ES2303361T3 - Conjugados de interferon-alfa-polimero con actividad biologica potenciada y procedimientos de preparacion de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para preparar conjugados de alfa-interferón-polímero, que comprende: a) formar un conjugado de un alfa-interferón estable frente al ácido con un polímero activado, sustancialmente no antigénico, en solución; b) acidificar la solución que contiene el conjugado de (a) hasta un nivel de pH inferior a aproximadamente 3, que es eficaz para escindir selectivamente cualquier enlace que reduzca la bioactividad del interferón conjugado; y a continuación c) ajustar la solución acidificada de (b) hasta un pH fisiológicamente aceptable, en el que la proporción molar de dicho polímero sustancialmente no antigénico con respecto a dicho alfa-interferón varía desde aproximadamente 8:1 hasta aproximadamente 1:8.
Description
Conjugados de
interferón-\alpha-polímero con
actividad biológica potenciada y procedimientos de preparación de
los mismos.
La presente invención está dirigida a
preparaciones de acción prolongada que contienen interferón. En
particular, la invención está dirigida a los conjugados del
interferón que tienen niveles más altos de actividad biológica
conservada, con relación a la actividad de los conjugados del
interferón previamente conocidos, así como a los procedimientos para
fabricar y usar los mismos.
Se ha sugerido que la conjugación de las
proteínas biológicamente activas a polímeros mejora una o más de las
propiedades de tales proteínas. Las propiedades mejoradas
proporcionadas por la conjugación de un material bioactivo a un
polímero incluyen la vida en circulación aumentada, solubilidad con
agua aumentada y/o antigenicidad reducida, con relación al mismo
material bioactivo en la forma no conjugada. Por ejemplo, algunos de
los conceptos iniciales del acoplamiento de péptidos o de
polipéptidos, incluidas las proteínas, al polietilenglicol (PEG) y a
polímeros solubles con agua similares, están descritos por Davis y
col., en la Patente de EEUU Nº 4.179.337, cuya descripción se
incorpora en este documento por referencia. Tales conjugados se
forman generalmente haciendo reaccionar un material biológicamente
activo, tal como una proteína, con un exceso molar de varias veces
de un polímero activado, es decir, un polímero que tiene un
grupo de enlace terminal, sin importar dónde se unirá el polímero a
la proteína.
Las proteínas biológicamente activas que
estuvieron entre las primeras para conjugarse de esta manera
incluyen, por ejemplo, la insulina y la hemoglobina. Estas
proteínas contienen varios sitios de unión amino nucleófilos libres,
tales como grupos alfa amino (de preferencia
N-terminal), grupos épsilon amino y residuos de
histidina, que permiten la unión de varios polímeros, sin pérdida
significativa de la actividad biológica.
En algunos casos, sin embargo, la reacción de
conjugación encuentra complicaciones. Por ejemplo, llevar a cabo una
reacción de conjugación usando cantidades excesivas de los polímeros
activados puede dar lugar a conjugados biológicamente inactivos. Tal
inactivación puede ser el resultado de cualquiera de una serie de
reacciones indeseables, incluidas, por ejemplo, la formación de un
enlace conector a la proteína que de como resultado un impedimento
estérico o conformacional de un motivo de la proteína necesario para
la actividad biológica. Este problema puede resultar difícil de
evitar puesto que el polímero y la proteína se unen típicamente en
reacciones basadas en soluciones y hay poco que pueda hacerse para
preseleccionar los puntos de unión del polímero.
Se ha sugerido que puede reducirse al mínimo la
unión no específica del polímero bloqueando previamente los sitios
activos con materiales protectores reversibles (eliminables), tales
como el fosfato de piridoxal, pero los resultados no han sido
coherentes.
Los interferones (a continuación pueden
denominarse como "IFNs") son un grupo de proteínas que podrían
beneficiarse de las técnicas mejoradas de conjugación a polímeros.
Una especie de IFN de gran potencial terapéutico que se beneficiaría
especialmente de tal conjugación a polímeros es el alfa interferón
(a continuación puede denominarse como
"\alpha-IFN"). En el pasado, se han sugerido
varios conjugados de polímero-interferón. Se cree
que ninguna de las enseñanzas anteriores de la técnica, sin embargo,
han descrito la posibilidad de escindir selectivamente algunos
enlaces para reducir la actividad del interferón conjugado.
Las Patentes de EEUU Nº 4.766.106 y 4.917.888,
describen, entre otros, conjugados de
\beta-interferón-PEG. Los
conjugados descritos en las patentes anteriores utilizan un enlace
amida o éster para unir el metoxipolietilenglicol al interferón. Se
describen proporciones molares amplias del polímero y el interferón,
que varían desde 0,1 hasta 1,000:1.
La Patente de EEUU Nº 4.894.226, describe el
\beta-interferón conjugado a través de un enlace
amida a poliprolina usando un brazo separador flexible. De manera
similar, la Patente de EEUU Nº 5.281.698, incorporada en su
totalidad en este documento por referencia, describe, entre otras,
la reacción de interferones con un enlace uretano que forma el
polietilenglicol activado usando una proporción de polímero con
respecto a la proteína, de mayor preferencia, de 5:1. También, la
Patente de EEUU Nº 5.382.657, describe la formación de conjugados de
interferón con enlaces amida o uretano usando una proporción de
polímero-proteína de aproximadamente 3:1. Aunque en
estas patentes se han descrito excesos molares relativamente bajos
del polímero activado, no hay enseñanza o sugerencia del control de
la localización de uniones covalentes entre el polímero y la
proteína o, lo que es más importante, de cómo evitar la formación de
conjugados que contengan los polímeros unidos en la área del sitio
activo. Por consiguiente, no hubo mención sobre la posibilidad de
someter a los conjugados a otro tratamiento para mejorar o
recuperar la bioactividad perdida por la reacción de
conjugación.
La Solicitud de Patente Europea que lleva Nº de
publicación 0 236 987 describe la reacción de alfa y gamma
interferones con altos excesos molares polietilenglicoles activados
con alquil-imido ésteres. La Solicitud de Patente
Europea que lleva Nº de publicación 0 510 356 describe la
conjugación de alfa interferón con PEG activado con piridinil
carbonilo y tiocarbonilo. En ambos casos, sin embargo, los
conjugados resultantes incluyen especies que contienen una amplia
variedad de especie pegiladas, incluida una cantidad sustancial que
contienen más de una hebra del polímero por molécula de
interferón.
En otros intentos anteriores para evitar la
pérdida de bioactividad tras la conjugación del polímero, se preparó
un conjugado del factor estimulante de colonias de granulocitos
("G-CSF")-polímero haciendo
reaccionar el G-CSF con un PEG
carboximetil-N-hidroxi succinimidil
éster. El conjugado resultante se trata a continuación con
hidroxilamina dos molar (pH 7,3) para eliminar los enlaces
"inestables", seguido por una reducción del pH hasta 3,5.
Kinstler y col., 1996, Pharmaceutical Res. 13(7):
996-1002. Los autores, sin embargo, no
proporcionaron ninguna descripción o sugerencia para obtener
G-CSF mejorado ni proporcionaron ninguna pauta con
respecto al tratamiento de cualquier otro conjugado.
