ES2231633T3 - Procedimiento para un diagnostico mejorado de las displasias. - Google Patents
Procedimiento para un diagnostico mejorado de las displasias.Info
- Publication number
- ES2231633T3 ES2231633T3 ES02024030T ES02024030T ES2231633T3 ES 2231633 T3 ES2231633 T3 ES 2231633T3 ES 02024030 T ES02024030 T ES 02024030T ES 02024030 T ES02024030 T ES 02024030T ES 2231633 T3 ES2231633 T3 ES 2231633T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- marker
- ink4a
- gene
- cells
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Fittings On The Vehicle Exterior For Carrying Loads, And Devices For Holding Or Mounting Articles (AREA)
- Ultra Sonic Daignosis Equipment (AREA)
- Lock And Its Accessories (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Un procedimiento para discriminar las células displásicas que sobreexpresan los productos del gen INK4a de otras células que expresan productos del gen INK4a a un nivel detectable en muestras biológicas, que comprende la determinación en un procedimiento de prueba citológico o histológico de la coexpresión de al menos dos moléculas marcadoras en al menos una sola célula, en el que al menos una molécula marcadora es un producto de expresión codificado por el gen INK4a y al menos otra molécula marcadora es un marcador de proliferación celular, en el que la sobreexpresión de al menos un producto del gen INK4a y la expresión de al menos un marcador de proliferación celular activa a una un nivel detectable en dicha célula única es indicadora del estado displásico de la célula y en el que la sobreexpresión de al menos un producto del gen INK4a y la expresión de al menos un marcador de senescencia, diferenciación celular terminal, apoptosis o detención del ciclo celular a un nivel detectable en dicha célula única es indicadora del estado no displásico de la célula.
Description
Procedimiento para un diagnóstico mejorado de las
displasias.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para un diagnóstico mejorado de las displasias basado
en la detección simultánea de productos del gen INK4a y al menos
un marcador de proliferación celular. Particularmente la presente
invención proporciona un procedimiento para discriminar las células
displásicas que sobreexpresan los productos del gen INK4a de las
células que sobreexpresan los productos del gen INK4a sin ser
displásicas mediante la detección de un marcador adecuado para
caracterizar las propiedades de proliferación de las células
respectivas. La caracterización de las propiedades de proliferación
puede comprender la detección de un marcador o de un conjunto de
marcadores característico de la proliferación celular activa y/o un
marcador o un conjunto de marcadores característico del retraso o
de la interrupción de la proliferación celular. Así, el
procedimiento que se presenta en esta solicitud permite un
diagnóstico específico de displasia en muestras histológicas y
citológicas.
La detección de la sobreexpresión de
p16^{INK4a} en las muestras biológicas ha resultado ser un
marcador útil para la detección de lesiones anogenitales como
carcinoma del cuello uterino (véanse los documentos WO00/01845;
Klaes y col., Int. J. Cancer: 92, 276-284 (2001)).
El procedimiento que se basa en la tinción inmunoquímica
específica de p16^{INK4a} permite la identificación sensible y
específica de células displásicas en secciones tisulares y en
muestras citológicas.
En los exámenes inmunohistoquímicos de los
tejidos, las células displásicas y neoplásicas se pueden teñir
usando un procedimiento de tinción mediado por un anticuerpo
específico frente a p16^{INK4a}. Así, el diagnóstico histológico
de las lesiones neoplásicas se puede basar en un procedimiento de
tinción que se basa en un marcador molecular característico de la
transformación de las células de las lesiones anogenitales. En estos
procedimientos el diagnóstico, tanto si las células son
neoplásicas como si no lo son, no se basa sólo en la tinción
específica frente a p16^{INK4a}, sino que también se basa en la
información histológica.
Esto se debe al hecho de que en aproximadamente
el 20-30% de las muestras las células metaplásicas
muestran cierto grado de inmunorreactividad a anticuerpos
específicos frente a p16^{INK4a}, y así se tiñen durante los
procedimientos. A pesar de todo, el patrón de tinción que dan estas
células metaplásicas difiere del patrón que se obtiene en las
lesiones neoplásicas. Las células metaplásicas dan un patrón de
tinción parcheada o focal, mientras que las lesiones neoplásicas
dan un patrón de tinción difusa. Además, la intensidad de la
tinción de las células metaplásicas es predominantemente menor que
la de las células neoplásicas.
