ES2299267T3

ES2299267T3 - Nueva proteina extracelular ligante de rage (en-rage) y sus usos.

Info

Publication number: ES2299267T3
Application number: ES99953081T
Authority: ES
Inventors: Ann Marie Schmidt; David Stern
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 1998-10-06
Filing date: 1999-10-06
Publication date: 2008-05-16
Anticipated expiration: 2019-10-06
Also published as: EP1121454A1; US20090228997A1; US6670136B2; HK1041293A1; JP2002526117A; US20020106726A1; ATE378418T1; EP1121454A4; US20040121372A1; WO2000020621A1; AU765719B2; AU6510099A; EP1121454B1; HK1041293B; CA2346217A1

Abstract

Un péptido aislado que tiene la secuencia N-terminal de aminoácidos mostrada en la Tabla 1 (ID. SEC. nº 2).

Description

Nueva proteína extracelular ligante de RAGE (EN-RAGE) y sus usos.

A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones por autor y fecha dentro del texto. Las citas completas de estas publicaciones se pueden hallar alfabéticamente enumeradas al final de las secciones de detalles experimentales para cada experimento.

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Antecedentes del invento

El receptor de AGE (RAGE) es un miembro de la superfamilia inmunoglobulínica de moléculas de la superficie celular (1-2). Originalmente identificado y caracterizado como un receptor celular de proteínas modificadas con glucosa (aldosa), o productos finales de glicosilación avanzada (AGEs; del inglés, advanced glycation endproducts) (3-13), del RAGE se ha comunicado posteriormente que interacciona con otros ligandos, tanto en escenarios de desarrollo normal como en la enfermedad de Alzheimer (14-16). En el desarrollo normal, RAGE interacciona con anfoterina, un polipéptido que media en la emergencia de neuritas en neuronas embrionarias en cultivo. En estos estudios, F(ab')_{2} anti-RAGE o RAGE soluble (sRAGE) inhibía la emergencia de neuritas en matrices revestidas con anfoterina pero no en matrices revestidas con otras sustancias tales como laminina y poli-1-lisina (3). En estudios posteriores, el RAGE fue identificado como un receptor, presente en neuronas y microglía, del péptido \beta amiloide, un polipéptido ligado a la patogénesis de la toxicidad neuronal y la muerte en la enfermedad de Alzheimer.

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Sumario del invento

El presente invento proporciona un péptido EN-RAGE (nueva proteína extracelular ligante de RAGE; en inglés, Extracellular Novel RAGE Binding Protein) humano aislado. El presente invento también proporciona un método para determinar si un compuesto es capaz de inhibir la interacción de un péptido EN-RAGE con un péptido RAGE, que comprende: (a) mezclar (i) un péptido RAGE o un péptido sRAGE o un fragmento de cualquiera de los mismos, (ii) un péptido EN-RAGE o un fragmento del mismo, y (iii) el compuesto; (b) medir el nivel de interacción entre el péptido de la operación (a) (i) y el péptido de la operación (a) (ii); y (c) comparar la cantidad de interacción medida en la operación (b) con la cantidad medida entre el péptido de la operación (a) (i) y el péptido de la operación (a) (ii) en ausencia del compuesto, determinándose de esta manera si el compuesto es capaz de inhibir la interacción del péptido EN-RAGE con el péptido RAGE; en el que una reducción en la cantidad de interacción en presencia del compuesto indica que el compuesto es capaz de inhibir la interacción. También se describe aquí un método para inhibir la inflamación en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un compuesto capaz de interferir en la interacción entre un péptido EN-RAGE y el receptor del producto final de glicosilación avanzada (RAGE) en el sujeto, para de este modo inhibir la inflamación en el sujeto.

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Breve descripción de las figuras

Figura 1

Inmunohistoquímica del riñón humano (nefritis por lupus activo)

Se obtuvo tejido renal de un paciente con nefritis por lupus activo y se fijó en formol, y se prepararon cortes embebidos en parafina. Los cortes fueron teñidos con IgG anti-RAGE, de conejo. Se advirtió una expresión aumentada de RAGE en los podocitos del glomérulo.

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Figura 2

La incubación de HUVECs con EN-RAGE da lugar a un aumento de VCAM-1 de la superficie celular

Se cultivaron durante 24 horas células endoteliales de vena de cordón umbilical humano (HUVEC; del inglés, human umbilical vein endothelial cell) en medio RPMI 1640 exento de suero, sin factor de crecimiento de células endoteliales, y luego se estimularon con EN-RAGE o albúmina sérica bovina (BSA; del inglés, bovine serum albumin), ambos en una concentración de 10 \mug/ml. Donde se indica, las células fueron pretratadas con IgG anti-RAGE humano generada en conejo, o con IgG no inmune de conejo; en ciertos casos, el EN-RAGE fue pretratado con la concentración indicada de RAGE soluble (sRAGE) durante 2 horas antes de la estimulación con EN-RAGE. Después de ocho horas de estimulación con EN-RAGE, las células fueron fijadas del modo anteriormente descrito. Se llevó a cabo un ELISA (ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas; del inglés, enzyme-linked immunosorption assay) de la superficie celular empleando IgG anti-VCAM-1. En la figura se muestran consideraciones estadísticas.

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Figura 3

La incubación de HUVECs con EN-RAGE aumenta la actividad funcional de VCAM-1: unión aumentada de células Molt-4

Se llevó a cabo la valoración de la actividad funcional de VCAM-1 usando células Molt-4 (ATCC) marcadas con ^{51}Cr, como se describió anteriormente. Se trataron HUVECs con BSA (10 \mug/ml) o EN-RAGE (5 \mug/ml) durante ocho horas. Se incubaron células Molt-4 (5 x 10^{7}/ml) durante 2 horas en RPMI que contenía ^{51}Cr (3700 kBq). Al final de ese tiempo, las células fueron lavadas con disolución salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés, phosphate buffered saline) y fueron luego añadidas a la monocapa de HUVECs tratadas, durante una hora. Las células Molt-4 no unidas fueron eliminadas mediante tres lavados con PBS. Las células fueron luego lisadas en tampón que contenía Triton-X 100 (2%) con objeto de liberar la radiactividad que contenían las células Molt-4. En la figura se muestran consideraciones estadísticas.

Figura 4

Modelo de hipersensibilidad retardada: supresión de la inflamación en presencia de RAGE soluble

Se sensibilizaron ratones CF-1 con mBSA. Tres semanas más tarde, se inyectó mBSA en la almohadilla de la pata trasera. Ciertos ratones fueron tratados con las concentraciones indicadas de albúmina sérica de ratón, sRAGE o los fragmentos indicados de F(ab')_{2} de anticuerpo anti-RAGE o anti-EN-RAGE. La calificación de la inflamación se definió como antes (escala: 1-9).

Figura 5

Secuencia de ácido nucleico de EN-RAGE bovino

Se clonó el cDNA de EN-RAGE bovino y se depositó en Genbank con el nº de acceso AF 011757. La secuencia (5' a 3') se muestra en la Figura 5.

Figura 6

La expresión de EN-RAGE está aumentada en células inflamatorias estimuladas (A-B); EN-RAGE se une a RAGE (C-D)

(Parte A): La expresión de EN-RAGE está aumentada en células Jurkat y PBMCs (células mononucleares de sangre periférica; del inglés, peripheral blood mononuclear cell) estimuladas, pero no en HUVECs. Se cultivaron PBMCs, células Jurkat E6 o HUVECs en medio estándar, solas o en presencia de los estímulos indicados, durante 12 horas. Las PBMCs y las células Jurkat E6 se estimularon con 12-miristato-13-acetato de forbol (PMA; del inglés, phorbol 12-myristate 13-acetate; 10 ng/ml)/ionomicina (100 ng/ml), y las HUVECs se trataron con TNF-\alpha (10 ng/ml). Al final de las 12 horas de incubación, se prepararon lisados celulares y se llevaron a cabo electroforesis/inmunotransferencias del modo anteriormente descrito empleando IgG anti-EN-RAGE (2 \mug/ml), de conejo. Los sitios del anticuerpo primario se visualizaron usando un anticuerpo contra IgG de conejo, conjugado con peroxidasa, y un sistema de detección por quimioluminiscencia aumentada (ECL; del inglés, enhanced chemiluminiscence). Como se indica, se desarrollaron simultáneamente marcadores de pesos moleculares. Se muestran los resultados del análisis densitométrico. Este experimento se repitió dos veces, con resultados análogos.

(Parte B): La infusión de lipopolisacárido (LPS) a ratones origina la elaboración de EN-RAGE en el plasma: Se infundió LPS, 30 \mug/kg de peso corporal, a ratones Balb/c por administración intraperitoneal en presencia o ausencia de sRAGE (100 \mug; administrados 12 h y 1 h antes de la inyección de LPS). En el momento indicado, se extrajo sangre y se sometió el plasma a electroforesis/inmunotransferencia para EN-RAGE usando IgG anti-EN-RAGE (2 \mug/ml), como antes. Se muestran los resultados del análisis densitométrico. Este experimento se repitió dos veces, con resultados análogos.

(Parte C-D): EN-RAGE se une a RAGE purificado (C) y células endoteliales de aorta bovina (BAECs; del inglés, bovine aortic endothelial cells) (D): En C, se inmovilizó RAGE humano soluble en las paredes de placas de plástico, y, en D, se cultivaron BAECs confluentes en pocillos tratados para cultivo tisular. Se llevaron a cabo ensayos de unión de radioligandos empleando la concentración indicada de ^{125}I-EN-RAGE en presencia o ausencia de EN-RAGE no marcado y en exceso (50 veces más). En C se demuestra la unión específica a RAGE purificado, con una K_{d} \approx 91 \pm 29 nM y una capacidad \approx 21 \pm 2,9 femtomoles/pocillo. En D se demuestra la unión específica a BAECs, con una K_{d} \approx 90,3 \pm 34 nM y una capacidad \approx 163 \pm 26,2 femtomoles/pocillo. Donde se indica, se incubó EN-RAGE radiomarcado (100 nM) con la cantidad indicada de sRAGE en exceso dos horas antes del ensayo de unión, o se preincubaron los pocillos durante dos horas con la concentración indicada de IgG no inmune de conejo o de IgG anti-RAGE o IgG anti-EN-RAGE monoespecíficas y policlonales de conejo, antes del ensayo de unión, y los resultados se presentan como % de la unión específica máxima \pm desviación típica (SD; del inglés, standard deviation) de la media. Estos experimentos se llevaron al menos cinco veces a cabo, con resultados análogos.

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Figura 7

La ligación de RAGE por EN-RAGE y S100B da lugar a activación celular Células endoteliales (A-D, H)

(Parte A): ELISA de la superficie celular para VCAM-1: Se cultivaron HUVECs en presencia de los mediadores indicados, durante 8 horas a 37ºC, en presencia o ausencia de pretratamiento con IgG no inmune, IgG anti-RAGE o RAGE soluble en exceso durante dos horas. Luego se fijaron las células y se llevó a cabo un ELISA de la superficie celular para VCAM-1 empleando IgG anti-VCAM-1 (4 \mug/ml).

(Parte B): Ensayos de adhesión de Molt-4: Se cultivaron HUVECs en presencia de los mediadores indicados durante 8 horas. Para EN-RAGE, se emplearon concentraciones (zona izquierda del gráfico) y tiempos de incubación (zona central del gráfico) variables. Después de la incubación, se dejó durante una hora que las células Molt-4 marcadas con ^{51}Cr se unieran a la monocapa. Al final de ese periodo, las células fueron lavadas en medio y fueron rotas en presencia de Triton-X 100 (1%); el material resultante fue sometido a cuenta en un contador de radiación beta. En la zona derecha del gráfico, las HUVECs fueron tratadas con EN-RAGE (5 \mug/ml) en presencia o ausencia de pretratamiento (2 h) con el indicado F(ab')_{2}, sRAGE en exceso o BSA en exceso. Los resultados se presentan como aumento, en número de veces, con respecto al testigo (tratamiento de las células con BSA, 10 \mug/ml). En A-B, los resultados se presentan como media \pm SD de la media. Los experimentos se llevaron al menos tres veces a cabo.

(Parte C): Ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética (EMSA; del inglés, electrophoretic mobility shift assay): Se trataron HUVECs con los mediadores indicados durante ocho horas.

En ciertos casos, las células fueron pretratadas con IgG anti-RAGE y, en otros casos, se pretrató EN-RAGE con sRAGE en exceso (dos horas). Ciertas HUVECs, antes del tratamiento con EN-RAGE, fueron transitoriamente transfectadas con una construcción que codificaba una forma de RAGE humano en que se había suprimido el dominio citosólico, o con vector solo como testigo (pcDNA3). Se preparó el extracto nuclear y se llevó a cabo un EMSA del modo descrito más adelante. Se llevaron a cabo ensayos de superdesplazamiento por incubación del extracto nuclear con el anticuerpo indicado (2 \mug/ml) durante 45 minutos antes del EMSA. Se adjuntan los resultados del análisis densitométrico. Este experimento se repitió dos veces con resultados análogos.

Fagocitos mononucleares (MPs) (Partes D-E)

(Parte D): Ensayos de quimiotaxis modificados: Se llevaron a cabo ensayos de quimiotaxis modificados, como se describe. Se pusieron mediadores en la cámara superior o inferior y células Molt-4 (que llevan RAGE en la superficie celular) durante 4 h a 37ºC, como se muestra. Las células que habían migrado a través de las membranas fueron teñidas y fueron contadas en nueve campos de gran aumento. Donde se indica (parte derecha), se pretrataron las células con los fragmentos F(ab')_{2} indicados, o se incubó EN-RAGE con sRAGE en exceso durante dos horas antes del ensayo de quimiotaxis. Se muestra la media \pm SD de la media. Cada experimento fue llevado dos veces a cabo; en cada caso, se emplearon seis duplicados por condición.

(Parte E): Generación de IL-1\beta y TNF-\alpha: Se incubaron macrófagos BV-2, fueran los transfectados con una construcción que codificaba el cDNA en que se había suprimido el dominio citosólico de RAGE o fueran células simuladamente transfectadas (vector solo), con los mediadores indicados durante 8 horas a 37ºC. Al final de ese periodo, se recogió el sobrenadante y se llevó a cabo un ELISA para IL-1\beta y TNF-\alpha. Se presentan los resultados como el nº de veces de aumento de inducción (en comparación con la incubación de las células con BSA sola). Se muestra la media \pm SD de la media para tres experimentos.

PBMCs y células Jurkat (Partes F-H)

(Parte F): Ensayo de mitogénesis: Se aislaron PBMCs de sangre completa del modo descrito y se sembraron en pocillos para cultivo tisular. Las células fueron tratadas con la concentración indicada de EN-RAGE durante 12 horas antes de la estimulación con PHA-P. Las células fueron luego impulsadas con ^{3}H-timidina y fueron incubadas durante 18 horas adicionales antes de la recolección y el procesamiento para la cuenta de centelleo en estado líquido. En ciertos casos, se pretrataron las células con IgG no inmune o IgG anti-RAGE o se pretrató el EN-RAGE con sRAGE en exceso.

(Parte G): Generación de IL-2: Se incubaron células Jurkat E6 con los mediadores indicados durante 8 horas, se recogió el sobrenadante y se llevó a cabo un ELISA para IL-2. Donde se indica, se pretrataron las células con la IgG indicada o se pretrató el EN-RAGE con sRAGE en exceso. Se presentan los resultados como el nº de veces de aumento de inducción (en comparación con la incubación de las células con BSA sola). En F-G, se presenta la media \pm SD de al menos dos experimentos.

(Parte H): S100B activa NF-\kappaB en HUVECs a través de RAGE. Se trataron HUVECs con los mediadores indicados durante ocho horas. El pretratamiento con anticuerpos o con sRAGE y el EMSA se llevaron a cabo del modo anteriormente descrito en (C).

Figura 8

EN-RAGE media en la activación celular in vivo

(Parte A): Expresión de VCAM-1 en el pulmón: Se inyectó intravenosamente EN-RAGE (30 \mug), BSA (30 \mug) o LPS (500 \mug) a ratones CF-1 a través de la vena de la cola. Doce horas más tarde, se recogieron rápidamente los pulmones y se preparó un extracto del modo descrito más adelante para inmunotransferencia. La electroforesis y la inmunotransferencia se llevaron a cabo del modo descrito empleando IgG anti-VCAM-1 (0,4 \mug/ml). Se muestran los resultados del análisis densitométrico. Este experimento fue llevado dos veces a cabo, con resultados análogos.

(Parte B): Ensayo de mitogénesis: Se recogieron esplenocitos de ratones sometidos a hipersensibilidad de tipo retardado (DTH; del inglés, delayed-type hypersensitivity) (véase más adelante) y se examinaron ex vivo en cuanto a la respuesta a PMA, como se describe. Para cada condición, n = 5 ratones. Se muestra la media \pm SD.

Figura 9

El bloqueo de EN-RAGE/RAGE suprime la inflamación aguda en un modelo de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH). Calificaciones clínica e histológica (A-K)

(Parte A): Calificación de la inflamación: Se sensibilizaron (ingle izquierda) y estimularon (pata trasera izquierda) ratones CF-1 con BSA metilada (mBSA), del modo descrito. Donde se indica, los ratones fueron pretratados con una inyección intraperitoneal de sRAGE, albúmina sérica murina, o fragmentos F(ab')_{2} inmunes o no inmunes, 24 y 12 horas antes de, y 6 y 12 horas después de, la estimulación local con mBSA. 24 horas después de la inyección de mBSA en la almohadilla de la pata, dos investigadores llevaron a cabo a ciegas las calificaciones clínica e histológica de la almohadilla de la pata, del modo descrito. En A, la calificación (máxima de 9; sin inflamación = 2) se define como la suma de las calificaciones clínica e histológica. Calificación clínica: 1 = ausencia de inflamación (identidad con respecto a la almohadilla no tratada de la pata derecha); 2 = rubefacción y edema ligeros; 3 = rubefacción y edema moderados con arrugas cutáneas; 4 = rubefacción y edema intensos sin arrugas cutáneas; y 5 = rubefacción y edema intensos con separación de los dedos a causa de un edema excesivo. Calificación histológica (de acuerdo con estudios con hematoxilina y eosina): 1 = sin infiltración leucocitaria y sin edema subcutáneo; 2 = ligera infiltración leucocitaria perivascular con ligero edema subcutáneo; 3 = intensa infiltración leucocitaria sin granulomas; y 4 = intensa infiltración leucocitaria con granulomas. En estos experimentos, n = 5/grupo. Se presenta la media \pm SD de la media.

(Partes B-E): Análisis clínico: Se muestran ratones representativos sensibilizados/estimulados con mBSA. B = tratamiento con MSA; C = tratamiento con sRAGE, 100 \mug ip por dosis; D = tratamiento con F(ab')_{2} anti-EN-RAGE, 200 \mug ip por dosis; y E = tratamiento con F(ab')_{2} anti-RAGE, 200 \mug ip por dosis.

