MXPA02002491A

MXPA02002491A - Acidos nucleicos y polipeptidos del factor 19 de crecimiento de fibroblastos y metodos de uso para tratamiento de la obesidad.

Info

Publication number: MXPA02002491A
Application number: MXPA02002491A
Authority: MX
Inventors: A Stewart Timothy
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-09-08
Filing date: 2000-03-09
Publication date: 2002-08-12

Abstract

La presente invencion esta dirigida a polipeptidos novedosos que pertenecen a la familia del factor de crecimiento de los fibroblastos y a las moleculas de acido nucleico que codifican estos polipeptidos. Tambien se proporcionan aqui los vectores y las celulas huesped que comprenden estas secuencias de acido nucleico, las moleculas de polipeptidos quimericos que comprenden los polipeptidos de la presente invencion fusionados a las secuencias de polipeptidos heterologos, los anticuerpos los cuales se unen a los polipeptidos de la presente invencion y a los metodos para producir los polipeptidos de la presente invencion. Ademas, se proporcionan metodos para el tratamiento de la obesidad.

Description

ÁCIDOS NUCLEICOS Y POLIPEPTIDOS DEL FACTOR 19 DE CRECIMIENTO DE FIBROBLASTOS Y METODOS DE USO PARA TRATAMIENTO DE LA OBESIDAD Campo de la Invención La presente invención se refiere en general a la identificación y aislamiento del ADN novedoso y a la producción recombinante de los polipéptidos novedosos designados aqui como los polipéptidos del factor 19 del crecimiento de los fibroblastos (FGF-19) , y a métodos, composiciones y ensayos que utilizan tales polipéptidos para el tratamiento terapéutico de la obesidad y para producir materiales activos farmacéuticamente que tienen propiedades terapéuticas y farmacológicas incluyendo aquellas asociadas con el tratamiento de la obesidad.

Antecedentes de la Invención La obesidad es una enfermedad crónica que es altamente prevaleciente en la sociedad moderna y está asociada no solamente con un estigma social, sino también con una prolongación reducida de la vida y numerosos problemas médicos, incluyendo el desarrollo psicológico adverso, los Ref.136361 desórdenes de la reproducción tales como la enfermedad policistica de los ovarios, los desordenes dermatológicos tales como infecciones, venas varicosas, la Acanthosis nigricans, y eccema, la intolerancia al ejercicio, diabetes mellitus, resistencia a la insulina, hipertensión, hipercolesterolemia, colelitiasis, osteoartritis, lesiones ortopédicas, enfermedad tromboembólica, cáncer y enfermedad de las coronarias del corazón, Rissanen et al., British Medical Journal, 301: 835-837 (1990). Las terapias existentes para la obesidad incluyen dietas estándares y ejercicio, dietas muy bajas en calorías, terapias del comportamiento, farmacoterapia que involucra los supresores del apetito, fármacos termogénicos, inhibidores de la absorción de los alimentos, dispositivos mecánicos tales como alambres para las quijadas, cordones para la cintura y balones, y cirugía. Jung y Chong, Clinical Endocrinology, 35: 11-20 (1991); Bray, Am. J. Clin. Nutr., 55: 538S-544S (1992). El ayuno modificado por la escasez de proteínas se ha reportado que va a ser efectivo en la reducción de peso de los adolescentes. Lee et al., Clin. Pediatr., 31: 234-236 (Abril 1992) . La restricción de calorías como un tratamiento para la obesidad provoca que el catabolismo de las proteínas del cuerpo almacene y produzca un equilibrio negativo del nitrógeno. Las dietas suplementadas con proteínas, por lo tanto, han alcanzado popularidad como un medio para reducir la pérdida de nitrógeno durante la restricción calórica. A causa de que tales dietas producen solamente una escasez de nitrógeno moderada, una manera más efectiva de preservar la masa corporal magra y los almacenes de las proteínas es necesaria. Además, el tratamiento de la obesidad podría ser mejorado si tal régimen también condujera a una pérdida acelerada de la grasa corporal. Varios enfoques de tal tratamiento incluyen aquellos descritos por eintraub y Bray, Med. Clinics N. Amer., 73: 237 (1989); Nutrition Reviews, 49: 33(1991) . Considerando la alta prevalecencia de la obesidad en nuestra sociedad y las serias consecuencias asociadas con la misma como se describieron anteriormente, cualquier fármaco terapéutico potencialmente útil en la reducción del peso de las personas obesas podrían tener un profundo efecto benéfico sobre su salud. Existe una necesidad en el arte de un fármaco que reducirá el peso corporal total de los sujetos obesos hacia su peso corporal ideal sin efectos laterales adversos significativos y que ayudará al sujeto obeso a mantener el nivel del peso reducido. Por lo tanto es deseable proporcionar un régimen de tratamiento que sea útil para regresar el peso corporal de los sujetos obesos a un peso corporal ideal, normal.

Además es deseable proporcionar una terapia para la obesidad que conduzca al mantenimiento del peso corporal reducido durante un período de tiempo prolongado . También es deseable prevenir la obesidad y, una vez que el tratamiento ha empezado, detener la progresión o prevenir el inicio de las enfermedades que son la consecuencia de, o son de efectos secundarios para, la obesidad, tales como la arteriosclerosis y la enfermedad policística de los ovarios. Tales métodos de tratamiento y las composiciones relacionadas son provistos aquí. También son provistas aquí las proteínas novedosas y los ácidos nucleicos, y los métodos para seleccionar los moduladores de los mismos. Otros métodos, tratamientos y composiciones provistas aquí llegarán a ser evidentes para aquellos expertos en el arte.

Breve Descripción de la Invención Un clon de ADNc (designado aquí como DNA49435-1219) ha sido identificado, que codifica un polipéptido novedoso, el cual tiene alguna semejanza de la secuencia con los miembros de la familia del factor de crecimiento de los fibroblastos, designado en la presente solicitud como el "factor 19 de crecimiento de los fibroblastos" (FGF-19) .

En una modalidad, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucléotidos que codifica un polipéptido de FGF-19. En un aspecto, la molécula de ácido nucleico aislado comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80% de la identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 81% de la identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia de ácido nucleico con respecto a (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido PEACH que tiene la secuencia de los residuos de aminoácidos desde aproximadamente 1 o aproximadamente 23 hasta aproximadamente 216, inclusive, de la Figura 2 (SEC ID NO:2), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) . En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico aislado comprende (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de FGF-19 que tiene la secuencia de los residuos de aminoácidos desde aproximadamente 1 o aproximadamente 23 hasta aproximadamente 216, inclusive, de la Figura 2 (SEC ID N0:2), o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) . En otros aspectos, la molécula de ácido nucleico aislado comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 81% de la identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia de ácido nucleico con respecto a (a) una molécula de ADN que tiene la secuencia de nucleótidos desde aproximadamente 464 o aproximadamente 530 hasta aproximadamente llll, inclusive, de la Figura 1 (SEC ID NO:l), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) . En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico aislado comprende (a) la secuencia de nucleótidos desde aproximadamente 464 o aproximadamente 530 hasta aproximadamente llll, inclusive, de la Figura 1 (SEC ID NO:l), o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) . En un aspecto adicional, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 81% de la identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia de ácido nucleico con respecto a (a) una secuencia de nucleótidos que codifica el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc de la proteína humana depositado en el ATCC el 21 de noviembre de 1997, bajo el Depósito del ATCC No. 209480 (DNA49435-1219) o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) . En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 81% de la identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia de ácido nucleico con respecto a (a) la secuencia de codificación de los polipéptidos de longitud total del ADNc de la proteína humana depositada en el ATCC el 21 de noviembre de 1997 bajo el Depósito No. 209480 del ATCC (DNA49435-1219) o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) . En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico aislado comprende (a) la secuencia de codificación de los polipéptidos de longitud completa del ADN depositado en el ATCC el 21 de noviembre de 1997 bajo el Depósito No. 209480 del ATCC (DNA49435-1219) o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) . En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislado la cual codifica un polipéptido de FGF-19 activo como se define posteriormente, que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibridiza al complemento de la secuencia de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 1 o aproximadamente 23 hasta aproximadamente 216, inclusive, de la Figura 2 (SEC ID NO: 2) . Preferentemente, la hibridación ocurre bajo condiciones severas de lavado e hibridación. En todavía otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislado la cual codifica un polipéptido de FGF-19 activo como se define posteriormente, que comprende una secuencia de nucleótidos que se hibridiza al complemento de la secuencia de ácido nucleico entre aproximadamente los nucleótidos 464 o aproximadamente 530 y aproximadamente llll, inclusive de la Figura 1 (SEC ID NO:l). Preferentemente, la hibridación ocurre bajo condiciones severas de lavado e hibridación. En un aspecto adicional, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente 22 nucleótidos y la cual es producida por la hibridación de una molécula del ADN de prueba bajo condiciones severas con (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido de FGF-19 que tiene la secuencia de los residuos de aminoácidos desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 23 hasta aproximadamente 216, inclusive, de la Figura 2 (SEC ID NO:2), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) , si la molécula del ADN de prueba tiene al menos aproximadamente una identidad de la secuencia de ácido nucleico del 80%, alternativamente al menos aproximadamente 81% de la identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia de ácido nucleico con respecto a (a) o (b) , y aislar la molécula del ADN de prueba.

En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislado que comprende (a) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que registra al menos aproximadamente 80% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 81% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 82% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 83% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 84% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 85% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 86% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 87% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 88% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 89% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 90% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 91% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 92% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 93% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 94% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 95% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 96% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 97% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 98% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 99% positivos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de los residuos de aproximadamente 1 o aproximadamente 23 hasta 216, inclusive, de la Figura 2 (SEC ID N0:2), o (b) el complemento de la secuencia de nucleótidos de (a) . En un aspecto específico, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que comprende el ADN que codifica un polipéptido de FGF-19 sin la secuencia de la señal N-terminal y/o la metionina de inicio, o que es complementaria con tal molécula de ácido nucleico de codificación. El péptido de la señal ha sido identificado tentativamente como extendiéndose desde aproximadamente la posición 1 de los aminoácidos hasta aproximadamente la posición 22 de los aminoácidos, inclusive, en la secuencia de la Figura 2 (SEC ID NO: 2) . Se señala, sin embargo, que la frontera C-terminal del péptido de la señal puede variar, pero más probablemente en no más de aproximadamente 5 aminoácidos sobre cualquier lado de la frontera o límite C-terminal del péptido de la señal como se identificó inicialmente aquí, en donde el límite o frontera C-terminal del péptido de la señal puede ser identificada con respecto a los criterios empleados rutinariamente en el arte para identificar este tipo de elemento de la secuencia de aminoácidos (por ejemplo, Nielsen et al., Prot. Eng. 10:1-6(1997) y von Heinje et al., Nucí . Acids . Res . 14:4683-4690 (1986) ) . Además, también se reconoce que, en algunos casos, la segmentación de una secuencia de la señal desde un polipéptido secretado no es completamente uniforme, conduciendo a más de una de las especies secretadas. Estos polipéptidos, y los polinucleótidos que los codifican, están contemplados por la presente invención. Como tal, para los propósitos de la presente solicitud, el péptido de la señal del polipéptido de FGF-19 mostrado en la Figura 2 (SEC ID NO: 2) se extiende desde los aminoácidos 1 a X de la Figura 2 (SEC ID N0:2) (SEC ID N0:2), en donde X es cualquier aminoácido desde 17 hasta 27 de la Figura 2 (SEC ID NO: 2) . Por lo tanto, las formas maduras del polipéptido de FGF-19 las cuales están abarcadas por la presente invención incluyen aquellas que comprenden los aminoácidos X a 216 de la Figura 2 (SEC ID N0:2), en donde X es cualquier aminoácido desde 17 hasta 27 de la Figura 2 (SEC ID NO: 2) y las variantes de las mismas como se describen posteriormente. Las moléculas de ácido nucleico aislado que codifican estos polipéptidos también están contempladas . Otra modalidad está dirigida a los fragmentos de una secuencia de polipéptidos de FGF-19 la cual incluye la secuencia de codificación que puede encontrar uso, por ejemplo, como sondas de hibridación o para codificar los fragmentos de un polipéptido de FGF-19 que puede codificar opcionalmente un polipéptido que comprende un sitio de aglutinación para un anticuerpo de anti-FGF-19. Tales fragmentos de ácido nucleico son usualmente de al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 40 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 50 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 60 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 70 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 80 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 90 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 100 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 110 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 120 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 130 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 140 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 150 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 160 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 170 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 180 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 190 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 200 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 250 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 300 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 350 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 400 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 450 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 500 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 600 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 700 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 800 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 900 nucléotidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 1000 nucléotidos de longitud, en donde en este contexto el término "aproximadamente" significa la longitud de la secuencia de nucleótidos referida más o menos 10% de aquella longitud referida. En una modalidad preferida, el fragmento de la secuencia de nucleótidos es derivada de cualquier región de codificación de la secuencia de nucleótidos mostrada en la Figura 1 (SEC ID N0:1). Se señaló que los fragmentos novedosos de una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de FGF-19 pueden ser determinados de una manera rutinaria alineando la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de FGF-19 con otras secuencias de nucleótidos conocidas utilizando cualquiera de un número de programas de alineación de las secuencias bien conocidos y determinando cual (es) fragmento (s) de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de FGF-19 es (son) novedoso (s). La totalidad de tales secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido de FGF-19 están contempladas aquí y pueden ser determinadas sin experimentación indebida. También están contemplados los fragmentos del polipéptido de FGF-19 codificados por estos fragmentos de la moléculas de nucleótidos, preferentemente aquellos fragmentos del polipéptido de FGF-19 que comprenden un sitio de unión para un anticuerpo de FGF-19. En otra modalidad, la invención proporciona un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el FGF-19 o sus variantes. El vector puede comprender cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aislado identificados aquí anteriormente. Una célula huésped que comprende tal vector también es provista. A manera de ejemplo, las células huésped pueden ser las células de CHO, E. coli, las células de insectos infectadas con el baculovirus, o la levadura. Un proceso para producir los polipéptidos de FGF-19 es provisto adicionalmente y comprende cultivar las células huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión del FGF-19 y la recuperación del FGF-19 desde el cultivo celular. En otra modalidad, la invención proporciona el polipéptido de FGF-19 aislado codificado por cualquiera de las secuencias de los ácido nucleico aislado identificadas aquí anteriormente. En un aspecto específico, la invención proporciona el polipéptido de FGF-19 de la secuencia natural aislada, el cual en ciertas modalidades, incluye una secuencia de aminoácidos que comprende los residuos desde aproximadamente 1 o aproximadamente 23 hasta aproximadamente 216 de la Figura 2 (SEC ID N0:2) . En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido de FGF-19 aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 80%, alternativamente al menos aproximadamente 81% de la identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia de los aminoácidos con la secuencia de los residuos de aminoácidos desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 23 hasta aproximadamente 216, inclusive, de la Figura 2 (SEC ID N0:2). En un aspecto adicional, la invención se refiere a un polipéptido de FGF-19 aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de la secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 80%, alternativamente al menos aproximadamente 81% de la identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia de los aminoácidos con respecto a una secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de la proteína humana depositada en el ATCC el 21 de noviembre de 1997 bajo el Depósito ATCC No. 209480 (DNA49435-1219) . En una modalidad preferida, el polipéptido de FGF-19 aislado comprende una secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de la proteína humana humana depositada en el ATCC el 21 de noviembre de 1997 bajo el Depósito ATCC No. 209480 (DNA49435-1219) . En un aspecto adicional, la invención se refiere a un polipéptido de FGF-19 aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que registra al menos aproximadamente 80% y positivos, alternativamente al menos aproximadamente 81% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 82% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 83% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 84% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 85% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 86% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 87% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 88% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 89% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 90% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 91% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 92% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 93% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 94% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 95% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 96% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 97% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 98% positivos, alternativamente al menos aproximadamente 99% positivos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de los residuos desde aproximadamente 1 o aproximadamente 23 hasta 216, inclusive, de la Figura 2 (SEC ID NO: 2) . En un aspecto específico, la invención proporciona un polipéptido de FGF-19 aislado sin la secuencia de la señal N-terminal y/o la metionina de inicio y está codificada por una secuencia de nucleótidos que codifica tal secuencia de aminoácidos como se describió aquí anteriormente. Los procesos para producir el mismo también son descritos aquí, en donde estos procesos comprenden cultivar una célula huésped que comprende un vector el cual comprende la molécula de ácido nucleico de codificación apropiada bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de FGF-19 y recuperar el polipéptido de FGF-19 desde el cultivo celular. En todavía otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido de FGF-19 aislado, que comprende la secuencia de los residuos de aminoácidos desde aproximadamente 1 o aproximadamente 23 hasta aproximadamente 216, inclusive, de la Figura 2 (SEC ID NO: 2), o un fragmento de la misma la cual es biológicamente activa o suficiente para proporcionar un sitio de unión o aglutinación para un anticuerpo de anti-FGF-19, en donde la identificación de los fragmentos del polipéptido de FGF-19 que poseen la actividad biológica o proporcionan un sitio de aglutinación para un anticuerpo de anti-FGF-19 puede ser efectuada de una manera rutinaria utilizando las técnicas las cuales son bien conocidas en el arte. Preferentemente, el fragmento de FGF-19 retiene una actividad biológica cualitativa de un polipéptido de FGF-19 natural, incluyendo la capacidad para tratar la obesidad terapéuticamente . En un aspecto todavía adicional, la invención proporciona un polipéptido producido (i) hibridizando una molécula del ADN de prueba bajo condiciones severas con (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido de FGF-19 que tiene la secuencia de los residuos de aminoácidos desde aproximadamente 1 o aproximadamente 23 hasta aproximadamente 216, inclusive, de la Figura 2 (SEC ID N0:2), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) , y si la molécula del ADN de prueba tiene una identidad de la secuencia de al menos aproximadamente un 80%, preferentemente al menos aproximadamente una identidad de la secuencia de ácido nucleico del 80%, alternativamente al menos aproximadamente 81% de la identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia de ácido nucleico con respecto a (a) o (b) , (ii) cultivar una célula huésped que comprende la molécula del ADN de prueba bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido, y (iii) recuperar el polipéptido del cultivo celular.

En otra modalidad, la invención proporciona moléculas quiméricas que comprenden un polipéptido de FGF-19 fusionado a un polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos, en donde el polipéptido de FGF-19 puede comprender cualquier polipéptido de FGF-19, variante o fragmento del mismo como se describió aquí anteriormente. Un ejemplo de tal molécula quimérica comprende un polipéptido de FGF-19 fusionado a una secuencia de la etiqueta del epítope o una región de Fc de una inmunoglobulina. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo como se define posteriormente el cual se une o aglutina específicamente a un polipéptido de FGF-19 como se describió aquí anteriormente. Opcionalmente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpos o un anticuerpo de una sola cadena. En todavía otra modalidad, la invención se refiere a los agonistas y antagonistas de un polipéptido de FGF-19 natural como se define posteriormente. En una modalidad particular, el agonista o antagonista es un anticuerpo de anti-FGF-19 o una molécula pequeña. En una modalidad adicional, la invención se refiere a un método de identificación de los agonistas o antagonistas para un polipéptido de FGF-19 el cual comprende poner en contacto el polipéptido de FGF-19 con una molécula candidata y verificar una actividad biológica mediada por el polipéptido de FGF-19. Preferentemente, el polipéptido de FGF-19 es un polipéptido de FGF-19 natural. En una modalidad todavía adicional, la invención se refiere a una composición de materia que comprende un polipéptido de FGF-19, o un agonista o antagonista de un polipéptido de FGF-19 como se describió aquí, o un anticuerpo de anti-FGF-19, en combinación con un portador. Opcionalmente, el portador es un portador farmacéuticamente aceptable. Otra modalidad de la presente invención está dirigida al uso de un polipéptido de FGF-19, o un agonista o antagonista del mismo como se describió aquí, o un anticuerpo de anti-FGF-19, para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una condición la cual es de respuesta al polipéptido de FGF-19, un agonista o antagonista del mismo o un anticuerpo de anti-FGF-19. En una modalidad, un método para la selección de un agente bioactivo capaz de unión al FGF-19 es provisto. En un aspecto, el método comprende agregar un agente bioactivo candidato a una muestra del FGF-19 y determinar la unión o aglutinación del agente candidato para el FGF-19, en donde la unión o aglutinación indica un agente bioactivo capaz de aglutinación al FGF-19.

Provisto adicionalmente aquí está un método para la selección de un agente bioactivo capaz de modular la actividad de FGF-19. En una modalidad, un método es provisto, el cual comprende los pasos de agregar un agente bioactivo candidato a una muestra de FGF-19 y determinar una alteración en la actividad biológica del FGF-19, en donde una alteración indica un agente bioactivo capaz de modular la actividad del FGF-19. En una modalidad, la actividad de FGF-19 es la absorción reducida de la glucosa en las células. En otra modalidad, la actividad de FGF-19 es la liberación de la leptina incrementada desde las células. En una modalidad preferida, la actividad de FGF-19 es la absorción reducida de la glucosa y la liberación de peptina incrementada desde las células. Preferentemente las células son adipocitos. En todavía otra modalidad, la actividad de FGF-19 es la oxidación incrementada de los lípidos y los carbohidratos. Preferentemente las células son las células del hígado o de los músculos. En todavía otra modalidad, la invención proporciona un método de identificación de un receptor de FGF-19. En una modalidad preferida, el método comprende combinar el FGF-19 con una composición que comprende el material de la membrana celular en donde el FGF-19 forma complejos con un receptor sobre el material de la membrana celular, e identificar al receptor como un receptor de FGF-19. En una modalidad, el método incluye un paso de reticulación con el FGF-19 y el receptor. La membrana celular puede ser de una célula intacta o una preparación del extracto de la membrana celular. En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para inducir la liberación de la leptina de las células, preferentemente los adipocitos. En una modalidad, el método comprende administrar el FGF-19 a las células en una cantidad efectiva para inducir la liberación de la leptina. En los métodos provistos aquí, el FGF-19 puede ser administrado como un ácido nucleico el cual expresa el FGF-19 o en la forma de proteína. Como se describe posteriormente, el FGF-19 puede ser administrado por infusión o en una formulación de liberación sostenida. Preferentemente, el FGF-19 es administrado a un individuo con un portador farmacéuticamente aceptable. También se proporciona aquí un método para inducir una reducción en la absorción de la glucosa en las células, preferentemente las células de los adipocitos. En una modalidad el método comprende administrar el FGF-19 a las células en una cantidad efectiva para inducir una reducción en la absorción de la glucosa.

