JPH07258293A - 新規な蛋白質ならびにその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 活性酸素産生抑制作用を有する新規蛋白質を
提供する。 【構成】 本蛋白質は、下記に示されるアミノ酸配列を
有する。また遺伝子は、該蛋白質のアミノ酸配列をコー
ドする塩基配列を有する。この蛋白質は細胞培養技術あ
るいは遺伝子工学的技術によって製造できる。 【効果】 本蛋白質は好酸球における活性酸素の産生を
抑制し、気管支喘息等の疾患の予防および治療に有効で
ある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な蛋白質に関し、更
に詳しくは、ヒト由来細胞の培養によって得られた培養
上清より精製された新規な生理活性物質に関する。本発
明はまた、活性酸素産生抑制剤に関し、更に詳しくは、
ヒト由来細胞の培養によって得られた培養上清より精製
された、顆粒球、例えば好酸球における活性酸素産生を
抑制する作用を有する新規な蛋白質、及びその製造方法
に関する。本発明はまた、該蛋白質のアミノ酸配列から
合成されたＤＮＡプローブに関する。また本発明は、遺
伝子工学的技術を応用してクローニングされた該蛋白質
の遺伝子に関する。本発明はまた、遺伝子工学的技術を
応用して作製される該蛋白質の遺伝子とベクターＤＮＡ
からなる組換えＤＮＡ体に関する。本発明はまた、遺伝
子工学的技術を応用して作製される該蛋白質を発現する
形質転換細胞に関する。更に本発明は、遺伝子工学の技
術を応用した、該蛋白質の製造方法に関する。更にまた
本発明は、該蛋白質と特異的に結合することを特徴とす
る抗体に関する。本発明はまた、該蛋白質を含有する活
性酸素産生抑制剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】好酸球の生体防御機構における特徴的な
機能は、寄生虫感染時における強力な寄生虫傷害作用で
ありこの作用は主として好酸球の高い活性酸素産生能と
特殊顆粒に局在する強塩基性蛋白質に基づくものと考え
られている。特殊顆粒中の塩基性蛋白質としてはｍａｊ
ｏｒ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＢＰ）、ｅｏｓ
ｉｎｏｐｈｉｌ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ
（ＥＣＰ）、ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ ｄｅｒｉｖｅｄ
ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ（ＥＤＮ）およびｅｏｓｉｎｏｐ
ｈｉｌ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＥＰＯ）が知られてい
る。しかし、近年になってこれらの組織傷害性物質は寄
生虫や細菌に対してだけではなく、時には自己の細胞に
対しても強い傷害作用を発現することが明らかにされつ
つある。

【０００３】ヒトの場合、好酸球は好中球に比べて高い
活性酸素産生能を有することが知られており¹⁾、生成さ
れた活性酸素には殺菌作用や細胞傷害作用がある。なか
でも過酸化水素はＥＰＯの基質となり、ｈａｌｉｄｅ
（Ｃｌ^- ，Ｂｒ^- ，Ｉ^- ）の共存下で強力な殺菌能を示
すハロゲン化オキシダント（ＨＯＣｌ，ＨＯＢｒ，ＨＯ
Ｉ）を生成し、その作用はｉｎ ｖｉｔｒｏでの比較に
おいてはＭＢＰ、ＥＣＰよりも強い殺菌作用や殺寄生虫
作用を有することが示されている²⁾³⁾。このように、好
酸球由来の組織傷害物質として活性酸素と塩基性蛋白質
が注目されているが、組織傷害の発現の主因として活性
酸素依存性の組織傷害が大きな役割を果たしていること
が明らかにされてきている。

【０００４】好酸球の増多が認められ、好酸球が主たる
免疫細胞としてその疾患の病態に関与していると考えら
れているものの一例として気管支喘息、アトピー性皮膚
炎、アレルギー性鼻炎などが挙げられる⁴⁾。〔１）Ｗｅ
ｉｓｓ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，サイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ），２３６，２００（１９８４）；２）Ｋｌｅｂ
ａｎｏｆｆ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ジャーナル オブ
イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ），１４３，２３
９（１９８９）；３）Ｈｕｍａｎｎ，Ｋ．Ｊ．ｅｔ ａ
ｌ．，ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ）１４４，３１６６（１９９０）；４）「好酸
球」牧野荘平ら編、１９９１年、国際医学出版〕

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、寄生
虫感染症や好酸球等の顆粒球が産生する活性酸素による
組織細胞傷害に基づく炎症生起によるものであることが
明らかになりつつあるが、これらの疾患に対する有効な
薬剤は未だ現れていない。

【０００６】本発明の目的は上述の組織傷害因子として
好酸球から産生される活性酸素が重要であるとの観点に
立ち、その産生を抑制する新規な活性酸素産生抑制因子
を提供するものである。本発明の他の目的は、該活性酸
素産生抑制因子のアミノ酸配列を基に合成されるＤＮＡ
プローブを提供することにある。本発明の更に他の目的
は、該活性酸素産生抑制因子を産生する細胞からクロー
ニングされた該活性酸素産生抑制因子の遺伝子を提供す
ることにある。また、本発明の更に他の目的は、該活性
酸素産生抑制因子の遺伝子を含む塩基配列と、宿主細胞
中で発現可能なベクターＤＮＡとを連結してなる組換え
ＤＮＡ体を提供することにある。本発明の更に他の目的
は、該組換えＤＮＡ体により形質転換された細胞を提供
することにある。本発明の更に他の目的は、該活性酸素
産生抑制因子を産生し得る細胞を培地にて培養し、その
培養液中に該蛋白質を産生させ、培養液から培養上清を
回収し、回収した培養上清から該蛋白質を分離・精製す
ることを含む該蛋白質の製造方法を提供することにあ
る。本発明の更に他の目的は、該活性酸素産生抑制因子
を、或は該活性酸素産生抑制因子の一部のペプチドを抗
原とすることにより作製される、該活性酸素産生抑制因
子と特異的に結合することを特徴とする抗体を提供する
ことにある。本発明の更に他の目的は、治療的に有効な
量の該活性酸素産生抑制因子を活性成分として含有する
医薬組成物、及びそれを用いた、好酸球増多を示し好酸
球が病態に関連していると考えられる疾患、例えば気管
支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎等の疾患
の予防及び治療方法を提供することにある。本発明の更
に他の目的は、活性酸素産生抑制因子を有効成分として
含有する研究試薬物を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者等は上記のごと
く目的から新規な活性酸素産生抑制剤を見いだすべく鋭
意研究を重ねた結果、動物細胞の培養上清中に全く新規
な活性酸素産生抑制能を有する因子を見出し、更に研究
を重ねた結果、以下のような知見を得、本発明を完成す
るに至った。

【０００８】即ち本発明によれば、配列表の配列番号４
で示されるアミノ酸配列を含む新規な蛋白質が提供され
る。本発明の他の態様によれば、該蛋白質のアミノ酸配
列を基に合成されるＤＮＡプローブが提供される。更
に、本発明の他の態様によれば、該蛋白質の遺伝子が提
供される。更にまた、本発明の他の態様によれば、該蛋
白質の遺伝子を含む塩基配列と、宿主細胞中で発現可能
なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡ体が提
供される。更にまた、本発明の他の態様によれば、該組
換えＤＮＡ体により形質転換された細胞が提供される。
更にまた、本発明の他の態様によれば、該蛋白質を産生
し得る細胞を培地中にて培養し、その培養液中に該蛋白
質を産生させ、培養液から培養上清を回収し、回収した
培養上清から該蛋白質を分離・精製することを含む該蛋
白質の製造方法が提供される。更にまた、本発明の他の
態様によれば、該蛋白質の少なくとも一部と特異的に結
合する抗体が提供される。

【０００９】上記の本発明の新規な蛋白質は以下のよう
にして得ることができる。該蛋白質を産生する細胞を培
養して得ることができる。即ち、本発明の方法において
用いられる細胞としては、該蛋白質を産生する能力を有
する各種の細胞を用いることができる。正常二倍体細胞
を有利に使用でき、例えば、ヒトの腎、腸、肺、心臓、
輸尿管、皮膚、***、舌、甲状腺、胎盤、子宮由来の細
胞を、好ましくはヒト胎児腎、肺、***由来の細胞を、
更により好ましくはヒト胎児肺由来の細胞を使用でき
る。

【００１０】例えばヒト胎児肺細胞（フローラボラトリ
ーズ社製）を、０．７５％プロテオースペプトンＮｏ．
３（ディフコ社製）を含んでいても或いは含まなくても
よい、血清を含まない１９９培地（ギブコ社製）にて培
養し、その培養上清中に該蛋白質を産生させ、回収した
培養上清より該蛋白質を分離・精製することにより該蛋
白質を得ることができる。

【００１１】精製方法としては、蛋白質化学において通
常使用される方法、例えば、担体による吸着法、塩析
法、電気泳動法、およびイオン交換、ゲル濾過、逆相ク
ロマトグラフィー、適当なリガンドへのアフィニティー
を応用した各種のクロマトグラフィー法等を単独で、ま
たは組み合わせて使用できる。クロマトグラフィー法と
して、好ましくは、カルボキシメチル基を結合させたセ
ファロースを用いるＣＭセファロースカラムクロマトグ
ラフィー、架橋したデキストランゲル等の粒子をもちい
るゲル濾過カラムクロマトグラフィー、フェニル基を有
するセファロースを用いるフェニルセファロースカラム
クロマトグラフィー、陽イオン交換のプレパックドカラ
ムであるモノＳカラムクロマトグラフィー、硬質ポリマ
ーにＣ８基を導入した充填剤を用いた逆相カラムクロマ
トグラフィー、本発明物質と特異的に結合する抗体を結
合させた抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィー
を使用できる。

【００１２】かくして生成する該蛋白質は本発明品と特
異的に結合する抗体を用いたエンザイムイムノアッセイ
（ＥＩＡ）法、ウェスタンブロッティングなどにより容
易に測定し、また検出することができる。また生成物に
活性酸素産生抑制作用がある場合は該活性を指標にして
測定することもできる。ここで用いる特異抗体は、該蛋
白質の少なくとも一部を認識するものであれば抗血清、
ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであ
ってもよい。

【００１３】免疫原としては、配列表の配列番号４に記
載のアミノ酸配列で表される蛋白質を用いることができ
るが、該蛋白質のアミノ酸配列のうち連続した一部のア
ミノ酸配列からなる部分ペプチド、例えば通常は６個以
上のアミノ酸配列、更に好ましくは７個以上のアミノ酸
配列からなるペプチドを用いることもできる。部分ペプ
チドはペプチド合成の公知の方法で製造し得る。そして
それは、固相合成法、液相合成法の何れによっても良
い。その例として、「ペプチド合成」（泉屋信夫ら著、
１９７５年、丸善株式会社）或いは、「ペプチド合成の
基礎と実験」（泉屋信夫ら著、１９８５年、丸善株式会
社）に記載の方法が挙げられる。

【００１４】また、該部分ペプチドは適当な酵素により
該蛋白質を切断することにより製造してもよい。該方法
として、例えば「生化学実験講座１ タンパク質の化学
II」（日本生化学会編、１９７６年、東京化学同人）の
２５５〜３３２ページに記載の方法が挙げられる。配列
表の配列番号４に記載のアミノ酸配列で表される蛋白
質、またはその部分ペプチドを免疫する際には、キャリ
アー蛋白質との複合体としてから免疫に用いてもよい。

【００１５】該キャリアー蛋白質としては、例えば、牛
血清アルブミン、牛ガンマグロブリン、ヘモシアニンな
どを用いることができる。ペプチドとキャリアー蛋白質
の結合には、公知の常套手段を用いて容易に実施でき
る。結合に用いる試薬としては、例えば、グルタールア
ルデヒド、水溶性カルボジイミドなどが挙げられる。ペ
プチドとキャリアー用蛋白質との使用比は、約１対１、
ないし約１対３０（重量比）が適当であり、特に１対１
５〜２０が好ましく、さらに、約１対１ないし、１対４
が好ましい。反応のｐＨは、中性付近、特に７．３前後
が良好な結果を与えることが多い。また、反応に要する
時間は約２〜６時間がよい場合が多いが、特に、約３時
間が適当である。このようにして複合体を作製すること
ができる。

