas correspondientes de plantas de tipo salvaje, cuyas
células no se han modificado genéticamente, pueden estar presentes
como un gen quimérico o como genes separados. Ejemplos de tales
constructos dobles o múltiples han sido descritos frecuentemente en
la bibliografía.
Las moléculas de ácido nucleico recombinante
indicadas anteriormente pueden estar presentes en cualquier célula
hospedadora.
En otra realización, la presente invención se
refiere también por tanto a una célula hospedadora, en particular a
una célula de planta, que contiene una composición de la
invención.
Las células de plantas y plantas de la invención
sintetizan un almidón, en particular en sus órganos de
almacenamiento de almidón, que está modificado en sus propiedades
físico-químicas, es decir el contenido de fosfato y
el contenido de amilosa, y/o la distribución de las cadenas
laterales y/o el comportamiento de viscosidad y/o la morfología de
los gránulos de almidón y/o el tamaño medio de los gránulos de
almidón en comparación con el almidón sintetizado en plantas de
tipo salvaje.
Así pues, el almidón que puede obtenerse a
partir de las células de las plantas, plantas y/o material de
propagación de la invención es también materia objeto de la
invención.
El almidón de la invención se caracteriza porque
tiene un contenido de amilosa de al menos 75% y un contenido
reducido de fosfato al menos en un 50% en comparación con el almidón
de plantas correspondientes de tipo salvaje que no se han
modificado genéticamente.
El significado del término "fuerza de gel
incrementada" ha sido ya definido en conexión con la descripción
de las células de plantas de la invención.
En comparación con los almidones ricos en
amilosa que se conocen hasta ahora, en particular con los almidones
de patata ricos en amilosa, los almidones de la invención no sólo
están modificados en el contenido de amilosa, el contenido de
fosfato, la distribución de las cadenas laterales, el comportamiento
de viscosidad y el comportamiento de formación de gel, sino también
en una morfología modificada de los gránulos de almidón, que hace
que estos almidones sean más adecuados para ciertos propósitos de
aplicación.
Los almidones de la invención, en particular los
almidones de patata, podrían utilizarse, por ejemplo, en lugar de
almidones de arroz, dado que después de la fragmentación mecánica,
los almidones de la invención tienen un tamaño medio de los
gránulos de almidón que es similar al de los almidones de arroz.
Comparados con los almidones de arroz, los almidones de la
invención, en particular los almidones de patata, tienen sin
embargo la ventaja de que los mismos pueden sedimentarse en unidades
mayores que tienen la forma de un racimo de uvas (véase el Ejemplo
2) dado que los pequeños gránulos de almidón forman aglomeraciones
semejantes a racimos de uvas, lo cual puede ser ventajoso en la
extracción y el procesamiento del almidón y por lo cual los costes
pueden reducirse.
Preferiblemente, la morfología de los gránulos
del almidón de la invención se caracteriza por una aglomeración de
pequeños gránulos de almidón que tienen la forma de un racimo de
uvas.
En otra realización, los almidones de la
invención se caracterizan porque el tamaño medio del gránulo se ha
reducido en comparación con el tamaño medio del gránulo de las
plantas correspondientes de tipo salvaje que no se han modificado
genéticamente.
En el contexto de la presente invención, el
término "tamaño medio de gránulo" significa el tamaño de
gránulo que puede determinarse utilizando, por ejemplo, un
foto-sedimentómetro del tipo "Lumoset FS1" por
Retsch GmbH (véase más adelante).
En otra realización de la invención, un tamaño
medio del gránulo reducido es una reducción del tamaño medio del
gránulo de al menos 20%, preferiblemente de al menos 40% y más
preferiblemente de al menos 60%.
En otra realización, los almidones de la
invención se caracterizan por un tamaño medio de gránulo menor que
20 \mum, en particular menor que 18 \mum, preferiblemente menor
que 16 \mum y más preferiblemente de 10 a 15 \mum.
En otra realización de la invención, los
almidones de la invención se caracterizan porque la proporción de
gránulos que tienen un tamaño medio del gránulo menor que 20 \mum
es al menos 70%, preferiblemente al menos 75% y más preferiblemente
al menos 80%.
Después de la fragmentación mecánica del
almidón, que puede llevarse a cabo como se describe más adelante,
los almidones de la invención tienen una proporción de gránulos que
tienen un tamaño de gránulo menor que 20 \mum de al menos 90%,
preferiblemente de al menos 90% y más preferiblemente de al menos
95%.
En una realización particularmente preferida, el
almidón de la invención es un almidón de patata.
Además, la presente invención se refiere a un
método para producir los almidones de la invención que comprende el
paso de extraer el almidón de una planta (célula) de la invención
y/o de partes de dicha planta que almacenan almidón.
Preferiblemente, dicho método comprende también el paso de cosechar
las plantas cultivadas y/o las partes de almacenamiento de almidón
de dichas plantas antes de extraer el almidón y, de modo
particularmente preferible, el paso de cultivar las plantas de la
invención antes de la cosecha.
Las personas expertas en la técnica conocen
métodos para extraer el almidón de las plantas o de las partes de
almacenamiento de almidón de las plantas. Adicionalmente, se han
descrito métodos para extraer el almidón de diversas plantas que
almacenan almidón, v.g. en ``Starch: Chemistry and Technology
(compiladores: Whistler, BeMiller and Paschall (1994), 2º edición,
Academic Press Inc. Londres Ltd.; ISBN
0-12-746270-8;
véase, p.ej. el Capítulo XII, páginas 412-468:
Maize and Sorghum Starches: Production; por Wason; Capítulo XIII,
páginas 469-479: almidones de mandioca, arrurruz y
sagú, producción; por Corbishley and Miller; Capítulo XIV, páginas
479-490: almidón de patata: producción y usos; por
Mitch; Capítulo XV, páginas 491 a 506: almidón de trigo:
producción, modificación y usos; por Knight y Oson; y Capítulo XVI,
páginas 507 a 528: almidón de arroz: producción y usos; por Rohmer y
Klem; almidón de maíz: Eckhoff et al., Cereal Chem. 73
(1996) 54-57), la extracción del almidón de maíz en
escala industrial se realiza generalmente por molienda húmeda. Los
aparatos utilizados usualmente en los procesos para extracción de
almidón de materiales de plantas son separadores, decantadores,
hidrociclones, secadores de pulverización y secadores de lecho
fluidizado.
Además, el almidón que puede obtenerse
utilizando el método de la invención arriba mencionado es también
materia que constituye objeto de la invención.
Los almidones de acuerdo con la invención pueden
modificarse posteriormente por procesos conocidos por las personas
expertas y son adecuados, en sus formas sin modificar o modificada,
conocidas por las personas expertas y son adecuados, en sus formas
no modificada o modificada, para una diversidad de aplicaciones en
el sector alimentario o no alimentario.
Las figuras muestran:
Figura 1: Representación esquemática del vector
de expresión ME 5/6 como se describe adicionalmente más
adelante.