En todavía otro aspecto de la invención se proporciona un método de tratamiento de la obesidad en un individuo. En una modalidad el método comprende administrar a un individuo una composición que comprende el FGF-19 en una cantidad efectiva para tratar la obesidad. De esta manera, las condiciones relacionadas con la obesidad también pueden se tratadas, tales como la enfermedad cardiovascular. También se proporciona aquí un método de reducción de la masa corporal total en un individuo, que comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva del FGF-19. En una modalidad preferida, la adiposidad (grasa) de un individuo es reducida. Además, un método es provisto aquí para reducir el nivel de al menos uno de los triglicéridos y los ácidos grasos libres en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del FGF-19. También se proporciona aquí un método para incrementar la velocidad metabólica en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del FGF-19. También se proporciona aquí un modelo de animal para determinar los efectos del FGF-19 y los moduladores de los mismos bajo condiciones y estados variables. En una modalidad, un animal, preferentemente un roedor, es provisto, el cual comprende un genoma que comprende un transgen que codifica el FGF-19.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID N0:1) de un ADNc que contiene una secuencia de nucleótidos (nucleótidos 464-1111) que codifica una secuencia natural del FGF-19, en donde la secuencia de nucleótidos (SEC ID N0:1) es un clon designado aquí como "DNA49435-1219" . También presentadas en letras con negritas y subrayado, están las posiciones de los codones de inicio y parada respectivos. La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 2) de una secuencia natural del polipéptido de FGF-19 como se deriva de la secuencia de codificación de la SEC ID N0:1. También son mostradas las localizaciones aproximadas de varios de los otros dominios de los polipéptidos importantes. Las Figuras 3A y 3B muestran gráficas de barras que demuestran que los ratones transgénicos de MLC-FGF-19 pesaron menos que sus compañeros de camada no transgénicos (Figura 3A) y tienen niveles de leptina de circulación inferior (Figura 3B) . La Figura 3A muestra el peso de los ratones transgénicos de FGF-19 (barras continuas) y los compañeros de camada no transgénicos (del tipo silvestre) (barras punteadas) a las 6 semanas de edad durante la alimentación ad libitum (hasta la izquierda) , después de ayunos de 6 y 24 horas, y 24 horas después de finalizar un ayuno de 24 horas (hasta la derecha) . La Figura 3B muestra los sueros de los mismos grupos de ratones presentados en la Figura 3A en un ensayo para la leptina (barras verticales) . Las Figuras 4A-4d son gráficas de barras que demuestran que los ratones transgénicos de FGF-19 tienen una admisión de alimentos y producción de orina incrementadas, pero tienen un conteo de hematocritos normal . Un grupo de ratones fueron verificados para verificar la admisión de alimentos durante la alimentación ad libitum y 24 horas después de finalizar un ayuno de 24 horas (Figura 4A) , la admisión de agua (Figura 4B) , la salida de orina (Figura 4C) y el conteo de hematocritos (Figura 4D) en donde los resultados para los ratones transgénicos de FGF-19 en cada gráfica son mostrados por las barras solo de color negro y los resultados para el tipo silvestre son mostrados por las barras puntadas . La Figura 5 es una gráfica de barras que demuestra que los ratones transgénicos de FGF-19 tienen una tasa incrementada de consumo del oxígeno. El consumo del oxígeno es mostrado para los ratones transgénicos de FGF-19 (barras solo de color negro) y del tipo silvestre (barras punteadas) durante ambos ciclos de luz (día o noche) , a continuación de un ayuno de 24 horas y 24 horas después de la finalización de un ayuno de 24 horas. Las Figuras 6A y 6B son gráficas de barras que demuestran que los ratones transgénicos de FGF-19 (barras solo de color negro) tienen niveles reducidos de triglicéridos (Figura 6A) y de ácidos grasos libres (Figura 6B) sobre los ratones del tipo silvestre (barras punteadas) . Las Figuras 7A y 7B son gráficas de barras las cuales demuestran que la infusión de los ratones no transgénicos con el FGF-19 (barras solo de color negro) conduce a un incremento en la admisión de alimentos (Figura 7A) y a un incremento en el consumo de oxígeno (Figura 7B) sobre los ratones infusionados con el vehículo que carecen del FGF-19 (barras punteadas) , en donde "n" significa noche y "d" significa día. Las Figuras 8A y 8B son gráficas de barras que indican que el FGF-19 incrementa la liberación de leptina de los adípocitos (Figura 8A) y reduce la absorción de la glucosa por los adipocitos (Figura 8B) . La Figura 9 es una gráfica de barras que muestra el peso de la almohadilla de grasa de los ratones transgénicos de FGF-19 (barras sombreadas) o del tipo silvestre (barras solo de color negro) cada una sobre una dieta elevada en grasas (HFD) durante el transcurso del tiempo, en donde a lo largo de la barra horizontal que empieza en la izquierda, los resultados son mostrados a las 6 semanas para el epidídimo (HFD Ep) y luego para retroperitoneal con peri-renal (HFD RP/PR) , y luego a las 10 semanas para el epidídimo y luego para retroperitoneal con peri-renal. La Figura 10 es una gráfica de barras que muestra la tolerancia a la glucosa de los ratones transgénicos de FGF-19 (barras sombreadas) o del tipo silvestre (barras solo de color negro) durante el transcurso del tiempo (ambos sobre dietas elevadas en grasas para diez semanas) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS I. Definiciones Los términos "polipéptido de FGF-19", "proteína de FGF-19" y "FGF-19" cuando se utilizan aquí abarcan el FGF-19 de la secuencia natural y las variantes del polipéptido de FGF-19 (las cuales están definidas adicionalmente aquí) . El polipéptido de FGF-19 puede ser aislado de una variedad de fuentes, tales como de los tipos de tejido humano o de otra fuente, o preparados por los métodos recombinantes y/o sintéticos. Un "FGF-19 de la secuencia natural" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un FGF-19 derivado de la naturaleza. Tal FGF-19 de la secuencia natural puede ser aislado de la naturaleza o puede ser producido por medios recombinantes y/o sintéticos. El término "FGF-19 de la secuencia natural" abarca específicamente las formas truncadas o secretadas que están presentes de manera natural (por ejemplo, una secuencia del dominio extracelular) , las formas variantes que están presentes de manera natural (por ejemplo, las formas empalmadas alternativamente) y las variantes alélicas que están presentes de manera natural del FGF-19. En una modalidad de la invención, el FGF-19 de la secuencia natural es un FGF-19 de la secuencia natural maduro o de longitud total que comprende los aminoácidos 1 a 216 de la Figura 2 (SEC ID NO: 2) . También, aunque el polipéptido de FGF-19 descrito en la Figura 2 (SEC ID NO: 2) se muestra que empieza con el residuo de metionina designado aquí como la posición 1 del aminoácido, es concebible y posible que otro residuo de metionina localizado ya sea corriente arriba o corriente abajo de la posición 1 de los aminoácidos en la Figura 2 (SEC ID NO: 2) pueda ser empleado como el residuo de los aminoácidos de partida para el polipéptido de FGF-19. "Polipéptido variante de FGF-19" significa un polipéptido de FGF-19 activo como se define posteriormente que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de (a) los residuos 1 o aproximadamente 23 hasta 216 del polipéptido de FGF-19 mostrado en la Figura 2 (SEC ID NO:2), (b) X a 216 del polipéptido de FGF-19 mostrado en la Figura 2 (SEC ID N0:2), en donde X es cualquier residuo de aminoácidos desde 17 hasta 27 de la Figura 2 (SEC ID N0:2), o (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (SEC ID NO: 2). Tales polipéptidos variantes de FGF-19 incluyen, por ejemplo, los polipéptidos de FGF-19 en donde uno o más residuos de aminoácidos son agregados, o delecionados, en la terminación N y/o C, así como dentro de uno o más dominios internos, de la secuencia de la Figura 2 (SEC ID NO: 2) . Ordinariamente, un polipéptido variante de FGF-19 tendrá al menos aproximadamente una identidad de la secuencia de aminoácidos del 80%, alternativamente al menos aproximadamente 81% de la identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de la secuencia de los aminoácidos, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia de los aminoácidos con (a) los residuos 1 o aproximadamente 23 a 216 del polipéptido de FGF-19 mostrado en la Figura 2 (SEC ID N0:2), (b) X a 216 del polipéptido de FGF-19 mostrado en la Figura 2 (SEC ID N0:2), en donde X es cualquier residuo de aminoácidos desde 17 hasta 27 de la Figura 2 (SEC ID NO: 2), o (c) otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (SEC ID NO: 2). Los polipéptidos variantes de FGF-19 no abarcan la secuencia de polipéptidos del FGF-19 natural. Ordinariamente, los polipéptidos variantes de FGF-19 son al menos de aproximadamente 10 aminoácidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 30 aminoácidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 40 aminoácidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 70 aminoácidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 80 aminoácidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 90 aminoácidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 150 aminoácidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 200 aminoácidos de longitud, alternativamente de al menos aproximadamente 300 aminoácidos de longitud, o más. "El porcentaje (%) de identidad de la secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias de polipéptidos de FGF-19 identificadas aquí está definido como el porcentaje de los residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que es idéntico con los residuos de aminoácidos en una secuencia de FGF-19, después de la alineación de las secuencias y la introducción de los huecos, si es necesario, para lograr la identidad de la secuencia porcentual máxima, y sin considerar ninguna de las substituciones conservadoras como parte de la identidad de la secuencia. La alineación para los propósitos de la determinación del porcentaje de la identidad de la secuencia de aminoácidos puede ser lograda de varias maneras que están dentro de la experiencia en el arte, por ejemplo, utilizando los programas de computadora disponibles públicamente tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR) . Aquellos expertos en el arte pueden determinar los parámetros apropiados para la medición de la alineación, incluyendo cualesquiera algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima sobre la longitud total de las secuencias que son comparadas. Para los propósitos de aquí, sin embargo, los valores del % de la identidad de la secuencia de aminoácidos son obtenidos como se describe posteriormente utilizando el programa de computadora ALIGN-2 para la comparación de las secuencias, en donde el código de la fuente completo para el programa ALIGN-2 es provisto en la Tabla 1 posterior. El programa de computadora para la comparación de las secuencias ALIGN-2 fue autorizado por Genentech, Inc., y el código de la fuente mostrado en la Tabla 1 ha sido presentado con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos Reservados de los Estados Unidos de América, Washington D.C., 20559, en donde el mismo está registrado bajo el Registro de Derechos Reservados de los Estados Unidos de América No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede ser compilado del código de las fuentes provisto en la Tabla 1. El programa ALIGN-2 debe ser compilado para su uso sobre un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4. OD digital. Todos los parámetros de comparación de las secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no varían. Para los propósitos de aquí, el % de la identidad de la secuencia de aminoácidos de una secuencia A de aminoácidos dada para, con, o contra una secuencia B de aminoácidos dada (la cual puede ser expresada alternativamente como una secuencia A de aminoácidos dada que tiene o que comprende un cierto porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos para, con, o contra una secuencia B de aminoácidos dada) es calculado como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de los residuos de aminoácidos registrados como correspondencias idénticas por el programa de alineación de la secuencia ALIGN-2 en esta alineación del programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual al % de identidad de la secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. Como los ejemplos de los cálculos del % de la identidad de la secuencia de aminoácidos, las Tablas 2 y 3 demuestran como calcular el % de identidad de la secuencia de aminoácidos, de la secuencia de aminoácidos designada "Proteína de Comparación" con respecto a la secuencia de aminoácidos designada "PRO" . A menos que se especifique de otra manera, todos los valores del % de la identidad de la secuencia de aminoácidos utilizados aquí son obtenidos como se describió anteriormente utilizando el programa de computadora para la comparación de las secuencias ALIGN-2. Sin embargo, el % de la identidad de la secuencia de aminoácidos también puede ser determinado utilizando el programa de comparación de las secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul et al . , Nucleic Acids Res . 25:3389-3402 (1997)). El programa de comparación de las secuencias NCBI-BLAST2 puede ser descargado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov u obtenido de otra manera del National Institute of Health, Bethesda, MD. El programa NCBI-BLAST2 utiliza varios parámetros de búsqueda, en donde la totalidad de estos parámetros de la búsqueda son fijados como valores de falla incluyendo, por ejemplo, sin máscara = si, hebra = todas, presentaciones esperadas = 10, longitud de la complejidad baja mínima = 15/5, valor 2 de pasos múltiples = 0.01, constante para los pasos múltiples = 25, reducción para la alineación final = 25 con huecos y matriz de evaluación = BLOSUM62. En situaciones en donde NCBI-BLAST2 es empleado para las comparaciones de las secuencias de aminoácidos, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos dada A para, con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B (la cual alternativamente puede ser expresada como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un cierto % de identidad de la secuencia de aminoácidos para, con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B) es calculada como sigue 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de los residuos de aminoácidos registrados como correspondencias idénticas por el programa de alineación de las secuencias NCBI-BLAST2 en esta alineación del programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual al % de la identidad de la secuencia de aminoácidos de B con respecto a A. "Polinucléotido variante de FGF-19" o "secuencia de ácido nucleico variante de FGF-19" significa una molécula de ácido nucleico la cual codifica un polipéptido de FGF-19 activo como se define posteriormente y el cual tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia de ácido nucleico con ya sea (a) una secuencia de ácido nucleico la cual codifica los residuos 1 o aproximadamente 23 hasta 216 del polipéptido de FGF-19 mostrado en la Figura 2 (SEC ID NO:2), (b) una secuencia de ácido nucleico la cual codifica los aminoácidos X hasta 216 del polipéptido de FGF-19 mostrado en la Figura 2 (SEC ID NO: 2), en donde X es cualquier residuo de aminoácidos desde 17 hasta 27 de la Figura 2 (SEC ID NO: 2), o (c) una secuencia de ácido nucleico la cual codifica otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (SEC ID NO: 2) . Ordinariamente, un polinucleótido variante de FGF-19 tendrá al menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 81% de la identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 82% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 83% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 84% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 85% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 86% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 87% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 88% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 89% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 90% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 91% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 92% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 93% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 94% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 95% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 96% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 97% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 98% de identidad de la secuencia de ácido nucleico, alternativamente al menos aproximadamente 99% de identidad de la secuencia de ácido nucleico con ya sea (a) una secuencia de ácido nucleico la cual codifica los residuos 1 o aproximadamente 23 hasta 216 del polipéptido de FGF-19 mostrado en la Figura 2 (SEC ID NO:2), (b) una secuencia de ácido nucleico la cual codifica los aminoácidos X hasta 216 del polipéptido de FGF-19 mostrado en la Figura 2 (SEC ID NO: 2), en donde X es cualquier residuo de aminoácidos desde 17 hasta 27 de la Figura 2 (SEC ID NO:2), o (c) una secuencia de ácido nucleico la cual codifica otro fragmento derivado específicamente de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (SEC ID NO: 2). Las variantes de los polinucleótidos no abarcan la secuencia de nucleótidos de FGF-19 natural. Ordinariamente, los polinucleótidos variantes de FGF-19 son de al menos aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 60 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 90 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 120 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 150 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 180 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 210 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 240 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 270 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 300 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 450 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 600 nucleótidos de longitud, alternativamente al menos aproximadamente 900 nucleótidos de longitud, o más . "El porcentaje (%) de la identidad de la secuencia de ácido nucleico" con respecto a las secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido de FGF-19 identificadas aquí, está definido como el porcentaje de los nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos con los nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de FGF-19, después de la alineación de las secuencias y la introducción de los huecos, si es necesario, para lograr la identidad de la secuencia porcentual máxima. La alineación para los propósitos de la determinación del porcentaje de identidad de la secuencia de ácido nucleico puede ser lograda de varias maneras que están dentro de la experiencia en el arte, por ejemplo, utilizando el programa de computadora disponible públicamente, tales como los programas BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR) . Aquellos expertos en el arte pueden determinar los parámetros apropiados por la medición de la alineación, incluyendo cualesquiera algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima sobre la longitud total de las secuencias que son comparadas. Para los propósitos de aquí, sin embargo, los valores del % de la identidad de la secuencia de ácido nucleico son obtenidos como se describe posteriormente utilizando el programa de computadora para la comparación de las secuencias ALIGN-2, en donde el código fuente completo para el programa ALIGN-2 es provisto en la Tabla 1 posterior. El programa de computadora para la comparación de las secuencias ALIGN-2 fue autorizado por Genentech, Inc., y el código fuente mostrado en la Tabla 1 ha sido presentado con la documentación del usuario en la Oficina de Derechos Reservados de los Estados Unidos de América, Washington D.C., 20559, en donde el mismo está registrado bajo el Registro de Derechos Reservados No. TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible públicamente de Genentech, Inc., South San Francisco, California o puede ser compilado del código fuente provisto en la Tabla 1. El programa ALIGN-2 debe ser compilado para su uso sobre un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4. OD digital. Todos los parámetros de comparación de las secuencias son descritos por el programa ALIGN-2 y no varían. Para los propósitos de aquí, el % de la identidad de la secuencia de ácido nucleico de una secuencia de aminoácidos dada C para, con, o contra una secuencia de ácido nucleico dada D (la cual puede ser expresada alternativamente como una secuencia de ácido nucleico dada C que tiene o comprende un cierto % de identidad de la secuencia de ácido nucleico para, con, o contra una secuencia de ácido nucleico dada D) es calculado como sigue: 100 veces la fracción W/Z en donde W es el número de nucleótidos registrado como las correspondencias idénticas por el programa de alineación de las secuencias ALIGN-2 en esta alineación del programa de C y D, y en donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de ácido nucleico C no es igual a la longitud de la secuencia de ácido nucleico D, el % de la identidad de la secuencia de ácido nucleico de C con respecto a D no será igual al % de identidad de la secuencia de ácido nucleico de D con respecto a C. Como los ejemplos de los cálculos del % de identidad del ácido nucleico, las Tablas 4 y 5 demuestran como calcular el % de identidad de la secuencia de ácido nucleico de la secuencia de ácido nucleico designada "ADN de Comparación" con respecto a la secuencia de ácido nucleico designado "PRO-DNA" . A menos que se establezca específicamente de otra manera, todos los % de los valores de la identidad de la secuencia de ácido nucleico utilizados aquí son obtenidos como se describió anteriormente utilizando el programa de computadora para la comparación de las secuencias ALIGN-2. Sin embargo, el % de la identidad de las secuencias de ácido nucleico también puede ser determinado utilizando el programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res . 25:3389-3402 (1997)). El programa de comparación de las secuencias NCBI-BLAST2 puede ser descargado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov u obtenido de otra manera del National Institute of Health, Bethesda, MD. El NCBI-BLAST2 utiliza varios parámetros de búsqueda, en donde la totalidad de estos parámetros de búsqueda son fijados para valores de falla que incluyen, por ejemplo, sin máscara = si, hebra = todas, eventos esperados = 10, longitud de complejidad baja mínima = 15/5, valor e de pasos múltiples = 0.01, constante para pasos múltiples = 25, reudcción para la alineación final con huecos = 25 y matriz de evaluación = BLOSUM62. En situaciones en donde NCBI-BLAST2 es empleado para las comparaciones de las secuencias, el % de identidad de la secuencia de ácido nucleico de una secuencia de ácido nucleico dada C para, con, o contra una secuencia de ácido nucleico dada D (la cual alternativamente puede ser expresada como una secuencia de ácido nucleico dada C que tiene o comprende un cierto % de identidad de la secuencia de ácido nucleico para, con, o contra una secuencia de ácido nucleico dada D) es calculada como sigue 100 veces la fracción W/Z en donde W es el número de nucleótidos registrado como las correspondencias idénticas por el programa de alineación de las secuencias NCBI-BLAST2 en esta alineación del programa de C y D, y en donde Z es el número total de nucleótidos en D. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de ácido nucleico C no es igual a la longitud de la secuencia de ácido nucleico D, el % de la identidad de la secuencia de ácido nucleico de C con respecto a D no será igual al % de identidad de la secuencia de ácido nucleico de D con respecto a C. En otras modalidades, los polinucleótidos de la variante de FGF-19 son las moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de FGF-19 activos y las cuales son capaces de hibridación, preferentemente bajo condiciones de lavado e hibridación severas, a las secuencias de nucleótidos que codifican el polipéptido de FGF-19 de longitud completa mostrado en la Figura 2 (SEC ID NO: 2) . Los polipéptidos variantes de FGF-19 pueden ser aquellos que son codificados por un polinucleótido de la variante FGF-19. El término "positivos", en el contexto de las comparaciones de la identidad de la secuencia de aminoácidos efectuadas como se describió anteriormente, incluye los residuos de aminoácidos en las secuencias comparadas que no son solo idénticos, sino también que tienen propiedades similares. Los residuos de aminoácidos que registran un valor positivo para un residuo de aminoácidos de interés son aquellos que son ya sea idénticos con respecto al residuo de aminoácidos de interés o son una substitución preferida (como se define en la Tabla 6 posterior) del residuo de aminoácidos de interés. Para los propósitos de aquí, el % del valor de los positivos de una secuencia de aminoácidos dada A para, con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B (la cual alternativamente puede ser expresada como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende un cierto % de positivos para, con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B) es calculada como sigue 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de los residuos de aminoácidos que registran un valor positivo como se definió anteriormente por el programa de alineación de las secuencias NCBI-BLAST2 en esta alineación del programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de positivos de A con respecto a B no será igual al % de positivos de B con respecto a A. "Aislado", cuando se utilice para describir los diversos polipéptidos descritos aquí, significa los polipéptidos que han sido identificados y separados y/o recuperados de un componente de su medio ambiente natural . Preferentemente, el polipéptido aislado está libre de asociación con todos los componente con los cuales el mismo está asociado naturalmente. Los componentes contaminantes de su medio ambiente natural son los materiales que típicamente podrían interferir con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos y no proteináceos. En las modalidades preferidas, el polipéptido será purificado (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos interna o N-terminal por el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (2) hasta la homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferentemente un tinte de plata. Los polipéptidos aislados incluyen los polipéptidos in situ dentro de las células recombinantes, puesto que al menos un componente del medio ambiente natural de FGF-19 no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el polipéptido aislado será preparado por al menos un paso de purificación. Una molécula de ácido nucleico "aislado" que codifica un polipéptido de FGF-19 es una molécula de ácido nucleico que es identificada y separada de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual la misma está asociada ordinariamente en la fuente natural del ácido nucleico que codifica el FGF-19. Preferentemente, el ácido nucleico aislado está libre de asociación con todos los componentes con los cuales el mismo está asociado de manera natural. Una molécula de ácido nucleico que codifica el FGF-19 aislado es diferente de la forma o medio ambiente en el cual el mismo es encontrado en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aisladas por lo tanto son distinguidas de la molécula de ácido nucleico que codifica el FGF-19 como existe la misma en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de FGF-19 incluye las moléculas de ácido nucleico que codifican el FGF-19 contenidas en las células que expresan ordinariamente el FGF-19 en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una localización cromosómica diferente de aquella de las células naturales. El término "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación enlazada operativamente en un organismo hospedero particular. Las secuencias de control que son adecuadas para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sitio de unión o aglutinación del ribosoma. Las células eucarióticas se sabe que utilizan los promotores, las señales de poliadenilación, y los mejoradores. El ácido nucleico es "enlazado operativamente" cuando el mismo es colocado en una relación funcional con otra secuencias de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o elemento delantero secretorio está enlazado operativamente al ADN para un polipéptido si el mismo es expresado como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o mejorador está enlazado operativamente a una secuencia de codificación si la misma afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de aglutinación del ribosoma está enlazado operativamente a una secuencia de codificación si la misma está colocada para facilitar la traducción. En general, "enlazado operativamente" significa que las secuencias de ADN que están enlazadas son contiguas, y, en el caso de un elemento delantero secretorio, son contiguas y están en una fase de lectura. Sin embargo, los mejoradores no tienen que estar contiguos. El enlace es efectuado por ligamiento o unión en los sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores o enlazadores de oligonucleótidos sintéticos son utilizados de acuerdo con la práctica convencional .

El término "anticuerpo" es utilizado en el sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-FGF-19 únicos (incluyendo los anticuerpos agonistas, antagonistas, y neutralizantes) , las composiciones de anticuerpos anti-FGF-19 con especificidad de poliepítopes, anticuerpos anti-FGF-19 de una sola cadena, y fragmentos de anticuerpos de anti-FGF-19 (véase posteriormente) . El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza aquí se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones que están presentes de manera natural, que pueden estar presentes en cantidades menores. La "severidad" de las reacciones de hibridación se pueden determinar fácilmente por una persona con experiencia ordinaria en el arte, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado, y la concentración de la sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más elevadas para el recocido apropiado, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas inferiores. La hibridación depende generalmente de la capacidad del ADN desnaturalizado para el recocido cuando las hebras complementarias están presentes en un medio ambiente abajo de su temperatura de fusión. Mientras más elevado sea el grado de homología deseado entre la sonda y la secuencia hibridizable, más elevada es la temperatura relativa la cual puede ser utilizada. Como resultado, se deduce que las temperaturas relativas más elevadas podrían tender a hacer a las condiciones de la reacción más severas, mientras que las temperaturas más bajas llevan a condiciones menos severas. Para los detalles adicionales y la explicación de la severidad de las reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995) . "Condiciones severas" o "condiciones de severidad elevadas", como se define aquí, pueden ser identificadas por aquellas que: (1) emplean una intensidad iónica inferior y una temperatura elevada para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0.015M/citrato de sodio 0.0015 M/dodecil sulfato de sodio al 0.1% a 50 °C; (2) emplean durante la hibridación un agente de desnaturalización, tal como la formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero de bovino al 0.1%/Ficoll al 0.1%/polivinilpirrolidona al 1%/amortiguador de fosfato de sodio 50mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C; o (3) emplean 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1%, 5 x de la solución de Denhardt, ADN del esperma de salmón sometido a la acción del sonido (50 µg/ml) , SDS al 0.1%, y sulfato de dextrano al 10% a 42 °C, con lavados a 42 °C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55 °C, seguido por un lavado de severidad elevada que consiste de 0.1 x SSC que contiene EDTA a 55 °C. Las "condiciones moderadamente severas" pueden ser identificadas como se describió por Sambrook et al., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de la solución de lavado y las condiciones de hibridación (por ejemplo, la temperatura, la intensidad y concentración iónica y el % de SDS) menos severas que aquellas descritas anteriormente. Un ejemplo de las condiciones moderadamente severas es la incubación toda la noche a 37 °C en una solución que comprende: 20% de formamida, 5 x SSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), 5 x de la solución de Denhardt, sulfato de dextrano al 10%, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón sometido a cizallamiento, desnaturado, seguido por el lavado de los filtros en 1 x SSC a aproximadamente 37-50 °C. El artesano experto reconocerá como ajustar la temperatura, la intensidad iónica, etc., cuando sea necesario para adaptar factores tales como la longitud de la sonda y semejantes. El término "etiquetado con el epítope" cuando se utilice aquí, se refiere a un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido de FGF-19 fusionado a un "polipéptido de la etiqueta". El polipéptido de la etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar un epítope contra el cual se puede hacer un anticuerpo, que es todavía lo suficientemente corto de tal modo que el mismo no interfiera con la actividad del polipéptido al cual el mismo está fusionado. El polipéptido de la etiqueta preferentemente también es bastante original de modo que el anticuerpo no reaccione substancial ente de manera cruzada con otros epítopes. Los polipéptidos de etiqueta adecuados generalmente tienen al menos seis residuos de aminoácidos y usualmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoácidos (preferentemente, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de aminoácidos) . Cuando se utilice aquí, el término "inmunoadhesina" designa moléculas semejantes a anticuerpos las cuales combinan la especificidad de unión o aglutinación de una proteína heteróloga (una "adhesina") con las funciones efectoras de los dominios constantes de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la especificidad de la aglutinación deseada la cual es diferente del sitio de reconocimiento y aglutinación del antígeno de un anticuerpo (es decir, es "heterólogo"), y una secuencia de dominio constante de la inmunoglobulina. La parte de adhesina de una molécula de inmunoadhesina típicamente es una secuencia de aminoácidos contigua que comprende al menos un sitio de aglutinación de un receptor o de un ligando. La secuencia de dominio constante de la inmunoglobulina en la inmunoadhesina puede ser obtenida de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos IgG-1, IgG-2, IgG-3, o IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e IgA-2), IgE, IgD o IgM. "Activo" o "actividad" para los propósitos de aquí se refiere a la(s) forma (s) del FGF-19 las cuales retienen una actividad biológica y/o inmunológica del FGF-19 nativo o que está presente de manera natural, en donde la actividad "biológica" se refiere a una función biológica (ya sea inhibidora o estimuladora) provocada por un FGF-19 nativo o que está presente de manera natural, diferente de la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico poseído por un FGF-19 nativo o que está presente de manera natural y una actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad para inducir la producción de un anticuerpo contra un epítope antigénico poseído por un FGF-19 nativo o que está presente de manera natural. Una actividad biológica preferida incluye cualquiera de una o más de las siguientes actividades: incrementar el metabolismo (o la velocidad metabólica) en un individuo, reducir el peso corporal de un individuo, reducir la adiposidad en un individuo, reducir la absorción de glucosa en los adipocitos, incrementar la liberación de la leptina desde los adipocitos, reducir los triglicéridos en un individuo, y reducir los ácidos grasos libres en un individuo. Se entiende que algunas de las actividades del FGF-19 son inducidas directamente por el FGF-19 y algunas son inducidas indirectamente, sin embargo, cada una son el resultado de la presencia de FGF-19 y de otra manera no podrían tener el mismo resultado en ausencia de FGF-19. El término "antagonista" es utilizado en el sentido más amplio, e incluye cualquier molécula que bloquee, inhiba, o neutralice parcial o totalmente una actividad biológica de un polipéptido de FGF-19 natural descrito aquí. De una manera semejante, el término "agonista" es utilizado en el sentido más amplio e incluye cualquier molécula que minimiza una actividad biológica de un polipéptido de FGF-19 natural descrito aquí. Las moléculas agonistas o antagonistas adecuadas incluyen específicamente los anticuerpos agonistas o antagonistas o los fragmentos de anticuerpos, los fragmentos o las variantes de secuencias de aminoácidos de los polipéptidos del FGF-19 natural, los péptidos, moléculas orgánicas pequeñas, etc. Los métodos para identificar los agonistas o antagonistas de un polipéptido de FGF-19 pueden comprender poner en contacto un polipéptido de FGF-19 con una molécula agonista o antagonista candidata y medir el cambio detectable en una o más actividades biológicas asociadas con el polipéptido de FGF-19. "Tratamiento" se refiere al tratamiento tanto terapéutico como profiláctico o a las medidas preventivas, en donde el objeto es prevenir o retrasar (disminuir) la condición o desorden patológico ubicado como blanco. Aquellos que tengan la necesidad del tratamiento incluyen tanto aquellos que ya tengan el desorden como aquellos propensos a tener el desorden o aquellos en quienes el desorden va a ser prevenido . La administración "crónica" se refiere a la administración del (de los) agente (s) en un modo continuo como lo opuesto a un modo agudo, para mantener el efecto terapéutico (actividad) durante un período de tiempo prolongado. La administración "intermitente" es el tratamiento que no se hace consecutivamente sin interrupción, sino que más bien es de naturaleza cíclica.

Un "mamífero", para propósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo los seres humanos, los animales domésticos y de la granja, y los animales del zoológico, los animales para actividades deportivas, o las mascotas, tales como los perros, gatos, el ganado, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferentemente, el mamífero es un ser humano. Un "individuo" es cualquier sujeto, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano. "Obesidad" se refiere a una condición por la cual un mamífero tiene un índice de Masa Corporal (BMI), el cual es calculado como el peso (kg) por altura2 (metros) , de al menos 25.9. Convencionalmente, aquellas personas con un peso normal tienen un BMI de 19.9 hasta menos de 25.9. La obesidad aquí se puede deber a cualquier causa, ya sea genética o del medio ambiente. Los ejemplos de los desordenes que pueden conducir a la obesidad o ser la causa de la obesidad incluyen la sobrealimentación y la bulimia, la enfermedad de los ovarios policísticos, el craneofaringioma, el Síndrome de Prader-Willi, el síndrome de Frohlich, la diabetes del Tipo II, los sujetos deficientes en GH, la estatura corta variable normal, el síndrome de Turner, y otras condiciones patológicas que muestran la actividad metabólica reducida o una reducción en el gasto de la energía en reposo como un porcentaje de la masa libre de grasa total, por ejemplo, los niños con leucemia linfoblástica aguda. "Condiciones relacionadas con la obesidad" se refieren a las condiciones las cuales son el resultado de, o las cuales son agravadas por la obesidad, tales como, pero sin estar limitado a los desórdenes dermatológicos tales como las infecciones, las venas varicosas, la Acanthosis nigricans, y el eccema, la intolerancia al ejercicio, la diabetes mellitus, la resistencia a la insulina, la hipertensión, la hipercolesterolemia, la colelitiasis, la osteoartritis, las lesiones ortopédicas, la enfermedad tromboembólica, cáncer, y enfermedad de las coronarias del corazón (o enfermedad cardiovascular) , particularmente aquellas condiciones cardiovasculares asociadas con niveles elevados de triglicéridos y ácidos grasos libres en un individuo . La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden. "Portadores" como se utiliza aquí, incluyen los portadores, excipientes, o estabilizadores farmacéuticamente aceptables, los cuales no son tóxicos para la célula o el mamífero que está expuesto a los mismos, a las dosificaciones y concentraciones empleadas . Frecuentemente el portador aceptable fisiológicamente es una solución amortiguada de pH acuoso. Los ejemplos de los portadores aceptables fisiológicamente incluyen los amortiguadores tales como el fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; los antioxidantes incluyendo el ácido ascórbico; los polipéptidos de peso molecular bajo (de menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como la albúmina del suero, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como la polivinilpirrolidona; los aminoácidos tales como la glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo la glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes queladores tales como EDTA; alcoholes de azúcar o de sacáridos tales como el manitol o sorbitol; los contraiones formadores de sales tales como el sodio; y/o los agentes tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, polietilenglicol (PEG) , y PLURONICS™. "Los fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente la región variable o de aglutinación del antígeno del anticuerpo intacto. Los ejemplos de los fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; "diabodies" (fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión del antígeno); anticuerpos lineales (Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995] ) ; moléculas de anticuerpos de una sola cadena; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de los fragmentos de anticuerpos . La digestión de la papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de aglutinación del antígeno idénticos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un sitio de unión del antígeno único, y un fragmento "Fc" residual, una designación que refleja la capacidad de cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación del antígeno y todavía es capaz de la reticulación del antígeno. "Fv" es el fragmento de anticuerpos mínimo el cual contiene un sitio de unión y de reconocimiento del antígeno completo. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de una cadena ligera y una cadena pesada, en asociación no covalente, estrecha. Es en esta configuración que los tres CDRs de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión del antígeno sobre la superficie del dímero de VH-VL. Colectivamente, los seis CDRs confieren una especificidad de unión del antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un dominio de una sola variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDRs específicos para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y unirse al antígeno, aunque a una afinidad inferior que el sitio de unión completo.

El fragmento de Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos de Fab' por la adición de una cantidad pequeña de residuos en la terminación de carboxi del dominio CH1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región de articulación del anticuerpo. Fab'-SH es la designación aquí para Fab' en la cual el (los) residuo (s) de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo de tiol libre. Los fragmentos de anticuerpos de F(ab')2 originalmente fueron producidos como pares de fragmentos Fab' los cuales tienen cisteínas de articulación entre ellos. Otra uniones o acoplamientos químicos de los fragmentos de anticuerpos también son conocidos. Las "cadenas ligeras" de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualesquiera especies de vertebrados pueden ser asignadas a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa y lambda, con base en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes . Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden ser asignadas a diferentes clases. Existen cinco clases mayores de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de estas pueden ser divididas adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Los fragmentos de anticuerpos de "sFv" o de "Fv de una sola cadena" comprenden los dominio VH y VL de los anticuerpos, en donde estos dominios están presentes en una cadena de polipéptidos única. Preferentemente, el polipéptido de Fv comprende adicionalmente un enlazador del polipéptido entre los dominios de VH y VL lo cual hace posible que el sFv forme la estructura deseada para la unión del antígeno. Para una revisión de sFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) . El término "diabodies" se refiere a fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión del antígeno, tales fragmentos comprenden el dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptidos (VH - VL) . Utilizando un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento o agrupación por parejas entre los dos dominios sobre la misma cadena, los dominios son forzados a formar parejas con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de unión del antígeno. Los "diabodies" o fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión del antígeno se describen de manera más completa, por ejemplo, en EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 90:6444-6448 (1993). Un anticuerpo "aislado" es uno el cual ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio ambiente natural. Los componentes contaminantes de su medio ambiente natural son los materiales los cuales podrían interferir con los usos terapéuticos o de diagnóstico para el anticuerpo, y pueden incluir las enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En las modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado (1) a un grado mayor que el 95 % en peso del anticuerpo como se determinó por el método de Lowry, y más preferentemente mayor que 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna por el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta la homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando el azul de Coomassie o, preferentemente, el tinte de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes puesto que al menos un componente del medio ambiente natural del anticuerpo no estará presente . Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado será preparado por al menos un paso de purificación.

La palabra "etiqueta" cuando se utilice aquí, se refiere a una composición o compuesto detectable el cual está conjugado directa o indirectamente al anticuerpo para generar un anticuerpo "etiquetado". La etiqueta puede ser detectable por sí misma (por ejemplo etiquetas de radioisótopos o etiquetas fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición del substrato la cual es detectable. Por "fase sólida" se entiende una matriz no acuosa a la cual se puede adherir el anticuerpo de la presente invención. Los ejemplos de las fases sólidas abarcadas aquí incluyen aquellas formadas parcial o totalmente de vidrio (por ejemplo, el vidrio de tamaño de poro controlado) , polisacáridos (por ejemplo, la agarosa) , poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En ciertas modalidades, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender la cavidad de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía por afinidad) . Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como aquellas descritas en la Patente U.S. No. 4,275,149. Un "liposoma" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o el agente tensioactivo el cual es útil para el suministro de un fármaco (tal como un polipéptido de FGF-19 o el anticuerpo para el mismo) . Los componentes del liposoma están distribuidos comúnmente en una formación de bicapa, de manera semejante al arreglo de lípidos de las membranas biológicas. Una "molécula pequeña" está definida aquí para tener un peso molecular abajo de aproximadamente 500 Daltons.