【００１６】ポリクローナル抗体は、例えば、「新生化
学実験講座１２ 分子免疫学 III」（日本生化学会編、
１９９２年、東京化学同人）に記載の方法を用いて製造
することができる。即ち、ポリクローナル抗体を製造す
るためには、以上のようにして製造した免疫原が温血動
物に接種される。抗体の製造に用いられる温血動物とし
ては、例えば、哺乳温血動物（例：羊、山羊、ウサギ、
ウシ、ラット、マウス、モルモット、ウマ、ブタ）、鳥
類（例：ニワトリ、ハト、アヒル、ガチョウ、ウズラ）
などが挙げられる。免疫原を温血動物に接種する方法と
しては、動物に接種する免疫原は抗体産生をするに有効
な量でよく、例えば、ウサギに１回１ｍｇを１ｍｌの生
理食塩水及びフロイント完全アジュバンド（ＦＣＡ）に
乳化して、皮下または皮内の数カ所に４週間おきに５回
接種すると抗体を産生する場合が多い。

【００１７】アジュバンドはＦＣＡの他、フロイント不
完全アジュバンド（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウムアジ
ュバンド、百日咳ワクチンアジュバンドなどを利用する
ことができる。このようにして、温血動物中に形成され
た抗体を採取する方法としては、例えばウサギでは、通
常最終接種後７日から１２日の間に耳静脈から採取し、
遠心分離して血清（抗血清）として得られる。

【００１８】抗血清は自身試薬として用いることも可能
であるが、抗血清から免疫グロブリンクラス、またはサ
ブクラスを蛋白質化学的に分離する非特異的精製法、或
いは抗体活性を持つ抗体蛋白質そのものを単離する特異
的精製法を用いてポリクローナル抗体を精製することが
できる。非特異的精製法としては、抗血清中に含まれる
免疫グロブリン（Ｉｇ）の各クラスの抗体から、各クラ
スの分子性状の差異に基づいて分離分画する精製法が用
いられる。一般にＩｇＧクラスに最も高濃度に抗体が含
まれることからＩｇＧの精製法を用いることができる。

【００１９】具体的には、プロテインＡ、プロテインＧ
を用いた分画法、密度勾配遠心法、限外濾過法、ゲルマ
トリックスによる分離分画法、等電点電気泳動法、イオ
ン交換クロマトグラフィー法、硫酸アンモニウム、硫酸
ナトリウムによる塩析法などを使用することができる。
特異的精製法としては、例えば、免疫原を保持させた担
体を用いるアフィニティクロマトグラフィーで吸着した
画分を回収することによりポリクローナル抗体を精製す
る方法を用いることができる。

【００２０】また、ケーラーとミルステインの方法（Ｎ
ａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，４９５）と同様の方法
により得られるモノクローナル抗体も利用できる。即
ち、上記のポリクローナル抗体の調製法と同様に免疫さ
れた温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個
体を選択し、最終免疫の１〜５日後脾臓またはリンパ節
を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞
と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマを調製することができる。融合操作は既知の
方法、例えばケーラーとミルステインの方法〔Ｎａｔｕ
ｒｅ（１９７５）２５６，４９５〕に従い実施できる。
融合剤としてはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセ
ンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧ
が用いられる。

【００２１】モノクローナル抗体を得るためにはラッ
ト、マウスを用いるのが好ましい。免疫方法は、例えば
マウスを免疫する場合、皮下、腹腔内、静脈内に注入す
るのが好ましい。また、免疫間隔、免疫量等の可変度は
高く、種々の方法が可能であるが、例えば２週間隔で約
２〜６回免疫し、最終免疫後、約１〜５日、好ましくは
約２〜４日後に摘出した脾臓細胞を用いる方法がよく用
いられる。免疫量は１回にペプチド量として、マウス当
り約０．１μｇ以上、好ましくは約１０μｇ〜３００μ
ｇ用いることが望ましい。また、脾臓を摘出する前に部
分採血を行ない、血中の抗体価の上昇を確認した上で脾
臓細胞を用いる融合実験を行うことが望ましい。

【００２２】上記脾臓細胞と骨髄腫細胞との細胞融合
は、例えば摘出したマウスの脾臓細胞を、ヒポキサンチ
ン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈ
ｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐ
ｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＨＧＰＲ
Ｔ）欠損やチミジンキナーゼ（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋ
ｉｎａｓｅ：ＴＫ）欠損の様なマーカーを持った適切な
同種または異種の骨髄腫細胞（例：Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ
８、Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１、Ｐ３／Ｘ６３−Ａ
ｇ８．Ｕ１、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４）と融合させる。例
えば骨髄腫細胞と脾細胞とを１：１〜１：２０の割合
で、例えばＲＰＭＩ１６４０培地（フローラボラトリー
社製）に懸濁させ、センダイウイルス、ポリエチレング
リコール（ＰＥＧ）等の融合剤を用いることができる。
もちろんジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）その他の融
合促進剤を加えることも可能である。

【００２３】ＰＥＧは通常、重合度が約１０００〜６０
００のものが、約１０〜８０％の濃度で添加され、２０
〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で０．５〜３０分間
インキュベートする事により効率よく細胞融合を実施で
きる。融合細胞はＨＡＴ（ヒポキサンチン：ｈｙｐｏｘ
ａｎｔｈｉｎｅ、アミノプテリン：ａｍｉｎｏｐｔｅｒ
ｉｎ、チミジン：ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）を含む１０％Ｆ
ＣＳ添加ＲＰＭＩ１６４０培地（ＨＡＴ培地）等を用い
て、選択的に増殖させることができる。増殖してきた細
胞の培養上清は、目的とする抗体産生があるか否かにつ
いてスクリーニングを行うことができるが、抗体価のス
クリーニングは次のようにして行うことができる。即
ち、免疫原に対する抗体産生の有無を、ラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ）法、またはエンザイムイムノアッセイ
（ＥＩＡ）法等の方法で調べることができるが、これら
の方法は種々の変法が可能である。また、分子量を考慮
して検出することもできる。

【００２４】選択培地で増殖を示し、かつ免疫に用いた
ペプチドに対する抗体活性の見られた細胞は、限界希釈
法等によりクローニングを行うことが望ましい。クロー
ン化された細胞の上清について前記と同様の方法でスク
リーニングを行うことにより免疫原と反応性を示すモノ
クローナル抗体産生ハイブリドーマクローンを得ること
ができる。

【００２５】上記のようにしてクローン化されたハイブ
リドーマを、液体培地中で増殖させる。具体的には例え
ば液体培地、例えば約０．１〜４０％の牛胎児血清を添
加したＲＰＭＩ１６４０培地（フローラボラトリー社
製）に約２〜１０日間、好ましくは約３〜５日間培養す
ることにより、培養上清から該モノクローナル抗体を得
ることができる。また、哺乳動物の腹腔内に接種し、細
胞を増殖させ、腹水を採取することにより抗体を取得す
ることができる。このためには、例えばマウスの場合プ
リスタン（Ｐｒｉｓｔａｎ：２，６，１０，１４−ｔｅ
ｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）等を予め
接種したＢＡＬＢ／ｃ等のマウスに約１×１０⁴ 〜１×
１０⁷ 個、好ましくは約５×１０⁵ 〜２×１０⁶ 個のハ
イブリドーマを腹腔内に接種し約７〜２０日後、好まし
くは約１０〜１４日後腹水液を採取する。腹水に生成蓄
積した抗体は、例えば硫安画分、ＤＥＡＥ−セルロース
カラムクロマトグラフィー等により容易にモノクローナ
ル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単離することがで
きる。

【００２６】このようにして本発明の蛋白質の少なくと
も一部を特異的に認識するモノクローナル抗体を得るこ
とができる。上記方法によって精製された該蛋白質の分
子量はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧ
Ｅ）によれば以下の通りであった。 分子量 ２５０００±２０００（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測
定） １４０００±２０００（還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定） 更に、精製された該蛋白質を、或いは該蛋白質を消化酵
素、例えばリジルエンドペプチダーゼを用いて消化する
ことにより断片化したペプチドをアミノ酸シークエンサ
ーにより解析することによって該蛋白質の部分アミノ酸
配列を明らかにした。明らかにした部分アミノ酸配列を
以下に示す。

【００２７】 アミノ酸配列１ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｘ Ｐｒｏ Ｌｅｕ （但し、Ｘは不明のアミノ酸） アミノ酸配列２ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｘ Ｙ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｙｓ （但し、Ｘ、Ｙは不明のアミノ酸） アミノ酸配列３ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｙｓ

【００２８】さらに、遺伝子工学的技術を応用し、該蛋
白質を産生している細胞の遺伝子ライブラリーから該蛋
白質の遺伝子をクローニングすることができる。即ち、
例えば、該蛋白質の産生細胞からメッセンジャー（ｍ）
ＲＮＡを分離し、該ｍＲＮＡから単鎖の相補ＤＮＡ（ｃ
ＤＮＡ）を、次いで二重鎖ＤＮＡを合成し、該相補ＤＮ
Ａをファージまたはプラスミドに組み込み、得られた組
換えファージまたはプラスミドで宿主を形質転換し、得
られた形質転換体培養後、形質転換体から適当な方法、
例えば該蛋白質の一部をコードするＤＮＡプローブとの
ハイブリダイゼーションにより、或いは該蛋白質と結合
する特異抗体を用いたイムノアッセイ法により目的とす
るＤＮＡを含有するファージ或いはプラスミドを単離
し、その組換え体から目的とするクローン化ＤＮＡを切
り出し、該クローン化ＤＮＡまたはその一部を発現ベク
ター中のプロモーターの下流に連結することにより、該
蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡのｃＤＮＡライ
ブラリーを製造することができる。

【００２９】該蛋白質をコードするｍＲＮＡは、種々の
該蛋白質産生細胞例えば、ヒト胎児肺細胞などから得る
ことができる。該蛋白質産生細胞からＲＮＡを調製する
方法としては、グアニジンチオシアネート法（Ｔ．Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃ
ｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．，１９８９）などが
挙げられる。次に常法に従ってｍＲＮＡを得る。この際
ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファル
マシア社製）を用いることができる。この様にして得ら
れたｍＲＮＡを鋳型とし、例えば岡山バーグの方法（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，２，１６１，１９８２ 及び、同誌，３，２
８０，１９８３）に従いｃＤＮＡを合成し、得られたｃ
ＤＮＡをプラスミドに組み込む。

【００３０】ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、
例えば大腸菌由来のｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ
１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（いずれも宝酒造社
販）などが挙げられるが、その他のものであっても宿主
内で複製増殖できるものであればいずれをも用いること
ができる。またｃＤＮＡを組み込むファージベクターと
しては、例えばλｇｔ１０、λｇｔ１１などが挙げられ
るが、その他のものであっても宿主内で増殖できるもの
であれば用いることができる。この様にして得られたプ
ラスミドは適当な宿主、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ）属菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
属菌などにカルシウムクロライド法などを用いて導入す
る。

【００３１】上記エシェリヒア属菌の例としては、エシ
ェリヒア・コリＫ１２ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１、ＬＥ
３９２、ＪＭ１０５などが挙げられる。上記バチルス属
菌の例としては、バチルス・サチリスＭＩ１１４などが
挙げられる。またファージベクターは、例えば増殖させ
た大腸菌にインビトロパッケージング法（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９７８）７１，２４４
２）を用いて導入することが出来る。上記方法により該
蛋白質ｃＤＮＡを含有する該蛋白質産生細胞のｃＤＮＡ
ライブラリーを作製することが出来る。

【００３２】該蛋白質ｃＤＮＡライブラリーから該蛋白
質ＤＮＡをクローニングする方法としては、例えばファ
ージベクターλｇｔ１０を用いて作製した該蛋白質ｃＤ
ＮＡライブラリーと該蛋白質をコードするオリゴヌクレ
オチドをプローブとして用いたプラークハイブリダイゼ
ーション法などが挙げられる。このようにして得られた
ＤＮＡの塩基配列を例えばサンガーらの方法（Ｓａｎｇ
ｅｒ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．（１９７７）７４，５４６３）によって決
定する事ができる。以上のようにして該蛋白質をコード
するＤＮＡが得られる。後述の実施例４で得られた該蛋
白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡの塩基配列を配列
表の配列番号１０に示した。