(Partes F-K): Análisis con hematoxilina y eosina (H&E): Se muestran análisis con H&E de almohadillas representativas de patas de ratones sensibilizados/estimulados con mBSA. F = tratamiento con MSA; G = almohadilla de pata contralateral, sin DTH; H = tratamiento con sRAGE, 100 \mug ip por dosis; I = F(ab')_{2} anti-EN-RAGE, 200 \mug ip por dosis; J = F(ab')_{2} anti-RAGE, 200 \mug ip por dosis; y K = F(ab')_{2} anti-EN-RAGE + anti-RAGE, 200 \mug ip por dosis. Barra de escala = xxx \mum.

(Parte L): EMSA: Se prepararon extractos nucleares a partir de almohadillas reunidas de patas traseras (n = 3/condición) y se llevó a cabo el EMSA. Se muestran los resultados del análisis densitométrico.

(Parte M): RT-PCR para IL-2 y TNF-\alpha: Se llevó a cabo una transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR; del inglés, reverse transcription-polymerase chain reaction) a partir de RNA preparado de almohadillas de patas traseras, como se indica en la figura, y se llevó a cabo usando cebadores para TNF-\alpha (carriles 1 y 2) o IL-2 (carriles 4 y 5) o \beta-actina. Se indican marcadores de pares de bases. El carril 3 representa el testigo negativo (sin DNA añadido durante la PCR).

Figura 10

El bloqueo de EN-RAGE/RAGE suprime la inflamación colónica crónica en ratones deficientes en IL-10

(Parte A): EMSA: Se prepararon extractos nucleares a partir de tejido de colon rectosigmoide de ratones tratados con sRAGE (carriles 1-6) o MSA (carriles 7-12). Se llevó a cabo un análisis densitométrico utilizando el software Image Quant de Molecular Dynamics. Los píxeles unitarios medios de la densitometría de los ratones tratados con mSA (n = 6) frente a los de los ratones tratados con sRAGE (n = 6) fueron 7121,8 \pm 5359,6 frente a 1911 \pm 1155 unidades; p = 0,04.

(Parte B): Valoración del TNF-\alpha plasmático: Inmediatamente antes del sacrificio, re recogió plasma de ratones deficientes en IL-10 y se sometió a centrifugación a 800 rpm durante 10 minutos para obtener un sobrenadante exento de células. Se llevó a cabo un ELISA para TNF-\alpha sobre este material de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los valores medios para los ratones tratados con MSA (n = 6) frente a los de los ratones tratados con sRAGE (n = 6) fueron 190,5 \pm 89,0 frente a 21,9 \pm 63,6 pg/ml; p = 0,02.

Figura 11

Amplificación de la respuesta inflamatoria mediada por el eje EN-RAGE/RAGE

Formulamos la hipótesis de que, tras el reclutamiento a sitios de estimulación inmune/inflamatoria, las células inflamatorias liberan EN-RAGE y moléculas de S100/calgranulina similares a EN-RAGE. Estas moléculas pueden luego unirse al RAGE celular de células tales como células endoteliales, fagocitos mononucleares (MP; del inglés, mononuclear phagocytes) y linfocitos, amplificando de esta manera la respuesta inflamatoria a través de la generación de mediadores esenciales de la inflamación, tales como moléculas de adhesión y citocinas.

Descripción detallada del invento

Aquí se utilizan las abreviaturas siguientes: CML = carboximetil-lisina, AGE = producto(s) final(es) de glicosilación avanzada; RAGE = receptor para producto(s) final(es) de glicosilación avanzada; sRAGE = receptor soluble para producto(s) final(es) de glicosilación avanzada; EN-RAGE = nueva proteína extracelular ligante de RAGE.

El presente invento proporciona un péptido EN-RAGE humano aislado. En una realización, el péptido EN-RAGE aislado tiene la secuencia N-terminal de aminoácidos mostrada en la Tabla 1. El presente invento describe además una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un péptido EN-RAGE. En una realización, el péptido EN-RAGE es EN-RAGE humano. En otra realización, el ácido nucleico es DNA, cDNA o RNA. En un ejemplo, la secuencia de ácido nucleico del EN-RAGE es la secuencia mostrada en la Figura 5 (ID. SEC. nº 1).

El presente invento también proporciona un vector replicable que comprende la molécula de ácido nucleico de EN-RAGE. En una realización, el vector replicable es un vector de expresión procariótico, un vector de expresión de levadura, un vector de expresión de baculovirus o un vector de expresión de mamífero.

El presente invento también proporciona una célula huésped que comprende el vector replicable. En una realización, la célula huésped es una célula eucariótica, una célula somática o una célula germinal.

En otra realización, la molécula de ácido nucleico del invento puede ser marcada con un resto detectable. El resto detectable puede ser seleccionado del grupo que consiste en un marcador fluorescente, una digoxigenina, una biotina, una enzima, un átomo radiactivo, un ion paramagnético y un marcador quimioluminiscente.

El presente invento también proporciona una molécula de ácido nucleico que consiste esencialmente en un fragmento único de una secuencia de ácido nucleico de EN-RAGE en una orientación 3' a 5', en que la secuencia es antisentido con respecto a al menos una porción de un gen que codifica un péptido EN-RAGE presente en la naturaleza.

El presente invento también proporciona una composición que comprende un péptido EN-RAGE o un fragmento del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, el vehículo farmacéuticamente aceptable es un vehículo para administración intravenosa, oral, tópica o por aerosol.

También se describe aquí un anticuerpo que inmunorreacciona con un epítopo que comprende una secuencia única de EN-RAGE.

También se describe aquí una ribozima que es capaz de escindir específicamente el mRNA de EN-RAGE en una célula.

También se describe aquí un mamífero transgénico no humano cuyas células germinales o somáticas contienen una molécula de ácido nucleico que codifica un péptido EN-RAGE o una variante biológicamente activa del mismo, introducida en el mamífero o en un antepasado del mismo en una fase embrionaria. En una realización, la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido EN-RAGE está sobreexpresada en las células del mamífero. En otra realización, la molécula de ácido nucleico codifica un péptido EN-RAGE humano. En otra realización, la variante activa comprende un compuesto homólogo de EN-RAGE.

También se describe aquí un mamífero transgénico no humano cuyas células germinales o somáticas han sido transfectadas con un vector adecuado que tiene una apropiada secuencia destinada a reducir los niveles de expresión del péptido EN-RAGE por debajo de los niveles de expresión del mismo en un mamífero originario. En una realización, el vector adecuado contiene un trozo apropiado de secuencia clonada de ácido nucleico genómico que permite la recombinación homóloga. En otra realización, el vector adecuado codifica una ribozima capaz de escindir una molécula de mRNA de EN-RAGE o una molécula antisentido que comprende una secuencia antisentido con respecto a la secuencia de mRNA de EN-RAGE presente en la naturaleza.

El presente invento también proporciona un método para determinar si un compuesto es capaz de inhibir la interacción de un péptido EN-RAGE con un péptido RAGE, que comprende: (a) mezclar (i) un péptido RAGE o un péptido sRAGE o un fragmento de cualquiera de ambos, (ii) un péptido EN-RAGE o un fragmento del mismo, y (iii) el compuesto; (b) medir el nivel de interacción entre el péptido de la operación (a) (i) y el péptido de la operación (a) (ii); y (c) comparar la cantidad de interacción medida en la operación (b) con la cantidad medida entre el péptido de la operación (a) (i) y el péptido de la operación (a) (ii) en ausencia del compuesto, determinándose de este modo si el compuesto es capaz de inhibir la interacción del péptido EN-RAGE con el péptido RAGE, en el que una reducción en la cantidad de interacción en presencia del compuesto indica que el compuesto es capaz de inhibir la interacción.

En una realización, el fragmento de la operación (a) (i) es el dominio V de RAGE. En otra realización, el fragmento de la operación (a) (i) o (a) (ii) es sintético. En otra realización, el compuesto comprende al menos una porción de péptido sRAGE presente en la naturaleza. En otra realización, el compuesto es un compuesto peptidomimético. En otra realización, el compuesto es una molécula orgánica. En otra realización, el compuesto es un péptido, un ácido nucleico o un producto químico inorgánico. En otra realización, el compuesto es una molécula con un peso molecular inferior a 10.000 dáltones. En otra realización, el compuesto es un anticuerpo o un fragmento del mismo. En otra realización, el compuesto es un péptido RAGE mutado o un fragmento del mismo. En otra realización, el compuesto es un péptido sRAGE mutado o un fragmento del mismo. En otra realización, el compuesto es un péptido EN-RAGE mutado o un fragmento del mismo. En otra realización, el péptido de la operación (a) (i) es fijado a una superficie sólida. En otra realización, el péptido de la operación (a) (ii) es fijado a una superficie sólida. En otra realización, el péptido de la operación (a) (i) o (a) (ii) es detectablemente marcado. En otra realización, el marcador detectable comprende fluorescencia, biotina o radiactividad.

En otra realización, en el método de exploración, el mezclamiento tiene lugar en una célula. En otra realización, el mezclamiento tiene lugar en un animal.

También se describe aquí un método para inhibir la inflamación en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un compuesto capaz de interferir en la interacción entre el péptido EN-RAGE y el receptor del producto final de glicosilación avanzada (RAGE) en el sujeto, inhibiéndose de este modo la inflamación en el sujeto.

En otra realización, el compuesto es un anticuerpo anti-EN-RAGE o un fragmento del mismo, o un anticuerpo anti-RAGE o un fragmento del mismo. En otra realización, el compuesto es un péptido sRAGE. En otra realización, el compuesto consiste esencialmente en el dominio del péptido sRAGE que se une al ligando, o el dominio del péptido EN-RAGE que se une al ligando. En otra realización, el compuesto es una molécula de ácido nucleico o un péptido. En otra realización, el péptido es un anticuerpo o un fragmento del mismo. En otra realización, la molécula de ácido nucleico es una ribozima o una molécula de ácido nucleico antisentido. En otra realización, el compuesto es un compuesto identificado mediante el método de exploración de la Reivindicación 26.

En otra realización, la inflamación está asociada con hipersensibilidad retardada, aterosclerosis acelerada o nefritis por lupus. En otra realización, el sujeto es un ser humano, un primate, un ratón, una rata o un perro.

En otra realización, la administración comprende inyección intralesional, intraperitoneal, intramuscular o intravenosa; infusión; distribución mediada por liposomas; o distribución tópica, intratecal, por el surco gingival, por el recto, intrabronquial, nasal, oral, ocular u óptica. En otra realización, el compuesto es administrado horaria, diaria, semanal, mensual o anualmente. En otra realización, la cantidad eficaz del compuesto comprende de aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal.

En otra realización, el sujeto está aquejado de lupus eritematoso sistémico, nefritis inflamatoria por lupus, choque séptico o endotoxemia. En otra realización, el sujeto está aquejado de inflamación.

En una realización más, el sujeto está aquejado de un trastorno autoinmune o inflamatorio en que tiene lugar el reclutamiento de células inflamatorias que contienen EN-RAGE. En otra realización, el sujeto está aquejado de una infección asociada a bacterias o asociada a otros patógenos.

En otra realización, el método comprende además administrar al sujeto un vehículo farmacéuticamente aceptable durante la administración del compuesto. En otra realización, el vehículo comprende un agente diluyente. En otra realización el vehículo comprende un virus, un liposoma, una microcápsula, una célula encapsulada en polímero, o un vector retrovírico. En otra realización, el vehículo es un vehículo para administración intravenosa, oral, tópica o por aerosol. En otra realización, el compuesto se administra desde un implante de liberación temporal.

También se describe aquí un método para determinar si un compuesto es capaz de inhibir la capacidad de la proteína EN-RAGE para unirse a una segunda proteína, que comprende: (a) mezclar la proteína EN-RAGE, la segunda proteína y el compuesto; (b) medir la cantidad de unión entre la proteína EN-RAGE y la segunda proteína; y (c) comparar la cantidad de unión medida en la operación (b) con la cantidad de unión entre EN-RAGE y la segunda proteína en ausencia del compuesto, en que una reducción de la cantidad de unión indica que el compuesto es capaz de inhibir la capacidad de la proteína EN-RAGE para unirse a la segunda proteína.

El cDNA humano de RAGE tiene 1406 pares de bases y codifica una proteína madura de 404 aminoácidos. Véase la Figura 3 de Neeper et al., 1992. Como se usa aquí, el "dominio V de RAGE" se refiere al dominio variable de tipo inmunoglobulínico como el mostrado en la Figura 5 de M. Neeper, A. M. Schmidt, J. Brett, S. D. Yan, F. Wang, Y. C. Pan, K. Elliston, D. Stern y A. Shaw, "Cloning and expression of RAGE: a cell surface receptor for advanced glycosylation end products of proteins", J. Biol. Chem. 267: 14.998-15.004, 1992. El dominio V incluye los aminoácidos de la posición 23 a la posición 120, como se muestra en la Figura 4 de Neeper et al. (1992). La secuencia líder mostrada no es parte del dominio V y, en el ser humano, el dominio V comienza con los aminoácidos A-Q-N-I-T... La secuencia mínima de aminoácidos necesaria para definir el sitio de unión a AGE en la proteína RAGE puede ser mucho menor de 120 aminoácidos.

Se ha clonado la secuencia de ácido nucleico de EN-RAGE bovino y se ha depositado en Genbank con el nº de acceso AF 011757. La secuencia de ácido nucleico de EN-RAGE se muestra en la Figura 5. Por medio de métodos conocidos por quien tiene experiencia en la técnica, se podrían obtener compuestos homólogos de EN-RAGE presentes en otras especies. Por ejemplo, secuencias únicas con respecto a la secuencia de cDNA de ácido nucleico de EN-RAGE bovino pueden ser utilizadas como sondas para explorar un banco de cDNA humano con objeto de obtener el compuesto homólogo humano.

Ligandos de RAGE tales como AGEs (AGEs modificados con CML) y p12, una citocina proinflamatoria, activan células inflamatorias. Esto se ha mostrado en ratones. Estos efectos de activación quedan bloqueados en presencia de sRAGE. Por lo tanto, se describen aquí métodos para bloquear la inflamación (por ejemplo, la inflamación debida a una estimulación inmune) en un sujeto mediante la administración de un compuesto que es capaz de interferir en la interacción entre EN-RAGE y RAGE en el sujeto. Dicho método sería selectivo para la inflamación. En un ejemplo, el compuesto es diseñado específicamente como un inhibidor competitivo de ligandos de RAGE.

El ensayo de exploración puede ser llevado a cabo de modo que uno de los componentes esté unido o fijado a una superficie sólida. En una realización, el péptido es fijado a una superficie sólida. En otra realización, el segundo péptido que tiene la secuencia del sitio de RAGE que se une a AGE es unido o fijado a una superficie sólida. Las superficies sólidas útiles en esta realización serían conocidas por quien tiene experiencia en la técnica. Por ejemplo, una realización de una superficie sólida es un glóbulo, una columna, una cubeta de plástico, una placa de plástico, un portaobjetos de microscopio, una membrana de nailon, etc. En un ejemplo, el material del que está compuesto la superficie sólida es sintético.

Uno de los componentes de la operación (a) del ensayo de exploración puede ser detectablemente marcado. El componente (sea el compuesto, el péptido o el dominio V, o el segundo péptido) puede ser marcado con un resto detectable que incluye un marcador fluorescente, una biotina, una digoxigenina, un átomo radiactivo, un ion paramagnético y un marcador quimioluminiscente. El componente puede ser marcado por medios covalentes, tales como medios químicos, enzimáticos u otros medios apropiados, con un resto tal como una enzima o un radioisótopo.

En una realización, el sujeto es un mamífero. En otra realización, el sujeto es un vertebrado. En una realización preferida, el mamífero es un ser humano. En un ejemplo, el sujeto es un sujeto diabético. En otro ejemplo del invento, el sujeto está aquejado de diabetes, insuficiencia renal, amiloidosis, envejecimiento o inflamación. El sujeto puede ser un sujeto obeso, según se define mediante los patrones de peso y altura de la American Medical Association. El sujeto puede ser de edad avanzada. El sujeto puede ser un ser humano, un primate, un sujeto equino, un sujeto ovino, un sujeto aviar, un sujeto bovino, un sujeto porcino, un sujeto canino, un sujeto felino o un sujeto murino.

En una realización, el sujeto está aquejado de una enfermedad relacionada con AGE. En otra realización, dicha enfermedad relacionada con AGE se manifiesta en el cerebro, la retina, el riñón, la vasculatura, el corazón o el pulmón. En otra realización, el sujeto está aquejado de la enfermedad de Alzheimer o de una enfermedad que se manifiesta por la acumulación de AGEs en el sujeto. En otra realización, el sujeto está aquejado de síntomas de diabetes, tales como lesiones de tejidos blandos, capacidad reducida para ver, enfermedad cardiovascular, enfermedad renal, etc. Di chos síntomas serían conocidos por quien tiene experiencia en la técnica.

El compuesto puede ser un polipéptido. El polipéptido puede ser un péptido, un compuesto peptidomimético, un polipéptido sintético, un derivado de un polipéptido natural, un polipéptido modificado, un polipéptido marcado o un polipéptido que incluye péptidos no naturales. El compuesto péptidomimético puede ser identificado mediante la exploración de bancos grandes de compuestos diferentes que son peptidomiméticos, para determinar un compuesto que sea capaz de prevenir la aterosclerosis acelerada en un sujeto predispuesto a ello. El polipéptido puede ser un polipéptido no natural que tenga una quiralidad no hallada en la naturaleza, es decir, D-aminoácidos o L-aminoácidos.

En una realización, el compuesto es un antagonista, antagonista que es capaz de unirse al RAGE con mayor afinidad que los AGEs, neutralizando así por competencia los efectos de la union del AGE .

En otra realización, el compuesto puede ser una ribozima que es capaz de inhibir la expresión de RAGE. En otra realización, el compuesto es un anticuerpo anti-RAGE, un anticuerpo anti-AGE o un anticuerpo anti-dominio V de RAGE. El anticuerpo puede ser monoclonal, policlonal, quimérico, humanizado o primatizado. El compuesto puede ser un fragmento de dicho anticuerpo.

También se describe un método para administrar al sujeto un vehículo farmacéuticamente aceptable durante la administración del polipéptido. La administración puede comprender una inyección intralesional, intraperitoneal, intramuscular o intravenosa; una infusión; una distribución mediada por liposomas; o una distribución tópica, nasal, oral, ocular u óptica. En una realización más, la administración incluye la administración intrabronquial, anal o intratecal.

El polipéptido puede ser distribuido horaria, diaria, semanal, mensual o anualmente (por ejemplo, en una forma de liberación temporal) o como una distribución de una sola vez. La distribución puede ser una distribución continua durante un periodo de tiempo, tal como, por ejemplo, una distribución intravenosa.

La cantidad eficaz del polipéptido puede comprender de aproximadamente 0,000001 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. En una realización, la cantidad eficaz puede comprender de aproximadamente 0,001 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. En otra realización, la cantidad eficaz puede variar de aproximadamente 0,01 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal. La cantidad eficaz real se basará en el tamaño del polipéptido, la biodegradabilidad del polipéptido, la bioactividad del polipéptido y la biodisponibilidad del polipéptido. Si el polipéptido no se degrada rápidamente, está biodisponible y es muy activo, se requerirá una cantidad más pequeña para que sea eficaz. La cantidad eficaz será conocida por quien tiene experiencia en la técnica; también dependerá de la forma del polipéptido, el tamaño del polipéptido y la bioactividad del polipéptido. Quien tuviera experiencia en la técnica podría llevar rutinariamente a cabo ensayos empíricos de actividad para un polipéptido, para determinar la bioactividad en bioensayos y, de este modo, determinar la cantidad eficaz.