El documento WO96/11953 informa la preparación
de conjugados haciendo reaccionar una proteína, ejemplificada por
consenso IFN, con un polímero, a un pH ácido (pH 4). El documento
WO96/11953 establece que esta reacción evita selectivamente la unión
a los grupos épsilon amina de la lisina, mientras que favorece el
enlace con el grupo alfa amino del extremo
N-terminal. El documento WO96/11953 también describe
un procedimiento de tratamiento del pH de dos etapas en el que se
hace reaccionar el G-CSF con un PEG a pH 8,0,
seguido por la reducción del pH hasta pH 4,0, simplemente como etapa
previa a cargar el producto en una columna de separación. No se ha
informado la preparación de conjugados de interferón por medio de
este segundo procedimiento. Además, debe notarse que el documento
WO96/11953 describe el uso de una reacción de alquilación reductora
según resulta de preferencia para la unión selectiva del polímero,
por ejemplo, PEG, al N-terminal y no enseña ni
sugiere las ventajas de una reacción de acilación para unir los
polímeros a residuos del IFN diferentes del
N-terminal.
Por consiguiente, se cree que ninguna de las
referencias de Kinstler y col. mencionadas anteriormente enseñan o
sugieren la eliminación preferencial de un enlace conector que
inhibe la bioactividad de un sitio activo del interferón.
A pesar del trabajo mencionado anteriormente en
la área de los conjugados de interferón-polímero, se
han buscado mejoras. En particular, sería beneficioso proporcionar
conjugados del interferón que tengan niveles de bioactividad
sustancialmente previsibles e incluso uniformes. También sería
beneficioso preparar los conjugados del IFN sustancialmente libres
de polímeros unidos a la región del sitio activo del interferón.
Si se dispusiera de un procedimiento eficaz para
conseguir la conjugación del polímero, que evite al mismo tiempo la
interferencia con los sitios bioactivos del alfa interferón, podrían
prepararse muchos conjugados de
\alpha-IFN-polímero útiles. Por
consiguiente, una solución a los problemas descritos anteriormente
pondría los conjugados de alfa-interferón
óptimamente bioactivos disponibles para la técnica.
Para resolver estas y otras necesidades en la
técnica, la presente invención proporciona conjugados nuevos de
polímeros adecuados con las proteínas del interferón que tienen
actividad biológica deseable, así como los procedimientos para
fabricar y usar los mismos. Los procedimientos de la invención
también proporcionan conjugados que demuestran proporciones más
elevadas de la actividad biológica de las proteínas nativas del
interferón, con relación a los producidos por medio de
procedimientos conocidos previamente.
De preferencia, tales proteínas del interferón
son relativamente estables frente al ácido y exhiben o tiene
potencial para al menos una actividad biológica útil. Las proteínas
del interferón estables frente al ácido deseable incluyen de
preferencia las proteínas del \alpha-IFN.
Por consiguiente, en un aspecto de la invención,
se proporcionan los procedimientos para tratar los conjugados de
polímeros del \alpha-IFN estable frente al ácido
para escindir y eliminar selectivamente las hebras de polímero en el
IFN, de preferencia aquellos que puedan reducir la bioactividad del
interferón conjugado. El procedimiento incluye las etapas de:
- a)
- formar un conjugado de un \alpha-IFN estable frente al ácido con un polímero activado, sustancialmente no antigénico, en solución;
- b)
- acidificar la solución que contiene el conjugado de (a) hasta un nivel de pH inferior a aproximadamente 3, que es eficaz para escindir selectivamente cualquier enlace del polímero que reduzca la bioactividad del interferón conjugado; y a continuación
- c)
- ajustar la solución acidificada de (b) a un pH fisiológicamente aceptable.
La reacción de la etapa (c) se realiza durante
un período de tiempo y a un pH eficaz para dar lugar a un producto
que esté sustancialmente libre de conjugados que tengan inhibición
significativa de la bioactividad del IFN nativo. Además, el producto
de la etapa (c) se aísla opcionalmente de la solución con cualquier
procedimiento adecuado conocido en la técnica, según necesidad. La
disminución del pH, por ejemplo, la acidificación, se lleva a cabo
con un ácido adecuado a una concentración y durante un tiempo tal
que los conjugados resultantes conserven sustancialmente la
bioactividad del IFN nativo.
Los conjugados del \alpha-IFN
se preparan de preferencia haciendo reaccionar un polímero no
antigénico, activado por carbamato, con el
\alpha-IFN, en una proporción molar de desde
aproximadamente 1:8 hasta aproximadamente 8:1 (moles del polímero,
por mol del IFN). Las proporciones molares de más preferencia
incluyen aquellas que varían desde aproximadamente 1:4 hasta
aproximadamente 4:1 moles del polímero por mol del IFN. El polímero
sustancialmente no antigénico es de preferencia un óxido del
polialquileno (PAO) tal como un polietilenglicol (PEG) que tiene un
peso molecular de desde aproximadamente 600 hasta aproximadamente
60.000.
De acuerdo con otra forma de realización de la
presente invención, se proporcionan conjugados de
\alpha-IFN-polímero que pueden
incluirse como parte de soluciones farmacéuticamente aceptables. Los
conjugados que pueden prepararse por medio del procedimiento
descrito anteriormente incluyen los \alpha-IFN
unidos a un polímero activado, sustancialmente no antigénico. La
activación se logra de preferencia haciendo reaccionar el polímero
con un resto formador de carbamato. Sin estar ligados a la teoría,
los solicitantes creen que el enlace del carbamato se extiende entre
un grupo amino del IFN y un extremo terminal del polímero
sustancialmente no antigénico.
En formas de realización de preferencia,
sustancialmente todos los conjugados de
\alpha-IFN-polímero de la presente
invención contienen una única hebra de polímero unida covalentemente
a la molécula del IFN, por ejemplo, son monosustituidos. Sin
la intención de estar ligados a ninguna teoría, se cree que el único
polímero mencionado anteriormente se une para evitar la inhibición
de la bioactividad del interferón conjugado.
Puesto que existen múltiples puntos de unión
posibles para un polímero para acilar un interferón y dado el
intervalo de proporciones molares aceptables, se comprenderá que, en
ciertas formas de realización, el producto conjugado incluye una o
más hebras poliméricas.
En otras formas de realización opcionales, donde
el IFN está sustituido por más de un polímero, las sustituciones
pueden variar desde 2 hasta aproximadamente 8 polímeros por molécula
de IFN.
Por consiguiente, pueden producirse
preparaciones farmacéuticas con conjugados diseñados para incluir un
número sustancialmente uniforme de hebras de polímero por molécula
del interferón, mientras se mantienen los niveles maximizados de
bioactividad del interferón nativo, con relación a los conjugados
del interferón previamente conocidos. Tales conjugados de
interferón-polímero previamente conocidos incluyen
aquellos preparados con grandes excesos molares de polímeros
activados y/o de polímeros incluidos, conjugados al sitio activo del
interferón.
La invención también incluye procedimientos para
tratar afecciones susceptibles al
\alpha-interferón en mamíferos. En este aspecto,
los procedimientos de tratamiento incluyen la administración de una
cantidad eficaz de conjugados del
\alpha-interferón a los mamíferos que necesitan
tal terapia.
Como resultado de la presente invención, se
proporcionan conjugados de \alpha-interferón que
tienen actividad de interferón fiable, relativamente uniforme. En
una forma de realización, sin la intención de estar ligados a
ninguna teoría o hipótesis, los solicitantes creen que este
resultado se debe a la presencia sustancialmente uniforme de una
única hebra de polímero por conjugado, en el que, como se discutió
anteriormente, la única hebra de polímero está unida sustancialmente
lejos del sitio activo del interferón. Otra característica de la
presente invención es que se logra una mayor vida en circulación con
pérdidas mínimas en la actividad conservada del interferón.