【００３３】本ＤＮＡ配列には１６番目に始まる開始コ
ドン（ＡＴＧ）から９４２番目で終わる終止コドン（Ｔ
ＧＡ）まで、３０８個のアミノ酸配列をコードし得るオ
ープンリーディングフレームが存在した。該オープンリ
ーディングフレームから翻訳したアミノ酸配列を配列表
の配列番号５に示した。更に、実施例３で得られた該蛋
白質のＮ末端アミノ酸配列、及び内部の部分アミノ酸配
列を参考に決定した該蛋白質のアミノ酸配列を配列表の
配列番号４に示した。ピーク１、ピーク２、ピーク３
〔Ｎ末端アミノ酸配列に一致（実施例３参照）〕の各ペ
プチド断片のアミノ酸配列（それぞれ配列表の配列番号
１，２，３）は、配列表の配列番号４に示す該蛋白質の
アミノ酸配列のそれぞれ９２から１０７番目、６３から
９１番目、１から９番目の配列と一致した。

【００３４】該蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配列番
号５に示されるアミノ酸配列の内部に存在することか
ら、配列表の配列番号５に示されるアミノ酸配列で表さ
れる蛋白質は、該蛋白質に配列表の配列番号５の１から
１９６番目に示されるアミノ酸配列からなるシグナルペ
プチドを付加した前駆体蛋白質の一例である。該前駆体
蛋白質は細胞内、あるいは細胞外で修飾作用を受けて、
該シグナルペプチドが切り離されることによって、配列
表の配列番号４で表される本発明の蛋白質に成熟すると
予想される。また、該前駆体蛋白質は該前駆体蛋白質を
コードする遺伝子を含有するＤＮＡを有する発現型プラ
スミドによって形質転換された細胞の培養上清中に存在
する。該前駆体蛋白質はウェスタンブロッティングによ
って検出することが可能であり、参考例１にその一例を
示した。

【００３５】配列表の配列番号８、配列表の配列番号９
の塩基配列は本発明で得られた該蛋白質のＤＮＡ配列で
ある。配列表の配列番号８に示した塩基配列は、配列表
の配列番号９の塩基配列の５８９番目から９２７番目の
塩基配列と同一の塩基配列である。本発明の蛋白質のア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列の一例として
は配列表の配列番号８が挙げられる。また、該蛋白質の
前駆体蛋白質の一例である配列表の配列番号５に示した
該前駆体蛋白質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩
基配列の一例としては配列表の配列番号９が挙げられ
る。

【００３６】該蛋白質は配列表の配列番号４で示される
アミノ酸配列を有するポリペプチドを構成成分とする。
該蛋白質の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量は、
該ポリペプチドから計算される分子量にだいたい一致す
る。また、該蛋白質の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定し
た分子量は、該ポリペプチドが２量体を形成した場合に
計算される分子量とほぼ一致する。従って本発明の蛋白
質は、配列表の配列番号４のアミノ酸配列よりなるポリ
ペプチド、または、そのペプチドが２量体となったも
の、または、場合によってはそれ以上の多量体をも含む
ものである。

【００３７】また本発明の蛋白質を構成するポリペプチ
ドは配列表の配列番号４のアミノ酸配列の一部を欠くも
ので有り得るし、ポイントミューテーションの手法によ
り部分的に変異させることもできるものである。また、
そのアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に多少のアミノ
酸残基、ペプチド残基が付加されることも有り得る。上
記の該蛋白質の変異体と該蛋白質とのアミノ酸配列の相
同性は、通常６０％以上であることが好ましく、特に７
０％以上が好ましく、さらに８０％以上が好ましく、と
りわけ９０％以上である場合が好ましい。本発明の蛋白
質は、本発明のポリペプチドを構成成分とすればよい。

【００３８】上記のようにしてクローン化された該蛋白
質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所
望により制限酵素で消化して使用することができる。ク
ローン化されたＤＮＡから発現させたい領域を切り出
し、発現に適したベクター中のプロモーターの下流に連
結して発現型ベクターを得ることができる。

【００３９】本発明の蛋白質を産生するために用いるＤ
ＮＡは、配列表の配列番号４に示したアミノ酸配列で表
されるポリペプチドをコードするＤＮＡであればいかな
るものであっても良いが、好ましくは配列表の配列番号
８に示したＤＮＡが挙げられる。さらには、該ポリペプ
チドをコードするＤＮＡを含有していれば、その５’末
端、あるいは３’末端にシグナルペプチドなどの特徴的
なペプチドをコードするＤＮＡが付加された如何なるＤ
ＮＡであっても良いが、好ましくは配列表の配列番号５
に示される該蛋白質の前駆体蛋白質をコードするＤＮＡ
が挙げられ、更に好ましくは配列表の配列番号９に示さ
れるＤＮＡが挙げられる。宿主が動物細胞である場合に
は配列表の配列番号９に示されるＤＮＡを用いるのが好
ましい。

【００４０】該ＤＮＡはその５’末端に翻訳開始コドン
を有し、又３’末端には翻訳終結コドンを有していても
よい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終結コドンは、適
当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもでき
る。さらに該ＤＮＡを発現させるにはその上流にプロモ
ーターを接続する。ベクターとしては上記の大腸菌由来
のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来プラ
スミド、或いはλファージなどのバクテリオファージお
よびレトロウィルス、ワクシニアウィルスなどの動物ウ
ィルスなどが挙げられる。本発明で用いられるプロモー
ターとしては、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切
なプロモーターであればいかなるものでもよい。

【００４１】形質転換する際の宿主がエシェリヒア属菌
である場合はｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモータ
ー、ｌａｃプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌で
ある場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモー
ターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＧＫプロモータ
ー、ＧＡＰプロモーターＡＤＨプロモーターなどが好ま
しい。宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来の
プロモーター、レトロウィルスのプロモーター、メタロ
チオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター
などがそれぞれ利用できる。

【００４２】また、本発明者らは、本発明の蛋白質をコ
ードする遺伝子を含有するＤＮＡを宿主細胞で発現さ
せ、該蛋白質を産生させる過程において、所望の遺伝子
産物を量産させるための技術として開発されたマルコス
法（所望の遺伝子発現単位を同一方向に多数連結させた
状態でコスミドベクターにクローン化し、得られた組換
え体ＤＮＡを動物細胞に導入するすることにより高産生
株を得る方法〔例えば池田らの文献；ＧＥＮＥ（１９８
８）７１，１９−２７〕）を適用することを試みた。

【００４３】この様にして構築された該蛋白質をコード
するＤＮＡを含有する発現プラスミドを用いて、形質転
換体を製造する。宿主としては例えばエシェリヒア属
菌、バチルス属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。
動物細胞としては、例えばサル細胞であるＣＯＳ−１、
Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、カイコ
細胞ＳＦ９などが挙げられる。このようにして該蛋白質
をコードするＤＮＡを含有する発現プラスミドで形質転
換された形質転換体が得られる。この形質転換体の好ま
しい例としては本発明者の作製したＯＳＰ−Ａ１（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−４５６２）株が挙げられる。

【００４４】各形質転換体をそれぞれ公知の方法によ
り、適当な培地中で適当な培養条件により培養すること
によって該蛋白質を製造することができる。上記培養物
から該蛋白質を分離精製するには、例えば下記の方法に
より行うことができる。該蛋白質を培養菌体或いは細胞
から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体或
いは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音
波、リゾチーム及び／または凍結融解などによって菌体
或いは細胞を破壊した後、遠心分離や濾過により該蛋白
質の粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液中
に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤や、トリトン
Ｘ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。

【００４５】培養液中に該蛋白質が分泌される場合に
は、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体或いは細胞
と上清とを分離し上清を集める。この様にして得られた
培養上清、或いは抽出液中に含まれる該蛋白質は、天然
物である該蛋白質と同様の方法で分離・精製することが
できる。かくして生成する組換え型該蛋白質のＮ末端ア
ミノ酸配列は、前記の天然物である該蛋白質のＮ末端ア
ミノ酸配列に一致し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの還元状態、並
びに非還元状態における分子量も一致した。従って、該
組換え型蛋白質は天然型該蛋白質と同一物質であると考
えられる。

【００４６】該蛋白質は天然物である該蛋白質と同様に
これらと特異的に結合する抗体を用いたエンザイムイム
ノアッセイなどにより測定することができる。また生成
物に活性酸素産生抑制作用がある場合は該活性を指標に
して測定することもできる。本発明の該蛋白質をコード
するＤＮＡとしては、該蛋白質のアミノ酸配列をコード
する塩基配列を含有するものであればいかなるものであ
ってもよいが、例えば配列表の配列番号９、或いは配列
表の配列番号８に示される塩基配列を含有するＤＮＡ或
いは一部のＤＮＡであることが好ましい。

【００４７】かくして得られた新規な蛋白質は、活性酸
素産生を抑制する活性を有するものである。該蛋白質
は、好酸球における活性酸素産生抑制の研究用試薬とし
て、また該蛋白質単独で、あるいは少なくとも１種の薬
剤として投与可能な担体、希釈液または賦型剤を添加し
て適当な剤型とし、医薬品としても使用される。本発明
の新規な蛋白質は、好酸球が一因となって引き起こされ
る組織傷害、例えば気管支喘息、アトピー性皮膚炎、ア
レルギー性鼻炎などの治療及び／または予防に用いるこ
とができる。

【００４８】本発明の新規な蛋白質は注射剤としても用
いることができる。この場合には、ショ糖、グリセリ
ン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等
の増粘剤、各種無機塩のｐＨ調整剤等を添加剤として加
えることができる。本発明の新規な蛋白質の成人１回当
りの投与量は、年齢、性別、体重、症状などによって異
なるが、一般に約０．１μｇ〜１００ｍｇであり、１日
当り１回または必要に応じて数回投与することができ
る。

【００４９】尚、本明細書に記載されているＤＮＡ、組
換え体宿主としての大腸菌の取扱いに必要な一般的な操
作は当業者間で通常行われており、例えばＭａｎｉａｔ
ｉｓらの実験操作書（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａ
ｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２，
１９８９）に従えば容易に実施できる。使用する酵素、
試薬類もすべて市販の製品を用いることができ、特に断
らない限り、製品で指定されている使用条件に従えば、
完全にそれらの目的を達成することができる。

【００５０】

【実施例】本発明をより詳細に記述するために、実施例
により説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限
定されるものではない。 実施例１ ヒト細胞培養法による新規な蛋白質の生産 市販のヒト胎児肺正常二倍体細胞（フローラボラトリー
社製）を１００ｌ容のガラスボトルに、１０⁵ ｃｅｌｌ
ｓ／ｍｌの密度で２．５ｍｇ／ｍｌ濃度のサイトデック
スＩ（細胞培養用ビーズ担体、ファルマシア社製）と共
に植え込み、３７℃、５％ＣＯ2 を含む空気中で、生育
培地として１０％牛胎児血清を含むＭＥＭ培地（ギブコ
社製）を６０l 添加し、６０ｒｐｍの回転数で撹拌しな
がら懸濁培養した。８日間培養し、細胞を充分に増殖さ
せた後、生理食塩液で細胞が接着したビーズ担体を洗浄
し、０．７５％のプロテオースペプトンＮｏ．３（ディ
フコ社製）を含む、血清を含まない１９９培地（ギブコ
社製）６０ｌに置き換え、６０ｒｐｍの回転数で撹拌し
ながら培養した。３日目毎にこの培地を交換しながら、
本物質を含む培養液（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄ
ｉｕｍ；ＣＭ）を回収した。