En otra realización, el método puede comprender además administrar un vehículo farmacéuticamente aceptable al sujeto durante la administración del compuesto. La administración puede comprender una inyección intralesional, intraperitoneal, intramuscular o intravenosa; una infusión; una distribución mediada por liposomas; o una distribución tópica, nasal, oral, ocular u óptica.

El compuesto puede ser administrado horaria, diaria, semanal, mensual o anualmente (por ejemplo, en una forma de liberación temporal) o como una distribución de una sola vez. La distribución o administración puede ser una distribución continua durante un periodo de tiempo, tal como, por ejemplo, una distribución intravenosa.

El compuesto puede ser un polipéptido sRAGE, tal como compuestos polipeptídicos análogos de sRAGE. Dichos compuestos análogos incluyen fragmentos de sRAGE. Siguiendo los procedimientos de la solicitud publicada de Alton et al. (Documento WO 83/04053), se pueden diseñar y fabricar fácilmente genes que codifiquen la expresión microbiana de polipéptidos que tienen conformaciones primarias que difieren de la conformación aquí especificada en términos de la identidad o posición de uno o más residuos (por ejemplo, sustituciones, adiciones terminales e intermedias, y deleciones). Alternativamente, se pueden realizar fácilmente modificaciones de genes genómicos y de cDNA mediante técnicas de mutagénesis dirigida al sitio bien conocidas y se pueden emplear las modificaciones para generar compuestos análogos y derivados de un polipéptido sRAGE. Dichos productos comparten al menos una de las propiedades biológicas de sRAGE pero pueden diferir en otras. Como ejemplos los productos del invento incluyen aquellos que están acortados mediante, por ejemplo, deleciones; o aquellos que son más estables frente a la hidrólisis (y, por lo tanto, pueden ejercer efectos más pronunciados o duraderos que los productos presentes en la naturaleza); o que han sido alterados para suprimir o añadir uno o más sitios potenciales de O-glicosilación y/o N-glicosilación o que tienen uno o más residuos de cisteína suprimidos o sustituidos por, por ejemplo, residuos de alanina o serina y potencialmente son más fácilmente aislados en forma activa a partir de sistemas microbianos; o que tienen uno o más residuos de tirosina reemplazados por fenilalanina y se unen más o menos fácilmente a proteínas diana o a receptores presentes en células diana. Están también comprendidos fragmentos polipéptidos que duplican sólo una parte de la secuencia continua de aminoácidos o de conformaciones secundarias de sRAGE, fragmentos que pueden poseer una propiedad de sRAGE y no otras. Es digno de mención que no es necesaria la actividad para que uno cualquiera o más de los polipéptidos del invento tengan utilidad terapéutica o utilidad en otros contextos, tal como en ensayos de antagonismo de sRAGE. Los antagonistas competitivos pueden ser bastante útiles en, por ejemplo, casos de sobreproducción de sRAGE.

Los informes de la propiedad inmunológica de péptidos sintéticos que duplican sustancialmente la secuencia de aminoácidos existente en proteínas, glicoproteínas y nucleoproteínas presentes en la naturaleza son aplicables a los compuestos polipeptídicos análogos del invento. Más específicamente, se ha mostrado que polipéptidos de peso molecular relativamente bajo participan en reacciones inmunes que tienen una duración y una extensión similares a las de las reacciones inmunes de proteínas fisiológicamente significativas, tales como antígenos víricos, hormonas polipeptídicas, y similares. Entre las reacciones inmunes de dichos polipéptidos se incluye la provocación de la formación de anticuerpos específicos en animales inmunológicamente activos [Lerner et al., Cell 23, 309-310 (1981); Ross et al., Nature 294, 654-658 (1981); Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 4882-4886 (1.981); Wong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5322-5326 (1982); Baron et al., Cell 28, 395-404 (1982); Dressman et al., Nature 295, 158-160 (1982); y Lerner, Scientific American 248, 66-74 (1983)]. Véase también Kaiser et al., [Science 223, 249-255 (1984)] en relación con las propiedades biológicas e inmunológicas de péptidos sintéticos que comparten aproximadamente las estructuras secundarias de hormonas peptídicas pero que pueden no compartir su conformación estructural
primaria.

El compuesto aquí descrito puede ser un compuesto peptidomimético que puede ser al menos parcialmente artificial. El compuesto peptidomimético puede ser una pequeña molécula mimética de una porción de la secuencia de aminoácidos de sRAGE. El compuesto puede tener una estabilidad, una eficacia, una potencia y una biodisponibilidad aumentadas en virtud del mimetismo. Además, el compuesto puede tener una toxicidad reducida. El compuesto peptidomimético puede tener una permeabilidad aumentada en la mucosa intestinal. El compuesto puede ser preparado sintéticamente. El compuesto del presente invento puede incluir aminoácidos L, D o antinaturales, aminoácidos alfa,alfa-disustituidos, N-alquil-aminoácidos y ácido láctico (un compuesto isoelectrónico análogo de alanina). La cadena peptídica principal del compuesto puede tener al menos un enlace sustituido por PSI-(CH=CH) (Kempf et al., 1991). El compuesto puede incluir además trifluorotirosina, p-Cl-fenilalanina, p-Br-fenilalanina, poli-L-propargilglicocola, poli-D,L-alilglicocola o poli-L-alilglicocola.

También se describe aquí un compuesto peptidomimético que tiene un enlace, una cadena peptídica principal o un aminoácido componente, sustituido por un mimetismo adecuado. Los ejemplos de aminoácidos antinaturales que pueden ser mimetismos adecuados de aminoácidos incluyen l-alanina, ácido L-\alpha-aminobutírico, ácido L-\gamma-aminobutírico, ácido L-\alpha-aminoisobutírico, ácido L-\varepsilon-aminocaproico, ácido 7-aminoheptanoico, ácido L-aspartico, ácido L-glutámico, cisteína (acetamidometílica), N-\varepsilon-Boc-N-\alpha-CBZ-L-lisina, N-\varepsilon-Boc-N-\alpha-Fmoc-L-lisina, L-metionina-sulfona, L-norleucina, L-norvalina, N-\alpha-Boc-N-\delta-CBZ-L-ornitina, N-\delta-Boc-N-\alpha-CBZ-L-ornitina, Boc-p-nitro-L-fenilalanina, Boc-hidroxiprolina y Boc-L-tioprolina (Blondelle et al., 1994; Pinilla et al., 1995).

En otra realización, el compuesto puede ser RAGE soluble (sRAGE) o un fragmento del mismo. El RAGE soluble no está situado en la superficie de la célula ni está asociado con una membrana celular.

El sujeto puede ser un animal mamífero o no mamífero. El sujeto puede ser un ser humano. El sujeto puede ser un ratón, una rata, una vaca, un mono, un caballo, un cerdo o un perro. El sujeto puede ser un sujeto diabético.

La administración del compuesto puede ser por inyección intralesional, intraperitoneal, intramuscular o intravenosa; infusión; distribución mediada por liposomas; o distribución tópica, nasal, oral, anal, ocular u óptica. La administración puede ser constante durante un cierto periodo de tiempo, o periódica y a intervalos específicos. El vehículo puede ser un agente diluyente, un aerosol, un vehículo tópico, una disolución acuosa, una disolución no acusa o un vehículo sólido.

En la práctica de cualquiera de los métodos aquí descritos o en la preparación de cualquiera de las composiciones farmacéuticas, una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad con la que se puede prevenir la interacción EN-RAGE/RAGE en un sujeto. En consecuencia, la cantidad eficaz variará con el sujeto que se trata así como con el estado que se va a tratar. Para los fines de este invento, los métodos de administración van a incluir, pero no se limitan a, las administraciones cutánea, subcutánea, intravenosa, parenteral, oral y tópica, y mediante un aerosol.

Como se usa aquí, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado" abarca cualesquiera de los vehículos farmacéuticamente aceptados estándares, tales como disolución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tales como una emulsión de aceite/agua o una emulsión de triglicéridos, diversos tipos de agentes humectantes, tabletas, tabletas revestidas y cápsulas. Un ejemplo de una emulsión de triglicéridos aceptable, útil para las administraciones intravenosa e intraperitoneal de los compuestos, es la emulsión de triglicéridos comercialmente conocida como Intralipid®.

Dichos vehículos contienen típicamente excipientes tales como almidón, leche, azúcar, ciertos tipos de arcilla, gelatina, ácido esteárico, talco, aceites o grasas vegetales, gomas, glicoles u otros excipientes conocidos. Dichos vehículos pueden también incluir aditivos saboreadores y colorantes, u otros ingredientes.

También se describen aquí composiciones farmacéuticas que incluyen cantidades terapéuticamente eficaces de compuestos y composiciones polipeptídicas, junto con adecuados agentes diluyentes, conservantes, agentes solubilizadores, agentes emulsivos, agentes adyuvantes y/o vehículos. Dichas composiciones pueden ser líquidos o ser formulaciones liofilizadas o, de lo contrario, secadas, e incluyen agentes diluyentes de diferentes tampón (por ejemplo, Tris-HCl, acetato y fosfato), pH y fuerza iónica, aditivos tales como albúmina y gelatina para evitar la absorción a superficies, detergentes (por ejemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, y sales de ácidos biliares), agentes solubilizadores (por ejemplo, glicerol y polietilenglicol), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico y metabisulfito sódico), conservantes (por ejemplo, Thimerosal, alcohol bencílico y parabenos), sustancias para dar cuerpo o agentes modificadores de la tonicidad (por ejemplo, lactosa y manitol), la fijación covalente del compuesto a polímeros tales como polietilenglicol, la complejación con iones metálicos, o la incorporación del compuesto a preparaciones corpusculares de compuestos polímeros tales como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), hidrogeles, etc., o a liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilaminares o multilaminares, fantasmas eritrocitarios o esferoplastos. Dichas composiciones influirán en el estado físico, la solubilidad, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de aclaramiento in vivo del compuesto o la composición. La elección de las composiciones dependerá de las propiedades físicas y químicas del compuesto.

Las composiciones de liberación controlada o continua incluyen la formulación en depósitos lipófilos (por ejemplo, ácidos grasos, ceras y aceites). También se describen aquí composiciones corpusculares revestidas con polímeros (por ejemplo, poloxámeros o poloxaminas), y el compuesto copulado con anticuerpos dirigidos contra antígenos, ligandos o receptores tisularmente específicos o copulado con ligandos de receptores tisularmente específicos. Otras realizaciones de las composiciones del invento llevan incorporados revestimientos protectores de formas corpusculares, inhibidores de proteasas o potenciadores de permeación para las diversas vías de administración, incluyendo las vías parenteral, pulmonar, nasal y oral.

Una vez administrados, los compuestos son a menudo aclarados rápidamente de la circulación y, por lo tanto, pueden generar una actividad farmacológica de duración relativamente corta. En consecuencia, para mantener la eficacia terapéutica, puede que sean necesarias inyecciones frecuentes de dosis relativamente grandes de compuestos bioactivos. Se sabe que compuestos modificados mediante la fijación covalente de polímeros solubles en agua, tales como polietilenglicol, copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona y poliprolina, presentan, después de una inyección intravenosa, semividas sanguíneas sustancialmente más largas que las de los correspondientes compuestos no modificados (Abuchowski et al., 1981; Newmark et al., 1982; y Katre et al., 1987). Dichas modificaciones pueden además aumentar la solubilidad del compuesto en una disolución acuosa, eliminar la agregación, potenciar las estabilidades física y química del compuesto, y reducir en gran medida la inmunogenicidad y la reactividad del compuesto. Como resultado, se puede alcanzar la deseada actividad biológica in vivo mediante la administración de dichos aductos de polímero-compuesto menos frecuentemente o en dosis menores que con el compuesto no modificado.

La fijación de polietilenglicol (PEG) a compuestos es particularmente útil porque el PEG tiene una bajísima toxicidad en mamíferos (Carpenter et al., 1971). Por ejemplo, en Estados Unidos se aprobó un aducto de PEG y adenosina desaminasa para uso en seres humanos, para el tratamiento del síndrome de inmunodeficiencia combinada grave. Una segunda ventaja proporcionada por la conjugación de PEG es la reducción eficaz de la inmunogenicidad y la antigenicidad de compuestos heterólogos. Por ejemplo, un aducto de PEG y una proteína humana podría ser útil para el tratamiento de una enfermedad en otra especie de mamífero, sin riesgo de desencadenar una respuesta inmune grave. El polipéptido o la composición del presente invento se puede distribuir en un dispositivo de microencapsulación con objeto de reducir o evitar una respuesta inmune del huésped contra el polipéptido o contra células que pueden producir el polipéptido. El polipéptido o la composición del presente invento se puede también distribuir microencapsulado en una membrana, tal como un liposoma.

Se pueden fijar convenientemente polímeros tales como PEG a uno o más residuos de aminoácido reactivos de una proteína, tales como el grupo alfa-amino del aminoácido amino-terminal, los grupos épsilon-amino de cadenas laterales de lisina, los grupos sulfhidrilo de cadenas laterales de cisteína, los grupos carboxilo de cadenas laterales de aspartilo y glutamilo, el grupo alfa-carboxilo del aminoácido carboxi-terminal, y las cadenas laterales de tirosina, o a derivados activados de cadenas glicosílicas fijadas a ciertos residuos de asparagina, serina o treonina.

Se han descrito numerosas formas activadas de PEG, adecuadas para la reacción directa con proteínas. Los reactivos útiles para la reacción de PEG con grupos amino de proteínas incluyen ésteres activos de derivados de ácido carboxílico o carbonato, particularmente aquellos en que los grupos lábiles son N-hidroxisuccinimida, p-nitrofenol, imidazol o 1-hidroxi-2-nitrobenceno-4-sulfonato. Los derivados de PEG que contienen grupos maleimido o haloacetilo son reactivos útiles para la modificación de grupos sulfhidrilo proteicos libres. Asimismo, los reactivos para PEG que contienen grupos amino-hidrazina o hidrazida son útiles para la reacción con aldehídos generados por la oxidación de grupos carbohidrato de proteínas con peryodato.

Productos farmacéuticos con vehículos

En una realización preferida, el vehículo farmacéutico puede ser un líquido y la composición farmacéutica estaría en forma de disolución. En otra realización igualmente preferida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es un sólido y la composición está en forma de un polvo o una tableta. En una realización más, el vehículo farmacéutico es un gel y la composición está en forma de un supositorio o una crema. En una realización más, el ingrediente activo puede ser formulado como una parte de un parche transdérmico farmacéuticamente aceptable.

Un vehículo sólido puede incluir una o más sustancias que pueden también actuar como agentes saboreadores, lubricantes, agentes solubilizadores, agentes suspendedores, cargas, agentes mejoradores de la fluencia, agentes auxiliares de la compresión, aglutinantes o agentes disgregantes de tabletas; también puede ser un material de encapsulación. En los polvos, el vehículo es un sólido finamente dividido que está mezclado con el ingrediente activo finamente dividido. En las tabletas, se mezcla el ingrediente activo con un vehículo que tiene las propiedades de compresión necesarias, en las proporciones adecuadas, y se compacta la mezcla hasta la forma y el tamaño deseados. Los polvos y las tabletas contienen preferiblemente hasta 99% del ingrediente activo. Los vehículos sólidos adecuados incluyen, por ejemplo, fosfato cálcico, estearato magnésico, talco, azúcares, lactosa, dextrina, almidón, gelatina, celulosa, polivinilpirrolidina, ceras de bajo punto de fusión y resinas de intercambio iónico.

Para preparar disoluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, elixires y composiciones presurizadas, se utilizan vehículos líquidos. El ingrediente activo puede ser disuelto o suspendido en un vehículo líquido farmacéuticamente aceptable, tal como agua, un disolvente orgánico, una mezcla de ambos, o grasas o aceites farmacéuticamente aceptables. El vehículo líquido puede contener otros aditivos farmacéuticos adecuados, tales como agentes solubilizadores, agentes emulsivos, tampones, conservantes, agentes edulcorantes, agentes saboreadores, agentes suspendedores, agentes espesantes, colorantes, agentes reguladores de la viscosidad, estabilizantes y osmorreguladores. Los ejemplos adecuados de vehículos líquidos para administraciones oral y parenteral incluyen agua (que parcialmente contiene aditivos como los anteriores, tales como, por ejemplo, derivados de celulosa, preferiblemente una disolución de carboxilmetil-celulosa sódica), alcoholes (incluyendo alcoholes monohidroxilados y alcoholes polihidroxilados tales como, por ejemplo, glicoles) y sus derivados, y aceites (por ejemplo, aceite de cacahuete y aceite de coco fraccionados). Para administración parenteral, el vehículo puede ser también un éster oleoso, tal como oleato de etilo o miristato de isopropilo. Los vehículos líquidos estériles son útiles en las composiciones estériles en forma líquida para administración parenteral. El vehículo líquido para composiciones presurizadas puede ser un hidrocarburo halogenado u otro propulsor farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones farmacéuticas líquidas que son disoluciones o suspensiones estériles pueden ser utilizadas, por ejemplo, mediante inyección intramuscular, intratecal, epidural, intraperitoneal o subcutánea. Las disoluciones estériles pueden ser también administradas intravenosamente. El ingrediente activo puede ser preparado como una composición sólida estéril que puede ser disuelta o suspendida en el momento de la administración utilizando agua o disolución salina estériles, u otro medio inyectable estéril apropiado. Se considera que los vehículos incluyen los necesarios e inertes aglutinantes, agentes suspendedores, lubricantes, agentes saboreadores, edulcorantes, conservantes, colorantes y revestimientos.

El ingrediente activo del presente invento puede ser administrado oralmente en forma de una disolución o suspensión estéril que contiene otros solutos o agentes suspendedores, tales como, por ejemplo, disolución salina o glucosa suficientes para hacer isotónica la disolución, sales biliares, goma arábiga, gelatina, monooleato de sorbitán, Polysorbate 80 (ésteres de oleato de sorbitol y sus anhídridos, copolimerizados con óxido de etileno) y similares.

El ingrediente activo puede ser también administrado oralmente en forma de composición líquida o sólida. Las composiciones adecuadas para administración oral incluyen formas sólidas tales como píldoras, cápsulas, gránulos, tabletas y polvos, y formas líquidas tales como disoluciones, jarabes, elixires y suspensiones. Las formas útiles para administración parenteral incluyen disoluciones, emulsiones y suspensiones estériles.

En otra realización del presente invento, el sujeto puede tener diabetes. El sujeto puede presentar complicaciones asociadas con la diabetes. Algunos ejemplos de dichas complicaciones incluyen la activación de receptores de AGE de células endoteliales y macrófagos, y proteínas de la membrana basal, la matriz y lipoproteínas alteradas; contractilidad y sensibilidad hormonal del músculo liso vascular alteradas; permeabilidad de células endoteliales alterada; acumulación de sorbitol; y agotamiento de mioinositol neural o actividad ATPasa Na-K alterada. Dichas complicaciones se discuten en una reciente publicación de Porte y Schwartz, "Diabetes Complications: Why is Glucose potentially Toxic?", Science, volumen 272, páginas 699-700.