Figura 2: Vista al microscopio óptico de
gránulos de almidón de plantas de patata de tipo salvaje.
Figura 3: Vista al microscopio óptico de
gránulos de almidón de plantas de patata 072VL036 que tienen una
expresión génica reducida de los genes R1 y BEI.
Figura 4: Vista al microscopio óptico de
gránulos de almidón de plantas de patata 203MH010 de acuerdo con la
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron en los ejemplos los métodos
siguientes:
Se aisló almidón de plantas de patata de acuerdo
con técnicas estándar y se determinó la relación de amilosa a
amilopectina utilizando el método descrito por
Hovenkamp-Hermelink et al. (Potato Research
31, (1988), 241-246).
Las posiciones C2, C3 y C6 de las unidades de
glucosa pueden estar fosforiladas en el almidón. Para determinación
del contenido de C6-P del almidón, se hidrolizan 50
mg de almidón en 500 \mul de HCl 0,7 M durante 4 horas a 95ºC. A
continuación, las mezclas se centrifugan durante 10 min a 15.500 g y
se recogen los sobrenadantes. Se mezclan 7 \mul de sobrenadantes
con 193 \mul de tampón de imidazol (imidazol 100 mM, pH 7,4;
MgCl_{2} 5 mM, EDTA 1 mM y NAD 0,4 mM). La medida se realizó en
el fotómetro a 640 nm. Después de establecer una absorción básica,
la reacción enzimática se inició por adición de 2 u de
glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa
(de Leuconostoc mesenteroides, Boehringer Mannheim). El cambio en
la absorción es direccionalmente proporcional a la concentración
del contenido de G-6-P del
almidón.
El contenido total de fosfato se determinó de
acuerdo con el método de Ames (Methods in Enzymology VIII, (1966),
115-118).
Se añaden 30 \mul de solución etanólica de
nitrato de magnesio a aproximadamente 50 mg de almidón y se calcinan
durante 3 horas a 500ºC en un horno de mufla. Se añaden 300 \mul
de ácido clorhídrico 0,5 M al residuo y se incuba durante 30 min a
60ºC. A continuación, se completa una parte alícuota hasta 300
\mul de ácido clorhídrico 0,5 M, se añade a una mezcla de 100
\mul de ácido ascórbico al 10% y 600 \mul de molibdato de
amonio al 0,42% en ácido sulfúrico 2 M y se incuba durante 20 min a
45ºC.
A continuación, se realiza una medida
fotométrica a 820 nm, utilizando una serie de calibración de fosfato
como estándar.
Se disuelven 2 g de almidón (TS) en 25 ml de una
solución acuosa al 60% (p/v) de CaCl_{2} y se realiza el
empastado en un aparato RVA (programa de temperatura: véase el
apartado d) "Determinación de las propiedades de viscosidad por
medio de un Analizador Visco Rapid (RVA)") y se guarda a
continuación en un recipiente cerrado durante 24 horas a la
temperatura ambiente. Las muestras se fijan bajo una sonda (punzón
de disco con una superficie plana) de un analizador de textura
TA-TX2 por Stable Micro Systems (Surrey, Reino
Unido) y se determina la fuerza de gel utilizando los parámetros
siguientes:
- - Velocidad de test
- 0,5 mm/s
- - Profundidad de penetración
- 7 mm
- - Área de contacto
- 113 mm^{2}
- - Presión
- 2 g
Se añaden 2 g de almidón (TS) a 25 ml de agua y
se utilizan para el análisis en un Analizador Visco Rapid (Newport
Scientific Pty Ltd., Investment Support Group, Warriewod NSW 2102,
Australia). El aparato se utiliza de acuerdo con las instrucciones
del fabricante. Para determinar la viscosidad de la solución acuosa
del almidón, la suspensión acuosa se calienta primeramente a 50ºC
durante 1 min, y se calienta luego desde 50 a 95ºC a una velocidad
de 12ºC por minuto. Subsiguientemente, la temperatura se mantiene a
95ºC durante 2,5 min. A continuación, se enfría la solución desde
95 a 50ºC a una velocidad de 12ºC por minuto. La viscosidad se
determina después del transcurso total del tiempo.
El contenido de glucosa, fructosa y sacarosa se
determina de acuerdo con el método descrito por Stitt et al.
(Methods in Enzymology 174, (1989), 518-552).
Para separar amilosa de amilopectina, se
disuelven 200 mg de almidón en recipientes de reacción de 50 ml con
12 ml de DMSO al 90% (v/v) en agua. Después de añadir 3 volúmenes de
etanol, el precipitado se separa por una centrifugación durante 10
minutos a aproximadamente 1800 g a la temperatura ambiente (TA). El
sedimento se lava luego con 30 ml de etanol, se seca y se disuelve
en 40 ml de solución de NaCl al 1% (p/v) a 75ºC. Después de enfriar
la solución a 30ºC, se añaden lentamente aprox. 90 mg de timol y
esta solución se incuba durante al menos 60 h a 30ºC. A
continuación, se centrifuga la solución durante 30 min a 2000 g
(TA). Se añaden luego 3 volúmenes de etanol al sobrenadante y la
amilopectina que precipita se separa por centrifugación durante 5
min a 2000 g (TA). El sedimento (amilopectina) se lava luego con
etanol y se seca utilizando acetona. Por adición de DMSO al
sedimento, se prepara una solución al 1%, 200 \mul de la cual se
añaden a 345 \mul de agua, 10 \mul de acetato de sodio 0,5 M
(pH 3,5) y 5 \mul de isoamilosa (dilución de 1:10; Megazyme) y se
incuba durante aproximadamente 16 horas a 37ºC. Una dilución acuosa
1:5 de esta digestión se filtra luego con un filtro de 0,2 \mum y
se analizan 100 \mul del filtrado por medio de cromatografía de
intercambio iónico (HPAEC-PAD, Dionex). La
separación se realiza con una columna PA-100 (con
una precolumna correspondiente), y la detección se lleva a cabo
amperométricamente. Las condiciones de elución son como sigue:
La proporción relativa de cadenas laterales
cortas en la proporción global de todas las cadenas laterales se
determina por determinación de la proporción en porcentaje que tiene
una cierta cadena lateral en la proporción global de todas las
cadenas laterales. La proporción global de todas las cadenas
laterales se determina por la determinación de la altura total de
los picos que representan los grados de polimerización de DP 6 a 40
en el cromatograma HPLC. La proporción en porcentaje que supone una
cierta cadena lateral en la proporción global de todas las cadenas
laterales se determina por la determinación de la relación de la
altura del pico que representa esta cadena lateral en el
cromatograma HPLC a la altura global de todos los picos que tienen
un DP de 6 a 40. Se utilizó el programa Chromeleon 6.20 de Dionex,
EE.UU., para determinar las alturas de pico. Los parámetros del
software de evaluación que tuvieron que ajustarse eran como
sigue:
Se extrajo almidón de los tubérculos de patata
de acuerdo con métodos estándar y se lavó varias veces con agua en
un cubo de 10 l (relación altura del cubo/diámetro del cubo = aprox.