Con objeto de apreciar la presente invención, se
describen los siguientes términos:
Debe entenderse que "estable frente al
ácido" describe una sustancia, incluida una proteína tal como
\alpha-interferón, que conserva sustancialmente
todas sus propiedades deseables, incluidas sus propiedades
bioactivas, cuando se somete a la etapa de reacción a pH ácido según
la invención;
Los términos "bioactivo" y
"biológicamente activo" deben considerarse sinónimos con objeto
de la presente invención, a menos que se especifique de otra manera.
Debe entenderse que el término bioactivo significa que la sustancia
a la que se aplica tal término tiene la propiedad de
"bioactividad", por ejemplo, utilidad médica
(terapéutica y/o de diagnóstico) en un mamífero, tejidos de
mamíferos y/o células de mamíferos. Por lo tanto, un interferón
bioactivo, o un derivado y/o conjugado del mismo, actúa modificando
o determinando un estado o función de un mamífero, de un órgano, un
tejido, célula, líquido, producto de secreción de mamífero, y
similares. Tal modificación es, por ejemplo, con el objeto de
proporcionar un tratamiento médico terapéutico u otro efecto deseado
y/o para indicar el estado o la función de un mamífero por medio de
una prueba de diagnóstico. Además, debe entenderse que las funciones
útiles de una sustancia bioactiva, tales como una proteína o un
conjugado del interferón, pueden obtenerse in vivo, ex
vivo, o in vitro, según sea adecuado;
debe entenderse que "polímeros
bis-activados" incluye a los polímeros que tienen
restos alfa y omega terminales que sirven como grupos salientes
adecuados durante las reacciones de conjugación (de enlace) con
interferones;
debe entenderse que "conjugados de
bis-interferón-polímero" describe
una única hebra de polímero sustancialmente no antigénico con dos
moléculas de interferón unidas covalentemente, una al extremo alfa
terminal y una al extremo omega terminal del polímero;
los enlaces "carbamato" y "uretano"
deben considerarse sinónimos con objeto de la presente
invención;
debe entenderse que "vida en circulación"
significa el período de tiempo durante el que un conjugado según la
invención, o un \alpha-interferón liberado de un
conjugado según la invención, permanece, in vivo, en una
concentración farmacéuticamente eficaz en la sangre y/o el plasma
circulantes de un mamífero, al que se le ha administrado el
conjugado.
debe entenderse que la "afección susceptible
al interferón" incluye todo estado de enfermedad, tales como
infecciones virales, trastornos inmunes, cánceres, o las afecciones
relacionadas, que se benefician terapéuticamente de la
administración de interferón exógeno, especialmente
\alpha-interferón;
debe entenderse que "conjugados de
mono-interferón-polímero"
describe a un conjugado que contiene una única molécula de
interferón unida covalentemente a un extremo terminal de una única
hebra del polímero sustancialmente no antigénico;
debe entenderse que "pH fisiológicamente
aceptable" describe un pH que sea compatible con los sistemas
fisiológicos.
Para una mejor comprensión de la presente
invención, se hace referencia a la siguiente descripción y su
alcance se precisará en las reivindicaciones.
La Figura 1 es un gráfico de una separación por
HPLC de conjugados de
PEG-\alpha-IFN tomada previo al
proceso de hidrólisis selectiva de la presente invención.
La Figura 2 es un gráfico de una separación por
HPLC de conjugados de
PEG-\alpha-IFN tomada tras el
proceso de hidrólisis selectiva de la presente invención.
Por consiguiente, la presente invención incluye
un procedimiento para preparar los conjugados del polímero con las
proteínas biológicamente activas del interferón, en el que los
conjugados producidos conservan altos niveles de actividad
biológica, con relación a los mismos interferones conjugados al
mismo polímero por medio de procedimientos previamente usados. En un
aspecto de preferencia, el interferón es una proteína del
\alpha-interferón. Por consiguiente, el
procedimiento de la invención incluye:
- a)
- formar un conjugado de un interferón estable frente al ácido, unido a polímero, con un polímero sustancialmente no antigénico, en solución;
- b)
- acidificar la solución que contiene el conjugado (a) hasta un nivel de pH inferior a 3 que es eficaz para escindir selectivamente cualquier enlace del polímero que reduzca la actividad del interferón conjugado; y a continuación
- c)
- ajustar la solución acidificada de (b) hasta un pH fisiológicamente aceptable.
En una forma de realización de preferencia, la
etapa (b) del procedimiento, descrito supra, se lleva a cabo
durante un período de tiempo y a un pH eficaz para dar lugar a un
producto conjugado según la invención. También resulta de
preferencia que el producto conjugado esté sustancialmente libre de
conjugados que tengan inhibición significativa de la bioactividad
del IFN nativo, por ejemplo, inhibición provocada por
interferencia del sitio activo, impedimento o bloqueo estérico por
el(los) polímero(s) unido(s). El experto en la
técnica, que determina y ajusta fácilmente el período de tiempo y el
pH óptimos, apreciará que tales parámetros se ajustan usando
procedimientos rutinarios, basados en el polímero específico, el
enlace activado, la naturaleza del conjugado deseado, y así
sucesivamente. El término "sustancialmente libre" indica que
una proporción significativa de los conjugados no deseables con
actividad más baja que la del IFN nativo, se eliminan. Por
consiguiente, el producto incluye generalmente desde aproximadamente
0 hasta aproximadamente 20 por ciento de los conjugados no deseables
descritos. De más preferencia, el producto incluye desde
aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 por ciento de los
conjugados no deseables, o desde aproximadamente 10 hasta
aproximadamente 15 por ciento de los conjugados no deseables.
En otra forma de realización de preferencia, el
producto de la etapa (c) del procedimiento de la invención se
purifica o aísla de preferencia de la solución con pH ajustado por
medio de cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica,
según sea necesario. Una discusión de un procedimiento del
aislamiento se discute y ejemplifica, simplemente con objeto
ilustrativo, por medio del texto y los Ejemplos a continuación en
este documento.
Los interferones son una familia compleja de
proteínas citocinas. Actualmente, los interferones se categorizan en
cinco diferentes tipos: alfa IFN (IFN de leucocitos), beta IFN (IFN
de fibroblastos), gammas IFN (IFN inmune), omega IFN y tau IFN
(factor trofoblástico). Para una revisión de los detalles y de las
relaciones de homología de las proteínas de IFN conocidas, véase,
por ejemplo, Viscomi, 1997, Biotherapy
10:59-86, incorporado en este documento por
referencia. Además, se han construido e informado diversos
interferones recombinantes y que no se presentan en la naturaleza.
Por ejemplo, el IFN humano de consenso es un alfa IFN producida de
manera recombinante como consenso de las secuencias especificadas
humanas del interferón. Aunque a continuación solamente se discuten
los alfa interferones, el experto apreciará que la invención puede
practicarse opcionalmente con otros miembros de la familia de
proteínas de los interferones que sean provechosamente estables
frente al ácido y que proporcionen los sitios de unión al polímero
necesarios y las actividades biológicas deseadas.