Tabla 1 /* * *C-C incrementado desde 12 hasta 15 *Z es el promedio de EQ *B es el promedio de ND * correspondencia con elemento de parada es _M; parada-parada = 0; correspondencia J (asociada) = 0 */ #define -M -8 /* valor de una correspondencia con un elemento de parada */ ?nt. d-ar261[26] = { /* A B CD E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z */ /*A*/ { 2, 0, -2, 0, 0, -4, 1, -1, -1, 0, -1, -2, -1, 0, Ü, 1, 0, -2, 1, 1, 0, 0, -6, 0, -3, 0}, /*B*/ { 0, 3, -4, 3, 2, -5, 0, 1, -2, 0, 0, -3, -2, 2, M, -1, 1, 0, 0, 0, 0, -2, -5, 0, -3, 1}, /* C */ í -2, -4, 15, -5, -5, -4, -3, -3, -2, 0, -5, -6, -5, -4, M, -3, -5, -4, 0, -2, 0, -2, -8, 0, 0, -5}, /*D*/ { 0, 3, -5, 4, 3, -6, 1, 1, -2, 0, 0, -4, -3, 2, -M, -1,T>, -1, 0, 0, 0, -2, -7, 0, -4, 2}, /*E*/ {0, 2, -5, 3, 4, -5, 0, 1, -2, 0, 0, -3, -2, 1, M, -1, 2, -1, 0, 0, 0, -2, -7, 0, -4, 3}, /*p * {-*, -5, -4, -6, -5, 9, -5, -2, 1, 0, -5, 2, 0, , M, -5, -5, -4, -3, -3, 0, -1, 0, 0, 7, -5}, l*G*l {1, 0, -3, 1, 0, -5, 5, -2, -3, 0, -2, -4, -3, 0, JvL -1, -1, -3, 1, 0, 0, -1, -7, 0, -5, 0}5 l*H*l {-1, 1, -3, 1, 1, -2, -2, 6, -2, 0, 0, -2, -2, 2, _M, 0, 3, 2, -1, -1, 0, -2, -3, 0, 0, 2}, 1*1*1 í-1, -2, -2, -2, -2, 1, -3, -2, 5, 0, -2, 2, 2, -2, M, -2, -2, -2, -1, 0, 0, 4, -5, 0, -1, -2}, l*J*l {o. o, o, o, o, o, o, o, o, o, o, o, o, o, H o, s, o, o, o, o, o, o, o, o, o>, l*K*/ {-1, 0, -5, 0, 0, -5, -2, 0, -2, 0, 5, -3, ü, 1, _M, -1, 1, 3, 0, 0, 0, -2, -3, 0, -4, 0}, 1*1.* I {-2, -3, -6, -4,-3, 2, -4, -2, 2, 0, -3, 6, 4, -3, M, -3, -2, -3, -3, -1, 0, 2, -2, 0, -1, -2}, l*M*l {-1, -2, -5, -3, -2, 0, -3, -2, 2, 0, 0, 4, 6, -2, M, -2, -1, 0, -2, -1, O, 2, -4, 0,-2, -1}, l*N*l {0, 2, -4, 2, 1, -4, 0, 2, -2, 0, 1, -3, -2, 2, _ív -1, 1, 0, 1, 0, 0, -2, -4, 0, -2, 1}, ? /** po **? {_H M,_H_M._ ._M,_M,_H M,_H--H_H_H M,o, H M, H M M, M, M, H H M. M}, {1, -r, -3, -1, -1, -5, -1, 0, -2, 0, -1, -3, -2, -1, _ T6, 0, 0, 1, 0, 0, -1, -6, 0, -3, 0}, ~ ~ /*Q*/ {0, 1, -5, 2, 2, -5, -l, 3, -2, 0, 1, -2, -1, 1, _M, 0, 4, 1, -1, -1, 0, -2, -5, 0, -4, 3), /*R*/ {-2, 0, -4, -1, -1, -4, -3, 2, -2, 0, 3, -3, 0, 0, M, 0, 1, 6, 0, -1, 0, -2, 2, 0, -4, 0}, /*S*/ {1, 0, 0, 0, 0, -3, 1, -1, -1, 0, 0, -3, -2, 1, _M¡ 1, -1, 0, 2, 1, 0, -1, -2, 0, -3, 0}, ?*t*? \l, O, -2, 0.0, -3, 0, -1, 0, 0, 0, -1, -1, 0, M, O, -1, -1, 1, 3, 0, 0, -5, 0, -3, 0}, ?*?*? ÍO, 0, 0, 0, 0, 0. O, O, O, O, O, O, O, O, _M,D, O, O, O, O, O, O, O, O, O, 01, ? /**wv*? {O, -2, -2, -2, -?, -1, -1, -2, 4, O, -2, 2, 2, -2, M, -1, -2, -2, -1, O, O, 4, -6, O, -2, -2}, {-6, -5, -8, -7, -7, O, -7 -3, -5, O, -3, -2, -4, -4, M, O, O, O, O, O, O, O, O, O, O, O}, /* */ /*?* *// ÍO, O, O, O, O, O, O, O, O, O, O, O, O, O, M, O, O, ü, O, O, O, O, O, O, O, O}, Y {-3, -3, O, -4, -4, 7, -5, O, -1, O, -4, -1, -2, -2, M, -5, -4, -4, -3, -3, O, -2, O, O, 10, -4}, ?*z*? {O, 1, -5, 2, 3, -5, 0, 2, -2, O, O, -2, -1, 1, _M,T>, 3, 0, 0, O, O, -2, -6, 0, -4, 4} }; Página 1 de day.h Tabla 1 (cont.) /* */ iinclude <stdio.h> #include <cty?e.h> #define MAXJMP 16 /* saltos máximos en un diag */ #defitte MAXGAP 24 /* no continúe penalizando huecos más grandes que esto */ #def?ne JMPS 1024 /* saltos máximos en una vía */ #def?ne MX 4 /* guarde si existen al menos MX-1 bases desde el último salto */ #define DMAT 3 /* valor de bases igualadas */ #define DMIS 0 /* penalidad para bases no igualadas */ #define DINSO 8 /* penalidad por un hueco */ #define DINS1 1 /* penalidad por base */ #define PINSO 8 /* penalidad por un hueco */ #defme P1NS1 4 /* penalidad por residuo */ struct jmp { short níMAXJMPl; /* tamaño del salto (neg. para retardo) */ unsigned short xpvIAXJ P}; /* No. de Base del salto en la sec. x */ /* límites de la sec. a 2* 16 -1 */ struct diag { int valor /* valor en el último salto */ long desvío; /* desvío del bloque previo */ short Índice de salto /* índice del salto actual */ struct jmp jp; /* lista de saltos */ }: struct path { int /* número de espacios delanteros */ short nTJMPS]; /* tamaño del salto (hueco) */ int xfJMPSJ; /* loe. del salto (último elem. antes del hueco) */ }; char *ofile; /* nombre de registro de salida */ char *namex[2]: /* nombres de sec: getseqs() */ char *prog. /* nom ibbrree < d"e prog- para mensajes error */ char *secx[2]; /* secs: : getseqsQ */ int dniax; /* mejor diag: nw() */ ipt dmaxO; /* diag. final */ int dna; /* fije si dna: principal() */ int endgaps; /* fije si se penalizan huecos en los extremos */ int gapx, gapy; /* huecos totales en las secuencias */ int IenO, lenl; /* reducción de sec. */ int ngapx, ngap ; /* tamaño total de los huecos */ int smax; /* valor máx.: nw() */ int *xbm; /* mapa de bitios para la correspondencia */ long desvío; /* desvío común en registro de salto */ struct diag *d?; /* diagonales retenidas */ struct patn /* vía detenida para las secuencias */ char * ccáallfkocO, *malloc(), *strcpy(=; char *getseqO, *g_calloc0; Página 1 de nw . h Tabla 1 (Cont) /* Programa de Alineación de Needleman-Wunsch * * uso: archivo 1 archivo 2 de los programas * en donde el archivo 1 y el archivo 2 son dos secuencias de proteínas o dos adn * Las secuencias pueden estar en mayúsculas o minúsculas y pueden contener ambigüedades * Cualesquiera líneas que empiecen con ';', *>' o '<' son ignoradas * La longitud máxima de un archivo es 65535 (limitado por una x corta sin señal en la estructura del salto) * Una secuencia con 1/3 o más de sus elementos ACGTÚ se supone que va a ser ADN * La salida está en el archivo "align.out" * Página 2 de nw.c para /* actualice la penalidad para del in x seq;; I* actualice la penalidad para del in y seq;; * favorecer new del sobre ongong del */ si (huecos finales 1 1 ndelx < MAXGAP) { si (coll[yy-l] - insO > = delx) { delx = coll[yy-l] - (insO + insl); ndelx = 1; } también { delx - = ins 1; ndelx + +; } también { si (colllyy-1] - (insO + insl) > = delx) { delx = coll[yy-l] - (insO + insl); ndelx = 1; } también ndelx + +; /* tome el valor máximo, se hace favoreciendo * mis sobre cualquier deí y delx sobre dely */ Página 3 de nw.c 65 Página 4 de nw.c Tabla 1 (cont) I* * * print(0) - solo rutina visible fuera de este módulo * * static: *getmatO — trace nuevamente la mejor ruta, cuenta las igualdades: print() * pr alignO - imprima alineación de lo descrito en el arreglo pfj: printO * dumpbiockO — vacíe la memoria de un bloque de líneas con números: stars: pr_align() * numsO — elimine un número de línea: dumpblock () *putline0 - elimine una línea (nombre, [num], seq, [num]): dumpblock() * starsO - - coloque una línea de estrellas: dumpblock() * stripnameO — retire cualquier vía y prefijo de un nombre de secuencia #include "nw.h" #def?ne SPC 3 #defu?e P LINE 256 /* línea de salida máxima */ #defineP_SPC 3 /* espacio entre nombre o num. y sec. */ extern day[26][26]; int olen; /* fije la longitud de la línea de salida */ FILE /* archivo de salida */ printO print { int lx, ly, primer hueco, último hueco; /* superposición */ lenO); lenl); pr_align0; } Tabla 1 (Cont) I* * trace de nuevo la mejor ruta, cuente las igualdades */ _ static get at getmat(lx, ly, primer hueco, último hueco) int lx, ly; /* "core" (menos los huecos finales) */ int primer hueco, último hueco /* superposición delantera trasera */ int pm, jO, il, sizO, sizl; char outx[32]; double pct; register nO, ni; register char *p0, *pl; /* proporcione las igualdades totales, registre */ iO = il = sizO = sizl = 0; pO = seqx 0] + pp[l]. ssppcc;; pl = seqx "1J + p] pj j. spc; nO = ppf 1 .spc : +- f; ni = pp[0 .spc + 1; Página 2 de n print . c Tabla 1.Cont) .getmat fprint(fx, " < huecos en la primera secuencia: %d", gapx); si (gapx) { (void) frintf(outx, " (%d%s%s)", ngapx. (dna)? "baseM:"residuoH, (ngapx = = 1)? "H:"s"); rmtfíf ^s3, outx); static nm; /* igualdades en el núcleo — para verificar */ static lmax; /* longitudes de los nombres de archivos retirados */ static /* índice de saltos para una vía */ static /* número en el inicio de la línea actual */ static /* número de elementos actuales — para formación de huecos */ static s ?izzfr ; static char /* ptr para el elemento actual */ static char /* ptr para la siguiente ranura de caracteres de salida */ static char LINE]; /* ínea de salida */ static char starp INE]; /* fije por estrellasO */ /* * imprima la alineación de lo descrito en la vía de la estructura ppfj */ static pr_align pr_align0 int nn; /* conteo de caracteres */ int mas; register i; para (i = 0, lmax = 0; i < 2; i + + ) { nn = stripname(namex[i]); si (nn > Imax) lmax = nn; Página 3 de nwprint.c Tabla 1 (cont) para (nn = nm = 0, more = 1; more;) { .pr_align para (i = more = 0; i < 2; i++) { /* * ¿se tiene más de esta secuencia? */ si (!*ps[i]) continué; more++; encia /* * vacíe la memoria de un bloque de líneas, incluyendo los números, stars: pr_align() estatic dumpblock dumpblockO register i; para (i = 0; i < 2; i++) *po[i]- = '\0,; Página 4 de n print.c Tabla 1 (cont) .dumpblock /* * elimine una línea numérica: dumpblock() */ static nums(ix) nu s int rx; /* índice en la línea de la secuencia de retención out[] */ { char ??linerP_LINE]; register Us; register char *pn, *px, *py; /* * elimine una línea (nombre, [num], sec, [num]): dumpblock() */ static putline(ix) putline int ix: { Página 5 de nwprint.c Tabla 1 (Cont) .putline hit register char *px; para (px = namexfix], i = 0; *px && *px != ':'; px++, i++) (void) putc(*px, fe); para (; i < lmax+P SPC; i++) (void) putc(' ', fe); /* estos se cuentan desde 1 : * nip es el elemento actual (desde 1) *ncf| es el número al inicio de la línea actual */ para (px = out[ix]; *px; px++) (void) putc(*px&0x7F, fe); (void) putc('\n', fe); /* * coloque una línea de estrellas (las secuencias siempre en out[0], out[l]): dumpblock() */ static starsO stars bit i; regíster char *pO, *pl, ex, *px; si (!*out[0J 1 1 (*out[0] = ' '&& *(pq[0]) = ") 1 1 outrill | (*outrjl] === • '&& *(po[?]) == ") 1 1 returp; px = star; para (i = lmax+P SPC; 1; i-) *px+-f = p; para (pO = = ouuttJrOOJ],, ppll = : oouutt[rli]];; **pp00 &&&& **ppll;; p i O-H-, pl++) { i (isalpha(*p0) && ?sa-pha(*pl)) { si (xbm pO-'A'J&xbmPpl-'A']) { ex nm también si (!dna && _day[*p0-?'][*pl- 'A'] > 0) cx = ' también cx = también cx = ' *px++ = ex; *px++ = V; +px = *\0'; Página 6 de nwprint.c Tabla 1 (cont) /* * prefijo o vía retirada de pn, returns len: pr alignO static stripname(?n) strpname char *pn; /* nombre del archivo (puede ser una vía) */ { register char *px, *py; py); return str en(pn ); Tabla 1 (cont) * cleanupO - elimine cualquier archivo de tmp * getsegO — lee en la secuencia, ajusta dna, len, max lleen * g_cal?ocO — callocO con verificación de errores * readjmpsO — da los saltos buenos, desde el archivo de tmp si es necesario * writejmpsO — escribe un arreglo lleno de saltos para un archivo de tmp: nw() */ #include "nw.h" #include <sys/ftle.h> char *i "/tmp?lomgXXXXXX,'; /* archivo tmp para jmps */ FILE *tj. int cleanupO; /* elimine archivo tmp */ long lseekO; /* * remueva cualquier archivo de tmp si está perdido */ cleanurXi) cleanup int i; { si (fj) (void) unlink(jname); exit(i); } I* * lea, regrese ptr a la secuencia, ajuste dna, len, maxlen * salte las lineas empezando con , , '<', o '>' * secuencia en letras mayúsculas o minúsculas */ char * getseqO-Ue, len) get seq char *file; /* nombre de archivo */ int *len; /* seq len */ char line[1024], *pseq; register char *px, *py; int natgc, tlen; FILE *fp; si ((íp = fopen(file, "r")) === 0) { fpnntf(stderr, "%s: no se puede leer %s\n", prog, archivo); sali(l); prog. tlen+6, archivo); Página 1 de nwsubr.c Tabla 1 (Cont) .getseq py = pseq + 4; *len = tlen; rewind(fp); aunque (fgetsflínea, 1024, fp)) { si (*línea = ';' | f ¿line == '<' 1 1 *line = '>') continué; para (px = línea; *px != '\n'; px++) { si (isupper(*px)) *px++ = *px; también si islower(*px)) *py++ = toupper(*px); si (index(,rATGCU,,,*O y-l») natgc++; } *py++ = -.O'; *py = W; (void) fclose(fb); dna = natgc > (tlen/3); return(pseq+4); } char * g_calloc(msg, nx, sz) g.calloc char *msg: /* programa, rutina de llamada */ int nx, sz; /* número y tamaño de los elementos */ { char *px, *callocO; si((px = calloc(unsigned)nx, (unsigned)sz)) : 0) { prog. msg, nx, sz); return(px); I* * proporcione los saltos finales desde dxfj o archivo tmp, ajuste pp[], reajuste dmax: main() */ readjmpsO readjmps ¡ni fd = -l; int siz, iO, il; register i, j, xx; si (5) { (void) fclose(fj); si ((fd = openQname, O RDONLY, 0)) < 0) í ~ ?rintf(stderr, "%s: no puede abrirO %s\n", prog, jname); eanup(l); } para (i = iO = il = 0, dmaxO =dmax, xx = lenO;; i++) { aunque (1) { para (j = dx[dmax].ijmp; j >= 0 && dx[dmax].jp.xfj] >= xx; j— ) Página 2 de nwsubr.c break; prOl.nFiO] = i; pf I.?fi?j = i; m ¡-i Página 3 de nwsubr.c Tabla 1 (Cont) I* * escriba un desvío de estructura de salto llena de una previa (si existe alguna): nwO */ writejmps(ix) writejmps int íx; { char *mktemp ; name); ívoid) fwrite((char *)&dx[ix].jp, sizeof(struct jmp), 1, fj); (void) fwrite((char *)&dx[ixj. ofíset, sizeof(dxpx].offset), 1, fj); Página 4 de nwsubr.c Tabla 2 PRO XXXXXXXXXXXXXXX (Longitud = 15 aminoácidos) Proteina de XXXXXYYYYYYY (Longitud = 12 aminoácidos) Comparación % de identidad de la secuencia de aminoácidos = (el número de residuos de aminoácidos que corresponden idénticamente entre las dos secuencias de polipéptidos como se determinó por ALIGN-2) dividido entre (el número total de residuos de aminoácidos del polipéptido PRO) = dividido entre 15 = 33.3% Tabla 3 PRO XXXXXXXXXX (Longitud = 10 aminoácidos) Proteina de XXXXXYYYYYYZZYZ (Longitud = 15 aminoácidos) Comparación % de identidad de la secuencia de aminoácidos = (el número de residuos de aminoácidos que corresponden idénticamente entre las dos secuencias de polipéptidos como se determinó por ALIGN-2) dividido entre (el número total de residuos de aminoácidos del polipéptido PRO) = dividido entre 10 = 50% Tabla 4 PRO-ADN NNNNNNNNNNNNNN (Longitud = 14 nucleótidos) ADN de NNNNNNLLLLLLLLLL (Longitud = 16 nucleótidos) Comparación % de identidad de la secuencia de ácido nucleico = (el número de nucleótidos que corresponden idénticamente entre las dos secuencias de ácido nucleico como se determinó por ALIGN-2) dividido entre (el número total de nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico de PRO-ADN) = 6 dividido entre 14 = 42.9% Tabla 5 PRO-ADN NNNNNNNNNNNN (Longitud = 12 nucleótidos; ADN de NNNNLLLW (Longitud = 9 nucleótidos) Comparación % de identidad de la secuencia de ácido nucleico = (el número de nucleótidos que corresponden idénticamente entre las dos secuencias de ácido nucleico como se determinó por ALIGN-2) dividido entre (el número total de nucleótidos de la secuencia de ácido nucleico de PRO-ADN) = 4 dividido entre 12 = 33.3% II. Composiciones y Métodos de la Invención A. Polipéptido de FGF-19 de longitud total La presente invención proporciona secuencias de nucleótidos aislados e identificados recientemente que codifican los polipéptidos referidos en la presente solicitud como FGF-19 (o también UNQ334) . En particular, el ADNc que codifica un polipéptido de FGF-19 ha sido identificado y aislado, como se describe con detalle adicional en los Ejemplos posteriores. Se señala que a las proteínas producidas en las rondas de expresión separadas se les pueden dar diferentes números PRO pero el número UNQ es único para cualquier ADN dado y proteina codificada, y no será cambiado. Sin embargo, para propósitos de simplicidad, en la presente especificación la proteína codificada por DNA49435-1219 así como todos los homólogos y variantes naturales adicionales, incluidos en la definición precedente de FGF-19 (también referido algunas veces como PR0533) , será referida como "FGF-19", sin importar su origen o su modo de preparación. Como se describe en los Ejemplos posteriores, un clon de ADNc designado aquí como DNA49435-1219 ha sido depositado en el ATCC. La secuencia de nucléotidos real del clon puede ser determinada fácilmente por el artesano experto por la secuenciación del clon depositado utilizando los métodos de rutina en el arte. La secuencia de aminoácidos predicha puede ser determinada de la secuencia de nucleótidos utilizando la experiencia de rutina. Para el polipéptido de FGF-19 y la codificación del ácido nucleico descrito aquí, los Solicitantes han identificado lo que se cree que va a ser el marco de lectura mejor identificable con la información de la secuencia disponible en el presente tiempo. Utilizando el programa de computadora para la alineación de la secuencia ALIGN-2 referido anteriormente, se ha encontrado que el FGF-19 de la secuencia natural de longitud total (mostrado en la Figura 2 y la SEC ID NO: 2) tiene cierta identidad de la secuencia de aminoácidos con AF007268_1. En consecuencia, actualmente se cree que el polipéptído de FGF-19 descrito en la presente solicitud es un elemento identificado recientemente de la familia de la proteína del factor de crecimiento de los fibroblastos y puede poseer una o más actividades biológicas y/o inmunológicas o propiedades típicas de esta familia de proteínas.

B. Variantes de FGF-19 Además de los polipéptidos de FGF-19 de la secuencia natural de longitud completa descrita aquí, se contempla que se pueden preparar variantes de FGF-19. Las variantes de FGF-19 pueden ser preparadas introduciendo los cambios de nucleótidos apropiados en el ADN de FGF-19, y/o por la síntesis del polipéptido de FGF-19 deseado. Aquellos expertos en el arte apreciarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos post-traduccionales del FGF-19, tales como el cambio del número de posición de los sitios de glicosilación o la alteración de las características de fijación de la membrana. Las variaciones en el FGF-19 de la secuencia de longitud total, natural, o en varios de los dominios de FGF-19 descritos aquí, se pueden hacer, por ejemplo, utilizando cualquiera de las técnicas y pautas para las mutaciones conservadoras y no conservadoras descritas, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 5,364,934. Las variaciones pueden ser una substitución, deleción o inserción de uno o más codones que codifican el FGF-19 que conducen a un cambio en la secuencia de aminoácidos del FGF-19 cuando se compara con la secuencia natural de FGF-19. Opcionalmente la variación es por la substitución de al menos un aminoácido con cualquier otro aminoácidos en uno o más de los dominios del FGF-19. La guía en la determinación de cual residuo de aminoácidos puede ser insertado, substituido o delecionado sin afectar adversamente la actividad deseada, puede ser encontrada comparando la secuencia del FGF-19 con aquella de las moléculas de proteínas conocidas, homologas, y minimizando el número de los cambios de la secuencia de aminoácidos hechos en las regiones de homología elevada. Las substituciones de aminoácidos pueden ser el resultado del reemplazo de un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades químicas y/o estructurales similares, tales como el reemplazo de una leucina con una serina, es decir, reemplazos de aminoácidos conservadores. Las inserciones o deleciones pueden estar opcionalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos . La variación permitida puede ser determinada haciendo inserciones, deleciones o substituciones de aminoácidos periódicamente en la secuencia y probando las variantes resultantes para verificar la actividad exhibida por la secuencia natural madura o de longitud total. Los fragmentos de los polipéptidos de FGF-19 son provistos aquí. Tales fragmentos pueden ser truncados en la terminación N o la terminación C, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se compara con una proteína natural de longitud completa. Ciertos fragmentos carecen de los residuos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada del polipéptido de FGF-19. Los fragmentos de FGF-19 pueden ser preparados por cualquiera de un número de técnicas convencionales. Los fragmentos de los péptidos deseados pueden ser sintetizados químicamente. Un enfoque alternativo involucra la generación de los fragmentos de FGF-19 por la disolución enzimática, por ejemplo, tratando la proteína con una enzima conocida para segmentar las proteínas en los sitios definidos por los residuos de aminoácidos particulares, o por la disolución del ADN con las enzimas de restricción adecuadas y aislando el fragmento deseado. Todavía otra técnica adecuada involucra el aislamiento y la amplificación de un fragmento de ADN que codifica un fragmento del polipéptido deseado, por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Los oligonucléotidos que definen las terminales deseadas del fragmento de ADN son empleadas en los cebadores de 5' y 3' en la PCR. Preferentemente, los fragmentos del polipéptido de FGF-19 comparten al menos una actividad biológica y/o inmunológica con el polipéptido de FGF-19 natural mostrado en la Figura 2 (SEC ID NO: 2). En las modalidades particulares, las substituciones conservadoras de interés son mostradas en la Tabla 6 bajo el encabezado de las substituciones preferidas. Si tales substituciones conducen a un cambio en la actividad biológica, entonces más cambios substanciales, denominados substituciones ejemplares en la Tabla 6, o como se describe de manera adicional posteriormente con referencia a las clases de aminoácidos, son introducidos y los productos seleccionados .

Tabla 6 Residuo Substituciones Substituciones Originales Ejemplares Preferidas Ala (A) val; leu; ile val Arg (R) lys; gln; asn lys Asn (N) gln; his; lys; arg gln Asp (D) glu glu Cys (C) ser ser Gln (Q) asn asn Glu (E) asp asp Gly (G) pro; ala ala His (H) asn; gln; lys; arg arg He (I) leu; val; met; ala; phe; norleucina leu Leu (L) ñorleucina; ile; val; met; ala; phe ile Lys (K) arg; gln; asn arg Met (M) leu; phe; ile leu Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu Pro (P) ala ala Ser (S) thr thr Thr (T) ser ser Trp (W) tyr; phe tyr Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucina leu Las modificaciones substanciales en la función o identidad inmunológica del polipéptido de FGF-19 son efectuadas por la selección de las substituciones que difieren significativamente en su efecto en mantener (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la substitución, por ejemplo, como una conformación helicoidal o de hoja, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio de blanco, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que están presentes de manera natural son divididos en grupos basado en las propiedades de la cadena lateral común : (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílicos neutrales: cis, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que tienen influencia en la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las substituciones no conservadoras abarcarán el intercambio de un elemento de una de estas clases por otra clase. Tales residuos substituidos también pueden ser introducidos en los sitios de substitución conservadores o, más preferentemente, en los sitios restantes (no conservados) . Se pueden hacer variaciones utilizando los métodos conocidos en el arte tales como la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida al sitio) , la exploración con alanina, y la mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida al sitio [Cárter et al., Nucí . Acids Res . , 13^:4331 (1986); Zoller et al., Nucí . Acids . Res . , 1_0:6487 (1987)], la mutagénesis del cásete [Wells et al., Gene, 3_4:315 (1985)], la mutagénesis de selección por restricción [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415(1986)] u otras técnicas conocidas pueden ser efectuadas sobre el ADN clonado para producir el ADN de la variante de FGF-19. El análisis de aminoácidos por exploración también puede ser empleado para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de exploración preferidos están los aminoácidos neutrales, relativamente pequeños . Tales aminoácidos incluyen la alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es tipicamente un aminoácido de exploración preferido entre este grupo a causa de que la misma elimina la cadena lateral más allá del carbón beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante [Cunningham y Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. La alanina también es preferida típicamente a causa de que es el aminoácido más común. Además, frecuentemente la misma es encontrada tanto en las posiciones expuesta como enterrada [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chotia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la substitución de alanina no produce las cantidades adecuadas de la variante, un aminoácido isotérico puede ser utilizado.

C. Modificaciones del FGF-19 Las modificaciones covalentes del FGF-19 están incluidas dentro del alcance de esta invención. Un tipo de la modificación covalente incluye hacer reaccionar los blancos de los residuos de aminoácidos de un polipéptido de FGF-19 con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con las cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminales del FGF-19. La derivación con los agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para la reticulación del FGF-19 a una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para su uso en el método de purificación de los anticuerpos de anti-FGF-19, y viceversa. Los agentes de reticulación utilizados comúnmente incluyen, por ejemplo, el 1, 1-bis (diazoacetil) -2-feniletano, glutaraldehído, esteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, los esteres con el ácido 4-azidosalicílico, los i idoésteres homobifuncionales, incluyendo los esteres de disuccinimidilo tales como el 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato) , las maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1, 8-octano y agentes tales como el metil-3- [ (p-azidofenil) ditio]propioimidato. Otras modificaciones incluyen la desamidación de los residuos de glutaminilo y asparaginilo a los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente, la hidroxilación de la prolina y la lisina, la fosforilación de los grupos hidróxilo de los residuos de serilo y treonilo, la metilación de los grupos a-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina, e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], la acetilación de la amina N-terminal, y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal . Otro tipo de modificación covalente del polipéptido de FGF-19 incluido dentro del alcance de esta invención comprende alterar la configuración de glicosilación natural del polipéptido. "Alteración de la configuración de glicosilación natural" está propuesto para los propósitos de aquí para que signifique la deleción de una o más porciones de carbohidratos encontradas en el FGF-19 de la secuencia natural (ya sea removiendo el sitio de glicosilación implícito o delecionando la glicosilación por medios químicos y/o enzimáticos) , y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el FGF-19 de la secuencia natural. Además, la frase incluye los cambios cualitativos en la glicosilación de las proteínas naturales, que involucran un cambio en la naturaleza y las proporciones de varias porciones de carbohidratos presentes. La adición de los sitios de glicosilación al polipéptido de FGF-19 puede ser efectuada alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración se puede hacer, por ejemplo, por la adición de, o la substitución por, uno o más residuos de serina o treonina al FGF-19 de la secuencia natural (para los sitios de glicosilación O-enlazados) . La secuencia de aminoácidos de FGF-19 puede ser alterada opcionalmente por medio de cambios al nivel del ADN, particularmente por la mutación del ADN que codifica el polipéptido de FGF-19 en las bases preseleccionadas de tal modo que los codones sean generados los cuales se traducirán en los aminoácidos deseados. Otros medios de incrementar el número de las porciones de carbohidratos sobre el polipéptido de FGF-19 son por la unión química o enzimática de los glicósidos al polipéptido. Tales métodos se describen en el arte, por ejemplo, en WO 87/05330 publicada el 11 de septiembre de 1987, y Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981) . La remoción de las porciones de carbohidratos presentes sobre el polipéptido de FGF-19 puede ser efectuada química o enzimáticamente o por la substitución mutacional de los codones que codifican los residuos de aminoácidos que sirven como blancos para la glicosilación. Las técnicas de desglicosilación química ya son conocidas en el arte y se describen, por ejemplo, por Ha imuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52(1987) y por Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). La segmentación enzimática de las porciones de carbohidratos sobre los polipéptidos puede ser lograda por el uso de una variedad de endo- y exo-glucosidasas como se describió por Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987). Otro tipo de modificación covalente del FGF-19 comprende el enlace del polipéptido de FGF-19 a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, o polioxialquilenos, de la manera descrita en las Patentes U.S.

Nos. 4,460,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 o 4,179,337. El FGF-19 de la presente invención también puede ser modificado de una manera para formar una molécula quimérica que comprende el FGF-19 fusionado a otro, polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácidos . En una modalidad, tal molécula quimérica comprende una fusión del FGF-19 con un polipéptido de etiqueta el cual proporciona un epítope al cual un anticuerpo de anti-etiqueta puede unirse selectivamente. La etiqueta del epítope es colocada generalmente en la terminación amino o carboxilo del FGF-19. La presencia de tales formas etiquetadas con el epítope del FGF-19 pueden ser detectadas utilizando un anticuerpo contra el polipéptido de etiqueta. También, la provisión de la etiqueta del epítope hace posible que el FGF-19 sea purificado fácilmente por la purificación de afinidad utilizando un anticuerpo de anti-etiqueta u otro tipo de matriz de afinidad que se une a la etiqueta del epítope. Los diversos polipéptidos de la etiqueta y sus respectivos anticuerpos son bien conocidos en el arte. Los ejemplos incluyen las etiquetas de poli-histidina (poli-his) o poli-histidina-glicina (poli-his-gly) ; el polipéptido de la etiqueta de flu HA y su anticuerpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165(1988)]; la etiqueta c-myc y los anticuerpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 para el mismo [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; y la etiqueta de la glicoproteína D (gD) del virus del Herpes simplex y su anticuerpo [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6): 547-553 (1990)]. Otros polipéptidos de etiqueta incluyen el péptido Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; el péptido del epítope KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; un péptido del epítope de la a-tubilina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166(1991)]; y la etiqueta del péptido de la proteína del gen 10 de T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]. En una modalidad alternativa, la molécula quimérica puede comprender una fusión del FGF-19 con una inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la molécula quimérica (también referida como una "inmunoadhesina") , tal fusión podría ser a la región Fc de una molécula de IgG. Las fusiones de Ig incluyen preferentemente la substitución de una forma soluble (dominio de la transmembrana delecionada o inactivada) de un polipéptido de FGF-19 en lugar de al menos una región variable dentro de una molécula de Ig. En una modalidad preferida particularmente, la fusión de inmunoglobulina incluye la articulación, CH2 y CH3, o la articulación, regiones CH1, CH2 y CH3, de una molécula de IgGl. Para la producción de las fusiones de la inmunoglobulina véase también la Patente US No. 5,428,130 expedida el 27 de junio de 1995.

