ES2300325T3 - Ensayo diagnostico que implica la citoquina 1 inhibitoria de macrofagos (mc1). - Google Patents
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Abstract
Un método para el diagnóstico de riesgo de aborto y/o de parto prematuro, comprendiendo dicho método: (i) la determinación de la cantidad de MC-1 presente en una muestra corporal tomada a un sujeto de prueba embarazado(a) que tiene un tiempo conocido de gestación, y (ii) la comparación de dicha cantidad determinada contra la cantidad, o intervalo de cantidades, presentes en muestra(s) corporales equivalentes tomadas a sujeto(s) de prueba embarazados(as) normales con un tiempo de gestación que es equivalente a dicho tiempo conocido de gestación de dicho sujeto de prueba.
Description
Ensayo diagnóstico que implica la citoquina 1
inhibitoria de macrófagos (MC-1).
Esta invención se refiere al campo del
diagnóstico medico. En particular la presente invención brinda
métodos para diagnosticar el riesgo de aborto y/o de parto
prematuro y de anormalidades fetales.
La superfamilia del factor \beta transformador
de crecimiento (TGF\beta) está compuesta por un número creciente
de moléculas que regulan una variedad de procesos celulares tales
como el crecimiento, la diferenciación y la oncogénesis. Los
miembros de la superfamilia TGF-\beta han sido
clasificados en grandes agrupaciones familiares que incluyen la
TGF-\beta, la proteína morfogénica ósea (BMP), el
factor de crecimiento y diferenciación (GDF), la inhibina/activina,
la sustancia inhibitoria muleriana (MIS), el factor glial
neurotrópico derivado (GDNF) y más recientemente, la citoquina 1
inhibitoria macrófaga (Bootcoy et. al., 1997). La presencia
de la superfamilia TGF\beta en la gestación humana se indica
mediante la detección de los TGF\beta1, TGF\beta2,
TGF\beta3, la activina e inhibina en el fluido amniótico y la
localización del TGF\beta1, la activina e inhibina en los vellos
placentarios (Graham et al., 1992 Petraglia et al.,
1993a; Petraglia et al., 1992; Minami et al., 1992;
Lang and Searle, 1994; Qu and Thomas, 1992; Altman et al.,
1990; Canniggia et al., 1999; Wallace et al.,
1997).
La superfamilia del TGF\beta ha sido
estudiada intensivamente debido a su importancia biológica ya su
potencial terapéutico. Su biología y funciones son bien conocidas y
se han reseñado extensivamente (e. g. Miyazono et al., 1993;
Wahl, 1992; y Roberts et al., 1993). Ellos son potentes
factores quimiotácticos para los macrófagos y fibroblastos y
generalmente inhiben la proliferación celular, quizás debido a su
papel en la diferenciación. En el contexto de la inflamación, el
TGF\beta es un potente estimulador de la síntesis de proteínas de
fibroblastos, colágeno y matriz, promueve la angiogénesis, modula
la expresión de moléculas de adhesión e inhibe la proliferación de
linfocitos, la producción de algunas linfoquinas y la función
celular NK. Las proteínas del TGF\beta también se han implicado
grandemente en la patogénesis de procesos y mecanismos
inflamatorios crónicos.
La superfamilia del TGF\beta también se
piensa que realiza múltiples roles durante el embarazo. La
capacidad de las isoformas TGF\beta para modular la adhesión
célula-célula, la migración celular y la
remodelación del tejido ha llevado a algunos autores a sugerir que
estas moléculas pudieran controlar la invasión e implantación de
trofoblastos a comienzos del embarazo Otros papeles posibles
incluyen la regulación del crecimiento fetal y la supresión del
sistema inmunológico materno. Las células placentarias son fuente
principal de las moléculas de la superfamilia TGF\beta y son
reguladas por al menos los TGF\beta1, TGF\beta3, la activina e
inhibina. Por ejemplo, la activina suprime la producción de
inhibina y realza la progesterona, la gonadotropina coriónica
humana (hCG) y la hormona liberadora de gonadotropina (GnRE) por
parte de células placentarias (Petraglia et al., 1989). La
inhibina suprime la hCG placentaria, la GnRH y la liberación de
progesterona inducida por activina (Petraglia et al., 1989),
mientras que el TGF\beta1 suprime la producción del lactógeno
placentario humano derivado de placenta (hPL). Se ha demostrado que
la activina y el TGF\beta3 también tienen efectos opuestos en
la regulación de la invasión extravellosa de trofoblastos a
comienzos del embarazo (Caniggia et al., 1997; Caniggia et
al., 1999). Estos resultados sugieren que los TGF\beta1,
TGF\beta3, la activina e inhibina regulan el crecimiento y
diferenciación de la placenta en una manera autocrina. El
TGF\beta1, la activina e inhibina están presentes también en el
propio embrión donde han demostrado que regulan el crecimiento y
diferenciación. En particular, los miembros de la superfamilia del
TGF\beta son bien conocidos por su capacidad para promover
inducción del mesodermo.
También se ha sugerido que las proteínas de la
superfamilia del TGF\beta promueven la supervivencia fetal. La
evidencia experimental sugiere que la concentración de fluido
amniótico de las citoquinas pro inflamatorias interleuquina1 (IL1),
IL6 y el factor de necrosis tumoral-\alpha
(TNF\alpha) surgen durante el trabajo de parto. Es más, la
producción de citoquina pro inflamatoria que acompaña a la infección
intrauterina se ha asociado con el rechazo fetal o la labor
pretérmino de parto. (Romero et al., 1992; Hillier et
al., 1993), Opsion et al., 1993). El TGF\beta1 y la
inhibina han mostrado que suprimen la producción de citoquinas pro
inflamatorias de macrófagos y linfocitos respectivamente (Bogdan y
Nathan, 1993; Petraglia et al., 1991), mientras que la
activina tiene efectos pro inflamatorios sobre macrófagos y el
amnios (Nusing y Barsig, 1997; Petraglia et al., 1993b),
Esto ha llevado a sugerir que el TGF\beta1 y la inhibina promueven
la supervivencia fetal suprimiendo la producción de citoquinas pro
inflamatorias por parte del sistema inmunológico materno.
La WO A 990 445 sugiere el uso de la GDF15, que
también es conocida como MC-1, para prevenir la
labor prematura de parto entre otras cosas. Solo se presenta el
múrido de la GDF15 y no se muestra la actividad real o expresión de
tejido de la GDF15.
Los solicitantes de la presente invención han
clonado recientemente y caracterizado un miembro divergente de la
superfamilia del TGF\beta, la citoquina1 (MC-1)
inhibitoria de macrófagos (Bootcoy et al., 1997), cuya
expresión se asocia con la activación de macrófagos. Para poder
determinar la naturaleza de cual es el rol que pudiera jugar las
MC-1 en el embarazo, los solicitantes de la presente
invención han desarrollado un ensayo sensible sándwich
inmunoabsorbente vinculado a enzimas (ELISA) para la cuantificación
de la MIG1 y utilizado esto para investigar la relación temporal
entre las concentraciones de MC-1 en el suero
materno humano y el tiempo de gestación, y aún más, han medido su
concentración en fluido amniótico y extractos placentarios.
Adicionalmente, los solicitantes de la presente invención, han
llevado a cabo experimentos para delinear los orígenes de
MC-1 evaluando la capacidad de la línea celular
trofoblástica placentaria (BeWo) para sintetizar la citoquina. Los
resultados presentados a continuación muestran que la
MC-1 es capaz de promover la supervivencia fetal
suprimiendo la producción de citoquinas pro inflamatorias derivadas
maternalmente dentro del útero. Consecuentemente, los ensayos
diagnósticos cuantitativos de MC-1 en muestras de
suero materno, fluido amniótico y extractos placentarios ofrece la
posibilidad de detección de mujeres embarazadas con niveles
anormales de MC-1 y que están por tanto en riesgo
de aborto y/o de parto prematuro.