Los procedimientos habituales que se usan en
pruebas de cribado para la detección temprana de displasias y/o
neoplasias no emplean pruebas basadas en la histología, sino que se
basan en procedimientos de pruebas citológicos. Especialmente en
los casos en los que no se dispone de información histológica sobre
la arquitectura de los tejidos, como por ejemplo en los exámenes
citológicos, la prueba únicamente de la sobreexpresión de
p16^{INK4a} puede dar resultados falsos positivos. Esto se debe
al hecho de que las fracciones de células metaplásicas que expresan
p16^{INK4a} a niveles elevados detectables pueden no
diferenciarse por medio de criterios histológicos.
El porcentaje de células que muestran
sobreexpresión de p16^{INK4a} aumenta en el transcurso de la
aparición de las displasias. Así, en las etapas neoplásicas o
preneoplásicas, cuando en las muestras sólo hay una población
escasa de células neoplásicas o preneoplásicas, la
inmunorreactividad a p16^{INK4a} puede ser débil. Esta débil
inmunorreactividad puede ser aproximadamente del mismo nivel que la
que producen las células metaplásicas. En etapas más tardías de las
displasias la inmunorreactividad total a p16^{INK4a} es más
intensa y de esta manera las lesiones neoplásicas son fácilmente
distinguibles de las metaplasias incluso en un formato de prueba
citológico. Esto puede dar lugar a casos en los que la presencia de
células metaplásicas que expresan p16^{INK4a} puede confundirse
con la presencia de células neoplásicas, y de esta manera da lugar
a un resultado falso positivo.
Especialmente en pruebas de cribado, en las que
es deseable la detección de etapas tempranas de las neoplasias,
esta situación es bastante desagradable. Esto es especialmente
cierto porque el diagnóstico basado en p16^{INK4a} ha resultado
ser una herramienta útil en los exámenes histológicos, y la
aplicación de procedimientos de cribado citológicos permitiría
mejorar estos procedimientos establecidos.
Para reducir los resultados falsos positivos de
las pruebas citológicas y de esta manera mejorar más la fidelidad
del diagnóstico mediado por p16^{INK4a} de las lesiones
anogenitales, sería deseable un procedimiento para discriminar las
metaplasias de las lesiones neoplásicas y displásicas. En las
formas de realización que se reivindican en la presente invención
se proporciona un procedimiento para discriminar las metaplasias de
las lesiones neoplásicas y preneoplásicas.
Para apoyar la discriminación de las metaplasias
respecto a las lesiones neoplásicas en los procedimientos de prueba
que se basan en la sobreexpresión de p16^{INK4a}, sería deseable
un marcador molecular que se expresase en células y tejidos
neoplásicos y/o preneoplásicos y que no se expresase
simultáneamente con los productos del gen INK4a en una célula
metaplásica única.
Los procedimientos que se reivindican en esta
invención proporcionan una solución al problema presente en la
técnica. En el transcurso de los experimentos que dieron lugar a la
presente invención los investigadores han encontrado que una
combinación de la detección de la presencia o ausencia y/o del
nivel de p16^{INK4a} en combinación con al menos un marcador de
proliferación celular como, por ejemplo, Ki67,
Ki-S2, mcm5 o mcm2, puede resolver el problema
presente en la técnica.
En la técnica se presentan algunos documentos
relativos al uso de una combinación de marcadores moleculares para
un diagnóstico mejorado de las displasias. En el documento
WO0208764 se describe un procedimiento para un diagnóstico mejorado
de las neoplasias malignas cervicales usando una combinación de un
marcador del VPH y un marcador de proliferación celular o de
actividad vírica. p16^{INK4a} se menciona en el contexto de esta
invención como marcador de actividad vírica para combinarlo con los
marcadores de VPH.
En el documento EP1217377 se describe un
procedimiento para la detección automatizada de las neoplasias
cervicales malignas mediado por la detección de más de una molécula
marcadora. En este documento se presentan algunas combinaciones
definidas de marcadores. En este documento no hay descripción sobre
la elección de marcadores adecuados para una combinación. El
objetivo de la combinación de esta aplicación es mejorar la
fidelidad del análisis automatizado de los patrones de tinción en
muestras citológicas y biológicas. Este documento menciona la
combinación de p16^{INK4a} con otros marcadores tumorales.
El documento WO02059616 prescribe un
procedimiento para la detección de trastornos del ciclo celular
para un diagnóstico mejorado de las neoplasias cervicales
malignas. El documento describe que las células displásicas
muestran trastornos del control del ciclo celular y de esta manera
se pueden identificar por medio de la detección en las células de
proteínas del tipo de la ciclina E junto a sustancias postG1.