D. Preparación del FGF-19 La descripción posterior se refiere principalmente a la producción del FGF-19 cultivando las células transformadas o transfectadas con un vector que contiene el ácido nucleico de FGF-19. Por supuesto, está contemplado que los métodos alternativos, los cuales son bien conocidos en el arte, puedan ser empleados para preparar el FGF-19. Por ejemplo, la secuencia de FGF-19, o las porciones de la misma, pueden ser producidas por la síntesis de los péptidos directa utilizando las técnicas de fase sólida [véase, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., j35_: 2149-2154 (1963)]. La síntesis de las proteínas in vi tro puede ser efectuada utilizando las técnicas manuales o por automatización. La síntesis automatizada puede ser efectuada, por ejemplo, utilizando un Sintetizador de Péptidos de Applied Biosystems (Foster City, CA) utilizando las instrucciones del fabricante. Varias porciones del FGF-19 pueden ser sintetizadas químicamente de manera separada y combinadas utilizando los métodos químicos o enzimáticos para producir el FGF-19 de longitud total. 1. Aislamiento del ADN que codifica el FGF-19 El ADN que codifica el FGF-19 puede ser obtenido de una biblioteca de ADNc preparada a partir del tejido que se cree que posee el ARN del FGF-19 y expresarlo en una etiqueta detectable. En consecuencia, el ADN del FGF-19 humano puede ser obtenido convenientemente de una biblioteca del ADNc preparada a partir del tejido humano, tal como se describe en los Ejemplos. El gen que codifica el FGF-19 también puede ser obtenido de una biblioteca genómica o por procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo la síntesis de ácido nucleico automatizada) . Las bibliotecas pueden ser seleccionadas con las sondas (tales como los anticuerpos para FGF-19 o los oligonucleótidos de al menos aproximadamente 20-80 bases) designadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por el mismo. La selección del ADNc o la biblioteca genómica con la sonda puede ser llevada a cabo utilizando los procedimientos estándares, tales como los descritos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Un medio alternativo para aislar el FGF-19 que codifica el gen es utilizar la metodología de PCR [Sambrook et al., supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995) ] . Los ejemplos posteriores describen las técnicas para seleccionar una biblioteca de ADNc. Las secuencias de nucleótidos seleccionadas como las sondas deben ser de suficiente longitud y suficientemente no ambiguas de modo que los positivos falsos sean minimizados. El oligonucleótido es etiquetado preferentemente de tal modo que el mismo pueda ser detectado durante la hibridación al ADN en la biblioteca que es seleccionada. Los métodos de etiquetación son bien conocidos en el arte, e incluyen el uso de radioetiquetas semejantes a ATP etiquetado con 32P, la biotinilación o la etiquetación de las enzimas. Las condiciones de hibridación, incluyendo la severidad moderada y la severidad elevada, son provistas en Sambrook et al., supra. Las secuencias identificadas en tales métodos de selección de la biblioteca pueden ser comparados y alineados con otras secuencias conocidas depositadas y disponibles en las bases de datos públicas tales como GenBank u otras bases de datos de las secuencias privadas . La identidad de la secuencia (ya sea al nivel de los aminoácidos o al nivel de los nucleótidos) dentro de las regiones definidas de la molécula o a través de la secuencia de longitud completa puede ser determinada utilizando los métodos conocidos en el arte y como se describió aquí . El ácido nucleico que tienen la secuencia de codificación de la proteína pueden ser obtenidos eligiendo las bibliotecas genómicas o del ADNc seleccionadas utilizando la secuencia de aminoácidos deducida descrita aquí por primera vez, y, si es necesario, utilizando los procedimientos de extensión del cebador convencionales como se describió en Sambrook et al., supra, para detectar los precursores y procesar los compuestos intermedios del ARNm que pueden no tener que haber sido transcritos de manera inversa en el ADNc. 2. Selección y Transformación de las Células Huésped Las células huésped son transformadas o transfectadas con los vectores de expresión o clonación descritos aquí para la producción de FGF-19 y cultivados en el medio nutriente convencional modificado cuando sea apropiado para inducir los promotores, seleccionar los transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones del cultivo, tales como el medio, la temperatura, el pH y semejantes, pueden ser seleccionados por aquellas personas expertas en el arte sin experimentación indebida. En general, los principios, protocolos, y las técnicas prácticas para maximizar la productividad de los cultivos celulares pueden ser encontradas en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., supra. Los métodos de la transfección de las células eucarióticas y la transformación de las células procarióticas son conocidas por el artesano con experiencia ordinaria, por ejemplo la electroporación mediada por CaCl2, CaP0, y por los liposomas. Dependiendo de la célula huésped utilizada, la transformación es efectuada utilizando las técnicas estándares apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio que emplea el cloruro de calcio, como se describió en Sambrook et al., supra, o la electroporación es utilizada generalmente para los procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens es utilizada para la transformación de ciertas células vegetales, como se describió por Shaw et al., Gener 23:315 (1983) y WO 89/05859 publicada el 29 de junio de 1989. Para las células de mamíferos sin tales paredes celulares, el método de precipitación del fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978) pueden ser empleado. Los aspectos generales de las transfecciones del sistema hospedero de la célula de mamífero han sido descritos en al Patente U.S. No. 4,399,216. Las transformaciones en la levadura son llevadas a cabo típicamente de acuerdo con el método de Van Zolingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979) . Sin embargo, otros métodos para la introducción del ADN en las células, tales como por microínyección nuclear, electroporación, fusión de los protoplastos bacterianos con las células intactas, o los policationes, por ejemplo, el polibreno, poliornitina, también pueden ser utilizados. Para varias técnicas para la transformación de las células de mamífero, véase Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988). Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores de aquí incluyen las células de procariotas, levadura, o los eucariotas más elevados. Los procariotas adecuados incluyen pero no están limitados a las eubacterias, tales como los organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriáceas tales como el E. coli . Varias cepas de E. coli están disponibles públicamente, tales como la cepa MM294 de E. coli K12 (ATCC 31,446); X1776 de E. coli (ATCC 31,537); cepa W3110 de E. coli (ATCC 27,325) y K5 772 (ATCC 53,635). Otras células huésped procarióticas adecuadas incluyen Enterobacteriáceas tales como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter , Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tal como B. subtilis y b. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P descrito en DD 266,710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales, como P. aeruginosa, y Streptomyces . Estos ejemplo son ilustrativos en lugar de ser limitativos. La cepa W3110 es un huésped preferido o un huésped original preferido particularmente a causa de que el mismo es una cepa huésped común para las fermentaciones del producto de ADN recombinante . Preferentemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 puede ser modificada para efectuar una mutación genética en los genes que codifican las proteínas endógenas para el huésped, con los ejemplos de tales huéspedes que incluyen la cepa W3110 1A2 de E. coli, la cual tiene el genotipo tonA completo; la cepa W3110 9E4 de E. coli, la cual tiene el genotipo tonA ptr3 completo; la cepa W3110 27C7 de E. coli (ARCC 55,244), la cual tiene el genotipo tonA ptr 3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP opmT kan ' completo; la cepa W3110 37D6 de E. coli, la cual tiene el genotipocompleto genotipo tonA ptr 3 phoA El 5 (argF-lac) 169 degP opmT rbsl ilvG kan ' completo; la cepa W3110 40B4 de E. coli, la cual es la cepa 37D6 con una mutación de la deleción de degP no resistente a la kanamicina, y una cepa de E. coli que tiene la proteasa periplásmica mutante descrita en la Patente U.S. No. 4,946,783 expedida el 7 de agosto de 1990. Alternativamente, los métodos de clonación in vi tro, por ejemplo, la PCR u otras reacciones de la polimerasa del ácido nucleico, son adecuadas. Además de los procariotas, los microbios eucarióticos tales como los hongos o las levaduras filamentosas son huéspedes de clonación o expresión adecuados para los vectores que codifican el FGF-19. El Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo hospedero eucariótico inferior utilizado comúnmente. Otros incluyen el Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139,383 publicada el 2 de mayo de 1985); huéspedes de Kluyveromyces (Patente U.S. No. 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tales como, por ejemplo, K. Lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154 (2) : 737-742 [1983] ) , K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. wal tii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van der Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia Pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1998]); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 76: 5259-5263 [1979] ) ; Schwanniomyces tal como Schawanniomyces occidentalis (EP 394,538 publicada el 31 de octubre de 1990) , y los hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicilli um, Tolypocladi um (WO 91/00357 publicada el 10 de enero de 1991), y los huéspedes de Aspergillus tales como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys . Res . Commun. , 112 : 284-289 [1983] ; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983] ; Yelton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J., : 475-479 [1985] ) . Las levaduras metilotrópicas son adecuadas aquí e incluyen, pero no están limitadas a, las levaduras capaces de crecer en metanol seleccionadas de los géneros que consisten de Hansenula, Candida, Kloechera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula . Una lista de las especies específicas que son ejemplares de esta clase de levaduras se puede encontrar en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982) . Las células huésped adecuadas para la expresión del FGF-19 glicosilado son derivadas de los organismos multicelulares. Los ejemplos de las células de invertebrados incluyen las células de insectos tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, así como las células vegetales. Los ejemplos de las líneas de las células huésped de mamíferos, útiles, incluyen las células de COS y las de los ovarios del hámster Chino (CHO) . Los ejemplos más específicos incluyen la línea CV1 del riñon del mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea del riñon embriónico humano (las células 293 o las células 293 subclonadas para el crecimiento en el cultivo de la suspensión, Graham et al., J. Gen Virol . , 36:59 (1977) ) ; las células de los ovarios del hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980) ) ; las células de sertoli del ratón (TM4, Mather, Biol.

Reprod. , 23:243-251 (1980)); las células del pulmón humano (W138, ATCC CCL 75) ; las células del hígado humano (Hep G2, HB 8065) ; y el tumor mamario del ratón (MMT 06052, ATCC CCL51) . La selección de la célula huésped apropiada se considera que va a estar dentro de la experiencia en el arte. 3. Selección y Uso de un Vector Replicable El ácido nucleico (por ejemplo, el ADNc o el ADN genómico) que codifica el FGF-19 puede ser insertado en un vector replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. Varios vectores están disponibles públicamente. El vector, por ejemplo, puede estar en la forma de un plásmido, cósmido, partícula viral, o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede ser insertada en el vector por una variedad de procedimientos. En general, el ADN es insertado en un (os) sitio (s) de la endonucleasa de restricción apropiado (s) utilizando las técnicas conocidas en el arte. Los componentes de los vectores incluyen de manera general, pero no estar limitados a, uno o más de una secuencia de la señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento mejorador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de los vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes emplean las técnicas de unión estándares las cuales son conocidas por el artesano experto. El FGF-19 puede ser producido recombinante no solo de manera directa, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, el cual puede ser una secuencia de la señal u otro polipéptido que tiene un sitio de segmentación específico en la terminación N de la proteína madura o polipéptido. En general, la secuencia de la señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN que codifica el FGF-19 que es insertado en el vector. La secuencia de la señal puede ser una secuencia de la señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, Ipp, o los elementos delanteros de exterotoxina estables con calentamiento. Para la secreción de la levadura la secuencia de la señal puede ser, por ejemplo, el elemento delantero de la invertasa de la levadura, el elemento delantero del factor alfa (incluyendo los elementos delanteros del factor a de Saccharomyces y Kluyveromyces, esta última descrita en la Patente U.S. No. 5,010,182, o el elemento delantero de la fosfatasa acida, el elemento delantero de la glucoamilasa de C. albicans (EP 362,179 publicada el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en WO 90/13646 publicadael 15 de noviembre de 1990. En la expresión de las células de los mamíferos, las secuencias de la señal del mamífero pueden ser utilizadas para dirigir la secreción de la proteína, tal como las secuencias de la señal desde los polipéptidos secretados de las mismas especies o de las especies relacionadas, así como los elementos delanteros secretorios virales. Los vectores tanto de expresión como de clonación contienen la secuencia de ácido nucleico que hace posible que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras, y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2µ es adecuado para la levadura, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para los vectores de clonación en las células de los mamíferos.

Los vectores de expresión y de clonación típicamente contendrán un gen de selección, también llamado un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican las proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, la ampicilina, la neomicina, el metotrexato, o la tetraciclina, (b) las deficiencias auxotróficas de complemento, o (c) el suministro de nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa de Bacilli . Un ejemplo de los marcadores seleccionables adecuados para las células de mamíferos son aquellas que son capaces de la identificación de las células competentes para recibir el ácido nucleico que codifica el FGF-19, tal como la DHFR o timidina cinasa. Una célula huésped apropiada cuando el DHFR del tipo silvestre es empleado es la línea celular CHO deficiente en la actividad de DHFR, preparada y propagada como se describe por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980) . Un gen de selección adecuado para su uso en la levadura es el gen trpl presente en el plásmido YRp7 de la levadura [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980)]. El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de la levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)]. Los vectores de expresión y clonación contienen usualmente un promotor enlazado operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el FGF-19 para dirigir la síntesis del ARNm. Los promotores reconocidos por una variedad de células huésped potenciales también ya son conocidos. Los promotores adecuados para su uso con los huéspedes procarióticos incluyen los sistemas promotores de la ß-lactamasa y de la lactosa [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res . , 8:4057 (1980); EP 36,776], y los promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]. Los promotores para su uso en los sistemas bacterianos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) enlazada operativamente al ADN que codifica el FGF-19. Los ejemplos de las secuencias promotoras adecuadas para su uso con los huéspedes de levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato cinasa [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] u otras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], tales como la enolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato utasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucocinasa. Otros promotores de levadura, los cuales son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones del crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la fosfatasa acida, las enzimas degradantes asociadas con el metabolismo del nitrógeno, metalotionenína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y las enzimas responsables de la utilización de la maltosa y la galactosa. Los vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión de la levadura son descritos adicionalmente en EP 73,657. La transcripción de FGF-19 desde los vectores en las células huésped de los mamíferos es controlada, por ejemplo, por los promotores obtenidos de los genomas de los virus tales como el virus del polioma, el poxvirus de las aves (UK 2,211,504 publicada el 5 de julio de 1989), el adenovirus (tales como el Adenovirus 2) , el virus del papiloma del bovino, el virus del sarcoma de las aves, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y el Virus 40 del Simio (SV40) , de los promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y de los promotores de los choques térmicos, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped. La transcrición de un ADN que codifica el FGF-19 por los eucariotas más elevados puede ser incrementada por la inserción de una secuencia mejoradora en el vector. Los mejoradores son elementos de actuación cis del ADN, usualmente de manera aproximada desde 10 hasta 300 pb, que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Muchas secuencias mejoradoras son ahora conocidas de los genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína, e insulina) . Típicamente, sin embargo, se utilizará un mejorador a partir de un virus de las células eucarióticas. Los ejemplos incluyen el mejorador de SV40 sobre el último lado del origen de replicación (100-270 pb) , el mejorador del promotor inicial del citomegalovirus, el mejorador del polioma sobre el último lado del origen de replicación, y los mejoradores del adenovirus. El mejorador pueden ser cortado en rebanadas en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia de codificación de FGF-19, pero está localizado preferentemente en un sitio 5' del promotor.

Los vectores de expresión utilizados en las células huésped eucatióticas (células de levadura, hongos, insectos, plantas, animales, seres humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de la transcipción y para estabilizar el ARNm. Tales secuencias están disponibles comúnmente desde las regiones del extremo 5' y, ocasionalmente 3', de los ADNs o ADNcs virales o eucarióticos. Estas regiones contienen los segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del FGF-19 que codifica el ARNm. Todavía otros métodos, vectores, y células huésped adecuadas para adaptación a la síntesis del FGF-19 en el cultivo de la las células de vertebrados recombinantes se describen en Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; y EP 117,058. 4. Detección de la Expresión/Amplificación del Gen La expresión y/o amplificación del gen puede ser medida en una muestra directamente, por ejemplo, por el procedimiento de Southern blotting convencional para cuantificar la transcripción del ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci, 77:5201-5205 (1980)], el procedimiento de dot blotting (transferencia por puntos) (análisis del ADN) , o la hibridación in situ, utilizando una sonda etiquetada apropiadamente, basado en las secuencias provistas aquí. Alternativamente, se pueden emplear anticuerpos que reconozcan los duplexos específicos, incluyendo los duplexos del ADN, los duplexos del ARN, y los duplexos híbridos de ADN-ARN o los duplexos de proteína-ADN. Los anticuerpos a su vez pueden ser etiquetados y el ensayo puede ser llevado a cabo en donde el duplexo esté unido a una superficie, de modo que durante la formación del duplexo sobre la superficie, la presencia del anticuerpo unido al duplexo pueda se detectada. La expresión del gen, alternativamente, puede ser medida por métodos inmunológicos, tales como el teñido inmunohistoquímico de las secciones de las células o el tejido y el ensayo del cultivo de las células o los fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto del gen. Los anticuerpos útiles para el teñido inmunohistoquímico y/o el ensayo de los fluidos de muestreo pueden ser ya sea monoclonales o policlonales, y pueden ser preparados en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos pueden ser preparados contra un polipéptido de FGF-19 de la secuencia natural o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN provistas aquí o contra la secuencia exógena fusionada al ADN de FGF-19 y que codifica un epítope del anticuerpo específico.

. Purificación del Polipéptido Las formas del FGF-19 pueden ser recuperadas del medio de cultivo o de los lisados de la célula huésped. Si están unidas a la membrana, las mismas pueden ser liberadas de la membrana utilizando una solución detergente adecuada (por ejemplo Triton-X 100) o por segmentación enzimática. Las células empleadas en la expresión del FGF-19 pueden ser alteradas o rotas por varios medios físicos o químicos, tales como el ciclo de licuado-descongelamiento, la aplicación de sonido, la ruptura mecánica, o agentes para el lisado de la célula. Puede ser deseable purificar el FGF-19 a partir de los polipéptidos o proteínas de las células recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplares de los procedimientos de purificación adecuados: por el fraccionamiento sobre una columna de intercambio iónico; la precipitación con etanol; la CLAR de fase inversa; la cromatografía sobre sílice o una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfocamiento; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; el uso de filtración en un gel, por ejemplo, Sephadex G-75; las columnas de proteína A Sepharose para remover los contaminantes tales como el IgG; y las columnas de quelación de los metales para unir las formas etiquetadas con el epítope del FGF-19. Varios métodos de purificación de la proteína pueden ser empleados y tales métodos ya son conocidos en el arte y se describen por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990) ; Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). El (los) paso(s) de purificación seleccionado (s) dependerá (n) , por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y del FGF-19 particular producido .

E. Usos para el FGF-19 Las secuencias de nucleótidos (o su complemento) que codifican el FGF-19 tienen varias aplicaciones en el arte de la biología molecular, incluyendo los usos como sondas de hibridación, en la conformación de mapas de los genes y cromosomas y en la generación del ARN y de ADN antisentido. Los ácidos nucleicos de FGF-19 también serán útiles para la preparación de los polipéptidos de FGF-19 por las técnicas recombinantes descritas aquí. El gen de FGF-19 de la secuencia natural de longitud completa (SEC ID NO:l), o las porciones de la misma, pueden ser utilizadas como sondas de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar el ADNc de FGF-19 de longitud total o para aislar todavía otros ADNcs (por ejemplo, aquellos que codifican las variantes que están presentes naturalmente de FGF-19 o el FGF-19 de otras especies) los cuales tienen una identidad de la secuencia deseada con respecto a la secuencia de FGF-19 descrita en la Figura 1 (SEC ID N0:1). Opcionalmente, la longitud de las sondas serán de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50 bases. Las sondas de hibridación pueden ser derivadas de las regiones al menos parcialmente novedosas de la secuencia de los nucleótidos de la SEC ID N0:1 en donde estas regiones pueden ser determinadas sin experimentación indebida o de las secuencias genómicas que incluyen los promotores, los elementos mejoradores y los intrones del FGF-19 de la secuencia natural. A manera de ejemplo, un método de selección comprenderá el aislamiento de la región de codificación del gen de FGF-19 utilizando la secuencia del ADN conocida para sintetizar una sonda seleccionada de aproximadamente 40 bases. Las sondas de hibridación pueden ser etiquetadas por una variedad de etiquetas, incluyendo los radionucleótidos tales como 32P o 35S, o las etiquetas enzimáticas tales como la fosfatasa alcalina unida a la sonda por medio de los sistemas de unión de la avidina/biotina. Las sondas etiquetadas que tienen una secuencia complementaria para aquella del gen de FGF-19 de la presente invención pueden ser utilizadas para seleccionar las bibliotecas del ADNc humano, el ADN o el ARNm genómico para determinar cuales elementos de tales bibliotecas hibridiza la sonda. Las técnicas de hibridación son descritas con detalle adicional en los Ejemplos posteriores. Cualesquiera secuencias de EST descritas en la presente solicitud pueden ser empleadas de manera semejante como sondas, utilizando los métodos descritos aquí. Otros fragmentos útiles del ácido nucleico de FGF- 19 incluyen los oligonucleótidos de sentido o antisentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico de una sola hebra (ya sea el ARJST o el ADN) capaz de unión a las secuencias de de blanco del ARNm de FGF-19 (de sentido) o de ADN de FGF-19 (de antisentido) . Los oligonucleótidos de sentido o antisentido, de acuerdo con la presente invención, comprenden un fragmento de la región de codificación del ADN del FGF-19. Tal fragmento comprende al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferentemente desde aproximadamente 14 hasta 30 nucleótidos. La capacidad para derivar un oligonucleótido de sentido o de antisentido, basado en una secuencia de ADNc que codifica una proteína dada se describe en, por ejemplo, Stein y Cohén (Cáncer Res. 48:2659, 1988) y van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988).

La unión de los oligonucleótidos de sentido o antisentido a las secuencias de blanco del ácido nucleico conduce a la formación de los duplexos que bloquean la transcripción o traducción del blanco de la secuencia por uno de varios medios, incluyendo la degradación mejorada de los duplexos, la terminación prematura de la transcripción o traducción, o por otros medios. Los oligonucleótidos de antisentido pueden ser utilizados así para bloquear la expresión de las proteínas de FGF-19. Los oligonucleótidos de sentido o antisentido comprenden los oligonucleótidos que tienen esqueletos de azúcar-fosfodiéster modificados (u otros enlaces de azúcar, tales como aquellos descritos en WO 91/06692) y en donde tales enlaces de azúcar son resistentes a las nucleasas endógenas. Tales oligonucleótidos con enlaces de azúcar resistentes son estables in vivo (es decir, capaces de resistir la degradación enzimática) pero retienen la especificidad de la secuencia para que sea capaz de unirse a los blancos de las secuencias de nucleótidos. Otros ejemplos de los oligonucleótidos de sentido o antisentido incluyen aquellos oligonucleótidos los cuales están enlazados covalentemente a las porciones orgánicas, tales como aquellas descritas en WO 90/10048, y otras porciones que incrementan la afinidad del oligonucleótido para una secuencia de blanco del ácido nucleico, tal como la poli- (L-lisina) . Todavía adicionalmente, los agentes de intercalación, tales como la elipticina, y los agentes de alquilación o los complejos metálicos pueden ser fijados a los oligonucleótidos de sentido o antisentido para modificar las especificidades de unión o aglutinación de los oligonucleótidos de sentido o antisentido para los blancos de las secuencias de nucleótidos. Los oligonucleótidos de sentido o antisentido pueden ser introducidos en una célula que contiene la secuencia de blanco del ácido nucleico por cualquier método de transferencia genética, incluyendo, por ejemplo, la transfección del ADN mediada por CaP04-, la electroporación, o por el uso de los vectores de transferencia de los genes tales como el virus de Epstein-Barr. En un procedimiento preferido, un oligonucleótido de sentido o antisentido es insertado en un vector retroviral adecuado. Una célula que contiene la secuencia de blanco del ácido nucleico se pone en contacto con el vector retroviral recombinante, ya sea in vivo o ex vivo. Los vectores retrovirales adecuados incluyen, pero no están limitados a, aquellos derivados del retrovirus M-MuLV del murino, N2 (un retrovirus derivado de M-MuLV) , o los vectores de copias dobles designados como DCT5A, DCT5B y DCT5C (véase WO 90/13641) .