Adicionalmente, los solicitantes de la presente
invención han encontrado que existe un número de variantes alélicas
de MC-1, todas las cuales muestran diferencias
menores en la secuencia de aminoácidos en las posiciones 9, 48 y
202 (véase la publicación de la patente internacional No. WO 97/00
958, cuyo contenido en su totalidad se incorpora aquí como
referencia, en el que se refiere a la MICC1 como CL13). La más
significativa de estas posiciones es la posición del aminoácido 202
ya que esta corresponde a la posición 6 de la forma madura de
MC-1 (i.e. con la secuencia líder eliminada a través
de escisión). En algunas de las variantes identificadas, el
residuo normal de histidina (H) en la posición 202 (o "H6") se
sustituye con ácido aspártico (D). Esto se debe a una sustitución
de un nucleótido sencillo dentro del gen de la MC-1
de manera tal que una citosina (C) en la posición 604 se sustituye
por una guanosina (G). Los solicitantes de la presente invención
han reconocido ahora que los sujetos que son heterocigóticos u
homocigóticos respecto a la variante alélica
Asp^{202}MC-1(o "D6") pueden tener
una predisposición alterada y dar curso a la enfermedad en relación
con enfermedad(es) inflamatorias y/o cáncer(es).
En una realización preferida de la presente
invención, la detección de cantidades deprimidas de
MC-1 en una muestra corporal, preferiblemente una
muestra de suero sanguíneo, fluido amniótico o extractos
placentarios, de un sujeto embarazado(a) de prueba sería
indicativa de una condición en la que habría un riesgo incrementado
de aborto y/o de parto prematuro.
Por tanto, en un primer aspecto, la presente
invención brinda un método para el diagnóstico del riesgo de aborto
y/o parto prematuro, comprendiendo dicho método;
(i) la determinación de la cantidad de
MC-1 presente en una muestra corporal tomada a un
sujeto embarazado(a) de prueba que tiene un tiempo de
gestación conocido, y
(ii) la comparación de dicha cantidad
determinada contra la cantidad, o intervalo o cantidades, presentes
en muestras corporales equivalentes tomadas a sujetos
embarazados(as) normales de un tiempo de gestación que es
sustancialmente equivalente a dicho tiempo de gestación de dicho
sujeto de prueba.
Como se mencionó anteriormente, las muestras
corporales preferidas a utilizar en el método del primer aspecto
son muestras de suero sanguíneo, fluido amniótico o extractos
placentarios. Sin embargo, las muestras de plasma de sangre
virgen, orina y fluido cerebroespinal también pueden ser
apropiadas.
La cantidad, o intervalo de cantidades,
presentes en las muestras corporales de embarazadas normales
aumenta con el avance del tiempo de gestación. Es por tanto
importante que la cantidad determinada de MC-1 de la
muestra del sujeto de prueba se compare con la cantidad(es)
de MC-1 presentes en la muestra(s)
equivalente de sujeto embarazado(a)(s) normal(es) de
un tiempo de gestación sustancialmente equivalente. Por tanto, en
el caso que las muestras corporales utilizadas sean muestras de
sueros, una cantidad determinada menor de o igual a 4 ng/ml de un
sujeto de prueba del primer trimestre, menor de o igual a 8 ng/ml de
un sujeto de prueba del segundo trimestre, y menor de o igual a 12
ng/ml de un sujeto de prueba del tercer trimestre, sería indicativa
de niveles deprimidos de MC-1 y un incremento
consecuente del riesgo de aborto y/o de parto prematuro. En el caso
que las muestras corporales sean muestras de fluido amniótico, una
cantidad determinada menor de o igual a 10 ng/ml de un sujeto de
prueba del segundo trimestre seria indicativa de niveles deprimidos
de MC-1 y por tanto un riesgo incrementado de aborto
y/o de parto prematuro. Finalmente, en el caso que las muestras
utilizadas sean extractos placentarios, una cantidad determinada
menor de o igual a 18 ng/ml, de mayor preferencia menor de o igual
a 10 ng/ml, en una muestra de extracto placentario de un sujeto de
prueba del tercer trimestre sería indicativa de niveles deprimidos
de MC-1 y por tanto un riesgo consecuente de aborto
y/o de parto prematuro.
El riesgo incrementado de aborto y/o parto
prematuro puede ser el resultado de un embarazo anormal y/o
desarrollo placentario asociado con niveles deprimidos de
MC-1. Esto es, en los casos que se determine un
desarrollo placentario anormal a través de la detección de niveles
deprimidos de MC-1, esto puede ser indicativo de
inducción temprana de labor de parto debido a que el feto puede
estar en riesgo si la placenta falla en su desarrollo hacia un
crecimiento normal.
La evaluación exitosa del riesgo de aborto y/o
de parto prematuro en mujeres embarazadas permite la posibilidad de
aplicación de terapias preventivas y de otras medidas (e. g.,
reposo, dieta mejorada, etc.)
En otra realización preferida de la presente
invención, la detección de cantidades deprimidas o elevadas de
MC-1 en una muestra corporal proveniente de un
sujeto embarazado(a) de prueba puede ser indicativa de una
condición en la que pudiera existir un riesgo incrementado de
anormalidades fetales.
Por tanto, en un segundo aspecto, la presente
invención brinda un método para el diagnóstico de anormalidades
fetales, comprendiendo dicho método;
(i) la determinación de la cantidad de
MC-1 presente en una muestra corporal tomada a un
sujeto embarazado(a) de prueba que tiene un tiempo de
gestación conocido, y
(ii) la comparación de dicha cantidad
determinada contra la cantidad, o intervalo de cantidades, presente
en la muestra(s) corporal equivalente de sujetos
embarazado(a)(s) normales con un tiempo de gestación que es
sustancialmente equivalente a dicho tiempo de gestación de dicho
sujeto de prueba.
La cantidad de MC-1 presente en
una muestra corporal puede determinarse rápidamente mediante, por
ejemplo, inmunoensayos o inmunohistoquímica (e. g. con secciones de
biopsias de tejido) utilizando anticuerpos (monoclonales o
policlonales) o fragmentos de estos contra la MC-1.
Los anticuerpos anti MC-1 y los fragmentos de estos
pueden producirse a partir de cualquiera de los métodos conocidos
por la técnica.
Las muestras corporales preferidas para uso en
el método del primer aspecto son muestras de sangre virgen, suero,
plasma y orina. Las biopsias de tejido también pueden ser
apropiadas.
Las secuencias de ADN y de aminoácidos de la
MC-1 humana (i.e. "tipo natural") y la
variante, Asp^{202}MC-1 se muestran en la figura
1.
Los términos "comprende", "comprenden"
y "comprendiendo" tal como se utilizan a lo largo de la
especificación se entiende que se refieren a la inclusión de un
paso, componente o característica o grupo de pasos, componentes o
características establecidas con o sin la inclusión de un paso,
componente o característica o grupo de pasos, componentes o
características adicionales.
La presente invención se describirá a
continuación haciendo referencia a los siguientes ejemplos no
limitantes y a las figuras acompañantes.
La Figura 1 presenta las secuencias de
aminoácidos (A) y las secuencias de ADN (B) de la
MC-1 humana y de la variante,
Asp^{202}MC-1.