【００５１】実施例２ 新規な蛋白質の精製 実施例１で得たヒト胎児肺正常二倍体細胞の培養上清１
７０l に、酢酸約１．１l を添加し、ｐＨを４に調製し
た後、濾過によって細胞断片及び生じた不溶物を除去し
た。予め０．２Ｍ食塩を含むｐＨ４．０の２０ｍＭ酢酸
緩衝液で充分に平衡化した、カルボキシメチルセファロ
ース（ＣＭセファロース；ファルマシア社製）カラム
（直径９ｃｍ×高さ２３．５ｃｍ）に吸着させ、同平衡
化緩衝液１３．５l 及び０．４Ｍ食塩を含むｐＨ４．０
の２０ｍＭ酢酸緩衝液６l で洗浄後、０．７５Ｍ食塩及
び１０ｍＭ塩酸リジンを含むｐＨ４．０の２０ｍＭ酢酸
緩衝液１２l で吸着している蛋白を溶出させた。本操作
によって、本蛋白質を含む粗精製液Ｉとして約５l の溶
出液を得た。培養上清中に多量に含まれるプロテオース
ペプトン成分は、１％以下にまで減少した。

【００５２】溶出液には通常、多量の組織プラスミノー
ゲンアクチベーター（ｔＰＡ）が含まれているので、こ
れを特異的に除去した。即ち、５Ｍ水酸化ナトリウム溶
液を加え、ｐＨを７．０に調製した後、予め０．５Ｍ食
塩を含むｐＨ７．５の２０ｍＭトリス塩酸緩衝液で充分
に平衡化した、ｔＰＡに対するモノクローナル抗体をセ
ファロースに結合させた（３ｍｇ／ｍｌゲル）、抗体カ
ラム（直径９ｃｍ×高さ２９ｃｍ）を素通りさせた。本
操作によって、粗精製液IIとして約６l の素通り液を
得、粗精製液Ｉに多量に含まれるｔＰＡ活性は除去され
た。

【００５３】粗精製液II６ｌを限外濾過モジュール（旭
化成社製、型式ＳＩＰ−００１３）で３００ｍｌにまで
濃縮し、１０倍容の約０．０５Ｍ食塩を含むｐＨ７．０
の２０ｍＭリン酸緩衝液を加えて、再び３００ｍｌにま
で濃縮し、緩衝液交換を行った。試料を、予め０．０５
Ｍ食塩を含むｐＨ７．０の２０ｍリン酸緩衝液で充分に
平衡化したＣＭセファロースカラム（直径５ｃｍ×高さ
１５ｃｍ）に吸着させ、４００ｍｌの同緩衝液で洗浄し
た後、約２００ｍｌの０．０５Ｍの食塩を含む同緩衝液
（Ｅ１）、約２００ｍｌの０．１５Ｍの食塩を含む同緩
衝液（Ｅ２）、更に約２００ｍｌの０．５Ｍの食塩を含
む同緩衝液でそれぞれ溶出を行った。流速は２００ｍｌ
／時間で行った。該蛋白質は主としてＥ２画分、即ち約
２００ｍｌの粗精製液III として、３０〜５０％の回収
率で回収された。

【００５４】粗精製液III 約２００ｍｌを上記限外濾過
中空糸を用いて１０倍に濃縮し、これを予めＰＢＳで充
分に平衡化したセファクリルＳ−２００（ファルマシア
社製）カラム（直径２．６ｃｍ×高さ９２ｃｍ）でゲル
濾過した。本発明の蛋白質は溶出分子量が約２５ｋｄ付
近にピークを有する画分、即ち約１００ｍｌの粗精製液
IVとして、４０〜６０％の回収率で回収された。

【００５５】粗精製液IVに最終濃度１Ｍとなるように硫
酸アンモニウムを加えた後、フェニルセファロース（フ
ァルマシア社製）カラム（直径１．６ｃｍ×高さ５ｃ
ｍ）に吸着させ、予め１Ｍ硫酸アンモニウムを含むｐＨ
７．０の１０ｍＭ燐酸緩衝液４０ｍｌで洗浄した後、１
〜０Ｍの硫酸アンモニウムの塩濃度を減少させる直線濃
度勾配による溶出、続いて５０％エタノールによる溶出
を行った。流速は２０ｍｌ／時間で行った。本蛋白質は
０．４〜０Ｍの硫酸アンモニウム濃度画分並びに５０％
エタノール画分に溶出され、即ち２０ｍｌの粗製***Ｖ
として２０〜４０％の回収率で回収された。

【００５６】粗製***Ｖを予めｐＨ６．０の２０ｍＭ燐
酸緩衝液に透析して緩衝液交換を行い、これを予め同緩
衝液で十分に平衡化したｍｏｎｏＳ ＨＲ５／５（ファ
ルマシア社製）カラムに吸着させた。１０ｍｌの同緩衝
液で洗浄した後、同緩衝液中で０〜１Ｍの食塩濃度の直
線濃度勾配による溶出を行なった。流速は６０ｍｌ／時
間で行なった。本蛋白質は食塩濃度が０．１５〜０．３
Ｍの間にピークを有する画分、即ち約７ｍｌの粗製***
VIとして１０〜３０％の回収率で回収された。同画分の
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析から、同画分に含ま
れる本発明の蛋白質として２５±２ｋｄの分子量をもつ
蛋白質である本物質を同定した。

【００５７】更に、同物質をβ−メルカプトエタノール
存在化、３分間煮沸処理した還元サンプルをＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで解析したところ１４±２ｋｄの分子量を示し
た。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを図１に、還元ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを図２に示した。尚、分子量は、分子量マーカー
ＬＭＷｋｉｔＥ（９４ｋｄ：ホスホリラーゼｂ、６７ｋ
ｄ：アルブミン、４３ｋｄ：オブアルブミン、３０ｋ
ｄ：カーボニックアンヒドラーゼ、２０ｋｄ：トリプシ
ンインヒビター、１４ｋｄ：α−ラクトアルブミン）
（ファルマシア社製）を用いて決定した。

【００５８】粗精製液VIを予め０．１％ＴＦＡを含む０
〜１００％のアセトニトリル濃度の直線濃度勾配で十分
に洗浄したＡｓａｈｉｐａｋ Ｃ８Ｐ−５０（旭化成社
製）（直径４．６ｍｍ×高さ１５ｃｍ）に吸着させ、
０．１％ＴＦＡを含む０〜１００％のアセトニトリル濃
度の直線濃度勾配による溶出を行い、アセトニトリル７
０〜８０％に単一に溶出されるピークを凍結乾燥して本
物質約１０μｇを得た。

【００５９】実施例３ 新規な蛋白質のアミノ酸配列の
決定 実施例２に記した方法により単離した本物質１０μｇを
ＤＥＶＥＬＯＳＩＬＮ．Ｐ．ＯＤＳ−２（野村化学社
製）（直径４ｍｍ×高さ１０ｍｍ）カラムに吸着させ、
０．０５％ＴＦＡを含む１０〜９０％のアセトニトリル
濃度のアセトニトリル−水の直線濃度勾配による溶出を
行ない、単一ピークを得た。このピークを凍結乾燥し、
気相シークエンサー（島津製作所、ＰＳＱ−１システ
ム）に導入し本物質のＮ末端アミノ酸配列の決定を行な
った。確認されたアミノ酸配列を以下に示す。

【００６０】 アミノ酸配列 Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ− Ｘ −Ｐｒｏ−Ｌｅｕ （但し、Ｘは不明のアミノ酸） 更に、本物質１０μｇを２Ｍ尿素を含む１００ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．２の緩衝液に溶解し、リジル
エンドペプチダーゼ（Ｌｙｓｙｌ Ｅｎｄｏｐｅｐｔｉ
ｄａｓｅ）（和光純薬社製）を１μｇ加えて３７℃、一
晩反応させ、本物質をフラグメント化した。反応液をＤ
ＥＶＥＬＯＳＩＬ Ｎ．Ｐ．ＯＤＳ−２（野村化学社
製）（直径４ｍｍ×高さ１０ｍｍ）カラムに吸着させ、
０．０５％ＴＦＡを含む１０〜９０％のアセトニトリル
濃度の直線濃度勾配による溶出を行ない、フラグメント
を分離溶出した。この結果、１５〜４０％アセトニトリ
ル濃度の範囲に、ピーク１〜３の３つの溶出ピークを得
た。各ピークを凍結乾燥し、気相シークエンサー（島津
製作所、ＰＳＱ−１システム）に導入しアミノ酸配列の
決定を行なった。

【００６１】アミノ酸配列を確認できたフラグメントの
アミノ酸配列を記す。 ピーク１のアミノ酸配列 Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ− Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ ピーク２のアミノ酸配列 Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ− Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ− Ｘ − Ｙ −Ｖａｌ−Ｐｒｏ− Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ− Ｇｌｎ−Ｌｙｓ （但し、Ｘ、Ｙは不明のアミノ酸） ピーク３のアミノ酸配列 Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ− Ｘ −Ｐｒｏ−Ｌｅｕ （但し、Ｘは不明のアミノ酸） ピーク３から得られたアミノ酸配列は先に決定した該蛋
白質のＮ末端アミノ酸配列と一致した。

【００６２】実施例４ 新規な蛋白質の遺伝子配列の決
定 （１）実施例３で得た活性酸素産生抑制因子のアミノ酸
配列に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドＭ１
ａ、Ｍ２ａを下記のように合成した。オリゴヌクレオチ
ドの合成は、ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステム
ズ社製：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用
いて添付のプロトコールに従って行なった。 Ｍ１ａ：ＡＧＧ（Ａ）ＴＣＧ（Ａ）ＴＣＧ（Ａ）ＴＡＮＧＴＴ（Ｃ）ＴＧ Ｍ２ａ：ＴＴＴ（Ｃ）ＴＧＴ（ＧＡ）ＡＴＮＡＧＮＡＣＣＡＴ （但しＮは任意のヌクレオチド） Ｍ１ａ、Ｍ２ａの両オリゴヌクレオチドを各々マニアテ
ィスらの実験書（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））に記載された方法
に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとγ−³²Ｐ−Ａ
ＴＰを用いてラベルし、以下に述べるハイブリダイゼー
ション実験のプローブとした。

【００６３】（２）実施例１に記した方法により培養し
たヒト胎児肺細胞（１．５×１０⁸ 細胞）を５００ｍｌ
のＰＢＳ（ホスフェート・バッファードセーライン、
０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む１０ｍＭホスフェートバッ
ファー、ｐＨ７．０）に懸濁し、遠心により２度洗浄し
てから、２４ｍｌのグアニジン溶液（６Ｍ Ｇｕａｎｉ
ｄｉｎｅ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ、１０ｍＭ
Ｎａ−Ｃｉｔｒａｔｅ ｐＨ７．０、０．５％Ｓａｒｋ
ｏｓｙｌ、０．１Ｍβメルカプトエタノール）に懸濁し
た。次に細胞懸濁液２．５ｍｌに対して１ｇの塩化セシ
ウムを加えた後、５．７Ｍの塩化セシウム溶液１２ｍｌ
を入れた遠心チューブに重層した。２０℃下、２７Ｋｒ
ｐｍ、１７時間遠心後、沈澱を滅菌水に溶解し等量のク
ロロホルム／ブタノール（４：１）で抽出した。２．５
倍容のエタノールを加えてＲＮＡを沈澱させた後滅菌水
に溶解した。こうして約１ｍｇのＲＮＡを得た。

【００６４】次に、このＲＮＡ全量をｍＲＮＡ Ｐｕｒ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ファルマシア社製）を用
い、添付のプロトコールに従ってオリゴｄＴセルロース
カラムにより精製し、４０μｇのｍＲＮＡを得た。

【００６５】（３）（２）で調製したｍＲＮＡ２μｇか
らＧｕｂｌｅｒ，Ｕ．＆Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｂ．Ｊ．
（Ｇｅｎｅ ２５，２６３，１９８３）の方法による、
ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ベーリンガーマ
ンハイム社製）を用い添付のプロトコールに従って二重
鎖ｃＤＮＡを作製した。即ち、ｍＲＮＡを鋳型として逆
転写酵素により一本鎖ｃＤＮＡを合成した。次にこのｍ
ＲＮＡ、ｃＤＮＡハイブリッドに対しリボヌクレアーゼ
Ｈでニックとギャップを形成した後、大腸菌ＤＮＡポリ
メラーゼＩによってｍＲＮＡをＤＮＡに置き換え二重鎖
ｃＤＮＡを合成し、さらに、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを
用いて末端を平滑にした二重鎖ｃＤＮＡを作製した。
０．４μｇの二重鎖ｃＤＮＡを得た。