Los oligonucleótidos de sentido o antisentido pueden ser introducidos en una célula que contiene la secuencia de blanco de los nucleótidos por la formación de un conjugado con una molécula de unión o aglutinación del ligando, como se describe en WO 91/04753. Las moléculas de unión o aglutinación adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, los receptores de la superficie celular, los factores de crecimiento, otras citocinas, u otros ligandos que se unen a los receptores de la superficie celular. Preferentemente, la conjugación de la molécula de unión o aglutinación de los ligandos no interfiere substancialmente con la capacidad de la molécula de unión del ligando para unirse a su molécula o receptor correspondiente, o para bloquear la entrada del oligonucleótido de sentido o antisentido o su versión conjugada en la célula. Alternativamente, un oligonucleótido de sentido o antisentido puede ser introducido en una célula que contiene la secuencia de blanco de ácido nucleico por la formación de un complejo de oligonucleótidos-lípidos, como se describe en WO 90/10448. El complejo de oligonucleótidos-lípidos de sentido o antisentido está disociado preferentemente dentro de la célula por una lipasa endógena. Las sondas también pueden ser empleadas en las técnicas de PCR para generar un grupo de secuencias para la identificación de las secuencias de codificación de FGF-19 relacionadas estrechamente. Las secuencias de nucleótidos que codifican un FGF-19 también pueden ser utilizadas para construir sondas de hibridación por la construcción de mapas de los genes que codifican el FGF-19 y para el análisis genético de los individuos con desórdenes genéticos . Las secuencias de nucleótidos provistas aquí pueden ser convertidas en mapas con respecto a un cromosoma y las regiones específicas de un cromosoma utilizando las técnicas conocidas, tales como la hibridación in situ, el análisis de los enlaces contra los marcadores cromosómicos conocidos, y la selección de la hibridación con las bibliotecas. Cuando las secuencias de codificación para el FGF-19 codifican una proteína la cual se une a otra proteína (por ejemplo, en donde el FGF-19 es un receptor) , el FGF-19 puede ser utilizado en los ensayos para identificar las otras proteínas o moléculas involucradas en la interacción de la unión o aglutinación. Por tales métodos, los inhibidores de la interacción de la unión del ligando/receptor pueden ser identificados. Las proteínas involucradas en tales interacciones de unión también pueden ser utilizadas para seleccionar el péptido o los inhibidores de las moléculas pequeñas o los agonistas de la interacción de la unión o aglutinación. También, el FGF-19 del receptor puede ser utilizado para aislar el (los) ligando (s) correlativo (s) . Los ensayos de selección pueden ser diseñados para encontrar los compuestos delanteros que imitan la actividad biológica de un FGF-19 natural o un receptor para el FGF-19. Tales ensayos de selección incluirán los ensayos que son capaces de la selección de rendimiento elevado de las bibliotecas químicas, haciéndolas adecuadas particularmente para la identificación de los candidatos de los fármacos de las moléculas pequeñas . Las moléculas pequeñas contempladas incluyen los compuestos orgánicos o inorgánicos sintéticos. Los ensayos pueden ser efectuados en una variedad de formatos, incluyendo los ensayos de unión de proteína-proteína, los ensayos de selección bioquímica, los inmunoensayos y los ensayos basados en las células, los cuales están bien caracterizados en el arte. El ácido nucleico que codifica el FGF-19 o sus formas modificadas también pueden ser utilizados para generar ya sea animales transgénicos o animales "knock out" los cuales, a su vez, son útiles en el desarrollo y selección de los reactivos útiles terapéuticamente. Un animal transgénico (por ejemplo, un ratón o rata) es un animal que tiene las células que contienen un transgen, tal transgen fue introducido en el animal o un ancestro del animal en una etapa prenatal, por ejemplo, una etapa embriónica. Un transgen es un ADN el cual es integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico. En una modalidad, el ADNc que codifica el FGF-19 puede ser utilizado para clonar el ADN genómico que codifica el FGF-19 de acuerdo con las técnicas establecidas y las secuencias genómicas utilizadas para generar los animales transgénicos que contienen las células las cuales expresan el ADN que codifica el FGF-19. Los métodos para generar los animales transgénicos, particularmente los animales tales como los ratones o las ratas, han llegado a ser convencionales en el arte y son descritos, por ejemplo en las Patentes U.S. Nos. 4,736,866 y 4,870,009. Tipicamente, las células particulares podrían ser ubicadas como blanco para la incorporación del transgen de FGF-19 con los mejoradores específicos del tejido. Los animales transgénicos que incluyen una copia de un transgen que codifica el FGF-19 introducido en la línea germinal del animal en una etapa embriónica, pueden ser utilizados para examinar el efecto de la expresión incrementada del ADN que codifica el FGF-19. Tales animales pueden ser utilizados como animales de prueba para los reactivos que se piensa que confieren protección contra, por ejemplo, las condiciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. De acuerdo con esta faceta de la invención, un animal es tratado con el reactivo y una incidencia reducida de la condición patológica, comparado con los animales no tratados que llevan el transgen, podría indicar una intervención terapéutica potencial para la condición patológica. Alternativamente, los homólogos no humanos del FGF-19 pueden ser utilizados para construir el animal de "knock out" de FGF-19 el cual tiene un gen defectuoso o alterado que codifica el FGF-19 como un resultado de la recombinación homologa entre el gen endógeno que codifica el FGF-19 y el ADN genómico alterado que codifica el FGF-19 introducido en una célula impulsora embriónica del animal. Por ejemplo, el ADNc que codifica el FGF-19 pueden ser utilizado para clonar el ADN genómico que codifica el FGF-19 de acuerdo con las técnicas establecidas . Una porción del ADN genómico que codifica el FGF-19 puede ser delecionada o reemplazada con otro gen, tal como un gen que codifica un marcador seleccionable el cual puede ser utilizado para verificar la integración. Típicamente, varias kilobases del ADN de flanqueo no alterado (los extremos tanto 5' como 3') están incluidos en el vector [véase por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell, 51:503 (1987) para una descripción de los vectores de recombinación homólogos] . El vector es introducido en una línea de la célula impulsora embriónica (por ejemplo, por electroporación) y las células en las cuales el ADN introducido se ha recombinado homólogamente con el ADN endógeno son seleccionadas [véase por ejemplo, Li et al, Cell, 69:915 (1992)]. Las células seleccionadas son inyectadas entonces en un blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón o rata) para formar las quimeras de agregación [véase por ejemplo, Bradley, en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells : A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152]. Un embrión quimérico puede ser implantado entonces en un animal adoptivo hembra seudopreñado adecuado y el embrión llevado a término para crear un animal "knock out". La progenie que reúne el ADN recombinado homólogamente en sus células impulsoras puede ser identificado por las técnicas estándares y utilizada para reproducir animales en los cuales la totalidad de las células del animal contengan el ADN recombinado homólogamente. Los animales de "knock out" pueden ser caracterizados por ejemplo, por su capacidad para defenderse contra ciertas condiciones patológicas y por su propio desarrollo de las condiciones patológicas debidas a la ausencia del polipéptido de FGF-19. El ácido nucleico que codifica los polipéptidos de FGF-19 también puede ser utilizado en la terapia genética. En las aplicaciones de la terapia genética, los genes son introducidos en las células para lograr una síntesis in vivo de un producto genético efectivo terapéuticamente, por ejemplo para el reemplazo de un gen defectuoso. "Terapia genética" incluye tanto la terapia genética convencional en donde un efecto final es logrado por un solo tratamiento, como la administración de agentes terapéuticos genéticos, el cual involucra la administración una sola vez o la administración repetida de un ADN o ARNm efectivos terapéuticamente. Los ARNs y ADNs de antisentido pueden ser utilizados como agentes terapéuticos para el bloqueo de la expresión de ciertos genes in vivo. También se ha mostrado que los oligonucleótidos de antisentido cortos pueden ser importados en las células en donde los mismos actúan como inhibidores, a pesar de sus concentraciones intracelulares bajas provocadas por su absorción restringida por la membrana celular. (Za ecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 [1986]). Los oligonucleótidos pueden ser modificados para mejorar su absorción, por ejemplo substituyendo sus grupos de fosfodiéster cargados negativamente por grupos no cargados . Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir el ácido nucleico en células viables. Las técnicas pueden variar dependiendo de si el ácido nucleico es transferido hacia las células cultivadas in vitro, o in vivo en las células del huésped propuesto. Las técnicas adecuadas para la transferencia del ácido nucleico en las células de mamífero in vitro incluyen el uso de los liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación del calcio, etc. Las técnicas de transferencia del gen in vivo preferidas actualmente incluyen la transfección con los vectores virales (típicamente retrovirales) y la transfección mediada por las proteínas-liposomas del recubrimiento viral (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205-210 [1993] ) . En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente del ácido nucleico con un agente que ubica como blanco las células de blanco, tales como un anticuerpo específico para una proteína de la membrana de la superficie celular o el blanco de la célula, un ligando para un receptor sobre el blanco de la célula, etc. En donde los liposomas son empleados, las proteínas las cuales se unen a una proteína de la membrana de la superficie celular asociada con la endocitosis pueden ser utilizadas para la ubicación como blanco y/o para facilitar la absorción, por ejemplo las proteínas de la capsida o los fragmentos de la misma, típicos para un tipo de célula particular, los anticuerpos para las proteínas las cuales padecen la internalización en la ciclización, las proteínas que ubican como blanco la localización intracelular y mejoran la vida media intracelular. La técnica de la endocitosis mediada por el receptor se describe, por ejemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem., 262, 4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990) . Para una revisión de los protocolos de marcación del gen y la terapia del gen véase Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992) . Los polipéptidos de FGF-19 descritos aquí también pueden ser empleados como marcadores de peso molecular para propósitos de electrofóresis de las proteínas. Las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de FGF-19 o los fragmentos de los mismos descritos aquí, son útiles para la identificación del cromosoma. A este respecto, existe una necesidad creciente de identificar nuevos marcadores de cromosomas, puesto que actualmente están disponibles relativamente pocos reactivos marcadores de los cromosomas, basado en los datos de la secuencia real. Cada molécula de ácido nucleico de FGF-19 de la presente invención puede ser utilizada como un marcador de cromosomas . Los polipéptidos de FGF-19 y las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser utilizados también para la tipificación del tejido, en donde los polipéptidos de FGF-19 de la presente invención pueden ser expresados en un tejido cuando se compara con otro. Las moléculas del ácido nucleico de FGF-19 encontrarán uso para generar sondas para PCR, el análisis de Northern, el análisis de Southern y el análisis de Western. Los polipéptidos de FGF-19 y los moduladores de los mismos descritos también pueden ser empleados como agentes terapéuticos. Los polipéptidos de FGF-19 y los moduladores de los mismos de la presente invención pueden ser formulados de acuerdo con los métodos conocidos para preparar las composiciones que son útiles farmacéuticamente, por lo cual el producto de FGF-19 de los mismos es combinado de manera mezclada con un vehículo portador farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones terapéuticas son preparadas para almacenamiento por el mezclado del ingrediente activo que tiene el grado deseado de pureza con los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables fisiológticamente, opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16/a. edición, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de las formulaciones liofilizados o las soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los pacientes o receptores a las dosificaciones y las concentraciones empleadas, e incluyen los amortiguadores tales como el fosfato, citrato u otros ácidos orgánicos; los antioxidantes incluyen el ácido ascórbico, los polipéptidos de peso molecular bajo (menos de aproximadamente 10 residuos) ; las proteínas tales como la albúmina del suero, la gelatina o las inmunoglobulinas; los polímeros hidrofílicos tales como la polivinilpirrolidona, los aminoácidos tales como la glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen la glucosa, mañosa, o dextrinas; los agentes de quelación tales como el EDTA; los alcoholes de azúcar tales como el manitol o sorbitol; los contraiones formadores de sales tales como el sodio; y/o los agentes tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o PEG. Las formulaciones que van a ser utilizadas para la administración in vivo deben ser estériles. Esto es efectuado fácilmente por la filtración a través de membranas de filtración estériles, previo a o a continuación de la liofilización y reconstitución. Las composiciones terapéuticas de aquí generalmente son colocadas en un recipiente que tiene una abertura de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o frasco pequeño que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. La ruta de administración es de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo inyección o infusión por las rutas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, infraocular, intraarterial o intralesional, la administración tópica, o por sistemas de liberación sostenida. Las dosificaciones y las concentraciones del fármaco deseadas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden hacer variar dependiendo del uso particular contemplado. La determinación de la dosificación o ruta de administración apropiada está dentro de la experiencia ordinaria de un médico. Los experimentos con animales proporcionan una guía confiable para la determinación de las dosis efectivas para la terapia humana. El escalamiento de las interespecies de las dosis efectivas puede ser efectuado siguiendo los principios establecidos por Mordenti, J. y Chappell, W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" en Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96. Cuando se emplea la administración in vivo de un polipéptido de FGF-19 o es empleado un agonista o antagonista del mismo, las cantidades de la dosificación normal pueden variar desde aproximadamente 10 ng/kg hasta 100 mg/kg de peso corporal del mamífero o más por día, preferentemente de manera aproximada de 1 µg/kg/día hasta 10 mg/kg/día, dependiendo de la ruta de administración. La guía para las dosificaciones y métodos particulares de suministro es provista en la literatura; véanse, por ejemplo, las Patentes U.S. Nos. 4,657,760; 5,206,344; o 5,225,212. Se anticipa que diferentes formulaciones serán efectivas para los diferentes compuestos de tratamiento y los diferentes desordenes, que la administración para ubicar como blanco un órgano o tejido, por ejemplo, puede necesitar el suministro de una manera diferente de aquella para otro órgano o tejido. En donde la administración de liberación sostenida de un polipéptido de FGF-19 o modulador sea deseada en una formulación con características de liberación adecuadas para el tratamiento de cualquier enfermedad o desorden que requiera la administración del polipéptido o modulador de FGF-19, la microencapsulación es contemplada. La microencapsulación de las proteínas recombinantes para la liberación sostenida ha sido efectuada exitosamente con la hormona del crecimiento humano (rhGH) , interferon- (rhIFN-) , interleucina-2, y MN rgp 120. Johnshon et al., Nat.Med. , 2:795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27:1221-1223; Hora et al., Bio/Technology, 8:755-758 (1990); Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglicolide Microsphere Systems", en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell y Newman, eds, (Plenum Press: New York, 1995), pp. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; y la Patente U.S. No. 5,654,010. Las formulaciones de liberación sostenida de estas proteínas fueron desarrolladas utilizando el polímero del ácido poliláctico-coglicólico debido a su biocampatibilidad y amplio intervalo de propiedades biodegradables. Los productos de degradación de PLGA, los ácidos láctico y glicólico pueden ser desechados rápidamente dentro del cuerpo humano. Además, la degradabilidad de este polímero puede ser ajustada desde meses hasta años dependiendo de su peso molecular y composición. Lewis, "Controlled reléase of biactive agents from lactide/glycolide polymer", en: M. Chasin y R. Langer (Eds.), Biodegradable Polymers as Drugs Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41. Los agentes terapéuticos y composiciones que comprenden el FGF-19 provistas aquí, pueden ser utilizadas en varias aplicaciones. Las aplicaciones incluyen el tratamiento de un individuo con obesidad o una condición asociada con la obesidad. En un aspecto, el FGF-19 es administrado a un individuo que tenga la necesidad del mismo en una cantidad efectiva para tratar la condición. Preferentemente, la condición es una la cual requiere que al menos una de las siguientes sea tratada: un incremento en el metabolismo, una reducción en el peso corporal, una reducción en la grasa del cuerpo, una reducción de los niveles de triglicéridos, una reducción en los ácidos grasos libres, un incremento en la liberación de glucosa desde los adipocitos y/o un incremento en la liberación de la leptina desde los adipocitos. Cada uno de estos parámetros puede ser medido por los métodos estándares, por ejemplo, midiendo el consumo de oxígeno para determinar la velocidad metabólica, utilizando escalas para determinar el peso, y midiendo el tamaño para determinar la grasa. Además, la presencia y la cantidad de los triglicéridos, los ácidos grasos libres, la glucosa y la leptina pueden ser determinadas por los métodos estándares . Cada uno de estos parámetros es ejemplificado posteriormente en los ejemplos específicos. El FGF-19 y las composiciones que comprenden el FGF-19 son utilizadas preferentemente in vivo. Sin embargo, como se describe posteriormente, la administración puede ser in vivo tal como en los métodos descritos posteriormente para la selección de los moduladores del FGF-19. Aunque, se entiende que los moduladores de FGF-19 también pueden ser identificados por el uso de los modelos de animales y las muestras de los pacientes. Esta invención abarca los métodos de selección de los compuestos para identificar aquellos que igualan o mejoran al polipéptido de FGF-19 (agonistas) o previenen o inhiben el efecto del polipéptido de FGF-19 (antagonistas) . Los agonistas y antagonistas son referidos como moduladores aquí . Los ensayos de selección para los candidatos del fármaco antagonista son diseñados para identificar los compuestos que se unen o forman un complejo con los polipéptidos de FGF-19 codificados por los genes identificados aquí, o que interfieren de otra manera con la interacción de los polipéptidos codificados con otras proteínas celulares. Tales ensayos de selección incluirán ensayos que son capaces de una selección de alto rendimiento de las bibliotecas químicas, haciéndolas particularmente adecuadas para la identificación de los cantidades del fármaco de moléculas pequeñas . Los ensayos pueden ser efectuados en una variedad de formatos, incluyendo los ensayos de unión de proteína-proteína, los ensayos de selección bioquímica, los inmunoensayos, y los ensayos basados en las células, los cuales están bien caracterizados en el arte. Todos los ensayos para los antagonistas son comunes porque los mismos pueden requerir poner en contacto el fármaco candidato con un polipéptido de FGF-19 codificado por un ácido nucleico identificado aquí bajo las condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que interaccionen estos dos componentes.

En los ensayos de unión o aglutinación, la interacción es la unión o aglutinación y el complejo formado puede ser aislado o detectado en la mezcla de la reacción. En una modalidad particular, el polipéptido de FGF-19 codificado por el gen identificado aquí o el fármaco candidato es inmovilizado sobre una fase sólida, por ejemplo, sobre una placa de microtitulación, por uniones o fijaciones covalentes o no covalentes. La unión o fijación no covalente es efectuada generalmente recubriendo la superficie sólida con una solución del polipéptido de FGF-19 y secándola. Alternativamente, un anticuerpo inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, específico para el polipéptido de FGF-19 que va a ser inmovilizado, puede ser utilizado para fijarlo a una superficie sólida. Este ensayo es efectuado agregando el componente no inmovilizado, el cual puede ser etiquetado por una etiqueta detectable, al componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que contiene el componente fijado. Cuando se complementa la reacción, los componentes que no reaccionaron son removidos, por ejemplo, por lavado, y los complejos fijados sobre la superficie sólida son detectados . Cuando el componente no inmovilizado originalmente lleva una etiqueta detectable, la detección de la etiqueta inmovilizada sobre la superficie indica que la formación del complejo ha ocurrido. En donde el componente no inmovilizado originalmente no lleva una etiqueta, la formación del complejo puede ser detectada, por ejemplo, utilizando un anticuerpo etiquetado que se une específicamente al complejo inmovilizado. Si el compuesto candidato interactúa con, pero no se une a un polipéptido de FGF-19 particular codificado por un gen identificado aquí, su interacción con estos polipéptidos puede ser evaluada por los métodos bien conocidos para detectar las interacciones de proteína-proteína. Tales ensayos incluyen los enfoques tradicionales, tales como, por ejemplo, la reticulación, la co-inmunoprecipitación, y la co-purificación por medio de columnas de gradientes o cromatográficas. Además, las interacciones de proteína-proteína pueden ser verificadas utilizando un sistema genético a base de levadura descrito por Fields y colaboradores (Fields and Song, Nature (London) , 340:245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582 (1991)) como se describe por Chevray y Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991) . Muchos activadores transcripcionales, tales como GAL4 de levadura,-consisten de dos dominios modulares discretos físicamente, uno que actúa como el dominio de unión del ADN, el otro que funciona como el dominio de transcripción-activación. El sistema de expresión de levadura descrito en las publicaciones precedentes (referidas generalmente como el "sistema de dos híbridos") aprovecha la ventaja de esta propiedad, y emplea las proteínas de dos híbridos, uno en el cual la proteína de blanco es fusionada al dominio de unión del ADN de GAL4, y otro, en el cual las proteínas de activación del candidato son fusionadas al dominio de activación. La expresión de un gen reportero de GALl-laci. bajo el control de un promotor activado con GAL4 depende de la reconstitución de la actividad de GAL4 por medio de la interacción de proteína-proteína. Las colonias que contienen los polipéptidos de interacción son detectados con un substrato cromogénico para la ß-galactosidasa. Un juego completo (MATCHMAKER™) para la identificación de las interacciones de proteína-proteína entre dos proteínas específicas que utilizan la técnicas de dos híbridos está disponible comercialmente de Clontech. Este sistema también puede ser extendido para convertir en un mapa los dominios de la proteína involucrados en las interacciones de la proteína específicos así como los residuos de aminoácidos identificados con precisión que son cruciales para estas interacciones . Los compuestos que interfieren con la interacción de un gen que codifica un polipéptido de FGF-19 identificado aquí y otros componentes intra o extra-celulares, pueden ser probados como sigue: usualmente una mezcla de reacción es preparada conteniendo el producto del gen y el componente intra- o extra-celular bajo las condiciones y durante un tiempo que permita la interacción y la unión de los dos productos. Para probar la capacidad de un compuesto candidato para inhibir la unión o aglutinación, la reacción se hace trabajar en la ausencia y en la presencia del compuesto de prueba. Además, un placebo puede ser agregado a una tercera mezcla de la reacción, para servir como un control positivo. La unión o aglutinación (formación del complejo) entre el compuesto de prueba y el componente intra- o extra-celular presente en la mezcla es verificado como se describió aquí anteriormente. La formación de un complejo en la(s) reacción (es) de control pero no en la mezcla de la reacción que contiene el compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba interfiere con la interacción del compuesto de prueba y su compañero de la reacción. Para la evaluación de los antagonistas, el polipéptido de FGF-19 puede ser agregado a una célula en compañía del compuesto que va a ser seleccionado para una actividad particular y la capacidad del compuesto para inhibir la actividad de interés en la presencia del polipéptido de FGF-19 indica que el compuesto es un antagonista para el polipéptido de FGF-19. Alternativamente, los antagonistas puede ser detectados combinando el polipéptido de FGF-19 y un antagonista potencial con los receptores del polipéptido de FGF-19 unidos a la membrana o los receptores recombinantes bajo las condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitivo. El polipéptido de FGF-19 puede ser etiquetado, tal como por radioactividad, de tal modo que el número de las moléculas del polipéptido de FGF-19 unidas al receptor puedan ser utilizadas para determinar la efectividad del antagonista potencial. El gen que codifica el receptor puede ser identificado por los numerosos métodos conocidos por aquellos con experiencia en el arte, por ejemplo, la extensión del ligando y la clasificación de FACS. Coligan et al., Current Protocols in Immun. , 1(2): Capítulo 5 (1991). Preferentemente, la clonación de la expresión es empleada en donde el ARN poliadenilado es preparado a partir de una célula de respuesta al polipéptido de FGF-19 y una biblioteca del ADNc creada a partir de este ARN es didivida en grupos y utilizada para transfectar las células de COS u otras células que no son de respuesta para el polipéptido de FGF-19. Las células transfectadas que se hacen crecer en portaobjetos de vidrio son expuestas al polipéptido de FGF-19 etiquetado. El polipéptido de FGF-19 puede ser etiquetado por una variedad de medios que incluyen la yodación o la inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína cinasa específica para el sitio. A continuación de la fijación e incubación, los portaobjetos son sometidos a análisis autorradiográfico. Los grupos positivos son identificados y los subgrupos son preparados y retransfectados utilizando un proceso de reselección y subagrupación interactivo, eventualmente produciendo un clon único que codifica el receptor supuesto. Como un enfoque alternativo para la identificación del receptor, el polipéptido de FGF-19 etiquetado puede ser enlazado por fotoafinidad con las preparaciones del extracto o la membrana celular que expresan la molécula receptora. El material reticulado es resuelto por PAGE y expuesto a una película de rayos X. El complejo etiquetado que contiene el receptor puede ser escindido, resuelto en fragmentos del péptido, y sometido a microsecuenciación de la proteína. La secuencia de aminoácidos obtenida de la microsecuenciación podría ser utilizada para diseñar un conjunto de sondas de oligonucleótidos degeneradas para seleccionar una biblioteca de ADNc para identificar el gen que codifica el receptor supuesto. En otro ensayo para los antagonistas, las células de mamífero o una preparación de membrana que expresa el receptor podría ser incubada con el polipéptido de FGF-19 en la presencia de un compuesto candidato. La capacidad del compuesto para mejorar o bloquear esta interacción podría ser medida entonces . Los ejemplos más específicos de los antagonistas potenciales incluyen un oligonucleótido que se une a las fusiones de la inmunoglobulina con el polipéptido de FGF-19, y, en particular, los anticuerpos que incluyen, sin limitación, los anticuerpos poli- y monoclonales y los fragmentos de anticuerpo, los anticuerpos de una sola cadena, los anticuerpos anti-idiotípicos, y las versiones quiméricas o humanizada de tales anticuerpos o fragmentos, así como los anticuerpos humanos y los fragmentos de anticuerpos . Alternativamente, un antagonista potencial puede ser una proteína relacionada estrechamente, por ejemplo, una forma mutada del polipéptido de FGF-19 que reconoce el receptor pero no imparte ningún efecto, por lo cual inhibe competitivamente la acción del polipéptido de FGF-19. En una modalidad de aquí, en donde los ensayos de unión competitiva son efectuados, el receptor 4 de FGF o un anticuerpo para el FGF-19 es utilizado como un competidor. Otro antagonista del polipéptido de FGF-19 potencial es una construcción de ARN o ADN de antisentido preparada utilizando la tecnología antisentido, en donde, por ejemplo, una molécula de ARN o ADN de antisentido actúa para bloquear directamente la traducción del ARNm por la hibridación al blanco de ARNm y prevenir la traducción de la proteína. La tecnología de antisentido puede ser utilizada para controlar la expresión del gen a través de la formación de triple hélice o el ADN o ARN de antisentído, ambos de tales métodos están basados en la unión o aglutinación de un polinucleótido para el ADN o ARN. Por ejemplo, la porción de codificación 51 de la secuencia de polinucleótidos, la cual codifica los polipéptidos de FGF-19 maduros, es utilizada para diseñar un oligonucleótido de ARN de antisentido desde aproximadamente 10 hasta 40 pares base de longitud. Un oligonucleótido del ADN está diseñado para que sea complementario con una región del gen involucrada en la transcripción (triple hélice - véase Lee et al., Nucí . Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), por lo cual se previene la transcripción y la producción del polipéptido de FGF-19. El oligonucleótido de ARN de antisentido se hibridiza al ARNm in vivo y la traducción de los bloques de la molécula del ARNm en el polipéptido de FGF-19 (antisense - Okano, Neurochem. , 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expressión (CRC Press: Boca Ratón, FL, 1988) . Los oligonucleótidos descritos anteriormente también pueden ser suministrados a las células de tal modo que el ARN o ADN antisentido puedan ser expresados in vivo para inhibir la producción del polipéptido de FGF-19. Cuando el ADN antisentido es utilizado, los oligodesoxirribonucleótidos derivados del sitio de inicio de la traducción, por ejemplo, entre las posiciones de aproximadamente -10 y +10 de la secuencia de nucleótidos del gen de blanco, son preferidos. Los antagonistas potenciales incluyen las moléculas pequeñas que se unen al sitio activo, el sitio de unión del receptor, o el factor de crecimiento u otro sitio de unión relevante del polipéptido de FGF-19, por lo cual se bloquea la actividad biológica normal del polipéptido de FGF-19. Los ejemplos de las moléculas pequeñas incluyen, pero no están limitadas a, los péptidos o las moléculas semejantes a los péptidos, pequeñas, preferentemente los péptidos solubles, y los compuestos orgánicos o inorgánico diferentes del peptidilo, sintéticos. Los ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas capaces de catalizar la segmentación específica del ARN. Los ribozimas actúan por la hibridación específica de la secuencia de blanco del ARN complementario, seguido por la segmentación endonucleolítica. Los sitios de segmentación del ribozima específicos dentro de un blanco de ARN potencial pueden ser identificados por las técnicas conocidas. Para los detalles adicionales véase, por ejemplo, Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994), y la publicación PCT No. WO 97/33551 (publicada el 18 de septiembre de 1997) . Las moléculas de ácido nucleico en la formación de triple hélice utilizadas para inhibir la transcripción deben de ser de un sola hebra y compuesta de los desoxinucleótidos . La composición base de estos oligonucleótidos está diseñada de tal modo que la misma promueva la formación de triple hélice por medio de las reglas de formación de parejas base de Hoogsteen, las cuales requieren generalmente los estiramientos dimensionables de las purinas o pirimidinas sobre una hebra de un duplexo. Para los detalles adicionales véase, por ejemplo, la publicación PCT No. WO 97/33551, supra. Estas moléculas pequeñas pueden ser identificadas por cualquiera de uno o más de los ensayos de selección descritos aquí anteriormente y/o por cualquiera otras técnicas de selección bien conocidas por aquellos expertos en el arte. Se apreciará que todos los ensayos provistos aquí pueden ser utilizados para seleccionar una amplia variedad de agentes bioactivos candidatos. El término "agente bioactivo candidato", "agente candidato" o "fármaco candidato" o los equivalentes gramaticales como se utilizan aquí, describen cualquier molécula, por ejemplo proteína, oligopéptido, molécula orgánica pequeña, polisacárido, polinucleótido, análogo de purina, etc., que va a ser probado para los agentes bioactivos que son capaces de alterar directa o indirectamente ya sea el fenotipo de la actividad celular o la expresión de una secuencia de FGF-19, incluyendo tanto las secuencias de ácido nucleico como las secuencias de la proteína. Los agentes candidatos pueden abarcar numerosas clases químicas, aunque las mismas típicamente son moléculas orgánicas, preferentemente compuestos orgánicos pequeños que tiene un peso molecular de más de 100 y menos de aproximadamente 2,500 daltons (d) . Las moléculas pequeñas son definidas adicionalmente aquí teniendo un peso molecular de entre 50 d y 2000 d. En otra modalidad, las moléculas pequeñas tienen un peso molecular de menos de 1500, o menos de 1200, o menos de 1000, o menos de 750, o menos de 500 d. En una modalidad, una molécula pequeña como es utilizada aquí tiene un peso molecular de aproximadamente 100 a 200 d. Los agentes candidatos comprenden los grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con las proteínas, particular la unión del hidrógeno, y típicamente incluyen al menos un grupo de amina, carbonilo, hidróxilo o carboxilo, preferentemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos frecuentemente comprenden estructuras heterocíclicas o de carbonos cíclicos y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas substituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. Los agentes candidatos también son encontrados entre las biomoléculas que incluyen los péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Son preferidos particularmente los péptidos. Los agentes candidatos son obtenidos a partir de una amplia variedad de fuentes incluyendo las bibliotecas de los compuestos naturales o sintéticos. Por ejemplo, numerosos medios están disponibles para la síntesis al azar o dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la expresión de los oligonucleótidos al azar. Alternativamente, las bibliotecas de los compuestos naturales en la forma de los extractos bacterianos, fungosos, vegetales y animales están disponibles o son producidos fácilmente. De manera adicional, las bibliotecas y los compuestos producidos natural o sintéticamente son modificados fácilmente a través de los medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales. Los agentes farmacológicos conocidos pueden ser sometidos a modificaciones químicas dirigidas o al azar, tales como la acilación, alquilación, esterificación, a idificación, para producir análogos estructurales. En una modalidad preferida, los agentes bioactivos candidatos son proteínas. Por "proteína" se entiende aquí al menos dos aminoácidos unidos covalentemente, los cuales incluyen las proteínas, polipéptidos, oligopéptidos y péptidos. La proteína puede estar compuesta de los aminoácidos que están presentes de manera natural y los enlaces de péptidos, o las estructuras peptidomiméticas sintéticas. Por consiguiente "aminoácidos", o "residuo de aminoácidos", como se utiliza aquí, significa los aminoácidos tanto sintéticos como los que están presentes de manera natural. Por ejemplo, la homo-fenilalanina, la citrulina y la norleucina son consideradas como aminoácidos para los propósitos de la invención. Los "aminoácidos" también incluyen los residuos de iminoácidos tales como la prolina y la hidroxiprolina. Las cadenas laterales pueden ser de la configuración ya sea (R) o (S) . En la modalidad preferida, los aminoácidos están en la configuración (S) o L. Si se utilizan las cadenas laterales que están presentes de manera no natural, se pueden utilizar substituyentes diferentes de los aminoácidos, por ejemplo para prevenir o retardar las degradaciones in vivo.

En una modalidad preferida, los agentes bioactivos candidatos son las proteínas que están presentes de manera natural o los fragmentos de las proteínas que están presentes de manera natural. Así, por ejemplo, los extractos celulares que contienen las proteínas, o las disoluciones al azar o dirigidas de los extractos celulares proteináceos, pueden ser utilizados. De esta manera las bibliotecas de las proteínas procarióticas o eucarióticas se pueden hacer por selección en los métodos de la invención. Son preferidas particularmente en esta invención las bibliotecas de las proteínas de bacterias, hongos, virus, y mamíferos, con éstas últimas que son preferidas, y las proteínas humanas que son preferidas especialmente. En una modalidad preferida, los agentes bioactivos candidatos son péptidos desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 30 aminoácidos, con desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 20 aminoácidos que son preferidos, y desde aproximadamente 7 hasta aproximadamente 15 que son preferidos particularmente. Los péptidos pueden ser diluciones de las proteínas que están presentes de manera natural como se describió anteriormente, péptidos al azar, o péptidos al azar "cambiados". Por los equivalentes "al azar" o gramaticales de aquí se entiende que cada ácido nucleico y péptido consiste esencialmente de nucleótidos y aminoácidos al azar, respectivamente. Puesto que generalmente estos péptidos al azar (o ácido nucleico, descritos posteriormente) son sintetizados químicamente, los mismos pueden incorporar cualesquiera nucleótidos o aminoácidos en cualquier posición. El proceso sintético puede ser diseñado para generar las proteínas o ácido nucleico al azar, para permitir la formación de la totalidad o la mayoría de las combinaciones posibles sobre la longitud de la secuencia, formando así una biblioteca de los agentes proteináceos bioactivos candidatos al azar. En una modalidad, la biblioteca es totalmente al azar, sin preferencias de la secuencia o las constantes en cualquier posición. En una modalidad preferida, la biblioteca es cambiada. Es decir, algunas posiciones dentro de la secuencia son ya sea mantenidas constantes, o son seleccionadas de un número limitado de posibilidades. Por ejemplo, en una modalidad preferida, los nucleótidos o residuos de aminoácidos son distribuidos al azar dentro de una clase definida, por ejemplo, de aminoácidos hidrofóbicos, residuos hidrofóbicos, residuos cambiados estéricamente (ya sea pequeños o grandes) , hacia la creación de dominios de unión del ácido nucleico, la creación de cisteínas, para la reticulación, las prolinas para los dominios de SH-3, las serinas, treoninas, tirosinas o histidinas para los sitios de fosforilación, etc., o para las purinas, etc. En una modalidad preferida, los agentes bioactivos candidatos son los ácidos nucleicos. Por "ácido nucleico" u "oligonucleótido" o equivalentes gramaticales de aquí se entiende al menos dos nucleótidos enlazados covalentemente de manera conjunta. Un ácido nucleico para la presente invención contendrá generalmente los enlaces de fosfodiéster, aunque en algunos casos, como se describe posteriormente, los análogos de ácido nucleico están incluidos, los cuales pueden tener esqueletos alternativos, que comprenden, por ejemplo, la fosforamida (Beaucage et al., Tetrahedron 49 (10) : 1925 (1993) y las referencias de allí; Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 (1970); Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81:579 (1977); Letsinger et al., Nucí. Acids Res. 14:3487 (1986); Sawai et al, Chem. Lett. 805 (1984), Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); y Pauwels et al., Chemica Scripta 26:141 91986)), fosforotioato (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:1437 (1991); y la Patente U.S. No. 5,644,048), fosforoditioato (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321 (1989) , enlaces de O-metilfosforoamidita (véase Eckstein, Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, Oxford Uníversity Press) , y esqueletos y enlaces de ácido nucleico del péptido (véase Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895 (1992); Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31:1008 (1992); Nielsen, Nature, 365:566 (1993); Carlsson et al., Nature 380:207 (1996) , la totalidad de los cuales son incorporados para referencia) . Otros ácidos nucleicos análogos incluyen aquellos con los esqueletos positivos (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 (1995); los esqueletos no iónicos (Patente U.S. Nos. 5,386,023, 5,637,684, 5,602,240, 5,216,141 y 4,469,863; Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 (1991); Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 (1988); Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13:1597 (1994); Capítulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui y P. Dan Cook; Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 (1994), Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34:17 (1994); Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)) y esqueletos diferentes de la ribosa, incluyendo aquellos descritos en las Patentes U.S. Nos. 5,235,033 y 5,034,506, y los Capítulos 6 y 7 del ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghui y P. Dan Cook; Mesmaeker. Los ácidos nucleicos que contienen uno o más azúcares carbocíclicos también están incluidos dentro de la definición de los ácidos nucleicos (véase Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. (1995) pp.169-176). Varios análogos de los ácidos nucleicos son descritos en Rawls, C & E News 2 de junio de 1997 página 35. La totalidad de estas referencias son incorporadas expresamente aquí para referencia. Estas modificaciones del esqueleto de ribosa-fosfato se pueden hacer para facilitar la adición de las porciones adicionales tales como las etiquetas, o para incrementar la estabilidad y la vida media de tales moléculas en los medios ambientes fisiológicos. Además, se pueden hacer mezclas de los ácidos nucleicos y análogos que están presentes de manera natural . Alternativamente, se pueden hacer mezclas de diferentes análogos de ácidos nucleicos, y mezclas de los ácidos nucleicos y análogos que están presentes de manera natural. Los ácidos nucleicos pueden ser de una sola hebra o de doble hebra, como se especificó, o contienen porciones de la secuencia tanto de una sola hebra como de doble hebra. El ácido nucleico puede ser el ADN, tanto genómico como el ADNc, ARN o un híbrido, en donde el ácido nucleico contiene cualquier combinación de desoxirribo- y ribo-nucleótidos, y cualquier combinación de las bases, incluyendo uracilo, adenina, timina, citosina, guanina, inosina, xatanina, hipoxatanina, isocitosina, isoguanina, etc. Como se describió anteriormente de manera general para las proteínas, los agentes bioactivos candidatos de ácidos nucleicos, pueden ser los ácidos nucleicos que están presentes de manera natural, los ácidos nucleicos al azar, o los ácidos nucleicos al azar "cambiados". Por ejemplo, las disoluciones de los genomas procarióticos o eucarióticos pueden ser utilizadas como se describió anteriormente para las proteínas. En una modalidad preferida, los agentes bioactivos candidatos son porciones químicas orgánicas, una amplia variedad de las cuales están disponibles en la literatura. En una modalidad preferida, como se describió anteriormente, las selecciones se pueden hacer sobre los genes individuales y los productos de los genes (proteínas) . En una modalidad preferida, el gen o la proteína ha sido identificado como se describirá posteriormente en los Ejemplos como un gen expresado diferencialmente asociado con tejidos particulares y por consiguiente las condiciones relacionadas con estos tejidos. Por consiguiente, en una modalidad, las selecciones son diseñadas para los primeros agentes candidatos encontrados que se pueden unir a FGF-19, y luego estos agentes pueden ser utilizados en ensayos que evalúan la capacidad del agente candidato para modular la actividad de FGF-19. Así, como será apreciado por aquellos expertos en el arte, existen un número de diferentes ensayos los cuales se pueden hacer funcionar.