Jeffrey Keating, en "22Ki67, Cyclin E, and
p16^{INK4a} Are Complimentary Surrogate Biomarkers for Human
Papilloma Virus-Related Cervical Neoplasia"
(American Journal of Surgical Pathology
25/7):884-891, 2001), describe la complementariedad
del uso de p16^{INK4a}, Ki67 y ciclina E en el transcurso del
diagnóstico de las displasias cervicales. El documento se refiere a
los problemas de cada marcador único en la detección de las
displasias y afirma que p16^{INK4a} en combinación con la ciclina
E puede ser adecuado para superar los inconvenientes de las
moléculas marcadoras aisladas, especialmente cuando se examinan
muestras citológicas. No se hace ninguna descripción sobre el uso
de p16^{INK4a} junto a un marcador característico de células en
proliferación como Ki67. el documento no enseña la combinación de
p16^{INK4a} para su uso en procedimientos diagnósticos; además,
la descripción se refiere a un uso restringido de Ki67 en el
diagnóstico diferencial de las lesiones cervicales y de esta manera
se aleja del uso de este marcador en el diagnóstico de las
neoplasias cervicales malignas.
En la técnica no hay ninguna descripción que
enseñe el uso de una combinación de p16^{INK4a} con un marcador
característico de proliferación celular para su uso en un
procedimiento diagnóstico para una mejor discriminación de las
células no displásicas positivas para p16^{INK4a} de las
displasias positivas para p16^{INK4a}. El documento WO02059616 no
aporta datos sobre el uso de p16^{INK4a} en la detección de la
proliferación de células displásicas. El documento EP1217377 no
enseña un objetivo de la combinación de marcadores tumorales en el
proceso de detección distinto a la automatización del procedimiento
del análisis. No hay ninguna descripción relativa a la ventaja de
las combinaciones con fines de discriminación específica como la
discriminación de células displásicas de, por ejemplo, células
metaplásicas en muestras cervicales.
Los inventores de la presente invención buscaron
superar el inconveniente presente en la técnica de que
p16^{INK4a}, que se sobreexpresa en varias displasias, también se
puede detectar en algunas otras células no displásicas. La
discriminación entre células no displásicas positivas para
p16^{INK4a} y células displásicas que sobreexpresan p16^{INK4a}
se puede basar en las características de proliferación de las
células respectivas. En células sometidas a un control normal,
p16^{INK4a} inhibe a cdk4 y de esta manera inhibe la
proliferación. Por el contrario, en las células displásicas la
regulación está alterada. Así, p16^{INK4a}, a pesar de su nivel
de expresión anormalmente elevado, no produce inhibición de la
proliferación celular.
Los inventores de la presente invención
encontraron que las células displásicas se pueden diferenciar de
las células que muestran una proliferación celular controlada
mediante la detección simultánea de p16^{INK4a} con un marcador
característico de la proliferación celular. Debido al hecho de que
en las células normales los niveles elevados de p16^{INK4a}
inhiben la proliferación celular, las células que sobreexpresan
p16^{INK4a} se pueden clasificar como displásicas si muestran
características de proliferación celular activa.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la discriminación de lesiones neoplásicas,
preneoplásicas y/o displásicas de células no displásicas que
muestran niveles elevados de p16^{INK4a}, en muestras biológicas
en un procedimiento de prueba histológico o citológico basado en la
detección de la presencia o ausencia de células que expresan el gen
de p16^{INK4a} simultáneamente a marcadores de proliferación
celular en dichas muestras biológicas. Marcadores adecuados de
proliferación celular pueden ser, por ejemplo, Ki67,
Ki-S2, Ki-S5, mcm5 y mcm2. En una
forma de realización de la invención las proteínas o el ARNm de los
marcadores de proliferación celular pueden actuar como marcador
para la discriminación de las metaplasias de las lesiones
displásicas tempranas o preneoplásicas en las muestras.
Un aspecto de la presente invención es
proporcionar un procedimiento para discriminar las células
displásicas que sobreexpresan los productos del gen INK4a de otras
células que expresan los productos del gen INK4a a un nivel
detectable en muestras biológicas, que comprende la determinación
en un procedimiento de prueba citológico o histológico de la
coexpresión de al menos dos moléculas marcadoras en al menos una
sola célula, en el que al menos una molécula marcadora es un
producto de expresión codificado por el gen INK4a y al menos otra
molécula marcada es un marcador de proliferación celular, en el que
la sobreexpresión de al menos un producto del gen INK4a y la
expresión de al menos un marcador de proliferación celular activa a
un nivel detectable mediante inmunoquímica en dicha célula única es
indicativa del estado displásico de la célula, y en el que la
sobreexpresión de al menos un producto del gen INK4a y la expresión
de al menos un marcador de senescencia, diferenciación terminal de
las células, apoptosis o detención del ciclo celular a un nivel
detectable en dicha célula única es indicativo del estado no
displásico de la célula.