La Figura 2 presenta un gráfico que muestra la
sensibilidad de antisueros anti MC-1 de oveja y
ratón. Las placas se recubrieron con 1,8 ng de
rhMC-1, 2 ng de rhTGF\beta1, o búfer de
recubrimiento solamente. El material flotante contentivo de un
anticuerpo monoclonal (MAb) de ratón anti MIC, el medio de cultivo
condicionado por la línea celular SP2/0 del mieloma de ratón, el
medio de cultivo no condicionado (DMEM+Nutridoma) y el diluente de
anticuerpo (Ab dil) fueron evaluados no diluidos mientras que el
suero normal enriquecido de oveja IgG y el anticuerpo policlonal de
oveja 233-P se diluyeron en 1:500 000 en Ab dil. El
IgG1 de ratón se evaluó a 20 ng/ml.
La Figura 3 presenta una curva estándar del
recombinante MC-1 humano generado mediante el ELISA
sándwich utilizando el MAb anti MC-1 para la
captura y el anticuerpo monoclonal de oveja 233B3P para la
detección.
La Figura 4 presenta los resultados de la
experimentación mostrando que la MC-1 está presente
en el suero materno y en el fluido amniótico durante el embarazo en
mujeres.
(A) Estimación de concentraciones de
MC-1 en suero humano normal combinado. (NHS)), suero
materno combinado por etapas y fluido amniótico combinado (AF) tal
como determinara el ELISA sándwich.
(B) Inmunoprecipitación y análisis
western de contraste de MIG1 en suero humano normal combinado
(carril 1), suero materno combinado por etapas (carril
2-4) y fluido amniótico combinado (carril 5).
La Figura 5 presenta concentraciones del suero
materno de MC-1 en cuatro mujeres embarazadas de 30
semanas de gestación hasta el nacimiento tal como determinara el
ELISA sándwich.
La Figura 6 presenta los resultados de
mediciones de concentraciones de MC-1 en cinco
extractos placentarios humanos diferentes tal como los evaluara el
ELISA sándwich.
La Figura 7 presenta los resultados de la
experimentación conducidos para evaluar la expresión y secreción de
MC-1 por parte de la línea celular trofoblástica
humana BeWO.
(A) la secreción de MC-1 por
parte de células BeWo después de 1 y 5 días en cultivo tal como
determinara el ELISA sándwich:
(B) La inmunoprecipitación y el análisis
western de contraste de MC-1 excretado por
células BeWo. Carril 1, medio de cultivo no condicionado; Carril
2, medio de cultivo que había sido condicionado mediante células
BeWo durante 5 días.
(C) Análisis de reacción en cadena inversa
trascriptasa-polimerasa (RT-PCR) de
la expresión de la MC-1 mediante células BeWo no
estimuladas. Carril 1, RT-PCR sobre ARN total de
células BeWo cultivadas durante 24 horas; Carril 2, control
negativo (no ARN total); Carril 3, control PCR positivo.
La Figura 8 presenta una curva estándar típica
de ELISA sándwich para MC-1 (rhMC-1.
1 000-7,8 pg/ml, i.e. 8 diluciones de doblaje).
Las muestras de suero se obtuvieron a partir de
22 mujeres embarazadas saludables con un embarazo normal sencillo
(un solo feto). Ninguna embarazada estudiada tomó medicación alguna.
En cada caso, el tiempo de gestación se determinó mediante un
ultrasonido a principios del embarazo. Todas las mujeres
subsiguientemente tuvieron un parto vaginal normal a término
(37-41 semanas) dando a luz bebés saludables de
talla normal. Se recogieron muestras de suero de seis mujeres
entre las 10-14 semanas de embarazo, y a 8 mujeres
entre las 26-30 semanas y 37-40
semanas de embarazo. Los períodos de tiempo indicados corresponden
al final de cada trimestre. Las muestras correspondientes a cada
trimestre se amalgamaron antes de la medición de los niveles de
MC-1. También se tomaron muestras seriadas de
suero, aproximadamente semanalmente, de 4 mujeres desde 30 semanas
de gestación hasta el parto. De nuevo, todas las cuatro mujeres
eran sanas con embarazo sencillo y tuvieron un parto vaginal normal
a término de un bebé saludable normal. Adicionalmente, se obtuvo
líquido amniótico de 10 mujeres sometidas a amniocentesis de
15-17 semanas de gestación para cariotipificación.
En todos los casos, la indicación de cariotipificación se
prescribió para edades maternas avanzadas (> 37 años). El fluido
amniótico también se combinó antes de la medición de los niveles de
MC-1.
Entre 100-150 mg de tejido
placentario (lavado de 4-5 veces en solución salina
y congelado en nitrógeno líquido y almacenado a -80ºC) se
homogeneizaron en 1 m. de solución salina amortiguada por fosfato
(PBS). Los homogenizados se centrifugaron a 10 000 rpm durante 30
segundos y el material flotante se transfirió a los tubos. Se hizo
la medición de la proteína total mediante ensayo BCA de proteína
total (Pierce) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se
utilizaron como soluciones estándar las soluciones de BSA en un
intervalo entre 0-1 000 \mug/ml.
La línea celular troflobástica humana de
coriocarcinoma (BeWo) se compró a ATCC (Rockville, MD). Las células
se sembraron en noventa y seis placas de pozo de cultivo celular a
5 000 células por pozo en 250 \mul del medio: Modification of
Eagle's Medium de Dubelco (DMEM) (Gibco BRL) contentivo de 4,5 g/l
de glucosa D, 110 mg/l de piruvato de sodio, 0,584 g/l glutamina L,
4 mg/l de hidrocloruro de piridoxina y 1X Nutridoma SR (Boehringer
Mannheim, Alemania) y cultivado a 37ºC en la presencia de 5% de
dióxido de carbono durante 1 a 5 días. En este tiempo, las placas
de cultivo se revolvieron a 1 000 r.p.m durante 10 minutos y se
retiró el material flotante almacenándose a -20ºC hasta la
cuantificación de la MC-1.
El ARN total se aisló de las monocapas de
células BeWo en noventa y seis placas de pozo utilizando el
reactante Tri Pure (Roche) y el método aportado por el fabricante.
La trascripción inversa (RT) se llevó a cabo en un volumen total de
reacción de 20 \mul utilizando 1 \mug de ARN, un cebador poli
(T)15 y 50 unidades de Trascriptasa de Expansión Inversa
(Roche) utilizando las condiciones recomendadas por el fabricante.
Una alícuota de 5 \mul de la reacción RT se amplificó en una
reacción PCR utilizando polimerasa Pfu (Promega) y los
cebadores:
- MSB-1 (5'-AGGACCTGCTAACCAGGCTGCGGGCCAACCAGAGC-3')
- (SEC ID NO: 5) y
- MSB-5 (5'-GGCTAACAAGTCATCATAGGTCTGGAGCGACAC-3')
- (SEC ID NO: 6),
que flanquean al intrón único de
MC-1. Las condiciones de la PCR fueron como sigue:
un paso de desnaturalización inicial a 95ºC durante 1 minuto,
seguida de 35 ciclos a 95ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30
segundos, 72ºC durante 2 minutos. Se utilizó como un control
negativo una reacción RT en la cual se omitió el ARN, mientras se
incluía como un control positivo un plásmido portador de la
secuencia de codificación pre-pro MIC/FLAG
(señalizador) de la MC-1 (Bootcov et al.,
1997). Los productos de la PCR fueron separados en 0,08 (p/v) de
geles de
agarosa.
agarosa.
