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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung eines
sprühgetrockneten
Bakteriocin-Pulvers mit antimikrobieller Aktivität. Die Erfindung betrifft ein
Lacticin 3147 sprühgetrocknetes
Pulver.
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Stand der Technik
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Die
Eliminierung von Lebensmittelverderben und pathogenen Organismen
wurde zum Fokus ausgedehnter Forschungen, da durch Lebensmittel übertragene
Krankheiten im Hinblick auf die betroffenen Individuen und Kosten
der Behandlung unglaubliche Auswirkungen haben. Es wurde geschätzt, daß mikrobielle
Pathogene in Nahrungsmitteln 6,5 bis 33 Millionen Fälle menschlicher
Erkrankungen in den USA jährlich
auslösen,
mit Kosten zwischen $ 2,9 bis $ 6,7 Billionen Dollars (2), wobei
Gram-positive Lebensmittelgetragene Pathogene zwischen 25 und 55%
der Kosten verursachen. In den letzten Jahren hat die Nachfrage
bei den Verbrauchern nach frischem, möglichst wenig verarbeiteten
sicheren Lebensmitteln, zusätzlich
zu Bedenken gegenüber
der Verwendung chemischer Konservierungsmittel in Nahrungsmitteln
ein substantielles Interesse an der Anwendung von Biokonvervierungsmitteln
ausgelöst.
Bacteriocine, die von Milchsäurebakterien
erzeugt werden, werden als Alternativen zu traditionellen Konservierungsmitteln
zur Sicherstellung der Lebensmittelsicherheit angesehen und potentielle
Anwendungen in Lebensmitteln wurden bereits einfach identifiziert
(21).
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Nisin,
ein Bacteriocin, das von bestimmten Stämmen von Lactococcus lactis
erzeugt wird, wurde erfolgreich zur Kontrolle des Verderbens von
Lebensmitteln verwendet, und zwar bei einer Anzahl unterschiedlicher
Lebensmittel, einschließlich
Käsen,
Konserven und Milchdesserts (10), siehe beispielsweise
DE 2616390 und eine Studie hinsichtlich
der Herstellung getrockneter Milch mit hohem Nisin-Gehalt (Datenbank FSTA
[online] Datenbank-Zugangsur. 75-2-06-p1345). Seine Verwendung unterliegt
jedoch bestimmten Restriktionen. Es ist besonders in denjenigen
Lebensmitteln effektiv, die einen sauren pH (unterhalb eines pHs
von 6,0) und einen niedrigen Protein- und Fettgehalt aufweisen.
Es ist oberhalb von pH 6,0 schlecht löslich und hat als solches eine
begrenzte Wirksamkeit in vielen Lebensmitteln. Ein pulverförmige Form
von Nisin, Nisaplin (Aplin und Barrett, Towbridge, Wiltshire, U.
K.) wurde entwickelt und wird für
die Konservierung von Lebensmitteln verwendet.
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Zusätzlich zu
der Entwicklung von Nisaplin wurden andere pulverförmige Bacteriocin-haltige
Mittel für die
Konservierung von Nahrungsmitteln entwickelt. Propionibacterium
freundreichii subsp. shermanni wird verwendet um Microgard (Wesmen
Food, Inc., Beaverton, OR) durch Pasteurisierung und Trocknen von
Propionibakterien fermentierter entfetteter Milch zu erzeugen. Es
wird geschätzt,
daß es
in ungefähr
einem Drittel aller Hüttenkäse verwendet
wird, die in den USA hergestellt werden und es soll gegenüber den
meisten Gram-negativen Bakterien und einigen Pilzen inhibitorisch
wirken (4). Die Wirkstoffe in Microgard beinhalten Propionsäure, Essigsäure, Diacetyl,
Milchsäure
und ein wärmestabiles
Peptid mit ungefähr
700 Daltons, das als besonders aktive Komponente betrachtet wird.
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Lacticin
3147 ist ein Bacteriocin, das von L. lactis DPC3147 erzeugt wird,
und das einen ähnlichen Wirtsbereich
wie Nisin aufweist, nämlich
darin, daß es
gegenüber
einem breiten Bereich Gram-positiver Organismen, einschließlich Listeria,
Clostridium spp., Enterococcus, Staphylococcus und Streptococcus
inhibitorisch ist (17). Angesichts der Tatsache, daß viele
dieser Organismen als Mittel für
ein Verderben von Lebensmitteln und eine Pathogenese infiziert wurden,
hat die Entwicklung von einem auf Lacticin 3147 basierenden System
zur Kontrolle dieser Organismen attraktive Gesichtspunkte. Dies
kann auf zwei Weisen erreicht werden. Der erste involviert die Verwendung
von Starterkulturen (einschließlich
Transkonjuganten), die Lacticin 3147 erzeugen und kann in Lebensmittelfermentationen
verwendet werden, wo diese Stämme
die ursprünglichen
Starterkulturen ersetzen können.
Die genetischen Determinanten für
Lacticin 3147 werden durch ein 60,2 kb-Plasmid, pMRC01 codiert,
das vollständig
sequenziert wurde (6) und das in einer Anzahl von Käsestarterkulturen
mobilisiert wurde (3). Lacticin 3147 ist Gegenstand der PCT-Anmeldung
Nr. PCT/IE96/00022, veröffentlicht
als
WO 96/32482 .
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Kürzlich wurde
gezeigt, daß eine
Lacticin 3147-erzeugende Transkonjugante Listeria monocytogenes in
Hüttenkäse inhibieren
kann (13). Dieser Starter wurde auch zur Kontrolle der Proliferation
von Nicht-Starter-Milchsäurebakterien
in Cheddarkäse
verwendet. Der zweite Ansatz zur Verbesserung der Lebensmittelsicherheit
durch Verwendung von Lacticin 3147 involvliert die Entwicklung einer
sprühgetrockneten
Form des Bacteriocins.
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Der
Vorteil eines solchen bioaktiven Pulvers ist derjenige, daß es als
Lebensmittelbestandteil bei einer Vielzahl von Lebensmitteln angewandt
werden könnte.
Es ist jedoch in keiner Weise eindeutig, daß das Bacteriocin robust genug
ist, um einem Sprühtrocknen
zu widerstehen und es gab die Möglichkeit,
daß das Sprühtrocknen
zu einem signifikanten Verlust der Bacteriocin-Aktivität führen würde.
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Aufgabe der Erfindung
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Die
Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur
Herstellung eines Lacticin 3147-angereicherten Lebensmittelbestandteils
zur Inkorporation in Lebensmittel. Insbesondere ist es wünschenswert,
ein sprühgetrocknetes
Lacticin 3147-Pulver bereitzustellen. Es konnte nicht vorhergesagt
werden, daß ein
solches sprühgetrocknetes
Pulver erzeugt werden könnte,
da das Sprühtrocknen
zu einer Hitzedenaturierung des Bacteriocins geführt haben könnte, wobei man bedenken sollte,
daß Lacticin
3147 aus zwei Peptiden besteht, die beide für die Aktivität benötigt werden.
Außerdem
könnte
eine Dehydratisierung das Bacteriocin irreversibel inaktivieren.