Un segundo aspecto de la presente invención se
relaciona con un kit de prueba para la determinación de displasias
en muestras según el procedimiento que se describe en esta
solicitud, y que comprende los componentes que se definen en las
reivindicaciones del kit.
Durante los experimentos que dieron lugar a la
presente invención se encontró que en ciertas circunstancias las
células no displásicas pueden mostrar inmunorreactividad a
p16^{INK4a}. Los inventores encontraron que estas células que
mostraban un control ordenado de la proliferación celular en
respuesta a los niveles elevados de los productos del gen INK4a
están sometidas a detención del crecimiento. Así, estas células
individuales no muestran inmunorreactividad a marcadores de
proliferación celular. Por el contrario, las células transformadas
que sobreexpresan p16^{INK4a} muestran una alteración de la
regulación del control de la proliferación celular y no responden
al nivel elevado de p16^{INK4a} mediante detención de la
proliferación. Así, estas células displásicas muestran la expresión
simultánea de p16^{INK4a} y de marcadores de proliferación
celular. Así, los inventores encontraron que la detección
simultánea de p16^{INK4a} con marcadores de proliferación celular
puede ayudar a discriminar las células displásicas de las células
que sobreexpresan p16^{INK4a} y que están en detención del
crecimiento, como las células metaplásicas.
El descubrimiento de que la sobreexpresión de
p16^{INK4a} en varias displasias también se puede detectar en
algunas células no displásicas llevó a los inventores del presente
procedimiento a establecer una técnica para discriminar entre
células no displásicas positivas a p16^{INK4a} y células
displásicas que sobreexpresan p16^{INK4a} basándose en las
características de proliferación de las células respectivas.
Mientras que en las células que tienen un control normal
p16^{INK4a} inhibe a cdk4 y de esta manera inhibe la
proliferación celular, esto no es así en las células displásicas.
Así, en las células displásicas, a pesar de su elevado nivel de
expresión, p16^{INK4a} no produce inhibición de la proliferación
celular.
El procedimiento que se describe en esta
solicitud se basa en el hecho de que las células displásicas se
pueden diferenciar de las células que muestran una proliferación
celular con un control normal mediante la detección simultánea de
un producto del gen INK4a, como p16^{INK4a}, con un marcador
característico de proliferación celular.
El término marcador, así como moléculas
marcadoras, en general se usará en esta solicitud para referirse a
productos de expresión de genes de marcadores de proliferación, así
como a los productos de expresión del gen INK4a.
Las denominaciones que se dan en este texto para
los genes se pueden relacionar en parte con los genes o proteínas
que se han descubierto en cualquier organismo. En el contexto de la
presente invención esta denominación se referirá al homólogo
correspondiente de los marcadores citados en el organismo a que se
refiere en particular el procedimiento que se describe en esta
solicitud. En ciertas formas de realización de la presente
invención este organismo es un mamífero, y en una forma de
realización puede ser un ser humano. Así, en una forma de
realización de la presente invención los marcadores citados serán
los homólogos humanos de los que se presentan, de manera
respectiva.
Generalmente, en todo el texto el término
"marcador de proliferación (celular)" o "marcador de
proliferación celular" en sus diversas formas gramaticales se
usa para referirse a proteínas y a marcadores de ácidos nucleicos.
En el caso de que se use en esta solicitud el nombre de la proteína
de un marcador como, por ejemplo, "proteína de replicación",
se comprenderá que este uso es una metonimia y que se refiere tanto
a la proteína como a las moléculas marcadoras del ácido nucleico
que codifica la proteína particular.
Un marcador útil en la presente invención puede
ser cualquier molécula que se transcribe a partir de un gen o
cualquier molécula que se traduce a partir de un transcrito de este
tipo. Así, producto génico, como se usa en el contexto de la
presente invención, puede comprender polinucleótidos como, por
ejemplo, ADN y ARN, y polipéptidos como proteínas, proteoglucanos,
péptidos, etc. Producto(s) de expresión, como se usa en el
contexto de la presente invención, comprende cualquier transcrito
de un locus génico en dirección anterógrada o inversa, incluyendo
cualquier marco de lectura y variante de ayuste. Productos de
expresión, como se usa en esta solicitud, comprende cualquier
producto alternativo codificado por los ácidos nucleicos de un
locus génico particular.
