JP2022521788A - 核酸増幅用の臨床サンプルを調製する改善された方法 - Google Patents
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Abstract
本開示は、宿主細胞、微生物、タンパク質およびポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む臨床サンプルを調製する方法である。本発明は、一部は、臨床サンプルにプロテアーゼを添加することで、サンプルの完全性または品質を別段実質的に害することなく、処理した臨床サンプル中のある特定の核酸増幅インヒビターによる汚染が低減され、それによって、上記臨床サンプルの核酸増幅を改善するという発見に依存する。改善された核酸増幅はまた、混合サンプル中の希な核酸（例えば、ヒト患者由来臨床サンプル中の微生物ＤＮＡ）の改善された検出を可能にする。
Description
発明の分野
本発明は一般に、臨床サンプル調製の分野に関し、具体的には、臨床サンプルへのある特定の添加剤によって引き起こされる核酸増幅検出に対する負の効果を低減することに関する。
本発明は一般に、臨床サンプル調製の分野に関し、具体的には、臨床サンプルへのある特定の添加剤によって引き起こされる核酸増幅検出に対する負の効果を低減することに関する。
背景
院内獲得性病原性微生物感染は、適切な抗微生物剤処置を確実にするために、存在する微生物の迅速な同定を必要とする。任意の所定の日に、３１名の入院患者の中で約１名が、少なくとも１つの院内獲得性病原性微生物感染を有する。２０１５年では、推定６８７，０００名の院内獲得性病原性微生物感染があり、７２，０００名が死亡した。広域スペクトルの非標的化抗微生物剤をこれらの院内獲得性微生物感染を有する患者へ投与すると、抗微生物剤耐性がもたらされ得る。
院内獲得性病原性微生物感染は、適切な抗微生物剤処置を確実にするために、存在する微生物の迅速な同定を必要とする。任意の所定の日に、３１名の入院患者の中で約１名が、少なくとも１つの院内獲得性病原性微生物感染を有する。２０１５年では、推定６８７，０００名の院内獲得性病原性微生物感染があり、７２，０００名が死亡した。広域スペクトルの非標的化抗微生物剤をこれらの院内獲得性微生物感染を有する患者へ投与すると、抗微生物剤耐性がもたらされ得る。
病原性微生物感染を有する被験体から得た臨床サンプル中での微生物の保存は、その後の臨床診断検査のために極めて重要である。そのために、ポリアニオン性界面活性剤は、全血における殺菌プロセス（例えば、補体経路）を阻害するために効果的であり、サンプル中の細菌の生存および増殖を促進するために、血液培養ボトル中で一般に使用される（Ｅｄｂｅｒｇら， １９７６， 「Ｕｓｅ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｐｏｌｙａｎｅｔｈｏｌ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ ａ ｒａｐｉｄ ｂｌｏｏｄ ｌｅｖｅｌ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ａｓｓａｙ」， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ９（３）： ４１４－４１７； Ｋｏｃｋａら， １９７２， 「Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｐｏｌｙａｎｉｏｎｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｎ ｌｙｓｏｚｙｍｅ， ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ， ａｎｄ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ」， Ａｎｎ． Ｃｌｉｎｃ． Ｌａｂ． Ｓｃｉ． ２（６）： ４７０－４７３； Ｔｒａｕｂ ａｎｄ Ｋｌｅｂｅｒ， １９７７， 「Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｂｙ ｓｏｄｉｕｍ ｐｏｌｙａｎｅｔｈｏｌ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ」， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５（３）： ２７８－２８４）。
臨床血液サンプルから細菌を同定するための次世代分子診断（例えば、核酸増幅）は、細菌の旧来の培養に代わる迅速な代替手段を提供する。しかし、殺菌プロセスを阻害するために臨床サンプルに一般に添加されるポリアニオン性化合物（例えば、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム（ＳＰＳ）および凝固を阻害するために添加されるヘパリンは、核酸増幅技術に対して阻害的な効果を有する（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ ａｎｄ Ｒｅｌｍａｎ， １９９８， 「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｂｌｏｏｄ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｏｄｉｕｍ ｐｏｌｙａｎｅｔｈｏｌ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ」， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ３６（１０）： ２８１０－２８１６； Ｑｉａｎら， ２００１， 「Ｄｉｒｅｃｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｒｏｍ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｌｏｏｄ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ： ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＡＣＴＥＣ ９２４０ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｔｒｕｅ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｆａｌｓｅ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ」， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ３９（１０： ３５７８－３５８５；およびＲｅｇａｎら， ２０１２， 「Ａ ｓａｍｐｌｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｆａｓｔｅｒ， ｍｏｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｃｕｌｔｕｒｅ」， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｄｉａｇｎ． １４（２）： １２０－１２９）。 このような添加剤に加えて、血液構成要素（例えば、ヘモグロビン、ラクトフェリン、ヘム、および免疫グロブリン）はまた、核酸増幅手順に干渉し得る。しかし、核酸とポリアニオン性ポリマー（例えば、ＳＰＳ）との間の化学的類似性は、多数の核酸精製技術において両方のポリマーの同時精製をもたらし、それによって、下流の分子適用の阻害を生じる（Ｒｅｇａｎら， ２０１２， 前出）。
臨床サンプルの処理の間の核酸増幅ベースの診断に対するある特定の一般的添加剤および天然に存在する化合物（例えば、ＳＰＳ、ヘパリン）の負の効果を低減するために、改善された方法が必要とされる。下流の核酸増幅のための臨床サンプル処理の現在の方法は、今のところ、最終サンプルを１０倍～１０００倍に希釈して、ＳＰＳ阻害を軽減する。しかし、これらのアプローチはまた、核酸検出感度を顕著に低減する（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ， ２０１４， 「Ｄｅａｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ： ｒｅａｇｅｎｔ ｃｈｏｉｃｅ ｍａｔｔｅｒｓ」， Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
Ｅｄｂｅｒｇら， １９７６， 「Ｕｓｅ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｐｏｌｙａｎｅｔｈｏｌ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｙｘｉｎ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｉｎ ａ ｒａｐｉｄ ｂｌｏｏｄ ｌｅｖｅｌ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ａｓｓａｙ」， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ９（３）： ４１４－４１７
Ｋｏｃｋａら， １９７２， 「Ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｌｆａｔｅｄ ｐｏｌｙａｎｉｏｎｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｎ ｌｙｓｏｚｙｍｅ， ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ， ａｎｄ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ」， Ａｎｎ． Ｃｌｉｎｃ． Ｌａｂ． Ｓｃｉ． ２（６）： ４７０－４７３
Ｔｒａｕｂ ａｎｄ Ｋｌｅｂｅｒ， １９７７， 「Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ａｎｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｂｙ ｓｏｄｉｕｍ ｐｏｌｙａｎｅｔｈｏｌ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ」， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５（３）： ２７８－２８４）
Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ ａｎｄ Ｒｅｌｍａｎ， １９９８， 「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｂｌｏｏｄ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｓｏｄｉｕｍ ｐｏｌｙａｎｅｔｈｏｌ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ」， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ３６（１０）： ２８１０－２８１６
Ｑｉａｎら， ２００１， 「Ｄｉｒｅｃｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｒｏｍ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｂｌｏｏｄ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ： ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＢＡＣＴＥＣ ９２４０ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｔｒｕｅ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｆａｌｓｅ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ」， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ３９（１０： ３５７８－３５８５
Ｒｅｇａｎら， ２０１２， 「Ａ ｓａｍｐｌｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｆａｓｔｅｒ， ｍｏｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＰＣＲ－ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｃｕｌｔｕｒｅ」， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｄｉａｇｎ． １４（２）： １２０－１２９
Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ， ２０１４， 「Ｄｅａｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ： ｒｅａｇｅｎｔ ｃｈｏｉｃｅ ｍａｔｔｅｒｓ」， Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
要旨
本発明は、一部は、臨床サンプルにプロテアーゼを添加することで、サンプルの完全性または品質を別段実質的に害することなく、処理した臨床サンプル中のある特定の核酸増幅インヒビターによる汚染が低減され、それによって、上記臨床サンプルの核酸増幅を改善するという発見に依存する。改善された核酸増幅はまた、混合サンプル中の希な核酸（例えば、ヒト患者由来臨床サンプル中の微生物ＤＮＡ）の改善された検出を可能にする。
本発明は、一部は、臨床サンプルにプロテアーゼを添加することで、サンプルの完全性または品質を別段実質的に害することなく、処理した臨床サンプル中のある特定の核酸増幅インヒビターによる汚染が低減され、それによって、上記臨床サンプルの核酸増幅を改善するという発見に依存する。改善された核酸増幅はまた、混合サンプル中の希な核酸（例えば、ヒト患者由来臨床サンプル中の微生物ＤＮＡ）の改善された検出を可能にする。
従って、１つの局面において、本開示は、被験体に由来する細胞、微生物、およびサンプル中の少なくとも１種のタンパク質に結合するポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、被験体に由来する臨床サンプルを調製するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記方法は、（ａ）上記被験体に由来する細胞、上記微生物、および血漿タンパク質、ならびにポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、上記被験体に由来する臨床サンプルを得る工程、（ｂ）上記臨床サンプルを、上記被験体の細胞を含む第１の画分ならびに上記微生物および上記タンパク質に結合されるポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第２の画分へと分離する工程、（ｃ）上記第２の画分に、上記タンパク質を分解するプロテアーゼを添加する工程、ならびに（ｄ）上記第２の画分を、上記微生物を含む第３の画分および上記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第４の画分へと分離する工程を包含する。
別の局面において、本開示は、微生物、およびサンプル中の少なくとも１種のタンパク質に結合するポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、被験体に由来する臨床サンプルを調製するための方法であって、上記方法は、（ａ）上記微生物および上記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、上記被験体に由来する臨床サンプルを得る工程、（ｂ）上記サンプルに、上記タンパク質を分解するプロテアーゼを添加する工程、（ｃ）上記臨床サンプルを、上記被験体の細胞を含む第１の画分ならびに上記微生物および上記タンパク質に結合されるポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第２の画分へと分離する工程、（ｄ）上記第２の画分を上記第１の画分から除去する工程、ならびに（ｅ）上記第２の画分を、上記微生物を含む第３の画分および上記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第４の画分へと分離する工程を包含する方法を提供する。
別の局面において、本開示は、微生物、細胞、およびサンプル中の少なくとも１種のタンパク質を結合する少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、被験体に由来する臨床サンプルを調製するための方法であって、上記方法は、（ａ）上記微生物、上記タンパク質および上記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、上記被験体に由来する臨床サンプルを得る工程、（ｂ）上記臨床サンプルに、上記タンパク質を分解するプロテアーゼを添加する工程、（ｃ）上記臨床サンプルを、上記被験体の細胞を含む第１の画分および上記微生物および上記タンパク質に結合されるポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第２の画分へと分離する工程、（ｄ）上記第２の画分を上記第１の画分から除去する工程、（ｅ）上記第２の画分を、上記微生物を含む第３の画分および上記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第４の画分へと分離する工程を包含する方法を提供する。