La selección de los agentes que modulan la actividad de FGF-19 también se puede hacer. En una modalidad preferida, los métodos para la selección de un agente bioactivo capaz de modular la actividad del FGF-19 comprenden los pasos de agregar un agente bioactivo candidato a una muestra del FGF-19 y determinar una alteración en la actividad biológica del FGF-19. La "modulación de la actividad del FGF-19 " incluye un incremento en la actividad, una reducción en la actividad, o un cambio en el tipo o clase de actividad presente. Por consiguiente, en esta modalidad, el agente candidato debe unirse también a FGF-19 (aunque esto puede no ser necesario) , y alterar su actividad biológica o bioquímica como se definió aquí. Los métodos incluyen ambos métodos de selección in vitro, como son descritos generalmente arriba, y la selección in vivo de las células para las alteraciones en la presencia, expresión, distribución, actividad o cantidad del FGF-19. Así, en esta modalidad, los métodos comprenden la combinación de una muestra y un agente bioactivo candidato, y evaluar el efecto sobre la actividad de FGF-19. Por "actividad de la proteína de FGF-19" o los equivalentes gramaticales aquí, se entiende al menos una de las actividades biológicas de la proteína de FGF-19 como se describieron anteriormente.

En una modalidad preferida, la actividad de la proteína de FGF-19 es incrementada; en otra modalidad preferida, la actividad de la proteína de FGF-19 es reducida. Por consiguiente, los agentes bioactivos que son antagonistas son preferidos en algunas modalidades, y los agentes bioactivos que son los agonistas pueden ser preferidos en otras modalidades. En un aspecto de la invención, las células que contienen las secuencias de FGF-19 son utilizadas en los ensayos de selección del fármaco evaluando el efecto de los candidatos del fármaco sobre el FGF-19. El tipo de célula incluye las células normales, las células tumorígenas, y los adipocitos. Los métodos de evaluación de la actividad de FGF-19 tales como los cambios en la absorción de la glucosa, la liberación de la leptina, el metabolismo, los niveles de triglicéridos y de ácidos grasos libres, el peso corporal y la grasa corporal, ya son conocidos en el arte y son ejemplificados posteriormente en los ejemplos. En una modalidad preferida, los métodos comprenden agregar un agente bioactivo candidato, como se definió anteriormente, a una célula que comprende el FGF-19. Los tipos de células preferidas incluyen casi cualquier célula. Las células contienen un ácido nucleico, preferentemente recombinante, que codifica una proteína de FGF-19. En una modalidad preferida, una biblioteca de los agentes candidatos es probada sobre una pluralidad de las células. En un aspecto, los ensayos son evaluados en la presencia o ausencia o exposición subsiguiente a las señales fisiológicas, por ejemplo las hormonas, anticuerpos, péptidos, antígenos, citocinas, factores de crecimiento, potenciales de acción, agentes farmacológicos que incluyen las substancias quimioterapéuticas, radiación, carcinogénesis, u otras células (es decir contactos de célula-célula) . En otro ejemplo, las determinaciones son determinadas en diferentes etapas del proceso del ciclo celular. Las secuencias de FGF-19 provistas aquí también pueden ser utilizadas en los métodos de diagnóstico. La sobrexpresión del FGF-19 puede indicar una velocidad metabólica anormalmente elevada y la subexpresión puede indicar que la persona es propensa a la obesidad. Además, una muestra de un paciente puede ser analizada para verificar el FGF-19 mutado o disfuncional. En general, tales métodos incluyen comparar una muestra de un paciente y comparar la expresión del FGF-19 con aquella de un control.

F. Anticuerpos Anti-FGF-19 La presente invención proporciona además anticuerpos anti-FGF-19. Los anticuerpos ejemplares incluyen los anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, biespecíficos, y los anticuerpos heteroconjugados. 1. Anticuerpos Policlonales Los anticuerpos anti-FGF-19 pueden comprender los anticuerpos policlonales. Los métodos de preparación de los anticuerpos policlonales ya son conocidos por el artesano experto. Los anticuerpos policlonales pueden ser realzados en un mamífero, por ejemplo, por una o más inyecciones de un agente de inmunización y, si se desea, un auxiliar. Típicamente, el agente de inmunización y/o auxiliar serán inyectados en el mamífero por inyecciones intraperitoneales o subcutáneas múltiples. El agente de inmunización puede incluir el polipéptido de FGF-19 o una proteína de fusión del mismo. Puede ser útil conjugar el agente de inmunización con una proteina que se sabe que va a ser inmunogénica en el mamífero que es inmunizado. Los ejemplos de tales proteínas inmunogénicas incluyen pero no están limitadas a la hemocianina de la lapa marina, la albúmina del suero, la tiroglobulina del bovino, y el inhibidor de la tripsina de soya. Los ejemplos de los auxiliares que pueden ser empleados incluyen el auxiliar completo de Freund y el auxiliar de MPL-TDM (Monofosforil Lípido A, dicorinomicolato de trehalosa sintético) . El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por una persona con experiencia en el arte sin experimentación indebida. 2. Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos de anti-FGF-19 pueden ser anticuerpos monoclonales, alternativamente. Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados utilizando los métodos del hibridoma, tales como aquellos descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un método del hibridoma, un ratón, hámster, u otro animal huésped apropiado, es inmunizado típicamente con un agente de inmunización para producir linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al agente de inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. El agente de inmunización típicamente incluirá el polipéptido de FGF-19 o una proteína de fusión del mismo. En general, cualesquiera linfocitos sanguíneos periféricos ("PBLs") son utilizados si se desean células de origen humano, o las células del bazo o las células de los nodos linfáticos son utilizadas si se desean fuentes de mamífero diferentes de las humanas. Los linfocitos son fusionados entonces con una línea celular inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como el polietilenglicol, para formar una célula del hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103] . Las líneas celulares inmortalizadas son células de mamífero transformadas usualmente, particularmente las células del mieloma de origen de roedor, bovino y humano. Usualmente, se emplean las líneas celulares del mieloma de la rata o el ratón. Las células del hibridoma pueden ser cultivadas en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más substancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células inmortalizadas, no fusionadas. Por ejemplo, si las células originales o paternales carecen de la enzima de hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá la hipoxantina, aminopterina, y timidina ("medio HAT"), tales substancias previenen el crecimiento de las células deficientes en HGPRT. Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la expresión a nivel elevado estable del anticuerpo por las células productoras de los anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio de HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son las líneas de mieloma de murino, las cuales pueden ser obtenidas, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y el American Type Culture Collection, Manassás, Virginia. Las líneas celulares del heteromieloma humano-ratón y del mielona humano también han sido descritas para la producción de los anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63]. El medio de cultivo en el cual las células del hibridoma son cultivadas pueden ser evaluadas entonces para verificar la presencia de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el FGF-19. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células del hibridoma es determinada por la inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como el radioinmunoensayo (RÍA) o el ensayo inmunoabsorbente enlazado a las enzimas (ELISA) . Tales ensayos y técnicas ya son conocidas en el arte. La afinidad de la unión del anticuerpos monoclonales, por ejemplo, puede ser determinada por el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal . Biochem. 107:220 (1980) .

Después que las células del hibridoma deseadas son identificadas, los clones pueden ser subclonados por los procedimientos de dilución limitantes y se hacen crecer por los métodos estándares [Goding, supra] . Los medios de cultivo apropiados para este propósito incluyen, por ejemplo el Medio de Eagle Modificado de Dulbecco y el medio RPMI-1640. Alternativamente, las células del hibridoma se pueden hacer crecer in vivo como los ascitos en un mamífero. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones pueden ser aislados o purificados a partir del medio de cultivo o el fluido de los ascitos por los procedimientos de purificación de la inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, la proteína A-Sepharose, la cromotografía con hidroxilaparita, la electrofóresis del gel, la diálisis, o la cromatografía de afinidad. Los anticuerpos monoclonales también se pueden hacer por los métodos de ADN recombinantes, tales como aquellos descritos en la Patente U.S. No. 4,816,567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención pueden ser aislados y secuenciados fácilmente utilizando los procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando las sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos de murino) . Las células del hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede ser colocado en los vectores de la expresión, los cuales son transfectados en las células huésped tales como las células COS del simio, las células de los ovarios del hámster Chino (CHO) , o las células del mieloma que no producen de otra manera la proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes . El ADN también puede ser modificado, por ejemplo, substituyendo la secuencia de codificación por los dominios constantes de la cadena ligera y pesada, humanos, en lugar de las secuencias de murino homologas [Patente U.S. No. 4,816,567; Morrison et al., supra] o por la unión covalente a la secuencia de codificación de la inmunoglobulina de la totalidad o una parte de la secuencia de codificación para un polipéptido diferente de la inmunoglobulina. Tal polipéptido diferente de la inmunoglobulina puede ser substituido por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o pueden ser substituidos por los dominios variables de un sitio de combinación del antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monovalentes . Los métodos de preparación de los anticuerpos monovalentes son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, un método involucra la expresión recombinante de la cadena ligera de inmunoglobulina y la cadena pesada modificada. La cadena pesada es truncada generalmente en cualquier punto en la región de Fc para prevenir la reticulación de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes son substituidos con otro residuo de aminoácidos o son delecionados para prevenir la reticulación. Los métodos in vi tro también son adecuados para la preparación de los anticuerpos monovalentes. La digestión de los anticuerpos para producir los fragmentos de los mismos, particularmente, los fragmentos Fab, pueden ser efectuados utilizando las técnicas de rutina conocidas en el arte. 3. Anticuerpos Humanos y Humanizados Los anticuerpos de anti-FGF-19 pueden comprender además los anticuerpos humanizados o los anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, del murino) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de la misma (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión del antígeno de los anticuerpos) los cuales contienen la secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen las inmunoglobulinas humanas (el anticuerpo del receptor) en las cuales los residuos de una región de determinación complementaria (CDR) del receptor o paciente son reemplazados por los residuos de un CDR de una especie no humana (anticuerpo del donador) tal como del ratón, la rata o el conejo, que tienen una especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la estructura de Fv de la inmunoglobulina humana son reemplazados por los residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender los residuos los cuales no son encontrados ni en el anticuerpo del receptor o paciente ni en las secuencias de CDR o de la estructura importadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales la totalidad o substancialmente la totalidad de las regiones de CDR corresponde a aquellas de una inmunoglobulina no humana y la totalidad o substancialmente la totalidad de las regiones de FR son aquellas de una secuencia de consenso de la inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanizados de manera óptima también comprenderán al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc) , típicamente aquella de una inmunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr.Op. Struct .Biol. , 2:593-596 (1992)]. Los métodos para la humanización de los anticuerpos no humanos ya son conocidos en el arte. De manera general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo a partir de una fuente la cual es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos son referidos frecuentemente como residuos de "importación", los cuales son tomados típicamente de un dominio variable de "importación". La humanización puede ser efectuada esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 329:1534-1536 (1988)], substituyendo las secuencias de CDR o CDRs del roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente U.S. No. 4,816,567), en donde substancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido substituido por la secuencia correspondiente desde una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente los anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR son substituidos por los residuos desde los sitios análogos en los anticuerpos del roedor.

Los anticuerpos humanos también pueden ser producidos utilizando varias técnicas conocidas en el arte, incluyendo las bibliotecas de exhibición del fago [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J^ Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Las técnicas de Colé et al., y Boerner et al., también están disponibles para la preparación de los anticuerpos monoclonales humanos (Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991)]. De manera semejante, los anticuerpos humanos se pueden hacer introduciendo los sitios de inmunoglobulina humana en los animales transgénicos, por ejemplo, los ratones en los cuales los genes de inmunoglobulina endógenos han sido inactivados parcial o completamente. Durante la estimulación, es observada la producción de los anticuerpos humanos, la cual se asemeja estrechamente a aquella observada en los seres humanos en todos los aspectos, incluyen el rearreglo de los genes, el acoplamiento o montaje y el repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo en las Patentes U.S. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825, 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996) ; Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995) . 4. Anticuerpos Biespecíficos Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos preferentemente humanos o humanizados, monoclonales, que tienen especificidades de la unión para al menos dos antígenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de la unión es para el FGF-19, la otra es para cualquier otro antígeno, y preferentemente para una proteína o receptor o subunidad receptora de la superficie celular. Los métodos de fabricación de los anticuerpos biespecíficos ya son conocidos en el arte. Tradicionalmente, la producción recombinante de los anticuerpos biespecíficos está basada en la coexpresión de dos pares de cadena ligera/cadena pesada de la inmunoglobulina, en donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades [Milstein Y Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. A causa de la clasificación al azar de las cadenas ligera y pesada de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez diferentes moléculas de anticuerpos, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta usualmente es efectuada por los pasos de cromatografía de afinidad. Los procedimientos semejantes son descritos en WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991). Los dominios variables de los anticuerpos con las especificidades de unión o aglutinación deseadas (sitios de combinación del anticuerpo-antígeno) pueden ser fusionadas a las secuencias del dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión preferentemente es con un dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos una parte de las regiones CH2, y CH3, de articulación. Se prefiere tener la primera región constante de la cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión o aglutinación de la cadena ligera en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, son insertadas en los vectores de expresión separados y son cotransfectados en un organismo huésped adecuado. Para los detalles adicionales de la generación de los anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986) .

De acuerdo con otra enfoque descrito en WO 96/27011, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpos puede ser diseñada para maximizar el porcentaje de heterodímeros los cuales son recuperados del cultivo celular recombinante. La interfase preferida comprende al menos una parte de la región de CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos más pequeñas desde la interfase de la primera molécula del anticuerpo son reemplazadas con cadenas laterales más grandes (por ejemplo de tirosina o triptófano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena (s) laterales grandes son creadas sobre la interfase de la segunda molécula de anticuerpos reemplazando las cadenas laterales de aminoácidos grandes con unas más pequeñas. (por ejemplo de alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre los productos finales no deseados tales como los homodímeros . Los anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos de F(ab')2). Las técnicas para generar los anticuerpos biespecíficos a partir de los fragmentos de anticuerpos han sido descritas en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados utilizando la unión o enlace químico. Brennan et al., Science 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde los anticuerpos intactos son segmentados proteolíticamente para generar los fragmentos de F(ab')2. Estos fragmentos son reducidos en la presencia de un agente formador de un complejo con ditiol, la arsenita de sodio, para estabilizar los ditioles vecinos y prevenir la formación del disulfuro intermolecular. Los fragmentos de Fab' generados son convertidos entonces a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados de Fab'-TNB es reconvertido entonces al Fab '-tiol por la reducción con la mercapetilamina y es mezclado con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden ser utilizados como agentes para la inmovilización selectiva de las enzimas . Los fragmentos de Fab' pueden ser recuperados directamente de E. coli y unidos químicamente para formar los anticuerpos biespec.íficos . Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) describe la producción de una molécula del anticuerpo biespecífico F(ab')2 humanizado totalmente. Cada fragmento de Fab' fue secretado separadamente del E. coli y sometido a unión química directa in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de unirse a las células que sobreexpresan el receptor de ErbB2 y las células T humanas normales, así como desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra los blancos del tumor del pecho humano . Varias técnicas para fabricar y aislar los fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente a partir del cultivo celular recombinante también han sido descritos. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos han sido producidos utilizando los elementos de cierre de leucina. Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5) : 1547-1533 (1992). Los péptidos del elemento de cierre de leucina de las proteínas de Fos y Jun fueron enlazadas a las porciones de Fab' de dos anticuerpos diferentes para la fusión del gen. Los homodímeros de los anticuerpos fueron reducidas en la región de articulación para formar los monómeros y luego reoxidados para formar los heterodímeros de .los anticuerpos . Este método también puede ser utilizado para la producción de los homodímeros de los anticuerpos . La tecnología de los "fragmentos de anticuerpos pequeños con dos sitios de unión del antígeno" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) ha provisto un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por un enlazador el cual es demasiado corto para permitir la agrupación como parejas entre los dos dominios sobre la misma cadena. En consecuencia, los dominios de VH y VL de un fragmento son forzados para formar una pareja con los dominios de otro fragmento, por lo cual se forman dos sitios de unión del antígeno. Otra estrategia para fabricar los fragmentos de anticuerpos biespecíficos por el uso de los dímeros de Fv de una sola cadena (sFv) también ha sido reportado. Véase, Gruber et al., J. Immunol . 152:5368 (1994). Los anticuerpos con más de dos valencias también están contemplados. Por ejemplo, se pueden preparar los anticuerpos triespecífieos. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991). Los anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden unirse a dos diferentes epítopes sobre un polipéptido de FGF-19 dado de aquí. Alternativamente, una ramificación del polipéptido de anti-FGF-19 puede ser combinado con una ramificación la cual se une a una molécula desencadenante o de activación sobre un leucocito tal como la molécula receptora de la célula T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28, o B7) , o los receptores de Fc para IgG (Fc?RIII) (DC16) para enfocar los mecanismos de defensa celular para que la célula exprese el polipéptido de FGF-19 particular. Los anticuerpos biespecíficos también pueden ser utilizados para localizar los agentes citotóxicos para las células las cuales expresan un polipéptido de FGF-19 particular. Estos anticuerpos poseen una ramificación de unión de FGF-19 y una ramificación la cual se une a un agente citotóxico o un quelador del radionúclido, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA, o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une al polipéptido de FGF-19 y además se une al factor del tejido (TF) .

. Anticuerpos Heteroconjugados Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos unidos covalentemente. Tales anticuerpos, por ejemplo, han sido propuestos para ubicar como blanco las células del sistema inmune a las células no deseadas [Patente U.S. No. 4,676,980], y para el tratamiento de la infección de VIH [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089] . Se contempla que los anticuerpos puedan ser preparados in vitro utilizando los métodos conocidos en la química de las proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que involucran los agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden ser construidas utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o formando una unión de tioéter. Los ejemplos de los reactivos adecuados para este propósito incluyen el iminotiolato. y el metil-4-mercaptobutirimidato y aquellos descritos, por ejemplo, en la patente U.S. No. 4,676,980. 6. Diseño de la Función Efectora Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, para mejorar, por ejemplo, la efectividad del anticuerpo en el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, el (los) residuo (s) de cisteína pueden ser introducidos en la región de Fc, por lo cual se permite la formación del enlace de disulfuro de la intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o un exterminio de las células mediadas por el complemento y una citoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC) , incrementadas. Véase Carón et al., J. Exp. Med., 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol . , 148: 2918-2922 (1992) . Los anticuerpos homodiméricos con la actividad antitumorígena mejorada también pueden ser preparados utilizando los reticuladores heterobifuncionales como se describió en Wolff et al., Cáncer Research, 53: 2560-2565 (1993) . Alternativamente, un anticuerpo puede ser diseñado el cual tenga regiones de Fc dobles y por lo tanto pueda tener capacidad de ADCC y de lisis del complemento mejoradas. Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989). 7. Inmunoconjugados La invención también pertenece a los inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado con un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, la toxina (por ejemplo, una toxina activa enzimáticamente de origen bacteriano, fungoso, vegetal o animal, o los fragmentos de la misma) , o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado) . Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados ya han sido descritos anteriormente. Las toxinas activas enzimáticamente y los fragmentos de las mismas que pueden ser utilizadas incluyen la cadena de la difteria A, los fragmentos activos no aglutinantes de la toxina de la difeteria, la cadena de la exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , la cadena de ricina A, la cadena de abrina A, la cadena de modeccina A, alfa-sarcina, las proteínas de Aleuri tes fordii, las proteínas de diantina, las proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , el inhibidor de la momordica charantia, curcina, crotina, el inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos. Una variedad de radionúclidos están disponibles para la producción de los anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y, y 18eRe. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se hacen utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de la proteína bifuncionales tales como el N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP) , iminotiolano (IT), los derivados bifuncionales de los imidoésteres (tales como el adipimidato de dimetilo HCL) , los esteres activos (tales como el suberato de disuccinimidilo) , los aldehidos (tales como el glutaraldehído) , los compuestos bis-azido (tales como la bis (p-azidobenzoil) hexandiamina) , los derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como el 2, 6-diisocianato de tolieno) , y los compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede ser preparada como se describió en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilentriaminpenta-acético etiquetado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente de quelación ejemplar para la conjugación del radionucleótido para el anticuerpo. Véase WO94/11026. En otra modalidad, el anticuerpo puede ser conjugado con un "receptor" (tal como la estreptavidina) para la utilización en la preubicación como blanco del tumor, en donde el conjugado del anticuerpo-receptor es administrado al paciente, seguido por la remoción del conjugado no unido de la circulación utilizando un agente de despeje o purificación y luego la administración de un "ligando" (por ejemplo, la avidina) que es conjugado con un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido) . 8. Inmunoliposomas Los anticuerpos descritos aquí también pueden ser formulados como inmunoliposomas . Las liposomas que contienen el anticuerpo son preparadas por los métodos conocidos en el arte, tal como se describe en Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y las Patentes U.S. Nos. 4,485,045 y 4,544,454. Los liposomas con un tiempo de circulación mejorado son descritos en la patente U.S. No. 5,013,556. Los liposomas particularmente útiles pueden ser generados por el método de la evaporación de fase inversa con una composición de lípidos que comprende la fosfatidilcolina, el colesterol, y la fosfatidiletanolamina derivada con PEG (PEG-PE) . Los liposomas son extruidos a través de los filtros del tamaño de poro definido para dar liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos de Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden ser conjugados a los liposomas como se describió en Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) por medio de una reacción de intercambio con disulfuro. Un agente quimioterapéutico (tal como la Doxorrubicina) está contenido opcionalmente dentro de los liposomas. Véase Gabizon et al., J. National Cáncer Inst., 81 (19) : 1484 (1989) . 9. Composiciones Farmacéuticas de los Anticuerpos Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de FGF-19 identificado aquí, así como otras moléculas identificadas por los ensayos de selección descritos aquí anteriormente, pueden ser administrados para el tratamiento de varios desórdenes en la forma de las composiciones farmacéuticas. Si el polipéptido de FGF-19 es intracelular y los anticuerpos completos son utilizados como inhibidores, se prefieren los anticuerpos de internalización. Sin embargo, las lipofecciones o los liposomas también pueden ser utilizados para suministrar el anticuerpo, o un fragmento del anticuerpo, en las células. En donde son utilizados los fragmentos del anticuerpo, el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína de blanco es preferido. Por ejemplo, con base en las secuencias de la región variable de un anticuerpo, las moléculas de los péptidos pueden designadas las cuales retienen la capacidad para la unión de la secuencia de proteína de blanco. Tales polipéptidos pueden ser sintetizados químicamente y/o producidos por la tecnología del ADN recombinante. Véase, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993) . La formulación de aquí también puede contener más de un compuesto activo cuando sea necesario para la indicación particular que es tratada, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Alternativamente, o adicionalmente, la composición puede comprender un agente que mejora su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citocina, agente quimioterapéutico, o agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas están presentes adecuadamente en combinación, en cantidades que son efectivas para el propósito propuesto. Los ingredientes activos también pueden ser atrapados en las microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en los sistemas de suministro de los fármacos coloidales (por ejemplo, los liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas, y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra . Las formulaciones que van a ser utilizadas para la administración in vivo deben ser estériles. Esto es efectuado fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles . Las preparaciones de liberación sostenida pueden ser preparadas. Los ejemplos adecuados de las preparaciones de liberación sostenida incluyen las matrices semipermeables de los polímeros hidrofóbicos sólidos. Que contiene el anticuerpo, tales matrices están en la forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Los ejemplos de las matrices de liberación sostenida incluyen los poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (alcohol vinílico)), polilactidas (Pat. U.S. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, acetato de vinilo-etileno no degradable, copolímeros de ácido glicólico-ácido láctico degradables tales como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas del copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y el acetato de leuprolida) , y el ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico. Aunque los polímeros tales como el acetato de vinilo-étileno y el ácido láctico-ácido glicólico hacen posible la liberación de las moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan las proteínas durante períodos de tiempo más breves. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un período de tiempo prolongado, los mismos pueden desnaturalizarse o agregarse como un resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, conduciendo a una pérdida de la actividad biológica y a cambios posibles en la inmunogenicidad. Las estrategias racionales pueden ser contempladas para la estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación se descubre que va a ser la formación de la unión de S-S intermolecular a través del intercambio del tio-disulfuro, la estabilización puede ser lograda modificando los residuos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de las soluciones acidas, controlando el contenido de humedad, utilizando los aditivos apropiados, y desarrollando las composiciones de la matriz polimérica específicas.

G. Usos para los Anticuerpos de anti-FGF-19 Los anticuerpos de anti-FGF-19 de la invención tienen varias utilidades. Por ejemplo, los anticuerpos de anti-FGF-19 pueden ser utilizados en los ensayos de diagnóstico para el FGF-19, por ejemplo, detectando su expresión en las células, tejidos, o el suero, específicos. Varias técnicas de ensayo de diagnóstico conocidas en el arte pueden ser utilizadas, tales como los ensayos de unión o aglutinación competitiva, los ensayos de emparedado indirectos y los ensayos de inmunoprecipitación llevados a cabo en las fases ya sea heterogéneas u homogéneas [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158] . Los anticuerpos utilizados en los ensayos de diagnóstico pueden ser etiquetados con una porción detectable. La porción detectable debe ser capaz de producir, ya sea directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la porción detectable puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 1C, 32P, 35S, o 125I, un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como un isotiocianato de fluoresceína, rodamina, o lucíferina, o una enzima, tal como la fosfatasa alcalina, la beta-galactosidasa o la peroxidasa del rábano picante. Cualquier método conocido en el arte para conjugar el anticuerpo con la porción detectable puede ser empleado, incluyendo aquellos métodos descritos por Hunter et al., Nature, 144; 945 (1962); Davis et al., Biochemistry, 13:1014(1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40:219(1981); y Nygren, J. Histochem. And Cytochem., 30:407 (1982). Los anticuerpos de anti-FGF-19 también son útiles para la purificación por afinidad del FGF-19 a partir de las fuentes naturales o el cultivo de las células recombinantes. En este proceso, los anticuerpos contra el FGF-19 son inmovilizados sobre un soporte adecuado, tal como una resina Sephadex o papel filtro, utilizando los métodos bien conocidos en el arte. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto entonces con una muestra que contiene el FGF-19 que va a ser purificado, y después de esto el soporte es lavado con un solvente adecuado que removerá substancialmente todo el material en la muestra excepto el FGF-19, el cual está unido al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte es lavado con otro solvente adecuado que liberará el FGF-19 a partir del anticuerpo. Los siguientes ejemplos son ofrecidos para propósitos ilustrativos solamente, y no están propuestos para limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera . Todas las referencias de patentes y literatura citadas en la presente especificación sin incorporadas aquí para referencia en su totalidad.

EJEMPLOS Los reactivos disponibles comercialmente referidos en los ejemplos fueron utilizados de acuerdo con las instrucciones del fabricante a menos que se indique de otra manera. La fuente de estas células identificadas en los siguientes ejemplos, y en toda la especificación, por los números de acceso del ATCC, es el American Type Culture Collection, Manassas, VA.