Productos génicos codificados por INK4a, como se
usa en la presente invención, será cualquier ARNm transcrito a
partir del locus del gen INK4a o cualquier polipéptido traducido
desde ese ARNm. En una forma de realización de la invención los
productos de expresión codificados por el gen INK4a pueden tener
pesos moleculares de aproximadamente 5 a 40 kDa o cualquier valor
intermedio, y preferentemente de aproximadamente 10 a 20 kDa o
cualquier valor intermedio, y más preferentemente de
aproximadamente 14 a aproximadamente 19 kDa o cualquier valor
intermedio, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos génicos de INK4a adecuados para el
procedimiento de la presente invención pueden comprender, por
ejemplo, productos génicos como, por ejemplo, p16^{INK4a} y
p14ARF.
El término "marcador de proliferación
(celular)" o "marcador de proliferación celular", como se
usa en el contexto de la presente invención, comprenderá cualquier
molécula marcadora que se sabe en la técnica que es característica
del estado de proliferación de las células. El estado de
proliferación puede ser, por ejemplo, un estado de células en
proliferación activa, de retraso de la proliferación celular, de
detención de la proliferación celular, de células senescentes, de
células con diferenciación terminal, de apoptosis, etc. En una
forma de realización de la invención el marcador de proliferación
celular es una molécula marcadora característica de la
proliferación celular activa. En otra forma de realización de la
invención la molécula marcadora de proliferación puede ser una
molécula característica de células detenidas, con diferenciación
terminal, senescentes o apoptóticas.
En ciertas formas de realización los marcadores
de proliferación para su uso en el contexto de la presente
invención pueden comprender genes que participan en la replicación
del ADN como, por ejemplo, proteínas del complejo de preiniciación
o de la horquilla de replicación. Esas moléculas pueden comprender,
por ejemplo, helicasas como la helicasa eucariótica o proteínas
MCM (MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6, MCM7), proteína TP según se
describe en los documentos WO0050451 y WO0217947 (también
denominada HELAD1, Pomfil2 y Unc-53), cinasas o
fosfatasas que participan en el proceso de replicación como, por
ejemplo, CDC6, proteín cinasa CDC7, Dbf4, proteín fosfatasa CDC14,
CDC45 y MCM10. Además, los marcadores de proliferación pueden
comprender proteínas que participan en el proceso de la horquilla
de replicación, como por ejemplo PCNA o ADN polimerasa delta,
proteína de replicación A (RPA), factor de replicación C (RFC) y
FEN1.
En otras formas de realización los marcadores de
proliferación pueden comprender moléculas necesarias para el
mantenimiento de la proliferación celular como Ki67,
Ki-S5 o Ki-S2. En esta forma de
realización las proteínas pueden, por ejemplo, estar presentes en
todo el ciclo celular. Son útiles para realizar un procedimiento
según la presente invención siempre que sean características de la
proliferación celular activa y que no se expresen de manera
significativa en células en estado de detención del crecimiento,
diferenciación terminal, apoptosis o senescencia. Ki67,
Ki-S2 y Ki-S5, se referirán a las
moléculas marcadoras proteicas detectadas con los anticuerpos
respectivos, así como los ácidos nucleicos que codifican estos
antígenos.
En otra forma de realización los marcadores de
proliferación celular para su uso en un procedimiento según la
presente invención pueden ser una molécula marcadora característica
del retraso o de la interrupción de la proliferación celular como,
por ejemplo, un marcador de senescencia, un marcador de detención
del ciclo celular, un marcador característico de células con
diferenciación terminal o un marcador de apoptosis. Esas moléculas
comprenden, por ejemplo, p21, p27, caspasas, BAD, CD95, ligando
fas, proteínas parp, etc.
Discriminación, como se usa en el contexto de la
presente invención, comprenderá la evaluación de si se debe
clasificar a una muestra de una u otra manera. En una forma de
realización de la invención la discriminación se refiere a la
evaluación de si un tejido o los componentes del mismo son
displásicos o si son no displásicos. Así, la discriminación, como
se usa en esta solicitud, es un juicio sobre las propiedades de
crecimiento de las células de una muestra biológica.
En una forma de realización de la presente
invención la discriminación comprende la detección de la expresión
de un producto del gen INK4a simultáneamente con la detección de la
expresión de un marcador característico de proliferación celular
activa. En este caso las células que coexpresan ambas moléculas
marcadoras se deben clasificar como displásicas.