別の局面において、本開示は、微生物、細胞、およびサンプル中の少なくとも１種のタンパク質を結合する少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、被験体に由来する臨床サンプルを調製するための方法であって、上記方法は、（ａ）上記微生物、上記タンパク質、および上記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、上記被験体に由来する臨床サンプルを得る工程、（ｂ）上記臨床サンプルを、上記被験体の細胞を含む第１の画分ならびに上記微生物および上記タンパク質に結合されるポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第２の画分へと分離する工程、（ｃ）上記第２の画分を上記第１の画分から除去する工程、（ｄ）上記第２の画分に、工程（ｂ）または工程（ｃ）の後に、上記第２の画分における上記タンパク質を分解するプロテアーゼを添加する工程、（ｅ）上記第２の画分を、上記微生物を含む第３の画分および上記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第４の画分へと分離する工程を包含する方法を提供する。
別の局面において、本開示は、微生物、およびサンプル中の少なくとも１種のタンパク質を結合する少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、被験体に由来する臨床サンプルを調製するための方法であって、上記方法は、（ａ）上記微生物、上記タンパク質、および上記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、上記被験体に由来する臨床サンプルを得る工程、（ｂ）上記微生物を選択的に溶解する工程、（ｃ）上記臨床サンプルに、上記タンパク質を分解するプロテアーゼを添加する工程、（ｄ）上記臨床サンプルを、上記臨床サンプルの上記細胞を含む第１の画分および上記微生物に由来する核酸を含む第２の画分へと分離する工程を包含する方法を提供する。
前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記方法は、上記微生物核酸を増幅する工程をさらに包含する。
前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記分離する工程は、遠心分離によるものである。前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記分離する工程は、微小流体によるものである。前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記分離する工程は、免疫沈降によるものである。前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記分離する工程は、濾過によるものである。
前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記得る工程は、真空液体容器を利用する。前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記得る工程は、血液培養ボトルを利用する。前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記得る工程は、ヘルスケア提供者からサンプルを受容する工程である。
前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、第Ｘａ因子、Ａｒｇ－Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ＋Ｎ末端Ｇｌｕ、３－ブロモ－３－メチル－２－（２－ニトロフェニルチオ）－３Ｈ－インドール（ＢＮＰＳ－スカトール）、カスパーゼ１、キモトリプシン－高特異性、クロストリパイン、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、エンテロキナーゼ、グランザイムＢ、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、ＬｙｓＮ、２－ニトロ－５－チオシアナト安息香酸（ＮＣＴＢ）、ペプシン、プロリン－エンドペプチダーゼ、ぶどう球菌ペプチダーゼＩ、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、サーモリシン、トロンビン、およびトリプシンからなる群より選択される。前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記添加されるプロテアーゼの量は、５ユニット（Ｕ）～５０００ユニットの間である。前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記プロテアーゼおよび上清は、２０℃～５５℃の間で、１０分～１２０分の間にわたってインキュベートされる。
前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記核酸増幅は、等温鎖置換増幅、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲ、またはプライマー伸長プレ増幅である。
前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記核酸増幅は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント、またはＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメントによるものである。
前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記プロテアーゼの添加は、５倍～１００倍の間で上記微生物核酸の増幅を増大させる。
前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記方法は、１０～１００，０００コロニー形成単位／ｍＬ（ｃｆｕ／ｍＬ）の間、１０～１０，０００ｃｆｕ／ｍＬの間、または１０～１００ｃｆｕ／ｍＬの間で、元の臨床サンプルに存在する微生物核酸の検出を可能にする。前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記方法は、２．５～１００，０００ｃｆｕ／ｍＬの間、２．５～１０，０００ｃｆｕ／ｍＬの間、２．５～１，０００ｃｆｕ／ｍＬの間、または２．５～１００ｃｆｕ／ｍＬの間で、上記臨床サンプルに存在する微生物核酸の検出を可能にする。前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記方法は、１～１００，０００ｃｆｕ／ｍＬの間、１～１，０００ｃｆｕ／ｍＬの間、１～１００ｃｆｕ／ｍＬの間、または１～１０ｃｆｕ／ｍＬの間で、上記臨床サンプルに存在する微生物核酸の検出を可能にする。
発明の詳細な説明
患者から得た臨床サンプルは、広い範囲の疾患および障害を診断するにあたって極めて重要である。診断検査のために臨床サンプルを迅速かつ効率的に調製できることは、患者の健康状態の維持にとって極めて重要であるだけでなく、診察室および臨床サンプルを調製しかつ診断検査を行う検査室の両方に関してより費用効果的でありかつ効率的でもある。
患者から得た臨床サンプルは、広い範囲の疾患および障害を診断するにあたって極めて重要である。診断検査のために臨床サンプルを迅速かつ効率的に調製できることは、患者の健康状態の維持にとって極めて重要であるだけでなく、診察室および臨床サンプルを調製しかつ診断検査を行う検査室の両方に関してより費用効果的でありかつ効率的でもある。
臨床血液サンプルは、病原性微生物感染を有するまたは有すると疑われる患者から慣用的に得られる。血液サンプル中でのポリアネトールスルホン酸ナトリウム（ＳＰＳ）およびヘパリンのような添加剤の使用は、細菌の生存度、回収、および病原性微生物を迅速に同定する能力を維持し、医師がより信頼性をもってどの抗微生物剤がその感染を最も効果的に処置するか推定することを可能にする（Ｂｅｌｄｉｎｇ ａｎｄ Ｋｅｌｂａｎｏｆｆ， １９７２， 「Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｐｏｌｙａｎｅｔｈｏｌｓｕｌｆｏｎａｔｅ ｏｎ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ」， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２４（５）： ６９１－６９８）。病原性微生物の同定は、微生物核酸が被験体の核酸と比較して増幅されることを必要とする。核酸のインビトロ増幅は、臨床サンプル中の核酸増幅インヒビターの存在によって阻害されることから、現行の実務は、（１）微生物回収効率を減少させるＳＰＳ含有サンプルをひとまとめに回避すること、または（２）顕著により長いタイムラインを有する、微生物をインビボで培養することのいずれかである（例えば、ＵＳ ２０１８／０１４２２３１ Ａ１を参照のこと）。
本開示は、一部は、ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターが、プロテアーゼの添加を通じて処理する間に臨床サンプルから除去され得るという発見に基づく。これらの核酸増幅インヒビターは、臨床サンプル中に存在する場合、その後の診断検査（例えば、微生物同定）を妨げる非タンパク質化合物（例えば、ポリマーおよび有機化合物（例えば、グリコサミノグリカン））である。
定義
本明細書で使用される全ての科学用語および技術用語は、以下で別段定義されなければ、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有することが意図される。何らかの矛盾がある場合、本明細書が、定義を含めて優先する。本明細書で使用される技術への言及は、当業者に明らかなそれら技術に関するバリエーションまたは等価なもしくは後に開発される技術の置き換えを含め、当該分野で一般に理解されるとおりの技術に言及することが意図される。発明である主題をより明確にかつ簡潔に記載するために、以下の定義が、本明細書および添付の請求項において使用されるある特定の用語に関して提供される。
本明細書で使用される全ての科学用語および技術用語は、以下で別段定義されなければ、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有することが意図される。何らかの矛盾がある場合、本明細書が、定義を含めて優先する。本明細書で使用される技術への言及は、当業者に明らかなそれら技術に関するバリエーションまたは等価なもしくは後に開発される技術の置き換えを含め、当該分野で一般に理解されるとおりの技術に言及することが意図される。発明である主題をより明確にかつ簡潔に記載するために、以下の定義が、本明細書および添付の請求項において使用されるある特定の用語に関して提供される。
本明細書で使用される場合、「調製する（ｐｒｅｐａｒｉｎｇ）」とは、診断検査前に臨床サンプルを改変するために行われる工程に言及する。いくつかの実施形態において、調製するは、サンプルを集める、分離する、一部を除去する、および／またはさらなる構成要素（例えば、プロテアーゼ）をサンプルに添加する、を含む。
本明細書で使用される場合、「分離する（ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ）」とは、臨床サンプルを、少なくとも２つの別個の画分へと物理的に分けることをいう。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」とは、片利共生する細胞（例えば、宿主微生物の一部である微生物細胞）、感染する細胞（例えば、病原性微生物）または夾雑する細胞（例えば、サンプル収集または調製の間に偶然に導入される）とは別個の、宿主または被験体に由来する細胞をいう。用語「宿主」とは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物であり得る、患者または医学的被験体に言及し得る。
本明細書で使用される場合、「得る（ｏｂｔａｉｎｉｎｇ）」とは、被験体から臨床サンプルを引き抜く、または被験体から引き抜かれている臨床サンプルを受容する、のいずれかに言及する。臨床サンプルを被験体から引き抜くことは、当該分野で公知の任意の経路（静脈内、動脈内、腹腔内、頭蓋内、髄腔内、筋肉内、尿道内、気管内、および鼻内が挙げられるが、これらに限定されない）によって達成され得る。種々の実施形態において、「引き抜く（ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ）」ことは、シリンジ、生検用の針、吸引チューブ、スワブもしくは類似のデバイスを使用して、または排尿、排便、喀出、創傷ドレナージもしくは洗浄によって達成され得る。
本明細書で使用される場合、「画分（ｆｒａｃｔｉｏｎ）」とは、より大きなかつより複雑なサンプルから物理的に分離されている別個の部分サンプルに言及する。いくつかの実施形態において、画分は、宿主細胞、微生物、可溶性タンパク質、および／またはポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む。２またはこれより多くの画分へのサンプルの分離は、完全または完璧である必要はない。例えば、全血サンプルの、血球画分および血漿画分への遠心分離は、代表的には、細胞画分またはペレット（これは、それでもなお、いくらかの血漿を含む）および血漿画分または上清（これは、それでもなお、いくらかの細胞を含む）を生じる。分離の程度または純度は、当業者の制御の範囲内であるが、完璧な分離は、実践的でも必要でもない。
本明細書で使用される場合、「遠心分離（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）」とは、密度に基づいて、サンプルを構成要素へと分離することに言及し、ここでより密な構成要素（例えば、血球、大きな粒子など）はペレットを形成し、余り密でない構成要素（例えば、液体、小さなペプチドなど）は上清を形成する。
本明細書で使用される場合、「微小流体（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」とは、臨床サンプルを、マイクロチャネルを経て流すことによって画分へと分離することによる、臨床サンプルの画分への分離に言及する。微小流体デバイスは、細胞サイズ、等速電気泳動的（ｉｓｏｔａｃｈｏｐｏｒｅｔｉｃ）、光学的、磁性の、および／または細胞タイプを区別する他の生体物理的特性に基づいて、異なる細胞タイプへと分離し得る。
本明細書で使用される場合、「血漿チューブ（ｐｌａｓｍａ ｔｕｂｅ）」とは、血漿を単離するための容器に言及する。血漿チューブは、特異的細胞タイプ（例えば、赤血球、白血球、血小板、微生物）を種々の画分へと単離するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）」とは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンに由来するかまたはこれに基づく合成分子（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’ フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、およびｓｃＦｖフラグメント、ならびに相当する重鎖のみ抗体（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ－ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）（ｈｃＡｂ）、ならびに軟骨魚類およびラクダ類の種に由来する相当するフラグメント）を使用する、特異的細胞タイプ（例えば、赤血球、白血球、血小板）またはタンパク質の固定化に言及する。上記免疫グロブリン（または免疫グロブリン様）分子は、分離されるべき細胞またはタンパク質を区別する任意の高分子（例えば、タンパク質、糖タンパク質）に結合し得る。
本明細書で使用される場合、「濾過（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」とは、臨床サンプルから構造体を除去することに言及する。構造体は、細胞、細胞フラグメント、オルガネラ、微生物、大きなタンパク質、またはタンパク質複合体（例えば、ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターおよびタンパク質）であり得る。
本明細書で使用される場合、上記サンプルの一部を「除去する（ｒｅｍｏｖｉｎｇ）」とは、サンプルの一部のうちの大部分を引き抜くことに言及し、ここで上記大部分は、少なくとも５０％に言及し得るが、上記サンプルの６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、または９９％超を含み得る。除去することは、当該分野で公知の任意の方法（ピペット操作、デカント、および濾過が挙げられるが、これらに限定されない）によって行われ得る。いくつかの実施形態において、一部を除去することは、液相（例えば、上清）をピペット操作することによるものである。
本明細書で使用される場合、「臨床サンプル（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）」とは、診断検査のために、被験体から引き抜かれるか、被験体に由来するか、または別の方法で被験体から得られ、処理される診断用標本に言及する。本明細書で使用される場合、臨床サンプルとしては、血液、喀痰、尿、粘液、唾液、組織膿瘍、創傷ドレナージ、リンパ液、洗浄物、糞便、脳脊髄液またはヒトおよび／もしくは他の哺乳動物起源の任意の流体吸引物もしくは組織抽出物が挙げられる（ＥＥＨｅａｌｔｈ， 「Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」， ２０１８）。
本明細書で使用される場合、「ポリアニオン性ポリマー（ｐｏｌｙａｎｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）」とは、一緒に結合された多数の類似の化学的単位からなり、多数の負に荷電した基を含み、少なくとも５００ダルトン（５００ Ｄａ）の平均分子量を有する分子構造を有する非タンパク質物質である。
本明細書で使用される場合、「ポリアネトールスルホン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｏｌｙａｎｅｔｈｏｌ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）」（または「ＳＰＳ」）とは、真空液体容器（血液収集容器を含む）の中で抗凝固剤として一般に利用されるポリアニオン性ポリマーである。ＳＰＳは、先天性免疫および液性免疫を通じて細菌を殺滅することから補体カスケードを阻害することによって、臨床血液サンプルに存在する細菌を保存する助けになる。市販のＳＰＳ調製物は、代表的には、平均分子量 ９～１１ｋＤａを有する（例えば、Ｃａｔ． Ｎｏ． ４４４４６４， Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）。