1,1). Para obtener las muestras de almidón que se sometieron
finalmente a la determinación del tamaño de los gránulos, los
almidones se dejaron en reposo durante aproximadamente 4 h después
del lavado para alcanzar una sedimentación lo más completa posible
de los almidones.
El tamaño de los gránulos se determinó luego por
medio de un foto-sedimentómetro del tipo "Lumosed
FS1" fabricado por Retsch GmbH, Alemania, utilizando el software
V.2.3. Los ajustes del software eran como sigue:
La distribución del tamaño de los gránulos se
determinó en una solución acuosa de acuerdo con las instrucciones
del fabricante, y basada en la bibliografía de v.g. H. Pitsch,
Korngrössenbestimmung; LABO-1988/3 Fachzeitschrift
für Labortechnik, Darmstadt.
Aproximadamente 0,5 g de cada almidón se
pusieron en un molino de café (fabricante: Mellert, tipo: M85,
Alemania) y se molieron 6 veces durante 30 s cada vez. Entre dos
intervalos, se interrumpió la molienda durante 20 s cada vez. La
distribución del tamaño de los gránulos se determinó como se
describe en el apartado g).
Para determinar la capacidad de fijación de agua
(WBC), se pesó el sobrenadante después de separar la porción
soluble por centrifugación del almidón hinchado a 70ºC. La capacidad
de fijación de agua (WBC) del almidón se ajustó en relación a la
porción pesada del almidón corregida por la masa soluble.
WBC (g/g) =
(residuo - (porción pesada - porción soluble))/(porción pesada -
porción
soluble).
El vector de expresión ME5/6 (véase Fig. 1) se
utilizó en los ejemplos:
pGSV71 es un derivado del plásmido pGSV7 que se
deriva del vector intermedio pGSV1. pGSV1 es un derivado de
pGSC1700, cuya construcción ha sido descrita por Cornelissen y
Vanderwiele (Nucleic Acids Research 17, (1989),
19-25). pGSV1 se obtuvo a partir de pGSC1700 por
deleción del gen de resistencia a la carbenicilina y deleción de
las secuencias de la región TL-DNA del plásmido
pTiB6S3. pGSV7 contiene el origen de replicación del plásmido
pBR322 (Bolivar et al., Gene 2, (1977),
95-113) así como el origen de replicación del
plásmido pSV1 de Pseudomonas (Itoh et al., Plasmid
11, (1984), 206). pGSV7 contiene adicionalmente el gen marcador
seleccionable aadA del transposón Tn1331 de Klebsiella
pneumoniae que confiere resistencia a los antibióticos
espectinomicina y estreptomicina (Tolmasky, Plasmid 24(3),
(1990), 218-226; Tolmasky and Crosa, Plasmid
29(1), (1993), 31-40).
El plásmido pGSV71 se obtuvo por clonación de un
gen quimérico bar entre las regiones límite de pGSV7. El gen
quimérico bar contiene la secuencia promotora del virus del
mosaico de la coliflor para iniciar la transcripción (Odell et
al., Nature 313, (1985), 180), el gen bar de
Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al., EMBO J.
6, (1987), 2519-2523) y la región 3' no traducida
del gen de la nopalina-sintasa del
T-DNA de pTiT37, para terminar la transcripción y la
poliadenilación. El gen bar confiere resistencia al
herbicida glufosinato de amonio.
En la posición 198-222, el
T-DNA contiene la secuencia del borde derecho del
TL-DNA del plásmido pTiB6S3 (Gielen et al.,
EMBO J. 3, (1984), 835-846). Existe una secuencia
polienlazadora entre los nucleótidos 223 y 249. Los nucleótidos
250-1634 contienen la región promotora P35S3 del
virus del mosaico de la coliflor (Odell et al., véase
arriba). La secuencia codificante del gen de resistencia a la
fosfinotricina (bar) de Streptomyces hygroscopicus
(Thompson et al., (1987), véase arriba) está contenida entre
los nucleótidos 1635 y 2186. Los dos codones terminales en el
extremo 5' del gen bar de tipo salvaje se reemplazaron por
los codones ATG y GAC. Existe una secuencia polienlazadora entre
los nucleótidos 2187 y 2205. El fragmento TaqI de 260 pb del
extremo 3' no traducido del gen de nopalina-sintasa
(3' nos) del T-DNA del plásmido pTiT37 (Depicker
et al., J. Mol. Appl. Genet. 1, (1986),
561-573 está localizado entre los nucleótidos 2206 y
2465. Los nucleótidos 2466-2519 contienen una
secuencia polienlazadora. La secuencia del borde izquierdo del
TL-DNA de pTiB6S3 (Gielen et al., EMBO J. 3,
(1984), 835-846 está localizada entre los
nucleótidos 2520 y 2544.
El vector pGSV71 se escindió luego con la enzima
PstI y se hizo romo. El promotor B33 y la casete ocs, se
escindieron del vector pB33-Kan como un fragmento
EcoRI-HindIII, se hicieron romos y se insertaron en
el vector pGSV71 que se había escindido con PstI y se había
hecho romo. El vector obtenido sirvió como vector de partida para
la construcción de ME5/6. Un oligonucleótido que contenía los sitios
de escisión EcoRI, PacI, SpeI, SrfI,
SpeI, NotI, PacI y EcoRI se insertó en
el sitio de escisión PstI entre el promotor B33 y el
elemento ocs del vector M4/6 por duplicación del sitio de escisión
de PstI. El vector de expresión obtenido se designó
ME5/6.
pSK-Pac es un derivado de pSK
Bluescript (Stratagene, EE.UU.) en el cual se insertaron sitios de
escisión con PacI que flanqueaban el sitio de clonación
múltiple (MCS).
Los ejemplos siguientes ilustran la
invención:
Para producir plantas transgénicas que tienen
una actividad reducida de una proteína BEI, R1 y BEII, se generaron
primeramente plantas transgénicas en las cuales la actividad de BEI
y la cantidad de proteína R1 eran reducidas. Para este propósito,
tanto el T-DNA del plásmido
pB33-aR1-Hyg como el
T-DNA del plásmido
pB33-a-BE1-Kan se
transfirieron simultáneamente a plantas de patata utilizando
Agrobacterias como ha sido descrito por Rocha-Sosa
et al. (EMBO J. 8, (1989), 23-29).
Para construir el plásmido
pB33-aRI-Hyg y el plásmido
pB33-aBEI-Kan, se construyeron
primeramente los vectores de expresión pB33-Kan y
pb33-Hyg, respectivamente. Para este propósito, el
promotor del gen patatín B33 de Solanum tuberosum
(Rocha-Sosa et al., 1989, véase arriba) se
ligó como fragmento Drat (nucleótidos -1512 a +14) en el
vector pUC19 (No. de Acceso a GenBank M77789) que se había escindido
con SstI, habiéndose hecho romos los extremos de dicho
vector por medio de la polimerasa T4-DNA. De este
modo se obtuvo el plásmido pUC19-B33. El promotor
B33 se escindió de este plásmido con EcoRI y SmaI y se
ligó al vector pBinAR que se había escindido correspondientemente.