En otra forma de realización de la presente
invención la discriminación comprende la detección de un producto
del gen INK4a simultáneamente con la detección de la expresión de
un marcador característico de detención, interrupción o retraso de
la proliferación celular. En este caso las células que coexpresan
ambas moléculas marcadoras se deben clasificar como no
displásicas.
En ciertas formas de realización de la presente
invención será útil detectar la presencia o ausencia y/o el nivel
de más de dos moléculas marcadoras. En una forma de realización se
detectará un producto de expresión del gen INK4a de manera
concertada con dos o más marcadores de proliferación celular. Esto
puede ser útil para mejorar la identificación de las propiedades de
proliferación de las células que expresan el producto del gen INK4a
en las muestras. Algunos marcadores de proliferación están
restringidos a fases específicas del ciclo celular o están
presentes en una cantidad baja en las células. Debido a este hecho
en algunos casos se puede mejorar la detección de las células en
proliferación que expresan los productos del gen INK4a mediante la
detección de dos o más marcadores de proliferación. En esos casos,
por ejemplo, un marcador de proliferación que se expresa durante
todo el ciclo proliferativo celular se puede detectar
simultáneamente con marcadores que son característicos de fases
específicas del ciclo celular. Por ejemplo, se puede detectar Ki67,
K1-S5 o Ki-S2 junto a mcm5, mcm2,
PCNA, rpA, rfC, etc. En otros casos, por ejemplo, se pueden
detectar proteínas que participan en la replicación del ADN junto a
Ki67, K1-S5 o Ki-S2. En otro ejemplo
se puede detectar Ki67 junto a Ki-S2. Se debe
comprender que estos ejemplos pretenden representar posibilidades
combinatorias y no serán exhaustivos, de modo que otras
combinaciones de marcadores de proliferación también son útiles y
adecuadas en la realización de un procedimiento según la presente
invención.
Cuando sea necesario, se puede aplicar una
combinación de dos o más moléculas marcadoras de proliferación
celular a un procedimiento como el que se describe en esta
solicitud. En otra forma de realización, se pueden detectar dos o
más moléculas marcadoras en grandes periodos del ciclo celular o
incluso en todo el ciclo celular o en células en proliferación
activa junto a un procedimiento como el que se describe en esta
solicitud. Una combinación de más de una molécula marcadora de
proliferación celular generalmente puede ser útil para mejorar la
sensibilidad de la detección de las características de
proliferación de las células.
En ciertas formas de realización de la presente
invención una combinación puede comprender además otras moléculas
marcadoras como moléculas marcadoras de senescencia, marcadores de
células con detención del crecimiento, marcadores de células con
diferenciación terminal, marcadores de células apoptóticas,
marcadores de infección vírica o de actividad vírica en las
células, o proteínas reguladoras del ciclo celular como marcadores.
En ciertas formas de realización en conexión con displasias que se
asocian a la infección por el VPH, puede ser útil la detección de
moléculas marcadoras asociadas al VPH o de marcadores de actividad
vírica para la detección de una displasia. Los procedimientos
útiles para la detección de la infección por el VPH en las muestras
son conocidos a los expertos en la materia. Estos procedimientos
pueden comprender procedimientos que emplean sondas específicas
para agentes del VPH o pueden emplear reacciones de amplificación
de ácidos nucleicos. La detección de una infección vírica se puede
realizar simultáneamente o posteriormente a la detección de las
moléculas la detección de las moléculas de INK4a y de las moléculas
marcadoras de proliferación.
Displásico, como se usa en el contexto de la
presente invención, se referirá a displasias desde leves a graves y
a sus etapas precursoras, así como a carcinomas como carcinomas
in situ o carcinomas invasores y células tumorales
diseminadas. Así, displásico, como se usa en esta solicitud,
también comprenderá las etapas tempranas y precursoras de
displasias y carcinomas.
Las células que sobreexpresan los productos del
gen INK4a sin ser displásicas (no displásico, como se usa en esta
solicitud), como se menciona en la presente solicitud, pueden, por
ejemplo, comprender células metaplásicas, células senescentes,
células con diferenciación terminal o células que, en ciertas
etapas del ciclo celular, muestran niveles elevados de los
productos del gen INK4a. En ciertas células los niveles elevados de
productos del gen INK4a pueden producirse incluso como respuesta a
señales externas como hormonas, transmisores, etc. En una forma de
realización de la presente invención las células no displásicas que
sobreexpresan productos del gen INK4a comprenden, por ejemplo,
células metaplásicas, células endometriales, etc.