本明細書で使用される場合、「ヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）」とは、ジサッカリドユニットの反復からなる非分枝状ポリサッカリドを含むグリコサミノグリカンである。ヘパリンは、代表的には、哺乳動物の粘膜組織（例えば、ウシの肺またはブタの腸）から得られるが、他の組織および他の哺乳動物からも得られ得る。市販のヘパリン調製物は、代表的には、平均分子量１２～１５ｋＤａを有するが、天然のヘパリンは、３～３０ｋＤａの範囲に及び得る。本明細書で使用される場合、用語「ヘパリン」は、任意の「ヘパリン塩」を含むことが意図される。「ヘパリン塩（ｈｅｐａｒｉｎ ｓａｌｔ）」は、ヘパリンが、正に荷電した分子と組み合わされた化合物である（例えば、ヘパリンナトリウム、ヘパリンリチウム、またはヘパリンアンモニウム）。
本明細書で使用される場合、「核酸増幅インヒビター（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」とは、非天然のレベルへと臨床サンプルに添加され、核酸増幅反応の間に存在する場合に、ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害する化合物に言及する。いくつかの実施形態において、核酸増幅インヒビターは、サンプル収集の間に臨床サンプルに導入される。いくつかの実施形態において、核酸増幅インヒビターは、サンプル処理の間に臨床サンプルに導入される。核酸増幅インヒビターは、天然（自然によって生成される）であっても、合成（自然によって生成されない）であってもよい。核酸増幅インヒビターは、非天然の非タンパク質（例えば、ＳＰＳ）であってもよい。核酸増幅インヒビターは、天然の非タンパク質（例えば、ヘパリン）であってもよい。
本明細書で使用される場合、「可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）」とは、タンパク質が、不溶性凝集物を沈殿および／または形成させるのではなく、溶液中に残る能力に言及する。
本明細書で使用される場合、「血清（ｓｅｒｕｍ）」とは、血漿、全電解質、抗体、抗原、ホルモン、および任意の外因性物質（例えば、薬物および微生物）を含む血液構成要素に言及する。血清は、血球または血小板を含むことは意図されないが、残留細胞が、血清調製後に存在していてもよい。
本明細書で使用される場合、［血清タンパク質（ｓｅｒｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎ）］とは、凝固（例えば、フィブリノゲン）に関与しない血液タンパク質中の任意のタンパク質に言及する。血清タンパク質としては、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）およびグロブリン（例えば、αグロブリン、βグロブリン、およびγグロブリン）、ならびにトランスフェリン、ラクトフェリン、グロビン、および抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」とは、可視化されるために顕微鏡を必要とする微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）である。微生物の例としては、細菌、古細菌、真菌、原生生物、ウイルス、および顕微鏡で見える動物（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ａｎｉｍａｌ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「病原性微生物（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｍｉｃｒｏｂｅ）」とは、疾患を引き起こす微生物である。ヒトにおける最も一般的な病原性微生物は、ウイルスおよび細菌である。それほど一般的でない病原性微生物としては、真菌、原生動物、および蠕虫類が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）」とは、タンパク質およびペプチドを、ペプチド結合の加水分解を通じて分解する酵素に言及する。
本明細書で使用される場合、「容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）」とは、被験体から臨床サンプルを集めるための入れ物である。いくつかの実施形態において、上記被験体は、微生物感染を有するかまたは有すると疑われる。本開示のいくつかの実施形態において、容器は、真空液体容器（例えば、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）である。いくつかの実施形態において、容器は、血液培養ボトルである。
本明細書で使用される場合、「真空液体容器（ｖａｃｕｕｍ ｌｉｑｕｉｄ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）」とは、チューブの内部で真空シールを維持するゴム栓を含む滅菌のガラス製またはプラスチック製の収集チューブである。この真空シールは、所定の容積の液体の収集を容易にする。本開示のいくつかの実施形態において、真空液体容器は、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム（ＳＰＳ）を含む。いくつかの実施形態において、真空液体容器は、ヘパリンを含む。
本明細書で使用される場合、「血液培養ボトル（ｂｌｏｏｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｏｔｔｌｅ）」とは、細菌感染を有するかまたは有すると疑われる患者から臨床サンプルを集め、培養するために利用される滅菌のガラス製またはプラスチック製の血液収集容器である。血液培養ボトルは、存在する微生物種の下流の同定のために、臨床サンプル中での微生物の増殖を容易にする。本開示のいくつかの実施形態において、血液培養ボトルは、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム（ＳＰＳ）を含む。いくつかの実施形態において、血液培養ボトルは、ヘパリンを含む。
本明細書で使用される場合、「核酸増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、臨床血液サンプルに由来する核酸分子の特異的集団を増幅するまたは増やすためのプロセスに言及する。いくつかの実施形態において、上記集団は、病原体（例えば、ウイルスまたは細菌）に由来する。いくつかの実施形態において、上記集団は、臨床血液サンプルの宿主に由来する。上記集団中の核酸分子の量は、いくつかの方法のうちのいずれか（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、または転写媒介性増幅（ＴＭＡ）が挙げられる）において拡大され得る。いくつかの実施形態において、核酸増幅は、等温鎖置換増幅、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲ、またはプライマー伸長プレ増幅である。
本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」とは、テンプレートとして既存の核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を利用して、新たな核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の形成を触媒して、その新たな分子における相補的な（または実質的に相補的な）ポリヌクレオチド配列を生成する酵素に言及する。いくつかの実施形態において、ポリメラーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成が起こる前に、ＤＮＡ二重らせんのうちの一方の鎖の置換を触媒する鎖置換ポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、鎖置換ポリメラーゼは、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、カタログ番号Ｍ０２６９， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（例えば、カタログ番号Ｍ０２７５， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）、またはＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメント（例えば、カタログ番号Ｍ０２１０， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）である。
本発明の原理
本発明は、一部は、ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビター（例えば、ＳＰＳ、ヘパリン、ヒアルロネート、デルマタン硫酸ポリアニオン、およびコンドロイチンＤ－グルクロネートアニオン）が、プロテアーゼを添加することによって、臨床サンプルから除去され得るという発見に依存する。これは、ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターが、核酸増幅の間に臨床サンプル中に存在する天然に存在するタンパク質を結合することである。従って、本開示は、病原性微生物に感染した被験体から得た臨床サンプルから、ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを除去する方法を提供する。
本発明は、一部は、ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビター（例えば、ＳＰＳ、ヘパリン、ヒアルロネート、デルマタン硫酸ポリアニオン、およびコンドロイチンＤ－グルクロネートアニオン）が、プロテアーゼを添加することによって、臨床サンプルから除去され得るという発見に依存する。これは、ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターが、核酸増幅の間に臨床サンプル中に存在する天然に存在するタンパク質を結合することである。従って、本開示は、病原性微生物に感染した被験体から得た臨床サンプルから、ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを除去する方法を提供する。
臨床サンプル
本発明の方法は、種々のタイプの被験体から得た種々のタイプの臨床サンプルに対して行われ得る。いくつかの実施形態において、臨床サンプルは、ヒトおよび／または他の哺乳動物起源の血液、リンパ液、尿、糞便、喀痰、粘液、唾液、組織膿瘍、創傷ドレナージ、洗浄物、脳脊髄液または任意の流体吸引物もしくは組織抽出物である。
本発明の方法は、種々のタイプの被験体から得た種々のタイプの臨床サンプルに対して行われ得る。いくつかの実施形態において、臨床サンプルは、ヒトおよび／または他の哺乳動物起源の血液、リンパ液、尿、糞便、喀痰、粘液、唾液、組織膿瘍、創傷ドレナージ、洗浄物、脳脊髄液または任意の流体吸引物もしくは組織抽出物である。
サンプル容器
種々の異なるサンプル容器が、種々のタイプの臨床サンプルに合わせて、当該分野で使用される。多くの場合に、最も一般に使用されかつ市販されているサンプル容器は、サンプル中に存在する種々の核酸の遺伝的同定または分析の間に、核酸増幅インヒビターとして作用するという意図しない影響を有し得る保存剤および／または抗凝固剤（例えば、ＳＰＳ、ヘパリン、ヒアルロネート、デルマタン硫酸ポリアニオン、ＥＤＴＡ、およびコンドロイチンＤ－グルクロネートアニオン）が予め装填されている。例えば、一般に使用される血液収集容器、血液培養ボトル、血漿チューブ、および血液培養培地は、ヘパリン（例えば、カタログ番号３６４９６０、３６６６６７、３６７８７１、３６７８７８、３６７８８４、３６７８８６、３６７９６０、３６７９６１、３６７９６２、および３６７９６４ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標） ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｔｕｂｅｓ， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）、ＳＰＳ（例えば、カタログ番号３６４９６０ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標） ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｔｕｂｅｓ， カタログ番号４４２０２２および４４２０２３， ＢＡＣＴＥＣＴＭ ＰＬＵＳ ｍｅｄｉａ， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）またはＥＤＴＡカリウム（例えば、カタログ番号３６７８４２、３６７８９９および３６８５８９， Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標） Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｋ２ＥＤＴＡ Ｔｕｂｅｓ， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）を含み得る。
種々の異なるサンプル容器が、種々のタイプの臨床サンプルに合わせて、当該分野で使用される。多くの場合に、最も一般に使用されかつ市販されているサンプル容器は、サンプル中に存在する種々の核酸の遺伝的同定または分析の間に、核酸増幅インヒビターとして作用するという意図しない影響を有し得る保存剤および／または抗凝固剤（例えば、ＳＰＳ、ヘパリン、ヒアルロネート、デルマタン硫酸ポリアニオン、ＥＤＴＡ、およびコンドロイチンＤ－グルクロネートアニオン）が予め装填されている。例えば、一般に使用される血液収集容器、血液培養ボトル、血漿チューブ、および血液培養培地は、ヘパリン（例えば、カタログ番号３６４９６０、３６６６６７、３６７８７１、３６７８７８、３６７８８４、３６７８８６、３６７９６０、３６７９６１、３６７９６２、および３６７９６４ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標） ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｔｕｂｅｓ， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）、ＳＰＳ（例えば、カタログ番号３６４９６０ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標） ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｔｕｂｅｓ， カタログ番号４４２０２２および４４２０２３， ＢＡＣＴＥＣＴＭ ＰＬＵＳ ｍｅｄｉａ， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）またはＥＤＴＡカリウム（例えば、カタログ番号３６７８４２、３６７８９９および３６８５８９， Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標） Ｐｌｕｓ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｋ２ＥＤＴＡ Ｔｕｂｅｓ， ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）を含み得る。
本発明の方法において、上記サンプルは、代表的には、それらが集められ、本発明の方法を行う前に、新しい容器（例えば、遠心分離チューブまたは微小流体デバイス）へと移された上記サンプル容器から除去される。しかし、いくつかの場合には、サンプル収集容器の性質に依存して、１またはこれより多くの工程が、上記サンプルが集められた容器の中で行われ得る。
タンパク質結合ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビター
上記で記載されるように、本発明は、一部は、臨床サンプルにプロテアーゼを添加することで、上記サンプルの完全性または品質を別段実質的に害することなく、処理された臨床サンプル中のある特定の核酸増幅インヒビターによる汚染が低減され、それによって、上記サンプル内の核酸の核酸増幅を改善するという発見に依存する。いかなる特定の理論によっても拘束されないが、臨床サンプル中のある特定のタンパク質は、核酸増幅インヒビターおよびタンパク質が上記サンプルを処理する間に同じ画分の中に残るように、ある特定の核酸増幅インヒビターに結合して、複合体を形成し得ると考えられる。これは、増幅されるべき核酸の集団からの核酸増幅インヒビターの分離を妨げる場合に、有害な影響を有し得る。
上記で記載されるように、本発明は、一部は、臨床サンプルにプロテアーゼを添加することで、上記サンプルの完全性または品質を別段実質的に害することなく、処理された臨床サンプル中のある特定の核酸増幅インヒビターによる汚染が低減され、それによって、上記サンプル内の核酸の核酸増幅を改善するという発見に依存する。いかなる特定の理論によっても拘束されないが、臨床サンプル中のある特定のタンパク質は、核酸増幅インヒビターおよびタンパク質が上記サンプルを処理する間に同じ画分の中に残るように、ある特定の核酸増幅インヒビターに結合して、複合体を形成し得ると考えられる。これは、増幅されるべき核酸の集団からの核酸増幅インヒビターの分離を妨げる場合に、有害な影響を有し得る。
いくつかの実施形態において、上記核酸増幅インヒビターに結合するタンパク質は、処理において使用される生理学的流体および／または溶液（例えば、遠心分離からの上清または微小流体デバイスもしくは濾過において使用される溶液）中で可溶性である。例えば、いくつかの実施形態において、上記タンパク質は、可溶性血清タンパク質（例えば、血清アルブミン）であり得る。いくつかの実施形態において、上記タンパク質は、ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターと複合体を形成する任意の他の可溶性タンパク質であり得る。臨床サンプル中のタンパク質の非限定的な例としては、ヒト血清アルブミン、アミラーゼ、免疫グロブリン、ラクトフェリン、カルプロテクチン、ミエロペルオキシダーゼ、アズロシジン（ａｚｕｒｏｃｉｄｉｎ）、ラクトトランスフェリン、カテリシジン（ｃａｔｈｅｌｉｃｉｄｉｎ）、ラクターゼ、ミオグロビン、ヘモグロビン、およびトランスフェリンが挙げられる。