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Hier
beschrieben wird ein auf Molke basierendes bioaktives Pulver mit
einer Effektivität
zur Kontrolle von zwei repräsentativen
Pathogenen: L. monocytogenes und Staphylococcus aureus, in Puffer
bei sowohl neutralem als auch saurem pH. Ebenfalls wird seine Wirksamkeit
bei der Kontrolle von L. monocytogenes in einer Kleinkinder-Milchformulierung
und anderen Nahrungsmitteln beschrieben. Es wird jedoch für den Fachmann
auf dem Gebiet deutlich sein, daß das beschriebene Bacteriocinpulver
nicht unbedingt auf einer Milchbasis vorliegen muß und daß es auch
möglich
wäre, ein
sprühgetrocknetes
Bacteriocin zu erzeugen, das beispielsweise auf anderen Pulvern,
synthetischen Materialien oder ähnlichem
basiert.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung eines sprühgetrockneten
Lacticin-3147-Pulvers bereitgestellt, umfassend:
- (a)
Inokulieren eines Mediums mit einem Lacticin-3147-erzeugenden Stamm
von Bakterien,
- (b) Fermentation des inokulierten Mediums,
- (c) Einstellung des pHs der Fermentation auf einen pH von 6,3
bis 6,7,
- (d) Inaktivieren des bakteriellen Fermentats,
- (e) Verdampfen des Fermentats von Schritt (d)
- (f) Sprühtrocknen
des in Schritt (e) erzeugten Pulvers.
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Das
Medium, das mit den Bakterien inokuliert werden kann, kann aus Milch
oder aus Milchprodukten-Basispulvern gewählt werden, einschließlich entmineralisiertem
Molkepulver, rekonstituiertem entfettetem Milchpulver, Molkeprotein-Konzentratpulver,
pasteurisierter Milch, Cheddarkäsemolke
oder synthetischen Labormedien wie LM17 oder TY broth oder ähnlichem
Vorzugsweise wird das inokulierte Medium bei ungefähr 30°C für ungefähr 6 bis
24 Stunden fermentiert.
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Vorzugsweise
wird der pH der Fermentation auf ungefähr 6,5 eingestellt.
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In
geeigneter Weise wird das bakterielle Fermentat durch Pasteurisierung
oder durch Behandlung bei Ultrahochtemperatur inaktiviert.
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Geeigneterweise
wird das Fermentat, wenn es pasteurisiert wird, bei ungefähr 72°C für ungefähr 15 Sekunden
pasteurisiert.
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Vorzugsweise
wird das inaktivierte Fermentat bei ungefähr 6°C auf ungefähr 40% Gesamtfeststoffe verdampft.
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Das
Konzentrat von Schritt (e) kann dann ungefähr bei 32°C abgekühlt werden, mit Lactose bei
ungefähr
0,1% G/G versetzt werden und man kann es bei einer Kühlrate von
ungefähr
1°C pro
Stunde kristallisieren lassen.
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Das
kristallisierte Konzentrat wird dann durch die Verfahren, die auf
dem Gebiet im Stand der Technik bekannt sind, gemäß Schritt
(f) sprühgetrocknet.
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Ein
sprühgetrocknetes
Lacticin 3147-Pulver, das eine Fähigkeit
zur Inhibition von Organismen aufweist, die nicht gegenüber Lacticin
3147 resistent sind und das in geeigneter Weise eine Aktivität von ungefähr 40.240
au (willkürliche
Einheit)/pro ml aufweist, wird beschrieben.
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Ein
Lebensmittelprodukt, umfassend ein sprühgetrocknetes Lacticin 3147-Pulver,
wie oben definiert, wird ebenfalls beschrieben. Das Lebensmittelprodukt
kann eine Kleinkind-Milchformulierung, eine Soße, Mayonnaise, ein Dessert,
ein Yoghurt, ein Senf, eine Konserve wie ein konserviertes pflanzliches
oder fleischliches Produkt, eine Suppe, ein Backprodukt oder ähnliche
Produkte sein.
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Das
Lebensmittelprodukt kann weiter einem erhöhten hydrostatischen Druck
während
der Verarbeitung unterworfen werden, geeigneterweise bei einem Druck
von ungefähr
150 bis 800 MPa.
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Figuren-Legenden
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Die
vorliegende Erfindung wird nun im größeren Detail unter Bezugnahme
auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, worin:
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1:
(A) Wachstum vom L. lactis DPC3147 und Lacticin 3147-Produktion in 10%
rekonstituierten entmineralisierten Molkepulver bei 30°C, unter
pH-kontrollierten und nicht kontrollierten Bedingung. (♦) KBE/ml
ohne pH-Kontrolle,
KBE/ml
bei konstantem pH von 6,0,
KBE/ml
bei konstantem pH von 6,5 und (O) KBE/ml bei konstantem pH von 7,0.
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AU/ml
ohne pH-Kontrolle, (☐) AU/ml bei konstantem pH von 6,0,
AU/ml
bei konstantem pH von 6,5 und
AU/ml
bei konstantem pH von 7,0.
- (B) Inhibitorische
Aktivität
von Lacticin 3147 gegen L. lactis HP, wenn (a) ohne pH-Kontrolle
und wenn (b) bei einem konstanten pH von 6,5 gezüchtet wird.
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2:
Schematisches Diagramm des Temperaturprofils und der Lacticin 3147-Aktivität während der Herstellung
von Lacticin 3147-Pulver.
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3:
Wirkung von Lacticin 3147-Pulver auf die Lebensfähigkeit von Listeria monocytogenes
Scott A in einem Puffer bei 30°C
(A) bei pH 5 und (B) bei pH 7. (♦) ohne Zugabe,
Zugabe
von 10% Lacticin 3147-Pulver.
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4:
Wirkung von Lacticin 3147-Pulver auf die Lebensfähigkeit von Staphylococcus
aureus 10 in Puffer bei 30°C
(A) bei pH 5 und (B) bei pH 7. (♦) ohne Zugabe,
Zugabe
von 15% Lacticin 3147-Pulver.
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5:
Wirkung von Lacticin 3147-Pulver auf die Lebensfähigkeit von L. monocytogenes
Scott A, wenn verwendet als Komponente einer Kleinkind-Milchformel.
15%
Lacticin-Pulver,
10%
Lacticin-Pulver, 5% Kleinkindmilchpulver,
5%
Lacticin-Pulver, 10% Kleinkindmilchpulver, (♦) 15% Kleinkindmilchpulver.
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6:
Wirkung von Lacticin 3147-Pulver (10%) auf die Lebensfähigkeit
von Listeria monocytogenes Scott A in Yoghurt. (♦) Kein Lacticin 3147 zugefügt,
10%
Lacticin 3147 zugefügt.
10% bezieht sich hier auf 10 g Lacticin 3147-Pulver zugefügt zu 90
g Yoghurt.
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7:
Wirkung von Lacticin 3147-Pulver (10%) auf die Lebensfähigkeit
von Listeria monocytogenes Scott A in Hüttenkäse. (♦) Kein Lacticin 3147 zugefügt,
10%
Lacticin 3147 zugefügt.
10% bezieht sich hier auf 10 g Lacticin 3147-Pulver zugefügt zu 90
g Hüttenkäse.