Se describe aquí un método para suprimir la inflamación en un sujeto al interferir en la interacción EN-RAGE/
RAGE en la hipersensibilidad de tipo retardado, la colitis inflamatoria, la enfermedad inflamatoria intestinal crónica, la colitis ulcerosa y trastornos inflamatorios crónicos tales como aterosclerosis, enfermedad de Alzheimer, diabetes e insuficiencia renal.

Se describe aquí un método para activar factores de transcripción a través de la interacción de EN-RAGE y RAGE. En una realización, el factor de transcripción es NF-\kappaB. En otra realización, el factor de transcripción es IL-1\beta. En otra realización, el factor de transcripción es TNF-\alpha. En otra realización, el factor de transcripción es IL-2.

Se describe aquí un método para activar células esenciales para la respuesta inflamatoria a través de la interacción entre RAGE y EN-RAGE o moléculas similares a EN-RAGE.

Se describe aquí un método para alterar el citoesqueleto y la forma celular, la transducción de señales, y la modulación de la función fagocítica incluyendo la quimiotaxis, la fagocitosis, la desgranulación y la generación de productos reactivos.

Se describe aquí un método para tratar la enfermedad de Alzheimer al prevenir la interacción entre RAGE y el péptido \beta amiloide.

Se describe aquí un método para inhibir la activación celular crónica, que comprende administrar un agente capaz de inhibir la interacción entre EN-RAGE y RAGE a un sujeto que padece activación celular crónica. En una realización, el agente es RAGE soluble, un anticuerpo anti-RAGE, un anticuerpo anti-EN-RAGE, o un fragmento de cualquiera de estos anticuerpos, tal como un fragmento F(ab').

Se describe aquí un método para la inhibición del daño tisular debido a la inflamación, que comprende administrar un agente capaz de inhibir la interacción entre EN-RAGE y RAGE a un sujeto que padece activación celular crónica.

Se describe aquí un método para inhibir la inflamación en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto aquejado de inflamación un agente capaz de inhibir la interacción entre EN-RAGE y RAGE en una cantidad suficiente para inhibir la interacción entre RAGE y EN-RAGE en el sujeto, inhibiéndose de este modo la inflamación en el sujeto. En una realización, el agente es RAGE soluble, un anticuerpo anti-RAGE, un anticuerpo anti-EN-RAGE, o un fragmento de cualquiera de estos anticuerpos, tal como un fragmento F(ab').

El nivel de activación celular en un sujeto puede ser medido de muchas formas, y dichas formas son conocidas por quien tiene experiencia en la técnica. Por ejemplo, se podría medir el nivel de ciertas moléculas que son indicativas de activación, tales como interleucina 1-beta, TNF-\alpha y otras citocinas conocidas por ser indicativas de la presencia de una respuesta inflamatoria.

Se describe aquí un método para tratar la colitis en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un agente capaz de inhibir la interacción entre RAGE y EN-RAGE en el sujeto con objeto de disminuir la inflamación crónica y tratar de ese modo la colitis en el sujeto.

Se describe aquí un método para inhibir la inflamación en un sujeto, que comprende administrar al menos un agente capaz de inhibir la interacción entre RAGE y EN-RAGE en el sujeto, inhibiéndose de este modo la inflamación en el sujeto. En una realización, se administran tanto un anticuerpo anti-RAGE como un anticuerpo anti-EN-RAGE.

Este invento es ilustrado en la sección "Detalles Experimentales" que viene a continuación. Estas secciones se exponen para facilitar la comprensión del invento pero no están destinadas a limitar, ni se debe considerar que limitan, en modo alguno el invento como se expone en las reivindicaciones que vienen más adelante.

Detalles experimentales

Experimento nº 1

El presente invento proporciona una nueva molécula proinflamatoria de tipo citocina (EN-RAGE) (que tiene cierta similitud de secuencia con la familia de las moléculas de calgranulina). EN-RAGE es una proteína situada dentro de células inflamatorias (tales como neutrófilos) y que puede ser liberada por dichas células inflamatorias. EN-RAGE
tiene una actividad biológica que puede ser responsable de la propagación y el mantenimiento de una respuesta inflamatoria al interaccionar con el receptor celular RAGE.

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Ejemplo 1 La interacción de EN-RAGE (nueva proteína extracelular ligante de RAGE) con el receptor de AGE (RAGE) perpetúa las respuestas inflamatorias: supresión de reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado con receptor soluble de AGE (sRAGE)

La expresión de RAGE, el receptor de los productos finales de glicosilación avanzada, se ve aumentada en el escenario de la inflamación. Se presenta aquí un nuevo miembro de la familia calgranulínica de citocinas proinflamatorias, denominado EN-RAGE (o nueva proteína extracelular ligante de RAGE), que interacciona con el RAGE de células tales como las células endoteliales para alterar propiedades celulares de un modo consistente con la perturbación. En un modelo de hipersensibilidad retardada, la administración de RAGE soluble (el dominio extracelular de RAGE que se une al ligando; sRAGE) o fragmentos F(ab')_{2} anti-RAGE o anti-EN-RAGE atenuaba notablemente la inflamación. Estos datos relacionan a RAGE con la respuesta inflamatoria e identifican a EN-RAGE y RAGE como nuevas dianas para intervención antiinflamatoria. Por lo tanto, el RAGE soluble es además una estructura prototípica para el diseño de una nueva clase de agentes antiinflamatorios.

El receptor de AGE (RAGE) es un miembro de la superfamilia inmunoglobulínica de moléculas de la superficie celular (1-2). Originalmente identificado y caracterizado como un receptor celular de proteínas modificadas con glucosa (aldosa), o productos finales de glicosilación avanzada (AGEs) (3-13), de RAGE se ha comunicado posteriormente que interacciona con otros ligandos, tanto en escenarios de desarrollo normal como en la enfermedad de Alzheimer (14-16). En el desarrollo normal, RAGE interacciona con anfoterina, un polipéptido que media en la emergencia de neuritas en neuronas embrionarias en cultivo. En estos estudios, F(ab')_{2} anti-RAGE o RAGE soluble (sRAGE) inhibía la emergencia de neuritas en matrices revestidas con anfoterina pero no en matrices revestidas con otros sustratos tales como laminina y poli-1-lisina (3). En estudios posteriores, el RAGE fue identificado como un receptor, presente en neuronas y microglía, del péptido \beta amiloide, un polipéptido ligado a la patogénesis de la toxicidad neuronal y la muerte en la enfermedad de Alzheimer.

En observaciones de nuestro laboratorio no publicadas, se advirtió una expresión aumentada de RAGE en las células vasculares e inflamatorias de lesiones inflamatorias, tal como en el tejido renal de pacientes con nefritis por lupus activo (Figura 1). Por lo tanto, se formuló la hipótesis de que RAGE podría interaccionar con un(os) ligando(s) alternativo(s) en ese escenario, quizás con objeto de participar en la respuesta inflamatoria.

Los hallazgos presentes demuestran que RAGE interacciona con una molécula que tiene una homología próxima a la de la calgranulina C. Hemos llamado EN-RAGE (nueva proteína extracelular ligante de RAGE) a esta molécula y mostrado que la interacción EN-RAGE:RAGE activa células tales como células endoteliales, las cuales están importantemente implicadas en la respuesta inflamatoria. En un modelo de hipersensibilidad retardada murina, la administración de RAGE soluble (sRAGE), que contiene el dominio de interacción con el ligando, inhibe el desarrollo de la activación celular y la inflamación. Estos hallazgos identifican a RAGE como una nueva diana para intervención antiinflamatoria.

Materiales y métodos Aislamiento y purificación de EN-RAGE

Se sometió polvo acetónico de pulmón bovino (SIGMA®) a solubilización en un tampón que contenía Tris (0,02 M, pH de 7,4), NaCl (0,15 M), octil-\beta-glucósido (1%) e inhibidores de proteasas (PMSF y aprotinina). Después de una cromatografía en serie sobre SP Sepharose (Pharmacia LKB®) y resina Affi-Gel 10 (BIO-RAD®) a las que se había adsorbido RAGE soluble humano purificado (preparado a partir de un sistema de expresión baculovírico), se identificaron proteínas ligantes de RAGE basándose en un ensayo de exploración en que se empleaban una fracción inmovilizada de columna (placas Nunc Maxisorp; NUNC®) y sRAGE marcado con ^{125}I, como antes. Después de una elución con tampón que contenía heparina (1 mg/ml), se identificaron las fracciones positivas. Las proteínas ligantes de RAGE fueron sometidas a un análisis de secuencias.

Clonación de EN-RAGE. El cDNA de EN-RAGE fue clonado a partir de un banco de pulmón bovino y fue introducido en un sistema de expresión baculovírico. En este sistema, se sintetizó EN-RAGE, que carece de una secuencia líder, dentro de células Sf9. Luego se purificó EN-RAGE después de una solubilización de las células en tampón que contenía detergente y una purificación secuencial en hidroxilapatito y resinas que contenían heparina. El producto final presentaba una única banda en electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE; del inglés, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), teñidos con Coomassie, y estaba desprovisto de endotoxina tras una cromatografía en columnas Detoxi-GEL (PIERCE®). La ausencia de endotoxina detectable fue confirmada utilizando el ensayo de amebocitos de Limulus (SIGMA®).

Análisis de secuencias. Después de que la SDS-PAGE permitiera identificar un polipéptido de \approx 12 kDa con actividad ligante de RAGE, la banda del gel fue eluida de acuerdo con métodos previamente publicados (17). El método publicado fue modificado mediante la adición de un lavado final con dos partes alícuotas (0,1 ml cada una) de guanidina (5,0 M), urea (5,0 M), ácido trifluoroacético (0,2%), acetonitrilo (10%) y Zwittergent 3-08 (1,0%; Calbiochem) para asegurar que la proteína era completamente separada del filtro por lavado. Se llevó a cabo un análisis de la secuencia amino-terminal. Se llevó a cabo una degradación automatizada de Edman empleando un secuenciador HP-G1005A (Hewlett Packard Analytical Instruments). Con objeto de obtener la secuencia interna, las bandas de los geles fueron tratadas del modo anterior para la elución salvo porque el tampón de extracción contenía la mitad de la cantidad habitual de SDS (1). Se añadió endoproteinasa Lys-C (1 \mug; Boehringer Mannheim) y se incubó la muestra durante la noche. El producto de digestión fue luego fraccionado mediante cromatografía de alta eficacia en fase líquida (HPLC; del inglés, high performance liquid chromatography), de microcalibre (Michrom Bioresources), en una columna PLRP-S de 1 mm x 50 mm (Polymer Laboratories, Ltd.). El gradiente utilizado fue 2% por minuto a partir de acetonitrilo (5-75%) en ácido trifluoroacético (0,1%), y se recogieron fracciones a intervalos de 30 segundos. Se verificó la absorbancia a 214 nm, y las fracciones que correspondían a picos cromatográficos fueron luego sometidas al análisis de secuencias.

Activación de células endoteliales. Se aislaron, caracterizaron y mantuvieron células endoteliales de vena de cordón umbilical humano de la manera previamente descrita (18). Se cultivaron las células durante 24 horas en medio RPMI 1640 exento de suero, sin factor de crecimiento de células endoteliales, y luego se estimularon con las concentraciones indicadas de EN-RAGE. Donde se indica, las células fueron pretratadas con IgG anti-RAGE humano generada en conejo o con IgG no inmune de conejo; en ciertos casos, el EN-RAGE fue pretratado con la concentración indicada de RAGE soluble (sRAGE) durante 2 horas antes de la estimulación con EN-RAGE. Después de ocho horas de estimulación con EN-RAGE, las células fueron fijadas con paraformaldehído (2%) durante 30 minutos, lavadas dos veces con PBS y tratadas con PBS que contenía leche seca sin grasa (5%) y BSA (2,5%) para bloquear los sitios de unión inespecífica de la superficie celular. Se llevó a cabo un ELISA de la superficie celular empleando IgG anti-VCAM-1 (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, California, EE.UU.). La valoración de la actividad VCAM-1 funcional fue determinada utilizando células Molt-4 (ATCC) marcadas con ^{51}Cr, de la manera previamente descrita (10).

Modelo de hipersensibilidad retardada. Se estableció un modelo murino de hipersensibilidad retardada basándose en estudios previamente publicados (19). Se sensibilizaron hembras de ratón CF-1 (Charles River Laboratories), de 6 semanas de edad, mediante una inyección subcutánea de una emulsión (0,1 ml) que contenía BSA metilada (mBSA; 25 mg/ml; SIGMA®), NaCl (0,9%), dextrano (peso molecular de 5-40 x 10^{6}; 50 mg/ml; SIGMA®) y adyuvante incompleto de Freund (50%; ICN Biomedical) en el ganglio linfático inguinal izquierdo. Tres semanas más tarde, se inyectó subcutáneamente mBSA (0,4 mg/ml; 0,050 ml) en la zona plantar de la pata trasera izquierda. Donde se indica, los ratones fueron pretratados con una inyección intraperitoneal de sRAGE (dosis indicada), albúmina sérica de ratón (SIGMA®) o fragmentos F(ab')_{2} inmunes o no inmunes (preparados utilizando un sistema de Pierce) 24 y 12 horas antes de, y 6 y 12 horas después de, la estimulación local con mBSA. 24 horas después de la inyección de mBSA en la almohadilla de la pata, se realizó la calificación clínica de la almohadilla de la pata. Luego se sacrificaron humanamente los ratones y se congelaron o fijaron en formol (10%) las patas para un análisis ulterior. Se llevó a cabo la calificación histológica sobre cortes de patas teñidos con hematoxilina y eosina (H&E; SIGMA®). La calificación clínica fue definida del modo siguiente (escala: 1-5): 1 = ausencia de inflamación y, por lo tanto, identidad con respecto a la pata no tratada; 2 = rubefacción y edema ligeros; 3 = rubefacción y edema intensos con arrugamiento de la piel de la almohadilla de la pata; 4 = rubefacción y edema intensos sin arrugamiento de la piel de la almohadilla de la pata; y 5 = rubefacción y edema intensos que dan lugar a separación de los dedos. La calificación histológica después de la tinción con hematoxilina y eosina fue definida del modo siguiente (escala: 1-5): 1 = sin infiltración leucocitaria y con ligero edema subcutáneo; 2 = ligera infiltración leucocitaria perivascular con ligero edema subcutáneo; 3 = intensa infiltración leucocitaria sin granulomas; y 4 = intensa infiltración leucocitaria con granulomas.

Resultados

Identificación de EN-RAGE. Después de una serie de sucesivos experimentos diseñados para identificar proteínas ligantes de RAGE procedentes de extracto pulmonar bovino (del que se purificó originalmente el RAGE), se identificó un polipéptido de \approx 12 kDa. Tras el análisis de la secuencia, se halló que este polipéptido presenta una homología significativa con respecto a miembros de la familia proteínica de la calgranulina C (Tabla 1) (20-21). Esta clase de proteínas existe intracelularmente en las células inflamatorias. Se formuló el postulado de que, tras la liberación en loci inflamados, podría ser capaz a su vez de afectar y activar otras células ya reclutadas en la respuesta inflamatoria. Por lo tanto, esto podría representar un medio importante mediante el cual podría propagarse y mantenerse la respuesta inflamatoria, aumentando por ello la probabilidad de daño celular.

EN-RAGE activa células endoteliales de un modo dependiente de RAGE. Para probar esta hipótesis, se purificó EN-RAGE del modo anteriormente descrito y se incubó con células endoteliales (EC; del inglés, endothelial cells). La incubación de EN-RAGE con HUVECs dio lugar a un aumento de la molécula 1 de adhesión de células vasculares (VCAM-1; del inglés, vascular cell adhesion molecule-1) en la superficie celular de un modo dependiente de RAGE (Figura 2). Estos datos sugerían que, en un foco inflamatorio, la interacción de EN-RAGE con RAGE de EC podría representar un medio mediante el cual se propagara más una respuesta inflamatoria. Consecuentemente con el aumento de antígeno VCAM-1 en la superficie de ECs tratadas con EN-RAGE, se originó una unión aumentada de células Molt-4 (que contienen el ligando de VCAM-1, VLA-4) (Figura 3). Mientras que la incubación con BSA o con IgG no inmune no afectaba a la capacidad de EN-RAGE para activar VCAM-1 de ECs, la incubación con sRAGE o F(ab')_{2} anti-RAGE atenuaba significativamente la capacidad de EN-RAGE para aumentar la unión de Molt-4 a HUVECs tratadas.

Se buscó probar estas hipótesis en modelos in vivo. Se demostró que en ratones diabéticos, en los que es probable que el ligando de RAGE sea, al menos en parte, productos de glicosilación/oxidación de proteínas/lípidos, los productos finales de glicosilación avanzada o AGEs, la administración de la porción soluble de RAGE que se une al ligando (RAGE soluble o sRAGE) suprimía la aterosclerosis acelerada en ratones diabéticos deficientes en apolipoproteína E (12) y mejoraba la cicatrización de heridas en ratones db+/db+ genéticamente diabéticos (22). De este modo, en presencia de sRAGE se podrían suprimir los efectos biológicos de EN-RAGE en focos muy inflamatorios, tales como los caracterizados por modelos de lesiones inflamatorias granulomatosas (hipersensibilidad retardada).

Para probar esto, se estudió un modelo de hipersensibilidad retardada (DH; del inglés, delayed hypersensitivity) en que primero se sensibilizaban ratones mediante la inyección de BSA metilada (mBSA, que no se une a RAGE) en los ganglios linfáticos inguinales de hembras de ratón CF-1. Tres semanas después de la sensibilización, los ratones fueron estimulados con mBSA inyectada en la almohadilla de la pata trasera. Se definió una calificación de inflamación mediante una escala de 1-9 que incluía tanto la calificación clínica (1-4) como la calificación histológica (1-5), como se indica en la Figura 4.

Consecuentemente con nuestra hipótesis, la administración de sRAGE suprimía la inflamación tras la inyección de mBSA en la almohadilla de la pata de ratones previamente sensibilizados con mBSA inyectada en los ganglios linfáticos, de una manera dependiente de la dosis (Figura 4). Con cerca de 100 \mug de sRAGE, la inflamación resultaba notablemente suprimida (p < 0,01). Por contraste, la administración de albúmina sérica de ratón no ejercía efecto alguno sobre el aspecto de la lesión inflamatoria (Figura 4). Consecuentemente con el importante papel de EN-RAGE y RAGE en el desarrollo de la inflamación en este modelo, el tratamiento de los ratones con F(ab')_{2} anti-EN-RAGE o F(ab')_{2} anti-RAGE suprimía considerablemente la inflamación (p < 0,05 en cada caso en comparación con el tratamiento con F(ab')_{2} no inmune). Cuando los ratones fueron tratados tanto con F(ab')_{2} anti-EN-RAGE como con F(ab')_{2} anti-RAGE, resultó una supresión aún mayor de la respuesta inflamatoria (p < 0,05 en comparación con el tratamiento con F(ab')_{2} no inmune) (Figura 4).

