ES2303379T3 - Polvo de bacteriocina secado por atomizacion con actividad antibiotica. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la obtención de polvo de lacticina 3147 secado por atomización, para utilizar como ingrediente alimentario, que comprende (a) la inoculación de un medio con una cepa de bacterias productoras de lacticina 3147; (b) la fermentación del medio inoculado; (c) el ajuste del pH de la fermentación entre 6,3 y 6,7; (d) la inactivación del fermento bacteriano: (e) la evaporación del fermento de la etapa (d); (f) el secado por atomización del polvo obtenido en la etapa (e).
Description
Polvo de bacteriocina secado por atomización con
actividad antibiótica.
La presente invención se refiere a un método
para obtener un polvo de bacteriocina secado por atomización con
actividad antibiótica.
La eliminación de las sustancias que deterioran
los alimentos y de los organismos patógenos ha sido objetivo de
numerosas investigaciones, ya que las enfermedades derivadas del
consumo de alimentos tienen un gran impacto en términos de
individuos afectados y coste del tratamiento. Se ha estimado que los
agentes patógenos microbianos presentes en los alimentos causan
anualmente entre 6,5 y 33 millones de casos de enfermedades humanas
en los EE.UU., con un coste de entre 2,9 y 6,7 miles de millones de
dólares (2), siendo los agentes patógenos tipo grampositivo
transmitidos por los alimentos responsables de entre un 25 y un 55%
de los costes. En los últimos años, la demanda por parte del
consumidor de alimentos frescos seguros mínimamente procesados,
además de la preocupación por el uso de conservantes químicos en
los alimentos, ha creado un interés notable en la aplicación de
bioconservantes. Las bacteriocinas producidas por bacterias del
ácido láctico se consideran alternativas a los conservantes
tradicionales para asegurar
la seguridad de los alimentos y se han identificado con facilidad aplicaciones potenciales en los alimentos (21).
la seguridad de los alimentos y se han identificado con facilidad aplicaciones potenciales en los alimentos (21).
La nisina, una bacteriocina producida por
ciertas cepas de Lactococcus lactis, se ha utilizado de
manera satisfactoria para controlar el deterioro de alimentos, en
varios alimentos diferentes, véase por ejemplo la patente DE
2616390 y el estudio de la fabricación de leche deshidratada con
alto contenido en nisina (base de datos FSTA [en línea] acceso a la
base de datos no.
75-2-06-p1345), que
incluye quesos, productos enlatados y postres lácteos (10). Sin
embargo, su empleo está sujeto a ciertas restricciones. Es más
eficaz en alimentos con pH ácido (pH inferior a 6,0) y bajo
contenido en proteínas y en grasas. Es poco soluble para valores de
pH superiores a 6,0 y por ello para muchos alimentos su eficacia es
limitada. Se ha desarrollado una forma en polvo de nisina, Nisaplin
(Aplin y Barrett, Towbridge, Wiltshire, Reino Unido), y se utiliza
para la conservación de alimentos.
Además del desarrollo de Nisaplin, se han
desarrollado otros agentes que contienen bacteriocina en polvo,
para la conservación de alimentos. Propionibacterium
freundenreichii ssp. shermanni se utiliza para obtener
Microgard (Wesman Foods, Inc., Beaverton, Oregón, EE.UU.) por
pasteurización y secado de la leche desnatada fermentada por
bacterias propiónicas. Se estima que se utiliza en aproximadamente
un tercio de todos los quesos cremosos cuajados fabricados en los
EE.UU. y supuestamente inhibe la mayor parte de las bacterias
gramnegativas y algunos hongos (4). Los agentes activos presentes en
Microgard incluyen ácido propiónico, ácido acético, diacetilo,
ácido láctico y un péptido termoestable de aproximadamente 700
daltonios que se considera el componente más activo.
La lacticina 3147 es una bacteriocina producida
por L. lactis DPC3147 que tiene una capacidad anfitriona
similar a la de la nisina, en la medida en que inhibe una gran
cantidad de organismos grampositivos, como Listeria,
Clostridium spp., Enterococcus, Staphylococcus y
Streptococcus (17). Dado que muchos de estos organismos se han
identificado como agentes de descomposición y agentes patógenos de
los alimentos, el desarrollo de un sistema basado en la lacticina
3147 para el control de estos organismos presenta atractivos
obvios. Esto puede obtenerse de dos maneras. La primera conlleva el
uso de cultivos iniciadores (que comprenden transconjugantes) que
producen lacticina 3147, y pueden utilizarse en fermentaciones de
alimentos en los que estas cepas pueden sustituirse por los
cultivos iniciadores originales. Los determinantes genéticos para la
lacticina 3147 se codifican en un plásmido de 60,2 kb, el pMRC01,
que se ha secuenciado completamente (6) y que se ha transferido a
diversos cultivos iniciadores de queso (3). La lacticina 3147 es el
objeto de la solicitud PCT No. PCT/IE96/00022, publicada como WO
96/32482.
Recientemente, se ha comprobado que una
lacticina 3147 que produce transconjugantes puede inhibir la
Listeria monocitogenes en quesos cremosos cuajados. Este
iniciador puede utilizarse también para controlar la proliferación
de baterías del ácido láctico no iniciadoras en queso Cheddar. La
segunda vía para mejorar la seguridad de los alimentos mediante el
uso de la lacticina 3147 conlleva el desarrollo de la bacteriocina
en una forma secada por atomización. La ventaja de dicho polvo
bioactivo es que podría aplicarse como un ingrediente para
alimentos en diversos alimentos. Sin embargo, no es obvio en
absoluto que la bacteriocina sea lo suficientemente consistente
como para resistir el secado por atomización y existe la posibilidad
de que el secado por atomización resulte en una pérdida importante
de actividad de la bacteriocina.
El objetivo de la presente invención es
proporcionar un proceso para fabricar un ingrediente para alimentos
enriquecido con lacticina 3127 para la incorporación en productos
alimentarios. En particular, se pretende proporcionar un polvo de
lacticina 3127 secada por atomización. No podía predecirse que
pudiera obtenerse dicho polvo secado por atomización, ya que el
secado por atomización podría haber causado la desnaturalización de
la bacteriocina debido al calor, teniendo en cuenta que la lacticina
3147 está compuesta por dos péptidos, ambos necesarios para su
actividad. Además, la deshidratación podría inactivar la
bacteriocina de manera irreversible.