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8:
Wirkung von Lacticin 3147-Pulver (10%) auf die Lebensfähigkeit
von Bacillus cereus in (Paket) suppe.
- (♦) kein Lacticin 3147 zugefügt,
- 1%
Lacticin 3147 zugefügt,
- 5%
Lacticin 3147 zugefügt,
- 10%
Lacticin 3147 zugefügt.
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1,
5 und 10% bezieht sich hier jeweils auf 1, 5 oder 10 g Lacticin
3147-Pulver, zugefügt
zu 99, 95 bzw. 90 g Paket-Suppenpulver, rekonstituiert gemäß den Anweisungen
des Herstellers.
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9:
Wirkung von Lacticin 3147-Pulver (10%) auf die Lebensfähigkeit
von Listeria monocytogenes Scott A in (Paket) suppe.
- (♦) kein
Lacticin 3147 zugefügt,
- 1%
Lacticin 3147 zugefügt,
- 5%
Lacticin 3147 zugefügt,
- 10%
Lacticin 3147 zugefügt.
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1,
5 und 10% bezieht sich hier jeweils auf 1, 5 oder 10 g Lacticin
3147-Pulver, zugefügt
zu 99, 95 bzw. 90 g Paket-Suppenpulver, rekonstituiert gemäß den Anweisungen
des Herstellers.
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10:
Wirkung von ansteigendem Druck auf die Aktivität von Lacticin 3147, (a) atmosphärischer Druck,
(b) 200 MPa, (c) 400 MPa, (d) 600 MPa und (e) 800 MPa.
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11:
Wirkung von Hochdruck und Lacticin 3147 auf die Lebensfähigkeit
von L. innocua DPC1770-Lebensfähigkeit.
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Beispiel
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Material und Methoden
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Bakterielle Stämme und
Kulturbedingungen
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Der
Bacteriocin-Erzeuger L. lactis subsp lactis DPC3147 und der empfindliche
Indikatorstamm L. lactis subsp lactis HP wurden routinemäßig bei
30°C in
M17 (20; Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, England), supplementiert
mit 0,5% (G/V) Lactose gezüchtet.
Andere Indikatorstämme,
die verwendet wurden, beinhalteten L. monocytogenes Scott A, gezüchtet in
Trypicase Soy Broth (TSB, Becton Dickinson und Co., Cockeysville, MD21030,
USA), supplementiert mit 0,6% (G/V) Hefeextrakte (Oxoid) und Staphylococcus
aureus 10 (DPC culture collection, Moorepark, Fermoy, Co. Cork,
Irland), gezüchtet
in Brain Heart Infusion broth (BHI, Oxoid), bei 37°C. Feste
Medien wurden durch Zugabe von 1% bakteriologischem Agar (Oxoid)
hergestellt.
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Eine
Anzahl unterschiedlicher Medien wurde im Hinblick auf die Produktion
von Lacticin 3147 untersucht. Diese wurden als 10% (G/V)-Lösungen hergestellt, außer aus
pasteurisierter Vollmilch- und Ceddarkäsemolke. Die 10%igen Lösungen wurden
aus entmineralisiertem Molkepulver (95% entmineralisiert) hergestellt,
aus rekonstituiertem entfettetem Milchpulver (Dairygold, Mitchelstown,
Co., Cork. Irland) und Molkeprotein-Konzentratpulver (WPC35, 35%
Protein in der Trockenmasse, Moorepark Technology Ltd., Moorepark, Fermoy,
Co. Cork, Irland). Die auf Molke basierenden Lösungen wurden durch Erhitzung
auf 95°C
für 30
Minuten sterilisiert. Die entfettete Milchpulverlösung wurde
durch Autoklavieren bei 121°C
für 5 Minuten
sterilisiert.
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Bacteriocin-Assay und Aktivitätsbestimmung
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Die
Bacteriocin-Aktivität
wurde durch den Agar-Vertiefungsdiffusionsassay, wie beschrieben
von Parente und Hill (15), bestimmt. Geschmolzener Agar wurde mit
einem Indikatorstamm versetzt und in Petrischalen verteilt. Vertiefungen
mit einem Durchmesser von ungefähr
4,6 mm wurden in den Agar gebohrt und ein 50 μl-Volumen einer zweifachen Serienverdünnung einer
Bacteriocin-Präparation
wurden in jede Vertiefung ausgegeben. Die Bacteriocin-Lösung wurde
Zentrifugation der Kultur und Wärmebehandlung
des Überstands
bei 70°C
für 10
Minuten vor der Durchführung
der Verdünnungsreihe
hergestellt. Die Platten wurden dann bei entweder 30 oder 37°C inkubiert,
abhängig
von dem verwendeten Indikatorstamm. Die Bacteriocin-Aktivität wurde als
inverse Zahl der letzten Verdünnung
berechnet, die eine definitive Clearance-Zone nach Inkubation über Nacht
ergab. Aktivitätseinheiten
(AU) wurden pro Milliliter ausgedrückt (1/Verdünnung × 20).
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Kontrollierte pH-Fermentationen
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Kontrollierte
pH-Fermentationen wurden über
eine 24-stündige
Zeitspanne durchgeführt,
wobei leicht bewegt wurde (ungefähr
20 Upm), bei 30°C.
Ein 1%iges Inokulum von DPC3147 wurde zum Inokulieren von 100 ml
Wachstumsmedium verwendet. Der pH der Wachstumsmedien wurde durch
Zugabe von 1,0 M NaOH nach Bedarf über ein 718 STAT Titrino (Metrohm,
Irland) konstant gehalten. Zellzahlen und Bacteriocin-Aktivitätsbestimmungen
wurden in stündlichen
Intervallen für
die ersten 10 Stunden durchgeführt
und eine letzte Probe wurde nach 24 Stunden genommen.
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Produktion eines sprühgetrockneten Lacticin 3147-Pulvers
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170
l-Volumen von entmineralisiertem Molkepulver (10% Gesamtfeststoffe)
wurden mit 1% DPC3147 inokuliert und der pH der 24-stündigen Fermentation
wurde durch Zugabe von 2,5 M NaOH nach Bedarf kontrolliert (pH 6,5).
Das Fermentat wurde dann bei 72°C
für 15
s unter Verwendung eines APV SSP-Pasteurisators (APV, Silkborg,
Dänemark)
pasteurisiert. Das pasteurisierte Fermentat wurde dann bei 60°C auf 40%
Gesamtfeststoffe unter Verwendung eines "single effect" Fallstromverdampfer (Anhydro Modell
F1 Lab.) verdampft. Das resultierende Konzentrat wurde auf 32°C abgekühlt, mit
Lactose (0,1% G/G) versetzt und man ließ es über Nacht bei einer Abkühlrate von
1°C pro
Stunde präkristallisieren.
Das präkristallisierte
Konzentrat wurde dann unter Verwendung einer Düsenatomisiervorrichtung in
einem Anhydro-Spray-Trockner (Anhydro Modell Lab 3) bei einer Lufteinlaßtemperatur
von 190°C
und einer Auslaßtemperatur
von 90°C
sprühgetrocknet.