【００６６】（４）（３）で調製した二重鎖ｃＤＮＡ
０．１μｇから、λファージλｇｔ１０を用いたｃＤＮ
Ａクローニングシステム（アマシャム社製）を用い、添
付のプロトコールに従って約２０万クローンのλｇｔ１
０組換え体からなるｃＤＮＡライブラリーを作製した。
即ち、ｃＤＮＡ０．１μｇにＴ４ＤＮＡリガーゼを用い
てＥｃｏＲＩアダプターを連結した。過剰のアダプター
をＳｉｚｅＳｅｐ^TM４００スパンカラム（ファルマシア
社製）を用いて除いた後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼでｃＤＮＡの末端をリン酸化した。

【００６７】次に、リン酸化したｃＤＮＡ０．１μｇに
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてλｇｔ１０ＥｃｏＲＩアー
ムを連結し、パッケージングエクストラクトＡ、Ｂを用
いてパッケージングしλｇｔ１０組換え体を作製した。
ＳＭバッファー（０．１ＭＮａＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ
₄ ・７Ｈ₂ Ｏ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、０．０１％ｇｅｌａｔｉｎ）で５００μｌに希釈
し、λｇｔ１０ファージ溶液とした。ファージ溶液の一
部をとり数種の希釈度で希釈したものを、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＮＭ５１４から作製したファージプレーティングセル
に感染させ、Ｌ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エ
キス、０．５％ＮａＣｌ）の寒天プレートにプラークを
形成させることによりタイトレーションした結果、タイ
ターは４×１０⁵ ｐｆｕ／ｍｌとなり、約２ｘ１０⁵ ク
ローンのλｇｔ１０組換え体からなるｃＤＮＡライブラ
リーが作製できたことが確認された。

【００６８】（５）（４）で得たλｇｔ１０組換え体約
１０万クローンを、（１）で合成したオリゴヌクレオチ
ドプローブＭ１ａ、Ｍ２ａを用いてプラークハイブリダ
イゼーションによりスクリーニングし３個のポジティブ
クローンを得た。即ち、（４）で得られたファージ溶液
の２５０μｌをＥ．ｃｏｌｉ ＮＭ５１４に感染させて
Ｌ培地の寒天プレート上に形成させた１×１０⁵ 個のプ
ラークを、ベントンらの方法（Ｂｅｎｔｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９７７）１９６，１８０−１
８２）に従ってニトロセルロースフィルターに転写し、
アルカリ変性、中和処理を行ない、ＤＮＡを固定した。

【００６９】次いで、（１）で作製したＭ１ａプローブ
と以下に述べる条件でハイブリダイゼーションを行なっ
た。ハイブリダイゼーションは、６×ＳＥＴ（２０×Ｓ
ＥＴ：３Ｍ ＮａＣｌ、０．４Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．８）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）、１０×デンハ
ーツ（１００×デンハーツ：フィコール１０ｇ、ポリビ
ニルピロリドン１０ｇ、牛血清アルブミン１０ｇを水５
００ｍｌに溶解したもの）、０．１％ＳＤＳ（ＳＤＳ：
ドデシル硫酸ナトリウム）、１００μｇ／ｍｌ変性サケ
***ＤＮＡ、１×１０⁶ ｃｐｍ／ｍｌのＭ１ａプローブ
を含有する溶液を用いて４０℃で２時間行なった。

【００７０】次に、フィルターを６×ＳＳＣ（０．９Ｍ
ＮａＣｌ、９０ｍＭ クエン酸ナトリウム）溶液中、
室温で１５分間、ついで、同溶液中３９℃で１５分間洗
浄した。さらに、０．１％を含む２×ＳＳＣ溶液中、３
９℃で１５分間洗浄した。インテンシファイヤースクリ
ーンを用い、−８０℃で２４時間オートラジオグラフィ
ーを行なった結果、５個の陽性スポットが認められた。
陽性スポットに相応する寒天領域よりファージを抽出
し、再度上記の工程に従ってプラークハイブリダイゼー
ションを行ない５種の純化λｇｔ１０組換え体を得た。

【００７１】さらに、５種のλｇｔ１０組換え体を、Ｍ
２ａプローブを用いて上記の工程に従いプラークハイブ
リダイゼーションを行った。その結果、Ｍ１ａ、Ｍ２ａ
両プローブにハイブリダイズする３種のλｇｔ１０組換
え体が得られた。これら３種の組換え体からグロスバー
ガーらの方法（Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
（１９８７）１５，６７３７）に従ってλｇｔ１０組換
え体ＤＮＡを抽出し、それぞれＯＳＰ−Ｃ，Ｄ，Ｅと命
名した。

【００７２】（６）（５）で得られたλｇｔ１０組換え
体ＤＮＡのひとつであるＯＳＰ−ＤをＥｃｏＲＩで切断
後、アガロースゲル電気泳動を行ったところ約１．２ｋ
ｂのインサートｃＤＮＡが認められ、このｃＤＮＡ断片
を含むゲル断片を切りだした。ゲル断片から、ジーンク
リーン（ＧＥＮＥ・ＣＬＥＡＮ^TM、フナコシ社販）を用
いて添付のプロトコールに従いＤＮＡを抽出した。得ら
れた約１．２ｋｂのＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ１８（宝酒
造社製）のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングしてプラ
スミドｐＫＩ５とした。塩基配列決定のためにディレー
ションミュータント（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎ
ｔ）を作製した。

【００７３】ミュータントの作製にはキロシーケンス用
ディレーションキット（宝酒造社製）を用いた。各ミュ
ータントの塩基配列をサンガーらの方法（Ｓａｎｇｅ
ｒ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．（１９７７）７４，５４６３）によって決
定し、１．２ｋｂｃＤＮＡ断片の全塩基配列を決定し
た。決定した塩基配列を配列表の配列番号１０に示し
た。塩基配列の決定はＤＮＡ蛍光シーケンサー（アプラ
イドバイオシステム社製：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍ）を用い、添付のマニュアルに従って行なっ
た。

【００７４】本ＤＮＡ配列には１６番目に始まる開始コ
ドン（ＡＴＧ）から９４２番目で終わる終止コドン（Ｔ
ＧＡ）まで、３０８個のアミノ酸配列をコードし得るオ
ープンリーディングフレームが存在した。該オープンリ
ーディングフレームから翻訳したアミノ酸配列を配列表
の配列番号５に示した。更に、実施例３で得られた蛋白
質のＮ末端アミノ酸配列、及び内部の部分アミノ酸配列
を参考に該蛋白質のアミノ酸配列を決定した。決定した
アミノ酸配列を配列表の配列番号４に示した。ピーク
１、ピーク２、ピーク３の各ペプチド断片のアミノ酸配
列（それぞれ配列表：配列番号１，２，３）は、配列表
の配列番号４に示す該蛋白質のアミノ酸配列のそれぞれ
９２から１０７番目、６３から９１番目、１から９番目
の配列と一致することが明かとなった。

【００７５】該蛋白質のアミノ酸配列は配列表の配列番
号５に示されるアミノ酸配列の１９７から３０８番目の
アミノ酸残基に一致することから、該蛋白質は配列表の
配列番号５に示されるアミノ酸配列で表される該蛋白質
の前駆体蛋白質が、細胞内、或いは細胞外において修飾
作用を受けて配列表の配列番号５のＮ末端の１番目から
１９６番目のアミノ酸残基が切断されることによって生
成する蛋白質であることが示唆された。

【００７６】実施例５ プラスミドｐＫＩ９の構築 実施例４に記した方法によって得られる該蛋白質の遺伝
子を動物細胞に導入するためのプラスミドｐＫＩ９を、
マルコス作製法（ＩＫＥＤＡ．Ｈ ｅｔ ａｌ．，ＧＥ
ＮＥ（１９８８）７１，１９−２７）に従って構築し
た。工程を図３〜図５に示し、以下に該工程を説明す
る。 （１）〔図３〕 まず、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１
４６）をＰｖｕIIとＢａｍＨＩで切断後、アガロースゲ
ル電気泳動に供し、ジーンクリーンを使用して約２ｋｂ
のＳＶ４０初期プロモーター（Ｐ．ｅ．）、ｄｈｆｒ遺
伝子、スモールＴイントロン、及びポリＡ付加シグナル
からなるＤＮＡ断片を分離精製した。

【００７７】一方、ｐＵＣ１８（宝酒造社製）をＨｉｎ
ｄ IIIで切断後、ＤＮＡブランティングキット（宝酒造
社製）を用い、添付のプロトコールに従って切断面を平
滑末端化した。次いでＢａｍＨ Iで切断してできたＢａ
ｍＨ I−Ｈｉｎｄ III（平滑末端化済み）間に、前記の
ｄｈｆｒ遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入してプラスミド
ｐｍＨＢ１を得た。次に、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆ
ｒをＰｖｕIIとＨｉｎｄ IIIで切断後、アガロースゲル
電気泳動に供し、ジーンクリーンを使用して０．３ｋｂ
のＳＶ４０初期プロモーターを含むＤＮＡ断片を分離精
製し、該断片をＤＮＡブランティングキットを使用して
切断面を平滑末端化した。該ＳＶ４０初期プロモーター
ＤＮＡ断片をプラスミドｐｍＨＢ１のＳｍａＩ部位に挿
入した。該ＳＶ４０初期プロモーターがｐｍＨＢ１に既
に存在しているＳＶ４０初期プロモーターと同方向に挿
入されたプラスミドを単離し、発現単位作製用カセット
プラスミドｐｍＨＢ２とした。

【００７８】（２）〔図４〕 コスミドベクターｐＬＡＦＲ１（ＡＴＣＣ３７１６７）
をＢｇｌIIで切断し、ＣＯＳ部位を有する約１．６ｋｂ
の断片を分離精製した。該ＤＮＡ断片と、ＢａｍＨＩで
切断しアルカリフォスファターゼ処理を施したｐｍＨＢ
１〔前記（１）参照〕とをＴ４リガーゼで連結すること
によりｐＣＤを得た。次いで、プラスミドｐＳＶ２−ｎ
ｅｏ（ＡＴＣＣ３７１５０）をＳｍａＩとＢｇｌIIで切
断して、ネオマイシン耐性遺伝子を有する約１ｋｂの断
片を分離精製し、ＤＮＡブランティングキットを用いて
切断面を平滑末端化した。該ＤＮＡ断片を、Ｈｉｎｄ I
IIとＢｇｌIIで切断しｄｈｆｒ遺伝子を取り除いた後切
断面を平滑末端化したｐＣＤとＴ４リガーゼで連結させ
た。該ネオマイシン耐性遺伝子がＳＶ４０初期プロモー
ターと同方向に挿入されたプラスミドを単離し、コスミ
ドベクターｐＣＮとした。

【００７９】（３）〔図５〕 実施例４に記した方法によって得た、該蛋白質をコード
するＤＮＡの一つＯＳＰ−Ｄを有するプラスミドｐＫＩ
５を、Ａｌｗ４４Ｉで切断した後、切断面を平滑末端化
した。次に、ＥｃｏＲＩで消化後、アガロースゲル電気
泳動に供し、約１ｋｂの該蛋白質をコードする遺伝子断
片をジーンクリーンを用いて分離精製した。該ＤＮＡ断
片をＭ１３ｍｐ１９（宝酒造社製）のＥｃｏＲＩ−Ｓｍ
ａＩに挿入する事によりｐＫＩ６を得た。次に、Ｅｃｏ
ＲＩで消化した後、Ｂａｌ３１で末端を消化して該蛋白
質遺伝子の５’末端側に存在するλｇｔ１０ＥｃｏＲＩ
アダプター由来の翻訳開始コドンＡＴＧを取り除き、断
面を平滑末端化してＨｉｎｄ IIIリンカー（宝酒造社
製）を挿入して再環状化させた。この様にして得たｐＫ
Ｉ７をＨｉｎｄ III、ＢａｍＨＩ両消化酵素を用いて消
化することにより５’末端側にＨｉｎｄ III切断部位
を、３’末端側にＢａｍＨＩ切断部位を有する該蛋白質
をコードするＤＮＡフラグメントが得られた。