En la presente invención se describe un polvo
bioactivo basado en el lactosuero, con eficacia en el control de
dos patógenos representativos, L. monocytogenes y
Staphylococcus aureus, en disolución amortiguadora del pH,
tanto a pH neutro como ácido. También se describe su eficacia en el
control de L. monocytogenes en una formulación de leche para
lactantes y otros productos alimentarios. Sin embargo, resultará
evidente para los expertos en la materia que el polvo de
bacteriocina descrito no necesita ser un derivado lácteo y que
sería posible también obtener una bacteriocina secada por
atomización a partir, por ejemplo, de otros polvos, materiales
sintéticos o similares.
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Según la presente invención se ofrece un proceso
para la producción de lacticina 3147 secada por atomización que
comprende:
(a) la inoculación de un medio con una cepa de
bacterias productora de lacticina 3147;
(b) la fermentación del medio inoculado;
(c) el ajuste del pH de la fermentación entre
6,3 y 6,7.
(d) la inactivación del fermento bacteriano;
(e) la evaporación del fermento de la etapa
(d);
(f) el secado por atomización del polvo obtenido
en la etapa (e).
El medio que puede inocularse con las bacterias
puede seleccionarse de entre polvos de leche o de productos lácteos
que comprenden polvo de lactosuero desmineralizado, polvo de leche
desnatada reconstituida, polvo concentrado de proteína de
lactosuero, leche pasteurizada, lactosuero de queso Cheddar o medios
sintéticos de laboratorio tales como caldo de LM17 o de TY o
semejantes.
Preferentemente el medio inoculado se fermenta a
unos 30ºC durante aproximadamente de 6 a 24 horas.
Preferentemente el pH de la fermentación se
ajusta a aproximadamente 6,5.
El fermento bacteriano se inactiva,
convenientemente, mediante pasteurización o mediante tratamiento a
temperaturas muy elevadas.
Si el fermento se pasteuriza, la pasteurización
se realiza convenientemente, a aproximadamente 72ºC durante
aproximadamente 15 segundos.
Preferentemente el fermento inactivado se
evapora a aproximadamente 6ºC hasta aproximadamente el 40% de los
sólidos totales.
El concentrado de la etapa (e) puede enfriarse a
aproximadamente 32ºC, sembrarse con lactosa a aproximadamente 0,1%
en peso y cristalizarse a una velocidad de enfriamiento de
aproximadamente 1ºC por hora.
El concentrado cristalizado se seca por
atomización mediante métodos conocidos en la técnica de acuerdo con
la etapa (f).
Se describe un polvo de lacticina 3147 secado
por atomización que tiene la capacidad de inhibir organismos que no
son resistentes a la lacticina 3147 y que puede tener,
convenientemente, una actividad de aproximadamente 40240 ua
(unidades arbitrarias)/por mL.
También se describe un producto alimentario que
comprende un polvo de lacticina 3147 secada por atomización. El
producto alimentario puede ser una formulación de leche para
lactantes, una salsa, una mayonesa, un postre, un yogur, una crema,
un producto alimentario enlatado, como por ejemplo una verdura
enlatada o un producto cárnico enlatado, una sopa, un producto de
repostería o productos similares.
El producto alimentario puede haber sido
sometido además a un aumento de presión hidrostática durante el
proceso de fabricación, convenientemente a una presión de
aproximadamente 150 a 800 MPa.
La presente invención se describe a continuación
de forma más detallada con respecto a los dibujos que la acompañan
donde:
Figura 1. (A) Crecimiento de L. lactis
DPC3147 y obtención de lacticina 3147 en suero desmineralizado
reconstituido al 10% a 30ºC, con control y sin control de pH.
(\blacklozenge) ufc/mL sin imponer control de pH, (\ding{110})
ufc/mL a pH constante de 6,0, (\medbullet) ufc/mL a pH constante
de 6,5 y (\medcirc) ufc/mL a pH constante de 7,0. (\ding{110})
UA/mL sin control de pH, (\boxempty) UA/mL a pH constante de 6,0,
(\ding{110}) UA/mL a pH constante de 6,5 y (\sqbullet) UA/mL a
pH constante de 7,0. (B) Actividad inhibitoria de la lacticina 3147
frente a L. lactis HP cuando (a) su crecimiento tiene lugar
sin control del pH y cuando (b) su crecimiento tiene lugar a pH
constante de 6,5.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Figura 2. Diagrama esquemático del perfil de
temperatura y de la actividad de la lacticina 3147 durante la
fabricación de polvo de lacticina 3147.
Figura 3. Electo del polvo de lacticina 3147 en
la viabilidad de Listeria monocytogenes Scott A en disolución
reguladora de pH a 30ºC (A) a un pH de 5 y (B) a un pH de 7.
(\blacklozenge) sin adición, (\ding{110}) adición de polvo de
lacticina 3147 al 10%.
Figura 4. Efecto del polvo de lacticina 3147 en
la viabilidad de Staphylococcus aureus 10 en disolución
reguladora de pH a 30ºC (A) a pH 5 y (B) a pH 7. (\blacklozenge)
sin adición, (\ding{110}) adición de polvo de lacticina al
15%.
Figura 5. Efecto del polvo de lacticina 3147 en
la viabilidad de L. monocytogenes Scott A cuando se utiliza
como componente de la formulación de la leche para lactantes,
(\ding{110}) polvo de lacticina al 15%, (\ding{115}) de polvo
de lacticina al 10%, polvo de leche para lactantes al 5%.
(\medbullet) polvo de lacticina al 5%, polvo de leche para
lactantes al 10%, (\blacklozenge) polvo de leche para lactantes al
15%.
Figura 6. Efecto del polvo de lacticina 3147
(10%) en la viabilidad de Listeria monocytogenes Scott A en
yogur, (\blacklozenge) sin adición de lacticina 3147,
(\ding{110}) adición de 10% de lacticina 3147. El 10% se refiere
aquí a 10 g de polvo de lacticina 3147 añadidos a 90 g de yogur.