Das Pulver wurde auf Aliquots verteilt, in Folien ausgekleidete
Probentaschen als Täschchen
verpackt und bei 4°C
gelagert. Die Bacteriocin-Aktivität wurde
bei jedem Schritt während
des Prozesses bewertet.
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Wirkung des Lacticin 3147-Pulvers gegen
Pathogene in Puffer
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Empfindliche
Zellen wurden bis zur mittleren exponentiellen Phase gezüchtet, gewaschen
und mit ungefähr
107 bis 108 KBE/ml
in 2,5 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 7,0 oder pH 5,0 und 2,5 mM
Natriumphosphat-Puffer,
pH 7,0 oder pH 5,0, supplementiert mit 10 mM Glucose resuspendiert.
Lacticin 3147-Pulver wurde zugefügt
(in unterschiedlichen Konzentrationen, abhängig von dem untersuchten empfindlichen
Stamm) und Proben wurden in geeigneten Zeitintervallen über eine
3-stündige
Periode zur Bestimmung der Zahl der lebensfähigen Zellen genommen.
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Wirkung von Lacticin 3147-Pulver gegen
L. monocytogenes in einer Kleinkind-Milchformulierung
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Lacticin
3147-Pulver wurde zu einer kommerziell erhältlichen Kleinkind-Milchformel
zugefügt
[Bestandteile aufgeführt
wie folgt: entmineralisiertes Molkepulver, pflanzliche Öle, Lactose,
entfettete Milch, Calciumcarbonat, Kaliumcitrat, Calciumchlorid,
Natriumcitrat, Magnesiumchlorid, Vitamin C, Emulgator (Sojalecithin),
Taurin, Kaliumhydroxid, Eisensulfat, Zinksulfat, Vitamin E, Nicotinamid,
Pantothensäure,
Vitamin A, Kupfersulfat, Zitronensäure, Thiamin, Vitamin B6 (Karotin, Mangansulfat, Kaliumiodid, Folsäure, Vitamin
K, Natriumselenit, Vitamin D, Biotin). Die Angaben des Herstellers
geben an, daß die
endgültige
Flüssigkeit
für den Kleinkindverbrauch
eine 15%ige Lösung
ist (G/V). In Experimenten wurde das 15%ige (G/V) Kleinkindmilchpulver
durch entweder 5% (G/V) Lacticin-Pulver und 10% (G/V) Kleinkindmilchpulver
oder durch 10% (G/V) Lacticin-Pulver und 5% (G/V) Kleinkindmilchpulver
ersetzt. L. monocytogenes-Zellen wurden zur mittleren exponentiellen
Phase gezüchtet,
gewaschen und bei ungefähr
104 KBE/ml in verschiedenen Kleinkindmilch-Formulierungen
bei 30°C
resuspendiert und Proben wurden nach geeigneten Zeitintervallen über eine
dreistündige
Periode zur Bestimmung der Zahl der lebensfähigen Zellen genommen.
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Präparation
von Lacticin 3147 zur Verwendung in Hochdruckinaktivierungsstudien
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Für die Inaktivierung
von Staph. aureus ATCC6538 wurde eine flüssige Präparation von Lacticin 3147 unter
Verwendung einer hydrophoben Adsorptionschromatographie hergestellt.
Für Studien
hinsichtlich der Inaktivierung von L. innocua DPC1770 wurde eine
food grade-Pulver-Präparation
von Lacticin 3147 wie oben beschrieben hergestellt, wobei sie die
folgende Modifikation aufwies: eine 1%ige entmineralisierte Molkepulverlösung wurde
mit L. lactis susp. lactis DPC3147 unter Bedingungen einer pH-Kontrolle
mit einem pH von 6,0 für
18 Stunden fermentiert.
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Die
Aktivität
von beiden Lacticin 3147-Präparationen
wurde durch den Agar-Vertiefungsdiffusionsassay, wie beschrieben
von Parente und Hill (15), bestimmt. Geschmolzener Agar wurde mit
dem Indikatorstamm L. lactis subsp. lactis HP ausgesät und auf
Petrischalen verteilt. Vertiefungen mit einem Durchmesser von ungefähr 6,0 mm
wurden in den Agar gebohrt und ein 50 μl-Volumen einer zweifachen seriellen Verdünnung einer Bacteriocin-Präparation
wurde in jede Vertiefung ausgegeben. Dann wurden die Platten bei
30°C inkubiert.
Die Bacteriocin-Aktivität
wurde als inverse Zahl der letzten Verdünnung, die eine definitive
Clearance-Zone nach Inkubation über
Nacht ergab, berechnet. Aktivitätseinheiten
(AU) wurden pro Milliliter ausgedrückt (1/Verdünnung × 20). Die Aktivität kann auch
als Zonendurchmesser (mm) ausgedrückt werden, wobei der Durchmesser der
ersten Zone (rein, unverdünnte
Probe) der Verdünnungsreihe
aufgezeichnet wird.
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Wirkung von Hochdruck auf die Staph. aureus
ATCC6538 und L. innocua DPC1770 Lebensfähigkeit
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Staph.
aureus ATCC6538-Zellen wurden in 10% RSM resuspendiert und in sterile
700 μl PCR-Eppendorfs
als Aliquots verteilt, bevor sie in sterile Stomacher-bags plaziert
wurden (Seward Ltd., London, UK). 10 ml Volumina von L. innocua
DPC1770-Zellen wurden in 20% rekonstituiertem entmineralisiertem
Molkepulver resuspendiert, aliquotiert in sterile Stomacher-bags.
Die Proben wurden individuell vor ihrem Plazieren in einem Druckgefäß vakuumversiegelt
(Stansted Fluid Power Ltd., Stanstet, England). Das Gefäß bestand
aus einem Zylinder aus rostfreiem Stahl (37 mm Durchmesser × 300 mm
Höhe),
gefüllt
mit einem 15% (V/V) Castoröl
in Ethanol-Lösung,
das als hydrostatisches Druckbildungsmedium wirkte. Die Proben wurden
bei 25°C für 30 min
in einem DrucKBEreich von 150 bis 600 MPa behandelt, zusätzlich zu
einer Kontrollprobe, die bei atmosphärischen Druck (0,1 MPa) gehalten
wurde. Alle Experimente wurden im Duplikat durchgeführt. Die Kammer temperatur
wurde durch ein Thermoregulierungssystem bestimmt, das zirkulierte,
um die Kammertemperatur zu erhalten.
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Wirkung von Hochdruck auf die Lacticin
3147-Aktivität
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Um
die Wirkung von Hochdruck auf die Lacticin 3147-Aktivität zu bestimmen,
wurden rekonstituiertes Lacticin 3147-Pulver und Aliquots von flüssigem Lacticin
3147 vakuumversiegelt und Druck in einem Bereich von 100 bis 800
MPa wie oben beschrieben ausgesetzt. Unter Druck gesetzte und nicht
unter Druck gesetzte Lösungen
von Lacticin 3147 wurden bei 80°C
10 Minuten vor einer Durchführung
einer Aktivitätsbestimmung durch
den Vertiefungsdiffusionsassay unter Verwendung von L. lactis HP
als Indikatorstamm wärmebehandelt.