El procedimiento para detectar el nivel de
expresión de los productos codificados por el gen INK4a y/o los
productos del gen del marcador de proliferación según la presente
invención es cualquier procedimiento que puede (pero que no tiene
por qué), por ejemplo, estar adaptado para detectar incluso
cantidades muy pequeñas de moléculas biológicas específicas en
muestras biológicas. La reacción de detección de la presente
invención es una detección que se basa en el nivel de ácidos
nucleicos o en el nivel de polipéptidos.
Se dice que una molécula marcadora es detectable,
como se usa en el contexto de la presente invención, siempre que
se pueda detectar el marcador durante el transcurso de un
procedimiento adecuado de detección como, por ejemplo, hibridación
in situ, tinción inmunoquímica, ensayos de captura de
híbridos, etc. Se puede detectar el nivel de expresión de una
molécula marcadora usando reacciones indicadoras adecuadas como,
por ejemplo, un procedimiento cromógeno o de tinción inmunoquímica
basado en fluorescencia o un procedimiento de hibridación in
situ para análisis microscópicos o automatizados. Para mejorar
la señal indicadora se pueden aplicar procedimientos adecuados
conocidos a los expertos en la materia en el transcurso de un
procedimiento de la presente invención. Así, se dice que el
marcador es detectable cuando la tinción sobrepasa a la tinción
basal respectiva que se obtiene de manera inherente en el
procedimiento de tinción inmunoquímica, de modo que se producen
resultados significativos de tinción.
Las moléculas marcadoras se pueden detectar
usando reactivos que reconocen específicamente estas moléculas. La
reacción de detección de los productos del gen INK4a y/o de los
productos del gen del marcador de proliferación puede comprender
una o más reacciones con agentes de detección que reconocen las
moléculas marcadoras iniciales o que reconocen las moléculas
anteriores que se usaron para reconocer otras moléculas.
En ciertas formas de realización de la presente
invención se pueden usar dos o más sondas para la detección de una
sola molécula marcadora. Por ejemplo, se pueden usar dos o más
agentes de unión diferentes (por ejemplo, anticuerpos) o sondas de
oligonucleótidos dirigidas frente a una sola molécula marcadora
(por ejemplo, frente a diferentes epítopos o diferentes
secuencias) en el transcurso del procedimiento que se describe en
la presente solicitud.
La detección de los diferentes productos génicos
se puede realizar en un recipiente o contenedor de reacción o en
diferentes contenedores simultáneamente o de manera sucesiva. Así,
los diferentes productos génicos se pueden detectar simultáneamente
en una célula que coexpresa ambos productos. En otros casos, se
pueden usar células que coexpresan los productos génicos para la
reacción de detección por separado (separada en el espacio o en el
tiempo) para detectar cada vez un solo marcador en las células. En
otra forma de realización podría haber células que expresan uno o
el otro marcador. La detección de las moléculas marcadoras en las
diferentes células también se puede realizar simultáneamente o por
separado en el tiempo y/o en el espacio.
La reacción de detección además puede comprender
una reacción indicadora que indica la presencia o ausencia y/o el
nivel de los productos del gen de la molécula marcadora. La
reacción indicadora puede ser, por ejemplo, una reacción que
produce un compuesto coloreado, una reacción de bioluminiscencia,
una reacción de fluorescencia, generalmente una reacción emisora de
radiación, etc.
En ciertas formas de realización se pueden
reconocer diferentes moléculas marcadoras con agentes que producen
diferentes señales indicadoras, de modo que se podrían distinguir
las señales que se refieren a las moléculas marcadoras. En una
forma de realización preferida de la invención la detección de la
expresión de los dos o más productos del gen INK4a y/o de los
productos del gen del marcador de proliferación se realiza
simultáneamente. En este caso, la reacción indicadora, por ejemplo,
puede emplear diferentes marcadores fluorescentes para las
diferentes moléculas que se detectan.
Sin embargo, en el contexto de la presente
invención no se debe responder necesariamente a si uno u otro del
marcador de proliferación y del producto génico del marcador de
INK4a se expresa en las células. En ciertas formas de realización
la pregunta es si se expresa algún marcador de proliferación y/o
producto del gen INK4a. Así, en el transcurso de los experimentos se
puede elegir un procedimiento que da la misma señal de
fluorescencia como indicación de la presencia de un marcador de
proliferación. Este procedimiento es adecuado para mejorar la
sensibilidad de la detección de las características de
proliferación celular (diferentes marcadores característicos de la
proliferación celular activa). Si es necesario se puede aplicar el
procedimiento para conseguir una señal detectable para 3, 4 o
incluso más moléculas marcadoras características de la
proliferación celular. De manera análoga, en ciertas circunstancias
puede ocurrir lo mismo con los productos de expresión del gen
INK4a. Se debe comprender que en algunas situaciones pueden ser
deseables señales de tinción diferentes para diferentes moléculas
marcadoras de proliferación. Los procedimientos se pueden aplicar a
las necesidades del experimento correspondiente.