De este modo, se obtuvo el vector de expresión de plantas
pB33-Kan. El plásmido pBinAR es un derivado del
plásmido vector pBin19 (Bevan, Nucl. Acids Research 12, (1984),
8711-8721) y fue construido por Höfgen y Willmitzer
(Plant. Sci. 66, (1990), 221-230). Partiendo del
plásmido pB33-Kan, el fragmento
EcoRI-HindIII que comprendía el vector B33, una
porción del polienlazador y el terminador ocs de
pB33-Kan se escindieron y se ligaron al vector
pBIB-Hyg (Becker, Nucleic Acids Res. 18 (1), (1990),
203) que se había escindido correspondientemente. Como resultado,
se obtuvo pB33-Hyg. A continuación, un fragmento
Asp718 de aproximadamente 2000 pb del plásmido pRL1 que
contiene la secuencia de nucleótidos de aproximadamente +2850 a
aproximadamente +4850 del cDNA R1 de Solanum tuberosum
(Lorberth, Charakterisierung von RL1: ein neues Enzym des
Stärkemetabolismus. Dissertation Freie Universität Berlin, en
orientación antisentido en el sitio de escisión Asp718 del
plásmido descrito anteriormente. El plásmido resultante se designó
pB33-aR1-Hyg. Para construir el
plásmido pB33-aBE1-Kan, análogamente
a la estrategia arriba mencionada, la región promotora del gen
patatín-clase I B33 de Solanum tuberosum - un
fragmento SmaI/HindIII que tiene una longitud de
aproximadamente 3100 pb y contiene un cDNA parcial para la enzima
BE1 de patata (Kossmann, Klonierung und funktionelle Analyse von
Genen codierend für am Kohlenhydratstoffwechsel der Kartoffel
beteiligte Proteine, Dissertation Technische Universität Berlin,
(1992)) - se hizo romo primeramente y se insertó en el sitio de
escisión SmaI del vector pBinAR-Hyg (véase
arriba) en orientación antisentido con respecto al promotor
B33.
Después de la transformación, pudieron
identificarse diferentes líneas de plantas transgénicas de patata
por medio de análisis mediante transferencia Western, teniendo los
tubérculos de dichas patatas un contenido de la proteína R1 que se
había reducido significativamente. Análisis ulteriores demostraron
que el almidón aislado de la línea 36 tenía el contenido máximo de
amilosa de todos los transformantes examinados con independencia
unos de otros.
Plantas de dicha línea se transformaron luego
con el plásmido pGSV71-aBE2-basta
como ha sido descrito por Rocha-Sosa et al.
(EMBO J. 8 (1989), 23-29).
El plásmido
pGSV31-aBE2-basta se construyó por
cribado de acuerdo con procedimientos estándar de una genoteca de
cDNA de patata específica del tubérculo con un fragmento de DNA que
se había amplificado por RT-PCR (iniciador 1 (SEQ
ID NO. 1): 5'-gggggtgttggctttgacta e iniciador 2
(SEQ ID NO: 2) 5'-cccttctcctcctaatccca; Stratagene,
sistema RT-PCR ProSTAR^{TM} HF
Single-Tube) con RNA total de tubérculos como molde.
De este modo, un fragmento de DNA que tiene un tamaño de
aproximadamente 1250 pb (véase SEQ ID NO. 3) y que se subclonó luego
como un fragmento EcoRV-SmaI en el sitio de
escisión EcoRV del vector de clonación
pSK-Pac (véase arriba) y se ligó finalmente como
fragmento PacI en el vector de expresión ME5/6 (Figura 1) en
orientación antisentido. Como resultado, se obtuvo el plásmido
pGSV71-aBE2-basta.
A partir de plantas que se obtuvieron luego por
la transformación con el plásmido
pGSV71-aBE2-basta y que exhibían
una expresión reducida de los genes R1, BEI y BEII, plantas que
fueron designadas como plantas 203MH, se tomaron muestras de tejido
de tubérculos de los transformantes independientes y se determinó su
contenido de amilosa (véase métodos). Los almidones de las líneas
independientes cuyos tubérculos tenían el mayor contenido de
amilosa se utilizaron para analizar ulteriormente las propiedades
del almidón (véase Ejemplo 2).
El almidón de las diferentes líneas
independientes de la transformación 203 MH descritas en el Ejemplo 1
se aisló de los tubérculos de patata. A continuación, se analizaron
las propiedades fisicoquímicas de este almidón. Los resultados de
la caracterización de los almidones modificados se muestran en Tabla
1 (Tab. 1) para una selección ilustrativa de ciertas líneas de
plantas.
Leyenda:
R1 = enzima R1, BEI = enzima ramificadora I,
BEII = enzima ramificadora II, as = antisentido
RVA = Analizador Visco Rapid, max = viscosidad
máxima, min = viscosidad mínima
fin = viscosidad al final de la medida, set =
reajuste = diferencia de min y fin
T = temperatura de empastado
Los valores en % se refieren al tipo salvaje (=
100%) excepto para el contenido de amilosa.
\vskip1.000000\baselineskip
La distribución de las cadenas laterales de la
amilopectina se analizó como se ha descrito arriba. La tabla
siguiente (Tab. 2) contiene un resumen de las proporciones de las
alturas de pico individuales de los cromatogramas HPAEC dentro de
la altura global de pico de las plantas de tipo salvaje (Desirée),
de plantas 072VL036 (plantas de patata que tenían una expresión
génica reducida de los genes R1 y BEI) y de líneas seleccionadas de
las transformaciones 203MH (véase el Ejemplo 1: plantas de patata
que tenían una expresión génica reducida de los genes R1, BEI y
BEII):
Si se compara la proporción de las alturas de
pico de las longitudes de cadena individuales (indicada en DP) en
la altura global de pico, puede verse un desplazamiento considerable
hacia cadenas laterales que tienen un DP > 26 con relación a la
distribución de las cadenas laterales de la amilopectina de las
plantas 203MH comparada con la amilopectina de las plantas de tipo
salvaje y también con las plantas 072VL. Si se calcula el valor
medio a partir de las proporciones relativas de las cadenas
laterales que tienen un DP de 26 a DP 31, se obtienen los valores
siguientes (Tab. 3):
\vskip1.000000\baselineskip
La amilopectina de las plantas 203MH se
caracteriza por una proporción incrementada de cadenas laterales que
tienen un DP de 26 a DP 31 comparado con la amilopectina de las
plantas de tipo salvaje y también de las plantas 072VL.
Adicionalmente, se examinó la morfología de los
gránulos de almidón:
La superficie de los gránulos de almidón de las
plantas de tipo salvaje aparece lisa bajo el microscopio óptico. La
forma de los gránulos es redondeada a ovalada, sin que sean
apreciables "estructuras internas". Además, puede verse una
distribución uniforme de los diferentes tamaños de gránulo (véase
Fig. 2).