Se generó un anticuerpo policlonal de oveja
(PAb) 233B3 anti MC-1 mediante inmunización con la
MC-1 (rhMC-1) recombinante humana
que fue sintetizada con el método descrito en la publicación de la
patente internacional No. WO 97/00 958 en Complete Freunds
Adjuvant. Se administraron dosis adicionales durante un período
de seis meses y se sangraron las ovejas 10 días después de la
inyección final. Se preparó una fracción enriquecida de IgG de
suero normal de oveja y de 233B3 mediante precipitación de ácido
caprílico seguido de precipitación de sulfato de amonio. La
fracción 233B3 enriquecida con IgG se designó como
233-P.
Se generó un hibridoma de ratón excretor de
anticuerpo monoclonal (MAb) anti MC-1 a partir de
ratones inmunizados con rhMC-1. Los hibridomas se
cultivaron en DMEM (Gibco BRL) contentivo de 4,5 g/l de glucosa D,
110 mg/l de piruvirato de sodio, 0,584 g/l de glutamina L, 4 mg/l
de hidrocloruro de piridoxina suplementado con 20% de FCS (CSL,
Melbourne). Para la recolección de MAb, los hibridomas se
transfirieron a glucosa DMEM hi suplementada con Nutridoma SR
(Boehringer Mannheim) durante 7 días. El material flotante del
cultivo se revolvió a 2 000 r.p.m durante 10 minutos para eliminar
los residuos celulares y se congeló hasta su uso. La sensibilidad de
los preparados de PAb y MAb se examinó mediante ELISA directo.
Noventa y seis placas de pozo Maxisorp ELISA
(Nunc) se recubrieron (100 \mul/pozo) con 18 ng/ml
rhMC-1 o 20 ng/ml de rhTGF\beta1 (R&D
Systems) en búfer de revestimiento (0,1 M de carbonato en H_{2}O
destilada, pH 9,4-9,8) a 40ºC durante 24 horas.
Las placas entonces se lavaron tres veces con 300 \mul de búfer de
lavado (PBs contentivo de 0,05% v/v). Se bloqueó el Tween 20
(Sigma) y la ligazón no específica con 250 \mul de 1% (p/v) BSA
(Boehringer Mannheim) en PBS durante dos horas a 37ºC. El medio del
hibridoma libre de suero contentivo de MAb anti
MC-1, el PAb 233B3P de oveja diluido en 1:500 000 en
diluente de anticuerpo (PBS contentivo de 1% p/v) BSA y 0,05% v/v
de Tween 20, el medio de cultivo condicionado por la línea celular
de mieloma de ratón SP 2/0, DMEM+Nutridoma, el suero de oveja
normal enriquecido con inmunoglobulina G diluido en 1:500 000 en
diluente de anticuerpo, 200 ng/ml de IgG1 de ratón (R&D Systems)
en DMEM+Nutridoma, o diluente de anticuerpo solo, se añadieron
entonces a las placas (100 \mul/pozo) e incubaron durante una hora
a 37ºC. Las placas se lavaron tres veces seguido de la adición de
100 \mul/pozo de IgG (Jackson Inmunoresearch) anti oveja
biotinilado de asno o de IgG (Jackson Inmunoresearch) anti ratón
biotinilado de cabra diluido 1:10 000 en diluente de anticuerpo en
incubado durante 1 hora a 37ºC. Las placas se lavaron tres veces
añadiendo 100 \mul/pozo de estreptavidina (Genzyme) de rábano
conjugada con peroxidasa diluida en 1:2 000 en diluente de
anticuerpo a las placas e incubada durante 30 minutos a 37ºC. Las
placas se lavaron cuatro veces seguido de la adición de 100
\mul/pozo de sustrato de peroxidasa (1 mg/ml de dicloruro de
o-fenilendiamina (Sigma) en 0,05 de búfer de
citrato fosfato contentivo de 0,014% H_{2}O_{2}, pH 5,0
(Sigma)). Se permitió que procediera el desarrollo del color
durante 5-15 minutos y se concluyó con la adición de
100 \mul/pozo de 4N H_{2}SO_{4}. La absorbancia se midió a
490 nm en un lector de microplacas (Pasteur Diagnostics).
Se estableció un ELISA sándwich MC1 utilizando
el MAb de ratón anti MC-1 para la captura de
antígeno y el PAb 233-P de oveja para la detección.
La concentración óptima de ambos anticuerpos se determinó
empíricamente y luego se utilizó para todos los estudios
subsiguientes. Noventa y seis placas de pozo Maxisorp ELISA se
recubrieron con material flotante MAb anti MC-1
diluido en 1: 5 (la concentración final de inmunoglobulina fue de
aproximadamente 20 ng/ml) en búfer de recubrimiento a 40ºC durante
24 horas. Las placas entonces se lavaron tres veces con 300 \mul
de búfer de lavado y la ligazón no específica fue bloqueada con 250
\mul de 1% (p/v) de BSA en PBS durante 2 horas a 37ºC. Entonces
se añadieron a las placas (100 \mul/pozo), estándares de
rhMC-1, material flotante de cultivo de tejido,
suero materno, extractos placentarios, o fluido amniótico diluido
en diluente de anticuerpo, e incubados durante 1 hora a 37ºC. Las
placas se lavaron tres veces seguido de la adición de 100
\mul/pozo del PAb 233-P de oveja diluido en 1:5
000 en diluente de anticuerpo e incubado durante 1 hora a 37ºC.
Las placas entonces se lavaron tres veces y se añadieron 100
\mul/pozo de IgG anti oveja biotinilado de asno diluido en 1: 5
000 en diluente de anticuerpo e incubaron durante 1 hora a 37ºC.
Las placas entonces se desarrollaron al igual que en el ELISA
directo. La concentración de hMC-1 en las muestras
se determinó por comparación con la curva estándar
rhMC-1. El nivel de rhMIC en esta curva estándar
se determinó sobre la base del contenido total de proteína y por
tanto en términos de cantidad absoluta está sujeto a error
significativo. Sin embargo, como se utilizaron los mismos
estándares a todo lo largo, esto no implica diferencia alguna
respecto a los valores relativos estimados en este ejemplo. Todas
las muestras fueron sometidas a ensayo por triplicado en al menos
dos ocasiones. Los resultados se presentan como la media +/- SD
(DE). La sensibilidad del ensayo sándwich MIG1 se evaluó mediante
prueba con hasta cantidades de 500 pg/ml de TGF\beta1 e
inhibina-A (ambos miembros de la superfamilia del
TGF\beta).
La inmunoprecipitación se llevó a cabo
utilizando 0,2 ml de medio de hibridoma libre de suero contentivo
del MAb anti MC-1 adsorbido a la proteína A
Sefarosa. Las muestras de suero y medio (1 ml) se incubaron con
estos anticuerpos durante la noche a 40ºC entonces se lavaron cinco
veces con PBS contentivo de 1% (v/v) Tritón X 100. Las proteínas
ligadas se diluyeron utilizando búfer no reductor de muestra de
dodecil sulfato de sodio (SDS) y analizaron mediante
electroforesis de gel de poliacrilamida SDS (SDS PAGE) (Laemmli,
1970), seguido de análisis de inmunocontraste con el anticuerpo
policlonal de oveja 233-P. El análisis de
inmunocontraste se desarrolló esencialmente tal como describe
Bootcov et al., (1997) excepto que se utilizó el anticuerpo
policlonal 233-P como anticuerpo primario en una
dilución de 1:7 000 y el anticuerpo secundario fue biotina IgG anti
oveja de asno en una dilución de 1:5 000.