病原性微生物
いくつかの局面において、本開示は、臨床サンプルをプロテアーゼで処理した後に、臨床サンプルから微生物ＤＮＡを増幅するための方法を提供する。
いくつかの局面において、本開示は、臨床サンプルをプロテアーゼで処理した後に、臨床サンプルから微生物ＤＮＡを増幅するための方法を提供する。
いくつかの実施形態において、上記微生物は、細菌である。細菌は通常、健康な哺乳動物に存在するが、宿主内での異なるタイプの細菌の中でのバランスの破壊、細菌と宿主との間のバランスの破壊、または宿主内の病原性細菌の存在は、感染をもたらし得る。病原性細菌の非限定的な例としては、以下が挙げられる： Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）。
Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、ヒトの身体に通常存在する細菌であり、鼻、呼吸器の中、および皮膚上で頻繁に見出される。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、常に病原性であるわけではないが、膿瘍、呼吸器感染、および食中毒を含む、皮膚感染症の一般的な原因である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染を処置する一般的な方法は、抗生物質を使用することであるが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの抗生物質耐性株（例えば、メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）およびバンコマイシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ））の出現は、全世界的な臨床上の健康面の難題になっている。
Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、通常、ヒトの身体に存在する細菌であり、ヒトの身体では、頻繁に皮膚上で見出される。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、概して病原性ではないが、免疫系が不全の被験体は、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ感染症を発生させるリスクにあり、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓは、外科手術による移植物を有する被験体に特別な脅威を引き起こす。なぜならそれは、プラスチック表面上で増殖し得、ヒトの身体に拡がり得るからである。Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ株はしばしば、抗生物質（リファマイシン、フルオロキノロン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン、クリンダマイシン、およびスルホンアミドが挙げられる）に耐性である。
Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅは、概して病原性ではなく、ヒトのうちの３０％までで消化管および泌尿生殖路において見出され得る細菌である。Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅに起因する病原性感染症は、新生児および免疫不全の個体にとって重大である。成人におけるＳ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ感染症は、生命を脅かす可能性があり、上記感染症としては、菌血症、軟部組織感染症、骨髄炎、心内膜炎、および髄膜炎が挙げられる。Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅは、クリンダマイシンおよびエリスロマイシンに対してますます耐性になっている。
Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓは、ヒトおよび他の哺乳動物の消化管に住む細菌である。しかし、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓは、心内膜炎、敗血症、***症、および髄膜炎を引き起こし得る。Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ感染症は、特に、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓがゲンタマイシンおよびバンコマイシンでの処置に耐性である場合、生命を脅かす可能性がある。
Ｅ．ｃｏｌｉは、ヒトおよび他の哺乳動物の消化管に住む細菌であるが、それは病原性である可能性もあり、胃腸炎、***症、新生児髄膜炎、出血性大腸炎、および菌血症のような状態を生じる。Ｅ．ｃｏｌｉは、多数の抗生物質（フルオロキノロン、セファロスポリン、およびカルバペネムが挙げられる）に対してますます耐性になっている。
Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、ヒトおよび他の哺乳動物の口、皮膚、および腸の中で通常見出される細菌である。しかし、それは、特に肺胞へと吸入される場合、ヒトおよび哺乳動物の肺に破壊的な変化を引き起こし得る。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染症は、免疫系が不全の被験体（糖尿病、アルコール依存症、がん、肝臓疾患、慢性閉塞性肺疾患、グルココルチコイド治療、および腎不全を有する被験体が挙げられる）において概して見出される。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅは、多数の抗生物質（フルオロキノロン、セファロスポリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カルバペネム、およびトリメトプリム／スルファメトキサゾールが挙げられる）に対してますます耐性になっている。
臨床サンプル中の核酸を単離するための方法
１つの局面において、本開示は、上記被験体に由来する細胞、微生物、およびサンプル中の少なくとも１種のタンパク質に結合する少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、被験体に由来する臨床サンプルを調製するための方法であって、上記方法は、（ａ）上記被験体に由来する細胞、上記微生物、およびタンパク質、ならびにポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、上記被験体に由来する臨床サンプルを得る工程；（ｂ）上記臨床サンプルを、上記被験体の細胞を含む第１の画分ならびに上記微生物および上記タンパク質に結合されるポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第２の画分へと分離する工程；（ｃ）上記第２の画分に、上記タンパク質を分解するプロテアーゼを添加する工程；ならびに（ｄ）上記第２の画分を、上記微生物を含む第３の画分および（ｉｉ）上記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第４の画分へと分離する工程を包含する方法を提供する。
１つの局面において、本開示は、上記被験体に由来する細胞、微生物、およびサンプル中の少なくとも１種のタンパク質に結合する少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、被験体に由来する臨床サンプルを調製するための方法であって、上記方法は、（ａ）上記被験体に由来する細胞、上記微生物、およびタンパク質、ならびにポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、上記被験体に由来する臨床サンプルを得る工程；（ｂ）上記臨床サンプルを、上記被験体の細胞を含む第１の画分ならびに上記微生物および上記タンパク質に結合されるポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第２の画分へと分離する工程；（ｃ）上記第２の画分に、上記タンパク質を分解するプロテアーゼを添加する工程；ならびに（ｄ）上記第２の画分を、上記微生物を含む第３の画分および（ｉｉ）上記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第４の画分へと分離する工程を包含する方法を提供する。
別の局面において、本開示は、微生物、およびサンプル中の少なくとも１種のタンパク質を結合する少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、被験体に由来する臨床サンプルを調製するための方法であって、上記方法は、（ａ）上記微生物および少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、上記被験体に由来する臨床サンプルを得る工程、（ｂ）上記サンプルに、上記タンパク質を分解するプロテアーゼを添加する工程、（ｃ）上記サンプルを、上記被験体の細胞を含む第１の画分ならびに上記微生物および上記タンパク質に結合されるポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第２の画分へと分離する工程、（ｄ）上記第２の画分を上記第１の画分から除去する工程、ならびに（ｅ）上記第２の画分を、上記微生物を含む第３の画分および上記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第４の画分へと分離する工程を包含する方法を提供する。
核酸増幅インヒビター
いくつかの実施形態において、核酸増幅インヒビターは、臨床サンプルが得られる場合に、容器の中に存在する。いくつかの実施形態において、上記核酸増幅インヒビターは、サンプル処理の間に臨床血液サンプルへと導入される。核酸増幅インヒビターは、ポリアニオン性ポリマー化合物（例えば、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム（ＳＰＳ）またはヘパリン）であり得る。核酸増幅インヒビターはまた、タンパク質（例えば、細菌毒素または免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ））であり得る。
いくつかの実施形態において、核酸増幅インヒビターは、臨床サンプルが得られる場合に、容器の中に存在する。いくつかの実施形態において、上記核酸増幅インヒビターは、サンプル処理の間に臨床血液サンプルへと導入される。核酸増幅インヒビターは、ポリアニオン性ポリマー化合物（例えば、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム（ＳＰＳ）またはヘパリン）であり得る。核酸増幅インヒビターはまた、タンパク質（例えば、細菌毒素または免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ））であり得る。
いくつかの実施形態において、核酸増幅インヒビターは、ポリアニオン性ポリマーである。いくつかの実施形態において、ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターは、５００Ｄａ超、１キロダルトン（１ｋＤａ）超、２ｋＤａ超、３ｋＤａ超、４ｋＤａ超、５ｋＤａ超、６ｋＤａ超、７ｋＤａ超、８ｋＤａ超、９ｋＤａ超、または１０ｋＤａ超の平均分子量を有する。ポリアニオン性ポリマーの非限定的な例としては、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム、ヘパリン、ヒアルロネート、デルマタン硫酸ポリアニオン、およびコンドロイチンＤ－グルクロネートアニオンが挙げられる。
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種のポリアニオン性ポリマーは、ポリアネトールスルホン酸ナトリウムである。上記で注記されるように、ＳＰＳは、種々の市販のサンプル収集容器（血液培養ボトルおよび微生物学的血液収集真空液体容器が挙げられる）に添加される。ＳＰＳは、カチオン性抗細菌剤の活性および有効性に干渉し、細菌に対する血液の阻害効果に対抗する。しかし、臨床サンプル容器中のＳＰＳの存在は、下流の分子ベースのアッセイ（核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を使用するアッセイを含む）の阻害を生じる。ＳＰＳはまた、先天的免疫および液性免疫を通じて細菌の殺滅から補体カスケードを阻害することによって、臨床血液サンプル中に存在する細菌を保護する。
いくつかの実施形態において、上記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターは、ヘパリンである。ヘパリンは、抗トロンビンを活性化し、従って、凝固カスケードを遮断する抗凝固剤である。上記で注記されるように、ヘパリンは、いくつかのサンプル収集容器（臨床血液サンプル容器が挙げられる）に存在する。いくつかの実施形態において、上記ヘパリンは、凍結乾燥される。いくつかの実施形態において、上記ヘパリンは、噴霧乾燥される。代表的には、ヘパリンまたは別の抗凝固剤のいずれかが、全血および血漿の収集が意図される血液サンプル容器に存在する。なぜなら抗凝固剤は、凝血および血清の形成を防止し得るからである。逆に、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）は、代表的には、凝血および血清のために使用されるべき血液サンプル収集容器には存在しない。いくつかの実施形態において、上記臨床血液サンプル容器に存在するヘパリンは、ヘパリン塩である。いくつかの実施形態において、ヘパリンは、ヘパリンナトリウムである。いくつかの実施形態において、ヘパリンは、ヘパリンリチウムである。いくつかの実施形態において、ヘパリンは、ヘパリンアンモニウムである。
プロテアーゼ
本開示は、臨床サンプルを提供するための方法であって、上記方法は、上記臨床サンプルにプロテアーゼを添加する工程を包含する方法を提供する。本発明において有用なプロテアーゼの非限定的な例としては、プロテイナーゼＫ、Ｆａｃｔｏｒ Ｚａ、Ａｒｇ－Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ＋Ｎ末端Ｇｌｕ、ＢＮＰＳ－スカトール、カスパーゼ１、キモトリプシン－高特異性、クロストリパイン、ＣＮＢｒ、エンテロキナーゼ、グランザイムＢ、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、ＬｙｓＮ、ＮＴＣＢ、ペプシン、プロリン－エンドペプチダーゼ、ぶどう球菌ペプチダーゼＩ、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、サーモリシン、トロンビン、トリプシン、エラスターゼ、プラスミン、先体プロテアーゼ、補体Ｃ１、ケラチナーゼ、コラゲナーゼ、フィブリノリシン、コクナーゼ、サーモリシン、およびカルボキシペプチダーゼＡが挙げられる。
本開示は、臨床サンプルを提供するための方法であって、上記方法は、上記臨床サンプルにプロテアーゼを添加する工程を包含する方法を提供する。本発明において有用なプロテアーゼの非限定的な例としては、プロテイナーゼＫ、Ｆａｃｔｏｒ Ｚａ、Ａｒｇ－Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ＋Ｎ末端Ｇｌｕ、ＢＮＰＳ－スカトール、カスパーゼ１、キモトリプシン－高特異性、クロストリパイン、ＣＮＢｒ、エンテロキナーゼ、グランザイムＢ、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、ＬｙｓＮ、ＮＴＣＢ、ペプシン、プロリン－エンドペプチダーゼ、ぶどう球菌ペプチダーゼＩ、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、サーモリシン、トロンビン、トリプシン、エラスターゼ、プラスミン、先体プロテアーゼ、補体Ｃ１、ケラチナーゼ、コラゲナーゼ、フィブリノリシン、コクナーゼ、サーモリシン、およびカルボキシペプチダーゼＡが挙げられる。
いくつかの実施形態において、上記プロテアーゼは、プロテイナーゼＫである。プロテイナーゼＫは、真菌Ｅｎｇｙｏｄｏｎｔｉｕｍ ａｌｂｕｍによって生成される酵素である。プロテイナーゼＫは、疎水性アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、またはトリプトファン）の後ろのタンパク質を優先的に分解する。しかし、タンパク質は、プロテイナーゼＫとともに充分長くインキュベートされれば、完全に分解される。プロテイナーゼＫ活性は、広いｐＨ範囲（例えば、ｐＨ４～ｐＨ１２）にわたって安定であり、３７℃から５０～６０℃への反応温度の上昇は、プロテイナーゼＫの活性を数倍増大させ得る。核酸を有するサンプルへのプロテイナーゼＫの添加は、核酸を結合し、分解するタンパク質を迅速に不活性化する。
いくつかの実施形態において、上記プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、Ｆａｃｔｏｒ Ｚａ、Ａｒｇ－Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ＋Ｎ末端Ｇｌｕ、ＢＮＰＳ－スカトール、カスパーゼ１、キモトリプシン－高特異性、クロストリパイン、ＣＮＢｒ、エンテロキナーゼ、グランザイムＢ、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、ＬｙｓＮ、ＮＴＣＢ、ペプシン、プロリン－エンドペプチダーゼ、ぶどう球菌ペプチダーゼＩ、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、サーモリシン、トロンビン、およびトリプシンからなる群より選択される。