Los gránulos de almidón de las plantas 072VL036
(Fig. 3) tienen un aspecto muy heterogéneo. Únicamente algunos
gránulos parecen lisos, otros tienen estrías, y algunos muestran
"aglomeraciones semejantes a racimos de uvas". Otros gránulos
tienen estructuras cruzados semejantes a rebajos. El espectro de los
tamaños de gránulo es amplio, constituyendo los gránulos más
pequeños una mayor proporción que en el caso de los gránulos de
almidón de las plantas de tipo salvaje.
La morfología de los gránulos de la línea
203MH010 (Fig. 4) es asimismo heterogénea, aunque menos evidente
que en las plantas 072VL036. La superficie de casi todos los
gránulos tiene estrías, y la mayoría de los gránulos exhiben
aglomeraciones semejantes a racimos de uvas. En ocasiones, pueden
verse partículas que se semejan a fragmentos de estas estructuras
aglomeradas. La distribución de tamaños es relativamente amplia,
aunque dominan los gránulos más pequeños.
Adicionalmente, se determinó el tamaño de los
gránulos utilizando un foto-sedimentómetro del tipo
"Lumosed" fabricado por Retsch GmbH, Alemania.
Se determinó el tamaño medio de los gránulos
tanto de las muestras de almidón sin tratar como de las muestras
que, antes de la determinación del tamaño de gránulo, se sometieron
a una fragmentación mecánica global de 3 minutos (para la
realización véase anteriormente) (Tab. 4). Además, se determinó la
proporción de los gránulos de almidón que tenían un tamaño de <
20 \mum (Tab. 5)
\vskip1.000000\baselineskip
Tamaño medio de gránulo [\mum]
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Proporción de gránulos < 20 \mum [%]
Los resultados demuestran que tanto el tamaño
medio de los gránulos como la proporción en porcentaje de gránulos
de almidón < 20 \mum de los almidones de la invención difieren
significativamente de los almidones de tipo salvaje así como de los
almidones derivados de las plantas 072VL036.
Después de la fragmentación mecánica de los
almidones, estas diferencias son aún más significativas que sin el
tratamiento mecánico.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Aventis CropScierice GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Plantas Transgénicas Que Sintetizan
Almidón Rico En Amilosa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> F 2027 PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE 10 12 8363.6
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-06-12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggggtgttg gctttgacta
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccttctcct cctaatccca
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1255
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(928)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 309
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5061
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (216)..(4607)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1464
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1641
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1638)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 546
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 814
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (27)
1. Una célula de planta transgénica
dicotiledónea que comprende una o más moléculas de ácido nucleico
extraño cuya presencia y/o expresión conduce a la reducción de la
actividad de una o más proteínas que catalizan la fosforilación del
almidón en una reacción de tipo diquinasa (proteínas R1) que tiene
lugar endógenamente en la célula de la planta, y a la reducción de
la actividad de una o más proteínas de la enzima ramificadora
isoforma I (BEI) que tiene lugar endógenamente en la célula de la
planta, y a la reducción de la actividad de una o más proteínas de
la enzima ramificadora isoforma II (BEII) que tiene lugar
endógenamente en la célula de la planta en comparación con células
de plantas correspondientes de plantas de tipo salvaje, cuyas
células no han sido modificadas genéticamente,
en donde dicha célula de planta transgénica
sintetiza un almidón modificado que tiene un contenido de amilosa
determinado de acuerdo con el método de Hovenkamp & Hermelink
(Potato Research 31, (1988), 241-246) de al menos
75% y un contenido de fosfato que está reducido al menos en un 50%
en comparación con el almidón de las células de plantas
correspondientes de plantas de tipo salvaje, cuyas células no han
sido modificadas genéticamente, y
en donde dichas moléculas de ácido nucleico
extraño cuyas presencia y/o expresión conducen a la reducción de la
actividad de una o más proteínas R1 se seleccionan del grupo
constituido por
- a)
- moléculas de DNA que codifican al menos un RNA antisentido que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína R1;
- b)
- moléculas de DNA que, por un efecto de cosupresión, conducen a la reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína R1;
- c)
- moléculas de DNA que codifican al menos una ribozima que escinde específicamente transcritos de genes endógenos que codifican proteínas R1;
- d)
- moléculas de ácido nucleico que se introducen por medio de mutagénesis in vivo y que conducen a una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga en los genes que codifican las proteínas R1 endógenas, en donde la mutación o inserción conduce a una reducción de la expresión de genes que codifican proteínas R1, o a la síntesis de R1 inactiva; y
- e)
- moléculas de DNA que codifican simultáneamente al menos un RNA antisentido y al menos un RNA de sentido, en donde dicho RNA antisentido y dicho RNA de sentido forman una molécula de RNA bicatenario que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde dicho RNA de sentido y dicho RNA antisentido contienen al menos parte de la secuencia de un gen endógeno que codifica proteína R1;
en donde dichas moléculas de ácido nucleico
extraño cuyas presencia y/o expresión conducen a la reducción de la
actividad de una o más proteínas BEI se seleccionan del grupo
constituido por
- i)
- moléculas de DNA que codifican al menos un RNA antisentido que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEI, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEI;
- ii)
- moléculas de DNA que, por un efecto de cosupresión, conducen a la reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEI, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEI;
- iii)
- moléculas de DNA que codifican al menos una ribozima que escinde específicamente transcritos de genes endógenos que codifican proteínas BEI;
- iv)
- moléculas de ácido nucleico que se introducen por medio de mutagénesis in vivo y que conducen a una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga en los genes que codifican las proteínas BEI, en donde la mutación o inserción conduce a una reducción de la expresión de genes que codifican proteínas BEI, o a la síntesis de proteínas BEI inactivas; y
- v)
- moléculas de DNA que codifican simultáneamente al menos un RNA antisentido y al menos un RNA de sentido, en donde dicho RNA antisentido y dicho RNA de sentido forman una molécula de RNA bicatenario que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteína BEI; en donde dicho RNA de sentido y dicho RNA antisentido contienen al menos parte de la secuencia de un gen endógeno que codifica proteína BEI; y
en donde dichas moléculas de ácido nucleico
extraño cuyas presencia y/o expresión conducen a la reducción de la
actividad de una o más proteínas BEII se seleccionan del grupo
constituido por
- A)
- moléculas de DNA que codifican al menos un RNA antisentido que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEII, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEII;
- B)
- moléculas de DNA que, por un efecto de cosupresión, conducen a la reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEII, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEII;
- C)
- moléculas de DNA que codifican al menos una ribozima que escinde específicamente transcritos de genes endógenos que codifican proteínas BEII;
- D)
- moléculas de ácido nucleico que se introducen por medio de mutagénesis in vivo y que conducen a una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga en los genes que codifican proteínas BEII endógenas, en donde la mutación o inserción conduce a una reducción de la expresión de los genes que codifican proteínas BEII, o a la síntesis de proteínas BEII inactivas; y
- E)
- moléculas de DNA que codifican simultáneamente al menos un RNA antisentido y al menos un RNA de sentido, en donde dicho RNA antisentido y dicho RNA de sentido forman una molécula de RNA bicatenario que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEII, en donde dicho RNA de sentido y dicho RNA antisentido contienen al menos parte de la secuencia de un gen endógeno que codifica proteína BEII.