La habilidad del PAb 233-P de
oveja y del MAb de ratón para ligarse a la rhMC-1 se
examinó mediante ELISA directo. Se encontró que tanto el material
flotante no diluido del cultivo de tejido contentivo del MAb y el
PAb 233-P de oveja en una dilución en 1:500 000 en
diluente de anticuerpo se ligó fuertemente a 1,8 ng de
rhMC-1 inmovilizado (Figura 2). Ningún medio de
cultivo condicionado por la línea celulares SP/20 de mieloma de
ratón, medio de cultivo no condicionado, IgG1 de ratón, suero de
oveja normal enriquecido con inmunoglobulina o diluente de
anticuerpo, reaccionaban con el rbMC-1. Se observó
una ligazón mínima de fondo a los pozos no recubiertos para todas
las muestras examinadas. No se detectó reactividad cuando tanto los
MAb anti MC-1 o el anticuerpo policlonal
233-P se incubaban con el rhTGF\beta1
inmovilizado.
Se estableció un sándwich ELISA empleando el MAb
y el PAb 233-P anti MC-1 que podían
cuantificar acertadamente la rhMC-1 en el intervalo
de 10-500 pg/ml (Figura 3). Para examinar el efecto
de los factores presentes en el suero humano y en el medio de
cultivo durante la estimación de esta citoquina, se añadieron 500
pg/ml de rhMC-1 a diluente de anticuerpo contentivo
de ó 10% (v/v) de suero humano normal o 10% (v/v) de DMEM +
Nutridoma y entonces se cuantificaron. Se encontró que el ELISA
sándwich era acertado hasta dentro del 5% del valor correcto. La
variación corrida a corrida fue menor del 5%. En el ELISA sándwich
con el TGF\beta1 y la inhibían, no se observó reacción cruzada
con estas citoquinas estructuralmente relacionadas.
Se diluyeron muestras combinadas entre
1:5-1:20 en diluente de anticuerpo antes de la
cuantificación de la MC-1 mediante ELISA sándwich.
Se determinó que los sueros humanos normales combinados contenían
aproximadamente 0,36 (+/- 0,04) ng/ml de la MC-1
(Figura 4). En el suero materno combinado, la concentración de
MC-1 se encontró que se incrementaba dramáticamente
durante el embarazo. Las muestras materiales de suero
correspondientes al primer trimestre contenían 6,3 (+/- 0,02) ng/ml
de MC-1, que se elevaba a 12,24 (+/- 0,54) ng/ml
durante el segundo trimestre, con un pico a 15,3 (+/- 1,31) ng/ml
durante el tercer trimestre.
La inmunoprecipitación se utilizó para confirmar
la presencia de MC-1 en muestras combinadas de suero
materno durante el embarazo. La MC-1 se visualizó
mediante inmunoprecipitación con el MAb anti MIC seguido de análisis
de inmunocontraste con PAb 233B3-P. Puede
observarse una banda correspondiente al péptido vinculado al
bisulfuro de la MC-1 madura (aproximadamente 25
kDA) en las muestras de suero del segundo y tercer trimestres de
gestación (Figura 4B, carriles 3-4). El nivel más
alto de MC-1 se encontró en la muestra del tercer
trimestre. No se observó una banda similar en el suero normal o en
la muestra correspondiente al primer trimestre debido a la baja
sensibilidad del análisis de inmunocontraste (Figura 4B, carriles
1-2).
Las concentraciones de la MC-1
en suero materno se examinaron también en muestras seriadas
provenientes de cuatro mujeres embarazadas. A las 30 semanas de
gestación, el suero de las cuatro mujeres examinadas contenía
aproximadamente 4 ng/ml de MC-1 (Figura 5). Se
encontró que los niveles de la MC-1 en el suero
materno incrementaban de las 30 semanas de gestación hasta el
parto. Las embarazadas designadas MH y JB exhibían una disminución
ligera en los niveles de MC-1 en el suero materno en
la última semana de embarazo.
En adición al suero materno, el fluido amniótico
recolectado de 10 mujeres durante el segundo trimestre con
propósitos de cariotipificación se conjugó antes de la
cuantificación de los niveles de MC-1 mediante el
ELISA sándwich. Se determinó que la muestra combinada de fluido
amniótico contenía aproximadamente 13,68 (+/-0,16) ng/ml de
MC-1 (Figura 4A). La inmunoprecipitación y el
análisis western de contraste del fluido amniótico combinado
reveló una banda de aproximadamente 25 kDA, que corresponde al
péptido vinculado al bisulfuro de la MIC madura (Figura 4B, carril
5).
Para examinar si la placenta es una fuente
principal de la circulación de MC-1 en el suero de
la mujer embarazada, se examinaron 5 extractos de placenta humana
buscando la presencia de la MC-1 mediante ELISA
sándwich. Se encontró que todas las cinco muestras eran positivas
respecto a la MC-1 (Figura 6), oscilando en
concentración de 5:04-54 ng/ml. Significativamente
la muestra designada PL2, que fue la única derivada de un parto
prematuro, contenía niveles mucho más bajos de MC-1
que las otras muestras.
Al detectar altos niveles de la
MC-1 en los extractos placentarios parece ser que la
línea de células placentaria trofoblástica, BeWo, produce también
esta citoquina. Por tanto se llevó a cabo un examen mediante ELISA
sándwich del medio de cultivo de tejido condicionado por células
BeWo bajo condiciones de reposo en busca de la presencia de
MC-1 segregada. Se determinó que el medio utilizado
para cultivar las células BeWo durante 24 horas contenía
aproximadamente 21,6 (+/- 2,95) ng/ml de MC-1
(Figura 7A). La concentración de MC-1 en el medio
de cultivo después de una incubación de 5 días aumentó a
aproximadamente a 117 (+/- 7,2) ng/ml. La habilidad de las células
BeWo no estimuladas para segregar MC-1 se examinó
también mediante inmunoprecipitación y análisis western de
contraste. Se observaron por parte de las células BeWo en las
condiciones del medio durante cinco días, altos niveles segregados
de MC-1 madura, tal como lo indicaba una banda de
aproximadamente 25 kDa (Figura 7B). Se observaron bandas
adicionales migrando a 55 kDa y 12,5, que pueden representar
hemidímeros y monómeros de MC-1 respectivamente
procesados de forma incompleta. El medio de cultivo que no había
sido expuesto a las células BeWo contenía MC-1 no
detectable cuando se examinaba mediante ELISA sándwich o por
inmunoprecipitación.
Se utilizó la RT-PCR para
investigar la presencia de la trascripción de la
MC-1 en células BeWo no estimuladas. Se extrajo el
ARN total de las células BeWo cultivadas durante 24 horas y
sometidas a la RT-PCR como se describió. Se observó
un único producto de 0,4 kbp, indicando que la trascripción de
MC-1 estaba presente en las células BeWo (Figura
7C). No se detectó producto en la ausencia de BeWo o ADN
plásmido.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados del ejemplo 1 indican que la MIC
está presente en grandes cantidades en los sueros maternos y que
los niveles se elevan sustancialmente con el avance de la
gestación.
Mientras que en el suero materno se producen
niveles elevados de MC-1 durante el embarazo, esto
no significa necesariamente que el feto en desarrollo esté expuesto
a esta citoquina. Sin embargo, la detección de la
MC-1 en el líquido amniótico representa evidencia
directa para la exposición fetal. El nivel de MC-1
en el fluido amniótico fue comparable al que estaba presente en el
suero materno en el segundo y tercer trimestre así como en exceso
del que estaba presente en el suero humano normal. Durante el
embarazo el feto ingiere grandes cantidades de fluido amniótico y
puede absorber también fluido amniótico vía la fina epidermis fetal.