EJEMPLO 1 Aislamiento de los Clones de ADNc que Codifican un FGF-19 Humano El número de acceso AF007268 de la secuencia de EST, un factor del crecimiento de los fibroblastos del murino (FGF-15) fue utilizado para investigar varias bases de datos» de EST públicas (por ejemplo, GenBank, Dayhoff, etc.). La investigación fue efectuada utilizando el programa de computadora BLAST o BLAST2 [Altschul et al . , Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)] como una comparación de las secuencias de la proteína de ECD para una traducción de 6 marcos o estructuras de las secuencias de EST. La investigación condujo al éxito con GenBank EST AA220994, el cual ha sido identificado como un precursor 937230 neuronal de STRATAGENE NT2. La secuencia del AA220994 también es referida aquí como DNA47412. Basado en la secuencia DNA47412, los oligonuclepótidos fueron sintetizados: 1) para identificar por PCR una biblioteca de ADNc que contuvo la secuencia de interés, y 2) para su uso como sondas para aislar un clon de la secuencia de codificación de longitud completa para el FGF-19. Los cebadores de PCR delantero e inverso generalmente varían desde 20 hasta 30 nucleótidos y frecuentemente están diseñados para dar un producto de PCR de aproximadamente 100-1000 pb de longitud. Las secuencias de la sonda son típicamente de 40-55 pb de longitud. En algunos casos, los oligonuclepótidos adicionales son sintetizados cuando la secuencia de consenso es mayor que aproximadamente 1-1.5 kbp. Para seleccionar varias bibliotecas para un clon de longitud completa, el ADN de las bibliotecas fue seleccionado por amplificación por PCR, como por Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, con el par del cebador de PCR. Una biblioteca positiva fue utilizada entonces para aislar los clones que codifican el gen de interés utilizando los oligonucleótidos de la sonda y uno de los pares de los cebadores. Los cebadores de PCR (delantero e inverso) fueron sintetizados : cebador de PCR delantero 5'-ATCCGCCCAGATGGCTACAATGTGTA-3 ' (SEC ID NO: 3) , y cebador de PCR trasero 5 ' -CCAGTCCGGTGACAAGCCCAAA-3 ' (SEC ID NO: 4) .

Adicionalmente, una sonda de hibridación de oligonucleótidos sintética fue construida a partir de la secuencia DNA47412 la cual tuvo la siguiente secuencia de nucleótidos: sonda de hibridación 5'-GCCTCCCGGTCTCCCTGAGCAGTGCCAAACAGCGGCAGTGTA-3' (SEC ID NO: 5) . El ARN para la construcción de las bibliotecas del ADNc fue aislado del tejido de la retina fetal humana. Las bibliotecas del ADNc para aislar los clones del ADNc fueron construidas por los métodos estándares utilizando los reactivos disponibles comercialmente tales como aquellos de Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc fue cebado con el oligo dT que contiene un sitio Notl, enlazado con extremos truncados a los adaptadores tratados con hemicinasa de Salí, segmentados con Notl, dimensionados apropiadamente por la electrofóresis con un gel, y clonados en una orientación definida en un vector de clonación adecuado (tal como pRKB o PRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que no contiene el sitio de Sfil; véase, Holmes et al., Science, 253:1278-1280 (1991)) en los sitios de Xhol y Notl únicos. El secuenciamiento de los clones aislados como se describió anteriormente, dio la secuencia del ADN para un polipéptido de FGF-19 de longitud completa (designado aquí como DNA49435-1219 [Figura 1,SEC ID NO:l]) y la secuencia de la proteína derivada para este polipéptido de FGF-19. El clon de longitud completa identificado anteriormente contuvo un marco de lectura abierta único con un sitio de inicio de la traducción aparente en las posiciones 464-466 del nucleótido y una señal de parada en las posiciones 1112-1114 del nucleótido (Figura 1, SEC ID NO:l). El precursor del polipéptido predicho es de 216 aminoácidos de longitud, tiene un peso molecular calculado de aproximadamente 24,003 daltons y una pl estimada de aproximadamente 6.99. El análisis de la secuencia de FGF-19 de longitud completa mostrada en la Figura 2 (SEC ID NO: 2) hace evidente la presencia de una variedad de los dominios del polipéptido importantes como se muestra en la Figura 2, en donde las localizaciones dadas para estos dominios de polipéptidos importantes son aproximadamente como se describieron anteriormente. La formación de mapas de cromosomas hace evidente que los ácidos nucleicos que codifican el FGF-19 tienen una asignación de coordenadas para el cromosoma Hql3.1, banda ql3.1, en los seres humanos. El clon DNA49435-1219 ha sido depositado en el ATCC el 21 de noviembre de 1997 y es asignado al ATCC con el depósito No. 209480.

Un análisis de la base de datos de Dayhoff (versión 35.45 SwissProt 35), utilizando el análisis de alineamiento de la secuencia ALIGN-2 de la secuencia de longitud completa mostrada en la Figura 2 (SEC ID NO: 2), evidenció la identidad de la secuencia entre la secuencia de aminoácidos del FGF-19 y las secuencias de Dayhoff siguientes: AF007268_1, S54407, P_W52596, FGF2_XENLA, P_W53793, AB002097_1, P_R27966, HSU67918 1, S23595, y P R70824.

EJEMPLO 2 Uso del FGF-19 como una sonda de hibridación El siguiente método describe el uso de una secuencia de nucleótidos que codifica el FGF-19 como una sonda de hibridación. El ADN que comprende la secuencia de codificación de longitud completa o el FGF-19 maduro es empleado como una sonda para seleccionar los ADNs homólogos (tales como aquellos que codifican las variantes que están presentes de manera natural del FGF-19) en las bibliotecas del ADNc del tejido humano o las bibliotecas genómicas del tejido humano. La hibridación y el lavado de los filtros que contienen cualesquiera ADNs de la biblioteca es efectuada bajo las siguientes condiciones de severidad elevadas. La hibridación de la sonda derivada de FGF-19 radioetiquetada a los filtros es efectuada en una solución de formamida al 50%, 5xSSC, 0.1% SDS, 0.1% pirofosfato de sodio, fosfato de sodio 50 mM, pH 6.8, 2x de la solución de Denhardt, y 10% de sulfato de dextrano a 42 °C durante 20 horas. El lavado de los filtros es efectuado en una solución acuosa de O.lx SSC y 0.1% SDS a 42 °C. Los ADNs que tienen una identidad de la secuencia deseada con el ADN que codifica el FGF-19 de la secuencia natural de longitud completa puede ser identificados entonces utilizando las técnicas estándares conocidas en el arte.

EJEMPLO 3 Expresión del FGF-19 en E. coli Este ejemplo ilustra la preparación de una forma no glicosilada del FGF-19 por la expresión recombinante en E. coli . La secuencia del ADN que codifica el FGF-19 es amplificada inicialmente utilizando los cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deben contener los sitios de la enzima de restricción los cuales corresponden a los sitios de la enzima de restricción sobre el vector de expresión seleccionado. Se pueden emplear una variedad de los vectores de expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado de E. coli ; véase Bolívar et al., Gene, 2:95 (1977) ) el cual contiene los genes para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina. El vector es diluido con la enzima de restricción y desfosforilado. Las secuencias amplificadas por PCR son ligadas entonces en el vector. El vector preferentemente incluirá secuencias las cuales codifican un gen de resistencia de los antibióticos, un promotor de trp, un elemento delantero de polyhis (incluyendo los primeros seis codones de STII, la secuencia de polyhis, y el sitio de segmentación de la enterocinasa) , la región de codificación de FGF-19, el terminador transcripcional lambda, y un gen ArgU. La mezcla de unión o ligación es utilizada entonces para transformar una cepa de E. coli seleccionada utilizando los métodos descritos en Sambrook et al., supra. Los transformantes son identificados por su capacidad para crecer sobre las placas de LB y luego se seleccionan las colonias resistentes a los antibióticos. El ADN del plásmido puede ser aislado y confirmado por el análisis de restricción y el secuenciamiento del ADN. Los clones seleccionados se pueden hacer crecer toda la noche en el medio de cultivo líquido tal como el caldo LB suplementado con antibióticos. El cultivo toda la noche puede ser utilizado subsiguientemente para inocular un cultivo a escala más grande. Las células se hacen crecer entonces hasta una densidad óptica deseada, durante lo cual el promotor de la expresión es activado. Después del cultivo de las células durante varias horas más, las células pueden ser colectadas por centrifugación. Las microesferas celulares obtenidas por la centrifugación pueden ser solubilizadas utilizando los diversos agentes conocidos en el arte, y la proteína del FGF-19 solubilizada puede ser purificada entonces utilizando una columna de quelación metálica bajo las condiciones que permitan la unión estrecha de la proteína. El FGF-19 puede ser expresado en E. coli en una forma etiquetada de poly-His, utilizando el , siguiente procedimiento. El ADN que codifica el FGF-19 es amplificado inicialmente utilizando los cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores contendrán los sitios de la enzima de restricción los cuales corresponden a los sitios de la enzima de restricción sobre el vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionan el inicio de la traducción confiable y eficiente, la purificación rápida sobre una columna de quelación metálica, y la remoción proteolítica con enterocinasa. Las secuencias etiquetadas con poly-His, amplificadas por PCR, son unidas o ligadas entonces en un vector de expresión, el cual es utilizado para transformar el huésped de E. coli basado en la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts (htpRts) clpP(lacIq). Los transformantes se hacen crecer primero en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina a 30 °C con agitación hasta que una O.D.600 de 3-5 es alcanzada. Los cultivos son diluidos entonces 50-100 veces en el medio CRAP (preparado mezclando 3.57 g (NH4)2S04, 0.71 g de citrato de sodio*2H20, 1.07 g de KCl, 5.36 g del extracto de levadura Difco, 5.36 g de Dheffield hycase SF en 500 ml de agua, así como MPOS 110 mM, pH 7.3, 0.55% (p/v) de glucosa y MgS04 7 mM) y se hicieron crecer durante aproximadamente 20-30 horas a 30 °C con agitación. Las muestras son removidas para verificar la expresión por el análisis de SDS-PAGE, y el cultivo volumétrico es centrifugado para convertir en microesferas las células. Las microesferas celulares son congeladas hasta la purificación y el repliegue. La pasta de E. coli de 0.5 a 1 1 de las fermentaciones (6-10 g de las microesferas) es resuspendida en 10 volúmenes (p/v) en guanidina 7 M, Tris 20 mM, amortiguador de pH 8. El sulfito de sodio sólido y el tetrationato de sodio son agregados para fabricar las concentraciones finales de 0.1M y 0.02 M, respectivamente, y la solución es agitada toda la noche a 4 °C. Este paso conduce a una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína bloqueados por sulfitolización. La solución es centrifugada a 40,000 rpm en una Ultracentrífuga Beckman durante 30 minutos. El sobrenadante es diluido con 3-5 volúmenes del amortiguador de la columna de quelato, metálica (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7.4) y se filtra a través de filtros de 0.22 mieras para aclararlo. El extracto clarificado es cargado sobre una columna de quelato metálica de Ni-NTA Qiagen equilibrada en el amortiguador de columna de quelato metálico. La columna es lavada con amortiguador adicional que contiene el imidazol 50 mM (Calbiochem., grado Utrol), pH 7.4. La proteína es eluida con amortiguador que contiene imidazol 250 mM. Las fracciones que contienen la proteína deseada son agrupadas y almacenadas a 4 °C. La concentración de la proteína es estimada por su absorbencia a 280 nm utilizando el coeficiente de extinción calculado basado en su secuencia de aminoácidos . Las proteínas son replegadas por dilución de la muestra lentamente en el amortiguador de repliegue preparado recientemente que consiste de: Tris 20 mM, pH 8.6, NaCl 0.3 M, urea 2.5 M, cisteína 5 mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de repliegue son elegidos de modo que la concentración de la proteína final esté entre 50 y 100 microgramos/ml. La solución de repliegue es agitada suavemente a 4 °C durante 12-36 horas. La reacción de repliegue es detenida por la adición de TFA a una concentración final de 0.4% (pH de aproximadamente 3). Antes de la purificación adicional de la proteína, la solución es filtrada a través de un filtro de 0.22 mieras y se agrega acetonitrilo a una concentración final del 2-10%. La proteína replegada es sometida a cromatografía sobre una columna de fase inversa Poros Rl/H utilizando un amortiguador móvil de 0.1% de TFA con elución con un gradiente de acetonitrilo desde 10 hasta el 80%. Las alícuotas de las fracciones con una absorbencia A280 son analizadas sobre geles de poliacrilamida de SDS y las fracciones que contienen la proteína replegada homogénea son agrupadas. En general, las especies replegadas apropiadamente de la mayoría de las proteínas son eluidas a las concentraciones más bajas de acetonitrilo puesto que estas especies son en su mayoría compactas con sus interiores hidrofóbicos protegidos de las interacciones con la resina de fase . inversa. Las especies agregadas son eluidas usualmente a concentraciones de acetonitrilo más elevadas. Además de la resolución de las formas plegadas erróneamente desde la forma deseada, el paso de fase invertida también remueve la endotoxina de las muestras . Las fracciones que contienen el polipéptido de FGF-19 plegado deseado son agrupadas y el acetonitrilo removido utilizando una corriente suave de nitrógeno dirigida en la solución. Las proteínas son formuladas en Hepes 20 mM, pH 6.8, con cloruro de sodio 0.14 M y manitol al 4% por diálisis o por filtración en un gel utilizando las resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas en el amortiguador de la formulación y filtradas de manera estéril.

EJEMPLO 4 Expresión del FGF-19 en las células de mamíferos Este ejemplo ilustra la preparación de una forma glicosilada potencialmente del FGF-19 por la expresión recombinante en las células de mamífero. El vector, pRK5 (véase EP 307,247, publicada el 15 de marzo de 1989) , es empleado como el vector de la expresión. Opcionalmente, el ADN del FGF-19 es ligado o unido en pRK5 con las enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN de FGF-19 utilizando los métodos de unión tales como se describieron en Sambrook et al., supra. El vector resultante es llamado pRK5-FGF-19. En una modalidad, las células huésped seleccionadas pueden ser las células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se hacen crecer hasta la confluencia en las placas de cultivo del tejido en un medio tal como DMEM suplementado con el suero de bovino fetal y opcionalmente componentes nutrientes y/o antibióticos. Aproximadamente 10 µg del ADN del pRK5-FGF-19 son mezclados con aproximadamente 1 µg del ADN que codifica el gen de ARN de VA [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] y disueltos en 500 µl de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0.1 mM, CaCl2 0.227 M. A esta mezcla se agregan, por goteo, 500 µl de HEPES 50 mM (pH 7.35), NaCl 280 mM, NaP04 1.5 mM, y un precipitado se permite que se forme durante 10 minutos a 25 °C. El precipitado es suspendido y se agrega a las células 293 y se permite que se sedimente durante aproximadamente cuatro horas a 37 °C. El medio de cultivo es aspirado completamente y se agregan 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. Las células 293 son lavadas entonces con el medio libre del suero, se agrega medio fresco y las células son incubadas durante aproximadamente 5 días. Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, el medio de cultivo es removido y reemplazado con el medio de cultivo (solo) o el medio de cultivo que contiene 200 µCi/ml de 35S-cisteína y 200 µCi/ml de 35S-metionina. Después de unas 12 horas de incubación, el medio acondicionado es colectado, concentrado sobre un filtro giratorio, y cargado sobre un gel de SDS al 15%. El gel procesado puede ser secado y expuesto a la película durante un período de tiempo seleccionado para revelar la presencia del polipéptido de FGF-19. Los cultivos que contienen las células transfectadas pueden padecer una incubación adicional (en el medio libre del suero) y el medio es probado en los bioensayos seleccionados. En una técnica alternativa, el FGF-19 puede ser introducido en las células 293 temporalmente utilizando el método del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981), las células 293 se hicieron crecer a densidad máxima en un recipiente giratorio y se agregan 700 µg del ADN de pRK5-FGF-19. Las células son concentradas primero a partir del recipiente giratorio por centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano es incubado sobre las microesferas celulares durante cuatro horas. Las células son tratadas con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con el medio de cultivo del tejido, y se reintroducen en el recipiente giratorio que contiene el medio de cultivo del tejido, 5 µg/ml de la insulina de bovino y 0.1 µg/ml de la transferrina de bovino. Después de aproximadamente cuatro días, el medio acondicionado es centrifugado y filtrado para remover las células y los desechos. La muestra que contiene el FGF-19 expresado puede ser concentrada y purificada entonces por cualquier método seleccionado, tal como la diálisis y/o la cromatografía en columna. En otra modalidad, el FGF-19 puede ser expresado en las células de CHO. El pRK5-FGF-19 puede ser transfectado en las células de CHO utilizando los reactivos conocidos tales como el CaP04 o el DEAE-dextrano . Como se describió anteriormente, los cultivos celulares pueden ser incubados, y el medio reemplazado con el medio de cultivo (solo) o el medio que contiene una radioetiqueta tal como la 35S-metionina. Después de determinar la presencia del polipéptido de FGF-19, el medio de cultivo puede ser reemplazado con el medio libre del suero. Preferentemente, los cultivos son incubados durante aproximadamente 6 días, y luego el medio acondicionado es colectado. El medio que contiene el FGF-19 expresado puede ser concentrado y purificado entonces por cualquier método seleccionado. El FGF-19 etiquetado con el epítope también puede ser expresado en las células de CHO huésped. El FGF-19 puede ser subclonado fuera del vector pRK5. El inserto del subclon puede padecer la PCR para fusionar un marco con una etiqueta del epítope seleccionado tal como una etiqueta de poly-his en un vector de expresión del Baculovirus. El inserto del FGF-19 etiquetado con poly-his puede ser subclonado entonces en un vector impulsado por SV40 que contiene un marcador de selección tal como DHFR para la selección de los clones estables. Finalmente, las células de CHO pueden ser transfectadas (como se describió anteriormente) con el vector impulsado de SV40. La etiquetación puede ser efectuada, como se describió anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene el FGF-19 etiquetado con poly-His expresado, puede ser concentrado y purificado entonces por cualquier método seleccionado, tal como por cromatografía de afinidad del quelato-Ni2+. El FGF-19 también puede ser expresado en CHO y/o las células COS por un procedimiento de expresión temporal o en las células de CHO por otro procedimiento de expresión estable. La expresión estable en las células de CHO es efectuada utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas son expresadas como una construcción de IgG (inmunoadhesina) , en la cual las secuencias de codificación para las formas solubles (por ejemplo, los dominios extracelulares) de las proteínas respectivas son fusionadas a una secuencia de la región constante de IgGl que contiene la articulación, el CH2 y los dominios de CH2 y/o es una forma etiquetada con poly-His. A continuación de la amplificación por PCR, los ADNs respectivos son subclonados en un vector de expresión de CHO utilizando las técnicas estándares como se describieron en Ausubel et al . , Current Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, Jophn Wiley and Sons (1997). Los vectores de expresión de CHO son construidos para que tengan sitios de restricción 5' y 3' compatibles del ADN de interés para permitir el transporte de los ADNcs. El vector utilizado para la expresión en las células de CHO es como se describió en Lucas et al., Nucí . Acids Res . 24:9 (1774-1779 (1996), y utiliza el promotor/mejorador inicial de SV40 para impulsar la expresión del ADNc de interés y la dihidrofolato reductasa (DHFR) . La expresión de DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del plásmido a continuación de la transfección. Doce microgramos del ADN del plásmido deseado son introducidos en aproximadamente 10 millones de células de CHO utilizando los reactivos de transfección disponibles comercialmente Superfect® (Qiagen) , Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim) . Las células se hacen crecer como se describió en Lucas et al., supra . Aproximadamente 3 x 10~7 células son congeladas en una ampolla para el crecimiento y la producción adicional como se describe posteriormente. Las ampollas que contienen el ADN del plásmido son descongeladas por la colocación en un baño de agua y mezcladas por agitación en forma de remolino. Los contenidos son transferidos con una pipeta hacia un tubo para máquina centrífuga que contiene 10 ml del medio y se centrifuga a 1000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante es aspirado y las células se vuelven a suspender en 10 ml del medio selectivo (PS20 filtrado de 0.2 µm con 5% de suero de bovino fetal diafiltrado de 0.2 µm) . Las células fueron alimentadas como alícuotas entonces a una máquina centrífuga de 100 ml que contiene 90 ml del medio selectivo. Después de 1-2 días, las células son transfectadas hacia una máquina centrífuga de 250 ml rellena con 150 ml del medio de crecimiento selectivo e incubadas a 37 °C. Después de otros 3 días, las máquinas centrífugas de 250 ml, 500 ml y 2000 ml son sembradas con 3 x 105 células/ml. El medio celular es intercambiado con el medio fresco por centrifugación y resuspensión en el medio de producción. Aunque cualquier medio de CHO adecuado puede ser empleado, un medio de producción descrito en la Patente U.S. No. 5,122,469, expedida el 16 de junio de 1992, puede ser utilizado realmente. Una máquina centrífuga de producción de 3 litros es sembrada a 1.2 x 106 células/ml. El día 0, el pH numérico de las células es determinado. El día 1, la máquina centrífuga es muestreada y el rociado con aire filtrado es comenzado. El día 2, la máquina centrífuga es muestreada, la temperatura es cambiada a 33 °C, y se toman 30 ml de la glucosa de 500 g/1 y 0.6 ml de la antiespuma al 10% (por ejemplo, la emulsión de polidimetilsiloxano al 35%, Emulsión de Grado Médico de Dow Corning 365) . De principio a fin de la producción, el pH es ajustado cuando ' sea necesario para mantenerlo alrededor de 7.2. Después de 10 días, o hasta que la viabilidad se haya reducido abajo del 70%, el cultivo celular es colectado por centrifugación y filtración a través de un filtro de 0.22 µm. El filtrado fue almacenado ya sea a 4 °C o cargado inmediatamente sobre columnas para la purificación. Para las construcciones etiquetadas con poly-His, las proteínas son purificadas utilizando una columna Ni-NTA (Qiagen) . Antes de la purificación, el imidazol es agregado al medio acondicionado a una concentración de 5 mM. El medio acondicionado es bombeado sobre una columna Ni-NTA de 6 ml equilibrada en Hepes 20 mM, pH 7.4, el amortiguador que contiene NaCl 0.3 M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5 ml/min., a 4 °C. Después de la carga, la columna es lavada con el amortiguador de equilibrio adicional y la proteína eluida con el amortiguador de equilibrio que contiene el imidazol 0.25 M. La proteína altamente purificada es desalada subsiguientemente en un amortiguador de almacenamiento que contiene Hepes 10 mM, NaCl 0.14 M y manitol al 4%, pH 6.8, con una columna Superfine (Pharmacia) G25 de 25 ml y se almacena a -80 °C. Las construcciones de inmunoadhesina (que contienen Fc) son purificadas a partir del medio acondicionado como sigue. El medio acondicionado es bombeado sobre una columna Protein A de 5 ml (Pharmacia) la cual ha sido equilibrada en el amortiguador de Na fosfato 20 mM, pH 6.8. Después de la carga, la columna es lavada extensivamente con el amortiguador de equilibrio antes de la elución con el ácido cítrico 100 mM, pH 3.5. La proteína eluida es neutralizada inmediatamente por la colección de fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 µl del amortiguador Tris 1 M, pH 9.

La proteína altamente purificada es desalada subsiguientemente en el amortiguador de almacenamiento como se describió anteriormente para las proteínas etiquetadas con poly-His. La homogeneidad es evaluada por los geles de poliacrilamida de SDS y por el secuenciamiento de los aminoácidos N-terminales por la degradación de Edman.

EJEMPLO 5 Expresión del FGF-19 en la Levadura El siguiente método describe la expresión recombinante del FGF-19 en la levadura. En primer lugar, los vectores de expresión de la levadura son construidos para la producción intracelular o la secreción del FGF-19 a partir del promotor de ADH2/GAPDH. El ADN que codifica el FGF-19 y el promotor es insertado en los sitios de la enzima de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular del FGF-19. Para la secreción, el ADN que codifica el FGF-19 puede ser clonado en el plásmido seleccionado, junto con el ADN que codifica el promotor de ADH2/GAPDH, un péptido de la señal de FGF-19 u otro péptido de la señal del mamífero, o, por ejemplo, un factor alfa de la levadura o la secuencia delantera/señal secretoria de la invertasa, y las secuencias enlazadoras (si son necesarias) para la expresión del FGF-19. Las células de levadura, tales como la cepa AB110 de la levadura, pueden ser transformadas entonces con los plásmidos de la expresión descritos anteriormente y cultivados en el medio de fermentación seleccionado. Los sobrenadantes de levadura transformados pueden ser analizados por la precipitación con 10% de ácido tricloroacético y la separación por SDS-PAGE, seguido por el teñido de los geles con el tinte del Azul de Coomassie. El FGF-19 recombinante puede ser aislado subsiguientemente y purificado removiendo las células de levadura del medio de fermentación por centrifugación y luego concentrando el medio utilizando los filtros del cartucho seleccionados. El FGF-19 que contiene el concentrado puede ser purificado adicionalmente utilizando las resinas de cromatografía de columna seleccionadas.

EJEMPLO 6 Expresión del FGF-19 en las Células de Insectos Infectadas con el Baculovirus El siguiente método describe la expresión recombinante del FGF-19 en las células de insectos infectadas con el baculovirus . La secuencia que codifica el FGF-19 es fusionada corriente arriba de una etiqueta del epítope contenida dentro del vector de expresión del baculovirus. Tales etiquetas del epítope incluyen las etiquetas de poly-his y las etiquetas de inmunoglobulina (semejantes a las regiones de Fc de IgG) . Se pueden emplear una variedad de plásmidos, incluyendo los plásmidos derivados de los plásmidos disponibles comercialmente tales como pVL1393 (Novagen) . Brevemente, la secuencia que codifica el FGF-19 o la porción deseada de la secuencia de codificación del FGF-19 tal como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína de la transmembrana o de la secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es extracelular, es amplificada por PCR con los cebadores complementarios para las regiones 5 ' y 3 ' . El cebador 5' puede incorporar los sitios de la enzima de restricción de flanqueo (seleccionados) . El producto es diluido entonces con aquellas enzimas de restricción seleccionadas y subclonadas en el vector de expresión.

El baculovirus recombinante es generado por cotransfección del plásmido anterior y el ADN del virus BaculoGold™ (Pharmingen) en las células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando la lipofectina (disponible comercialmente de GIBCO-BRL) . Después de 4 - 5 días de incubación a 28 °C, los virus liberados son colectados y utilizados para amplificaciones adicionales. La infección viral y la expresión de la proteína son efectuadas como se describió por O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994) . El FGF-19 etiquetado con poly-his expresado puede ser purificado entonces, por ejemplo, por cromatografía de afinidad del quelato-Ni2+ como sigue. Los extractos son preparados a partir de las células de Sf9 infectadas con el virus recombinante como se describió por Rupert et al . , Nature, 362:175-179 (1993). Brevemente, las células Sf9 fueron lavadas, resuspendidas en el amortiguador para la aplicación del sonido (25 ml de Hepes, pH 7.9; MgCl2 12.5 mM; EDTA 0.1 mM; 10% de glicerol; 0.1% de NP-40; KCl 0.4 M) , y se aplica el sonido dos veces durante 20 segundos sobre hielo. Los materiales a los cuales se les ha aplicado el sonido son despejados por centrifugación, y el sobrenadante es diluido 50 veces en el amortiguador de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, 10% de glicerol, pH 7.8) y se filtra a través de un filtro de 0.45 µm. La columna de agarosa de Ni2+-NTA (disponible comercialmente de Qiagen) es preparada con un volumen del lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml del amortiguador de carga. El extracto celular filtrado es cargado sobre la columna a 0.5 ml por minuto. La columna es lavada hasta la línea base A2so con el amortiguador de carga, en tal punto se inicia la colección de la fracción por puntos . A continuación, la columna es lavada con un amortiguador de lavado secundario (fosfato 50 mM; NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6.0), el cual se une no específicamente a la proteína. Después de alcanzar la línea base A28o nuevamente, la columna es revelada con un gradiente de Imidazol de 0 a 500 nM en el amortiguador de lavado secundario. Las fracciones de un ml son colectadas y analizadas por SDS-PAGE y el teñido con plata o el análisis de Western blot con el conjugado de Ni2+-NTA para la fosfatasa alcalina (Qiagen) . Las fracciones que contienen el FGF-19 etiquetado con Hisio eluido son agrupadas y dializadas contra el amortiguador de carga. Alternativamente, la purificación del FGF-19 etiquetado con IgG (o etiquetado con Fc) ) puede ser efectuada utilizando las técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo por ejemplo, la cromatografía en columna de la Proteína A o de la proteína G.

EJEMPLO 7 Preparación de los Anticuerpos que se Unen a FGF-19 Este ejemplo ilustra la preparación de los anticuerpos monoclonales los cuales pueden unirse específicamente al FGF-19. Las técnicas para producir los anticuerpos monoclonales ya son conocidos en el arte y son descritos, por ejemplo, en Goding, supra. Los inmunógenos que pueden ser empleados incluyen el FGF-19 purificado, las proteínas de fusión que contienen el FGF-19, y las células que expresan el FGF-19 recombinante sobre la superficie celular. La selección del inmunógeno se puede hacer por el artesano experto sin experimentación indebida. Los ratones, tales como Balb/c, son inmunizados con el inmunógeno de FGF-19 emulsificado en el auxiliar de Freund completo e inyectados subcutánea e intraperitonealmente en una cantidad desde 1-100 microgramos. Alternativamente, el ínmunógeno es emulsificado en el auxiliar de MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) , e inyectado en la carnosidad de las patas traseras del animal. Los ratones inmunizados son reforzados entonces 10 a 12 días más tarde con el inmunógeno adicional emulsificado en el auxiliar seleccionado. Después de esto, durante varias semanas, los ratones también pueden ser reforzados con inyecciones de inmunización adicionales. Las muestras del suero pueden ser obtenidas periódicamente a partir de los ratones por hemorragia retro-orbital para la prueba en los ensayos de ELISA para detectar los anticuerpos de anti-FGF-19. Después de que una concentración adecuada de los anticuerpos ha sido detectada, los animales "positivos" para los anticuerpos pueden ser inyectados con una inyección intravenosa final de FGF-19. Tres a cuatro días más tarde, los ratones son sacrificados y se colectan las células del bazo. Las células del bazo son fusionadas entonces (utilizando 35% de polietilenglicol) para una línea celular del mieloma del murino seleccionada tal como P3X63AgU.l, disponible del ATCC, No. CRL 1597. Las fusiones generan las células del hibridoma las cuales son colocadas entonces en placas de cultivo del tejido de 96 cavidades que contienen el medio HAT (hipoxantina, aminopterina, y timidina) para inhibir la proliferación de las células no fusionadas, los híbridos del mieloma, y los híbridos de las células del bazo. Las células del hibridoma serán seleccionadas en un ELISA para verificar la reactividad contra el FGF-19. La determinación de las células del hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos monoclonales deseados contra el FGF-19 están dentro de la experiencia en el arte. Las células del hibridoma positivas pueden ser inyectadas intraperitonealmente en los ratones de Balb/c singenéicos para producir los ascitos que contienen los anticuerpos monoclonales de anti-FGF-19. Alternativamente, las células del hibridoma se pueden hacer crecer en los recipientes para el cultivo del tejido o las botellas giratorias. La purificación de los anticuerpos monoclonales producidos en los ascitos puede ser efectuada utilizando la precipitación con el sulfato de amonio, seguido por la cromatografía de exclusión del gel. Alternativamente, la cromatografía de afinidad basada en la unión del anticuerpo a la proteína A o la proteína G puede ser empleada.