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Ergebnisse
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Das
Ziel dieser Forschung war die Entwicklung eines Verfahrens zur Erzeugung
einer pulverförmigen Form
von Lacticin 3147, das zur Verwendung als Bestandteil geeignet ist,
der die Kontrolle von unerwünschten Mikroorganismen
in Nahrungsmitteln unterstützen
kann. Folgend auf die Optimierung der Lacticin 3147-Produktion wurde
eine Scale-Up-Fermentation durchgeführt und das Fermentat wurde
sprühgetrocknet,
um ein Bacteriocinreiches Pulver zu bilden. Dieses Pulver wurde
sowohl in einem Puffer als auch in einem Kleinkind-Milchnahrungsmittelsystem
im Hinblick auf seine Fähigkeit
zur Inhibition von Pathogenen bewertet.
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Lacticin 3147-Produktion in verschiedenen
Medien
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Folgend
auf eine Inokulation von DPC3147 (1%) und Übernacht-Inkubation bei 30°C wurde die
Lacticin 3147-Aktivität
in einer Anzahl unterschiedlicher Wachstumsmedien bewertet. Die
meisten Medien basierten auf Milchprodukten jedoch waren auch zwei
synthetische Medien beinhaltet (LM17 und TV). Die Ergebnisse der
Produktion von Lacticin 3147 (siehe Tabelle 1) demonstrierten, daß die Aktivität in allen
auf Milch basierenden Medien (1280 bis 2560 AU/ml) hoch war, außer bei
WPC35 (320 AU/ml). Die höchsten
Lacticin 3147-Aktivitätsniveaus
wurden in Cheddarkäse-Molke
angetroffen, außerdem
in Vollmilch und LM17 (2560 AU/ml). Sowohl 10%iges rekonstituiertes
entmineralisiertes Molkepulver als auch 10%iges rekonstituiertes entfettetes
Milchpulver ergab eine Aktivität
von 1280 AU/ml. Niedrigere Lacticin 3147-Aktivitätsniveaus wurden bei TY-broth
beobachtet (640 AU/ml).
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Da
entmineralisiertes Molkepulver kommerziell und einfach erhältlich ist
und eine gute Lacticin 3147-Aktivität in diesen Medien beobachtet
wurde, wurden weitere Untersuchungen hinsichtlich der Optimierung
der Lacticin 3147-Produktion in entmineralisiertem Molkepulver durchgeführt.
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Optimierung der Lacticin 3147-Produktion
in 10%igen rekonstituiertem entmineralisiertem Molkepulver
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Die
Bacteriocin-Produktion und die Zahl lebensfähiger Zellen in pH-kontrollierten und
pH-nicht-kontrollierten Fermentationen ergaben, daß erhöhte Niveaus
von Lacticin 3147 durch Erhalt des pHs bei einem konstanten Wert,
nämlich
pH 6,5 in den Wachstumsmedien erzeugt werden konnten (1).
Die Niveaus der Bacteriocin-Aktivität erreichten 10 240 AU/ml in
10%igem rekonstituiertem entmineralisierten Molkepulver, wenn der
pH des Wachstumsmediums bei einem pH von 6,5 konstant gehalten wurde
(1B(a)), im Vergleich mit 640 AU/ml,
wenn keine pH-Kontrolle ausgeübt
wurde (1B(b)). Sowohl bei pH 6,0 als
auch pH 7,0 erreichte die Lacticin-Aktivität 5120 AU/ml. Die Ergebnisse
der Zählungen
der lebensfähigen
Zellen über
eine 24-stündige
Zeitspanne zeigten an, daß eine
erhöhte
Bacteriocin-Aktivität zu höheren Zelldichten
korrespondierte. Ohne pH-Kontrolle erreichte die Zahl lebensfähiger Zellen
1 × 109 KBE/ml, während bei Erhalt des pHs in
den Wachstumsmedien bei einem konstanten pH von 6,5 die Zahl lebensfähiger Zellen
3,8 × 109 KBE/ml erreichte (1A).
Mit einer pH-Kontrolle
bei 6,0 und 7,0 erreichten die Zahlen lebensfähiger Zellen 2,5 × 109 KBE/ml.
-
Produktion von Lacticin 3147-Pulver
-
Eine
sprühgetrocknete
Lacticin 3147-Präparation
wurde wie in Material und Methoden beschrieben hergestellt. während des
Herstellungsverfahrens wurde die Bacteriocin-Aktivität bei jedem
Schritt bewertet, wobei L. lactis HP als Indikatorstamm verwendet
wurde (2). Folgend auf die pH-kontrollierte Fermentation (in 10% rekonstituiertem
entmineralisiertem Molkepulver) betrug die Bacteriocin-Aktivität 10 240
AU/ml. Das Fermentat wurde einer Pasteurisierung unterworfen, um
die Bacteriocin-produzierende Kultur DPC3147 zu inaktivieren. Die
Pasteurisierung hatte keine Wirkung auf die Bacteriocin-Aktivität (2).
Eine Verdampfung (von 10% Feststoffen zu 40% Gesamtfeststoffen)
führte
zu einer Konzentration des Fermentats und führte zu einem Anstieg der Bacteriocin-Aktivität auf 40
960 AU/ml. Folgend auf eine Über-Nacht-Kristallisierung
blieb die Aktivität
des Konzentrats stabil. Ein Sprühtrocknen
des Konzentrats führte
zu einer Produktion eines aktiven Pulvers. Wenn das sprühgetrocknete
Pulver bei einer Konzentration von 50 mg/ml (5% Feststoffe) resuspendiert
wurde, enthielt es 5120 AU, was anzeigte, daß die Aktivität des Lacticin-Pulvers
102 400 AU/g (100% Feststoffe) betrug. Die als AU/g von Trockenmasse
ausgedrückte
Lacticin 3147-Aktivität
blieb während
der Herstellung konstant bei 102 400 AU/g, was anzeigte, daß während der
Verarbeitung kein Verlust der Bacteriocin-Aktivität auftrat.
-
Die
inhibitorische Aktivität
des mit Bacteriocin angereicherten Pulvers wurde der Wirkung von
Lacticin 3147 und nicht derjenigen anderer Fermentationsmetaboliten
wie Milchsäure
zugeschrieben, da es einen empfindlichen L. lactis MG1614 inhibierte,
jedoch keine inhibitorische Wirkung gegen eine Transkonjugante zeigte, die
das pMRC01-Plasmid enthielt.
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Wirkung von Lacticin 3147-Pulver auf Pathogene
-
Das
mit Lacticin 3147 angereicherte entmineralisierte Molkepulver (Lacticin
3147-Pulver) wurde im Hinblick auf seine Fähigkeit zur Inhibition zweier
Lebensmittel-getragener Pathogene untersucht. Die inhibitorische
Wirkung des Pulvers wurde bei einem pH von 5 und einem pH von 7
untersucht, in Gegenwart und Abwesenheit von 10 mM Glucose. Die
Wirksamkeit einer 10%igen (G/V)-Lösung von Lacticin 3147-Pulver
gegen Zellen in der mittleren exponentiellen Wachstumsphase von
L. monocytogenes Scott A demonstrierte, daß ungefähr eine 3,3 log-Tötung (99,95%ige
Tötung)
bei einem pH von 5 innerhalb von 3 Stunden bei 30°C erreicht werden
konnte (3A). Ein Abtöten von
L. monocytogenes Scott A mit einer 10%igen (G/V)-Lösung von Lacticin-Pulver
war etwas effektiver bei pH 7 (3B).