【００８０】該ＤＮＡフラグメントを、ｐｍＨＢ２〔前
記（１）参照〕のＨｉｎｄ III、ＢｇｌII部位に挿入し
た。この操作によって得られたプラスミドをｐＫＩ８と
した。ネオマイシン耐性遺伝子を有するコスミドベクタ
ーｐＣＮ（前記（２）参照）をＳｆｉＩで切断したフラ
グメントと、プラスミドｐＫＩ８をＳｆｉＩで切断して
得た該蛋白質遺伝子の発現単位である約２．３ｋｂのフ
ラグメントを、重量比で約１対２０の割合で混ぜて連結
させた。次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングキッ
トＧｉｇａｐａｋ ｇｏｌｄ（東洋紡績社販）を用いて
パッケージング後大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。得
られたコロニーからプラスミドを調製し、アガロースゲ
ル電気泳動によりプラスミドのサイズを同定したとこ
ろ、該蛋白質遺伝子の発現単位を約２０単位有する約５
０ｋｂのプラスミドｐＫＩ９が得られた。

【００８１】実施例６ プラスミドによるＣＨＯ細胞の
形質転換 ＣＨＯ−ＤＸＢ１１株（Ｃｈａｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９
８０）７７，４２１６）をＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
〔ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ（１９８７−１９９３）〕ＵＮＩＴ９．４
に記載の方法に従って形質転換した。具体的にはＤＯＴ
ＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて形質転換
させた。

【００８２】すなわち、実施例５に記した方法で得た発
現プラスミドｐＫＩ９、５μｇ及びｐＳＶ２−ｄｈｆｒ
（ＡＴＣＣ ３７１４６）０．５μｇを混合してエタノ
ール沈澱し、風乾後１００μｌのＨＢＳ（２０ｍＭ Ｈ
ｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解
した。３０μｌのｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ−ｒｅａｇ
ｅｎｔ（ベーリンガーマンハイム社製）を７０μｌのＨ
ＢＳで希釈した後、ＤＮＡ−ＨＢＳ溶液と混合した。１
０分間室温に放置した後、５．８ｍｌの１０％（ｖ／
ｖ）ＦＣＳを含むＨａｍ’ｓ Ｆ−１２培地（フローラ
ボラトリー社製）と混合した。一方、形質転換前日に直
径６ｃｍの細胞培養用ディッシュに５×１０⁵ 個／ディ
ッシュとなるようにＣＨＯ細胞を蒔き一夜培養した。培
地を吸引した後、前述のプラスミドＤＮＡを含むＨａ
ｍ’ｓ Ｆ−１２培地を加えて３７℃で４〜５時間培養
した。培地を新鮮な培地に交換して更に２４時間培養し
た。

【００８３】ディッシュに付着した細胞を０．２５％ト
リプシン、０．０２％ＥＤＴＡ溶液を用いてはがし直径
１０ｃｍの培養用ディッシュに１０〜１００倍に希釈し
て培養した。２４時間後選択培地に交換した。選択培地
の組成は１０％の透析済ＦＣＳを含むＤＭＥＭに、４０
０μｇ／ｍｌになるようにジェネティシンＧ−４１８
（ギブコ社製）を添加したものである。３〜４日おきに
培地交換を行いながら約２週間培養してトランスフォー
ムした細胞をクローニングし、３株の形質転換体を得
た。３株の形質転換体の一つをＯＳＰ−Ａ１（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４５６２）と命名した。

【００８４】実施例７ 遺伝子組換え型該蛋白質の生産 ３リットル容量のスピンナーフラスコに４ｇの旭化成マ
イクロキャリア（旭化成社製）を加えた、８％のウシ血
清（以下ＣＢＳと略する）（ハイクローン社製）を含む
ＤＭＥＭ（ギブコ社製）培地１．２ｌを入れ、毎分２５
回転で撹拌させた。これにＯＳＰ−Ａ１（実施例６参
照）３．５×１０⁸ 個を播種して接着を行った。接着完
了後、同培地を０．８ｌ加え培養液量を２ｌとして一晩
培養してから潅流培養を開始した。細胞密度が５×１０
⁶ 個／ｍｌとなったところでＣＢＳ濃度を０．５％に落
とした生産用培地に置き換え、５日間生産培養を行い１
０ｌの培養液を得た。

【００８５】実施例８ 遺伝子組換え型該蛋白質の精製 実施例７に記載した方法で作製した組換え型該蛋白質を
含む培養液１０l に１０分の１量の２００ｍＭ燐酸緩衝
液（ｐＨ６）を加え、更に塩酸によってｐＨ６に合わせ
た後、ＳＰセファロースＦ．Ｆ．（ファルマシア社製）
カラム（直径５ｃｍ×高さ１５ｃｍ）クロマトグラフィ
ーに供した。即ちＳＰセファロースＦ．Ｆ．カラムクロ
マトグラフィーに通し、０．１ＭのＮａＣｌを含む２０
ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６）で洗浄後、０．４ＭのＮａＣ
ｌを含む２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６）で溶出して粗精
製液Ａとした。

【００８６】粗精製液Ａに最終濃度１Ｍとなるように硫
酸アンモニウムを加えた後、フェニルセファロースＦ．
Ｆ．（ファルマシア社製）カラム（直径５ｃｍ×高さ５
ｃｍ）クロマトグライーに供した。即ち、１Ｍ硫酸アン
モニウムを含む２０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７）で洗浄
後、１〜０Ｍの硫酸アンモニウムの直線濃度勾配による
溶出を行った。各溶出画分をポリアクリルアミド濃度１
５−２５％のグラジェントを用いるＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行い、２Ｄ−銀染色試薬・II「第
一」（第一化学薬品社製）によって染色した。バンドを
観察して該組換え型本発明の蛋白質が認められる画分を
プールして粗精製液Ｂとした。

【００８７】粗精製液Ｂを限外濾過中空糸（旭化成社
製）を用いて約２０倍に濃縮した後、セファクリルＳ−
２００（ファルマシア社製）カラム（直径２．６ｃｍ×
高さ９０ｃｍ）でゲル濾過した。溶出画分を銀染色によ
って観察したところ該組換え型本発明の蛋白質を単一の
バンドで含む画分が認められた。

【００８８】実施例９ 抗Ｍ２抗体の作製 まず、配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列で表さ
れる本発明の蛋白質の部分ペプチドを有する、下記のア
ミノ酸配列で示されるＭ２ペプチドを化学合成した。合
成はペプチド合成機（アプライドバイオシステムズ社
製）を使用し、添付のプロトコールに従って行なった。 アミノ酸配列 Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ 該Ｍ２ペプチドをキャリアー蛋白質であるキーホールリ
ンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合させ複合体とし
た。即ち、該Ｍ２ペプチドとＫＬＨを重量比で約１対２
０で混合し、ｐＨ７．３で３時間反応させることによっ
て複合体を作製した。

【００８９】次に、該複合体をウサギに免疫することに
より抗Ｍ２ペプチド抗体を得た。即ち、ウサギに、１回
に該Ｍ２ペプチド複合体１ｍｇを１ｍｌの生理食塩水及
びフロイント完全アジュバンド（ＦＣＡ）に乳化して、
皮下または皮内の数カ所に４週間おきに５回接種した。
最終接種後１０日めに耳静脈から採血し、遠心分離して
抗Ｍ２抗体を得た。該Ｍ２抗体が本発明の蛋白質の少な
くとも一部と特異的に結合することを参考例１に方法を
記載したウェスタンブロッティングにより確認した。

【００９０】参考例１ 新規な蛋白質のウェスタンブロ
ッティングを用いた検出 該蛋白質は該蛋白質と特異的に結合する抗該蛋白質抗体
を用いたウェスタンブロッティングにより検出すること
ができる。具体的にはＥＣＬウェスタンブロッティング
アナリシスシステム（アマシャム社製）を用いて添付の
プロトコールに従って行なった。以下に概要を示す。該
蛋白質、或いは該蛋白質を含む混合物を、βメルカプト
エタノール存在化で３分間煮沸した後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって分離する。分離した蛋白質をゲルからウェスタ
ンブロッティングシステム（バイオラッド社製）を用い
添付のプロトコールに従ってハイボンドＥＣＬ膜（アマ
シャム社製）に転写する。

【００９１】該膜を１０％（ｗ／ｖ）のスキムミルクを
含むトリス緩衝液（２０ｍＭトリス、１３７ｍＭ塩化ナ
トリウム、０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０（バイ
オラッド社製）、ｐＨ７．６）中でブロッキングした
後、０．１％（ｖ／ｖ）の抗Ｍ２抗体（実施例９参照）
と０．５％（ｗ／ｖ）のスキムミルクを含むトリス緩衝
液中で反応させて一次抗体を結合させる。反応後、トリ
ス緩衝液で洗浄後、０．１％（ｖ／ｖ）のホースラディ
ッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ウサギＩｇ抗
体（アマシャム社製）を含むトリス緩衝液中で反応させ
て二次抗体で結合させる。

【００９２】次に、トリス緩衝液で洗浄後、ディテクシ
ョンリージェント（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎ
ｔｓ）で反応させた膜を、ハイパーフィルムＥＣＬ（ア
マシャム社製）に露光し、フィルムを現像することによ
って該蛋白質のブロッティング像を得ることができる。
該蛋白質の前駆体蛋白質（実施例４参照）は３０ｋｄ付
近に、該蛋白質は１４ｋｄ付近にバンドとして検出され
る。該蛋白質の遺伝子を含有する発現プラスミドで形質
転換した動物細胞の培養上清をウェスタンブロッティン
グにより解析し、該培養上清中に分泌される該蛋白質、
並びに該前駆体蛋白質を検出した例を一例として図６に
示した。このようにしてウェスタンブロッティングを指
標にして、該蛋白質を各種精製ソースから精製すること
が可能である。

【００９３】実施例１０ 活性酸素産生抑制活性 実施例８に記載した方法で作製した組換え型本発明の蛋
白質の好酸球における活性酸素産生抑制活性を、参考例
２に記載した活性酸素産生抑制活性測定法で測定した。
その結果を図７に示す。

【００９４】参考例２ 好酸球における活性酸素産生抑
制活性測定法 本発明によって得られる新規な蛋白質の好酸球における
活性酸素産生抑制活性は下記の方法で測定した。 （１）モルモット好酸球の誘導及び精製 モルモット（ハートレー系、オス、３００〜３５０ｇ）
（チャールズリバー社販）１匹当たり、１週間に１ｍｌ
の馬血清の腹腔内投与を行った。８週以上投与したモル
モットを最終投与の翌日にエーテル麻酔し、腹腔内に腹
腔洗浄液（０．８５％ ＮａＣｌ、０．４％ クエン酸
ナトリウム）５０ｍｌを注入してマッサージ後腹腔内液
を回収した。この操作を４回繰り返して約２００ｍｌの
腹腔内液を得た。

【００９５】回収した腹腔内液を卓上遠心機（クボタ社
製：形式８１００）で２００×ｇ、１０分間遠心した。
沈澱を３ｍｌの０．１％ＢＳＡを含むハンクス平衡塩液
（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌ
ｕｔｉｏｎ：ＨＢＳＳ）（ギブコ社製）に再懸濁した
後、０．２％ ＮａＣｌ溶液２０ｍｌを加えて溶血操作
を行った。室温で１分間静置した後、等量の１．６％Ｎ
ａＣｌ溶液を加えて等張に戻し、遠心、洗浄した。得ら
れた沈澱を１０％ＦＣＳを含む比重１．０７のＰｅｒｃ
ｏｌｌ液に懸濁し、比重１．１２３、１．０９のＰｅｒ
ｃｏｌｌ液の上に重層し、卓上遠心機（クボタ社製）で
１７００×ｇ、２０分間遠心した。比重１．１２３と
１．０９の間に形成された好酸球のバンドを回収し、洗
浄した後、適当量の０．１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳに懸
濁した。

【００９６】（２）活性酸素量の測定 ０．１％ＢＳＡを含むＨＢＳＳに溶解した、１６０μＭ
のチトクロームＣ１００μｌを分注した９６穴プレート
に、最終評価濃度の１０倍濃度の評価サンプル２０μｌ
と、３×１０⁶ 個／ｍｌの濃度の好酸球懸濁液１００μ
ｌを添加した。室温で１０分間静置した後、３７℃のイ
ンキュベーターで保温した状態で１０^-4Ｍのカルシウム
イオノフォアＡ２３１８７（和光純薬社製）を２０μｌ
加えて反応を開始する。１０分後、並びに２０分後の５
５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（バイオ
ラッド社製：Ｍｏｄｅｌ ２５５０）で測定した。