Figura 7. Efecto del polvo de lacticina 3147
(10%) en la viabilidad de Listeria monocytogenes Scott A en
el queso cremoso cuajado, (\blacklozenge) sin añadir lacticina
3147, (\ding{110}) añadiendo lacticina 3147 al 10%. El 10% se
refiere aquí a 10 g de polvo de lacticina 3147 añadidos a 90g de
queso cremoso cuajado (tipo cottage).
Figura 8. Efecto del polvo de lacticina 3147
(10%) en la viabilidad de Bacillus cereus en sopa (de
sobre).
(\blacklozenge) sin añadir lacticina 3147,
(\ding{110}) añadiendo 1% de lacticina
3147,
(\ding{115}) añadiendo 5% de lacticina
3147,
(\medbullet) añadiendo 10% de lacticina
3147.
El 1, 5, 10% se refiere aquí a 1, 5 ó 10 g de
lacticina 3147 añadidos a 99, 95 ó 90 g de polvo de sopa en sobre,
reconstituidos después conforme a las instrucciones del
fabricante.
Figura 9. Efecto del polvo de lacticina 3147
(10%) en la viabilidad de Listeria monocytogenes Scott A en
sopa (de sobre).
(\blacklozenge) sin añadir lacticina 3147,
(\ding{110}) añadiendo 1% de lacticina
3147,
(\ding{115}) añadiendo 5% de lacticina
3147,
(\medbullet) añadiendo 10% de lacticina
3147.
El 1, 5, 10% se refiere aquí a 1, 5 ó 10 g de
lacticina 3147 añadidos a 99, 95 ó 90 g de polvo de sopa en sobre,
reconstituidos después conforme a las instrucciones del
fabricante.
Figura 10. Efecto del aumento de la presión en
la actividad de lacticina 3147, (a) presión atmosférica, (b) 200
MPa, (c) 400 MPa, (d) 600 MPa y (e) 800 MPa.
Figura 11. Efecto del aumento de la presión y de
la lacticina 3147 en la viabilidad de L. innocua DPC
1770.
Ejemplo
El productor de bacteriocina L. lactis
ssp. lactis DPC3147 y la cepa indicadora sensible L.
lactis subsp. lactis HP se cultivaron de la manera
habitual a 30ºC en M17 (20: Oxoid Ltd. Basingstoke. Hampshire.
Inglaterra) enriquecidas con un 0,5% (peso/volumen) de lactosa.
Otras cepas indicadoras utilizadas incluían L. monocitogenes
Scott A cultivada en Trypicase Soy Broth (TSB. Becton Dickinson and
Co. Cockeysville, MD21030, EE.UU.) enriquecidas con un 0,6%
(peso/volumen) de extracto de levadura (Oxoid), y Staphylococcus
aureus 10 (colección de cultivo DPC. Moorepark, Fermoy, Co.
Cork, Irlanda) cultivada en caldo de Brain Heart Infusion (BHI.
Oxoid), ambos a 37ºC. Los medios sólidos se prepararon mediante la
adición de un agar bacteriológico al 1% (Oxoid).
Para la fabricación de lacticina 3147 se
investigaron diversos medios diferentes. Éstos se prepararon como
disoluciones al 10% (peso/volumen), aparte de leche entera
pasteurizada y de lactosuero de queso Cheddar. Las disoluciones al
10% se prepararon a partir de polvo de lactosuero desmineralizado
(95% desmineralizado), polvo de leche desnatada reconstituida
(Dairygold, Mitchelstown, Co. Cork. Irlanda) y polvo concentrado de
proteína de lactosuero (WPC35, 35% de proteínas en materia seca.
Moorepark Technology Ltd. Moorepark, Fermoy, Co. Cork, Irlanda).
Las disoluciones derivadas del lactosuero se esterilizaron por
calentamiento a 95ºC durante 30 minutos. La disolución en polvo de
leche desnatada se esterilizó al autoclave a 121ºC durante 5
minutos.
La actividad de la bacteriocina se determinó
mediante la técnica de difusión en pocillos de agar descrito por
Parente y Hill (15). Se hizo una siembra de una cepa de indicador en
agar fundido y distribuido en placas de Petri. Se realizaron
pocillos de aproximadamente 4,6 mm de diámetro en el agar y se
distribuyó en cada pocillo un volumen de 50 \mum de la disolución
resultante de llevar a cabo diluciones 1:2 sucesivas de una
preparación de bacteriocina. La disolución de bacteriocina se
preparó centrifugando el cultivo y tratando térmicamente el
sobrenadante a 70ºC durante 10 minutos, antes de llevar a cabo las
diluciones sucesivas. Las placas se incubaron a 30ºC o a 37ºC
dependiendo de la cepa indicadora utilizada. La actividad de la
bacteriocina se calculó como el inverso del cociente de la última
dilución que dio una zona clara definida tras la incubación durante
la noche. Las unidades de actividad (UA) se expresaron por milímetro
(L/dilución x 20).
Se llevaron a cabo fermentaciones con los pH
controlados durante un periodo de 24 horas, con agitación lenta
(aproximadamente 20 rpm) a 30ºC. Se utilizó un inóculo al 1% de
DPC3147 para inocular 100 mL de medio de cultivo. El pH del medio
de cultivo se mantuvo constante mediante la adición de NaOH 1,0 M
según lo necesario mediante un 71S STAT' Titrino (Metrohm,
Irlanda). Los recuentos de células y las estimaciones de actividad
de la bacteriocina se llevaron a cabo a intervalos horarios durante
las 10 primeras horas, y se tomó una muestra final al cabo de 24
horas.