Eine 3,8 log-Tötung (99,98%ige
Tötung)
wurde innerhalb von 3 Stunden bei 30°C beobachtet.
-
Es
erwies sich, daß S.
aureus 10 gegenüber
der Wirkung des an Lacticin angereicherten Pulvers etwas resistenter
war als L. monocytogenes Scott A; aus diesem Grund wurde eine 15%ige
Lösung
des Pulvers verwendet. Die Wirksamkeit einer 15%igen (G/V)-Lösung von
Lacticin 3147-Pulver gegen Zellen von S. aureus 10 in der mittleren
exponentiellen Wachstumsphase führte
zu einer ungefähr
1,1 log-Tötung
(90,4%igen Tötung)
bei pH 5 innerhalb von 3 Stunden bei 30°C (4A).
Die Abtötungswirkung
einer 15%igen Lösung
(G/V) eines Lacticin-Pulvers erhöhte
sich dramatisch bei pH 7, wo ungefähr eine 4 log-Abtötung (99,98%ige
Tötung) von
S. aureus 10 innerhalb von 3 Stunden bei 30°C beobachtet wurde (4B). Der Einschluß von 10 mM Glucose führte nur
zu geringen Anstiegen im Niveau des Zelltods für sowohl L. monocytogenes Scott
A als auch S. aureus 10 (Ergebnisse nicht dargestellt).
-
Wirkung von Lacticin 3147-Pulver gegen
L. monocytogenes Scott A in einer Kleinkind-Milchformulierung
-
Um
die Wirksamkeit des Lacticin 3147-Pulvers in einem Nahrungsmittelsystem
zu bewerten, wurden Experimente an einer Kleinkind-Milchformel durchgeführt, da
diese ein Beispiel für
ein Nahrungsmittel ist, das für
Verbraucher mit hohem Risiko bestimmt ist und das entmineralisiertes
Molkepulver als Hauptbestandteil enthält. Die Ergebnisse zeigten
eine mehr als 99%ige Abtötung
von L. monocytogenes Scott A, die sich ergaben, wenn ein Teil der
Kleinkind-Milchformulierung durch entweder zwei Drittel (10% Lacticin-Pulver
und 5% Kleinkind-Milchpulver) oder ein Drittel Lacticin 3147-Pulver
(5% Lacticin-Pulver und 10% Kleinkind-Milchpulver) ersetzt wurden
(5). Die Zahlen reduzierten sich hier von ungefähr 7 × 104 KBE/ml auf 3 × 101 KBE/ml innerhalb
von 3 Stunden bei 30°C.
In der Kontrollkultur ohne vorhandenes Lacticin 3147-Pulver erhöhten sich die
Zahlen von ungefähr
104 KBE/ml auf ungefähr 105 KBE/ml
in derselben Zeitspanne.
-
Anwendung des Lacticin 3147-Pulvers auf
einen Bereich von Nahrungsmitteln
-
Pulverförmiges Lacticin
3147 wurde im Hinblick auf seine Inhibition eines Verderbens von
Nahrungsmitteln bewertet sowie von pathogenen Mikroorganismen in
einer Anzahl von Nahrungsmittelsystemen, einschließlich Kleinkind-Nahrungsmittelformeln,
pulverförmigen
Suppen, Hüttenkäse und natürlichem
Yoghurt. Das folgende sind spezifische Beispiele der Verwendung
von Lacticin 3147 zur Inhibition von Pathogenen in Nahrungsmittelsystemen.
-
Die
Fähigkeit
des Lacticin 3147-Pulvers zur Inhibition von Listeria monocytogenes
Scott A wurde anfänglich
in einer Kleinkind-Milchformulierung wie oben beschrieben untersucht.
Um die inhibitorische Wirkung des Lacticin 3147-Pulvers weiter zu
untersuchen, wurden Inaktivierungsversuche gegen eine Anzahl unterschiedlicher
Mikroorganismen in natürlichem
Yoghurt, Hüttenkäse und rekonstituierter
pulverförmiger
Suppe durchgeführt,
mit pHs von 4,5, 4,4 bzw. 6,6.
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Die
Wirkung des 10%igen Lacticin 3147-Pulvers auf die Inhibition von
Listeria monocytogenes Scott A (104 KBE/ml)
in natürlichem
Yoghurt demonstrierte, daß mehr
als 98,3% der Kultur innerhalb von 5 Minuten bei 30°C abgetötet wurde.
Innerhalb von 60 Minuten verblieben keine lebensfähigen Zellen
(6).
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Im
Falle des Hüttenkäses, der
mit 104 KBE/ml Listeria monocytogenes inokuliert
worden war, wurde 40% der Population innerhalb von 5 Minuten bei
30°C in
Gegenwart von 10% Lacticin 3147-Pulver abgetötet. Nach 160 Minuten blieb
nur 14% der Population lebensfähig
(7).
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Die
Wirkung von 1, 5 und 10%igen Konzentrationen von Lacticin 3147 in
pulverförmiger
Suppe gegen Bacillus cereus bei 30°C demonstrierte, daß folgend
auf eine 24-stündige
Inkubation eine mehr als 99,9%ige Abtötung in Gegenwart der 5 und
10%igen Lacticin 3147-Pulverkonzentrationen beobachtet wurde. Im
Fall der 1%igen Lacticin 3147-Konzentration überlebten 17% der Populationen
(8).
-
Eine ähnliche
Studie wurde durchgeführt
um die Wirkung von 1, 5 und 10%igen Konzentrationen des Lacticin
3147-Pulvers auf das Überleben
von Listeria monocytogenes Scott A in pulverförmiger Suppe zu bestimmen.
Eine 1%ige Konzentration von Lacticin war bei der Inhibition von
Scott A innerhalb von 24 Stunden ineffektiv, während eine 5%ige Konzentration
mehr als 10% der Population inhibiert war. Bei einer Konzentration
von 10% wurden mehr als 40% der Kultur inhibiert (9).
-
Aus
diesen Ergebnissen kann man sehen, daß eine pulverförmige Form
von Lacticin 3147 tatsächlich viele
Anwendungen bei der Nahrungsmittelsicherheit zur Kontrolle von Nahrungsmittelpathogenen
und Organismen, die zu einem Verderben derselben führen, aufweist.
-
Wirkung von hydrostatischen Druck
-
Die
Verwendung von hydrostatischem Druck und Lacticin 3147-Behandlungen wurde
in Milch und Molke im Hinblick auf eine Kombination beider Behandlungen
zur Verbesserung der Qualität
von nur minimal verarbeiteten Milchnahrungsmitteln bewertet. Das
System wurde unter Verwendung von zwei Nahrungsmittel-getragenen
Pathogenen, Staphylococcus aureus ATCC6538 und Listeria innocua
DPC1770 bewertet. Versuche gegen Staph. aureus ATCC6538 wurden unter
Verwendung von konzentriertem Lacticin 3147, hergestellt aus Kulturüberstand,
durchgeführt.