Discusión

Ciertamente, el fenotipo de inflamación observado en las reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado representa la culminación de una interacción y una contribución complejas de múltiples tipos celulares y sus mediadores celulares. En el desarrollo de la inflamación, una fuente importante de los estímulos puede proceder de las propias células inflamatorias. Tras el reclutamiento inicial en un locus inflamatorio, células tales como neutrófilos y macrófagos pueden liberar mediadores tales como los de la familia calgranulínica, incluyendo EN-RAGE, y propagar y mantener la respuesta inflamatoria. Es probable que dichos mediadores, tales como EN-RAGE, requieran receptores celulares para iniciar procesos que culminarán en una expresión génica alterada.

Nuestros datos sugieren acusadamente que la interacción EN-RAGE/RAGE es un factor importante en estos procesos. Se advirtió una supresión casi completa de la inflamación en presencia de sRAGE, de un modo dependiente de la dosis. Según nuestros estudios, sRAGE puede actuar como un señuelo en este escenario para unirse a EN-RAGE antes de que éste pueda interaccionar con células que contienen RAGE, implicadas en la respuesta inflamatoria. Además, en presencia de F(ab')_{2} anti-RAGE/anti-EN-RAGE o anti-RAGE + anti-EN-RAGE, se observó una supresión sustancial de la inflamación, lo que indica además un papel de estos factores en la modulación de la respuesta inflamatoria.

Por supuesto, es importante advertir que en estos escenarios pueden estar operativos mecanismos alternativos que sirvan de base a los efectos beneficiosos de sRAGE. Sin embargo, los estudios anteriormente expuestos en que se emplean los fragmentos F(ab')_{2} indicados implican acusadamente a EN-RAGE y RAGE en la evolución de la respuesta inflamatoria en este escenario.

En conclusión, los estudios aquí presentados implican centralmente a RAGE en la respuesta inflamatoria e identifican a RAGE soluble como una estructura prototípica para el desarrollo de nuevos agentes antiinflamatorios.

Nota: la Figura 5 muestra la secuencia de ácido nucleico (secuencia de cDNA) del EN-RAGE bovino.

TABLA 1 Análisis de la secuencia de EN-RAGE y comparación con la de proteínas relacionadas

1

Ejemplo 2 Células endoteliales activadas con EN-RAGE (nueva proteína extracelular ligante de RAGE) median en respuestas inflamatorias

La expresión del receptor de AGE (RAGE) está aumentada en escenarios inflamatorios tales como aterosclerosis y vasculitis autoinmunes. Proponemos la hipótesis de que, en tales escenarios, el receptor de AGE (RAGE) podría interaccionar con ligandos alternativos además de con los productos finales de glicosilación avanzada (AGEs). Se aisló y purificó un polipéptido de \approx 12 kDa a partir de extracto de pulmón bovino, que presentaba homología con respecto a la familia calgranulínica de mediadores proinflamatorios. Este polipéptido, llamado EN-RAGE, se une a RAGE inmovilizado y a RAGE de células endoteliales (EC)/macrófagos (MP) en pocillos de cultivo con una Kd \approx 75 nM, procesos que resultan bloqueados en presencia de IgG anti-RAGE o de RAGE soluble (sRAGE; los dos tercios extracelulares de RAGE). In vitro, la exposición de ECs cultivadas a EN-RAGE aumentó la activación de NF-\kappaB, la expresión de VCAM-1 de la superficie celular (4,3 veces en comparación con el tratamiento con albúmina sérica bovina, BSA) y la adhesión de células Molt-4 (que llevan VLA-4, el contraligando de VCAM-1) (siete veces en comparación con BSA), todo de una manera inhibida en presencia de IgG anti-RAGE o sRAGE. La exposición de macrófagos a EN-RAGE dio lugar a una quimiotaxis aumentada de un modo dependiente de RAGE. Para probar estos conceptos in vivo, se utilizó un modelo de hipersensibilidad retardada en ratones, a los que se indujo una inflamación localizada mediante inyecciones de BSA metilada (mBSA) en las almohadillas de las patas. Un pretratamiento (intraperitoneal; ip) con sRAGE evitó la inflamación mediada por mBSA, de un modo dependiente de la dosis. Con 100 \mug de sRAGE ip, la pata tratada con mBSA no manifestó inflamación y presentó una activación notablemente disminuida de NF-\kappaB en comparación con la de ratones tratados con vehículo, albúmina sérica de ratón (MSA); además, se evitó completamente la elaboración de TNF-alfa en el suero. Se observaron respuestas antiinflamatorias parciales tras el tratamiento de los ratones con F(ab')_{2} anti-RAGE o anti-EN-RAGE. El F(ab')_{2} no inmune no produjo efecto alguno. Considerados conjuntamente, estos hallazgos indican que ligandos alternativos a AGEs tales como EN-RAGE activan ECs y MPs, lo que liga RAGE a la respuesta inflamatoria generalizada.

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Ejemplo 3 sRAGE origina una mortalidad disminuida después de una endotoxemia: un posible tratamiento para el choque séptico

El uso de sRAGE o de compuestos que son capaces de inhibir la interacción de EN-RAGE y RAGE podría ser útil para el tratamiento del choque séptico o la sepsis en sujetos. Se ha mostrado que un sujeto que recibe dosis letales de LPS presenta una mortalidad reducida cuando el LPS se administra en presencia de sRAGE.

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sRAGE y endotoxemia

Se ha mostrado que el receptor soluble de AGE (sRAGE) evita la inflamación en un modelo de hipersensibilidad de tipo retardado. Se cree que sRAGE, a diferencia de ciertos agentes de tipo antiinflamatorio, podría ejercer efectos beneficiosos cuando se administra en el escenario de una endotoxemia, un resultado prototípico de, por ejemplo, una intensa bacteriemia Gram negativa.

Cuando se administraron dosis uniformemente letales de LPS a ratones Balb/C (= 750 \mug), la administración de sRAGE (antes o después de la inyección de LPS) evitó la muerte en \approx 50% de los ratones en estudios piloto.

Estos datos subrayan la proposición de que los potentes efectos antiinflamatorios de sRAGE no están asociados con una inclinación adversa hacía morbilidad/mortalidad a causa de la presencia de septicemia/endotoxemia. Por lo tanto, sRAGE puede ser un agente antiinflamatorio selectivo con efectos protectores selectivos frente a respuestas inflamatorias mal adaptadas.

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Ejemplo 4

Se indujo artritis en ratones dba mediante sensibilización con colágeno II bovino. Ciertos ratones (20) fueron tratados con RAGE soluble murino (100 \mug/día administrados intraperitonealmente); otros (20) fueron tratados con albúmina sérica murina, como tratamiento con vehículo. La mitad de los ratones fue sacrificada 6 semanas más tarde; la mitad restante fue sacrificada 9 semanas más tarde.

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Los datos son los siguientes:

1. Se midió la hinchazón articular en los ratones tratados con sRAGE frente a los tratados con albúmina. La hinchazón articular aumentó 2 veces en los ratones tratados con albúmina frente a los tratados con sRAGE; p < 0,05 en ambos momentos.

2. En el momento de las 9 semanas, los niveles plasmáticos del factor alfa de necrosis tumoral eran 3 veces mayores en los ratones tratados con albúmina frente a los tratados con sRAGE (p < 0,05).

3. Una inyección local de colágeno II bovino en la oreja dio lugar a un aumento de 2 veces del espesor de la oreja en los ratones tratados con albúmina; no se advirtió cambio alguno de la línea de base en los ratones tratados con sRAGE (p < 0,05).

4. Los niveles de monocitos en sangre periférica eran 2,5 veces menores en los ratones tratados con sRAGE frente a los tratados con albúmina (p < 0,05), lo que sugiere una inflamación disminuida.

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Referencias

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Experimento nº 2

RAGE media en un nuevo eje proinflamatorio: el receptor de la superficie celular para polipéptidos S100/calgranulina

Los polipéptidos S100/calgranulina están presentes en sitios de inflamación, probablemente liberados por células inflamatorias dirigidas a dichos loci por una diversidad de señales ambientales. Se comunica aquí que el receptor de AGE (RAGE) es el receptor de la superficie celular para EN-RAGE (nueva proteína extracelular ligante de RAGE) y miembros relacionados de la superfamilia de S100/calgranulina. La interacción de EN-RAGEs con RAGE celular en el endotelio, fagocitos mononucleares y linfocitos desencadena una activación celular, con generación de mediadores proinflamatorios esenciales. El bloqueo de EN-RAGE/RAGE sofoca la hipersensibilidad de tipo retardado y la colitis inflamatoria en modelos murinos al detener la activación de las vías centrales de señalización y la expresión de genes inflamatorios. Estos datos destacan un nuevo paradigma en la inflamación e identifican nuevos papeles para EN-RAGEs y RAGE en la activación celular y el daño tisular crónicos.

El receptor de los productos finales de glicosilación avanzada (RAGE), un miembro de la superfamilia inmunoglobulínica de moléculas de la superficie celular (Schmidt et al., 1992; Neeper et al., 1992), interacciona con diferentes ligandos. Aunque el RAGE fue originalmente descrito como un receptor celular de productos finales de glicosilación avanzada (AGEs), los productos de glicoxidación que se acumulan en trastornos tales como la diabetes y la insuficiencia renal (Brownlee et al., 1988; Sell y Monnier, 1989; Reddy et al., 1995; Miyata et al., 1996 a,b), datos recientes indican que está surgiendo un papel importante para RAGE en una diversidad de escenarios, tanto en la homeostasis como en estados patofisiológicamente importantes (Hori et al., 1995; Yan et al., 1996; Yan et al., 1997).

Consecuentemente con un paradigma emergente que pone en tela de juicio el concepto de un receptor que interacciona con un ligando, advertimos previamente que RAGE se unía a un polipéptido de \approx 12 kDa (Hori et al., 1995), un miembro de la superfamilia S100/calgranulínica de citocinas proinflamatorias (Zimmer et al., 1995; Schafer y Heinzmann, 1996). Dichas moléculas, probablemente liberadas por células inflamatorias activadas tales como leucocitos polimorfonucleares, fagocitos mononucleares procedentes de sangre periférica y linfocitos, han sido tradicionalmente descritas como moléculas que se acumulan en estados caracterizados por una inflamación crónica, tales como conjuntivitis inflamatoria (Gottsch et al., 1997; Gottsch y Liu, 1998), enfermedad cutánea psoriásica (Madson, 1991), fibrosis quística (Andersson et al., 1988), enfermedad inflamatoria intestinal (Lugering et al., 1995; Schmid et al., 1995), artritis reumatoide (Odink et al., 1987) e infección parasitaria crónica (Marti et al., 1996). Sin embargo, hasta la fecha, no se han elucidado medios específicos por los cuales polipéptidos de la familia de S100/calgranulina modulan potencialmente el curso de procesos inflamatorios. Se comunica aquí la caracterización de un polipéptido de 12 kDa, denominado EN-RAGE (nueva proteína extracelular ligante de RAGE). La ligación de RAGE celular por EN-RAGE y moléculas similares a EN-RAGE media en la activación de células endoteliales, macrófagos y linfocitos, células centrales para el desarrollo del fenotipo inflamatorio. Consecuentemente con el concepto de que la interacción EN-RAGE/RAGE es una fase próxima crítica en la cascada de procesos que amplifican la inflamación, la administración de RAGE soluble o F(ab')_{2} anti-RAGE/anti-EN-RAGE en modelos murinos de hipersensibilidad de tipo retardado y de enfermedad inflamatoria intestinal crónica suprime el desarrollo de la inflamación, con una activación suprimida de NF-\kappaB y mediadores inflamatorios.

Los datos presentes validan así por vez primera una importante función patogénica para EN-RAGE y moléculas similares a EN-RAGE en la respuesta inflamatoria. Se formula la hipótesis de que, tras el reclutamiento de células inflamatorias a, por ejemplo, sitios de lesiones autoinmunes, físicas o mediadas por infección, la liberación de estas moléculas y su subsiguiente interacción con el RAGE celular pueden propagar una potente serie de agravantes procesos proinflamatorios. Por lo tanto, estos datos destacan un nuevo paradigma en la inflamación e identifican nuevas funciones para EN-RAGEs y RAGE en la activación celular y el daño tisular crónicos.

Procedimientos experimentales 1. Análisis de secuencias de proteínas

Para llevar a cabo el análisis de secuencias, las bandas (\approx 12 kDa) fueron eluidas de geles de SDS-PAGE del modo previamente descrito (Hori et al., 1995). Se llevó a cabo una degradación de Edman automatizada usando un secuenciador HP-G1005A (Hewlett Packard Analytical Instruments, Palo Alto, California, EE.UU.). Se llevó a cabo la secuenciación interna utilizando una digestión con endoproteinasa Lys-C (Boehringer Mannheim) seguida de una HPLC de microcalibre, del modo descrito (Hori et al., 1995).

2. Clonación molecular

Se llevó a cabo la clonación molecular utilizando un banco de pulmón bovino y un banco de pulmón humano (Clontech, Palo Alto, California, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con objeto de obtener el cDNA para los EN-RAGE bovino y humano. La secuencia que codifica el cDNA bovino para EN-RAGE tiene la referencia AF 011757 (Genbank).

3. Expresión proteica

El cDNA que codifica EN-RAGE fue dispuesto en un sistema de expresión baculovírico y fue hecho expresar en células de Spodoptera frugiperda 9 (Sf9; Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.). El EN-RAGE fue purificado a partir de sedimentos celulares de centrifugación mediante cromatografía secuencial en columnas de heparina e hidroxilapatito (Amersham Pharmacia, Piscataway, New Jersey, EE.UU.), realizándose la elución con NaCl en concentraciones crecientes. El EN-RAGE purificado, una única banda en los geles teñidos con Coomassie, Mr \approx 12 kDa, fue desprovisto de endotoxina antes de los experimentos mediante cromatografía en columnas Detoxi-Gel (Pierce, Arlington Heigths, Illinois, EE.UU.). La ausencia de endotoxina fue confirmada utilizando un sistema de Sigma (St. Louis, Missouri, EE.UU.) (ensayo de amebocitos de Limulus). Donde se indica, se empleó S100B purificado procedente de cerebro humano (Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, California, EE.UU.).

4. Inmunotransferencia

Estudios in vitro : Se aislaron células mononucleares humanas procedentes de sangre periférica de voluntarios normales utilizando Histopaque 1077 (Sigma) y se obtuvieron células Jurkat E6 de la Corporación Americana de Tejidos Tipo (Rockville, Maryland, EE.UU.). Donde se indica, las células fueron estimuladas con PMA (10 ng/ml), ionomicina (100 ng/ml) o TNF-\alpha (Genzyme, Cambridge, Massachusetts, EE.UU.) durante 12 horas. Las células (1x10^{7}) fueron sonicadas (Sonifer 250, Branson, Danbury, Connecticut, EE.UU.) en PBS que contenía una mezcla de inhibidores de proteasas (Boehringer Mannheim, Indianápolis, Indiana, EE.UU.) y centrifugadas a 4ºC durante 30 minutos a 14.000 rpm. Se midió la concentración proteica del sobrenadante utilizando el ensayo proteico de Bio-Rad (Hercules, California, EE.UU.). Se añadieron 7 \mug de proteína a cada carril de geles de Tris-glicocola (Novex, San Diego, California, EE.UU.). Luego se transfirieron los geles a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad) y se realizó la inmunotransferencia usando IgG anti-EN-RAGE monoespecífica y policlonal de conejo, preparada contra EN-RAGE bovino recombinante de longitud completa. Se emplearon IgG anti-conejo generada en cabra, marcada con peroxidasa de rábano picante (Sigma), y un sistema de ECL (Amersham-Pharmacia) para indicar los sitios de la unión del anticuerpo primario.

Estudios in vivo : Se inyectó intraperitonealmente LPS (Sigma; 30 \mug/g de peso corporal) a ratones CF-1. Donde se indica, ciertos ratones fueron pretratados con sRAGE murino (100 \mug) 12 horas y 1 hora antes de la inyección de LPS. Se sacrificaron los ratones en los momentos indicados, y se sometió suero (0,015 ml) a electroforesis utilizando geles de Tris-glicocola (14%; Novex) y se realizó la inmunotransferencia del modo anterior. En ambos casos, se llevó a cabo una densitometría utilizando el software ImageQuant de Molecular Dynamics (Foster City, California, EE.UU.).

5. Ensayos de unión de radioligandos

El EN-RAGE purificado fue radiomarcado utilizando ^{125}I y Iodobeads (Pierce) hasta una actividad específica de aproximadamente 5000 cpm/ng. Los ensayos de unión de radioligandos se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos a los que se había adsorbido RAGE humano purificado (5 \mug/pocillo) o células endoteliales de aorta bovina. En el primer caso, después de la adsorción de RAGE soluble humano a la placa de plástico en tampón de carbonato/bicarbonato (pH de 9,3) durante la noche, los pocillos fueron lavados con PBS que contenía Tween 20 (0,05%). Los sitios ligantes desocupados de los pocillos de plástico fueron bloqueados por incubación con PBS que contenía calcio/magnesio y albúmina sérica bovina (1%) durante dos horas a 37ºC. Tras la aspiración del contenido de los pocillos, se llevó a cabo un ensayo de unión de radioligandos en presencia de la concentración indicada de EN-RAGE radiomarcado \pm un exceso molar de 50 veces de EN-RAGE no marcado en PBS que contenía calcio/magnesio y BSA, 0,2%, durante 3 horas a 37ºC. Al final de ese tiempo, los pocillos fueron rápidamente lavados con tampón de lavado como antes. La elución del material unido se llevó a cabo en una disolución que contenía heparina, 1 mg/ml. Luego se aspiró la disolución de los pocillos y se sometió a cuenta en un contador de radiación gamma (LKB, Gaithersburg, Maryland, EE.UU.). En los ensayos de unión celular, se sembraron células endoteliales de aorta bovina (BAECs) en placas de 96 pocillos para cultivo tisular previamente revestidas con colágeno I (Biocoat; Becton Dickinson, Bedford, Massachusetts, EE.UU.). Una vez alcanzada la confluencia, se lavaron las células con PBS y se llevó a cabo un ensayo de unión de radioligandos como antes. Los datos de la unión en equilibrio fueron analizados de acuerdo con la ecuación de Klotz y Hunston (Klotz y Hunston, 1984): B = nKA/1 + KA, donde B = ligando específicamente unido (unión total, células incubadas sólo con indicador, menos unión inespecífica, células incubadas con indicador en presencia de material no marcado en exceso), n = sitios/célula, K = constante de disociación, y A = concentración de ligando libre), usando un análisis no lineal por mínimos cuadrados (Prism; San Diego, California, EE.UU.). Donde se indica, se llevó a cabo un pretratamiento con anticuerpos o con RAGE soluble.