Estos hallazgos por tanto aportan fuerte evidencia respecto a que
el feto en desarrollo está expuesto a altas concentraciones de
MC-1.
Para investigar si el suero materno y la
MC-1 en el fluido amniótico se originan a partir de
una fuente fetal o materna, se midió la MC-1 en
extractos placentarios humanos y esto demostró que estos contenían
grandes cantidades de proteína MC-1.
Interesantemente, la cantidad de MC-1 presente en 4
de los cinco extractos placentarios (>18 ng/ml) era superior a
la encontrada en sueros maternos y fluido amniótico combinados.
Utilizando la inmunohistoquímica y la hibridización in situ
se ha demostrado que el trascrito de la MC-1 y la
proteína está presente en los vellos terminales de la placenta
(Paralkar et al., 1998), una estructura rica en
sincitiotrofoblastos. Se razona por tanto que la línea celular BeWo
trofoblástica humana puede sintetizar y segregar esta citoquina.
Las células BeWo expresan de manera constitutiva el trascrito
MC-1 y segregan grandes cantidades de
MC-1 bajo condiciones de reposo. Estos hallazgos
sugieren que las células trofoblásticas dentro de la placenta son
una fuente principal de la MC-1 presente en el suero
materno y en el fluido amniótico. Sin embargo, la localización del
trascrito de la MC-1 y la proteína a la epidermis en
desarrollo en embriones de rata al día 18 (Paralkar et al,,
1998) sugieren que el embrión puede contribuir también a los niveles
observados de MC-1.
El papel preciso de la MC-1
durante el embarazo es desconocido. Sin embargo, basándose en los
resultados antes descritos y la experimentación reportada en otros
sitios, al parecer la MC-1 tiene un papel
inmunomodulador durante el embarazo. Por ejemplo, se ha reportado
previamente que la rhMIC inhibe la liberación de citoquinas
proinflamatorias de macrófagos activados LPS (Bootcov et al.,
1997). Es más, se conoce que la MC-1 suprime la
formación de linajes celulares de eritrocitos y de
granulocitos/macrófagos a partir de células de médula normales
humanas T no adherentes agotadas (Hromas et al., 1997) Estos
resultados indican que la MC-1 es un amplio
inhibidor de la inflamación, suprimiendo tanto el desarrollo del
linaje monocito/macrófago como su capacidad para producir
mediadores proinflamatorios.
La inflamación intrauterina que acompaña a la
producción de citoquina proinflamatoria se ha asociado con el
rechazo fetal o parto pretérmino. (Romero et al., 1992;
Hillier et al., 1993; Opción et al., 1993). En este
contexto, los solicitantes de la presente consideran que la
MC-1 presente en la placenta y en el fluido
amniótico actúa para mantener el embarazo suprimiendo la producción
de citoquinas proinflamatorias dentro del útero. El hallazgo en el
ejemplo presente respecto a que los extractos placentarios derivados
de una labor de parto prematura contenían concentraciones
deprimidas de MC-1 cuando se comparaban con
embarazos normales aporta un fuerte apoyo a esta consideración.
En el proceso de clonación de la
MC-1 se entendió que había al menos dos alelos de
esta citoquina de la superfamilia del TGF\beta. En
investigaciones subsiguientes de material humano se confirmó que los
dos alelos estaban representados en la comunidad general. Estos
alelos difieren por mutación de un punto arrojando un cambio de
histidina en la posición 6 de la secuencia aminoácida de la
MC-1 (H6) madura normal o "tipo natural", a un
ácido aspártico en la posición 6 (D6). Esto representa una
sustitución no conservadora de un aminoácido aromático, débilmente
ácido a un aminoácido acícilico, fuertemente acídico.
Los hibridomas secretores de anticuerpos
monoclonales (Mab) anti MC-1 se generaron a partir
de ratones inmunizados con MC-1
(rhMC-1) recombinante humana, producida en fermento
(Pichia pastoris) en correspondencia con el método descrito
en la Publicación de la Patente Internacional WO 97/00 958. Los
hibridomas se cultivaron en DMEM (Gibco BRL) contentivos de 4,5 g/l
de glucosa D, 110 mg/l de piruvirato de sodio, 0,584 g/l de
glutamina L, 4 mg/l de hidrocloruro de piridoxina suplementado con
20% FCS (CSL, Melbourne). Para la recolección del MAb, los
hibridomas se transfirieron a glucosa hi DMEM fresca suplementada
con Nutridoma SR (Boehringer Mannheim) durante 7 días. El material
flotante del cultivo se revolvió a 2 000 r.p.m durante 10 minutos
para eliminar los residuos celulares y se congeló hasta su uso.
Los Mabs recolectados se sometieron a estudios
epítopes de mapeo utilizando el análisis western de
contraste, un panel extenso de familiares de la
MC-1, mutantes y quimeras. Ninguno de los Mabs fue
capaz de reacción cruzada con el homólogo múrido de la
MC-1 o con el hTGF-\beta1, siendo
todos los epítopes Mab dependientes de la conformación. Se observó
un patrón de reactividad cruzada distintivo con los varios antígenos
para cada uno de los Mabs sugiriendo la presencia de al menos cinco
regiones inmunogénicas en la superficie de la MC-1.
Dos de los Mabs (13C4H3 y 26G6H6) se seleccionaron para estudio
posterior sobre la base de sus elevadas afinidades (teniendo cada
uno ED50's en el intervalo de 1,3-2,5 x
10_{-9}M).
Se encontró que el Mab 13C4H3 se ligaba al
terminal amino (posiciones 1-13) de la
MC-1 humana madura natural (i.e. con la histidina
en la posición 6) con una afinidad significativamente mayor que la
del epítope correspondiente de MC-1Asp^{202} y es
por tanto capaz de discriminar entre el tipo natural de
MC-1 y el tipo MC-1^{202} Como el
Mab 13C4H3 fue incapaz de reconocer una quimera de múrido humana
MC-1 (en la que todos los aminoácidos del terminal
amino (1-13) que no eran similares a la secuencia
humana fueron reemplazados con los aminoácidos correspondientes del
MC-1 humano), se concluyó que los residuos
adicionales fuera del terminal amino que difieren entre las
proteínas humanas y de ratón posiblemente están involucrados
también.
Se encontró que el Mab 26G6H6 estaba dirigido
contra un epítope (comprendiendo aminoácidos en la región de las
posiciones 24-37, 56-68 y
91-98 de la MC-1 madura humana
natural) situado cerca de las puntas de los denominados
"dedos" de la MC-1. El Mab 26G6H6 no
discriminaba entre las proteínas de MC-1 que tenían
histidina o ácido aspártico en la posición 6.
Estos anticuerpos por tanto capacitan la
detección de individuos heterocigotos y homocigotos mediante la
medición en inmunoensayos de niveles ligados de
MC-1. Esto es, con el Mab 13C4H3 se esperaría que
la ligazón máxima sería observada con homocigotos H6/H6 y la
ligazón cero con homocigotos D6/D6, a la vez que se esperaría un
nivel intermedio de ligazón (e. g. 50%) con los heterocigotos
H6/H6.
Las especificidades de ligazón del epítope de
los anticuerpos anti MC-1 se describen en detalle en
Fairlie et al., 2001.