Se inoculó un volumen de 170 L de polvo de suero
desmineralizado (10% de los sólidos totales) con un 1% de DPC3147 y
se controló el pH de la fermentación de 24 horas mediante la adición
de NaOH 2,5 M según lo necesario (pH 6,5). El fermento se
pasteurizó entonces a 72ºC durante 15 segundos utilizando un
pasteurizador APV SSP (APV, Silkborg, Dinamarca). El fermento
pasteurizado se evaporó entonces a 60ºC hasta un 40% de los sólidos
totales utilizando un evaporador de película descendente de simple
efecto (Anhydro model F1 Lab). El concentrado resultante se enfrió
a 32ºC, se sembró con lactosa (0,1% peso húmedo) y se dejó
precristalizar durante la noche a una velocidad de enfriamiento de
1ºC por hora. El concentrado precristalizado se secó después por
atomización utilizando atomización por boquilla en un secador por
atomización Anhydro (modelo Anhydro Lab 3) a una temperatura de
entrada del aire de 190ºC y una temperatura de salida del aire de
90ºC. Se tomaron alícuotas del polvo, se envasaron en bolsas de
muestra revestidas interiormente con papel de aluminio y se
almacenaron a 4ºC. La actividad de la bacteriocina se evaluó en cada
paso durante el proceso.
Se cultivaron células sensibles hasta una fase
exponencial media, se lavaron y se resuspendieron a aproximadamente
10^{7}-10^{8} ufc/mL en 2,5 mM de disolución
reguladora de pH de fosfato de sodio a pH 7,0 o pH 5,0 y 2,5 mM de
disolución reguladora de pH de fosfato de sodio a pH 7,0 o pH 5,0
enriquecida con 10 mM de glucosa. Se añadió polvo de lacticina 3147
(en diferentes concentraciones dependiendo de la cepa sensible
investigada) y se tomaron muestras a intervalos de tiempo
apropiados durante un periodo de 3 horas para determinar el recuento
de células viables.
Se añadió polvo de lacticina 3147 a una
formulación de leche para lactantes disponible comercialmente,
[ingredientes detallados en la siguiente lista: polvo de lactosuero
desmineralizado, aceites vegetales, lactosa, leche desnatada,
carbonato de calcio, citrato de potasio, cloruro de calcio, citrato
de sodio, cloruro de magnesio, vitamina C, emulsionante (lecitina
de soja), taurina, hidróxido de potasio, sulfato de hierro, sulfato
de cinc, vitamina E, nicotinamida, ácido pantoténico, vitamina A,
sulfato de cobre, ácido cítrico, tiamina, vitamina B_{0},
(caroteno, sulfato de manganeso, yoduro potásico, ácido fólico,
vitamina K, selenito de sodio, vitamina D, biotina). Las
instrucciones de los fabricantes indican que el líquido final para
el consumo para lactantes es una disolución final al 15%
(peso/volumen). En los experimentos, el 15% (peso/volumen) del polvo
de leche para lactantes se reemplazó con 5% (peso/volumen) de polvo
de lacticina y 10% (peso/volumen) de polvo de leche para lactantes,
o con 10% (peso/volumen) de polvo de lacticina y 5% (peso/volumen)
de polvo de leche para lactantes. Se cultivaron células de L.
monocytogenes hasta la fase exponencial media, se lavaron y se
resuspendieron a aproximadamente 10^{4} ufc/mL en las diferentes
formulaciones de leche para lactantes a 30ºC y se tomaron muestras
a intervalos de tiempo apropiados durante un periodo de 3 horas para
determinar el recuento de células viables.
Se elaboró una preparación de lacticina 3147
para la inactivación de S. aureus ATCC6538 utilizando
cromatografía de adsorción hidrófoba. Se fabricó una preparación en
polvo de grado alimentario de lacticina 3147 para estudiar la
inactivación de L. innocua DPC 1770 de la manera descrita
anteriormente con la siguiente modificación: se fermentó una
disolución en polvo de suero desmineralizado al 1% con L.
lactis subsp. lactis DPC3127 en condiciones de control
de pH a pH 6,0 durante 18 horas.
Se determinó la actividad de ambas preparaciones
de lacticina 3147 mediante la técnica de difusión en pocillos de
agar tal y como describen Parente y Hill (15). Se sembró en agar
fundido la cepa indicadora L. lactis subsp. lactis HP
y se distribuyó en placas de Petri. En el agar se realizaron
pocillos de aproximadamente 6,00 mm de diámetro y se distribuyó en
cada pocillo un volumen de 50 \mum de una disolución resultante de
llevar a cabo diluciones 1:2 sucesivas de una preparación de
bacteriocina. Las placas se incubaron después a 30ºC. La actividad
de la bacteriocina se calculó como la inversa de la última dilución
que dio una zona clara definida tras incubación de un día para
otro. Las unidades de actividad (UA) se expresaron por milímetro
(1/dilución, x 20). La actividad también puede ser expresada como
diámetro de zona (mm), donde se toma como diámetro el de la primera
zona (muestra clara, sin diluir) de la serie de dilución.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células de S. aureus ATCC6538 se
resuspendieron en 10% de leche desnatada reconstituida y se llevaron
alícuotas de las mismas a pipetas Eppedorf estériles para PCR de
700 \muL antes de ponerlos en bolsas del homogeneizador Stomacher
(Seward Ltd., London, Reino Unido). Se resuspendieron unos volúmenes
de 10 mL de células de L. innocua DPC1770 en polvo de
lactosuero desmineralizado reconstituido al 20% en bolsas Stomacher
esterilizadas. Las muestras se sellaron al vacío de manera
individual antes de ser situadas en el recipiente a presión
(Stansted Fluid Power Ltd., Stansted, Inglaterra). El recipiente
consistía en un cilindro de acero inoxidable (37 mm de diámetro x
300 mm de altura) que contenía un 15% en volumen de aceite de ricino
en disolución de etanol como medio de presurización hidrostática.
Las muestras se trataron a 25ºC durante 30 min en el intervalo de
presión de 150 a 600 MPa, además de realizarse un control de muestra
a presión atmosférica (0,1 MPa). Todos los experimentos se llevaron
a cabo por duplicado. La temperatura de la cámara se determinó
mediante un sistema termorregulador que circulaba para mantener la
temperatura de la cámara.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar el efecto del aumento de presión
en la actividad de lacticina 3147, se selló al vacío polvo de
lacticina 3147 reconstituida y alícuotas de lacticina 3147 en forma
líquida y se expusieron a presiones comprendidas entre 100 y 800
MPa tal como se ha descrito anteriormente. Las disoluciones
presurizadas y no presurizadas de lacticina 3147 fueron tratadas
térmicamente a 80ºC durante 10 minutos de manera previa a la
determinación de la actividad mediante el método de difusión en
perforaciones utilizando L. lactis HP como cepa
indicadora.