いくつかの実施形態において、添加されるプロテアーゼの量は、５ユニット／ｍＬ（Ｕ／ｍＬ）～５０００Ｕ／ｍＬの間である。「プロテアーゼユニット（ｐｒｏｔｅａｓｅ ｕｎｉｔ）」（Ｕ）とは、受容されるアッセイ法の特定の条件下で、１分間あたり１マイクロモルの基質の変換を触媒する酵素の量（１Ｕ＝１μｍｏｌ／分）として定義される、プロテアーゼの触媒活性の国際単位である。いくつかの実施形態において、添加されるプロテアーゼの量は、少なくとも５ Ｕ／ｍＬである。いくつかの実施形態において、添加されるプロテアーゼの量は、５０００ Ｕ／ｍＬ未満またはこれに等しい。いくつかの実施形態において、添加されるプロテアーゼの量は、５Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ、３００Ｕ／ｍＬ、４００Ｕ／ｍＬ、５００Ｕ／ｍＬ、６００Ｕ／ｍＬ、７００Ｕ／ｍＬ、８００Ｕ／ｍＬ、９００Ｕ／ｍＬ、１０００Ｕ／ｍＬ、１１００Ｕ／ｍＬ、１２００Ｕ／ｍＬ、１３００Ｕ／ｍＬ、１４００Ｕ／ｍＬ、１５００Ｕ／ｍＬ、１６００Ｕ／ｍＬ、１７００Ｕ／ｍＬ、１８００Ｕ／ｍＬ、１９００Ｕ／ｍＬ、２０００Ｕ／ｍＬ、２１００Ｕ／ｍＬ、２２００Ｕ／ｍＬ、２３００Ｕ／ｍＬ、２４００Ｕ／ｍＬ、２５００Ｕ／ｍＬ、２６００Ｕ／ｍＬ、２７００Ｕ／ｍＬ、２８００Ｕ／ｍＬ、２９００Ｕ／ｍＬ、３０００Ｕ／ｍＬ、３１００Ｕ／ｍＬ、３２００Ｕ／ｍＬ、３３００Ｕ／ｍＬ、３４００Ｕ／ｍＬ、３５００Ｕ／ｍＬ、３６００Ｕ／ｍＬ、３７００Ｕ／ｍＬ、３８００Ｕ／ｍＬ、３９００Ｕ／ｍＬ、４０００Ｕ／ｍＬ、４１００Ｕ／ｍＬ、４２００Ｕ／ｍＬ、４３００Ｕ／ｍＬ、４４００Ｕ／ｍＬ、４５００Ｕ／ｍＬ、４６００Ｕ／ｍＬ、４７００Ｕ／ｍＬ、４８００Ｕ／ｍＬ、４９００Ｕ／ｍＬまたは５０００Ｕ／ｍＬである。
いくつかの実施形態において、上記プロテアーゼは、上記サンプル（または上記サンプルの一部）とともに２０℃～６０℃の間でインキュベートされる。いくつかの実施形態において、上記プロテアーゼは、少なくとも２０℃でインキュベートされる。いくつかの実施形態において、上記プロテアーゼは、６０℃未満またはこれに等しい温度でインキュベートされる。いくつかの実施形態において、上記プロテアーゼは、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、または６０℃でインキュベートされる。
いくつかの実施形態において、上記プロテアーゼは、上記サンプル（または上記サンプルの一部）とともに１０分間～１２０分間の間にわたってインキュベートされる。いくつかの実施形態において、上記プロテアーゼは、少なくとも１０分間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、上記プロテアーゼは、１２０分未満または１２０分間インキュベートされる。いくつかの実施形態において、上記プロテアーゼは、１０分間、２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、７０分間、８０分間、９０分間、１００分間、１１０分間、または１２０分間にわたってインキュベートされる。
臨床サンプル調製
いくつかの局面において、本開示は、臨床サンプルを調製するための方法を提供する。「調製する」とは、診断検査前に臨床サンプルを改変するために行われる工程に言及する。いくつかの実施形態において、調製するは、臨床サンプルを得る、分離する、サンプルの一部を除去する、および／またはさらなる構成要素（例えば、プロテアーゼ）をサンプルに添加する、を含む。
いくつかの局面において、本開示は、臨床サンプルを調製するための方法を提供する。「調製する」とは、診断検査前に臨床サンプルを改変するために行われる工程に言及する。いくつかの実施形態において、調製するは、臨床サンプルを得る、分離する、サンプルの一部を除去する、および／またはさらなる構成要素（例えば、プロテアーゼ）をサンプルに添加する、を含む。
本発明の方法は、サンプル（または部分サンプル）を、宿主細胞、微生物、および／またはポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む画分へと分離する工程または分ける工程を包含する。分離の非限定的な例としては、遠心分離、微小流体技術、免疫沈降、および濾過が挙げられる。
種々の実施形態において、上記宿主細胞は、赤血球、白血球、血小板、上皮細胞、筋細胞、骨細胞、ニューロン、グリア細胞、肝細胞、免疫細胞、腎細胞、胃細胞、および／または結腸細胞であり得る。
いくつかの実施形態において、上記方法は、多数の遠心分離工程を含む。いくつかの実施形態において、２回の遠心分離工程が存在する。いくつかの実施形態において、３回の遠心分離工程が存在する。いくつかの実施形態において、４回の遠心分離工程が存在する。いくつかの実施形態において、５回の遠心分離工程が存在する。いくつかの実施形態において、多数の遠心分離工程が、同じ速度でおよび／または同じ時間の長さにわたって行われ得る。いくつかの実施形態において、多数の遠心分離工程が、異なる速度でおよび／または異なる時間の長さにわたって行われ得る。
いくつかの実施形態において、サンプル（またはサンプル画分）は、５００×ｇ（５００×重力）～５０，０００×ｇの間で遠心分離される。いくつかの実施形態において、サンプル（またはサンプル画分）は、少なくとも５００×ｇで遠心分離される。いくつかの実施形態において、サンプル（またはサンプル画分）は、５０，０００×ｇ未満または５０，０００×ｇで遠心分離される。いくつかの実施形態において、サンプル（またはサンプル画分）は、５００×ｇ、１，０００×ｇ、２，０００×ｇ、３，０００×ｇ、４，０００×ｇ、５，０００×ｇ、６，０００×ｇ、７，０００×ｇ、８，０００×ｇ、９，０００×ｇ、１０，０００×ｇ、１１，０００×ｇ、１２，０００×ｇ、１３，０００×ｇ、１４，０００×ｇ、１５，０００×ｇ、１６，０００×ｇ、１７，０００×ｇ、１８，０００×ｇ、１９，０００×ｇまたは２０，０００×ｇで遠心分離される。
いくつかの実施形態において、サンプル（またはサンプル画分）は、２分間～６０分間の間、遠心分離される。いくつかの実施形態において、サンプル（またはサンプル画分）は、少なくとも２分間遠心分離される。いくつかの実施形態において、サンプル（またはサンプル画分）は、６０分間未満または６０分間遠心分離される。いくつかの実施形態において、サンプル（またはサンプル画分）は、２分間、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、４０分間、４５分間、５０分間、５５分間、または６０分間遠心分離される。
いくつかの実施形態において、遠心分離は、真空液体容器を使用して行われる。いくつかの実施形態において、遠心分離は、血漿チューブを使用して行われる。血漿チューブは、血漿を血清から分離するために、抗凝固剤（例えば、ＥＤＴＡ、クエン酸ナトリウム、ヘパリン）を含む。
上記で記載されるように、サンプル分離は、当該分野で公知の微小流体デバイスを使用して行われ得る。微小流体デバイスの非限定的な例としては、以下が挙げられる： 慣性微小流体技術（ｉｎｅｒｔｉａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）（Ｈｏｕら， ２０１５， 「Ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｅｍｉａｓ ｕｓｉｎｇ ｉｎｅｒｔｉａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ」， Ｌａｂ Ｃｈｉｐ， １５（１０）： ２２９７－２３０７）、プラグベースの微小流体技術（ｐｌｕｇ－ｂａｓｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）（Ｂｏｅｄｉｃｋｅｒら， ２００８， 「Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅｉｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｂｙ ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ ｉｎ ｎａｎｏｌｉｔｅｒ ｄｒｏｐｌｅｔｓ ｕｓｉｎｇ ｐｌｕｇ－ｂａｓｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ」， Ｌａｂ Ｃｈｉｐ， ８： １２６５－１２７２）、オンチップ細菌精製（Ｍａｈａｌａｎａｂｉｓら， ２００９， 「Ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ａｎｄ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒａｍ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｇｒａｍ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｆｒｏｍ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ｉｎ ａ ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｈｉｐ」， Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ ９： ２８１１－２８１７； Ｃａｄｙら， ２００５， Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ： Ｃｈｅｍｉｃａｌ， １０７： ３３２－３４１）、およびアフィニティーベースの捕捉（Ｂｏｅｈｍら， ２００７， Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ： Ｃｈｅｍｉｃａｌ， １２６： ５０８－５１４； Ｘｉａら， ２００６， 「Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ－ｍｉｃｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｌｏｗ」， Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ ８： ２９９－３０８； Ｙｕｎｇら， ２００９， 「Ｍｉｃｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ－ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｂｌｏｏｄ ｃｌｅａｎｓｉｎｇ ｄｅｖｉｃｅ」， Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ， ９：１１７１－１１７７； Ｌｅｅら， ２０１４， 「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｌｉｇａｎｄ－ｃｏａｔｅｄ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｂｌｏｏｄ」， Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒ， １４： １－５； Ｃｈｏら， ２００７， 「Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ｏｎ ａ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ」， Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ， ７： ５６５－５７３）。
いくつかの実施形態において、臨床サンプルは、微小流体技術を使用して、１またはこれより多くの画分へと分離される。いくつかの実施形態において、タンパク質、ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビター、および／または宿主細胞の高分子複合体は、微小流体技術によって１つの画分へと分離される。いくつかの実施形態において、微生物および／または宿主細胞は、微小流体技術によって１つの画分へと分離される。高分子複合体、宿主細胞または微生物は、分離を補助するために標識され得る。いくつかの実施形態において、上記高分子複合体、宿主細胞または微生物は、上記タンパク質および／または微生物の表面上のタンパク質に結合する、発蛍光団（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ）、アフィニティータグ、または抗体で標識される。いくつかの実施形態において、上記高分子複合体、宿主細胞または微生物は、分離前に標識されない。臨床サンプル中の標識されていない高分子複合体、宿主細胞および／または微生物を微小流体技術によって分離する方法としては、サイズ排除および等速電気泳動が挙げられるが、これらに限定されない。サイズ排除微小流体技術は、より小さな粒子（例えば、微生物、タンパク質、ポリアニオン性ポリマー）をより大きな高分子粒子（例えば、哺乳動物細胞）から分離する。
いくつかの実施形態において、臨床サンプルは、免疫沈降使用して、１またはこれより多くの画分へと分離される。プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）での臨床サンプルの処理は、ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターが免疫沈降抗体に非特異的に結合し得る上記臨床サンプル中のタンパク質と複合体を形成しないようにすることによって、免疫沈降の間に抗体へのタンパク質の非特異的結合を減少させ得る。いくつかの実施形態において、臨床サンプルは、ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターの保持を減少させるために、免疫沈降前にプロテアーゼで処理される。
免疫沈降は、微生物上のタンパク質を結合するが、真核生物上のタンパク質を結合しない抗体を利用し得る。免疫沈降は、真核生物細胞上のタンパク質を結合するが、微生物上のタンパク質を結合しない抗体を利用し得る。いくつかの実施形態において、免疫沈降は、微生物細胞に結合し、これを除去することによって、宿主細胞中の臨床サンプルを富化する。いくつかの実施形態において、免疫沈降は、宿主細胞に結合し、これを除去することによって、臨床サンプルから宿主細胞を枯渇させる。
免疫沈降は、臨床サンプルを分離する別の方法とともに利用され得る。いくつかの実施形態において、遠心分離されるサンプルはまた、ポリアニオン性ポリマー核酸インヒビターの保持をさらに減少させるために、免疫沈降によって分離される。いくつかの実施形態において、微小流体技術によって分離されるサンプルはまた、ポリアニオン性ポリマー核酸インヒビターの保持をさらに減少させるために、免疫沈降によって分離される。いくつかの実施形態において、濾過によって分離されるサンプルは、ポリアニオン性ポリマー核酸インヒビターの保持をさらに減少させるために、免疫沈降によって分離される。
いくつかの実施形態において、臨床サンプルは、濾過を使用して、１またはこれより多くの画分へと分離される。フィルターの孔サイズに依存して、上記フィルターは、宿主細胞、微生物、またはタンパク質複合体（例えば、タンパク質に結合したポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビター）を除去し得る。
本発明の方法において、プロテアーゼは、サンプル調製の間に、臨床サンプルまたは上記サンプルの画分に添加される。いくつかの実施形態において、上記プロテアーゼは、画分への臨床サンプルの何らかの分離の前に、上記サンプルに添加される。いくつかの実施形態において、上記プロテアーゼは、画分へと分離する１またはこれより多くの工程の後に、画分（例えば、上清、再懸濁したペレット、濾液）に添加される。
核酸の増幅
いくつかの局面において、本発明は、元のサンプルに存在した核酸の集団のさらなる増幅工程を含む。核酸集団の増幅は、核酸（例えば、哺乳動物ＤＮＡ、微生物ＤＮＡ）の供給源を同定する前に行われ得る。いくつかの実施形態において、増幅される上記核酸は、微生物核酸である。いくつかの実施形態において、増幅される上記核酸は、宿主核酸である。いくつかの実施形態において、上記核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、上記核酸は、ＲＮＡである。当該分野で公知の核酸増幅技術の非限定的な例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲ、プライマー伸長プレ増幅、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、または転写媒介性増幅（ＴＭＡ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記核酸増幅は、等温鎖置換増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲ、またはプライマー伸長プレ増幅によるものである。
いくつかの局面において、本発明は、元のサンプルに存在した核酸の集団のさらなる増幅工程を含む。核酸集団の増幅は、核酸（例えば、哺乳動物ＤＮＡ、微生物ＤＮＡ）の供給源を同定する前に行われ得る。いくつかの実施形態において、増幅される上記核酸は、微生物核酸である。いくつかの実施形態において、増幅される上記核酸は、宿主核酸である。いくつかの実施形態において、上記核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、上記核酸は、ＲＮＡである。当該分野で公知の核酸増幅技術の非限定的な例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲ、プライマー伸長プレ増幅、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、または転写媒介性増幅（ＴＭＡ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、上記核酸増幅は、等温鎖置換増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲ、またはプライマー伸長プレ増幅によるものである。
先に言及された方法のうちのいずれかによる核酸の集団の増幅は、プライマーおよびポリメラーゼを必要とする。ポリメラーゼの非限定的な例としては、真核生物ポリメラーゼ（例えば、ポリメラーゼα、ポリメラーゼδ、およびポリメラーゼε）；細菌ポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）、およびＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ））；ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩ）；および鎖置換ポリメラーゼが挙げられる。