【００９７】実施例１１ プラスミドによるＣＯＳ−１
細胞の形質転換 ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）をＣｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ〔ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｂｙ Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９８７−１９９
３）〕ＵＮＩＴ９．２に記載の方法に従って形質転換し
た。

【００９８】即ち、ＣＯＳ−１細胞を直径１０ｃｍのプ
ラスチックディッシュ中に入れた１０％（ｖ／ｖ）のウ
シ胎児血清（以下ＦＣＳと略する）（ギブコ社製）を加
えたダルベッコ最小必須培地（以下ＤＭＥＭと略する）
（フローラボラトリー社製）を用いて、３７℃で５％炭
酸ガスインキュベーター中で対数増殖期になるまで培養
した。形質転換前日に０．１％トリプシン及び０．０２
％ＥＤＴＡを用いてディッシュに付着増殖した細胞をは
がして、１×１０⁶ 個／ディッシュとなるようにして再
度ディッシュに蒔いた。実施例５に記した方法で得た発
現プラスミドｐＫＩ９、５〜１０μｇを６０μｌのＴＢ
Ｓ〔Ａ溶液（ＮａＣｌ ８０ｇ／ｌ、ＫＣｌ ３．８ｇ
／ｌ、Ｎａ₂ ＨＰＯ₄ ２ｇ／ｌ、Ｔｒｉｓｂａｓｅ３０
ｇ／ｌ、ｐＨ７．５）１０ｍｌ、Ｂ溶液（ＣａＣｌ₂ １
５ｇ／ｌ、ＭｇＣｌ₂ １０ｇ／ｌ）１ｍｌ、Ｈ₂ Ｏ ８
９ｍｌ〕に溶解した後、１２０μｌのＤＥＡＥ−ｄｅｘ
ｔｒａｎ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）に撹拌しながら滴下し
た。

【００９９】得られたＤＮＡ／ＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａ
ｎを均一にディッシュに滴下し、３７℃インキュベータ
ー内で一晩培養した。翌日、ディッシュ上に形質転換細
胞と非形質転換細胞の混合細胞を得ることができた。培
地をウシ胎児血清を含まないＤＭＥＭに交換し、３〜５
日間培養することにより培養上清中に本発明の蛋白質を
産生させることができた。該培養上清中に産生された本
発明の蛋白質は、培養上清を参考例１に記載の方法に従
ってウェスタンブロッティングを行うことによって検出
された。本実施例において作製した形質転換細胞は、数
日のうちに死亡した。

【０１００】

【適用例】以下に本発明の新規な蛋白質の適用例を応用
例をもって説明するが、本発明はそれら応用例をもって
何ら限定されるものではない。 応用例１ 本発明品 １ｍｇ 精製ゼラチン ２０ｍｇ マンニトール １００ｍｇ 塩化ナトリウム ７．８ｍｇ リン酸ナトリウム １５．４ｍｇ 上記成分を注射用蒸留水２ｍｌに溶解し、無菌バイアル
に入れ、−３５℃で真空度０．０７５Ｔｏｒｒで３５時
間一次乾燥し、次いで３０℃、真空度０．０３Ｔｏｒｒ
で５時間二次乾燥して、注射用バイアルを製造した。得
られた組成物は、投与直前に生理食塩水もしくはブドウ
糖注射液５００ｍｌに溶解して点滴静注するのに用いら
れる。

【０１０１】応用例２ 本発明品 １０μｇ アルブミン ５ｍｇ マンニトール ２５ｍｇ 塩化ナトリウム １．９５ｍｇ リン酸ナトリウム ３．８５ｍｇ 上記成分にて、応用例１と実質的に同様の方法により注
射用バイアルを製造した。

【０１０２】

【発明の効果】本発明の新規な蛋白質は、活性酸素産生
抑制活性を有する。本発明の新規な蛋白質は気管支喘息
等の疾患の予防及び治療に有効に用いることができる。

【配列表】

【０１０３】配列番号：１ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys 1 5 10 15

【０１０４】配列番号：２ 配列の長さ：２９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Xaa Xaa 1 5 10 15 Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys 20 25

【０１０５】配列番号：３ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Arg Asn Gly Asp His Xaa Pro Leu 1 5

【０１０６】配列番号：４ 配列の長さ：１１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg 1 5 10 15 Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp 20 25 30 Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys 35 40 45 Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser 50 55 60 Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val 85 90 95 Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 110

【０１０７】配列番号：５ 配列の長さ：３０８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg Thr Leu Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu 1 5 10 15 Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Leu Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Leu 20 25 30 Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro Gly Pro Ser Glu Leu His Ser 35 40 45 Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu 50 55 60 Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Ser Trp Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu 65 70 75 80 Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly 85 90 95 Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu 100 105 110 Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Leu His Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser 115 120 125 Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln 130 135 140 Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro Ala Leu His Leu Arg Leu Ser 145 150 155 160 Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp Gln Leu Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala 165 170 175 Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg 180 185 190 Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly 195 200 205 Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly 210 215 220 Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys 225 230 235 240 Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln 245 250 255 Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro 260 265 270 Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr 275 280 285 Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp 290 295 300 Cys His Cys Ile 305

【０１０８】配列番号：６ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGRTCRTCRT ANGTYTG

【０１０９】配列番号：７ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTYTGDATNA GNACCAT

【０１１０】配列番号：８ 配列の長さ：３３９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：ヒト 細胞の種類：ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｌｕｎ
ｇ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１．．３３９ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GCG CGC AAC GGG GAC CAC TGT CCG CTC GGG CCC GGG CGT TGC TGC CGT 48 Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg 1 5 10 15 CTG CAC ACG GTC CGC GCG TCG CTG GAA GAC CTG GGC TGG GCC GAT TGG 96 Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp 20 25 30 GTG CTG TCG CCA CGG GAG GTG CAA GTG ACC ATG TGC ATC GGC GCG TGC 144 Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys 35 40 45 CCG AGC CAG TTC CGG GCG GCA AAC ATG CAC GCG CAG ATC AAG ACG AGC 192 Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser 50 55 60 CTG CAC CGC CTG AAG CCC GAC ACG GTG CCA GCG CCC TGC TGC GTG CCC 240 Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro 65 70 75 80 GCC AGC TAC AAT CCC ATG GTG CTC ATT CAA AAG ACC GAC ACC GGG GTG 288 Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val 85 90 95 TCG CTC CAG ACC TAT GAT GAC TTG TTA GCC AAA GAC TGC CAC TGC ATA 336 Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 100 105 110 TGA 339

【０１１１】配列番号：９ 配列の長さ：９２７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：ヒト 細胞の種類：ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｌｕｎ
ｇ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１．．９２７ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 ATG CCC GGG CAA GAA CTC AGG ACG CTG AAT GGC TCT CAG ATG CTC CTG 48 Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg Thr Leu Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu -195 -190 -185 GTG TTG CTG GTG CTC TCG TGG CTG CCG CAT GGG GGC GCC CTG TCT CTG 96 Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Leu Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Leu -180 -175 -170 -165 GCC GAG GCG AGC CGC GCA AGT TTC CCG GGA CCC TCA GAG TTA CAC TCC 144 Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro Gly Pro Ser Glu Leu His Ser -160 -155 -150 GAA GAC TCC AGA TTC CGA GAG TTG CGG AAA CGC TAC GAG GAC CTG CTA 192 Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu -145 -140 -135 ACC AGG CTG CGG GCC AAC CAG AGC TGG GAA GAT TCG AAC ACC GAC CTC 240 Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Ser Trp Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu -130 -125 -120 GTC CCG GCC CCT GCA GTC CGG ATA CTC ACG CCA GAA GTG CGG CTG GGA 288 Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly -115 -110 -105 TCC GGC GGC CAC CTG CAC CTG CGT ATC TCT CGG GCC GCC CTT CCT GAG 336 Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu -100 -95 -90 -85 GGG CTC CCC GAG GCC TCC CGC CTT CAC CGG GCT CTG TTC CGG CTG TCC 384 Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Leu His Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser -80 -75 -70 CCG ACG GCG TCA AGG TCG TGG GAC GTG ACA CGA CCG CTG CGG CGT CAG 432 Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln -65 -60 -55 CTC AGC CTT GCA AGA CCC CAG GCG CCC GCG CTG CAC CTG CGA CTG TCG 480 Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro Ala Leu His Leu Arg Leu Ser -50 -45 -40 CCG CCG CCG TCG CAG TCG GAC CAA CTG CTG GCA GAA TCT TCG TCC GCA 528 Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp Gln Leu Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala -35 -30 -25 CGG CCC CAG CTG GAG TTG CAC TTG CGG CCG CAA GCC GCC AGG GGG CGC 576 Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg -20 -15 -10 -5 CGC AGA GCG CGT GCG CGC AAC GGG GAC CAC TGT CCG CTC GGG CCC GGG 624 Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly 1 5 10 CGT TGC TGC CGT CTG CAC ACG GTC CGC GCG TCG CTG GAA GAC CTG GGC 672 Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly 15 20 25 TGG GCC GAT TGG GTG CTG TCG CCA CGG GAG GTG CAA GTG ACC ATG TGC 720 Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys 30 35 40 ATC GGC GCG TGC CCG AGC CAG TTC CGG GCG GCA AAC ATG CAC GCG CAG 768 Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln 45 50 55 60 ATC AAG ACG AGC CTG CAC CGC CTG AAG CCC GAC ACG GTG CCA GCG CCC 816 Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro 65 70 75 TGC TGC GTG CCC GCC AGC TAC AAT CCC ATG GTG CTC ATT CAA AAG ACC 864 Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr 80 85 90 GAC ACC GGG GTG TCG CTC CAG ACC TAT GAT GAC TTG TTA GCC AAA GAC 912 Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp 95 100 105 TGC CAC TGC ATA TGA 927 Cys His Cys Ile 110