\vskip1.000000\baselineskip
2. La célula de planta transgénica de acuerdo
con la reivindicación 1, en donde el almidón modificado se
caracteriza porque tiene una distribución modificada de las
cadenas laterales en comparación con el almidón sintetizado en las
plantas correspondientes de tipo salvaje.
3. La célula de planta transgénica de acuerdo
con la reivindicación 1 ó 2, que es una célula de planta de
patata.
4. Una planta transgénica dicotiledónea que
contiene células de plantas de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
5. Un método para producir una célula de planta
transgénica dicotiledónea que sintetiza un almidón modificado, en
donde una célula de planta dicotiledónea se modifica genéticamente
por la introducción de una o más moléculas de ácido nucleico
extraño cuyas presencia y/o expresión conducen a la reducción de la
actividad de las proteínas R1, BEI y BEII en comparación con
células de plantas correspondientes de plantas de tipo salvaje,
células que no se han modificado genéticamente,
en donde el almidón modificado se
caracteriza porque tiene un contenido de amilosa determinado
de acuerdo con el método de Hovenkamp-Hermelink
et al. (Potato Research 31, (1988), 241-246)
de al menos 75% y un contenido de fosfato que se ha reducido al
menos en un 50% en comparación con el almidón de las plantas de tipo
salvaje correspondientes que no se han modificado genéticamente,
y
en donde dichas moléculas de ácido nucleico
extraño cuyas presencia y/o expresión conducen a la reducción de la
actividad de una o más proteínas R1 se seleccionan del grupo
constituido por:
- a)
- moléculas de DNA que codifican al menos un RNA antisentido que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína R1;
- b)
- moléculas de DNA que, por un efecto de cosupresión, conducen a la reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína R1;
- c)
- moléculas de DNA que codifican al menos una ribozima que escinde específicamente transcritos de genes endógenos que codifican proteínas R1;
- d)
- moléculas de ácido nucleico que se introducen por medio de mutagénesis in vivo y que conducen a una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga en los genes que codifican las proteínas R1 endógenas, en donde la mutación o inserción conduce a una reducción de la expresión de genes que codifican proteínas R1, o a la síntesis de R1 inactiva; y
- e)
- moléculas de DNA que codifican simultáneamente al menos un RNA antisentido y al menos un RNA de sentido, en donde dicho RNA antisentido y dicho RNA de sentido forman una molécula de RNA bicatenario que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde dicho RNA de sentido y dicho RNA antisentido contienen al menos parte de la secuencia de un gen endógeno que codifica proteína R1;
en donde dichas moléculas de ácido nucleico
extraño cuyas presencia y/o expresión conducen a la reducción de la
actividad de una o más proteínas BEI se seleccionan del grupo
constituido por
- i)
- moléculas de DNA que codifican al menos un RNA antisentido que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEI, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEI;
- ii)
- moléculas de DNA que, por un efecto de cosupresión, conducen a la reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEI, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEI;
- iii)
- moléculas de DNA que codifican al menos una ribozima que escinde específicamente transcritos de genes endógenos que codifican proteínas BEI;
- iv)
- moléculas de ácido nucleico que se introducen por medio de mutagénesis in vivo y que conducen a una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga en los genes que codifican las proteínas BEI, en donde la mutación o inserción conduce a una reducción de la expresión de los genes que codifican las proteínas BEI, o a la síntesis de proteínas BEI inactivas; y
- v)
- moléculas de DNA que codifican simultáneamente al menos un RNA antisentido y al menos un RNA de sentido, en donde dicho RNA antisentido y dicho RNA de sentido forman una molécula de RNA bicatenario que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEI, en donde dicho RNA de sentido y dicho RNA antisentido contienen al menos parte de la secuencia de un gen endógeno que codifica proteína BEI; y
en donde dichas moléculas de ácido nucleico
extraño cuyas presencia y/o expresión conducen a la reducción de la
actividad de una o más proteínas BEII se seleccionan del grupo
constituido por
- A)
- moléculas de DNA que codifican al menos un RNA antisentido que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEII, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEII;
- B)
- moléculas de DNA que, por un efecto de cosupresión, conducen a la reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEII, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEII;
- C)
- moléculas de DNA que codifican al menos una ribozima que escinde específicamente transcritos de genes endógenos que codifican proteínas BEII;
- D)
- moléculas de ácido nucleico que se introducen por medio de mutagénesis in vivo y que conducen a una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga en los genes que codifican proteínas BEII exógenas, en donde la mutación o inserción conduce a una reducción de la expresión de los genes que codifican las proteínas BEII, o a la síntesis de proteínas BEII inactivas; y
- E)
- moléculas de DNA que codifican simultáneamente al menos un RNA antisentido y al menos un RNA de sentido, en donde dicho RNA antisentido y dicho RNA de sentido forman una molécula de RNA bicatenario que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEII, en donde dicho RNA de sentido y dicho RNA antisentido contienen al menos parte de la secuencia de un gen endógeno que codifica proteína BEII.
\vskip1.000000\baselineskip
6. El método de la reivindicación 5, en donde la
célula de planta transgénica es una célula de planta de patata.