いくつかの実施形態において、上記核酸増幅は、鎖置換ポリメラーゼによるものである。「鎖置換ポリメラーゼ（ｓｔｒａｎｄ－ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）」とは、プライマーテンプレートを伸長するにつれて、ＤＮＡ二重らせんの鎖を分離する酵素である。鎖置換ポリメラーゼの非限定的な例としては、以下が挙げられる： ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ；Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）；Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）；Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）；Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（登録商標）（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）；ＤＮＡポリメラーゼＩ、ラージフラグメント；Ｍ－ＭｕＬＶ逆転写酵素；Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）；Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）；Ｖｅｎｔ（登録商標）（エキソ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｉｐｓｗｉｃｈ， ＭＡ）；ＳＤポリメラーゼ；およびクレノウフラグメント。いくつかの実施形態において、上記核酸増幅は、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント、またはクレノウフラグメントによるものである。本明細書で使用される場合、「ｐｈｉ２９」とは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓファージｐｈｉ２９に由来する複製ポリメラーゼをいう。ｐｈｉ２９ポリメラーゼは、鎖置換特性および前進的合成（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）特性、ならびに固有の３’→５’エキソヌクレアーゼプローフリーディング能力を有する。
本発明の方法において、プロテアーゼの添加は、臨床サンプル中の核酸の増幅を増大させる。いくつかの実施形態において、上記核酸集団は、微生物核酸である。いくつかの実施形態において、上記プロテアーゼの添加は、プロテアーゼで処理していないサンプルと比較して、５倍～１００倍の間で核酸の増幅を増大させる。いくつかの実施形態において、上記核酸の増幅は、プロテアーゼで処理していないサンプルと比較して、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、または１００倍増大される。いくつかの実施形態において、上記核酸の増幅は、プロテアーゼで処理していないサンプルと比較して、少なくとも５倍増大される。いくつかの実施形態において、上記核酸の増幅は、プロテアーゼで処理していないサンプルと比較して、１００倍より少なく増大される。
本発明の方法において、プロテアーゼの添加は、臨床サンプルからの核酸の単離を増大させる。いくつかの実施形態において、上記核酸は、微生物核酸である。いくつかの実施形態において、上記プロテアーゼの添加は、プロテアーゼで処理していないサンプルと比較して、１０倍～１００倍の間で核酸の単離を増大させる。いくつかの実施形態において、上記核酸の単離は、プロテアーゼで処理していないサンプルと比較して、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、または１００倍増大される。いくつかの実施形態において、上記核酸の単離は、プロテアーゼで処理していないサンプルと比較して、少なくとも１０倍増大される。いくつかの実施形態において、上記核酸の単離は、１００倍より少なく増大される。
サンプル処理の代替方法に対する適用
いくつかの局面において、本開示は、微生物、細胞、およびサンプル中の少なくとも１種のタンパク質を結合する少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、被験体に由来する臨床サンプルを調製するための方法であって、上記方法は、（ａ）上記微生物、上記タンパク質および上記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、上記被験体に由来する臨床サンプルを得る工程、（ｂ）上記臨床サンプルに、上記タンパク質を分解するプロテアーゼを添加する工程、（ｃ）上記臨床サンプルを、上記被験体の細胞を含む第１の画分ならびに上記微生物および上記タンパク質に結合されるポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第２の画分へと分離する工程、（ｄ）上記第２の画分を上記第１の画分から除去する工程、（ｅ）上記第２の画分を、上記微生物を含む第３の画分および上記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第４の画分へと分離する工程を包含する方法を提供する。
いくつかの局面において、本開示は、微生物、細胞、およびサンプル中の少なくとも１種のタンパク質を結合する少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、被験体に由来する臨床サンプルを調製するための方法であって、上記方法は、（ａ）上記微生物、上記タンパク質および上記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、上記被験体に由来する臨床サンプルを得る工程、（ｂ）上記臨床サンプルに、上記タンパク質を分解するプロテアーゼを添加する工程、（ｃ）上記臨床サンプルを、上記被験体の細胞を含む第１の画分ならびに上記微生物および上記タンパク質に結合されるポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第２の画分へと分離する工程、（ｄ）上記第２の画分を上記第１の画分から除去する工程、（ｅ）上記第２の画分を、上記微生物を含む第３の画分および上記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第４の画分へと分離する工程を包含する方法を提供する。
いくつかの局面において、本開示は、微生物、細胞、およびサンプル中の少なくとも１種のタンパク質を結合する少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、被験体に由来する臨床サンプルを調製するための方法であって、上記方法は、（ａ）上記微生物、上記タンパク質、および上記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、上記被験体に由来する臨床サンプルを得る工程、（ｂ）上記臨床サンプルを、上記被験体の細胞を含む第１の画分ならびに上記微生物および上記タンパク質に結合されるポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第２の画分へと分離する工程、（ｃ）上記第２の画分を上記第１の画分から分離する工程、（ｄ）上記第２の画分に、工程（ｂ）または工程（ｃ）の後に、上記第２の画分中の上記タンパク質を分解するプロテアーゼを添加する工程、（ｅ）上記第２の画分を、上記微生物を含む第３の画分および上記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第４の画分へと分離する工程を包含する方法を提供する。
いくつかの局面において、本開示は、微生物、およびサンプル中の少なくとも１種のタンパク質を結合する少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、被験体に由来する臨床サンプルを調製するための方法であって、上記方法は、（ａ）上記微生物、上記タンパク質、および上記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、上記被験体に由来する臨床サンプルを得る工程、（ｂ）上記微生物を選択的に溶解する工程、（ｃ）上記臨床サンプルに、上記タンパク質を分解するプロテアーゼを添加する工程、（ｄ）上記臨床サンプルを、上記臨床サンプルの細胞を含む第１の画分および上記微生物に由来する核酸を含む第２の画分へと分離する工程を包含する方法を提供する。
前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記分離する工程は、遠心分離によるものである。前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記分離は、濾過によるものである。前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記分離は、微小流体サイズ排除によるものである。前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記分離は、血漿チューブによるものである。前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記分離は、免疫沈降によるものである。
前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記臨床サンプルは、血液、喀痰、尿、粘液、唾液、組織膿瘍、創傷ドレナージ、リンパ液、洗浄物、糞便、脳脊髄液、またはヒトもしくは他の哺乳動物起源の任意の流体吸引物もしくは組織抽出物である。
前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターは、ポリアネトールスルホン酸ナトリウムである。前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターは、ヘパリンである。
前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記得る工程は、真空液体容器または血液培養ボトルを利用する。
前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、第Ｘａ因子、Ａｒｇ－Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ＋Ｎ末端Ｇｌｕ、３－ブロモ－３－メチル－２－（２－ニトロフェニルチオ）－３Ｈ－インドール（ＢＮＰＳ－スカトール）、カスパーゼ１、キモトリプシン－高特異性、クロストリパイン、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、エンテロキナーゼ、グランザイムＢ、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、ＬｙｓＮ、２－ニトロ－５－チオシアナト安息香酸（ＮＴＣＢ）、ペプシン、プロリン－エンドペプチダーゼ、ぶどう球菌ペプチダーゼＩ、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、サーモリシン、トロンビン、およびトリプシンからなる群より選択される。
前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記添加されるプロテアーゼの量は、５ユニット／ｍＬ（Ｕ／ｍＬ）～５０００ユニット／ｍＬ（Ｕ／ｍＬ）の間である。
前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記プロテアーゼおよび上記第２の画分は、２０℃～５５℃の間で少なくとも１０分間インキュベートされる。
前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記微生物は、病原性微生物である。
前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記方法は、上記第３の画分中の核酸の核酸増幅工程をさらに包含する。前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記核酸増幅は、等温鎖置換増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲ、またはプライマー伸長プレ増幅である。
前述の局面の各々のうちのいくつかの実施形態において、上記プロテアーゼの添加は、プロテアーゼが添加されていないサンプルに対して少なくとも５倍、上記微生物核酸の増幅を増大させる。
実施例１：ポリアネトールスルホン酸ナトリウム（ＳＰＳ）は、血清／血漿タンパク質を結合する
血液収集容器は一般に、抗凝固剤、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム（ＳＰＳ）を含む。ＳＰＳは、多くの利点 － 補体系による細菌細胞の溶解の防止、血球凝集の低減、ならびに固体（例えば、赤血球および白血球など）および液体（例えば、血漿、低分子量核酸増幅インヒビターなど）への血液構成要素の分離の促進、を有するが、ＳＰＳが液相中にあり続けることは、核酸増幅のような下流のアプローチを阻害することが広く公知である。
血液収集容器は一般に、抗凝固剤、ポリアネトールスルホン酸ナトリウム（ＳＰＳ）を含む。ＳＰＳは、多くの利点 － 補体系による細菌細胞の溶解の防止、血球凝集の低減、ならびに固体（例えば、赤血球および白血球など）および液体（例えば、血漿、低分子量核酸増幅インヒビターなど）への血液構成要素の分離の促進、を有するが、ＳＰＳが液相中にあり続けることは、核酸増幅のような下流のアプローチを阻害することが広く公知である。
どのようにしてＳＰＳが細胞および血漿への血液の分離後にあり続けるかに関する１つの仮説は、それが、液相中の分子（例えば、血漿および血清中の存在量が最も豊富なタンパク質であるアルブミンのようなタンパク質）と大きな複合体を形成し、それが、分離の間の共沈を引き起こすことである。この仮説は、０．０５％ ＳＰＳと０．２５％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）とを予め混合することによって試験した。すると、そのＳＰＳ－ＢＳＡ混合物は、ＳＹＢＲ－ｓａｆｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）で染色したアガロースゲル上で、細部によって分離された（図１）。
図１において、レーン１は、１ｋｂ ＤＮＡラダーであり、レーン２は、０．２５％ ＢＳＡであり、レーン３は、０．０５％ ＳＰＳである；レーン４は、０．２５％ ＳＰＳおよび０．０５％ ＢＳＡの混合物である。０．０５％ ＳＰＳ単独および０．２５％ ＢＳＡ単独の溶液は、ＳＹＢＲ－ｓａｆｅで目視できない。これは、ＳＰＳおよびＢＳＡが、大きな高分子複合体を形成することを示す。
実施例２： ＳＰＳタンパク質複合体は、プロテイナーゼＫ処理で低減される
プロテアーゼ処理がＳＰＳタンパク質複合体を破壊するか否かを決定するために、健常ドナーに由来する全血サンプルを、ＡＣＤ真空容器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）中に集めた。全血のうちの１ミリリットル（ｍＬ）を、１．７５ｍＬのダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ， Ｃａ＋２およびＭｇ＋２非含有、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）および０．２５ｍＬの水中１％ ＳＰＳで３倍希釈した。合計８個の血液サンプルを、分析用に調製した。
プロテアーゼ処理がＳＰＳタンパク質複合体を破壊するか否かを決定するために、健常ドナーに由来する全血サンプルを、ＡＣＤ真空容器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）中に集めた。全血のうちの１ミリリットル（ｍＬ）を、１．７５ｍＬのダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水（ＤＰＢＳ， Ｃａ＋２およびＭｇ＋２非含有、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）および０．２５ｍＬの水中１％ ＳＰＳで３倍希釈した。合計８個の血液サンプルを、分析用に調製した。
細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を、最終濃度 ９０，０００コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬにおいて上記血液サンプルに添加して、菌血症の血液サンプルを模倣した。その菌血症の血液サンプルを短時間遠心分離（５００×ｇで３分間）して、ヒト血球（すなわち、赤血球および白血球）を細菌富化血漿から分離した。そのペレットは、赤血球および白血球を含み、その上清は、血漿、細菌、ならびにＳＰＳ－血清タンパク質複合体およびＳＰＳ－血清タンパク質複合体を含んだ。上記菌血症の血液サンプルに由来する上清のうちの２ミリリットルを、ピペット操作することによって手動で除去し、新しいチューブに移した。この最初の上清（Ｓ１）を、プロテアーゼであるプロテイナーゼＫ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）の漸増濃度（上清１ｍＬあたり０ユニット（Ｕ）、４Ｕ、１２Ｕ、および４０Ｕ）で、３７℃において５分間処理し、次いで、４０μＬの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を、最終濃度 ０．２％に達するように添加し、３７℃において５分間さらにインキュベートする。次いで、Ｓ１を、３０００×ｇで５分間遠心分離し、過剰な上清を除去する。その元のペレット化した血液サンプルを、さらに２ミリリットルの１×ＤＰＢＳで再懸濁し、次いで、５００×ｇで３分間もう１回遠心分離する。第２の上清（Ｓ２）のうちのさらなる２ミリリットルを取り出し、３０００×ｇの遠心分離の後にＳ１に由来するペレットに添加する。次いで、Ｓ２を、４０μＬの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００で５分間、室温において処理し、３０００×ｇで遠心分離する。次いで、過剰な上清を吸引して、最終サンプルを残す。