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El objetivo de esta investigación era
desarrollar un método para producir una forma en polvo de lacticina
3147 apta para ser utilizada como ingrediente de ayuda en el control
de microorganismos no deseados en los alimentos. Se llevó a cabo
una fermentación a escala tras la optimización de producción de
lacticina 3147 y el fermentado se secó por atomización para formar
un polvo rico en bacteriocina. Este polvo se sometió, en una
disolución reguladora de pH y en un sistema alimentario de leche
para lactantes, a una prueba para determinar su capacidad para
inhibir organismos patógenos.
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Tras la inoculación de DPC3147 (1%) y la
incubación durante la noche a 30ºC, se analizó la actividad de la
lacticina 3147 en una variedad de diferentes medios de cultivo. La
mayor parte de los medios eran derivados lácteos, pero se
incluyeron también dos medios sintéticos (LM 17 y TY). Los
resultados de la producción de lacticina 3147 (véase la tabla 1)
demostraron que la actividad era alta en casi todos los medios
derivados de productos lácteos (1280 a 2560 UA/mL) aparte del WPC35
(320 UA/mL). Los niveles más altos de actividad de lacticina 3147
se hallaron en el lactosuero del queso Cheddar, en la leche entera y
en el LM17 (2560 UA/mL). Tanto el polvo de lactosuero
desmineralizado reconstituido al 10% como el polvo de leche
desnatada reconstituida al 10% dieron una actividad de 1280 UA/mL.
Se observaron niveles menores de actividad de lacticina 3147 en el
caldo de TY (640 UA/mL).
Puesto que el polvo de lactosuero
desmineralizado está disponible comercialmente y se puede adquirir
con facilidad y se observó una buena actividad de lacticina 3147 en
este medio, se llevaron a cabo más investigaciones encaminadas a la
optimización de la obtención de lacticina 3147 en polvo de suero
desmineralizado.
La producción de bacteriocina y los recuentos de
células viables en fermentaciones con control de pH y sin control
de pH indicaron que los aumentos de niveles de lacticina 3147 podían
obtenerse manteniendo el pH de los medios de cultivo a un valor
constante de 6,5 (Figura 1). Los niveles de actividad de la
bacteriocina alcanzaron 10240 UA/mL en polvo de suero
desmineralizado reconstituido al 10% cuando el pH de los medios de
cultivo se mantuvo constante a un valor de 6,5 (Figura 1B (a))
comparado con 640 UA/mL cuando no se impuso control del pH (Figura
1B (b)). Tanto a pH 6,0 como a pH 7,0 la actividad de la lacticina
alcanzó 5120 UA/mL. Los resultados de los recuentos de células
viables durante un periodo de 24 horas indicaron que el aumento de
actividad de la bacteriocina correspondía a unas densidades
celulares mayores. Sin control de pH los recuentos de células
alcanzaron 1 x 10^{9} ufc/mL, mientras que cuando el pH de los
medios de crecimiento se mantuvo a pH constante de 6,5 los
recuentos de células viables alcanzaron 3,8 x 10^{9} ufc/mL
(Figura 1A). Con control de pH a 6,0 y 7,0 los recuentos de células
viables alcanzaron 2,5 x 10^{9} ufc/mL.
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Se fabricó un preparado de lacticina 3147 secado
por atomización según la manera descrita en el apartado materiales
y métodos. Durante el proceso de fabricación se evaluó la actividad
de la bacteriocina en cada paso, utilizando
L. lactis HP como cepa indicadora (Figura 2). Tras la fermentación con control de pH (en polvo de suero desmineralizado reconstituido al 10%) la actividad de la bacteriocina fue de 10,24() UA/mL. El fermento se sometió a pasteurización para inactivar el cultivo productor de bacteriocina DPC 3147.
L. lactis HP como cepa indicadora (Figura 2). Tras la fermentación con control de pH (en polvo de suero desmineralizado reconstituido al 10%) la actividad de la bacteriocina fue de 10,24() UA/mL. El fermento se sometió a pasteurización para inactivar el cultivo productor de bacteriocina DPC 3147.
La pasteurización no tuvo ningún efecto en la
actividad de la bacteriocina (Figura 2). La evaporación (del 10 al
40% de sólidos totales) produjo una concentración del fermento y
provocó un aumento de la actividad de la bacteriocina a 40,960
UA/mL. Después de la cristalización durante la noche, la actividad
del concentrado permaneció estable. El secado por atomización del
concentrado dio como resultado la producción de un polvo activo.
Cuando el polvo secado por atomización se resuspendió a una
concentración de 50 mg/mL (5% de los sólidos) contenía 5120 UA lo
que indicaba que la actividad del polvo de lacticina era de 102400
UA/g (100% de los sólidos). La actividad de la lacticina 3147
expresada como UA/g de materia seca permaneció durante todo el
proceso de fabricación a un valor constante de 102400 UA/g, lo que
indicaba que no se había producido pérdida de la actividad de la
bacteriocina durante la fabricación.
La actividad inhibitoria del polvo enriquecido
con bacteriocina se atribuyó a la acción de la lacticina 3147 más
que a otros metabolitos de la fermentación tales como el ácido
láctico, ya que inhibió una L. lactis MG1614 sensible pero
no mostró ningún efecto inhibitorio frente a un trasconjugante que
contenía el plásmido pMRC01.
\vskip1.000000\baselineskip
El polvo de suero desmineralizado enriquecido
con lacticina 3147 (polvo de lacticina 3147) se investigó por su
capacidad para inhibir dos patógenos formados en los alimentos. El
efecto inhibitorio del polvo se investigó a pH 5 y a pH 7, en
presencia y en ausencia de 10mM de glucosa. La eficacia de una
disolución al 10% (peso/volumen) de polvo de lacticina 3147 frente
a células en fase de crecimiento exponencial medio de L.
monocytogenes Scott A demostró que aproximadamente una
reducción de 3,3 log (99,95% del nivel de eliminación) podía
alcanzarse a pH 5 al cabo de 3 horas a 30ºC (Figura 3A). La
eliminación de L. monocytogenes Scott A con una solución al
10% (peso/volumen) fue algo más eficaz a pH 7 (Figura 3B). Se
observó una reducción de 3,8 log (99,98% nivel de eliminación) al
cabo de 3 horas a 30ºC.