Las placas ELISA (Maxisorb, Nunc) se recubrieron
durante 24 horas a 4ºC con 80 \mul, en 1:500 de 26G6H6 en búfer
de bicarbonato pH 9,4-9,8 con cuidado para evitar
una evaporación significativa, las muestras se diluyeron en 1:3
1:100, en dependencia de la concentración estimada de
MC-1, en búfer de muestra (1% p/v BSA (Progen),
0,05% v/v Tween (Sigma) en PBS, pH 7,2 y un MC-1
"estándar" preparado diluyendo 1 \mug/ml de
rhMC-1 (en 1% de BSA p/v, HCl 3 mM) en 1:1 000 en
búfer de muestra seguido por ocho diluciones con doblaje (1 000
pg/ml - 7,8 pg/ml).
Los ensayos se llevaron a cabo como sigue:
Las placas recubiertas se lavaron tres veces con
búfer de lavado (0,05% v/v Tween en PBS) 300 \mul/pozo. Se
realizó el bloqueo por incubación con 250 \mul 1% BSA p/v a 21ºC
durante 1 hora. El búfer de bloqueo se retiró entonces y se
añadieron 100 \mul/pozo de estándares o muestras sin intervención
de lavado, durante 1 hora a 21ºC. Subsiguientemente, en el
anticuerpo de detección, 233-P, en 1:25 000, se
añadió el búfer de muestra v/v, 100 \mul/pozo e incubó durante
16 horas a 4ºC. El IgG de asno, anti oveja, biotinilado (Jackson's
Laboratories) en 1:50 000 en búfer de muestra v/v, 100 \mul/pozo,
se añadió entonces e incubó durante 1 hora a 21ºC seguido de
incubación con conjugado (Genzyme) Streptaviden-HRP
en 1:2 000 en búfer de muestra v/v, 100 \mul/pozo, durante 30
minutos a 21ºC. 0,4 mg/ml de OPD (Sigma), se incubaron en el
búfer recomendado por el fabricante a 100 \mul/pozo hasta que se
vio una clara diferencia entre el estándar de 7,8 pg/ml y el
estándar cero. El estándar 1 000 pg/ml debía tener un OD de al
menos mayor que uno. Finalmente, la reacción se detuvo con 100
\mul/pozo de 2N H_{2}SO_{4}.
Las placas pueden leerse a 490 nm y construirse
una curva estándar utilizando una hipérbola de ligazón de dos
sitios. Los valores de la muestra se extrapolan de esta curva.
Las placas se lavaron entonces con 300
\mul/pozo de búfer de lavado después de cada paso desde antes de
la adición del anticuerpo 233-P de detección hasta
la adición del OPD.
La habilidad del PAB 233-P de
oveja y el MAb 13C4H3 de ratón para ligarse a la
rhMC-1 fue examinada mediante ELISA directo. Se
encontró que ambos materiales flotantes no diluidos de cultivo de
tejido contentivos del MAb 13C4H3 y del PAB 233-P
de oveja a una dilución de 1:500 000 en diluente de anticuerpo se
ligaban fuertemente a 1,8 ng de rhMC-1
inmovilizada. No se observó reacción entre la
rhMC-1 y el medio de cultivo condicionado por la
línea celular SP 2/0 del mieloma de ratón, medio de cultivo no
condicionado, IgG1 de ratón, suero normal de oveja enriquecido con
inmunoglobulina, o diluente de anticuerpo. Se observó una ligazón
mínima de fondo a los pozos no recubiertos para todas las muestras
examinadas. No se detectó reactividad cuando tanto el 13C4H3 como
el 233-P se incubaron con
rhTGF-\beta1 inmovilizada.
La especificidad de los anticuerpos se determinó
mediante inmunoprecipitación de la rhMC-1 purificada
con MAb 13C4H4 y 26G6H6, seguido de análisis por inmunocontraste
con diversos anticuerpos específicos de la MC-1.
Todos los anticuerpos de la MC-1 reconocieron
específicamente la MC-1 dimérica de 25 kD.
Adicionalmente, el bloqueo de los anticuerpos se llevó a cabo
mediante preincubación del anticuerpo con rhMC-1
purificada, antes del análisis western de contraste. Esto
redujo grandemente la interacción del anticuerpo con la banda 25 kD
específica de MC-1, confirmando la especificidad de
los anticuerpos Mab 13C4H4, 26G6H6 y 233-P. Aún
más, estos anticuerpos puestos a prueba, fallaron en el
reconocimiento de la inhibina, otro miembro de la superfamilia
TGF\beta. Se muestra una curva de ensayo típica estándar en la
Figura 10 con barras de error que representan una desviación
estándar.
La mayor afinidad del anticuerpo de detección
233-P a una multitud de epítopes
MC-1, en comparación con el 13C4H4 conllevó a una
mayor diferencia en la MC-1 detectada entre los
alelos H6 y D6. Esta diferencia es una función de las afinidades
que difieren de los epítopes H6 y D6 al 13C4H4. La presencia de
233-P en una incubación larga, lleva a que
progresivamente menos D6 se ligue al anticuerpo de captura, 13C4H4.
Estas moléculas ahora desligadas, se ligan progresivamente a
componentes de mayor afinidad del anticuerpo policlonal que son
específicos del sitio de ligazón del 13C4H4. Estas moléculas están
ahora excluidas de la MC-1 que es capaz de ser
medida.
También se observa otro efecto. Este es, que
cada molécula de MC-1 excluida de ligarse al
anticuerpo de captura excluye un múltiplo de anticuerpos
233-P. Esto ocurre debido a que el
233-P es policlonal y se liga a partes múltiplas de
la molécula de MC-1. Como resultado estos complejos
inmunes, entre MC-1 y 233-P quedan
excluidos del ensayo. Como el anticuerpo 233-P es
el contribuyente principal al fondo, la diferencia observada en la
concentración de la MC-1 se magnifica aún más. En
el caso de un genotipo homocigótico D6/D6, la decoloración de fondo
se reduce al punto que se obtiene una lectura por debajo de cero a
lo largo de amplias diferencias de concentración. En el caso del
aleo H6, la probabilidad de que la MC-1 se libere
para ligarse al anticuerpo policlonal únicamente, es mucho menor,
creando una diferencia más amplia en la concentración observada de
MC-1.
Los dos ensayos sándwich inmunoabsorbentes
vinculados a enzima involucrados en la determinación de la
concentración de la MC-1 y el alelo
MC-1 en una muestra en particular utilizan el 26G6H6
y el 13C4H4 respectivamente como anticuerpos de captura. Las
muestras analizadas pueden provenir de cultivo de tejido (medio de
cultivo de tejido o extracto celular), humano, de suero o plasma, o
cualquier muestra humana en fase fluida o pueden procesarse a la
fase fluida mediante cualquier proceso.
Los ensayos utilizaron placas ELISA (Maxisorb,
Nunc) recubiertas durante 24 horas a 4ºC con 80 \mul; en1:500 de
13C4H4 en búfer de bicarbonato pH 9,4-9,8 (debe
tenerse cuidado para evitar la evaporación significativa). Las
muestras se diluyeron en 1:3 1:100, en dependencia de la
MC-1 estimada, determinada en la concentración de
ensayo del 13C4H4, en búfer de Muestra (1% p/v BSA (Progen), 0,05%
v/v Tween (Sigma) en PBs, pH 7,2. La concentración de la muestra
debe estar entre 50 y 150 pg/ml. El Estándar MC-1
(1 \mug/ml de MC-1 recombinante en 1% BSA p/v, 3
mM HCL) se diluyó en 1:1 000 en búfer de muestra realizando entonces
ocho diluciones de doblaje (1 000 pg/ml-7,8
pg/ml).