6. Estudios de activación celular

Células endoteliales: se aislaron, caracterizaron y mantuvieron células endoteliales de vena de cordón umbilical humano (HUVECs) del modo previamente descrito (Schmidt et al., 1995). Las células fueron cultivadas en RPMI 1640 exento de suero, sin factor de crecimiento de células endoteliales, durante 24 horas y fueron luego estimuladas con las concentraciones indicadas de EN-RAGE u otros estímulos. Donde se indica, las células fueron pretratadas con IgG anti-RAGE humano generada en conejo o con IgG de conejo no inmune; en ciertos casos, se pretrató el EN-RAGE con la concentración indicada de sRAGE durante 2 horas antes de la estimulación con EN-RAGE. Después de ocho horas de estimulación con EN-RAGE, las células fueron fijadas con paraformaldehído (2%) durante 30 minutos, lavadas dos veces con PBS y tratadas con PBS que contenía leche seca sin grasa (5%) y BSA (2,5%) para bloquear los sitios de unión inespecífica de la superficie celular. Se llevó a cabo un ELISA de la superficie celular empleando IgG anti-VCAM-1 (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, California, EE.UU.) del modo previamente descrito (Schmidt et al., 1995b). La valoración de la actividad VCAM-1 funcional fue determinada utilizando células Molt-4 (ATCC) marcadas con ^{51}Cr, de la manera previamente descrita (Schmidt et al., 1995b). Se evaluó la activación de NF-\kappaB utilizando extractos nucleares de HUVEC preparados del modo previamente descrito (Schreiber et al., 1998). Se cargaron 10 \mug de extracto nuclear en geles para PAGE y se llevó a cabo un EMSA usando una sonda para NF-\kappaB, marcada con ^{32}P, procedente del promotor de VCAM-1 (Neish et al., 1992). Se llevaron a cabo ensayos de superdesplazamiento mediante la preincubación de IgG no inmune, anti-p50 o anti-p65, o ambas IgG, con el extracto nuclear durante 45 minutos a temperatura ambiental antes de la adición de la sonda oligonucleotídica radiomarcada.

7. Células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), fagocitos mononucleares (MPs) y células Jurkat

Ensayos de quimiotaxis: se llevaron a cabo ensayos de quimiotaxis del modo previamente descrito (Schmidt et al., 1993) en cámaras de 48 pocillos para microquimiotaxis (Neuro-Probe, Bethesda, Maryland, EE.UU.) que contenían una membrana de policarbonato (8 \mum; Nucleopore, Pleasanton, California, EE.UU.). La cámara inferior contenía el estímulo quimiotáctico, según se indica. Como testigo positivo se empleó N-formil-met-leu-phe (Sigma). Se añadieron células Molt-4 (que llevan RAGE en la superficie celular) a la cámara superior (10^{4} células/pocillo). Después de una incubación a 37ºC durante 4 horas, las células no migratorias de la superficie superior de la membrana fueron suavemente separadas por raspado y eliminadas, la membrana fue luego fijada en metanol (100%) y las células que habían migrado a través de la membrana fueron teñidas con Giemsa (Sigma) y contadas. Se contaron las células en nueve campos de gran aumento y se presentó la media \pm error típico de la media. Cada experimento fue repetido dos veces; en cada caso, se emplearon seis duplicados por condición.

Ensayos mitogénicos: En los estudios in vitro, se aislaron PBMCs de sangre completa utilizando un gradiente de Ficoll (Histopaque 1077; Sigma) y se suspendieron en RPMI que contenía suero bovino fetal (FBS; del inglés, fetal bovine serum) (10%), en una concentración de 1x10^{6} células/ml. Las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos para cultivo tisular y fueron tratadas del modo indicado con EN-RAGE durante 12 horas antes de la estimulación con PHA-P (Sigma) durante 12 horas. Las células fueron luego estimuladas con ^{3}H-timidina (37kBq/pocillo; New England Nuclear, Boston, Massachusetts, EE.UU.) y fueron incubadas durante 18 horas adicionales antes de la recolección y del procesamiento para la cuenta del centelleo en estado líquido utilizando un contador LK Betaplate (Wallac, Inc., Gaithersburg, Maryland, EE.UU.). En los estudios in vivo, se obtuvieron esplenocitos de ratón (raza CF-1) de tejido esplénico de ratones sometidos a estudios de DTH, como se describe más adelante, y se aislaron usando Histopaque 1077. Se estimularon con PMA (0,5 \mug/ml) durante 18 horas los esplenocitos (5x10^{5} por pocillo; placas de 96 pocillos para cultivo tisular) en RPMI que contenía FBS (10%) y, como anteriormente en los estudios in vitro, se determinó el índice de proliferación usando timidina tritiada. Todos los experimentos se llevaron a cabo con determinaciones triplicadas.

Valoración de los niveles de citocinas: se incubaron células BV2 (Yan et al., 1997), que llevan RAGE en la superficie celular, o células Jurkat E6 (ATCC) del modo indicado con EN-RAGE durante los tiempos indicados. En ciertos experimentos, las células fueron preincubadas con F(ab')_{2} anti-RAGE antes de la estimulación con EN-RAGE. En otros casos, se preincubó EN-RAGE con sRAGE antes de la estimulación. Se llevó a cabo un ELISA para TNF-\alpha, IL-1\beta o IL-2 utilizando sistemas de R&D Systems (Minneapolis, Minnesota, EE.UU.). Donde se indica, las células fueron transfectadas con una construcción que codificaba un RAGE humano en que se había suprimido el dominio citosólico (cola) empleando Superfect (Qiagen, Valencia, California, EE.UU.) (1 \mug de DNA/ml de medio); se empleó pcDNA3 (Invitrogen) como vector. Se llevaron a cabo experimentos de estimulación 48 horas después de la transfección.

Estudios con infusiones: Se inyectó intravenosamente EN-RAGE (30 \mug), BSA (30 \mug) o LPS (500 \mug), a través de la vena de la cola, a ratones Balb/c (Charles River) de aproximadamente 6 semanas de edad. Doce horas más tarde, se extrajeron rápidamente los pulmones y se homogeneizaron en disolución salina tamponada con Tris (TBS; del inglés, Tris buffered saline) que contenía inhibidores de proteasas (Boehringer Mannheim), y se sometió el producto de homogeneización a centrifugación a 8000 rpm durante 10 minutos. Luego se centrifugó el sobrenadante a 40.000 rpm durante una hora a 4ºC. El sedimento de centrifugación fue luego disuelto en TBS que contenía inhibidores de proteasas y octil-\beta-glucósido (2%) durante 4 horas a 4ºC. Luego se sometió la suspensión a centrifugación a 14.000 rpm durante 10 minutos y se evaluó la concentración de proteínas (Bio-Rad) en el sobrenadante. Se llevó a cabo una inmunotransferencia después de someter 30 \mug de proteína/carril a electroforesis y transferir los componentes del gel a nitrocelulosa. La IgG anti-VCAM-1 se obtuvo de Santa Cruz Biotechnologies y la visualización de las bandas se realizó con el sistema de ECL (Amersham-Pharmacia).

8. Modelo de hipersensibilidad retardada

Se sensibilizaron hembras de ratón CF-1, de 6 semanas de edad, mediante una inyección subcutánea de una emulsión (0,1 ml) que contenía BSA metilada (mBSA; 25 mg/ml; SIGMA), NaCl (0,9%), dextrano (peso molecular de 5-40 x 10^{6}; 50 mg/ml; SIGMA) y adyuvante incompleto de Freund (50%; ICN Biomedical, Aurora, Ohio, EE.UU.) en el ganglio linfático inguinal izquierdo. Tres semanas más tarde, se inyectó subcutáneamente mBSA (0,4 mg/ml; 0,050 ml) en la zona plantar de la pata trasera izquierda. Donde se indica, los ratones fueron pretratados con una inyección intraperitoneal de sRAGE (dosis indicada), albúmina sérica de ratón (SIGMA) o fragmentos F(ab')_{2} inmunes o no inmunes (preparados usando un sistema de Pierce, Arlington Heights, Illinois, EE.UU.) 24 y 12 horas antes de, y 6 y 12 horas después de, la estimulación local con mBSA. 24 horas después de la inyección de mBSA en la almohadilla de la pata, dos investigadores llevaron a cabo a ciegas la calificación clínica de la almohadilla de la pata del modo anteriormente descrito. Luego se sacrificaron humanamente los ratones y se congelaron o fijaron en formol (10%) las patas para un análisis ulterior. Dos investigadores llevaron a cabo a ciegas la calificación histológica sobre cortes de patas teñidos con hematoxilina y eosina (SIGMA). Se llevó a cabo el ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética empleando 10 \mug de extracto nuclear de almohadilla de pata añadidos por carril, como antes. Se llevó a cabo una RT-PCR utilizando cebadores comercialmente asequibles (Clontech) para IL-2 (tamaño esperado: 413 pares de bases), TNF-\alpha (tamaño esperado: 310 pares de bases) y \beta-actina (tamaño esperado: 540 pares de bases). En ciertos ratones, tras el sacrificio, se extrajo el bazo y se prepararon esplenocitos por separación mediante Histopaque 1077 (Sigma). Se pusieron 5x10^{4} células en los pocillos de placas de 96 pocillos para cultivo tisular y se llevó a cabo una estimulación con PMA, 0,5 \mug/ml, durante 16 horas. Al final de este período, se añadió timidina tritiada durante 18 horas adicionales. Luego se recogieron las células y se contaron en un contador de radiación beta.

9. Modelo de colitis crónica en ratones deficientes en IL-10

Ratones de origen C57BL/6 deficientes en IL-10 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, EE.UU.) nacieron y fueron criados en condiciones libres de patógenos. A las 3 semanas de edad, los ratones fueron llevados a un alojamiento convencional estándar con acceso libre a comida y agua. Una semana después de la disposición en condiciones estándares, los ratones fueron tratados una vez al día con una inyección intraperitoneal de MSA (100 \mug/día) o sRAGE (100 \mug/día), durante seis semanas. Al final de ese periodo, se anestesiaron profundamente los ratones, se extrajo plasma y luego se extrajo el colon rectosigmoide para un análisis histológico (hematoxilina y eosina) o la preparación de un extracto nuclear, como se describió anteriormente. Los cortes de colon rectosigmoide teñidos con hematoxilina y eosina fueron evaluados a ciegas por uno de los investigadores. Se evaluaron los niveles de TNF-\alpha en plasma (R&D Systems) y se llevó a cabo un EMSA para NF-\kappaB sobre los extractos nucleares.

Resultados 1. Caracterización de la proteína ligante de RAGE, de \approx 12 kDa

Habíamos especulado previamente sobre que dicho receptor de la superfamilia inmunoglobulínica podría interaccionar con ligandos distintos de los AGEs. Tras la preparación del extracto de pulmón bovino usando detergente, y la cromatografía del material en columnas sucesivas, incluyendo en la última operación una resina de Affi-Gel a la que se había adsorbido RAGE, se eluyeron dos polipéptidos que tenían actividad ligante de RAGE en ensayos de unión de radioligandos. El primero, un polipéptido de \approx 23 kDa, fue identificado como anfoterina (Hori et al., 1995). El segundo, un polipéptido de \approx 12 kDa, fue sometido a un análisis de la secuencia de aminoácidos tanto en el extremo amínico como internamente después de una digestión con la endopeptidasa Lys-C (Tabla 2). La secuencia de este polipéptido, inicialmente denominado "p12", reveló que poseía la más estrecha y sorprendente homología con respecto a un polipéptido conocido como proteína bovina 1 ligante de calcio en fluido amniótico (CAAF-1) (Hitomi et al., 1996) o antígeno corneal bovino/calgranulina C (Gottsch et al., 1997), recientemente clasificado como S100A12 (Ilg et al., 1996). Este polipéptido fue posteriormente llamado EN-RAGE, nueva proteína extracelular ligante de RAGE. La secuencia de EN-RAGE difería de la del antígeno corneal bovino en dos aminoácidos. En la posición nº 30, el EN-RAGE estaba compuesto de una tirosina (Y) mientras que el antígeno corneal bovino estaba compuesto de una arginina (R). En la posición nº 36, el EN-RAGE estaba compuesto de una glicocola (G) mientras que el antígeno corneal bovino estaba compuesto de una isoleucina (I) (Tabla 2). Estudios de clonación molecular revelaron que EN-RAGE era un miembro de la familia calgranulínica/S100 de citocinas proinflamatorias. Dos clones de cDNA obtenidos de un banco de pulmón bovino codificaban polipéptidos idénticos al antígeno corneal bovino basándose en la deducida secuencia de aminoácidos, con una arginina en la posición nº 30 y una isoleucina en la posición nº 36. Basándose en estos datos, no se puede excluir la posibilidad de que no se aislaran clones específicos que codificaran la secuencia exacta de EN-RAGE. Empleando un banco de pulmón humano, la clonación molecular produjo un clon; la deducida secuencia de aminoácidos del cDNA reveló que era probable que la equivalencia humana de EN-RAGE fuera calgranulina C humana (o antígeno corneal humano/S100A12) (Gottsch y Liu, 1998; Ilg et al., 1996; Yamamura et al., 1996). La deducida secuencia de aminoácidos del polipéptido reveló que la equivalencia humana era muy homóloga al antígeno corneal bovino (> 77%).

En realidad, p12 es un miembro de la superfamilia de S100/calgranulina (Dell'Angelica et al., 1994; IIg et al., 1996; Wicki et al., 1996; Gottsch et al., 1997; Gottsch y Liu, 1998). Por lo tanto, conservamos el nombre de EN-RAGE porque una nueva propiedad de éste y otros miembros de dicha familia es su interacción con RAGE, lo cual tiene importantes implicaciones para la función de estos polipéptidos, como se describe más adelante.

TABLA 2 Análisis de la secuencia de aminoácidos de p12, más tarde denominado "EN-RAGE", y comparación con la de los polipéptidos homólogos: antígeno corneal bovino y CAAF1 bovino. Las últimas secuencias se obtuvieron de Gottsch et al., 1997. A, Ala; C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His; I, Ile; K, Lys; L, Leu; M, Met; N, Asn, P, Pro; Q, Gln; R, Arg; S, Ser; T, Thr; V, Val; W, Trp; e Y, Tyr. X es un resto de aminoácido no identificado en esa posición

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2. La expresión de EN-RAGE está aumentada en células inflamatorias estimuladas

La familia molecular de S100/calgranulina ha sido ampliamente asociada con una gran variedad de trastornos inflamatorios, especialmente los de naturaleza crónica. Puesto que se sabe que estos polipéptidos son liberados por células inflamatorias tales como leucocitos polimorfonucleares y fagocitos mononucleares procedentes de sangre periférica, se ha especulado durante mucho tiempo sobre el hecho de que pueden desempeñar una función en el desarrollo del fenotipo inflamatorio, tal como al estimular la migración y activación de macrófagos. Por lo tanto, analizamos el concepto de que la ligación de RAGE por EN-RAGE activaría rutas de señalización celular proinflamatorias, lo que conduciría a la modulación de la expresión génica de un modo ligado a la inflamación.

Cuando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o células Jurkat, una línea inmortalizada de células T, fueron estimuladas con PMA/ionomicina, la inmunotransferencia del producto de homogeneización celular reveló una generación de EN-RAGE aumentada 2,8 veces y 2,1 veces, respectivamente (Figura 6A). Por contraste, tras la estimulación de células endoteliales de vena de cordón umbilical humano (HUVEC) en cultivo con un estímulo prototípico, el factor \alpha de necrosis tumoral, no se vio una modulación de la expresión de EN-RAGE (Figura 6A). Similarmente, la exposición de HUVEC a PMA/ionomicina no aumentó la expresión de EN-RAGE (datos no mostrados). Por lo tanto, como es típico de miembros de la familia de S100/calgranulina, la expresión de EN-RAGE puede ser modulada en células inflamatorias estimuladas.

Para determinar si se libera EN-RAGE en un ambiente inflamatorio in vivo, se infundió intravenosamente lipopolisacárido (LPS) a ratones. Se advirtió un aumento dependiente del tiempo en la liberación de EN-RAGE en el plasma (Figura 6B). La máxima liberación de EN-RAGE se observó 12 horas después de la inyección; en ese momento se demostró un aumento de EN-RAGE \approx 3,6 veces por inmunotransferencia (Figura 6B). Consecuentemente con la posibilidad de que RAGE soluble, la porción extracelular de RAGE que se une al ligando, pudiera interaccionar con EN-RAGE en el plasma, facilitando por ello su aclaramiento y eliminación, la administración concomitante de sRAGE (que no se une a LPS) y LPS no dio lugar a un aumento detectable de EN-RAGE plasmático por inmunotransferencia (Figura 6B), ni siquiera a las 12 horas después de la inyección de LPS (Figura 6B).

Estos datos sugerían que EN-RAGE se unía a RAGE. En ensayos de unión de radioligandos, ^{125}I-EN-RAGE se unía a RAGE inmovilizado en pocillos de plástico, de un modo dependiente de la dosis, con una K_{d} \approx 91 \pm 29 nM y una capacidad \approx 21 \pm 2,9 femtomoles/pocillo (Figura 6C). Tras la incubación de EN-RAGE radiomarcado con sRAGE no marcado en exceso, la unión al RAGE inmovilizado resultó significativamente atenuada (Figura 6C, inserción). La unión específica de EN-RAGE radiomarcado a RAGE resultó disminuida un 82,5% en presencia de un exceso molar de 50 veces de RAGE no marcado. Por contraste, la incubación con albúmina sérica bovina (BSA) no marcada en exceso resultó sin efecto (Figura 6C). Además, la preincubación de IgG anti-RAGE con el RAGE inmovilizado inhibía significativamente la unión de EN-RAGE radiomarcado al RAGE inmovilizado (Figura 6C, inserción). En presencia de IgG anti-RAGE, 50 \mug/ml, la unión resultaba inhibida un 67,9%. Por contraste, la preincubación con IgG no inmune resultó sin efecto (Figura 6C, inserción). Es importante advertir que la preincubación con S100B humano en exceso también suprimía significativamente la unión de EN-RAGE a RAGE, lo que sugiere que una variedad de polipéptidos S100/calgranulina se unen a RAGE.

Sin embargo, resultó crítico determinar si EN-RAGE podía interaccionar con RAGE en la superficie de células implicadas en la respuesta inflamatoria. Para probar esto, se llevaron a cabo ensayos de unión de radioligandos sobre células endoteliales de aorta bovina (BAEC) en cultivo. Consistentemente con nuestros estudios previos, ^{125}I-EN-RAGE se unía a RAGE de BAECs de un modo dependiente de la dosis, con una K_{d} \approx 90,3 \pm 34 nM y una capacidad \approx 163 \pm 26,2 femtomoles/pocillo (Figura 6D), de modo similar a lo observado con otros ligandos de RAGE, tales como AGEs (Schmidt et al., 1992) y anfoterina (Hori et al., 1995). La unión específica de EN-RAGE radiomarcado a RAGE de BAECs resultó disminuida un 84,3% en presencia de un exceso molar de 50 veces de RAGE no marcado. Por contraste, la incubación con BSA no marcada en exceso resultó sin efecto (Figura 6D, inserción). La unión de EN-RAGE radiomarcado a RAGE resultó inhibida un 41% tras la preincubación de BAECs con IgG anti-RAGE, 50 \mug/ml, pero sólo un 28,7% en presencia de IgG anti-RAGE, 5 \mug/ml. Por contraste, la IgG no inmune resultó sin efecto (Figura 6D, inserción). Se observaron resultados similares (no mostrados) en células BV2 de tipo macrófago en cultivo.

Estos datos indicaban que EN-RAGE se unía a RAGE de un modo específico y nos condujo a formular la hipótesis de que la ligación de RAGE por EN-RAGE podía desencadenar una activación celular.