Se descubrió que S. aureus 10 era más
resistente que L. monocytogenes Scott A a la acción del polvo
enriquecido en lacticina, por lo que se utilizó una disolución del
polvo al 15%. La eficacia de una disolución al 15% (peso/volumen)
de polvo de lacticina 3147 frente a células en fase exponencial
media de S. aureus 10 resultó en aproximadamente una
reducción de 1,1 log (90,4% nivel de eliminación) a un pH 5 al cabo
de 3 horas a 30ºC (Figura 4A). La capacidad de eliminación de una
disolución al 15% (peso/volumen) de un polvo de lacticina aumentó
enormemente a pH 7 donde al cabo de 3 horas a 30ºC se observó casi
una reducción de 4 log (99,98% nivel de eliminación) de S.
aureus 10 (Figura 4B). La inclusión de 10 mM de glucosa produjo
sólo pequeños aumentos en el nivel de muertes celulares tanto para
L. monocytogenes Scott A como para S. aureus 10 (no
se muestran los resultados).
\vskip1.000000\baselineskip
Para analizar la eficacia del polvo de lacticina
3147 en un sistema alimentario, se llevaron a cabo experimentos en
una fórmula de leche para lactantes, puesto que es un ejemplo de
alimento destinado a un tipo de consumidor de alto riesgo que
contiene polvo de lactosuero desmineralizado como un constituyente
principal. Los resultados indicaron que se obtuvo más de un 99% de
nivel de eliminación de L. monocytogenes Scott A cuando parte
de la formulación de leche para lactantes se sustituyó por dos
terceras partes (10% de polvo de lacticina y 5% de polvo de leche
para lactantes) o una tercera parte de polvo de lacticina 3147 (5%
polvo de lacticina y 10% de polvo de leche para lactantes) (Figura
5). Los recuentos se redujeron en este caso desde aproximadamente 7
x 10^{4} ufc/mL a 3 x 10^{1} ufc/mL al cabo de 3 horas a 30ºC.
En el cultivo de control sin polvo de lacticina 3147 presente los
recuentos aumentaron de aproximadamente 10^{4} ufc/mL a
aproximadamente 10^{5} ufc/mL al cabo del mismo intervalo de
tiempo.
La lacticina 3147 en polvo se ha evaluado para
la inhibición del deterioro de alimentos y microorganismos
patógenos en diversos sistemas alimentarios incluyendo formulaciones
de alimentos para lactantes, sopa en polvo, queso cremoso cuajado y
yogur natural. Los siguientes son ejemplos específicos del uso de
lacticina 3147 para inhibir patógenos en sistemas alimentarios.
Inicialmente se investigó la capacidad del polvo
de lacticina 3147 para inhibir Listeria monocytogenes Scott
A en una formulación de leche para lactantes de la manera descrita
anteriormente. Para investigar posteriormente el efecto inhibitorio
del polvo de lacticina 3147, se llevaron a cabo pruebas de
inactivación frente a diversos microorganismos diferentes en un
yogur natural, en queso cremoso cuajado y en sopa de sobre
reconstituida, con valores de pH de 4,5, de 4,4 y 6,6
respectivamente.
El efecto del polvo de lacticina 3147 al 10% en
la inhibición de Listeria monocytogenes Scott A (10^{4}
ufc/mL) en yogur natural demostró que más del 98,3% del cultivo fue
eliminado al cabo de 5 minutos a 30ºC. Al cabo de 60 minutos no
quedaban células viables (Figura 6).
En el caso del queso cremoso cuajado (tipo
cottage) inoculado con 10^{4} ufc/mL de Listeria
monocytogenes se eliminó el 40% de la población al cabo de 5
minutos a 30ºC en presencia de un 10% de polvo de lacticina 3147.
Después de 160 minutos sólo el 14% de la población permanecía
viable. (Figura 7).
El efecto correspondiente a concentraciones del
1, del 5 y del 10% de lacticina 3147 en sopa en polvo frente a
Bacillus cereus a 30ºC, demostró que tras 24 horas de
incubación se observaba más del 99,9% de nivel de eliminación en
presencia de concentraciones de polvo de lacticina 3147 del 5 y del
10%. En el caso de la concentración de lacticina 3147 del 1%
sobrevivió un 17% de la población (Figura 8).
Se llevó a cabo un estudio similar para
determinar el efecto de concentraciones del 1, del 5 y del 10% de
polvo de lacticina 3147 en la supervivencia de Listeria
monocutogenes Scott A en sopa en polvo. Una concentración de un
1% de lacticina fue inefectiva para inhibir Scott A en 24 horas,
mientras que a una concentración del 5% más del 10% de la población
estaba inhibida. A una concentración del 10% más del 40% del cultivo
estaba inhibido (Figura 9).
A partir de estos resultados se puede observar
que una forma en polvo de lacticina 3147 tiene de hecho más
aplicaciones en la seguridad de los alimentos para el control de
agentes patógenos en los alimentos y organismos de deterioro.
Se evaluó en la leche y en el lactosuero el uso
de presión hidrostática y de tratamientos con lacticina 3147 con el
objetivo de combinar ambos tratamientos para mejorar la calidad de
los alimentos lácteos mínimamente procesados. El sistema se evaluó
utilizando dos agentes patógenos presentes en los alimentos.