全ての実験サンプル（上清およびプロテイナーゼＫ）およびコントロールサンプル（プロテイナーゼＫなしの上清）を、９００μＬのＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（Ｓｉｇｍａ Ｐ９４１６））中に再懸濁し、１０，０００×ｇで３分間さらに遠心分離して、上記細菌および不溶性ＳＰＳ－血清タンパク質複合体を濃縮した。この遠心分離に由来する上清を、遠心分離後に完全に吸引し、ペレットのみを残した。
ペレット化したサンプルを、１０μＬの１×ＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、１０μＬの溶解緩衝液（５０ｍＭ ＮａＯＨ、０．４ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶解する。溶解したサンプルを、７５℃で１０分間インキュベートして、溶解を促進し、次いで、１０μＬの中和緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０））を添加する。各サンプルのうちの１５μＬを、ＳＹＢＲ－ｓａｆｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）で染色したアガロースゲル上で泳動させて、ＳＰＳ夾雑を可視化する。
図２において、ＳＰＳタンパク質複合体形成を、プロテイナーゼＫ処理によって最小限にする。レーン１は、１ｋｂ ＤＮＡラダーであり、レーン２～３は、プロテイナーゼＫで処理しなかったサンプルであり、レーン４～５は、８ユニット（Ｕ） プロテイナーゼＫで処理したサンプルであり、レーン６～７は、２４Ｕ プロテイナーゼＫで処理したサンプルであり、レーン８～９は、８０Ｕ プロテイナーゼＫで処理したサンプルである。プロテイナーゼＫを含まないサンプルからの細菌ペレットは、プロテイナーゼＫを含むサンプルに対してＳＰＳおよび血清タンパク質が富化された（図２）。さらに、プロテイナーゼＫでの処理は、濃度依存性様式において、上記ペレット中のＳＰＳおよび血清タンパク質を低減させた。
実施例３： プロテイナーゼＫでの処理は、ＳＰＳを含む菌血症の血液サンプル中の血清タンパク質を低減させる
プロテイナーゼＫでの処理が、顕著な可溶性タンパク質低減を生じるか否かを決定するために、健常ドナーに由来する全血サンプルのうちの１ｍＬを、ＳＰＳを含む真空液体容器中に集め、最終容積 ３ｍＬへと１×ＤＰＢＳ（Ｃａ＋２およびＭｇ＋２非含有、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）で希釈した。上記サンプルに、１０，０００ ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉを添加して、菌血症の血液サンプルを模倣した。
プロテイナーゼＫでの処理が、顕著な可溶性タンパク質低減を生じるか否かを決定するために、健常ドナーに由来する全血サンプルのうちの１ｍＬを、ＳＰＳを含む真空液体容器中に集め、最終容積 ３ｍＬへと１×ＤＰＢＳ（Ｃａ＋２およびＭｇ＋２非含有、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）で希釈した。上記サンプルに、１０，０００ ＣＦＵのＥ．ｃｏｌｉを添加して、菌血症の血液サンプルを模倣した。
上記菌血症の血液サンプルを、５００×ｇで遠心分離して、血球をペレット化した。そのペレットは、赤血球および白血球を含み、その上清は、血漿、細菌、およびＳＰＳ－血清タンパク質複合体を含んだ。上記菌血症の血液サンプルに由来する上清のうちの２ミリリットルを、ピペット操作することによって手動で除去し、新しいチューブに移し、その後、最終濃度 ０．２％になるように４０μＬの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００および最終濃度 ４Ｕ／ｍＬになるように８ユニット（Ｕ）のプロテイナーゼＫで処理した（図３）。全てのサンプルを、３７℃で１０分間インキュベートした。その上清のサンプルを、プロテイナーゼＫ処理の前および後で取り出し、ＢＯＬＴ ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）で希釈し、ＭＥＳ ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）とともに、ＢＯＬＴ ４－１２％ Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）上に載せた。上記サンプルをゲルで分離した後、そのタンパク質ゲルを、ＰａｇｅＢｌｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）で染色し、製造業者の説明書に従って脱色した。
図３において、レーン１は、ＳｅｅＢｌｕｅ－Ｐｌｕｓ２前染色タンパク質標準（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）であり、レーン２は、ＤＰＢＳで希釈した臨床血液サンプルの遠心分離後の上清に存在するタンパク質であり、レーン３は、１０分間、３７℃でのプロテイナーゼＫ処理後の、ＤＰＢＳで希釈した臨床血液サンプルの遠心分離後の上清に存在するタンパク質である。
図３に認められるように、プロテイナーゼＫ処理は、大きな体積の臨床サンプルにおいて可溶性タンパク質を顕著の低減し、従って、潜在的なＳＰＳ－タンパク質複合体形成およびその後の富化されたペレットにおける夾雑をを低減する。
実施例４： 細菌生存度は、プロテイナーゼＫ処理によって影響を及ぼされない
細菌生存度に対するプロテイナーゼＫ処理の効果を調べるために、臨床血液サンプルを集め、実施例２におけるように、以下を改変して処理した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ． ｃｏｌｉ）細菌を、最終濃度 １０，０００ ＣＦＵ／ｍＬにおいて、ＳＰＳバキュテイナー中に集め、希釈した血液サンプルに添加した。Ａ プロテイナーゼＫで処理した上清のうちの１００μＬ 画分およびプロテイナーゼＫで処理しなかった上清のうちの１００μＬ 画分を、アガープレート上で培養した。個々のコロニーを、一晩のインキュベーション後に計数した。その上清中のＥ．ｃｏｌｉの生存度は、プロテイナーゼＫでの処理によって顕著には阻害されなかった（図４）。図４はまた、ＳＰＳ真空液体容器中に集めた臨床血液サンプルからの生存する細菌の優れた回収を図示する。
細菌生存度に対するプロテイナーゼＫ処理の効果を調べるために、臨床血液サンプルを集め、実施例２におけるように、以下を改変して処理した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ． ｃｏｌｉ）細菌を、最終濃度 １０，０００ ＣＦＵ／ｍＬにおいて、ＳＰＳバキュテイナー中に集め、希釈した血液サンプルに添加した。Ａ プロテイナーゼＫで処理した上清のうちの１００μＬ 画分およびプロテイナーゼＫで処理しなかった上清のうちの１００μＬ 画分を、アガープレート上で培養した。個々のコロニーを、一晩のインキュベーション後に計数した。その上清中のＥ．ｃｏｌｉの生存度は、プロテイナーゼＫでの処理によって顕著には阻害されなかった（図４）。図４はまた、ＳＰＳ真空液体容器中に集めた臨床血液サンプルからの生存する細菌の優れた回収を図示する。
実施例５： プロテイナーゼＫでの処理は、ＳＰＳを添加して集めたサンプルの富化ペレットからの、インビトロＤＮＡ増幅の速度を増強する。
ＤＮＡ増幅効率に対するプロテイナーゼＫ処理の効果を調べるために、臨床血液サンプルを、ＡＣＤバキュテイナー中に集め、実施例２にあるように、１×ＤＰＢＳおよびＳＰＳで希釈した。細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を、上記血液サンプルに、最終濃度１，０００ ＣＦＵ／ｍＬで添加して、菌血症の血液サンプルを模倣した。その菌血症の血液サンプルを、５００×ｇで３分間、短時間遠心分離して、細菌富化した血漿からヒト血球を分離した。上記菌血症の血液サンプルに由来する上清のうちの２ミリリットルを、ピペット操作することによって手動で除去し、新しいチューブに移した（上清１、Ｓ１）。そのペレット化した血液サンプルを、さらに２ミリリットルの１×ＤＰＢＳで再懸濁し、次いで、５００×ｇで３分間、もう１回遠心分離した。この第２の上清（Ｓ２）のうちのさらに２ミリリットルを取り出し、Ｓ１に添加した。次いで、その合わせた４ｍＬの上清を、プロテイナーゼＫなしまたは４Ｕ／ｍＬのプロテイナーゼＫ、および、最終濃度０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００で、３７℃において１０分間処理した。次いで、上記サンプルを、３０００×ｇで５分間遠心分離して、細菌を集めた。その上清の大部分を吸引し、濃縮したサンプルを残した。
ＤＮＡ増幅効率に対するプロテイナーゼＫ処理の効果を調べるために、臨床血液サンプルを、ＡＣＤバキュテイナー中に集め、実施例２にあるように、１×ＤＰＢＳおよびＳＰＳで希釈した。細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を、上記血液サンプルに、最終濃度１，０００ ＣＦＵ／ｍＬで添加して、菌血症の血液サンプルを模倣した。その菌血症の血液サンプルを、５００×ｇで３分間、短時間遠心分離して、細菌富化した血漿からヒト血球を分離した。上記菌血症の血液サンプルに由来する上清のうちの２ミリリットルを、ピペット操作することによって手動で除去し、新しいチューブに移した（上清１、Ｓ１）。そのペレット化した血液サンプルを、さらに２ミリリットルの１×ＤＰＢＳで再懸濁し、次いで、５００×ｇで３分間、もう１回遠心分離した。この第２の上清（Ｓ２）のうちのさらに２ミリリットルを取り出し、Ｓ１に添加した。次いで、その合わせた４ｍＬの上清を、プロテイナーゼＫなしまたは４Ｕ／ｍＬのプロテイナーゼＫ、および、最終濃度０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ１００で、３７℃において１０分間処理した。次いで、上記サンプルを、３０００×ｇで５分間遠心分離して、細菌を集めた。その上清の大部分を吸引し、濃縮したサンプルを残した。
全ての実験サンプルを、９００μＬのＴＢＳＴ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（Ｓｉｇｍａ Ｐ９４１６））中で再懸濁し、１０，０００×ｇで３分間さらに遠心分離して、細菌を濃縮した。その上清を完全に吸引し、ペレットのみを残した。
次いで、その濃縮され、ペレット化したサンプルを、ＭＤＡ反応緩衝液に、０．５％ ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を補充して、ＲＥＰＬＩ－ｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ＭＤＡプロトコールに供した。時点サンプルを、３０℃でのインキュベーション／ＭＤＡの１．５時間後、２．５時間後、および４時間後に採取した。その細菌ＤＮＡ濃度を定量するために、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子濃度を、特注の１６Ｓ ｒＲＮＡ ＴａｑＭａｎプローブおよびＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて測定した。全ての増幅したＤＮＡを、Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）を使用して定量した。
図５Ａは、プロテイナーゼＫの添加が、１．５時間、２．５時間、および４時間の時点で、プロテイナーゼＫで処理しなかったサンプルと比較した場合、全ＤＮＡ増幅の速度を少なくとも１００倍増強することを図示する。図５Ｂは、全ＤＮＡ増幅と同様に、細菌ＤＮＡ増幅がまた、１６Ｓシグナルによって測定される場合、プロテイナーゼＫで処理しなかったサンプルと比較した場合に、少なくとも１００倍増大されることを図示する。
実施例６： プロテイナーゼＫでの処理は、ヘパリンリチウム真空液体容器中に集めたサンプルからのインビトロＤＮＡ増幅の速度を増強する
健常ドナーに由来する血液を、ヘパリンリチウムバキュテイナー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）へと集めた。４ｍＬの血液の複製物に、２．５ ＣＦＵ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉを添加し、８ｍＬの１×ＤＰＢＳで希釈した。細菌で富化した血漿上清を、実施例２に記載されるように、５００×ｇでの２回連続の遠心分離によって生成した。その上清のうちの半分をプロテイナーゼＫ（最終濃度 ４Ｕ／ｍＬ）で処理し、全ての上清を、１０％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００（最終濃度 ０．２％）で処理し、続いて、１０分間、３７℃でインキュベートした。全ての上清サンプルを、３，０００×ｇで１０分間の高速遠心分離でペレット化した。そのペレットを、１×ＤＮａｓｅ Ｉ緩衝液中で再懸濁し、ＤＮａｓｅ Ｉ（最終濃度 ４０Ｕ／ｍＬ； Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）で１５分間、３７℃において処理した。次いで、そのＤＮａｓｅ処理したサンプルを、１０，０００×ｇで３分間にわたってペレット化し、１ｍＬ ＴＢＳＴで洗浄し、再びペレット化した。その上清を吸引し、そのペレット内に含まれるＤＮＡを、ＲＥＰＬＩ－ｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ＭＤＡプロトコールを使用して増幅した。図６に示されるように、プロテイナーゼＫの添加は、プロテイナーゼＫで処理しなかったコントロールサンプルに対して、細菌ＤＮＡの増幅を平均１０倍増強した（図６）。
健常ドナーに由来する血液を、ヘパリンリチウムバキュテイナー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ， ＮＪ）へと集めた。４ｍＬの血液の複製物に、２．５ ＣＦＵ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉを添加し、８ｍＬの１×ＤＰＢＳで希釈した。細菌で富化した血漿上清を、実施例２に記載されるように、５００×ｇでの２回連続の遠心分離によって生成した。その上清のうちの半分をプロテイナーゼＫ（最終濃度 ４Ｕ／ｍＬ）で処理し、全ての上清を、１０％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００（最終濃度 ０．２％）で処理し、続いて、１０分間、３７℃でインキュベートした。全ての上清サンプルを、３，０００×ｇで１０分間の高速遠心分離でペレット化した。そのペレットを、１×ＤＮａｓｅ Ｉ緩衝液中で再懸濁し、ＤＮａｓｅ Ｉ（最終濃度 ４０Ｕ／ｍＬ； Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）で１５分間、３７℃において処理した。次いで、そのＤＮａｓｅ処理したサンプルを、１０，０００×ｇで３分間にわたってペレット化し、１ｍＬ ＴＢＳＴで洗浄し、再びペレット化した。その上清を吸引し、そのペレット内に含まれるＤＮＡを、ＲＥＰＬＩ－ｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ＭＤＡプロトコールを使用して増幅した。図６に示されるように、プロテイナーゼＫの添加は、プロテイナーゼＫで処理しなかったコントロールサンプルに対して、細菌ＤＮＡの増幅を平均１０倍増強した（図６）。
実施例７： 菌血症の患者から単離した微生物からのＲＮＡライブラリーの合成
ＤＮＡポリメラーゼと同様に、逆転写酵素機能は、ポリアニオン性ポリマー（例えば、ＳＰＳ、ヘパリン）によって阻害される（Ｋｉｅｈｌら， １９７３， Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ ａｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ５１（５）： １７０５－１７０７）。従って、ポリメラーゼインヒビターが存在しないことは、臨床サンプルからの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーの調製、およびその後のトランスクリプトームにとって、極めて重要である。プロテイナーゼＫ処理を使用して、ポリアニオン性ポリマー（例えば、ＳＰＳ、ヘパリン）阻害効果を軽減することはまた、菌血症の患者に由来する微生物細胞またはヒト細胞の転写プロフィールの決定を可能にするために使用され得る。これは、例えば、抗生物質耐性を推測するために臨床的に使用され得る（Ｋｈａｌｅｄｉ，ら， ２０１６， Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， ６０（８）： ４７２２－４７３３）。
ＤＮＡポリメラーゼと同様に、逆転写酵素機能は、ポリアニオン性ポリマー（例えば、ＳＰＳ、ヘパリン）によって阻害される（Ｋｉｅｈｌら， １９７３， Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ ａｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， ５１（５）： １７０５－１７０７）。従って、ポリメラーゼインヒビターが存在しないことは、臨床サンプルからの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリーの調製、およびその後のトランスクリプトームにとって、極めて重要である。プロテイナーゼＫ処理を使用して、ポリアニオン性ポリマー（例えば、ＳＰＳ、ヘパリン）阻害効果を軽減することはまた、菌血症の患者に由来する微生物細胞またはヒト細胞の転写プロフィールの決定を可能にするために使用され得る。これは、例えば、抗生物質耐性を推測するために臨床的に使用され得る（Ｋｈａｌｅｄｉ，ら， ２０１６， Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， ６０（８）： ４７２２－４７３３）。