En un aspecto de la invención, los
\alpha-IFN resultan de preferencia para los
procesos y conjugados de la presente invención. En general, puede
prepararse u obtenerse la porción \alpha-IFN del
conjugado del polímero de una diversidad de fuentes incluidas las
técnicas recombinantes, tales como aquellas que usan genes
sintéticos expresados en E. coli. Véase también Pestka,
"Interferon a" en Human Citokines, Blackwell Scientific
Publications 1-16 (1992), cuya descripción se
incorpora en este documento por referencia. Otros IFN se describen
en "Structure-activity of Type I Interferons"
Biotherapy 10:59-86 (1997), en las Patentes de EEUU
Nº 4.897.471, 5.541.293 y 5.661.009, cuyos contenidos se incorporan
en este documento por referencia. Como alternativa, el
\alpha-IFN puede también ser un extracto de un
mamífero tal como un \alpha-IFN de ser humano,
rumiante o bovino.
Se conoce una serie de proteínas de
\alpha-IFN. Estas incluyen, por ejemplo, las
proteínas codificadas por los ocho diferentes ADNc clonados de IFN
de leucocitos humanos informados por Goeddel y col., 1981, Nature
290:20-21, cuya descripción se incorpora en este
documento por referencia. Otro \alpha-IFN es el
interferón humano de consenso. El interferón de consenso es un
péptido que no se presenta en la naturaleza, que incluye
principalmente las secuencias de aminoácidos y péptidos presentes en
todos los subtipos de \alpha-IFN humanos que se
presentan en la naturaleza. En las posiciones de la secuencia en las
que no hay aminoácidos comunes a todos los subtipos, se selecciona
el residuo que predomina entre los diversos subtipos. Más
información con respecto al \alpha-IFN humano de
consenso y a los procedimientos para obtener el mismo se resumen,
por ejemplo, en el documento WO 96/11953, cuya descripción se
incorpora en este documento por referencia.
Un \alpha-IFN particularmente
de preferencia es el IFN\alpha-2b, un producto
fabricado de manera recombinante del Schering Corp., Kenilworth, NJ.
Otras sustancias, incluidas fracciones de IFN o del
\alpha-IFN o polipéptidos o sustancias precursoras
que tienen un efecto de IFN en los mamíferos, pueden también
incluirse en los conjugados de la presente invención.
Según se usa en este documento, "efecto de IFN
en mamíferos" significa cualquier sustancia que demuestre
actividad in vivo que corresponda con la observada con los
IFN. Estas sustancias se preparan usando las técnicas conocidas por
los expertos en la técnica tales como el cultivo de tejidos, la
extracción de fuentes animales o por medio de procedimientos de ADN
recombinante. También se contemplan las fuentes transgénicas de IFN
y restos relacionados. Tales proteínas se obtienen de animales
transgénicos, es decir, ratones, cerdos, vacas, etc. en los
que la proteína de IFN se expresa en la leche, sangre, o en los
tejidos. Se entiende también que las técnicas recombinantes podrían
también incluir un sitio de glicosilación para la adición de un
resto carbohidrato en el polipéptido derivado de manera
recombinante. El procedimiento por el que se prepara el IFN para los
conjugados de la presente invención no se limita a los descritos en
este documento.
Como se estableció anteriormente, el
\alpha-IFN resulta de preferencia para la presente
invención no sólo por sus características bioquímicas y serológicas,
sino también porque tiene propiedades antivirales documentadas y
difunde más con eficacia en el torrente sanguíneo que otros
interferones. Además, el \alpha-interferón es
estable frente al ácido por lo que se beneficia de los
procedimientos de la invención. Mientras que no desea estar ligado a
ninguna teoría, se cree que la eliminación catalizada por el ácido
de los polímeros no deseables del \alpha-IFN
contribuye a mantener la actividad del IFN nativo.
Según se indicó anteriormente, los
\alpha-IFN de acuerdo con la invención son de
mayor preferencia estables frente al ácido cuando se ponen en
contacto durante un período de tiempo eficaz con una solución de
reacción que tiene un pH ácido. El nivel del pH es suficiente para
eliminar, hidrolizar o de otra manera escindir los enlaces, por
ejemplo, enlaces carbamato, en una área del sitio activo de una
proteína del interferón de interés. Los
\alpha-interferones recombinantes adecuados que
pueden usarse en la práctica de la invención incluyen, pero no se
limitan al interferón alfa-2b tal como Intron® A
disponible en Schering Corporation, Kenilworth, N. J., interferón
alfa-2a tal como Roferon® A disponible en
Hoffmann-La Roche, Nutley, N. J., e Infergen®
disponible en Amgen, Thousand Oaks, CA.
Para formar los conjugados de interferón de la
presente invención, se convierten los polímeros sustancialmente no
antigénicos tales como los poli(óxidos de alquileno) (PAO) en las
formas activadas, término conocido por los expertos en la técnica.
Por consiguiente, uno y de preferencia ambos grupos hidroxilo del
extremo terminal del polímero, (es decir, los grupos
hidroxilo alfa y omega terminales) se convierten en grupos
funcionales reactivos que, a su vez, permiten que el polímero se
conjugue de manera covalente a una proteína de interés. A este
proceso se lo denomina con frecuencia "activación" y al
producto se lo llama "poli(óxido de alquileno) activado". A los
polímeros que contienen los dos grupos de enlace alfa y omega se los
denomina óxidos de polialquileno bis-activados.
Otros polímeros sustancialmente no antigénicos tales como el
polipropilenglicol (PPG) y aquellos que se describen en este
documento se "activan" o funcionalizan de manera similar.
Los polímeros activados de preferencia son los
que forman un enlace uretano o carbamato con un grupo amino
nucleófilo, por ejemplo, un grupo
\alpha-amino N-terminal, un grupo
\varepsilon-amino ácido de lisina y un grupo
imidazol amino de histidina, que se encuentra en las moléculas de
IFN. De preferencia, el enlace uretano se forma usando un grupo
oxicarbonil-oxi-N-dicarboximida
terminal, tal como un grupo carbonato de succinimidilo. Los grupos
activadores alternativos incluyen N-succinimida,
N-ftalimida, N-tetrahidroftalimida y
otros de tales grupos activadores, tal como el benzotriazol. Por
consiguiente, los polímeros sustancialmente no antigénicos incluyen
los grupos salientes en los extremos alfa y/u omega
terminal(es). Estos grupos formadores de uretano se describen
en la Patente de EEUU Nº 5.122.614 del solicitante, cuya descripción
se incorpora en este documento por referencia.
La Patente de EEUU Nº 5.122.614 también describe
la formación de derivados del carbonato de
N-succinimida de óxidos de polialquileno incluidos
los polietilenglicoles que también son capaces de formar enlaces
uretano con dianas de grupos amino de lisina. Los otros grupos
incluyen, carbonato del p-nitrofenilo (PNP),
oxicarbonilimidazol (CI) y tiazolidintiona.
De preferencia, el polímero sustancialmente no
antigénico se activa con el grupo SC. La Patente de EEUU Nº
5.122.614 también describe la formación de derivados carbonato de
mono- y bis-N-succinimidilo de los
óxidos de polialquileno y de los conjugados producidos de los
mismos. Se comprenderá, sin embargo, que sin importar el grupo
saliente del polímero activado utilizado, la reacción del enlace
uretano o carbamato tendrá lugar de una manera similar que resultará
evidente para el experto en la técnica sin excesiva
experimentación.