3. La ligación de RAGE por EN-RAGE y moléculas similares a EN-RAGE activa células centrales para la respuesta inflamatoria Células endoteliales

Puesto que la activación del endotelio es un componente central de la respuesta inflamatoria, se probó primero la capacidad de EN-RAGE para activar RAGE de ECs. Consecuentemente con esta hipótesis, la incubación de EN-RAGE con células endoteliales de vena de cordón umbilical humano (HUVECs) en cultivo dio lugar a una expresión aumentada de la molécula 1 de adhesión de células vasculares en la superficie celular, un medio importante mediante el cual las células mononucleares que llevan VLA-4 pueden ser dirigidas al endotelio estimulado (Li et al., 1993; Richardson et al., 1994) (Figura 7A). Que esto fue mediado en gran medida por RAGE resultó evidente tras experimentos en que se inhibía el acceso a RAGE. La preincubación de EN-RAGE con un exceso molar de 40 veces de sRAGE atenuaba significativamente la expresión de VCAM-1, lo mismo que la preincubación de las células con IgG anti-RAGE (Figura 7A). Por contraste, la preincubación con IgG no inmune no dio lugar a cambio alguno en el grado de expresión de VCAM-1 en la superficie celular después del tratamiento con EN-RAGE (Figura 7A). Consecuentemente con la observación de que la ligación de RAGE por EN-RAGE daba lugar a una expresión aumentada de VCAM-1 en la superficie celular, se advirtió una unión aumentada de células Molt, que llevan VLA-4, al endotelio estimulado por EN-RAGE. La capacidad de EN-RAGE para potenciar la unión de Molt-4 a HUVECs fue dependiente de la dosis (Figura 7B, parte izquierda).

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Los efectos de EN-RAGE fueron dependientes del tiempo, observándose un aumento máximo de unión de Molt-4 después de 8 horas de incubación (Figura 7B, parte central). Consecuentemente con nuestros hallazgos previos, la unión aumentada de Molt-4 era debida a la interacción de EN-RAGE con RAGE celular. La preincubación de HUVECs con F(ab')_{2} anti-RAGE, 5 \mug/ml, atenuó significativamente la unión de Molt-4 a células tratadas con EN-RAGE. Por contraste, tanto F(ab')_{2} anti-RAGE, 0,1 \mug/ml, como F(ab')_{2} no inmune no ejercieron efecto alguno (Figura 7B, parte derecha). Similarmente, la preincubación de EN-RAGE con un exceso molar de 30 veces de sRAGE atenuó significativamente la potenciación, mediada por EN-RAGE, de la unión de Molt-4 a HUVEC. Por contraste, la preincubación de EN-RAGE con sRAGE (exceso molar de 5 veces) o BSA, 5 \mug/ml, resultó sin efecto significativo alguno (Figura 7B, parte derecha).

Un medio importante por el cual resulta un mRNA aumentado para VCAM-1 es por la activación de un factor de transcripción central en la respuesta inflamatoria, NF-\kappaB (Neish et al., 1992). En estudios previos, demostramos que la ligación de RAGE por AGEs y el péptido \beta amiloide daba lugar a una translocación aumentada de componentes de NF-\kappaB en el núcleo, como se demostró mediante un ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética (Yan et al., 1994; Yan et al., 1996; Lander et al., 1997). Por lo tanto, analizamos si la ligación de RAGE de ECs por EN-RAGE mediaba en la activación de NF-\kappaB. En el ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética (EMSA) de extractos nucleares preparados a partir de HUVECs, la incubación con EN-RAGE (2,5 o 5,0 \mug/ml) daba lugar a un aumento \approx 5 veces del NF-\kappaB nuclear por densitometría, en comparación con la incubación con BSA (Figura 7C, carriles 1, 2 y 7, respectivamente, e inserción). Que esto fue mediado en gran medida por la interacción con RAGE resultó demostrado mediante experimentos en que se pretrataban HUVECs con IgG anti-RAGE antes de con EN-RAGE, en los que la activación de NF-\kappaB resultó significativamente atenuada (Figura 7C, carril 4 e inserción). Similarmente, la preincubación de EN-RAGE con sRAGE en exceso (50 veces) dio lugar a una activación disminuida de NF-\kappaB (Figura 7C, carril 3 e inserción). Ensayos de superdesplazamiento en que se empleaban tanto IgG anti-p50 como IgG anti-p65 demostraron que el complejo de NF-\kappaB activado tras la ligación de RAGE por EN-RAGE estaba compuesto tanto de p50 como de p65 (Figura 7C, carriles 13, 14 y 15). Por contraste, la preincubación del extracto nuclear con IgG no inmune no dio lugar a un desplazamiento de bandas (Figura 7C, carril 12). Para analizar el concepto de que el dominio citosólico de RAGE era crítico para la activación de rutas de señalización próximas y esenciales para la activación de NF-\kappaB, se llevó a cabo la transfección transitoria de HUVECs con una construcción que codificaba un RAGE humano en que estaba suprimido el dominio citosólico. Consecuentemente con una función importante del dominio citosólico en cuanto a la mediación en la señalización celular, la activación de NF-\kappaB estimulada por EN-RAGE resultó notablemente suprimida en los transfectantes que contenían RAGE con la cola citosólica suprimida (Figura 7C, carril 5 e inserción) en comparación con aquellos transfectados con vector solo (Figura 7C, carril 6 e inserción).

Tomados en conjunto, estos datos sugerían que la interacción EN-RAGE/RAGE en células endoteliales activaba un factor de transcripción importante, NF-\kappaB, implicado en la respuesta inflamatoria, lo que sugería un medio central mediante el cual esta interacción podría impartir una perturbación proinflamatoria.

Fagocitos mononucleares

Además de las células endoteliales, los fagocitos mononucleares (MPs) son críticamente importantes en la mediación de procesos inmunes/inflamatorios. Formulamos la hipótesis de que el EN-RAGE liberado por células reclutadas a sitios de daño podría ser más importante a la hora de amplificar la respuesta inflamatoria. Por lo tanto, se analizó la capacidad de EN-RAGE para estimular la migración de células similares a MP. En cámaras de quimiotaxis modificadas, el EN-RAGE dispuesto en la cama inferior mediaba en la quimiotaxis de células Molt-4 (que llevan RAGE en la superficie celular) dispuestas en la cámara superior, de un modo dependiente de la dosis (Figura 7D, parte izquierda, líneas 2, 3, 4 y 5). Por contraste, la disposición de BSA en la cámara inferior resultó sin efecto significativo alguno (Figura 7D, línea 1). El que esto representaba una quimiotaxis verdadera fue sugerido por experimentos en que se ponía EN-RAGE tanto en la cámara superior como en la inferior. Cuando se añadían células Molt-4, no se producía una migración significativa a la cámara inferior (Figura 7D, parte izquierda, línea 6). Para probar el concepto de que el RAGE de la superficie de células MP era un medio principal por el cual EN-RAGE estimulaba la migración, se preincubó EN-RAGE con sRAGE en exceso; resultó una significativa atenuación de la migración de Molt-4 a la cámara inferior (Figura 7D, parte derecha, líneas 2 y 3) en comparación con la preincubación con BSA (Figura 7D, parte derecha, línea 1). Además, cuando se preincubaron células Molt-4 con F(ab')_{2} anti-RAGE, se produjo una significativa disminución en la migración de células Molt-4 mediada por EN-RAGE (Figura 7D, parte derecha, líneas 5 y 6). Por contraste, la preincubación con F(ab')_{2} no inmune resultó sin efecto alguno (Figura 7D, parte derecha, línea 4).

Buscamos delimitar si la interacción de EN-RAGE con RAGE de MP daba lugar a una generación aumentada de mediadores tales como IL-1\beta y TNF-\alpha, unas citocinas críticamente ligadas a la activación celular y la inflamación. La incubación de células BV2 de tipo macrófago simuladamente transfectadas (vector solo), en cultivo, con EN-RAGE daba lugar a una significativa elaboración de IL-1\beta de un modo dependiente de la dosis en el sobrenadante celular (Figura 7E, parte izquierda, barras oscuras). El que las rutas de señalización intracelulares de RAGE intactas eran esenciales fue demostrado mediante experimentos en que se transfectaron transitoriamente células BV2 con una construcción que contenía RAGE humano con la cola suprimida; resultó la supresión completa de la elaboración de IL-1\beta, mediada por EN-RAGE, en el sobrenadante, lo que es consistente con un efecto "negativo dominante" (Figura 7E, parte izquierda, barras rayadas). Se observaron resultados similares tras el examen de TNF-\alpha; la interacción EN-RAGE/RAGE daba lugar a una expresión significativamente aumentada de TNF-\alpha en los sobrenadantes celulares de un modo dependiente de la dosis (Figura 7E, parte derecha, barras oscuras). Sin embargo, tras la transfección transitoria con la construcción que contenía RAGE con la cola suprimida, la elaboración de TNF-\alpha en el sobrenadante de BV2 resultó anulada (Figura 7E, parte derecha, barras rayadas). Un medio central mediante el cual tuvo lugar la modulación de la expresión de citocinas en MPs fue por activación de NF-\kappaB. Similarmente a los resultados obtenidos con HUVECs en cultivo, el EMSA de extractos nucleares preparados a partir de células BV2 estimuladas con EN-RAGE reveló la activación de NF-\kappaB, un proceso notablemente suprimido en presencia de F(ab')_{2} anti-RAGE o sRAGE o por la transfección con la construcción que tiene la supresión de la cola (datos no mostrados).

Células mononucleares de sangre periférica y células Jurkat

La ligación de RAGE por EN-RAGE en células Jurkat media en la activación. La incubación de células mononucleares procedentes de sangre periférica (PBMCs) con EN-RAGE preparó a las células para una respuesta exagerada cuando fueron estimuladas con PHA-P. En comparación con el pretratamiento con BSA, se advirtió una significativa incorporación de timidina tritiada en las células previamente incubadas con EN-RAGE (Figura 7F). Que esto fue debido en gran medida a la interacción de EN-RAGE con RAGE de PBMC fue demostrado mediante estudios en que se incubaron PBMCs con IgG anti-RAGE o se preincubó EN-RAGE con sRAGE en exceso; resultó una significativa atenuación de la incorporación, estimulada por EN-RAGE, de timidina tritiada (Figura 7F).

Consecuentemente con la evidencia de la activación generalizada de PBMCs, la incubación de células Jurkat (que llevan RAGE en la superficie celular) con EN-RAGE dio lugar a una elaboración aumentada de II-2 en el medio sobrenadante, de un modo dependiente de RAGE (Figura 7G).

Tomados en conjunto, estos estudios demuestran que la implicación de RAGE en la superficie de células críticas para la propagación de la respuesta inflamatoria, tales como células endoteliales, MPs y linfocitos, daba lugar a la activación de estas células de una manera ligada a la estimulación de la migración, la proliferación y la generación de mediadores citocínicos, respuestas esenciales para la orquestación del fenotipo inflamatorio.

Resulta importante advertir que se buscó ensayar la diversidad de miembros de la superfamilia de S100/calgranulina que son ligandos de RAGE y se analizó la capacidad de S100B humano para activar ECs. Puesto que la activación de NF-\kappaB es un precursor esencial para la modulación de la expresión de genes inflamatorios, analizamos este concepto por EMSA. Cuando se estimularon HUVECs con S100B humano, resultó evidente un aumento de la translocación nuclear de NF-\kappaB \approx 13,9 veces por EMSA (Figura 7H, carril 2) en comparación con la exposición de las células a BSA (Figura 7H, carril 1). Que estos hallazgos eran debidos a la activación de RAGE fue demostrado mediante estudios en que la preincubación con IgG anti-RAGE (Figura 7H, carril 3), o la transfección con una construcción que contenía RAGE con la cola suprimida, atenuaba acusadamente la sensibilidad a S100B (Figura 7H, carril 5). Por contraste, la preincubación con IgG no inmune (Figura 7H, carril 4) o una transfección simulada (Figura 7H, carril 6) resultaban sin efecto. Estas observaciones indican que una diversidad de ligandos polipeptídicos S100/calgranulina interaccionan con RAGE.

4. La infusión de EN-RAGE a ratones estimula la activación celular y la modulación de la expresión génica

Se buscó ampliar nuestros hallazgos en modelos in vitro para determinar si EN-RAGE mediaba en la activación celular y en la expresión de mediadores inflamatorios in vivo. Aunque especulamos que, in vivo, EN-RAGE es localmente liberado en sitios de estimulación inmune/inflamatoria, se probó el concepto de que la infusión de EN-RAGE a ratones inmunocompetentes mediaría en la expresión de mediadores inflamatorios. Consecuentemente con este concepto, la infusión de EN-RAGE, 30 \mug, a ratones CF-1 dio lugar a un aumento de 2,4 en la expresión de VCAM-1 en el pulmón por inmunotransferencia, en comparación con la infusión de BSA (Figura 8a, carriles 2 y 1, respectivamente). Que esto era debido en gran parte a la implicación del RAGE vascular fue demostrado mediante la significativa atenuación de la expresión de VCAM-1 estimulada por EN-RAGE, en el pulmón, en presencia de sRAGE (Figura 8A, carril 3) o de IgG anti-RAGE (Figura 8A, carril 4). Por contraste, la infusión de IgG no inmune/EN-RAGE resultó sin efecto (Figura 8A, carril 5).

5. Papel de EN-RAGE y RAGE en la respuesta inflamatoria Inflamación aguda

Sin embargo, la prueba crítica de estas hipótesis fue si EN-RAGE y RAGE participan en la respuesta inflamatoria en modelos de inflamación in vivo. Se ensayó primero este concepto en un modelo murino de hipersensibilidad de tipo retardado (Dunn et al., 1993). En este modelo, se sensibilizaron ratones CF-1 con BSA metilada (mBSA; que no se une a RAGE). Se inyectó localmente mBSA, mezclada con una emulsión que contenía cloruro sódico, dextrano y adyuvante incompleto de Freund, en los ganglios linfáticos de la ingle. Veintiún días más tarde, se inyectó mBSA o vehículo (disolución salina tamponada con fosfato) en la almohadilla de la pata trasera izquierda. Nuestros estudios indicaban que la segunda inyección no tenía efecto alguno y que, similarmente, la inyección de mBSA sin sensibilización previa no generaba una respuesta inflamatoria (datos no mostrados). En lo ratones tanto sensibilizados como estimulados con mBSA en la almohadilla de la pata trasera izquierda, se produjo una significativa respuesta inflamatoria, según se midió mediante la calificación de la inflamación (Figuras 9A, B, F).

Para analizar en este modelo el papel del bloqueo de RAGE/EN-RAGE en la potencial modulación de la inflamación, ciertos ratones sensibilizados/estimulados fueron tratados intraperitonealmente con vehículo, albúmina sérica murina (MSA). 24 horas después de la inyección de mBSA en la almohadilla de la pata, apareció una significativa evidencia de inflamación local (calificación: 9,0 \pm 0,4) (Figura 9A, línea 1; y Figura 9B). Además, el análisis con H&E de la almohadilla de la pata afectada confirmó una acusada afluencia de células inflamatorias, con granulomas así como un significativo edema (Figura 9F). Sin embargo, en marcado contraste, la inyección de sRAGE murino dio lugar a la supresión de la inflamación, dependiente de la dosis, en los ratones sensibilizados/estimulados con mBSA; tras la inyección de sRAGE, 100 \mug/dosis, la calificación de la inflamación se redujo a 2,7 \pm 0,3, p < 0,001, en comparación con la correspondiente a la MSA (Figura 9A, líneas 2-3-4-5-6; y Figura 9C). Consecuentemente con la marcada supresión de la inflamación, el examen de la almohadilla de la pata de los ratones tratados con sRAGE (100 \mug) mediante H&E reveló una sorprendente supresión de la afluencia de células inflamatorias a la zona (Figura 9H). Especulamos que, al menos en parte, sRAGE ejerce sus propicios efectos antiinflamatorios al unirse a EN-RAGE e inhibir su interacción con el RAGE celular y la activación de éste.

Resultó así crucial determinar si el bloqueo de EN-RAGE empleando F(ab')_{2} anti-EN-RAGE o el bloqueo del acceso al propio RAGE empleando F(ab')_{2} anti-RAGE ejercería efectos beneficiosos similares, validando por ello un papel importante para estos mediadores en las cascadas inflamatorias desencadenadas por la inyección de mBSA a ratones sensibilizados. Cuando ratones sensibilizados/estimulados fueron tratados con F(ab')_{2} no inmune, no se advirtió efecto alguno (calificación: 9,0 \pm 0,2). Sin embargo, en presencia de F(ab')_{2} anti-RAGE (200 \mug) o F(ab')_{2} anti-EN-RAGE, resultó evidente una significativa atenuación de la respuesta inflamatoria (Figura 9A, líneas 9 y 11, respectivamente, y Figuras 9E y D, respectivamente), con calificaciones de inflamación de 4,9 \pm 0,8 y 5,6 \pm 0,5, respectivamente (p < 0,05 en ambos casos en comparación con el tratamiento con F(ab')_{2} no inmune). Confirmando la inflamación disminuida en presencia de F(ab')_{2} anti-RAGE o F(ab')_{2} anti-EN-RAGE, el análisis histológico reveló una reducción significativa en los números de células inflamatorias y edemas, y ausencia de granulomas (Figuras 9J e I, respectivamente). Apoyando intensamente un papel crítico para EN-RAGE/RAGE en la mediación de la inflamación, se observó una sorprendente atenuación de la inflamación cuando se administraron simultáneamente F(ab')_{2} anti-EN-RAGE y F(ab')_{2} anti-RAGE (Figura 9A, línea 12); la calificación de la inflamación se redujo a 3,6 \pm 0,9, p < 0,01, en comparación con el tratamiento con F(ab')_{2} no inmune. En realidad, el análisis con H&E reveló números notablemente disminuidos de células inflamatorias y edemas (Figura 9K).

Estos datos sugerían que el bloqueo de EN-RAGE/RAGE sofocaba sustancialmente la activación celular en este modelo. En realidad, paralelamente a la evidencia de inflamación disminuida en ratones sensibilizados/estimulados con mBSA a los que se había administrado sRAGE, F(ab')_{2} anti-RAGE o F(ab')_{2} anti-RAGE/anti-EN-RAGE, se observó una supresión significativa de la activación de NF-\kappaB en extractos nucleares preparados a partir de las almohadillas de las patas afectadas. En comparación con la almohadilla de la pata contralateral (sensibilización con mBSA/ausencia de estimulación local), los extractos nucleares de la almohadilla de la pata en que se había inyectado mBSA revelaron un aumento = 6,4 veces en la activación de NF-\kappaB por EMSA (Figura 9L, carriles 1 y 2, respectivamente). En presencia de sRAGE ip, 100 \mug/dosis, se advirtió una significativa reducción en la activación de NF-\kappaB en comparación con el tratamiento con vehículo, MSA ip (Figura 9L, carriles 4 y 2, respectivamente). Tras el tratamiento con F(ab')_{2} anti-RAGE/anti-EN-RAGE de los ratones sensibilizados/estimulados con mBSA, se advirtió una disminución \approx 75% en la activación de NF-\kappaB (Figura 9L, carril 6) en comparación con el tratamiento con F(ab')_{2} no inmune (Figura 9L, carril 7). Considerados conjuntamente, estos datos sugerían acusadamente que el bloqueo de EN-RAGE/RAGE sofocaba potentemente la activación de la ruta de señalización celular de NF-\kappaB.