Staphylococcus aureus ATCC6538 y Listeria innocua
DPC1770. Se llevaron a cabo pruebas frente a Staph. aureus
ATCC6538 utilizando lacticina 3147 concentrada preparada a partir
de cultivo sobrenadante. Los resultados demostraron más de un
efecto aditivo cuando ambos tratamientos fueron utilizados en
combinación, por ejemplo, la combinación de 250 MPa (reducción de
2,2 log) con lacticina 3147 (reducción de 1 log) resultó en una
reducción de más de 6 log (Figura 10). Unos resultados similares se
obtuvieron cuando se analizó una forma en polvo de calidad
alimentaria de lacticina 3147 (desarrollada a partir de una
fermentación de polvo de suero desmineralizado reconstituido secado
por atomización) para la inactivación de L. innocua DPC 1770
(Figura 11). Además, se observó que el tratamiento de las
preparaciones de lacticina 3147 con presiones superiores a 400 MPa
dieron como resultado un aumento en la actividad de la bacteriocina
(equivalente a doblar la actividad). Estos resultados indican que
una combinación de alta presión con lacticina 3147 es apropiada para
mejorar la calidad de alimentos mínimamente procesados a niveles de
presión hidrostática menores.
Se consiguió desarrollar un ingrediente
alimentario bioactivo derivado del suero después de investigaciones
acerca de la producción de lacticina 3147 en medios diferentes. La
actividad de la lacticina 3147 era alta en todos los medios
derivados de productos lácteos investigados, aparte del concentrado
de proteína de suero (WPC35). Una posible explicación para el bajo
nivel de actividad en el concentrado de proteína de suero podría
ser que la actividad de la bacteriocina se repartiera en el interior
de la pastilla durante la centrifugación, antes de analizar la
actividad. Se investigaron dos medios sintéticos para la producción
de lacticina 3147, caldo de LM17 (20) y caldo de TY (15). Los
niveles de actividad de la lacticina 3147 en LM17 resultaron
comparables a los de medios derivados de productos lácteos, pero
esto no resulta sorprendente, puesto que estos medios se
desarrollaron para el cultivo de lactococos. Sin embargo, el caldo
TY, en el que se observaron unos niveles bajos de actividad de la
lacticina 3147, se desarrolló para proporcionar una obtención óptima
de bacteriocina (enterocina 1146) mientras se minimizan los niveles
de péptidos en el medio (para eliminar péptidos que puedan
interferir en la purificación). Es claramente ventajoso utilizar los
medios de cultivo más rentables económicamente para el desarrollo
de un polvo. Se investigó el polvo de lactosuero desmineralizado,
medio que se puede adquirir fácilmente y es rentable (20
\textdollar por cada 25 kg), para la optimización de la producción
de lacticina 3147. Sin embargo, podrían utilizarse otros medios de
cultivo apropiados, tal como se ha descrito anteriormente.
El efecto del pH en la producción de
bacteriocina ha sido bien documentado, y para diversas cepas
productoras de bacteriocina, el control del pH durante el
crecimiento da lugar a mayores valoraciones de bacteriocina (11,
14, 18). La actividad de la lacticina 3147 aumentó enormemente
cuando el pH de los medios de crecimiento se mantuvo constante a
6,5. A este pH se observaron los cinco valores cuantitativos de
bacteriocina más altos y los números mayores de células. Los
valores cuantitativos de bacteriocina menores y las menores
cantidades de células se observaron cuando no se impuso control de
pH. La actividad aumentada de la bacteriocina se correspondió con
las cantidades aumentadas de células.
Una vez que la obtención de lacticina 3147 se
hubo optimizado en un polvo de suero desmineralizado reconstituido
al 10%, se instaló una fermentación a escala para generar
suficientes fermentos para el secado por atomización. La producción
de un polvo activo secado por atomización demostró la resistencia de
la bacteriocina a las condiciones extremas del proceso. Durante
todo el proceso se detectó actividad y el polvo final tuvo una
actividad de 102.400 UA/g de materia seca, equivalente a la
actividad presente al comienzo del proceso. Este resultado
sorprendente es significativo en la medida en que sugiere que no se
produjo pérdida de actividad durante la fabricación.
El análisis de la actividad inhibitoria del
polvo bioactivo demostró que puede inhibir tanto L.
monocytogenes como S. aureus a pH 5 y pH 7. En ambos
casos el polvo bioactivo presentó una mayor capacidad de eliminación
a pH neutro. Esto es un hallazgo significativo, ya que se sabe que
el Nisaplin, un ingrediente alimentario fermentado utilizado para
la extensión del tiempo de almacenamiento sin refrigeración del
producto y para la prevención del deterioro tiene la máxima
eficacia a pH ácido (pH por debajo de 6,0). El desarrollo de un
ingrediente alimentario capaz de eliminar bacterias grampositivas a
pH neutro indica que el polvo de lacticina 3147 puede ser adecuado
para la incorporación a una amplia variedad de alimentos, para los
que no existían hasta ahora posibilidades de prevención del
deterioro de los alimentos/de la patogénesis, aparte de la adición
de conservantes químicos.
Se ha descubierto el mecanismo de acción de la
lacticina 3147 (12). Provoca la muerte celular al permeabilizar las
membranas de células sensibles a través de la formación de poros,
permitiendo el flujo de salida de iones K^{+} y fosfato. Esta
acción provoca y la disipación de la fuerza motora de los protones,
la hidrólisis del ATP intracelular y finalmente produce la muerte
celular. Las células excitadas son más susceptibles a la acción de
la lacticina 3147. Las células incubadas en presencia de polvo de
lacticina combinadas con 10 mM de glucosa presentaron unos aumentos
ligeros en la eficacia de eliminación (aparte del S. aureus
10 a pH 7, resultados no mostrados). Esto está en consonancia con
los resultados proporcionados por McAuliffe et al., (12),
donde se observó que las células excitadas eran más sensibles a la
lacticina 3147. Las células excitadas tienen una fuerza motora de
protones que puede favorecer la inserción de moléculas de lacticina
3147 en la membrana, tal como ocurre con la nisina, un formador de
poros lantibióticos (7, 8).