EJEMPLO 8 Purificación de los Polipéptidos de FGF-19 Utilizando los Anticuerpos Específicos Los polipéptidos de FGF-19 naturales o recombinantes pueden ser purificados por una variedad de técnicas estándares en el arte de la purificación de las proteínas. Por ejemplo, el polipéptido de pro-FGF-19, el polipéptido de FGF-19 maduro, o el polipéptido de pre-FGF-19 es purificado por cromatografía de inmunoafinidad utilizando los anticuerpos específicos para el polipéptido de FGF-19 de interés. En general, una columna de inmunoafinidad está construida uniendo covalentemente el anticuerpo del polipéptido de anti-FGF-19 a una resina cromatográfica activada. Las inmunoglobulinas policlonales son preparadas a partir del suero inmune ya sea por precipitación con sulfato de amonio o por purificación sobre la Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). De manera semejante, los anticuerpos monoclonales son preparados a partir del fluido de los ascitos del ratón por precipitación con sulfato de amonio o cromatografía sobre la Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina purificada parcialmente está fijada covalentamente a una resina cromatográfica tal como SHEPAROSE™ activada con CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology) . El anticuerpo es acoplado a la resina, la resina es bloqueada, y la resina derivada es lavada de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tal columna de inmunoafinidad es utilizada en la purificación del polipéptido de FGF-19 preparando una fracción de las células que contienen el polipéptido de FGF-19 en una forma soluble. Esta preparación es derivada por la solubilización de la célula completa o de una fracción subcelular obtenida por medio de centrifugación diferencial por la adición del detergente o por otros métodos bien conocidos en el arte. Alternativamente, el polipéptido de FGF-19 soluble que contiene una secuencia de la señal puede ser secretado en una cantidad útil en el medio en el cual las células se hacen crecer. Una preparación que contiene el polipéptido de FGF-19 soluble se hace pasar sobre la columna de inmunoafinidad, y la columna es lavada bajo condiciones que permitan la absorbencia preferente del polipéptido de FGF-19 (por ejemplo, los amortiguadores de intensidad iónica elevada en la presencia del detergente) . Luego, la columna es eluida bajo condiciones que alteren la unión del anticuerpo/FGF-19 (por ejemplo, un amortiguador de pH bajo tal como de pH 2-3 aproximadamente, o una concentración elevada de un caotropo tal como la urea o el ion tiocianato) , y el polipéptido de FGF-19 es colectado.

EJEMPLO 9 Selección del Fármaco Esta invención es particularmente útil para la selección de los compuestos utilizando el polipéptido de FGF-19 o el fragmento de unión del mismo en cualquiera de una variedad de técnicas de selección el fármaco. El polipéptido de FGF-19 o el fragmento empleado en tal prueba puede estar libre en la solución, fijado a un soporte sólido, llevado sobre una superficie celular, o localizado intracelularmente. Un método de selección del fármaco utiliza las células huéspedes eucarióticas o procarióticas las cuales son transformadas establemente con los ácidos nucleicos recombinantes que expresan el polipéptido de FGF-19 o un fragmento del mismo. Los fármacos son seleccionados contra tales células transformadas en los ensayos de unión competitivos. Tales células, ya sea en la forma fija o viable, pueden ser utilizadas para los ensayos de unión estándares. Se puede medir, por ejemplo, la formulación de los complejos entre el polipéptido de FGF-19 o un fragmento y el agente que es probado. Alternativamente, se puede examinar la disminución en la formación del complejo entre el polipéptido de FGF-19 y su célula de blanco u otros receptores de blanco provocada por el agente que es probado. Así, la presente invención proporciona métodos de selección para los fármacos o cualesquiera otros agentes los cuales pueden afectar una enfermedad o desorden asociado con el polipéptido de FGF-19. Estos métodos comprenden poner en contacto tal agente con un polipéptido de FGF-19 o fragmento del mismo y para evaluar (I) la presencia de un complejo entre el agente y el polipéptido de FGF-19 o un fragmento, o (ii) para verificar la presencia de un complejo entre el polipéptido de FGF-19 o un fragmento y la célula, por los métodos bien conocidos en el arte. En tales ensayos de unión competitivos, el polipéptido de FGF-19 o fragmento del mismo es etiquetado típicamente. Después de la incubación adecuada, el fragmento o el polipéptido de FGF-19 libre es separado de aquel presente en la forma unida, y la cantidad de la etiqueta libre o que no ha formado un complejo es una medida de la capacidad del agente particular para unirse al polipéptido de FGF-19 o para interferir con el complejo de la célula/polipéptido de FGF-19. Otra técnica para la selección del fármaco proporciona una selección de rendimiento elevado para los compuestos que tienen una afinidad de unión adecuada para un polipéptido y se describe con detalle en WO 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984. En resumen, los números grandes de diferentes compuestos de prueba de los péptidos pequeños son sintetizados sobre un substrato sólido, tal como pernos de plástico o alguna otra superficie. Cuando se aplica a un polipéptido de FGF-19, los compuestos de prueba del péptido se hacen reaccionar con el polipéptido de FGF-19 y se lavan. El polipéptido de FGF-19 unido es detectado por los métodos bien conocidos en el arte. El polipéptido de FGF-19 purificado también puede ser recubierto directamente sobre las placas para su uso en las técnicas de selección del fármaco mencionadas anteriormente. Además, los anticuerpos no neutralizantes pueden ser utilizados para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre el soporte sólido. Esta invención también contempla el uso de los ensayos de selección del fármaco competitivos en los cuales los anticuerpos de neutralización capaces de unión del polipéptido de FGF-19 competen específicamente con un compuesto de prueba para la unión al polipéptido de FGF-19 o los fragmentos de los mismos. De esta manera, los anticuerpos pueden ser utilizados para detectar la presencia de cualquier polipéptido el cual comparte una o más determinantes antigénicas con el polipéptido de FGF-19.

EJEMPLO 10 Diseño de un Fármaco Racional La meta del diseño del fármaco racional es producir los análogos estructurales del polipéptido activo biológicamente de interés (es decir, un polipéptido de FGF-19) o de moléculas pequeñas con las cuales las mismas interactúan, por ejemplo, los agonistas, antagonistas, o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos pueden ser utilizados para adaptarse a los fármacos los cuales son formas más activas o estables del polipéptido de FGF-19 o las cuales mejoran o interfieren con la función del polipéptido de FGF-19 in vivo (cotéjese, Hodgson, Bio/Technology, 9 19-21 (1991)). En un método, la estructura tridimensional del polipéptido de FGF-19, o de un complejo el inhibidor-polipéptido de FGF-19, es determinada por la cristalografía de rayos x, por la modelación por computadora o, más típicamente, por una combinación de los dos métodos. Tanto la forma como las cargas del polipéptido de FGF-19 deben ser averiguadas para vislumbrar la estructura y determinar el (los) sitio (s) de actividad de la molécula. Menos frecuentemente, la información útil con respecto a la estructura del polipéptido de FGF-19 puede ser obtenida por modelación con base en la estructura de las proteínas homologas. En ambos casos, la información estructural relevante es utilizada para diseñar las moléculas semejantes al polipéptido de FGF-19 análogo o para identificar inhibidores eficientes. Los ejemplos útiles del diseño del fármaco racional pueden incluir moléculas las cuales tengan una actividad o estabilidad mejorada como se muestra por Braxton y Wells, Biochemistry, 31:7796-7801 (1992) o las cuales actúan como los inhibidores, agonistas, o antagonistas de los péptidos naturales como se muestra por Athauda et al., J, Biochem., 113:742-746 (1993).

También es posible aislar un anticuerpo específico para el blanco, seleccionado por el ensayo funcional, como se describió anteriormente, y luegto resolver su estructura cristalina. Este método, en un principio, produce un núcleo farmacéutico sobre el cual puede estar basado el diseño del fármaco subsiguiente. Es posible derivar la cristalografía de las proteínas conjuntamente por la generación de los anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ids) para un anticuerpo activo farmacológicamente, funcional. Como una imagen al espejo de una imagen al espejo, el sitio de unión o aglutinación de los anti-ids se podría esperar que sea un análogo del receptor original. El anti-id podría ser utilizado entonces para identificar y aislar los péptidos de los bancos de los péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados podrían actuar entonces como un núcleo farmacológico. En virtud de la presente invención, pueden estar disponibles cantidades suficientes del polipéptido de FGF-19 para efectuar tales estudios analíticos como la cristalografía de rayos X. Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de FGF-19 provista aquí proporcionará una guía para aquellas personas que emplean técnicas de modelación por computadora en lugar de o además de la cristalografía de rayos X.

EJEMPLO 11 Investigación del Peso, los Niveles de Leptina, la Producción de Orina, el Consumo de Oxígeno, y los Niveles de Triglicéridos y Ácidos Grasos Libres en los Ratones Transgénicos de FGF-19 Como se describió aquí, el FGF-19 ha sido identificado recientemente como un elemento de una familia en crecimiento de las proteínas secretadas relacionadas con el factor de crecimiento de los fibroblastos. El FGF-19 ha sido caracterizado aquí como de interacción con el receptor 4 de FGF y no parece que actúa como un mitógeno. Para investigar adicionalmente las funciones de esta proteína, se han generado ratones transgénicos los cuales expresan el FGF-19 humano. En particular, el ADNc que codifica el FGF-19 humano fue clonado en un plásmido que contiene el promotor para la cadena ligera de miosina. Este promotor es suficiente para la transcripción específica de los músculos del transgen. Un aceptor o donador del empalme también fue incluido 5' con respecto al ADNc del FGF-19 para incrementar el nivel de expresión y un donador y aceptador del empalme con una señal de adición de poly A fue incluido 3 ' con respecto al ADNc del FGF-19 para incrementar el nivel de transcripción y para proporcionar un sitio de terminación de la transcripción. El ADN que abarca el promotor de MLC, el aceptor y donador del empalme de 5 ' , el ADNc del FGF-19 y el aceptor y donador del empalme 3' y el sitio de terminación de la transcripción (el transgen) fue liberado de las secuencias del vector bacteriano utilizando las enzimas de restricción apropiadas y purificado a continuación del fraccionamiento por tamaño sobre los geles de agarosa. El ADN purificado fue inyectado en un pronúcleo de los huevos de ratón fertilizados y los ratones transgénicos generados e identificados como se describió (Genetic Modification of Animáis; Tim Stewart; En Exploring Genetic Mechanisms pp.565-598; 1997 Eds M Singer y P Berg; University Science Books; Sausalito, Calif) . Los ratones fueron de 6 semanas de edad para las mediciones descritas posteriormente para la admisión de agua, el consumo de alimentos, la salida de la orina y el conteo de hematocritos. Las mediciones de la leptina, los triglicéridos y los ácidos grasos libres, fueron sobre los mismos animales a las 8 semanas de edad. Como lo muestran los resultados descritos posteriormente, estos ratones demuestran una admisión de alimentos incrementada y una velocidad metabólica incrementada como es evidenciado por su velocidad de consumo del oxígeno. A pesar de la admisión de alimentos incrementada, estos ratones pesan significativamente menos que sus compañeros de camada no transgénicos. Este peso corporal reducido parece que va a ser una consecuencia de la adiposidad reducida como leptina la cual se correlaciona estrechamente con la masa del tejido adiposo en los seres humanos y los roedores y la cual es reducida en los ratones transgénicos. En apoyo adicional de esto, los ratones transgénicos tienen un crecimiento lineal normal como es evaluado por las mediciones de la longitud de la nariz a la cadera o cuarto trasero. Ellos son normales con respecto a los valores de la temperatura corporal, del cuerpo (longitud ósea) y hematológicos. De manera coincidente con la admisión de alimentos incrementada, los ratones transgénicos tienen un rendimiento de la orina incrementado . Debido a que los ratones no parece que beban más y no están deshidratados como se determinó por un conteo de hematocritos normal, el rendimiento de orina incrementado puede ser derivado del metabolismo de los alimentos incrementado. Debido a que el FGF-19 reduce la adiposidad sin alterar ni la masa muscular ni la formación de los huesos largos, el FGF-19 está indicado como un elemento terapéutico efectivo en el tratamiento de la obesidad y las condiciones relacionadas.

Más particularmente, los ratones transgénicos de MLC-FGF-19 fueron pesados en varias instantes bajo condiciones de ayuno y alimentación diferentes. Más particularmente, los grupos de ratones transgénicos de FGF-19 hembras y sus compañeros de camada no transgénicos fueron pesados a las 6 semanas de edad durante la alimentación ad libitum, después de 6 y 24 horas de ayuno y 24 horas después de la finalización de un ayuno de 24 horas. Como se muestra en la Figura 3A, bajo todas las condiciones, los ratones transgénicos de FGF-19 (barras continuas) pesaron menos que sus compañeros de camada no transgénicos, del tipo silvestre (barras punteadas) . La Figura 3B muestra los sueros de los mismos grupos de ratones representados en la Figura 3A, evaluados para la leptina. La leptina reducida en los ratones transgénicos de FGF-19 es consistente con los pesos corporales inferiores (Figura 3A) que son debidos a la adiposidad reducida. Un grupo de ratones transgénicos de 6 semanas de edad fue verificado en la admisión de alimentos (Figura 4A) , la admisión de agua (Figura 4B) , el rendimiento de la orina (Figura 4C) y el conteo de hematocritos (Figura 4D) . Como se puede observar, los ratones transgénicos de FGF-19 (barras continuas) consumen más alimentos que sus compañeros de camada del tipo silvestre, pero no beben más. Aunque no existe cambio en el consumo de agua, los ratones transgénicos producen más orina (Figura 4C) . A pesar el incremento en la producción de orina, los ratones transgénicos no parece que estén deshidratados como es evidente por el conteo de hematocritos normal (Figura 4D) . La reducción en el peso corporal (Figura 3) con un incremento en el consumo de alimentos (Figura 4) podría ser explicada como un incremento en la velocidad metabólica. La velocidad metabólica fue determinada por la medición del consumo de oxígeno. Como se muestra en la Figura 5, los ratones transgénicos de FGF-19 tienen una velocidad metabólica incrementada durante ambos ciclos de luz, a continuación de un ayuno de 24 horas y 24 horas después de la finalización de un ayuno de 24 horas. La obesidad y los niveles elevados de triglicéridos y los ácidos grasos libres son factores de riesgo para la enfermedad cardiovascular. Como el FGF-19 reduce uno de los factores de riesgo para la enfermedad cardiovascular (obesidad (Figura 3) ) , se investigó si el FGF-19 también podría reducir otros factores de riesgo. Como se puede observar en la Figura 6, el nivel de triglicéridos y los ácidos grasos libres (FFA) también es inferior en los ratones transgénicos de FGF-19.

EJEMPLO 12 La Infusión de FGF-19 conduce a un Incremento en la Absorción de Alimentos y a un Incremento en el Consumo de Oxígeno Para confirmar que los efectos observados en los ratones transgénicos de FGF-19 fueron provocados por la proteína de FGF-19, los grupos de ratones de FvB no transgénicos fueron infusionados con el FGF-19 recombinante (1 mg/kg/día, iv) suministrado por una bomba implantada impulsada osmóticamente. Como se muestra en las Figuras 7A-B, la administración del FGF-19 humano recombinante provoca un incremento en la admisión de alimentos cuando se compara con los ratones infusionados con el portador solamente. Además, la infusión del FGF-19 conduce a un incremento en la velocidad metabólica como se mide por el consumo de oxígeno.

EJEMPLO 13 El FGF-19 Reduce la Absorción de Glucosa e Incrementa la Liberación de Peptina de los Adipocitos Para investigar adicionalmente el mecanismo por el cual el FGF-19 altera el metabolismo, el FGF-19 humano recombinante fue agregado a los cultivos de los adipocitos de rata primarios y se midió la absorción de la glucosa y la liberación de la leptina por las células. Como se muestra en las Figuras 8A-B, el FGF-19 incrementa la liberación de la leptina desde, y reduce la absorción de la glucosa en los adipocitos de la rata primarios.

EJEMPLO 14 Investigación de la Tolerancia a la Glucosa y los Pesos de las Almohadillas de Grasa sobre los Ratones Transgénicos de FGF-19 Alimentados con Dietas Elevadas en Grasas En general, los ratones (y los seres humanos) con una dieta elevada en grasas aumentarán de peso y adiposidad y llegarán a ser ya sea diabéticos o intolerantes a la glucosa.

Para examinar si la exposición al FGF-19 tendrá impacto sobre los grupos de la adiposidad y la tolerancia a la glucosa de los ratones transgénicos y sus compañeros de camada no transgénicos (de edad y sexo correspondientes) , a los compañeros de camada se les proporcionó una dieta elevada en grasas como se describe por Rubeffe-Scrive et al Metabolism Vol. 42, No. 11 '1993 pp.1405-1409 y Surwit et al Metabolism, Vol. 44, No. 5 1995 pp. 645-651 con la modificación de que el contenido de sodio fue normalizado con respecto a la comida normal (dietas preparadas por Research Diets Inc. Catálogo No. D12330N) . Después de diez semanas de la alimentación del ratón ya sea normal o de la dieta elevada en grasas, los ratones (las hembras transgénicas y sus compañeros de camada no transgénicos) fueron sometidos a una prueba de tolerancia a la glucosa. Por consiguiente cada ratón fue inyectado intraperitonealmente con 1.0 mg de glucosa por kg de peso corporal y la concentración de la glucosa presente en la sangre fue medida a intervalos a continuación de la inyección. La gráfica en la Figura 10 muestra los niveles de glucosa en los ratones y demuestra que 8/9 de los ratones no transgénicos hembras que han sido alimentados con la dieta elevada en grasas podrían ser definidos como diabéticos (niveles de glucosa a las 2 horas mayores que 200 mg/dl; (World Book of Diabetes in Practice. Vo]3; Ed. Krall, L.P.; Elsevier) ) mientras que 0/5 de los ratones transgénicos alimentados con una dieta comparable podrían ser considerados diabéticos. Los ratones machos que fueron alimentados con la dieta elevada en grasas fueron sacrificados después de estar en la dieta durante ya sea 6 o 10 semanas y la adiposidad se determinó por la medición de los pesos de los depósitos de grasa específicos. Como se muestra en la Figura 9, los ratones transgénicos que han sido alimentados con una dieta elevada en grasas fueron significativamente menos gordos que los compañeros de camada no transgénicos .

Depósito de Material Los siguientes materiales han sido depositados en el American Type culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC) : Material ATCC Dep. No. Fecha de Depósito DNA49435-1219 209480 21 de noviembre de 1997 Este depósito se hizo bajo las condiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para el Propósito de Procedimiento de Patentes y las Regulaciones bajo el mismo (Tratado de Budapest) . Esto asegura el mantenimiento de un cultivo viable del depósito durante 30 años desde la fecha de depósito. El depósito se hará disponible por el ATCC bajo los términos del Tratado de Budapest, y sometido a un acuerdo entre Genentech, Inc., y el ATCC, lo cual asegura la disponibilidad permanente y no restringida de la progenie del cultivo del depósito al público durante la expedición de la patente U.S. pertinente y durante la presentación abierta al público de cualquier solicitud de patente U.S. o extranjera, cualquiera de que se trate primero, y asegura la disponibilidad de la progenie a una determinada por el Comisionado de Patentes y Marcas Registradas de los Estados Unidos de América que va a ser autorizado con respecto al mismo de acuerdo con 35 USC §122 y las reglas del Comisionado con respecto a la misma (incluyendo 37 CFR §1.14 con referencia particular a 886 OG 638) . El cesionario de la presente solicitud está de acuerdo en que si un cultivo de los materiales sobre el depósito debe morir o ser perdido o destruido cuando sea cultivado bajo las condiciones adecuadas, los materiales serán reemplazados rápidamente durante la notificación con otros del mismo tipo. La disponibilidad del material depositado no va a ser considerado como una licencia para la práctica de la invención en contravención de los derechos otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus leyes de patentes. La especificación escrita precedente se considera que va a ser suficiente para hacer posibble que una persona experta en el arte practique la invención. La presente invención no va a estar limitada en su alcance por la construcción depositada, puesto que la modalidad depositada está propuesta como una ilustración única de ciertos aspectos de la invenciópn y cualesquiera construcciones que sean funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de esta invención. El depósito del material de aquí no constituye una admisión de que la descripción escrita contenida aquí sea inadecuada para practicar cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni se va a interpretar como limitativa del alcance de las reivindicaciones para las ilustraciones específicas que la misma representa. Realmente, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas aquí, llegarán a ser evidentes para aquellos expertos en el arte a partir de la descripción precedente y caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una molécula de ácido nucleico aislado, caracterizada porque comprende el ADN que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia con respecto a (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido de FGF-19 que comprende la secuencia de los residuos de aminoácidos desde aproximadamente 1 o aproximadamente 23 hasta aproximadamente 216 de la Figura 2 (SEC ID NO:2), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) .
2. La molécula de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende la secuencia de las posiciones de los nucleótidos desde aproximadamente 464 o aproximadamente 530 hasta aproximadamente llll de la Figura 1 (SEC ID N0:1).
3. La molécula de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende la secuencia de nucleótidos de la Figura 1 (SEC ID NO: 1 ) .
4. La molécula de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de los residuos de aminoácidos desde aproximadamente 1 o aproximadamente 23 hasta aproximadamente 216 de la Figura 2 (SEC ID NO: 2) .
5. Una molécula de ácido nucleico aislado, caracterizada porque comprende el ADN que comprende al menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia con respecto a (a) una molécula de ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc de la proteína humana depositado en el ATCC el 21 de noviembre de 1997 bajo el Depósito del ATCC No. 209480 (DNA49435-1219) , o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a) .
6. La molécula de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque comprende el ADN que codifica el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc de la proteína humana depositada en el ATCC el 21 de noviembre de 1997 bajo el Depósito del ATCC No. 209480 (DNA49435-1219) .
7. Una molécula de ácido nucleico aislado, caracterizada porque comprende el ADN que comprende al menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia con respecto a (a) la secuencia de codificación del polipéptido de longitud completa del ADNc de la proteína humana depositada en el ATCC el 21 de noviembre de 1997 bajo el Depósito del ATCC No. 209480 (DNA49435-1219) , o (b) el complemento de la secuencia de codificación de (a) .
8. La molécula de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque comprende la secuencia de codificación del polipéptido de longitud completa del ADNc de la proteína humana depositado en el ATCC el 21 de noviembre de 1997 bajo el Depósito del ATCC No. 209480 (DNA49435-1219) .
9. Una molécula de ácido nucleico aislado, caracterizada porque codifica un polipéptido de FGF-19 que comprende un ADN que se hibridiza al complemento de la secuencia de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 1 o aproximadamente 23 hasta aproximadamente 216 de la Figura 2 (SEC ID NO: 2) .
10. La molécula de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el ácido nucleico que codifica los aminoácidos 1 o aproximadamente 23 hasta aproximadamente 216 de la Figura 2 (SEC ID NO:2), comprende los nucleótidos 464 o aproximadamente 530 hasta aproximadamente llll de la Figura 1 (SEC ID NO:l) .
11. La molécula de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la hibridación ocurre bajo condiciones severas de lavado e hibridación.
12. Una molécula de ácido nucleico aislado, caracterizada porque comprende (a) el ADN que codifica un polipéptido que tiene un valor de al menos 80% positivos cuando se compara con la secuencia de residuos de aminoácidos desde 1 o aproximadamente 23 hasta aproximadamente 216 de la Figura 2 (SEC ID N0:2), o (b) el complemento del ADN de (a).
13. Una molécula de ácido nucleico aislado, caracterizada porque comprende al menos aproximadamente 22 nucelótidos y la cual es producida por la hibridación de una molécula del ADN de prueba bajo condiciones de hibridación estrictas con (a) una molécula del ADN la cual codifica un polipéptido de FGF-19 que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos desde 1 o aproximadamente 23 hasta aproximadamente 216 de la Figura 2 (SEC ID NO:2), o (b) el complemento de la secuencia de ADN de (a) , y aislar la molécula del ADN de prueba.
14. La molécula de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia con (a) o (b) .
15. Un vector, caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
16. El vector de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico está enlazada operativamente a las secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector.
17. Una molécula de ácido nucleico, caracterizada porque es como se depositó en el ATCC bajo el número de acceso 209480 (DNA49435-1219) .
18. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 15.
19. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la célula es una célula de CHO.
20. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la célula es una de E. coli .
21. La célula huésped de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque la célula es una célula de levadura.
22. Un proceso para la producción de un polipéptido de FGF-19, caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 18 bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido de FGF-19 y recuperar el polipéptido de FGF-19 del cultivo celular.
23. Un polipéptido de FGF-19 aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 80% de identidad de la secuencia con la secuencia de los residuos de aminoácidos desde aproximadamente 1 o aproximadamente 23 hasta aproximadamente 216 de la Figura 2 (SEC ID NO:2).
24. El polipéptido de FGF-19 aislado de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque comprende los residuos de aminoácidos 1 o aproximadamente 23 hasta aproximadamente 216 de la Figura 2 (SEC ID NO: 2) .
25. Un polipéptido de FGF-19 aislado, caracterizado porque tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia con respecto al polipéptido codificado por el inserto de ADNc del vector depositado en el ATCC el 21 de noviembre de 1997 como el Depósito del ATCC No. 209480 (DNA49435-1219) .
26. El polipéptido de FGF-19 aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque está codificado por el inserto de ADNc del vector depositado en el ATCC el 21 de noviembre de 1997 como el Depósito del ATCC No. 209480 (DNA49435-1219) .
27. Un polipéptido de FGF-19 aislado que tiene un valor de al menos 80% positivos cuando se compara con la secuencia de los residuos de aminoácidos desde 1 o aproximadamente 23 hasta aproximadamente 216 de la Figura 2 (SEC ID NO:2) .
28. Un polipéptido de FGF-19 aislado, caracterizado porque comprende la secuencia de los residuos de aminoácidos desde 1 o aproximadamente 23 hasta aproximadamente 216 de la Figura 2 (SEC ID N0:2), o un fragmento del mismo suficiente para proporcionar un sitio de unión para un anticuerpo de anti-FGF-19.
29. Un polipéptido aislado, caracterizado porque es producido (i) hibridizando una molécula del ADN de prueba bajo condiciones severas con (a) una molécula de ADN que codifica un polipéptido de FGF-19 que comprende la secuencia de los residuos de aminoácidos desde 1 o aproximadamente 23 hasta aproximadamente 216 de la Figura 2 (SEC ID NO:2), o (b) el complemento de la molécula de ADN de (a), (ii) cultivar una célula huésped que comprende la molécula del ADN de prueba bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido, y (iii) recuperar el polipéptido desde el cultivo celular.
30. El polipéptido aislado de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el ADN de prueba tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de la secuencia con respecto a (a) o (b) . .
31. Una molécula quimérica, caracterizada porque comprende un polipéptido de FGF-19 fusionado a una secuencia de aminoácidos heteróloga.
32. La molécula quimérica de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos heteróloga es una secuencia de la etiqueta del epítope.
33. La molécula quimérica de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque la secuencia de aminoácidos heteróloga es una región de Fc de una inmunoglobulina.
34. Un anticuerpo, caracterizado porque se une específicamente a un polipéptido de FGF-19.
35. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .
36. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.
37. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.
38. Un agonista, caracterizado porque es para un polipéptido de FGF-19.
39. Un antagonista, caracterizado porque es para un polipéptido de FGF-19.
40. Una composición de material, caracterizada porque comprende (a) un polipéptido de FGF-19, (b) un agonista para un polipéptido de FGF-19, (c) un antagonista para un polipéptido de FGF-19, o (d) un anticuerpo de anti-FGF-19 mezclado con un portador farmacéuticamente aceptable.
41. Un método para la selección de un agente bioactivo capaz de unión al FGF-19, caracterizado porque comprende: a) agregar un agente bioactivo candidato a una muestra de FGF-19, y b) determinar la unión del agente candidato al FGF-19, en donde la unión indica un agente bioactivo capaz de unión al FGF-19.
42. Un método para la selección de un agente bioactivo capaz de modular la actividad del FGF-19, el método está caracterizado porque comprende los pasos de: a) agregar un agente bioactivo candidato a una muestra de FGF-19, y b) determinar una alteración en la actividad biológica del FGF-19, en donde una alteración indica un agente bioactivo capaz de modular la actividad del FGF-19.
43. Un método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la actividad biológica es la absorción reducida de la glucosa en los adipocitos.
44. Un método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la actividad biológica es la liberación incrementada de leptina desde los adipocitos.
45. Un método de identificación de un receptor para el FGF-19, el método está caracterizado porque comprende combinar el FGF-19 con una composición que comprende el material de la membrana celular en donde el FGF-19 forma un complejo con un receptor sobre el material de la membrana celular, e identificar el receptor como un receptor de FGF-19.
46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el FGF-19 se une al receptor, y el método incluye además un paso de reticulación del FGF-19 y el receptor.
47. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la composición es una célula.
48. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la composición es una preparación del extracto de la membrana celular.
49. Un método de inducción de la liberación de la leptina desde las células de los adipocitos, el método está caracterizado porque comprende administrar el FGF-19 a las células en una cantidad efectiva para inducir la liberación de la leptina.
50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el FGF-19 es administrado como una proteína.
51. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el FGF-19 es administrado como un ácido nucleico.
52. Un método para inducir una reducción en la absorción de la glucosa en las células de los adipocitos, el método está caracterizado porque comprende administrar el FGF-19 a las células en una cantidad efectiva para inducir una reducción en la absorción de la glucosa.
53. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el FGF-19 es administrado como una proteína.
54. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el FGF-19 es administrado como un ácido nucleico.
55. Un método de tratamiento de la obesidad en un individuo, el método está caracterizado porque comprende administrar al individuo una composición que comprende el FGF-19 en una cantidad efectiva para tratar la obesidad.
56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el tratamiento de la obesidad conduce además al tratamiento de una condición relacionada con la obesidad.
57. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el FGF-19 es administrado como una proteína.
58. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el FGF-19 es administrado como un ácido nucleico.
59. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la composición comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.
60. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el FGF-19 tiene al menos aproximadamente 85% de identidad de la secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (SEC ID NO: 2) .
61. Un método para reducir la masa corporal total en un individuo, el método está caracterizado porque comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del FGF-19.
62. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el FGF-19 es administrado como una proteína.
63. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el FGF-19 es administrado como un ácido nucleico.
64. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el FGF-19 es administrado con un portador farmacéuticamente aceptable.
65. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la reducción en la masa corporal total incluye una reducción en la grasa del individuo.
66. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque el FGF-19 tiene al menos aproximadamente 85% de identidad de la secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (SEC ID NO: 2) .
67. Un método de reducción del nivel de al menos uno de los triglicéridos y los ácidos grasos libres en un individuo, el método está caracterizado porque comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del FGF-19.
68. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el FGF-19 es administrado como una proteína.
69. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el FGF-19 es administrado como un ácido nucleico.
70. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el FGF-19 es administrado con un portador farmacéuticamente aceptable.
71. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el FGF-19 tiene al menos aproximadamente 85% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (SEC ID NO: 2) .
72. Un método para incrementar la velocidad metabólica en un individuo, el método está caracterizado porque comprende administrar al individuo una cantidad efectiva del FGF-19.
73. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el FGF-19 es administrado como una proteína.
74. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el FGF-19 es administrado como un ácido nucleico.
75. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el FGF-19 es administrado con un portador farmacéuticamente aceptable-
76. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el FGF-19 tiene al menos aproximadamente 85% de identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 (SEC ID NO: 2) .
77. Un roedor, caracterizado porque comprende un genoma que comprende un transgen que codifica el FGF-19.