Aunque los enlaces carbamato o uretano
generalmente se consideran en la técnica como relativamente
resistentes a la hidrólisis, se ha encontrado sorpresivamente que
bajo las condiciones descritas en este documento, se considera
posible que cuando el enlace carbamato que une al grupo amino de
lisina o histidina al polímero está localizado cerca de un ácido
glutámico o aspártico, el grupo amino libre de estas lisinas o
histidinas de la región del sitio activo se regenera cuando el
conjugado se expone a un pH inferior durante un tiempo suficiente,
aumentando de esta manera la actividad específica del conjugado
resultante, mientras que otros enlaces carbamato en la proteína no
están sustancialmente afectados. Aunque los polímeros pueden unirse
al interferón usando otros tipos de enlace, es decir, amida,
urea, etc., usando tipos alternativos de polímeros activados, el
enlace carbamato resulta de preferencia por su relativamente único
grado de fuerza de enlace y susceptibilidad a la hidrólisis
selectiva en la región del sitio activo del interferón.
En otro aspecto de la invención, el grupo de
polímeros sustancialmente no antigénicos, incluye opcionalmente los
polímeros bis-activados, por ejemplo, óxidos de
polialquileno (PAO) bis-activados, tales como los
polietilenglicoles bis-activados.
Los polímeros adecuados variarán sustancialmente
en peso; sin embargo, los polímeros que tienen pesos moleculares que
varían desde aproximadamente 600 hasta aproximadamente 60.000 se
seleccionan usualmente para el objeto de la presente invención. Los
pesos moleculares desde aproximadamente 1.000 hasta aproximadamente
40.000 resultan de preferencia y desde 2.000 hasta aproximadamente
20.000 son particularmente de preferencia.
Las sustancias poliméricas empleadas según la
invención son también de preferencia hidrosoluble a temperatura
ambiente. Una lista no limitante de tales polímeros incluye a los
homopolímeros de óxido de polialquileno tales como del
polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles
polioxietilenados, copolímeros de los mismos y copolímeros de bloque
de los mismos, a condición de que se mantenga la solubilidad con
agua de los copolímeros de bloque.
Como alternativa a los polímeros basados en PAO,
pueden usarse con eficacia materiales no antigénicos tales como
dextrano, polivinilpirrolidonas, poliacrilamidas, alcoholes
polivinílicos, polímeros basados en hidrocarburos y similares. La
activación de los grupos terminales de estas sustancias poliméricas
puede afectarse en formas similares a la usada para convertir óxidos
de poliaquileno y por lo tanto resultará evidente para los expertos
en la técnica. Los expertos en la técnica se darán cuenta que la
lista siguiente es meramente ilustrativa y que están contemplados
todos los materiales poliméricos que tengan las cualidades descritas
en este documento. Con objeto de la presente invención,
"eficazmente no antigénico" significa todos los materiales
comprendidos en la técnica que no sean tóxicos y que no provoquen
una respuesta inmunogénica apreciable en los mamíferos.
Los polímeros activados se utilizan de
preferencia en proporciones molares cuidadosamente definidas para
formar los conjugados descritos en este documento. Resulta de
preferencia que el polímero formador de enlaces carbamato esté
presente en cantidades molares aproximadamente iguales o inferiores
al interferón. Por consiguiente, el polímero activado estará
presente en cantidades desde aproximadamente 1:8 hasta
aproximadamente 8:1 (moles de polímero por mol de IFN). Otras
proporciones molares usadas según la invención incluyen aquellas que
varían desde aproximadamente 1:4 hasta aproximadamente 4:1 moles de
polímero por mol de IFN. En otro aspecto, pueden usarse proporciones
molares desde aproximadamente 1:2 hasta aproximadamente 2:1 moles de
polímero por mol de IFN. El experto por consiguiente apreciará que
el procedimiento de la invención permite proporciones de al menos
aproximadamente 8 moles de polímero por cada mol de IFN que
posibilitan la formación de cantidades significativas de los
conjugados deseados, que pueden a continuación tratarse para
maximizar la bioactividad y, si es necesario, seleccionarse para
eliminar las especies con peso molecular más elevado.
La reacción de conjugación se realiza bajo
condiciones relativamente suaves para evitar la inactivación del
interferón. Las condiciones suaves incluyen mantener el pH de la
solución de reacción en el intervalo de 6-8 y las
temperaturas de la reacción dentro del intervalo desde
aproximadamente 0 hasta 30ºC y de preferencia aproximadamente a
temperatura ambiente, es decir, 19-22ºC. Una
lista no limitante de tampones adecuados incluye el fosfato,
citrato, acetato, etc. El interferón sin modificar resultante de
estas condiciones de reacción puede reciclarse fácilmente en futuros
lotes para otras reacciones de conjugación.
En un aspecto opcional de la invención, se usan
las formas bis-activadas de un polímero para formar
los conjugados de interferón.
Las reacciones de conjugación de la presente
invención que usan el polímero activado proporcionan inicialmente a
una mezcla de reacción o combinación que contiene conjugados de
mono-interferón, interferón sin reaccionar, el
polímero sin reaccionar y algunas especies del peso molecular alto.
Las especies de peso molecular alto incluyen conjugados de hebras
múltiples, es decir, conjugados que contienen una pluralidad
de hebras del polímero y/o especies de PEG-IFN
polimerizadas (entrecruzadas), hasta el número máximo de
sustituciones deseadas y que pueden conseguirse con un IFN
particular. Tras eliminar las especies sin reaccionar y las especies
de peso molecular alto, se recuperan las composiciones que contienen
principalmente los conjugados de
mono-interferón-polímero. Los
conjugados tienen al menos aproximadamente el 20% de la actividad
biológica asociada con el interferón nativo o sin modificar, según
se mide usando de un ensayo de protección viral convencional, tal
como un ensayo de CPE con desafío de células de carcinoma de pulmón
humanas A549 con virus EMC. Véase, por ejemplo, Larocca, A. T.,
Borden, E. C., y Colby, C. B. en Human Citokynes, Handbook for Basic
& Clinical Research B.B. Aggarwal & S.U. Gutterman (eds.),
Blackwell Scientific Publications, Boston, 1991, cuya descripción se
describe en este documento por referencia. En aspectos de
preferencia de la invención, sin embargo, los conjugados tienen
aproximadamente el 30% de la actividad biológica asociada con el
interferón sin modificar y de mayor preferencia, la mezcla tiene
aproximadamente el 40% de la actividad biológica asociada con el
interferón sin modificar. Debe entenderse que estos valores
actividad conservada son valores calculados previo al procedimiento
de tratamiento ácido descrito en este documento.
En un aspecto opcional de la invención, se usa
un tensioactivo en los procedimientos de conjugación de la presente
invención. Los tensioactivos adecuados incluyen agentes de tipo
iónico tales como dodecilsulfato sódico, (SDS). También pueden
usarse otros tensioactivos iónicos tales como el dodecilsulfato de
litio, compuestos de amonio cuaternarios, ácido taurocólico, ácido
caprílico, ácido decansulfónico, etc. También pueden usarse los
tensioactivos no iónicos tales como los polioxietilen sorbitán
(Tween), éteres de polioxietileno (Tritones). Véase también
Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in
Biology and Biochemistry (1992) Calbiochem Corp. Las únicas
limitaciones en los tensioactivos usados en los procedimientos de la
invención son que se utilicen bajo condiciones y a las
concentraciones que no provoquen la desnaturalización sustancial
irreversible del interferón y que no inhiban totalmente la
conjugación del polímero. Los tensioactivos están presentes en las
mezclas de reacción en cantidades desde aproximadamente 0,01 hasta
0,5%; de preferencia desde 0,05 hasta 0,5%; y de mayor preferencia
desde aproximadamente 0,075 hasta 0,25%. También están contempladas
las mezclas de los tensioactivos.