El desarrollo de una forma en polvo de lacticina
3147 permitiría aplicarlo a diversos sistemas alimentarios. Puesto
que el polvo de lacticina 3147 existente se ha desarrollado a partir
de un polvo de lactosuero desmineralizado, este polvo tiene
aplicaciones en todos los alimentos donde el polvo de lactosuero
desmineralizado constituye un ingrediente. Por ejemplo el polvo de
lactosuero desmineralizado se incorpora a diversos alimentos como
por ejemplo formulaciones de leche para lactantes. Los resultados
que se presentan en este documento demuestran la capacidad de este
polvo de inactivar eficazmente el 99% de L. monocytogenes
Scott A añadido a formulaciones para lactantes, donde parte del
polvo de leche para lactantes ha sido sustituido con el polvo de
lacticina 3147. Las formulaciones de leche para lactantes se
fabrican para alcanzar la mejor calidad posible y los incidentes
asociados a enfermedades producidas por los alimentos son raros. Sin
embargo, las formulaciones de leche para lactantes son más
susceptibles a la contaminación por contaminantes habituales en el
medio doméstico que muchos otros alimentos, poniendo en riesgo la
salud de los lactantes. Por esta razón la adición de un polvo
enriquecido con lacticina 3147 en dichas formulaciones puede
proporcionar un aumento de la protección en el caso de que se
produzca alguna contaminación, lo que sería beneficioso tanto para
los fabricantes como para los consumidores.
Para los fabricantes que ya utilizan polvo de
lactosuero desmineralizado como ingrediente alimentario debería
resultar posible sustituir este polvo (parcial o totalmente) con un
polvo de lactosuero desmineralizado bioactivo para salvaguardar los
productos alimentarios del deterioro y de los organismos patógenos
grampositivos. Y de hecho, para los fabricantes que no utilizan
polvo de lactosuero desmineralizado como ingrediente alimentario la
adición de bajos niveles del polvo bioactivo podría ser suficiente
para conferir una mayor protección sin afectar a las
características sensoriales o funcionales de estos alimentos. Sin
embargo, resulta también evidente que mediante la presente
invención podría obtenerse también un polvo de lacticina 3147 secado
por atomización derivado de un medio distinto de un polvo de
lactosuero. Dicho polvo puede emplearse como sustituto en áreas
donde no se utiliza polvo de lactosuero, con los mismos efectos
beneficiosos.
La lacticina 3147 de gama amplia, producida por
Lactococcus lactis DPC3147, inhibe una gran variedad de
organismos grampositivos que deterioran los alimentos y de
organismos patógenos. Una solución al 10% de polvo de suero
desmineralizado se fermentó con DPC3147 a un pH constante de 6,5. El
fermento se secó por atomización y el polvo resultante mostró
actividad inhibidora. La capacidad del polvo enriquecido en
lacticina 3147 para inhibir Listeria monocytogenes Scott A y
Staphylococcus aureus 10 se analizó en una disolución
amortiguadora de pH, tanto a pH ácido (pH 5) como a pH neutro (pH
7). Además, se analizó la capacidad del polvo para inhibir L.
monocytogenes Scott A en una formulación de leche para
lactantes. La resuspensión de células de L. monocytogenes
Scott A en fase exponencial media S.3 log en una disolución al 10%
del polvo enriquecido con lacticina 3147 produjo una reducción de
1000 veces en células viables a pH 5 y a pH 7 después de 3 horas a
30ºC. En el caso de S. aureus 10, la resuspensión de 2,5 x
10^{7} células en fase exponencial media en una disolución al 15%
del polvo enriquecido con lacticina 3147 produjo sólo una reducción
de 10 veces en recuentos de células viables, comparado con una
reducción de 1000 veces a pH 7, después de incubación a 30ºC durante
3 horas. En una formulación de leche para lactantes el uso del polvo
de lacticina 3147 produjo más del 99% de eliminación de L.
monocytogenes al cabo de 3 horas a 30ºC. De manera similar, el
polvo de lacticina 3147 mostró ser eficaz en la inhibición del
deterioro de alimentos en sopa en polvo, en yogur y en queso
cremoso cuajado. Además, la combinación de presión hidrostática y
lacticina 3147 causa un aumento en el tasa de eliminación,
constituyendo esto un método atractivo de prevención del deterioro
en productos alimentarios mínimamente procesados. Por lo tanto este
ingrediente alimentario de lacticina 3147 bioactiva encontrará
aplicaciones en una gran variedad de alimentos, entre ellos aquellos
con pH próximo al neutro.
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veldhoven, the Netherlands. 235-249. Kluwer Academic
Publishers.
Las expresiones "comprende/que comprende" y
las expresiones "que presenta/que incluye" aquí utilizadas en
la presente memoria según la presente invención se utilizan para
especificar la presencia de características detalladas, de
unidades, de pasos o de componentes pero no excluye la presencia o
adición de una o varias características, de unidades, de pasos, de
componentes o de grupos de los mismos.
Claims (9)
1. Procedimiento para la obtención de polvo de
lacticina 3147 secado por atomización, para utilizar como
ingrediente alimentario, que comprende
(a) la inoculación de un medio con una cepa de
bacterias productoras de lacticina 3147;
(b) la fermentación del medio inoculado;
(c) el ajuste del pH de la fermentación entre
6,3 y 6,7;
(d) la inactivación del fermento bacteriano:
(e) la evaporación del fermento de la etapa
(d);
(f) el secado por atomización del polvo obtenido
en la etapa (e).
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el medio se selecciona de entre polvos de leche o polvos de
productos lácteos que incluyen polvo de lactosuero desmineralizado,
polvo de leche desnatada reconstituida, polvo de concentrado de
proteínas de lactosuero, leche entera pasteurizada, lactosuero de
queso Cheddar, polvos de levadura o medios o caldos sintéticos de
tipo laboratorio.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que el medio de tipo laboratorio es caldo de LM 17 o de TY.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el concentrado de la etapa (e) se
enfría, se siembra con lactosa a razón de aproximadamente 0,1% en
peso y se deja cristalizar a una velocidad de enfriamiento de
aproximadamente 1ºC por hora.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el medio inoculado se
fermenta a aproximadamente 30ºC durante aproximadamente 6 a 24
horas.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el pH de la fermentación se
ajusta a aproximadamente 6,5.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el fermento inactiva por
pasteurización o tratamiento a una temperatura muy elevada.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que el fermento se pasteuriza a aproximadamente 72ºC durante
aproximadamente 15 minutos.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el fermento de la etapa (d)
se evapora a aproximadamente 60ºC hasta obtener aproximadamente el
40% de los sólidos totales.
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