Los ensayos se llevaron a cabo como sigue:
Las placas recubiertas se lavaron tres veces con
búfer de lavado (0,05 v/v Tween en PBS) 300 \mul/pozo. Se realizó
el bloqueo por incubación con 250 \mul 1% BSA p/v a 21ºC durante 1
hora. El búfer bloqueador se retiró y se añadieron 100 \mul/pozo
de estándares o muestras durante 1 hora a 21ºC sin intervención de
lavado. Se añadió el anticuerpo de detección,
233-P, en 1:10 000 en búfer de muestra v/v, 100
\mul/pozo, e incubó durante 16 horas a 4ºC. El IgG de asno, anti
oveja, biotinilado (Jackson's Laboratories) en 1:5 000 en búfer de
muestra v/v, 100 \mul/pozo, se añadió entonces e incubó durante 1
hora a 21ºC seguido por incubación con conjugado Streptaviden NRP
(Genzyme) en 1:2 000 en búfer de muestra v/v, 100 \mul/pozo,
durante 30 minutos a 21ºC. Se incubó OPD (Sigma) 0,4 mg/ml, en el
búfer recomendado por el fabricante, a 100 \mul/pozo hasta que se
pudo distinguir una diferencia clara entre el estándar de 7,8 pg/ml
y el estándar cero. El estándar de 1 000 pg/ml debía tener una OD
al menos mayor que uno. La reacción se detiene con 100 \mul/pozo
de 2N H_{2}SO_{4}.
Se leyeron las placas a 490 nm y se construyó
una curva estándar utilizando una hipérbola de ligazón de dos
sitios. Los valores de muestra pueden extrapolarse a partir de
esta curva.
Entonces se lavaron las placas con 300
\mul/pozo de búfer de lavado después de cada paso desde antes de
la adición del anticuerpo de detección 233-P hasta
la adición del OPD.
Para determinar el alelo de
MC-1, la concentración observada de
MC-1, obtenida a partir del ensayo de 13C4H6 se
dividió entre la concentración total de MC-1,
determinada en el ensayo 26G6H6. Las proporciones de interrupción
para los diversos alelos se determinaron mediante los controles
homocigóticos H6/H6 y D, así como los heterocigóticos (HD)
utilizados en ambos ensayos. Se incluyeron los datos de la
validación como se expone más adelante.
Una proporción menor de 0 indica un genotipo
homocigótico D6/D6, de 0-0,6 es heterocigótico y
mayor de 0,7 es homocigótico H6/H6. Es de notar que hay
proporciones mayores de 1. Debido a la dinámica del ensayo, con
respecto a la proteína homocigótica D6/D6, las concentraciones
mayores llevan a un OD aún más abajo del cero.
Los datos derivados de 38 trabajadores de
laboratorio sanos ambulatorios se muestran más adelante en forma
tabular. De estos, se obtuvo el genotipo MC-1
determinado mediante secuenciación de ADN. Hubo un acuerdo del 100%
entre la secuencia de ADN de los 18 sujetos y el genotipo
determinado mediante el método ELISA. Otras 95 muestras adicionales
se analizaron a partir de donantes de sangre saludables con 48
hombres y 47 mujeres, con un intervalo de edades entre
20-69 y 17-71 años respectivamente.
Hubo cinco sujetos con un genotipo homocigótico D6/D6, 45 con un
genotipo heterocigótico y 45 con un genotipo homocigótico H6/H6.
\vskip1.000000\baselineskip
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tratamiento que involucra a la citoquina 1 macrófaga inhibitoria
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<160> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 308
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 308
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 927
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 927
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggacctgct aaccaggctg cgggccaacc agagc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggctaacaag tcatcatagg tctggagcga cac
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Arg Asn Gly Asp Asp Cys Pro Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccgccgccg tcgcagtcgg a
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
cebador PCR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggcggtgc aggctcgtct tgat
\hfill24
Claims (14)
1. Un método para el diagnóstico de riesgo de
aborto y/o de parto prematuro, comprendiendo dicho método:
(i) la determinación de la cantidad de
MC-1 presente en una muestra corporal tomada a un
sujeto de prueba embarazado(a) que tiene un tiempo conocido
de gestación, y
(ii) la comparación de dicha cantidad
determinada contra la cantidad, o intervalo de cantidades, presentes
en muestra(s) corporales equivalentes tomadas a
sujeto(s) de prueba embarazados(as) normales con un
tiempo de gestación que es equivalente a dicho tiempo conocido de
gestación de dicho sujeto de prueba.
2. Un método según la reivindicación 1, en el
que dicha muestra corporal se selecciona entre sangre virgen, suero
sanguíneo, plasma, fluido amniótico, extractos placentarios, orina y
líquido cerebroespinal.
3. Un método según la reivindicación 2, en el
que la muestra corporal se selecciona entre suero sanguíneo, fluido
amniótico y extractos placentarios.
4. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a la 3, en el que la muestra de sangre es una
muestra de suero sanguíneo.
5. Un método según la reivindicación 4, en el
que el sujeto de prueba está en el primer trimestre de embarazo y
en el que una cantidad determinada de MC-1 presente
en el suero sanguíneo de dicho sujeto de prueba que es menor o
igual a 4 ng/ml es indicativa de riesgo incrementado de aborto y/o
de parto prematuro.
6. Un método según la reivindicación 4, en el
que el sujeto de prueba está en el segundo trimestre de embarazo y
en el que una cantidad determinada de MC-1 presente
en la muestra de suero sanguíneo de dicho sujeto de prueba que es
menor o igual a 8 ng/ml es indicativa de riesgo incrementado de
aborto y/o de parto prematuro.
7. Un método según la reivindicación 4, en el
que el sujeto de prueba está en el tercer trimestre de embarazo y
en el que una cantidad determinada de MC-1 presente
en el suero sanguíneo de dicho sujeto de prueba que es menor o
igual a 12 ng/ml es indicativa de riesgo incrementado de aborto y/o
de parto prematuro.
8. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a la 3, en el que la muestra corporal es una
muestra de fluido amniótico.
9. Un método según la reivindicación 8, en el
que dicho sujeto de prueba está en el segundo trimestre de embarazo
y en el que una cantidad determinada de MC-1
presente en la muestra de fluido amniótico de dicho sujeto de
prueba que es menor o igual a 10 ng/ml es indicativa de un riesgo
incrementado de aborto y/o de parto prematuro.
10. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a la 3, en el que la muestra corporal es una
muestra de extracto placentario.
11. Un método según la reivindicación 10, en el
que dicho sujeto de prueba está en el tercer trimestre de embarazo
y en el que una cantidad determinada de MC-1
presente en la muestra de extracto placentario que es menor o igual
a 18 ng/ml es indicativa de un riesgo incrementado de aborto y/o de
parto prematuro.
12. Un método según la reivindicación 10, en el
que dicho sujeto de prueba está en el tercer trimestre de embarazo
y en el que una cantidad determinada de MC-1
presente en la muestra de extracto placentario que es menor o igual
a 10 ng/ml es indicativa de un riesgo incrementado de aborto y/o de
parto prematuro.
13. Un método de diagnóstico de anormalidades
fetales, comprendiendo dicho método:
(i) la determinación de la cantidad de
MC-1 presente en una muestra corporal tomada a un
sujeto embarazado(a) de prueba que tiene un tiempo conocido
de gestación, y
(ii) la comparación de dicha cantidad
determinada contra la cantidad, o intervalo de cantidades, presentes
en muestra(s) corporales equivalentes de sujeto(s)
embarazados(as) normales con un tiempo de gestación que es
equivalente al tiempo de gestación de dicho sujeto de prueba.
14. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a la 13, en el que la cantidad de
MC-1 presente en la muestra corporal se determina
mediante inmunoensayo o inmunohistoquímica utilizando anticuerpos o
fragmentos de éstos contra la MC-1.
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