Die Ergebnisse demonstrierten eine mehr als additive Wirkung, wenn
beide Behandlungen in Kombination verwendet wurden, beispielsweise
führte
die Kombination von 250 MPa (2,2 log Reduktion) und Lacticin 3147
(1 log Reduktion) zur mehr als 6 logs Abtötung (10). Ähnliche
Ergebnisse wurden erhalten, wenn eine pulverförmige Form vom Nahrungsmittelgrad
von Lacticin 3147 (entwickelt aus einer sprühgetrockneten Fermentation
von rekonstituiertem entmineralisiertem Molkepulver) im Hinblick
auf die Inaktivierung von L. innocua DPC1770 bewertet (11).
Weiterhin wurde beobachtet, daß die
Behandlung von Lacticin 3147-Präparationen
mit Druck von mehr als 400 MPa zu einem Anstieg der Bacteriocin-Aktivität führte (äquivalent
zu einer Verdopplung der Aktivität).
Diese Ergebnisse zeigen an, daß eine
Kombination von Hochdruck und Lacticin 3147 zur Verbesserung der
Qualität
von nur minimal prozessierten Nahrungsmitteln bei niedrigeren hydrostatischen
Druckniveaus geeignet sein kann.
-
Diskussion
-
Die
Entwicklung eines auf Molke basierenden bioaktiven Nahrungsmittelbestandteils
wurde folgend auf Untersuchungen zur Lacticin 3147-Produktion in unterschiedlichen
Medien erreicht. Die Lacticin 3147-Aktivität war bei allen untersuchten
auf Milch basierenden Medien hoch, außer bei dem Molkeprotein-Konzentrat (WPC35).
Eine mögliche
Erklärung
für das
niedrige Aktivitätsniveau
im Molkeprotein-Konzentrat könnte
sein, daß die
Bacteriocin-Aktivität
vor dem Assay auf die Aktivität
in das Pellet bei Zentrifugation fraktionierte. Zwei synthetische
Medien wurden im Hinblick auf die Lacticin 3147-Produktion untersucht,
die LM17 broth (20) und TY broth (15). Die Niveaus der Lacticin
3147-Aktivität
in LM17 waren vergleichbar zur denjenigen bei auf Milch basierenden
Medien, jedoch war dies nicht unerwartet, da diese Medien für die Kultivierung
von Lactococcen entwickelt wurden. Die TY-broth, worin niedrige
Niveaus einer Lacticin 3147-Aktivität beobachtet wurden, wurde
entwickelt, um optimale Bacteriocin (Enterocin 116)-Produktion zu
ergeben, während
die Peptidniveaus im Medium minimiert wurden (um Peptide zu eliminieren,
die mit der Reinigung interferieren könnten). Für die Entwicklung eines Pulvers
ist die Verwendung des besonders kosteneffektiven Wachstumsmediums
natürlich
vorteilhaft. Entmineralisierte Molkepulver, ein leicht erhältliches
und kosteneffektives Medium (20 $ pro 25 kg) wurde im Hinblick auf
eine. Optimierung der Lacticin 3147-Produktion untersucht. Andere
geeignete Wachstumsmedien können
jedoch wie oben beschrieben verwendet werden.
-
Die
Wirkung des pHs auf die Bacteriocin-Produktion wurde gut dokumentiert
und für
eine Anzahl von Bacteriocin-erzeugenden Stämmen führt die Kontrolle des pHs während des
Wachstums zur höheren
Bacteriocin-Titern (11, 14, 18). Die Lacticin 3147-Aktivität stieg
dramatisch, wenn der pH der Wachstumsmedien bei einem pH von 6,5
konstant gehalten wurde. Die fünf
höchsten
Bacteriocin-Titer und höchsten
Zellzahlen wurden bei diesem pH beobachtet. Die niedrigsten Bacteriocin-Titer
und niedrigsten Zellzahlen wurden beobachtet, wenn keine pH-Kontrolle
ausgeübt
wurde. Eine erhöhte
Bacteriocin-Aktivität
korrespondierte zu erhöhten Zellzahlen.
-
Sobald
die Lacticin 3147-Produktion in 10%igem rekonstituiertem entmineralisiertem
Molkepulver optimiert worden war, wurde ein Fermentation in großem Umfang
aufgestellt, um ausreichend Fermentat für ein Sprühtrocknen zu erzeugen. Die
Produktion eines aktiven sprühgetrockneten
Pulvers demonstrierte die Flexibilität des Bacteriocins, in den
Extremen der Verarbeitungsbedingungen. Die Aktivität wurde
während
des Verfahrens nachgewiesen und das endgültige Pulver hatte eine Aktivität von 102
400 AU/g Trockenstoff, äquivalent
zu der zu Beginn des Prozesses vorliegenden Aktivität. Dieses
unerwartete Ergebnis ist signifikant darin, daß es nahelegt, daß während der
Produktion keinerlei Aktivität
verlorengeht.
-
Die
Bewertung der inhibitorischen Aktivität des bioaktiven Pulvers demonstrierte,
daß es
dazu in der Lage ist, sowohl L. monocytogenes als auch S. aureus
bei einem pH von 5 und einem pH von 7 zu inhibieren. In beiden Fällen zeigte
das bioaktive Pulver eine erhöhte
Abtötungsfähigkeit
bei neutralem pH. Dies ist eine signifikante Feststellung, da Nisaplin,
ein fermentierter Nahrungsbestandteil zur Verlängerung der Lagerfähigkeit
eines Produkts und zur Verhinderung von Verderben bekanntlich besonders
bei saurem pH effektiv ist (unterhalb eines pHs von 6,0). Die Entwicklung
eines Nahrungsmittelbestandteils, der Gram-positive Bakterien bei neutralem
pH abtöten
kann, zeigt an, daß das
Lacticin 3147-Pulver zum Einbau in einen breiteren Bereich von Nahrungsmittel
geeignet sein kann, wo es bis jetzt keine Gelegenheit für eine Verhinderung
eines Verderbens der Nahrungsmittel/Pathogenese, außer einem
Einschluß chemikalischer
Konservierungsmittel, gab.
-
Der
Wirkungsmechanismus von Lacticin 3147 wurde erhellt (12). Es induziert
einen Zelltod durch Permeabilisieren der Membranen empfindlicher
Zellen durch Porenbildung, was einen Ausfluß von K+-Ionen
und Phosphat ermöglicht.
Diese Wirkung resultiert in der Verteilung der Protonen-Antriebskraft, einer
Hydrolyse von intrazellulärem
ATP und schließlich
Zelltod. Energetisch aufgeladene Zellen sind gegenüber der
Wirkung von Lacticin 3147 stärker
empfänglich.
Die Zellen, die in Gegenwart von Lacticin-Pulver inkubiert wurden,
kombiniert mit 10 mM Glucose, zeigten einen leichten Anstieg der
Abtötungseffizienz
(außer
bei S. aureus 10 bei pH 7, Ergebnisse nicht dargestellt). Dies stimmt
mit den von McAuliffe et al. (12) berichteten Ergebnissen überein,
wobei beobachtet wurde, daß energetisch
geladenen Zellen gegenüber
Lacticin 3147 empfindlicher waren. Energetisch geladene Zellen haben
eine Protonen-Antriebskraft, die die Insertion des Lacticin 3147-Moleküls in die
Membran begünstigen
könnte,
wie beispielsweise im Fall von Nisin, einem lantibiotischen Porenbilder
(7, 8).