7. Un método para producir una planta
transgénica dicotiledónea que sintetiza un almidón modificado, en
donde el almidón modificado se caracteriza porque tiene un
contenido de amilosa determinado de acuerdo con el método de
Hovenkamp-Hermelink et al. (Potato Research
31, (1988), 241-246) de al menos 75% y un contenido
de fosfato que está reducido al menos en un 50% en comparación con
el almidón de las plantas correspondientes de tipo salvaje que no
se han modificado genéticamente, en donde
- I)
- una célula de planta dicotiledónea se modifica genéticamente por introducción de una o más moléculas de ácido nucleico extraño cuyas presencia y/o expresión conducen a la reducción de la actividad de proteínas R1, BEI y BEII comparada con células de plantas correspondientes de plantas de tipo salvaje, cuyas células no se han modificado genéticamente;
- II)
- se regenera una planta a partir de la célula producida de acuerdo con I); y
- III)
- opcionalmente se producen plantas adicionales a partir de la planta producida de acuerdo con el paso II),
en donde dichas moléculas de ácido nucleico
extraño cuyas presencia y/o expresión conducen a la reducción de la
actividad de una o más proteínas R1 se seleccionan del grupo
constituido por:
- a)
- moléculas de DNA que codifican al menos un RNA antisentido que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína R1;
- b)
- moléculas de DNA que, por un efecto de cosupresión, conducen a la reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína R1;
- c)
- moléculas de DNA que codifican al menos una ribozima que escinde específicamente transcritos de genes endógenos que codifican proteínas R1;
- d)
- moléculas de ácido nucleico que se introducen por medio de mutagénesis in vivo y que conducen a una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga en los genes que codifican las proteínas R1 endógenas, en donde la mutación o inserción conduce a una reducción de la expresión de genes que codifican proteínas R1, o a la síntesis de R1 inactiva; y
- e)
- moléculas de DNA que codifican simultáneamente al menos un RNA antisentido y al menos un RNA de sentido, en donde dicho RNA antisentido y dicho RNA de sentido forman una molécula de RNA bicatenario que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde dicho RNA de sentido y dicho RNA antisentido contienen al menos parte de la secuencia de un gen endógeno que codifica proteína R1;
\vskip1.000000\baselineskip
en donde dichas moléculas de ácido nucleico
extraño cuyas presencia y/o expresión conducen a la reducción de la
actividad de una o más proteínas BEI se seleccionan del grupo
constituido por:
- i)
- moléculas de DNA que codifican al menos un RNA antisentido que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEI, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEI;
- ii)
- moléculas de DNA que, por un efecto de cosupresión, conducen a la reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEI, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEI;
- iii)
- moléculas de DNA que codifican al menos una ribozima que escinde específicamente transcritos de genes endógenos que codifican proteínas BEI;
- iv)
- moléculas de ácido nucleico que se introducen por medio de mutagénesis in vivo y que conducen a una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga en los genes que codifican las proteínas BEI, en donde la mutación o inserción conduce a una reducción de la expresión de los genes que codifican las proteínas BEI, o a la síntesis de proteínas BEI inactivas; y
- v)
- moléculas de DNA que codifican simultáneamente al menos un RNA antisentido y al menos un RNA de sentido, en donde dicho RNA antisentido y dicho RNA de sentido forman una molécula de RNA bicatenario que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEI, en donde dicho RNA de sentido y dicho RNA antisentido contienen al menos parte de la secuencia de un gen endógeno que codifica proteína BEI; y
\vskip1.000000\baselineskip
en donde dichas moléculas de ácido nucleico
extraño cuyas presencia y/o expresión conducen a la reducción de la
actividad de una o más proteínas BEII se seleccionan del grupo
constituido por:
- A)
- moléculas de DNA que codifican al menos un RNA antisentido que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEII, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEII;
- B)
- moléculas de DNA que, por un efecto de cosupresión, conducen a la reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEII, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEII;
- C)
- moléculas de DNA que codifican al menos una ribozima que escinde específicamente transcritos de genes endógenos que codifican proteínas BEII;
\newpage
- D)
- moléculas de ácido nucleico que se introducen por medio de mutagénesis in vivo y que conducen a una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga en los genes que codifican proteínas BEII, en donde la mutación o inserción conduce a una reducción de la expresión de los genes que codifican las proteínas BEII, o a la síntesis de proteínas BEII inactivas; y
- E)
- moléculas de DNA que codifican simultáneamente al menos un RNA antisentido y al menos un RNA de sentido, en donde dicho RNA antisentido y dicho RNA de sentido forman una molécula de RNA bicatenario que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEII, en donde dicho RNA de sentido y dicho RNA antisentido contienen al menos parte de la secuencia de un gen endógeno que codifica proteína BEII.
\vskip1.000000\baselineskip
8. El método de la reivindicación 7, en donde la
planta transgénica es una planta de patata.
9. La planta transgénica de acuerdo con la
reivindicación 4, que es una planta que almacena almidón.
10. La planta transgénica de acuerdo con la
reivindicación 4, que es una planta de patata.
11. Material de propagación de plantas de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4, 9 y 10 que
contiene células de plantas de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3.
12. Uso de una o más moléculas de ácido nucleico
que codifican proteínas que tienen la actividad enzimática de las
proteínas R1, BEI y BEII o fragmentos de las mismas para la
producción de células de plantas de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3 o de plantas de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 4, 9 y 10.
13. Uso para la producción de plantas de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 4, 9 y 10 de las
moléculas de ácido nucleico siguientes:
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I: moléculas de ácido nucleico seleccionadas del
grupo constituido por
- a)
- moléculas de DNA que codifican al menos un RNA antisentido que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína R1;
- b)
- moléculas de DNA que, por un efecto de cosupresión, conducen a la reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína R1;
- c)
- moléculas de DNA que codifican al menos una ribozima que escinde específicamente transcritos de genes endógenos que codifican proteínas R1;
- d)
- moléculas de ácido nucleico que se introducen por medio de mutagénesis in vivo y que conducen a una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga en los genes que codifican las proteínas R1 endógenas, en donde la mutación o inserción conduce a una reducción de la expresión de genes que codifican proteínas R1, o a la síntesis de R1 inactiva; y
- e)
- moléculas de DNA que codifican simultáneamente al menos un RNA antisentido y al menos un RNA de sentido, en donde dicho RNA antisentido y dicho RNA de sentido forman una molécula de RNA bicatenario que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde dicho RNA de sentido y dicho RNA antisentido contienen al menos parte de la secuencia de un gen endógeno que codifica proteína R1;
\vskip1.000000\baselineskip
II: moléculas de ácido nucleico seleccionadas
del grupo constituido por
- i)
- moléculas de DNA que codifican al menos un RNA antisentido que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEI, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEI;
- ii)
- moléculas de DNA que, por un efecto de cosupresión, conducen a la reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEI, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEI;
- iii)
- moléculas de DNA que codifican al menos una ribozima que escinde específicamente transcritos de genes endógenos que codifican proteínas BEI;
- iv)
- moléculas de ácido nucleico que se introducen por medio de mutagénesis in vivo y que conducen a una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga en los genes que codifican las proteínas BEI, en donde la mutación o inserción conduce a una reducción de la expresión de los genes que codifican las proteínas BEI, o a la síntesis de proteínas BEI inactivas; y
- v)
- moléculas de DNA que codifican simultáneamente al menos un RNA antisentido y al menos un RNA de sentido, en donde dicho RNA antisentido y dicho RNA de sentido forman una molécula de RNA bicatenario que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEI, en donde dicho RNA de sentido y dicho RNA antisentido contienen al menos parte de la secuencia de un gen endógeno que codifica proteína BEI; y
\vskip1.000000\baselineskip
III: moléculas de ácido nucleico seleccionadas
del grupo constituido por
- A)
- moléculas de DNA que codifican al menos un RNA antisentido que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEII, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEII;
- B)
- moléculas de DNA que, por un efecto de cosupresión, conducen a la reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEII, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEII;
- C)
- moléculas de DNA que codifican al menos una ribozima que escinde específicamente transcritos de genes endógenos que codifican proteínas BEII;
- D)
- moléculas de ácido nucleico que se introducen por medio de mutagénesis in vivo y que conducen a una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga en los genes que codifican proteínas BEII endógenas, en donde la mutación o inserción conduce a una reducción de la expresión de los genes que codifican las proteínas BEII, o a la síntesis de proteínas BEII inactivas; y
- E)
- moléculas de DNA que codifican simultáneamente al menos un RNA antisentido y al menos un RNA de sentido, en donde dicho RNA antisentido y dicho RNA de sentido forman una molécula de RNA bicatenario que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEII, en donde dicho RNA de sentido y dicho RNA antisentido contienen al menos parte de la secuencia de un gen endógeno que codifica proteína BEI.