A continuación se presenta una reacción de
conjugación representativa:
Se disuelve un exceso molar de aproximadamente 2
veces de un polímero activado formador de enlaces carbamato en Agua
Para Inyección (pH aproximadamente 6,0) y a continuación se añade a
una solución del interferón ajustada hasta un pH de aproximadamente
6,5-7,2 con el tampón de fosfato u otro tampón
adecuado. Se deja incubar la reacción a temperatura ambiente
(aproximadamente 20-25ºC) durante un tiempo
adecuado, tal como aproximadamente 2 horas, mezclando suavemente de
forma continua. Se apreciará que si se utiliza más polímero
activado, será más probable que los conjugados resultantes contengan
más de una hebra del polímero.
El número promedio de hebras incluidas como
parte del conjugado puede determinarlo un experto, sin excesiva
experimentación. De la misma manera, el experto podrá determinar
fácilmente el número óptimo de hebras por conjugado y/o el número
promedio óptimo de hebras por conjugado, simplemente realizando las
evaluaciones rutinarias de la potencia y eficacia del conjugado para
el uso previsto.
A continuación, se detiene la reacción de
conjugación un exceso varias veces molar de glicina. El interferón
sin modificar presente en la combinación de la reacción, tras la
extinción puede reciclarse en futuras reacciones usando
cromatografía de intercambio iónico o de exclusión por tamaño o
técnicas de separación similares. De preferencia, las composiciones
de la presente invención contienen menos de aproximadamente 5% de
interferón sin modificar.
Tras la preparación de los conjugados de
polímero-interferón deseados y si de ser necesario,
la purificación, o separación de los productos de reacción no
deseados, los conjugados se tratan para eliminar sustancialmente
todos los polímeros, que interfieren con la región del sitio activo,
para aumentar la actividad de interferón del conjugado. Por
consiguiente, en este aspecto de la invención, el procedimiento
incluye:
Formar un conjugado de un
\alpha-IFN estable frente al ácido con un polímero
activado, sustancialmente no antigénico, en solución, y a
continuación ajustar (por ejemplo, acidificar) hasta un nivel
de pH inferior a aproximadamente 3 que es eficaz para escindir
selectivamente cualquier enlace presente en o adyacente a un sitio
activo del \alpha-IFN. A continuación, el pH de la
solución acidificada se ajusta hasta un valor fisiológicamente
aceptable.
Los conjugados se mantienen típicamente en una
solución acuosa tamponada tras la conjugación y purificación a un pH
de aproximadamente 6,0-7,5. A continuación se
transfiere la solución, de ser necesario, a un recipiente adecuado
al que se puede añadir el ácido. Una lista no limitante de ácidos
adecuados incluye los ácidos haloacéticos tales como el ácido
trifluoroacético, ácido acético, ácido clorhídrico, ácido sulfúrico,
ácido fosfórico, etc. La cantidad de ácido añadido a los conjugados
se describe como una cantidad que reduce el pH. Esta cantidad
dependerá de varios factores incluidos el tipo de ácido
seleccionado, la fuerza y concentración del ácido y la proteína de
\alpha-IFN particular, etc. La cantidad puede
describirse además como la cantidad suficiente para conseguir la
reducción deseada del pH y la hidrólisis selectiva deseada en la
región del sitio activo sin provocar desnaturalización irreversible
significativa o el desplegamiento del interferón.
El pH de la solución que contiene el ácido se
reduce hasta menos de 3. Por lo tanto, el pH de la solución
adicidificada o que contiene ácido variará desde un pH desde
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 3. Como podrá apreciar el
experto, el intervalo óptimo de pH se determinará fácilmente por
medio de la manipulación rutinaria y sin excesiva experimentación,
al realizar el procedimiento y cuantificar la calidad y cantidad del
rendimiento, que depende de las condiciones de reacción particulares
y, por ejemplo, los conjugados a tratar. De manera similar,
se optimizan fácilmente los otros parámetros de la reacción de
conjugación, especialmente la etapa de acidificación.
El tiempo durante el que se exponen los
conjugados al pH más bajo se considera generalmente como un tiempo
suficiente para conseguir el resultado deseado mientras se evitan
efectos perjudiciales en el interferón. El tiempo exacto variará
dependiendo del tamaño del lote, el tipo de ácido utilizado y otros
parámetros del proceso que serán evidentes para el experto en la
técnica. Está contemplado que los períodos de tiempo de desde
aproximadamente 2 minutos hasta aproximadamente 7 horas se
considerarán generalmente suficientes para conseguir la suficiente
hidrólisis selectiva sin desnaturalización irreversible
significativa de las proteínas. De más preferencia, se usa un
período de tiempo de desde aproximadamente 2 minutos hasta
aproximadamente 4 horas, o incluso un período de tiempo de desde
aproximadamente 1 hasta aproximadamente 4 horas.
Según lo precisado anteriormente, mientras que
los Solicitantes no están ligados a la teoría, se cree que la mejora
de la bioactividad proporcionada por el tratamiento ácido se produce
por la escisión de un grupo amino nucleófilo modificado por
carbamato. El grupo carbamato escindido es posiblemente uno que
provoca interferencia con la bioactividad del interferón, por
ejemplo, al bloquear o interferir con un sitio activo, o quizás
con la estructura o la conformación del interferón de alguna
manera.
Tras la etapa de hidrólisis selectiva de la
reacción, se vuelve a poner a los conjugados tratados con ácido de
interferón y polímero sustancialmente no antigénico en un pH
fisiológicamente aceptable, es decir, desde aproximadamente
6,5 hasta aproximadamente 7,5.
En otra forma de realización opcional de la
invención, se aíslan las diversas especies de
interferón-polímero, es decir, conjugados de
mono o polihebras. Esta etapa puede llevarse a cabo previo a, o de
preferencia, tras la etapa del tratamiento ácido. La separación se
efectúa colocando las especies mezcladas en una solución tampón que
contiene desde aproximadamente 1 hasta 10 mg/ml de los conjugados de
interferón-polímero. Las soluciones adecuadas tienen
un pH desde aproximadamente 6,0 hasta aproximadamente 9,0 y de
preferencia desde aproximadamente 7,5 hasta aproximadamente 8,5. Las
soluciones contienen de preferencia una o más sales tampón
seleccionadas de KCl, NaCl, K_{2}HPO_{4}, KH_{2}PO_{4},
Na_{2}HPO_{4}, NaH_{2}PO_{4}, NaHCO_{3}, NaBO_{4} y
NaOH. Resultan de preferencia los tampones de fosfato de sodio.
Según el tampón de la reacción, la solución del
conjugado de polímero-interferón puede tener que
someterse primero a intercambio/ultrafiltración del tampón para
eliminar cualquier polímero sin reaccionar. Por ejemplo, la solución
del conjugado de PAO-interferón puede ultrafiltrarse
a través de una membrana con un corte de bajo peso molecular (10.000
a 30.000 Dalton) para eliminar la mayoría de los materiales no
deseados tales como el polímero sin reaccionar, tensioactivos (si
están presentes), o similares.