ｃＤＮＡライブラリーを、当該分野で多くのプロトコールのうちのいずれかを利用して、臨床サンプルから調製する。例えば、その臨床サンプルを、請求項中に記載されるように、プロテイナーゼＫで処理し、所望の微生物ＤＮＡを、遠心分離を通じて単離する。上記サンプル中の全ＲＮＡを、ＰｉｃｏＰｕｒｅ ＲＮＡ単離キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）とランダムヘキサマーまたは任意の他の適切なプライマーを使用して抽出する。
Claims (68)
- 微生物およびサンプル中の少なくとも１種のタンパク質を結合する少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、被験体に由来する臨床サンプルを調製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）前記微生物、前記少なくとも１種のタンパク質、および前記少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、前記被験体に由来する臨床サンプルを得る工程；
（ｂ）前記臨床サンプルを、
（ｉ）前記被験体の前記細胞を含む第１の画分、ならびに
（ｉｉ）前記微生物および前記少なくとも１種のタンパク質に結合される前記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第２の画分、
へと分離する工程；
（ｃ）前記第２の画分に、前記少なくとも１種のタンパク質を分解するプロテアーゼを添加する工程；ならびに
（ｄ）前記第２の画分を、
（ｉ）前記微生物、前記被験体に由来する任意の残りの細胞を含む第３の画分、および
（ｉｉ）前記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第４の画分、
へと分離する工程、
を包含する方法。 - 前記分離する工程は、遠心分離によるものである、請求項１に記載の方法。
- 前記分離する工程は、濾過によるものである、請求項１に記載の方法。
- 前記分離する工程は、微小流体サイズ排除によるものである、請求項１に記載の方法。
- 前記分離する工程は、血漿チューブによるものである、請求項１に記載の方法。
- 前記分離する工程は、免疫沈降によるものである、請求項１に記載の方法。
- 前記臨床サンプルは、血液、喀痰、尿、粘液、唾液、組織膿瘍、創傷ドレナージ、リンパ液、洗浄物、糞便、脳脊髄液、またはヒトもしくは他の哺乳動物起源の任意の流体吸引物もしくは組織抽出物である、請求項１に記載の方法。
- 前記少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターは、ポリアネトールスルホン酸ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
- 前記少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターは、ヘパリンである、請求項１に記載の方法。
- 前記得る工程は、真空液体容器または血液培養ボトルを利用する、請求項１に記載の方法。
- 前記プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、第Ｘａ因子、Ａｒｇ－Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ＋Ｎ末端Ｇｌｕ、３－ブロモ－３－メチル－２－（２－ニトロフェニルチオ）－３Ｈ－インドール（ＢＮＰＳ－スカトール）、カスパーゼ１、キモトリプシン－高特異性、クロストリパイン、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、エンテロキナーゼ、グランザイムＢ、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、ＬｙｓＮ、２－ニトロ－５－チオシアナト安息香酸（ＮＴＣＢ）、ペプシン、プロリン－エンドペプチダーゼ、ぶどう球菌ペプチダーゼＩ、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、サーモリシン、トロンビン、およびトリプシンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
- 前記添加されるプロテアーゼの量は、５ユニット／ｍＬ（Ｕ／ｍＬ）～５０００ユニット／ｍＬ（Ｕ／ｍＬ）の間である、請求項１に記載の方法。
- 前記プロテアーゼおよび前記第２の画分は、２０℃～５５℃の間で少なくとも１０分間インキュベートされる、請求項１に記載の方法。
- 前記微生物は、病原性微生物である、請求項１に記載の方法。
- 前記第３の画分における核酸の核酸増幅工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
- 前記核酸増幅は、等温鎖置換増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲ、またはプライマー伸長プレ増幅である、請求項１５に記載の方法。
- 前記プロテアーゼの添加は、プロテアーゼが添加されていないサンプルに対して少なくとも５倍、微生物核酸の増幅を増大させる、請求項１５に記載の方法。
- 微生物、細胞、およびサンプル中の少なくとも１種のタンパク質を結合する少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、被験体に由来する臨床サンプルを調製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）前記微生物、前記タンパク質および前記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、前記被験体に由来する臨床サンプルを得る工程；
（ｂ）前記臨床サンプルに、前記タンパク質を分解するプロテアーゼを添加する工程；
（ｃ）前記臨床サンプルを、
（ｉ）前記被験体の前記細胞を含む第１の画分、ならびに
（ｉｉ）前記微生物および前記タンパク質に結合されるポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第２の画分；
へと分離する工程、
（ｄ）前記第２の画分を前記第１の画分から除去する工程；ならびに
（ｅ）前記第２の画分を、
（ｉ）前記微生物を含む第３の画分、および
（ｉｉ）前記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第４の画分、
へと分離する工程、
を包含する方法。 - 前記分離する工程は、遠心分離によるものである、請求項１８に記載の方法。
- 前記分離する工程は、濾過によるものである、請求項１８に記載の方法。
- 前記分離する工程は、微小流体サイズ排除によるものである、請求項１８に記載の方法。
- 前記分離する工程は、血漿チューブによるものである、請求項１８に記載の方法。
- 前記分離する工程は、免疫沈降によるものである、請求項１８に記載の方法。
- 前記臨床サンプルは、血液、喀痰、尿、粘液、唾液、組織膿瘍、創傷ドレナージ、リンパ液、洗浄物、糞便、脳脊髄液、またはヒトもしくは他の哺乳動物起源の任意の流体吸引物もしくは組織抽出物である、請求項１８に記載の方法。
- 前記少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターは、ポリアネトールスルホン酸ナトリウムである、請求項１８に記載の方法。
- 前記少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターは、ヘパリンである、請求項１８に記載の方法。
- 前記得る工程は、真空液体容器または血液培養ボトルを利用する、請求項１８に記載の方法。
- 前記プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、第Ｘａ因子、Ａｒｇ－Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ＋Ｎ末端Ｇｌｕ、３－ブロモ－３－メチル－２－（２－ニトロフェニルチオ）－３Ｈ－インドール（ＢＮＰＳ－スカトール）、カスパーゼ１、キモトリプシン－高特異性、クロストリパイン、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、エンテロキナーゼ、グランザイムＢ、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、ＬｙｓＮ、２－ニトロ－５－チオシアナト安息香酸（ＮＴＣＢ）、ペプシン、プロリン－エンドペプチダーゼ、ぶどう球菌ペプチダーゼＩ、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、サーモリシン、トロンビン、およびトリプシンからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
- 前記添加されるプロテアーゼの量は、５ユニット／ｍＬ（Ｕ／ｍＬ）～５０００ユニット／ｍＬ（Ｕ／ｍＬ）の間である、請求項１８に記載の方法。
- 前記プロテアーゼおよび前記臨床サンプルは、２０℃～５５℃の間で少なくとも１０分間インキュベートされる、請求項１８に記載の方法。
- 前記微生物は、病原性微生物である、請求項１８に記載の方法。
- 前記第３の画分における核酸の核酸増幅工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
- 前記核酸増幅は、等温鎖置換増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲ、またはプライマー伸長プレ増幅である、請求項３２に記載の方法。
- 前記プロテアーゼの添加は、プロテアーゼが添加されていないサンプルに対して少なくとも５倍、微生物核酸の増幅を増大させる、請求項３２に記載の方法。
- 微生物、細胞、およびサンプル中の少なくとも１種のタンパク質を結合する少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、被験体に由来する臨床サンプルを調製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）前記微生物、前記タンパク質および前記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、前記被験体に由来する臨床サンプルを得る工程；
（ｂ）前記臨床サンプルを、
（ｉ）前記被験体の前記細胞を含む第１の画分、ならびに
（ｉｉ）前記微生物および前記タンパク質に結合されるポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第２の画分、
へと分離する工程；
（ｃ）前記第２の画分を前記第１の画分から除去する工程；
（ｄ）前記第２の画分に、工程（ｂ）または工程（ｃ）の後に、前記第２の画分における前記タンパク質を分解するプロテアーゼを添加する工程；ならびに
（ｅ）前記第２の画分を、
（ｉ）前記微生物を含む第３の画分、および
（ｉｉ）前記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む第４の画分、
へと分離する工程、
を包含する方法。 - 前記分離する工程は、遠心分離によるものである、請求項３５に記載の方法。
- 前記分離する工程は、濾過によるものである、請求項３５に記載の方法。
- 前記分離する工程は、微小流体サイズ排除によるものである、請求項３５に記載の方法。
- 前記分離する工程は、血漿チューブによるものである、請求項３５に記載の方法。
- 前記分離する工程は、免疫沈降によるものである、請求項３５に記載の方法。
- 前記臨床サンプルは、血液、喀痰、尿、粘液、唾液、組織膿瘍、創傷ドレナージ、リンパ液、洗浄物、糞便、脳脊髄液、またはヒトもしくは他の哺乳動物起源の任意の流体吸引物もしくは組織抽出物である、請求項３５に記載の方法。
- 前記少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターは、ポリアネトールスルホン酸ナトリウムである、請求項３５に記載の方法。
- 前記少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターは、ヘパリンである、請求項３５に記載の方法。
- 前記得る工程は、真空液体容器または血液培養ボトルを利用する、請求項３５に記載の方法。
- 前記プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、第Ｘａ因子、Ａｒｇ－Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ＋Ｎ末端Ｇｌｕ、３－ブロモ－３－メチル－２－（２－ニトロフェニルチオ）－３Ｈ－インドール（ＢＮＰＳ－スカトール）、カスパーゼ１、キモトリプシン－高特異性、クロストリパイン、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、エンテロキナーゼ、グランザイムＢ、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、ＬｙｓＮ、２－ニトロ－５－チオシアナト安息香酸（ＮＴＣＢ）、ペプシン、プロリン－エンドペプチダーゼ、ぶどう球菌ペプチダーゼＩ、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、サーモリシン、トロンビン、およびトリプシンからなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
- 前記添加されるプロテアーゼの量は、５ユニット／ｍＬ（Ｕ／ｍＬ）～５０００ユニット／ｍＬ（Ｕ／ｍＬ）の間である、請求項３５に記載の方法。
- 前記プロテアーゼおよび前記第２の画分は、２０℃～５５℃の間で少なくとも１０分間インキュベートされる、請求項３５に記載の方法。
- 前記微生物は、病原性微生物である、請求項３５に記載の方法。
- 前記第３の画分における核酸の核酸増幅工程をさらに包含する、請求項３５に記載の方法。
- 前記核酸増幅は、等温鎖置換増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲ、またはプライマー伸長プレ増幅である、請求項４９に記載の方法。
- 前記プロテアーゼの添加は、プロテアーゼが添加されていないサンプルに対して少なくとも５倍、微生物核酸の増幅を増大させる、請求項４９に記載の方法。
- 微生物およびサンプル中の少なくとも１種のタンパク質を結合する少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、被験体に由来する臨床サンプルを調製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）前記微生物、前記タンパク質および前記ポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターを含む、前記被験体に由来する臨床サンプルを得る工程；
（ｂ）前記微生物を選択的に溶解する工程；
（ｃ）前記臨床サンプルに、前記タンパク質を分解するプロテアーゼを添加する工程；ならびに
（ｄ）前記臨床サンプルを、
（ｉ）前記臨床サンプルの前記細胞を含む第１の画分、および
（ｉｉ）前記微生物に由来する核酸を含む第２の画分、
へと分離する工程、
を包含する方法。 - 前記分離する工程は、遠心分離によるものである、請求項５２に記載の方法。
- 前記分離する工程は、濾過によるものである、請求項５２に記載の方法。
- 前記分離する工程は、微小流体サイズ排除によるものである、請求項５２に記載の方法。
- 前記分離する工程は、血漿チューブによるものである、請求項５２に記載の方法。
- 前記分離する工程は、免疫沈降によるものである、請求項５２に記載の方法。
- 前記臨床サンプルは、血液、喀痰、尿、粘液、唾液、組織膿瘍、創傷ドレナージ、リンパ液、洗浄物、糞便、脳脊髄液、またはヒトもしくは他の哺乳動物起源の任意の流体吸引物もしくは組織抽出物である、請求項５２に記載の方法。
- 前記少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターは、ポリアネトールスルホン酸ナトリウムである、請求項５２に記載の方法。
- 前記少なくとも１種のポリアニオン性ポリマー核酸増幅インヒビターは、ヘパリンである、請求項５２に記載の方法。
- 前記得る工程は、真空液体容器または血液培養ボトルを利用する、請求項５２に記載の方法。
- 前記プロテアーゼは、プロテイナーゼＫ、第Ｘａ因子、Ａｒｇ－Ｃプロテイナーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ、Ａｓｐ－Ｎエンドペプチダーゼ＋Ｎ末端Ｇｌｕ、３－ブロモ－３－メチル－２－（２－ニトロフェニルチオ）－３Ｈ－インドール（ＢＮＰＳ－スカトール）、カスパーゼ１、キモトリプシン－高特異性、クロストリパイン、臭化シアン（ＣＮＢｒ）、エンテロキナーゼ、グランザイムＢ、ギ酸、グルタミルエンドペプチダーゼ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、ＬｙｓＣ、ＬｙｓＮ、２－ニトロ－５－チオシアナト安息香酸（ＮＴＣＢ）、ペプシン、プロリン－エンドペプチダーゼ、ぶどう球菌ペプチダーゼＩ、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、サーモリシン、トロンビン、およびトリプシンからなる群より選択される、請求項５２に記載の方法。
- 前記添加されるプロテアーゼの量は、５ユニット／ｍＬ（Ｕ／ｍＬ）～５０００ユニット／ｍＬ（Ｕ／ｍＬ）の間である、請求項５２に記載の方法。
- 前記プロテアーゼおよび前記臨床サンプルは、２０℃～５５℃の間で少なくとも１０分間インキュベートされる、請求項５２に記載の方法。
- 前記微生物は、病原性微生物である、請求項５２に記載の方法。
- 前記第２の画分における核酸の核酸増幅工程をさらに包含する、請求項５２に記載の方法。
- 前記核酸増幅は、等温鎖置換増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、縮重オリゴヌクレオチドＰＣＲ、またはプライマー伸長プレ増幅である、請求項６６に記載の方法。
- 前記プロテアーゼの添加は、プロテアーゼが添加されていないサンプルに対して少なくとも５倍、微生物核酸の増幅を増大させる、請求項６６に記載の方法。
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