-
Die
Entwicklung einer pulverförmigen
Form von Lacticin 3147 würde
es ermöglichen,
daß es
in einer Anzahl von Nahrungsmittelsystemen verwendet wird. Da das
existierende Lacticin 3147-Pulver aus entmineralisiertem Molkepulver
entwickelt wurde, hat dieses Pulver Anwendungen bei allen Nahrungsmitteln,
bei denen entmineralisiertes Molkepulver ein existierender Bestandteil
ist. Beispielsweise wird entmineralisiertes Molkepulver in eine
Anzahl von Nahrungsmitteln, einschließlich Kleinkind-Milchformulierungen
eingebaut. Die in diesem Artikel demonstrierten Ergebnisse demonstrieren
die Fähigkeit
dieses Pulvers effektiv 99% von L. monocytogenes Scott A, zugegeben
zu einer Kleinkind-Formel zu inaktivieren, wobei ein Teil des Kleinkind-Milchpulvers
durch das Lacticin 3147-Pulver ersetzt wurde. Kleinkind-Milchformulierungen
werden mit dem höchstmöglichen
Standard hergestellt und das Auftreten von durch Nahrungsmittel übertragene
Krankheiten, die mit solchen Nahrungsmitteln assoziiert sind, ist
selten. Mehr als viele andere Nahrungsmittel sind jedoch Kleinkind-Milchformeln
gegenüber
einer Kontamination durch Haushaltskontaminationen empfänglich, was
die Gesundheit von Kleinkindern einem Risiko aussetzt. Aus diesem
Grund kann der Einschluß eines
an Lacticin 3147 angereicherten Pulvers in solche Formulierungen
einen erhöhten
Schutz im Fall einer Kontamination bieten, was sowohl für die Erzeuger
als auch die Verbraucher günstig
wäre.
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Da
die Hersteller bereits entmineralisiertes Molkepulver als Nahrungsmittelbestandteil
verwenden, sollte es möglich
sein, dieses Pulver (entweder teilweise oder vollständig) mit
einem bioaktiven entmineralisierten Molkepulver zu ersetzen, um
Nahrungsmittelprodukte weiter vor einem Verderben und pathogenen Gram-positiven
Organismen zu schützen.
Und tatsächlich,
für Hersteller,
die entmineralisierte Molkepulver nicht als Nahrungsmittelbestandteil
verwenden, könnte
der Einschluß von
niedrigen Niveaus des bioaktiven Pulvers ausreichen um einen verstärkten Schutz
zu verleihen, ohne die sensorischen oder funktionellen Eigenschaften
dieser Nahrungsmittel zu beeinflussen. Es wird jedoch auch deutlich,
daß ein
sprühgetrocknetes Lacticin
3147-Pulver, basierend auf einem anderen Medium als Molkepulver,
durch diese Erfindung erhältlich wäre. Ein
solches Pulver hat ein Potential zur Anwendung als Ersatz in Bereichen,
in denen Molkepulver nicht verwendet wird, mit denselben günstigen
Wirkungen.
-
Zusammenfassung
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Das
von Lactococcus lactis DPC3147 erzeugte Breitspektrumbacteriocin
Lacticin 3147 ist gegenüber einem
breiten Bereich von Nahrungsmittelverderben durch Gram-positive
und pathogene Organismen inhibitorisch. Eine 10%ige Lösung von
entmineralisiertem Molkepulver wurde mit DPC3147 bei einem konstanten pH
von 6,5 fermentiert. Das Fermentat wurde sprühgetrocknet und das resultierende
Pulver zeigte eine inhibitorische Aktivität.
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Die
Fähigkeit
des Lacticin 3147 angereicherten Pulvers zu Inhibition von Listeria
monocytogenes Scott A und Staphylococcus aureus 10 wurde in Puffer
bei sowohl saurem (pH 5) als auch neutralem pH (pH 7) bewertet.
Zusätzlich
wurde die Fähigkeit
des Pulvers zur Inhibition von L. monocytogenes Scott A in einer
Kleinkind-Milchformulierung bewertet. Die Resuspension von 8,3 log
sich in der mittleren exponentionellen Wachstumsphase befindlichen
L. monocytogenes Scott A-Zellen in einer 10%igen Lösung des
Lacticin 3147-angereicherten
Pulvers führte
zu einer 1000-fachen Reduktion lebensfähiger Zellen bei einem pH von
5 und 7 nach 3 Stunden bei 30°C.
Im Fall von S. aureus 10 führte
die Resuspension von 2,5 × 107 sich in einer mittleren exponentiellen
Wachstumsphase befindlichen Zellen in einer 15%igen Lösung des
Lacticin 3147-angereicherten Pulvers bei einem pH von 5 zu nur einer
10-fachen Reduktion der Zellzahlen lebensfähiger Zellen im Vergleich zu
einer 1000-fachen Reduktion bei pH 7, folgend auf eine Inkubation
für 3 Stunden
bei 30°C.
In einer Kleinkind-Milchformulierung führte die Verwendung des Lacticin
3147-Pulvers zu mehr als einer 99%igen Abtötung von L. monocytogenes innerhalb
von 3 Stunden bei 30°C. Ähnlich konnte
gezeigt werden, daß das Lacticin
3147-Pulver bei der Inhibition des Verderbens von Nahrungsmitteln
in pulverförmiger
Suppe, Yoghurt und Hüttenkäse effektiv
war. Weiterhin führt
die Kombination von hydrostatischem Druck und Lacticin 3147 zu einer
erhöhten
Abtötung,
was dies zu einem attraktiven Verfahren zur Verhinderung eines Verderbens
von minimal prozessierten Nahrungsmitteln macht. So wird dieser
bioaktive Lacticin 3147-Nahrungsmittelbestandteil Anwendungen in
vielen unterschiedlichen Nahrungsmitteln finden, einschließlich denjenigen
mit einem pH nahe am neutralen pH.
-
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-
Die
Bezeichnungen "umfaßt/umfassend" und die Bezeichnungen "hat/beinhaltend", wie hier in der
gegenwärtigen
Erfindung verwendet, werden verwendet um die Gegenwart der angegebenen
Merkmale, Zahlen, Schritte und Komponenten anzuzeigen, schließen jedoch
die Gegenwart oder Addition von ein oder mehr anderen Merkmalen,
Zahlen Schritten, Komponenten oder Gruppen davon nicht aus. Tabelle 1: Lacticin 3147-Aktivität in verschiedenen
Medien nach einer Inkubation über
Nacht bei 30°C
Wachstumsmedium | Lacticin
3147-Aktivität
(AU/ml) |
Cheddarkäse-Molke | 2560 |
Vollmilch | 2560 |
Rekonstituiertes
entfettetes Milchpulver | 1280 |
Rekonstituiertes
demineralisierte Molkepulver | 1280 |
Molkeprotein-Konzentrat
(WPC35) | 320 |
LM17 | 2560 |
TY
broth | 640 |