El fraccionamiento de los conjugados en una
combinación que incluye el producto deseado sustancialmente aislado,
por ejemplo, polímero monosustituido-IFN, se realiza
de preferencia usando un medio de cromatografía de intercambio
aniónico. Tales medios son capaces de unir selectivamente conjugados
de PAO-interferón a través de las diferencias de
cargas que varían de una manera algo predecible. Por ejemplo, la
carga superficial del \alpha-IFN está determinada
por el número de aminoácidos cargados disponibles en la superficie
de la proteína. De estos aminoácidos cargados, los grupos amino
nucleófilos, por ejemplo, los grupos alfa amino, los residuos de
lisina y/o los residuos de histidina sirven como el punto de unión
potencial de los conjugados de óxido de polialquileno. Por
consiguiente, las diversas especies de conjugados del interferón
tendrán diferentes cargas y permitirán el aislamiento selectivo.
\newpage
El uso de resinas de intercambio aniónico
fuertemente polares tales como las resinas de intercambio aniónico
de aminas cuaternarias son especialmente de preferencia para el
procedimiento de la presente invención. Incluidas entre las resinas
de intercambio aniónico cuaternario disponibles en el comercio
adecuadas para uso con la presente invención están
Q-HD, QA TRISACRYL® y
QMA-SPHEROSIL®, resinas de aminas cuaternarias
recubiertas sobre una matriz de polímero, fabricadas por IBF de
Garenne, Francia, para Sepracor de Marlborough, Massachusetts;
también pueden usarse TMAE650M®, una resina de tetrametilamino etilo
recubierta sobre una matriz de polímero, fabricada por
EM-Separators de Gibbstown, Nueva Jersey; QAESS0C®,
y SUPERQC®, ambas resinas de amina cuaternaria recubiertas sobre una
matriz de polímero y fabricadas por TosoHaas de Montgomeryville, PA.
QMA Accell, fabricado por Millipore de Millford, MA y resinas PEI
fabricadas por JT Baker de Phillipsburg, NJ. También pueden usarse
otras resinas de intercambio aniónico adecuadas, por ejemplo,
las resinas DEAE.
Por ejemplo, la resina de intercambio aniónico
se empaqueta de preferencia en una columna y se equilibra por los
medios convencionales. Se usa un tampón que tiene el mismo pH y
osmolalidad que la solución del interferón conjugado con el
polímero. El tampón de elución contiene de preferencia una o más
sales seleccionadas de KCl, NaCl, K_{2}HPO_{4},
KH_{2}PO_{4}, Na_{2}HPO_{4}, NaH_{2}PO_{4}, NaHCO_{3},
NaBO_{4} y (NH_{4})_{2}CO_{3}. La solución que
contiene el conjugado se adsorbe a continuación sobre la columna con
la especie de alto peso molecular y el polímero sin reaccionar que
no se retiene. Al completarse la carga, se aplica a la columna un
flujo de un gradiente de un tampón de elución con concentraciones
crecientes de la sal para eluir la fracción deseada de interferón
conjugado con óxido de polialquileno. Las fracciones combinadas
eluidas se limitan de preferencia a conjugados de mono- y bis-
interferón-polímero tras la etapa de separación de
intercambio aniónico. Cualquier especie del interferón sin conjugar
puede a continuación lavarse de la columna por medio de técnicas
convencionales. Si se desea, también pueden separarse las especies
de mono- y bis-interferón una de la otra por medio
de otra cromatografía de intercambio iónico o por cromatografía de
exclusión por tamaño.
También pueden usarse técnicas que utilizan
múltiples pasos isocráticos para aumentar la concentración. Las
múltiples etapas de elución isocráticas para aumentar la
concentración darán lugar a la elución secuencial de conjugados de
mono-interferón-polímero y a
continuación, en formas de realización opcionales, conjugados de
bis-interferón-polímero.
El intervalo de temperaturas para la elución
está entre aproximadamente 4ºC y aproximadamente 25ºC. De
preferencia, la elución se realiza a una temperatura de desde
aproximadamente 6ºC hasta aproximadamente 22ºC. Por ejemplo, la
elución de la fracción del
PAO-\alpha-IFN se detecta por
absorbancia de UV a 280 nm. La recogida de las fracciones puede
conseguirse por medio de simples perfiles de tiempo de elución.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona procedimientos de tratamiento para diversas afecciones
en mamíferos. Los procedimientos incluyen administrar una cantidad
eficaz de conjugados de interferón-polímero, que se
han preparado como se describe en este documento, a un mamífero que
necesita tal tratamiento. Los conjugados son útiles para, entre
otras cosas, tratar las enfermedades o las afecciones susceptibles
al interferón que responderían positiva o favorablemente, según se
conoce a estos términos en las técnicas médicas, a la terapia basada
en el interferón. Por consiguiente, sin limitación, los conjugados
de interferón pueden usarse para tratar las afecciones que se
beneficiarían de la inhibición de la replicación de virus sensibles
al interferón. Además, los conjugados pueden usarse para modificar
diversas respuestas inmunes incluidas la inhibición de la respuesta
de anticuerpos al desafío antigénico, la inhibición de las
reacciones de hipersensibilidad, de regulación de la potenciación de
la actividad de las células NK de la actividad citotóxica de las
células de T, la modulación de la producción de prostaglandinas y la
potenciación de la fagocitosis por los macrófagos.
Las otras afecciones en las que pueden usarse
los conjugados de interferón-polímero incluyen la
leucemia de células vellosas, las verrugas venéreas o genitales
(condylomata acuminata), el sarcoma de Kaposi Relacionado al SIDA,
la hepatitis y afecciones virales análogas a la hepatitis incluidas
la hepatitis B y la hepatitis crónica no A, no B/C, y diversos
tumores sólidos. El experto comprenderá que el tratamiento
proporcionado por los conjugados de la invención puede ser, por
ejemplo, paliativo, por ejemplo, al proporcionar cierto control o
alivio de los efectos de una afección, así como también
completamente o parcialmente curativo de cualquier enfermedad o
afección tratada de esa manera.
Además, también se contempla que está dentro del
alcance de la invención cualquier afección para que la
administración del interferón sirve para el diagnóstico.
La cantidad del conjugado de
interferón-polímero administrada para tratar las
afecciones descritas anteriormente está basada en la actividad del
interferón del conjugado polimérico. Es una cantidad que resulta
suficiente para producir significativamente una respuesta clínica
positiva. La dosis máxima para los mamíferos incluidos los seres
humanos es la dosis más alta que no provoca efectos laterales
clínicamente importantes. Con objeto de la presente invención, tales
efectos clínicamente importantes son los que requerirían el cese de
la terapia por síntomas análogos a la gripe grave, la depresión del
sistema nervioso central, trastornos gastrointestinales graves,
alopecia, prurito grave o erupción. Las anormalidades sustanciales
en los leucocitos y/o glóbulos rojos y/o enzimas hepáticas o
afecciones análogas a la anemia pueden también ser limitantes de la
dosis.
Naturalmente, las dosificaciones de las
composiciones basadas en interferón variarán algo según el resto de
interferón y del polímero seleccionados. Generalmente, sin embargo,
el conjugado se administra en cantidades que varían desde
aproximadamente 100.000 hasta aproximadamente varios millones de
UI/m^{2} de interferón por día, en base a la afección del
mamífero. El intervalo establecido anteriormente es ilustrativo y
los expertos en la técnica determinarán la dosificación óptima del
conjugado seleccionado en base a la experiencia clínica y la
indicación del tratamiento.