Puesto que una consecuencia importante de la ligación de RAGE por EN-RAGE era una expresión aumentada de mediadores inflamatorios, al menos en parte mediada por la activación de NF-\kappaB, se llevó a cabo una RT-PCR del RNA extraído de ratones sensibilizados/estimulados con mBSA y tratados con sRAGE, 100 \mug, y se halló una ausencia de transcritos para IL-2 o TNF-\alpha (Figura 9M, carriles 5 y 2, respectivamente). Por contraste, en las almohadillas de las patas de los ratones tratados con vehículo, MSA, eran evidentes transcritos para IL-2 y TNF-\alpha (Figura 9M, carriles 4 y 1, respectivamente).

Cuando se aislaron esplenocitos de ratones sometidos a DTH y se analizaron ex vivo, se advirtió una respuesta mitogénica disminuida en presencia de PMA en aquellos esplenocitos recogidos de ratones tratados con sRAGE, F(ab')_{2} anti-RAGE o F(ab')_{2} anti-EN-RAGE, cuando se comparó con la de esplenocitos de ratones tratados con MSA o F(ab')_{2} no inmune (Figura 3B).

Considerados conjuntamente, estos datos sugieren que el bloqueo de la interacción EN-RAGE/RAGE en hipersensibilidad de tipo retardado suprimía significativamente la activación de rutas de señalización celular, la modulación de la expresión génica y el fenotipo inflamatorio.

Inflamación crónica

Característico de los polipéptidos S100/calgranulina es su presencia en zonas de inflamación crónica, tales como en enfermedades inflamatorias intestinales humanas (Lugering et al., 1995; Schmidt et al., 1995). Para ensayar el concepto de que su interacción con RAGE puede ser importante en la patogénesis de la inflamación crónica, se ensayaron estos conceptos en un modelo murino de colitis, ratones deficientes en IL-10 (Kuehn et al., 1993; Rennick et al., 1997). Para ensayar este concepto, se trataron ratones deficientes en IL-10, comenzando a la edad de 4 semanas, con MSA o sRAGE, 100 \mug ip por día durante 6 semanas. Al final de este periodo, se sacrificaron los ratones y se evaluó su colon rectosigmoide en cuanto a la evidencia de inflamación. Aunque en 4/5 ratones que recibieron MSA se reveló evidencia de inflamación colónica submucosa, compuesta de linfocitos, macrófagos, eosinófilos y células plasmáticas, sólo 1/5 ratones tratados con sRAGE presentó una inflamación desigual en la base de las criptas (Tabla 3). Consecuentemente con estos hallazgos, cuando se preparó tejido colónico para EMSA, se observó una disminución media de unidades de densitometría \approx 3,7 veces en el tejido recogido de ratones deficientes en IL-10 y tratados con sRAGE en comparación con los que habían recibido MSA (p = 0,04; Figura 10A). Similarmente, se observó una disminución de los niveles de TNF-\alpha plasmático \approx 8,7 veces en los ratones tratados con sRAGE en comparación con los que habían recibido MSA (p = 0,002; Figura 10B).

Considerados conjuntamente, estos datos sugieren que la inhibición del eje EN-RAGE/RAGE suprime potentemente la activación celular y la expresión de mediadores esenciales en modelos de inflamaciones aguda y crónica.

TABLA 3 Examen histológico de tejido rectosigmoide recogido de ratones deficientes en IL-10. Las células inflamatorias se identifican del modo siguiente: M, monocito/macrófago; L, linfocito; E, eosinófilo; y P, célula plasmática

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Discusión

Se ha advertido durante mucho tiempo la presencia de polipéptidos S100/calgranulina en sitios de inflamaciones aguda y crónica. En realidad, se ha sugerido la evaluación de los niveles séricos de MRP8/14 (proteínas de relación mieloide; del inglés, myeloic-related protein), moléculas similares a S100, como un medio para rastrear actividad morbosa en pacientes con colitis ulcerosa, una enfermedad inflamatoria crónica del intestino ligada a disfunción intestinal de larga duración y a neoplasia (Lugering et al., 1995). Las moléculas de S100/calgranulina presentan homologías estructurales definitorias, tales como dominios de "mano EF" ligantes de calcio (Schafer y Heizmann, 1996). Basándose en estas propiedades, se formuló el postulado de una diversidad de posibles funciones intracelulares para estos polipéptidos, tales como alteración del citoesqueleto y la forma celular, transducción de señales y, a través de unos niveles aumentados de calcio celular, modulación de la función fagocítica, incluyendo quimiotaxis, fagocitosis, desgranulación y generación de especies oxigenadas reactivas (ROIs; del inglés, reactive oxigen species) (Snyderman y Goetzl, 1981; Smolen et al., 1981; Lew et al., 1984; Sawyer et al., 1985). En realidad, la generación de ROIs puede representar un medio distinto más por el que estas moléculas inician la alteración de rutas de señalización proinflamatorias (Schreck et al., 1992).

A pesar del hecho de que EN-RAGE y miembros familiares relacionados carecen de péptidos señal, hay suficiente evidencia de que estos polipéptidos logran acceder fácilmente al espacio extracelular (Suzuki et al., 1983; Shashoua et al., 1984; Schafer y Heizmann, 1996). En este contexto, estudios previos han sugerido que miembros de esta familia pueden mediar en una serie de fenómenos inflamatorios. Por ejemplo, tras la infusión de péptido quimiotáctico 10 (CP-10; del inglés, chemotactic peptide) (un miembro de la familia de S100) a ratones, los macrófagos provocados muestran aumento de receptor supresor, producción de TNF-\alpha, carga de lipoproteínas de baja densidad acetiladas y formación de células espumosas, y fagocitosis, así como producción disminuida de óxido nítrico. Además, tras la inyección local de CP-10 en la almohadilla de la pata, se origina una intensa afluencia de leucocitos polimorfonucleares seguida de una infiltración de células mononucleares mixtas (Hu et al., 1996; Geczy, 1996; Yen et al., 1997; Kumar et al., 1998). Los datos aquí presentados amplían estos hallazgos y sugieren que, tras el reclutamiento de células inflamatorias a sitios de inflamación, parece que estas moléculas se liberan y se dirigen al RAGE celular. Tras la afectación de RAGE, un receptor crítico para miembros de esta familia, puede tener lugar más estimulación celular, lo que conduciría a activación de rutas de señalización, modulación de la expresión génica y amplificación de procesos inflamatorios (Figura 11). Estas consideraciones aumentan más las implicaciones de la interacción EN-RAGE/RAGE en trastornos inflamatorios crónicos tales como la aterosclerosis (Ross, 1999).

Ciertamente, la inflamación es un proceso complejo, con un montón de desencadenamientos iniciadores y moléculas participantes intermedias implicados. Sin embargo, los mecanismos proinflamatorios a menudo pueden quedar considerablemente desenfrenados para conducir a isquemia tisular crónica, muerte celular y respuestas reparadoras mal adaptadas. Los datos presentes sugieren un nuevo paradigma en la inflamación: prevenir la interacción de EN-RAGEs con RAGE puede atenuar un mecanismo de amplificación esencial de la respuesta inflamatoria a través del bloqueo de rutas de señalización centrales que conducen a la expresión de citocinas. Los datos presentes no excluyen la implicación de otros receptores de estas moléculas. En este contexto, estudios futuros deben también determinar el grado en que otros miembros distintos de la familia de S100/calgranulina, además de EN-RAGE y S100B, poseen capacidad para interaccionar con RAGE. Sin embargo, en dos estudiados hasta la fecha, uno más similar a calgranulina (EN-RAGE) y el otro más similar a S100 (S100B), parece que RAGE es un sitio de interacción celular central. En realidad, el presente hallazgo de que la administración de sRAGE, F(ab')_{2} anti-EN-RAGE, F(ab')_{2} anti-RAGE o F(ab')_{2} anti-EN-RAGE + anti-RAGE suprime significativamente la generación de mediadores esenciales de la inflamación tales como TNF-\alpha e IL-2, sugiere acusadamente un papel fundamental para la interacción entre EN-RAGE, y miembros familiares relacionados, con RAGE en el fenotipo inflamatorio.

Los hallazgos presentes amplían el contexto de RAGE como un miembro distinto de la superfamilia inmunoglobulínica de moléculas de la superficie celular en virtud de su extraordinario conjunto de ligandos, con implicaciones tanto en estados de desarrollo como en estados patofisiológicamente relevantes (Schmidt et al., 1998). La identificación de la anfoterina como un ligando de RAGE (Rauvala y Pihlaskari, 1987; Parkkinen et al., 1993; Hori et al., 1995) sugería un papel para RAGE en la emergencia de neuritas en el sistema nervioso central (CNS; del inglés, central nervous system) en desarrollo. Consecuentemente con este concepto, la expresión de anfoterina y RAGE neuronales está sorprendentemente aumentada y conjuntamente localizada en neuronas en desarrollo del CNS de rata (Hori et al., 1995). En estudios in vitro, la emergencia neurítica de neuronas embrionarias de rata en cultivo fue específicamente inhibida en matrices revestidas con anfoterina mediante el bloqueo de RAGE empleando RAGE soluble (sRAGE) o fragmentos F(ab')_{2} anti-RAGE. Resulta importante advertir que la observación de que RAGE reacciona con anfoterina en neuronas en desarrollo para mediar en la emergencia de neuritas presenta notables paralelismos en la biología de la familia de S100. Ciertos miembros de este segundo grupo, tal como S100B, median en la emergencia de neuritas (Kligman y Marshak, 1985; Marshak, 1990; Barger et al., 1992).

Después del desarrollo, la expresión de anfoterina y RAGE neuronales disminuye en la homeostasis (Hori et al., 1995). Sin embargo, tras la acumulación de péptido \beta amiloide en el cerebro de enfermos de Alzheimer, aumenta la expresión de RAGE, particularmente en neuronas y vasculatura afectadas (Yan et al., 1996; Mackic et al., 1998). Estudios en que se emplean neuronas y células de tipo neuronal en cultivo sugieren que la interacción del péptido \beta amiloide con RAGE media en el estrés y la toxicidad neuronales y en la activación de la microglía, conduciendo esto último a una generación aumentada del factor estimulador de colonias de macrófagos, un posible medio, creemos, para desencadenar respuestas inflamatorias localizadas en el cerebro afectado, lo que exacerba la toxicidad neuronal (Yan et al., 1997). La expresión aumentada del RAGE neuronal y vascular, que está conjuntamente localizado con sitios de péptido \beta amiloide en el cerebro de sujetos humanos con enfermedad de Alzheimer, sugiere además que esta interacción puede ser muy relevante in vivo. Están en camino estudios para elucidar la importancia de esta interacción empleando ratones en que los niveles de RAGE y péptido \beta amiloide en neuronas del CNS han sido genéticamente incrementados.

En la homeostasis, hemos observado que los niveles de RAGE son bastantes bajos en una gran variedad de tipos celulares (Brett et al., 1993; Schmidt et al., 1995a). Las implicaciones de esto no están totalmente claras; sin embargo, en otros estudios hemos demostrado que la administración de RAGE soluble a ratones diabéticos adultos durante largos periodos de tiempo (hasta seis meses) no tiene efectos negativos (observaciones no publicadas; D. Stern y A. M. Schmidt). En realidad, en el escenario de la diabetes, se han advertido efectos saludables al administrar sRAGE.

En tejido diabético, la expresión de RAGE está muy suprarregulada en tejidos tales como la vasculatura y se localiza conjuntamente con niveles elevados de los productos de glicosilación y oxidación no enzimáticas, AGEs (Schmidt et al., 1995a; Park et al., 1988). Formulamos la hipótesis de que la interacción AGE-RAGE y la consiguiente perturbación celular crónica están detrás, al menos en parte, de las complicaciones de larga duración en células vasculares, neurales e inflamatorias de este trastorno que imparten consecuencias debilitantes (Schmidt et al., 1993; Schmidt et al., 1994; Wautier et al., 1994; Schmidt et al., 1995b; Wautier et al., 1996; Schmidt et al., 1996; Miyata et al., 1996). Consecuentemente con esto, la administración de sRAGE a roedores diabéticos invierte la hiperpermeabilidad vascular y suprime la aterosclerosis acelerada (Wautier et al., 1996; Park et al., 1998).

Basándose en estas observaciones, el grado en que los EN-RAGEs contribuyen a procesos inflamatorios y a la disfunción celular de trastornos que varían, por ejemplo, de diabetes e insuficiencia renal a enfermedad de Alzheimer, surge una serie de cuestiones intrigantes; futuros estudios dirigirán dichas posibilidades a modelos murinos transgénicos.

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Por lo tanto, los presentes hallazgos amplían el concepto de que RAGE es una molécula importante en escenarios en que se acumulan sus ligandos. La caracterización del promotor de RAGE, en el que se identificaron múltiples posibles sitios ligantes de DNA para una diversidad de factores de transcripción capaces de alterar el fenotipo del huésped, tales como NF-\kappaB, NF-IL-6, g-IRE, Sp1, AP2, etc. (Li y Schmidt, 1997; Li et al., 1998), sugiere marcadamente que RAGE es un gen versátil, sensible a un conjunto distinto de señales ambientales. Además, la localización del gen que codifica RAGE humano en el cromosoma seis, dentro del complejo principal de histocompatibilidad, sugiere que RAGE está implicado en la respuesta del huésped, desde el desarrollo hasta estados patofisiológicamente importantes (Sugaya et al., 1994).

Por lo tanto, en conjunto, la identificación de EN-RAGE y moléculas similares a EN-RAGE como ligandos de RAGE define la relevancia biológica de los polipéptidos S100/calgranulina y de la molécula de RAGE de la superfamilia inmunoglobulínica. La presente demostración de que el bloqueo de EN-RAGE, RAGE y su interacción detiene eficazmente la activación celular identifica estos mediadores como nuevas próximas dianas para estrategias antiinflamatorias diseñadas para sofocar las respuestas inflamatorias exageradas, limitando por ello el daño tisular.

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<110> Schmidt, Ann Marie

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Stern, David

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<120> NUEVA PROTEÍNA EXTRACELULAR LIGANTE DE RAGE (EN-RAGE) Y USOS DE LA MISMA

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<130> 0575-55873-B-PCT

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<140> Nº de Solicitud Internacional: AÚN NO CONOCIDO

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<141> 06-10-1999

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<170> PatentIn versión 2.0

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<210> 1

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<212> DNA

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<213> SEC 1

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<212> PRT

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<400> 6

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\sa{Ala Gln Asn Ile Thr}

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> Los Administradores de la Universidad de Columbia de la Ciudad de New York

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<120> Nueva proteína extracelular ligante de Rage (En-Rage) y usos de la misma

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<130> B4873-CA/CS

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<140> 99953081.9

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<141> 06-10-1999

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<160> 6

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<170> PatentIn versión 3.0

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<210> 1

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<211> 395

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<212> DNA

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<213> Bos taurus

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<400> 1

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9

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<210> 2

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<211> 50

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> Poco seguro

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<222> (47)..(47)

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<223> Xaa = cualquier aminoácido

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<400> 2

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10

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<210> 3

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<211> 90

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<400> 3

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11

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<210> 4

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<211> 90

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<400> 4

12

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<210> 5

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

13

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<210> 6

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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\sa{Ala Gln Asn Ile Thr}

Claims

1. Un péptido aislado que tiene la secuencia N-terminal de aminoácidos mostrada en la Tabla 1 (ID. SEC. nº 2).

2. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un péptido que tiene la secuencia N-terminal de aminoácidos mostrada en la Tabla 1 (ID. SEC. nº 2).

3. Una molécula de ácido nucleico aislada que tiene la secuencia mostrada en la Figura 5 (ID. SEC. nº 1).

4. Un vector replicable que comprende la molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 2 ó 3.

5. El vector replicable de la Reivindicación 4, en que el vector es un vector de expresión procariótico, un vector de expresión de levadura, un vector de expresión de baculovirus o un vector de expresión de mamífero.

6. Una célula huésped que comprende el vector de la Reivindicación 4.

7. La célula huésped de la Reivindicación 6, en que la célula huésped es una célula eucariótica, una célula somática o una célula germinal.

8. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 2 ó 3, en que la molécula de ácido nucleico está marcada con un resto detectable.

9. La molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 8, en que el resto detectable es un marcador fluorescente, una digoxigenina, una biotina, una enzima, un átomo radiactivo, un ion paramagnético o un marcador quimioluminiscente.

10. Una composición que comprende un péptido que tiene la secuencia N-terminal de aminoácidos mostrada en la Tabla 1 (ID. SEC. nº 2), y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. Una composición que comprende un péptido codificado por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 5 (ID. SEC. nº 1), y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. La composición de la Reivindicación 10 ó 11, en que el vehículo farmacéuticamente aceptable es un vehículo para administración intravenosa, oral, tópica o por aerosol.

13. Un método para determinar si un compuesto es capaz de inhibir la interacción entre el péptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 2 ó 3 y un péptido RAGE, que comprende:

(a) mezclar:

(i): un péptido RAGE o un péptido sRAGE o un fragmento de cualquiera de los mismos,

(ii): el péptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 2 ó 3; y

(iii): el compuesto;

(b) medir el nivel de interacción entre el péptido de la operación (a) (i) y el péptido de la operación (a) (ii); y

(c) comparar la cantidad de interacción medida en la operación (b) con la cantidad medida entre el péptido de la operación (a) (i) y el péptido de la operación (a) (ii) en ausencia del compuesto, determinándose de esta manera si el compuesto es capaz de inhibir la interacción entre el péptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la Reivindicación 2 ó 3 y el péptido RAGE; en el que una reducción en la cantidad de interacción en presencia del compuesto indica que el compuesto es capaz de inhibir la interacción.

14. El método de la Reivindicación 13, en que el fragmento de la operación (a) (i) es el dominio V de RAGE.

15. El método de la Reivindicación 13, en que el fragmento de la operación (a) (i) o (a) (ii) es sintético.

16. El método de la Reivindicación 13, en que el compuesto comprende al menos una porción de un péptido sRAGE presente en la naturaleza.

17. El método de la Reivindicación 13, en que el compuesto es un compuesto peptidomimético.

18. El método de la Reivindicación 13, en que el compuesto es una molécula orgánica.

19. El método de la Reivindicación 13, en que el compuesto es un péptido, un ácido nucleico o un producto químico inorgánico.

20. El método de la Reivindicación 13, en que el compuesto es una molécula de peso molecular inferior a 10.000 dáltones.

21. El método de la Reivindicación 13, en que el compuesto es un anticuerpo o un fragmento del mismo.

22. El método de la Reivindicación 13, en que el compuesto es un péptido RAGE mutado o un fragmento del mismo.

23. El método de la Reivindicación 13, en que el compuesto es un péptido mutado de la Reivindicación 1 o un fragmento del mismo.

24. El método de la Reivindicación 13, en que el péptido de la operación (a) (ii) es fijado a una superficie sólida.

25. El método de la Reivindicación 13, en que el péptido de la operación (a) (i) o (a) (ii) es detectablemente marcado.

26. El método de la Reivindicación 25, en que el marcador detectable comprende fluorescencia, biotina o radiactividad.

27. El método de la Reivindicación 13, en que el mezclamiento tiene lugar en una célula.

28. El método de la Reivindicación 13, en que el mezclamiento tiene lugar en un animal.