\vskip1.000000\baselineskip
14. Una composición que contiene moléculas de
ácido nucleico adecuadas para la producción de células de plantas
transgénicas o plantas transgénicas en las cuales la actividad de
las proteínas R1 y BEI y BEII está reducida en comparación con
células de plantas de tipo salvaje o plantas correspondientes de
tipo salvaje, que no se han modificado genéticamente, comprendiendo
dicha composición:
\vskip1.000000\baselineskip
I: moléculas de ácido nucleico seleccionadas del
grupo constituido por
- a)
- moléculas de DNA que codifican al menos un RNA antisentido que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína R1;
- b)
- moléculas de DNA que, por un efecto de cosupresión, conducen a la reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína R1;
- c)
- moléculas de DNA que codifican al menos una ribozima que escinde específicamente transcritos de genes endógenos que codifican proteínas R1;
- d)
- moléculas de ácido nucleico que se introducen por medio de mutagénesis in vivo y que conducen a una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga en los genes que codifican las proteínas R1 endógenas, en donde la mutación o inserción conduce a una reducción de la expresión de genes que codifican proteínas R1, o a la síntesis de R1 inactiva; y
- e)
- moléculas de DNA que codifican simultáneamente al menos un RNA antisentido y al menos un RNA de sentido, en donde dicho RNA antisentido y dicho RNA de sentido forman una molécula de RNA bicatenario que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas R1, en donde dicho RNA de sentido y dicho RNA antisentido contienen al menos parte de la secuencia de un gen endógeno que codifica proteína R1;
II: moléculas de ácido nucleico seleccionadas
del grupo constituido por
- i)
- moléculas de DNA que codifican al menos un RNA antisentido que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEI, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEI;
- ii)
- moléculas de DNA que, por un efecto de cosupresión, conducen a la reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEI, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEI;
- iii)
- moléculas de DNA que codifican al menos una ribozima que escinde específicamente transcritos de genes endógenos que codifican proteínas BEI;
- iv)
- moléculas de ácido nucleico que se introducen por medio de mutagénesis in vivo y que conducen a una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga en los genes que codifican las proteínas BEI, en donde la mutación o inserción conduce a una reducción de la expresión de los genes que codifican las proteínas BEI, o a la síntesis de proteínas BEI inactivas; y
- v)
- moléculas de DNA que codifican simultáneamente al menos un RNA antisentido y al menos un RNA de sentido, en donde dicho RNA antisentido y dicho RNA de sentido forman una molécula de RNA bicatenario que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEI, en donde dicho RNA de sentido y dicho RNA antisentido contienen al menos parte de la secuencia de un gen endógeno que codifica proteína BEI; y
\vskip1.000000\baselineskip
III: moléculas de ácido nucleico seleccionadas
del grupo constituido por
- A)
- moléculas de DNA que codifican al menos un RNA antisentido que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEII, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEII;
- B)
- moléculas de DNA que, por un efecto de cosupresión, conducen a la reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEII, en donde la secuencia de dichas moléculas de DNA es idéntica en más de un 65% a un gen endógeno que codifica proteína BEII;
- C)
- moléculas de DNA que codifican al menos una ribozima que escinde específicamente transcritos de genes endógenos que codifican proteínas BEII;
- D)
- moléculas de ácido nucleico que se introducen por medio de mutagénesis in vivo y que conducen a una mutación o una inserción de una secuencia heteróloga en los genes que codifican proteínas BEII endógenas, en donde la mutación o inserción conduce a una reducción de la expresión de los genes que codifican las proteínas BEII, o a la síntesis de proteínas BEII inactivas; y
- E)
- moléculas de DNA que codifican simultáneamente al menos un RNA antisentido y al menos un RNA de sentido, en donde dicho RNA antisentido y dicho RNA de sentido forman una molécula de RNA bicatenario que conduce a una reducción de la expresión de genes endógenos que codifican proteínas BEII, en donde dicho RNA de sentido y dicho RNA antisentido contienen al menos parte de la secuencia de un gen endógeno que codifica proteína BEII.
\vskip1.000000\baselineskip
15. El uso de la reivindicación 13 o la
composición de acuerdo con la reivindicación 14, en donde las
moléculas de ácido nucleico están contenidas en una molécula de
ácido nucleico recombinante.
16. Una célula hospedadora aislada que contiene
una composición de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15.
17. Una célula de planta transgénica
dicotiledónea que contiene la composición de acuerdo con la
reivindicación 14 ó 15.
18. La célula de planta transgénica de la
reivindicación 17, que es una célula de planta de patata.
19. Almidón que puede obtenerse de células de
plantas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3
y 17 o de una planta de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 4, 9 y 10 o de material de propagación de acuerdo
con la reivindicación 11, en donde dicho almidón se
caracteriza porque tiene un contenido de amilosa determinado
de acuerdo con el método de Hovenkamp-Hermelink
et al. (Potato Research 31, (1988), 241-246)
de al menos 75% y un contenido de fosfato que está reducido al menos
en un 50% en comparación con el almidón de las plantas
correspondientes de tipo salvaje que no se han modificado
genéticamente.
20. Almidón de acuerdo con la reivindicación 19,
caracterizado porque tiene un contenido de fosfato en la
posición C-6 de los monómeros de glucosa de hasta 15
mmol C6-P mg^{-1} de almidón.
21. Almidón de acuerdo con la reivindicación 19
ó 20, caracterizado porque tiene una distribución modificada
de las cadenas laterales en comparación con el almidón de las
plantas correspondientes de tipo salvaje que no se han modificado
genéticamente.
22. Almidón de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque tiene una
morfología modificada de los gránulos de almidón en comparación con
el almidón de plantas correspondientes de tipo salvaje que no están
modificadas genéticamente.
23. Almidón de acuerdo con la reivindicación 22,
en donde los gránulos de almidón tienen la forma de un racimo de
uvas.
24. Almidón de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 23, caracterizado porque el tamaño
medio de los gránulos está reducido en comparación con el tamaño
medio de los gránulos de almidón de plantas correspondientes de
tipo salvaje que no están modificadas genéticamente.
25. Almidón de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 24 que forma un gel después de empastado en
una solución de CaCl_{2} al 60% (p/v), teniendo el gel una fuerza
de gel que está incrementada al menos en un 1000% en comparación
con la fuerza de gel del almidón de las plantas correspondientes de
tipo salvaje que no se han modificado genéticamente.
26. Almidón de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 25, que es un almidón de patata.
27. Un método para producir un almidón de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26 que
comprende la extracción del almidón de una planta de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 4, 9 y 10 y/o de partes que
almacenan de almidón de una planta de este tipo y/o de una célula de
planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,
17 y 18 y/o material de propagación de acuerdo con la reivindicación
11.
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