Los conjugados de IFN-polímero y
las composiciones que contienen los conjugados de mono- y
bis-interferón polímero de la presente invención
pueden incluirse en una o más composiciones farmacéuticas adecuadas
para la administración a los mamíferos. Las composiciones
farmacéuticas pueden estar en la forma de una solución, suspensión,
un comprimido, cápsula o similares, incluidos, por ejemplo,
productos liofilizados de fácil reconstitución, preparados según los
procedimientos bien conocidos en la técnica. También se contempla
que la administración de tales composiciones será principalmente por
la vía parenteral aunque también puede usarse la vía oral o por
inhalación según las necesidades del experto.
Los siguientes ejemplos sirven para proporcionar
otra apreciación de la invención pero pretenden de ninguna manera
restringir el alcance eficaz de la invención.
En este ejemplo, se usó el polietilenglicol
activado con carbonato de succinimidilo, con peso molecular 12.000,
para modificar el alfa interferón. El PEG activado con carbonato de
succinimidilo se preparó según el procedimiento de la Patente de
EEUU Nº 5.122.614 mencionada anteriormente. El interferón era
\alpha-IFN-2b recombinante,
(r\alpha-IFN), un producto de
Schering-Plough Corporation, Madison, Nueva
Jersey.
Se ajustó el pH del alfa interferón (0,28
\mumoles, 5 mg) hasta 6,5 con tampón de fosfato 100 mM. El PEG
activado se disolvió en Agua Para Inyección (pH aproximadamente 6,0)
y a continuación se añadió al alfa interferón en una proporción de
aproximadamente medio mol del polímero activado por mol de
interferón. Se incubó la reacción a temperatura ambiente (21ºC)
durante aproximadamente 2 horas mezclando suavemente de forma
continua. Tras 2 horas, se detuvo la reacción con un exceso molar de
diez veces de glicina. Los productos de la reacción se analizaron
por medio de SEC-HPLC (BioRad,
Bio-Sil columna SEC-125) a un caudal
de 1,0 ml/minuto usando un tampón de fosfato 0,1 molar, pH 7,0 con
detección a 280 nm. Los resultados del análisis de HPLC se presentan
en la Figura 1 que muestra dos picos en 7,29 y 8,13, que indican que
los conjugados eran en gran parte las especies 1-PEG
y 2-PEG. También se detectó una cantidad de menor
importancia de una especie de peso molecular más alto.
En este ejemplo, se trató la combinación de
conjugado de PEG_{12.000}-IFN, que contiene los
conjugados 1-PEG y 2-PEG resultantes
del Ejemplo 1, con ácido trifluoroacético al 0,1% para reducir el pH
de los conjugados hasta aproximadamente 1,6 durante aproximadamente
3 horas a 37ºC. La reacción se detuvo por la adición del tampón de
fosfato de sodio (100 mM), pH 6,5, y el pH final de la solución fue
de entre pH 6,0 y 6,2. Los conjugados tratados con ácido se
analizaron por medio de HPLC (tampón de fosfato del sodio 100 mM, pH
7,0). Los resultados se presentan en la Figura 2 que ilustra un pico
mucho más agudo en 7,95 y una meseta más pequeña así como algo de
IFN nativo. Esto también indica que los conjugados tratados con
ácido fueron en gran parte el
1-PEG_{12.000}-IFN. Se recogió
esta fracción, se concentró por medio de un concentrador Centricon,
se purificó por HPLC usando una columna de exclusión por tamaño y se
analizó usando el ensayo de CPE para la actividad. Los resultados se
compararon con los valores obtenidos al analizar los conjugados del
Ejemplo 1 que no sufrieron la etapa del tratamiento ácido. El
control representa el interferón sin modificar. Los resultados
comparativos se presentan en la siguiente tabla:
De lo anterior, puede verse que los conjugados
tratados con ácido tenían una mejora significativa en la actividad
conservada y que esta etapa del tratamiento no desnaturalizó el
interferón.
Claims (26)
1. Un procedimiento para preparar conjugados de
\alpha-interferón-polímero, que
comprende:
- a)
- formar un conjugado de un \alpha-interferón estable frente al ácido con un polímero activado, sustancialmente no antigénico, en solución;
- b)
- acidificar la solución que contiene el conjugado de (a) hasta un nivel de pH inferior a aproximadamente 3, que es eficaz para escindir selectivamente cualquier enlace que reduzca la bioactividad del interferón conjugado; y a continuación
- c)
- ajustar la solución acidificada de (b) hasta un pH fisiológicamente aceptable, en el que la proporción molar de dicho polímero sustancialmente no antigénico con respecto a dicho \alpha-interferón varía desde aproximadamente 8:1 hasta aproximadamente 1:8.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el polímero no antigénico está activado con un resto formador
de enlaces carbamatos.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en
el que dicho resto formador de enlaces carbamatos se selecciona del
grupo constituido por
oxicarbonil-oxi-N-dicarboximida,
carbonatos de para nitroarilo, carbonil diimidizol, carbonatos de
benzotriazol y carbonatos de piridilo.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en
el que dicha
oxicarbonil-oxi-N-dicarboximida
es un carbonato de succinimidilo.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho polímero sustancialmente no antigénico está activado
con un carbonato de succinimidilo.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la proporción molar de dicho polímero sustancialmente no
antigénico con respecto a dicho \alpha-interferón
varía desde 4:1 hasta 1:4.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la proporción molar de dicho polímero sustancialmente no
antigénico con respecto a dicho \alpha-interferón
varía desde 2:1 hasta 1:2.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho polímero sustancialmente no antigénico comprende un
óxido de polialquileno.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que dicho óxido de polialquileno comprende un
polietilenglicol.
10. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la solución se acidifica con un ácido seleccionado del grupo
constituido por ácidos haloacéticos, acético, clorhídrico, sulfúrico
y fosfórico.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en
el que el ácido haloacético es ácido trifluoroacético.
12. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el nivel de pH de la etapa (b) es inferior a aproximadamente
2.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que el nivel de pH es inferior a aproximadamente 1,6.
14. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que el pH es aproximadamente 1,6.
15. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el nivel de pH de la etapa (b) varía desde aproximadamente 1
hasta aproximadamente 3.
16. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la porción de polímero sustancialmente no antigénico de
dichos conjugados tiene un peso molecular de desde 600 hasta
aproximadamente 60.000.
17. El procedimiento de la reivindicación 16, en
el que la porción de polímero sustancialmente no antigénico de
dichos conjugados tiene un peso molecular de desde 1.000 hasta
aproximadamente 40.000.
18. El procedimiento de la reivindicación 16, en
el que la porción de polímero sustancialmente no antigénico de
dichos conjugados tiene un peso molecular de desde 2.000 hasta
aproximadamente 20.000.
19. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho pH fisiológicamente aceptable varía desde
aproximadamente 6,5 hasta aproximadamente 7,5.
20. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho \alpha-interferón es
\alpha-interferón 2b.
21. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho \alpha-interferón es un interferón
humano.
22. El procedimiento de la reivindicación 21, en
el que dicho interferón es el interferón humano de consenso.
23. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho polímero sustancialmente no antigénico se selecciona
del grupo constituido por dextrano, polivinilpirrolidonas,
poliacrilamidas, alcoholes polivinílicos, polímeros basados en
hidratos de carbono.
24. El procedimiento de la reivindicación 1 que
además comprende sustancialmente el aislamiento y la purificación
del producto de la etapa (c).
25. Los conjugados de
\alpha-interferón-polímero
obtenibles por medio del procedimiento de la reivindicación 1.
26. Una composición farmacéutica que comprende
un conjugado de
\alpha-interferón-polímero según
se definió en la reivindicación 25 y un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
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