【０１１２】配列番号：１０ 配列の長さ：１２００ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：ヒト 細胞の種類：ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎａｌ ｌｕｎ
ｇ 配列の特徴 特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置：１６．．９４２ 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：ｐｏｌｙＡ ｓｉｔｅ 存在位置：１１８４．．１２００ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GCAACCTGCA CAGCC ATG CCC GGG CAA GAA CTC AGG ACG CTG AAT GGC 48 Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg Thr Leu Asn Gly -195 -190 TCT CAG ATG CTC CTG GTG TTG CTG GTG CTC TCG TGG CTG CCG CAT GGG 96 Ser Gln Met Leu Leu Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Leu Pro His Gly -185 -180 -175 -170 GGC GCC CTG TCT CTG GCC GAG GCG AGC CGC GCA AGT TTC CCG GGA CCC 144 Gly Ala Leu Ser Leu Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro Gly Pro -165 -160 -155 TCA GAG TTA CAC TCC GAA GAC TCC AGA TTC CGA GAG TTG CGG AAA CGC 192 Ser Glu Leu His Ser Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg -150 -145 -140 TAC GAG GAC CTG CTA ACC AGG CTG CGG GCC AAC CAG AGC TGG GAA GAT 240 Tyr Glu Asp Leu Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Ser Trp Glu Asp -135 -130 -125 TCG AAC ACC GAC CTC GTC CCG GCC CCT GCA GTC CGG ATA CTC ACG CCA 288 Ser Asn Thr Asp Leu Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu Thr Pro -120 -115 -110 GAA GTG CGG CTG GGA TCC GGC GGC CAC CTG CAC CTG CGT ATC TCT CGG 336 Glu Val Arg Leu Gly Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Ser Arg -105 -100 -95 -90 GCC GCC CTT CCT GAG GGG CTC CCC GAG GCC TCC CGC CTT CAC CGG GCT 384 Ala Ala Leu Pro Glu Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Leu His Arg Ala -85 -80 -75 CTG TTC CGG CTG TCC CCG ACG GCG TCA AGG TCG TGG GAC GTG ACA CGA 432 Leu Phe Arg Leu Ser Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Val Thr Arg -70 -65 -60 CCG CTG CGG CGT CAG CTC AGC CTT GCA AGA CCC CAG GCG CCC GCG CTG 480 Pro Leu Arg Arg Gln Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro Ala Leu -55 -50 -45 CAC CTG CGA CTG TCG CCG CCG CCG TCG CAG TCG GAC CAA CTG CTG GCA 528 His Leu Arg Leu Ser Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp Gln Leu Leu Ala -40 -35 -30 GAA TCT TCG TCC GCA CGG CCC CAG CTG GAG TTG CAC TTG CGG CCG CAA 576 Glu Ser Ser Ser Ala Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg Pro Gln -25 -20 -15 -10 GCC GCC AGG GGG CGC CGC AGA GCG CGT GCG CGC AAC GGG GAC CAC TGT 624 Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp His Cys -5 1 5 CCG CTC GGG CCC GGG CGT TGC TGC CGT CTG CAC ACG GTC CGC GCG TCG 672 Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser 10 15 20 CTG GAA GAC CTG GGC TGG GCC GAT TGG GTG CTG TCG CCA CGG GAG GTG 720 Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val 25 30 35 CAA GTG ACC ATG TGC ATC GGC GCG TGC CCG AGC CAG TTC CGG GCG GCA 768 Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala 40 45 50 55 AAC ATG CAC GCG CAG ATC AAG ACG AGC CTG CAC CGC CTG AAG CCC GAC 816 Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp 60 65 70 ACG GTG CCA GCG CCC TGC TGC GTG CCC GCC AGC TAC AAT CCC ATG GTG 864 Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val 75 80 85 CTC ATT CAA AAG ACC GAC ACC GGG GTG TCG CTC CAG ACC TAT GAT GAC 912 Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp 90 95 100 TTG TTA GCC AAA GAC TGC CAC TGC ATA TGAGCAGTCC TGGTCCTTCC 959 Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile 105 110 ACTGTGCACC TGCGCGGGGG ACGCGACCTC AGTTGTCCTG CCCTGTGGAA TGGGCTCAAG 1019 GTTCCTGAGA CACCCGATTC CTGCCCAAAC AGCTGTATTT ATATAAGTCT GTTATTTATT 1079 ATTAATTTAT TGGGGTGACC TTCTTGGGGA CTCGGGGGCT GGTCTGATGG AACTGTGTAT 1139 TTATTTAAAA CTCTGGTGAT AAAAATAAAG CTGTCTGAAC TGTTAAAAAA AAAAAAAAAA 1199 A 1200

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２で精製した本発明品の非還元ＳＤＳ−
ＰＡＧＥパターンの模式図を示したもので、レーン１は
分子量マーカー、レーン２は本精製標品である。

【図２】図１と同様に実施例２で精製した本発明品の還
元ＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンの模式図を示したもので、
レーン１はマーカー、レーン２は本精製標品である。

【図３】実施例５で作製した、本発明蛋白質の動物細胞
用発現プラスミドの構築の工程を示すものである。

【図４】図３に続く本発明蛋白質の動物細胞用発現プラ
スミドの構築の工程を示すものである。

【図５】図４に続く本発明蛋白質の動物細胞用発現プラ
スミドの構築の工程を示すものである。

【図６】参考例１に記載した方法で行った、動物細胞の
培養上清に分泌される本発明の蛋白質、並びに該蛋白質
の前駆体蛋白質の還元状態におけるウェスタンブロッテ
ィング像の一例を示す。該蛋白質は約１４ｋｄに、該蛋
白質の該前駆体蛋白質は約３０ｋｄ付近にバンドとして
検出される。隣に示した分子量は、同一フィルターにて
電気泳動した分子量マーカーの位置を表すものである。

【図７】実施例１０で測定した、本発明品の好酸球にお
ける活性酸素産生抑制効果を示すもので、横軸は反応時
間、たて軸は吸光度を示す。本発明品の濃度を５ｐｇ／
ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌの範囲で４段階に設定して測定した
ものである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＦ ＡＣＤ ＡＤＡ Ｃ１２Ｎ 5/10 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9161−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＦ ＡＣＤ ＡＤＡ 7729−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 9281−4Ｂ 15/00 ＺＮＡ Ａ (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記のアミノ酸配列を有するポリぺプチ
   ドから構成される蛋白質。 Ａｌａ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｌａ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｉｌｅ
2. 【請求項２】 該蛋白質が下記の分子量を有することを
   特徴とする請求項１に記載の蛋白質。 ２５０００±２０００（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測
   定） １４０００±２０００（還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定）
3. 【請求項３】 該蛋白質が好酸球における活性酸素産生
   を抑制する活性を有することを特徴とする請求項１に記
   載の蛋白質。
4. 【請求項４】 請求項１に記載の蛋白質をコードする遺
   伝子。
5. 【請求項５】 請求項１に記載の蛋白質をコードする遺
   伝子を含む塩基配列と、宿主細胞中で発現可能なベクタ
   ーＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡ体。
6. 【請求項６】 該蛋白質をコードする遺伝子を含む塩基
   配列が、下記の塩基配列を有することを特徴とする請求
   項５に記載の組換えＤＮＡ体。 ＧＣＧＣＧＣＡＡＣＧ ＧＧＧＡＣＣＡＣＴＧ ＴＣＣＧＣＴＣＧＧＧ ＣＣＣＧＧＧＣＧＴＴ ＧＣＴＧＣＣＧＴＣＴ ＧＣＡＣＡＣＧＧＴＣ ＣＧＣＧＣＧＴＣＧＣ ＴＧＧＡＡＧＡＣＣＴ ＧＧＧＣＴＧＧＧＣＣ ＧＡＴＴＧＧＧＴＧＣ ＴＧＴＣＧＣＣＡＣＧ ＧＧＡＧＧＴＧＣＡＡ ＧＴＧＡＣＣＡＴＧＴ ＧＣＡＴＣＧＧＣＧＣ ＧＴＧＣＣＣＧＡＧＣ ＣＡＧＴＴＣＣＧＧＧ ＣＧＧＣＡＡＡＣＡＴ ＧＣＡＣＧＣＧＣＡＧ ＡＴＣＡＡＧＡＣＧＡ ＧＣＣＴＧＣＡＣＣＧ ＣＣＴＧＡＡＧＣＣＣ ＧＡＣＡＣＧＧＴＧＣ ＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧ ＣＴＧＣＧＴＧＣＣＣ ＧＣＣＡＧＣＴＡＣＡ ＡＴＣＣＣＡＴＧＧＴ ＧＣＴＣＡＴＴＣＡＡ ＡＡＧＡＣＣＧＡＣＡ ＣＣＧＧＧＧＴＧＴＣ ＧＣＴＣＣＡＧＡＣＣ ＴＡＴＧＡＴＧＡＣＴ ＴＧＴＴＡＧＣＣＡＡ ＡＧＡＣＴＧＣＣＡＣ ＴＧＣＡＴＡＴＧＡ
7. 【請求項７】 該蛋白質をコードする遺伝子を含む塩基
   配列が、下記の塩基配列を有することを特徴とする請求
   項５に記載の組換えＤＮＡ体。 ＡＴＧＣＣＣＧＧＧＣ ＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧ ＧＡＣＧＣＴＧＡＡＴ ＧＧＣＴＣＴＣＡＧＡ ＴＧＣＴＣＣＴＧＧＴ ＧＴＴＧＣＴＧＧＴＧ ＣＴＣＴＣＧＴＧＧＣ ＴＧＣＣＧＣＡＴＧＧ ＧＧＧＣＧＣＣＣＴＧ ＴＣＴＣＴＧＧＣＣＧ ＡＧＧＣＧＡＧＣＣＧ ＣＧＣＡＡＧＴＴＴＣ ＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴ ＣＡＧＡＧＴＴＡＣＡ ＣＴＣＣＧＡＡＧＡＣ ＴＣＣＡＧＡＴＴＣＣ ＧＡＧＡＧＴＴＧＣＧ ＧＡＡＡＣＧＣＴＡＣ ＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣ ＴＡＡＣＣＡＧＧＣＴ ＧＣＧＧＧＣＣＡＡＣ ＣＡＧＡＧＣＴＧＧＧ ＡＡＧＡＴＴＣＧＡＡ ＣＡＣＣＧＡＣＣＴＣ ＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣ ＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧ ＧＡＴＡＣＴＣＡＣＧ ＣＣＡＧＡＡＧＴＧＣ ＧＧＣＴＧＧＧＡＴＣ ＣＧＧＣＧＧＣＣＡＣ ＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣ ＧＴＡＴＣＴＣＴＣＧ ＧＧＣＣＧＣＣＣＴＴ ＣＣＴＧＡＧＧＧＧＣ ＴＣＣＣＣＧＡＧＧＣ ＣＴＣＣＣＧＣＣＴＴ ＣＡＣＣＧＧＧＣＴＣ ＴＧＴＴＣＣＧＧＣＴ ＧＴＣＣＣＣＧＡＣＧ ＧＣＧＴＣＡＡＧＧＴ ＣＧＴＧＧＧＡＣＧＴ ＧＡＣＡＣＧＡＣＣＧ ＣＴＧＣＧＧＣＧＴＣ ＡＧＣＴＣＡＧＣＣＴ ＴＧＣＡＡＧＡＣＣＣ ＣＡＧＧＣＧＣＣＣＧ ＣＧＣＴＧＣＡＣＣＴ ＧＣＧＡＣＴＧＴＣＧ ＣＣＧＣＣＧＣＣＧＴ ＣＧＣＡＧＴＣＧＧＡ ＣＣＡＡＣＴＧＣＴＧ ＧＣＡＧＡＡＴＣＴＴ ＣＧＴＣＣＧＣＡＣＧ ＧＣＣＣＣＡＧＣＴＧ ＧＡＧＴＴＧＣＡＣＴ ＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡ ＡＧＣＣＧＣＣＡＧＧ ＧＧＧＣＧＣＣＧＣＡ ＧＡＧＣＧＣＧＴＧＣ ＧＣＧＣＡＡＣＧＧＧ ＧＡＣＣＡＣＴＧＴＣ ＣＧＣＴＣＧＧＧＣＣ ＣＧＧＧＣＧＴＴＧＣ ＴＧＣＣＧＴＣＴＧＣ ＡＣＡＣＧＧＴＣＣＧ ＣＧＣＧＴＣＧＣＴＧ ＧＡＡＧＡＣＣＴＧＧ ＧＣＴＧＧＧＣＣＧＡ ＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧ ＴＣＧＣＣＡＣＧＧＧ ＡＧＧＴＧＣＡＡＧＴ ＧＡＣＣＡＴＧＴＧＣ ＡＴＣＧＧＣＧＣＧＴ ＧＣＣＣＧＡＧＣＣＡ ＧＴＴＣＣＧＧＧＣＧ ＧＣＡＡＡＣＡＴＧＣ ＡＣＧＣＧＣＡＧＡＴ ＣＡＡＧＡＣＧＡＧＣ ＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣ ＴＧＡＡＧＣＣＣＧＡ ＣＡＣＧＧＴＧＣＣＡ ＧＣＧＣＣＣＴＧＣＴ ＧＣＧＴＧＣＣＣＧＣ ＣＡＧＣＴＡＣＡＡＴ ＣＣＣＡＴＧＧＴＧＣ ＴＣＡＴＴＣＡＡＡＡ ＧＡＣＣＧＡＣＡＣＣ ＧＧＧＧＴＧＴＣＧＣ ＴＣＣＡＧＡＣＣＴＡ ＴＧＡＴＧＡＣＴＴＧ ＴＴＡＧＣＣＡＡＡＧ ＡＣＴＧＣＣＡＣＴＧ ＣＡＴＡＴＧＡ
8. 【請求項８】 請求項５に記載した組換えＤＮＡ体によ
   り形質転換された細胞。
9. 【請求項９】 該蛋白質が請求項８に記載の細胞により
   生産された蛋白質。
10. 【請求項１０】 請求項１に記載の蛋白質を産生し得る
    細胞を培地にて培養し、産生された蛋白質を採取するこ
    とを特徴とする蛋白質の製造方法。
11. 【請求項１１】 請求項１に記載の蛋白質と特異的に結
    合することを特徴とする抗体。
12. 【請求項１２】 請求項１に記載の蛋白質を含有する、
    ヒトの好酸球に由来する活性酸素による組織傷害の治療
    用薬剤。