En ciertas formas de realización de la presente
invención se puede detectar una combinación de uno o más (por
ejemplo, dos diferentes) productos del gen INK4a con una
combinación de uno o más, por ejemplo un conjunto de 2, un conjunto
de 3, un conjunto de 4, un conjunto de 5 o un conjunto de incluso
más marcadores de proliferación celular. Si es necesario la
detección de las moléculas marcadoras de proliferación celular
puede dar sólo una señal indicadora. En otros casos cada marcador
único de proliferación celular puede dar una señal indicadora
específica o grupos de moléculas marcadoras pueden dar señales
indicadoras específicas.
Las señales para la indicación de la presencia de
inmunorreactividad pueden ser señales cromógenas producidas por
varios procedimientos conocidos en la técnica. Se pueden usar
señales fluorescentes de manera alternativa o incluso en
combinación. Señales indicadoras adecuadas comprenden marcadores
fluorescentes como fluoresceína, rodamina, etc.
Los formatos aplicables a la reacción de
detección según la presente invención pueden ser técnicas de
inmunotransferencia como inmunotransferencia Western,
inmunotransferencia Southern, inmunotransferencia Northern y
procedimientos inmunocitoquímicos o inmunohistoquímicos. Las
técnicas de inmunotransferencia son conocidas a las personas que
tienen conocimientos normales en la materia y se pueden realizar,
por ejemplo, como electroinmunotransferencia, inmunotransferencia
semiseca, inmunotransferencia al vacío o inmunotransferencia en
gota. Los procedimientos de tinción inmunocito/histoquímica son
conocidos a los expertos en la materia y pueden comprender la
detección mediada por agentes de unión de polipéptidos, así como
técnicas de hibridación in situ. Las dos técnicas diferentes
se pueden aplicar incluso simultáneamente. En cierta forma de
realización se puede usar para la detección la captura de híbridos
de ácidos nucleicos. La reacción de amplificación también puede ser
aplicable para la detección de, por ejemplo, moléculas de ácidos
nucleicos.
En una forma de realización de la invención la
detección del nivel de los productos del gen INK4a y/o del gen del
marcador de proliferación se realiza mediante la detección de los
respectivos ácidos nucleicos (por ejemplo, ARNm) o fragmentos de
los mismos presentes en la muestra. Los medios para la detección de
moléculas de ácidos nucleicos son conocidos a los expertos en la
materia. El procedimiento para la detección de ácidos nucleicos
puede, por ejemplo, realizarse mediante una reacción de unión de la
molécula que se va a detectar con sondas para ácidos nucleicos
complementarios, proteínas con especificidad de unión para los
ácidos nucleicos o cualesquiera otras entidades que reconozcan
específicamente a dichos ácidos nucleicos y se unan específicamente
a ellos. En una forma de realización se pueden usar sondas de
hibridación in situ de oligonucleótidos frente a ácidos
nucleicos para la detección de los productos o marcadores de
expresión.
Las sondas, como se usa en el contexto de la
presente invención, pueden ser cualquier agente que se une
específicamente a una molécula. El caso de los ácidos nucleicos,
una sonda puede ser un oligonucleótido que se hibrida con una
secuencia particular. En una forma de realización la sonda puede
ser, por ejemplo, un cebador. En el caso de la detección de
polipéptidos o proteínas la sonda, como se usa en esta solicitud,
puede ser, por ejemplo, un agente de unión como un anticuerpo. En
ciertas formas de realización de la presente invención las sondas
pueden estar marcadas para su detección. El marcador se puede
seleccionar del grupo que comprende un radioisótopo, un compuesto
bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto
fluorescente, un quelato metálico o un enzima. La sonda se puede
aplicar a cualquier procedimiento de detección conocido en la
técnica, por ejemplo, en el transcurso de un procedimiento de
hibridación in situ, en el transcurso de ensayos de captura
de híbridos, en el transcurso de una reacción de tinción
inmunoquímica, en el transcurso de técnicas de inmunotransferencia,
etc.
Este procedimiento se puede realizar tanto in
vitro como directamente in situ, por ejemplo, en el
transcurso de una reacción de detección mediante tinción. Otra
manera de detectar los ARNm marcadores en una muestra que se
realiza con el procedimiento según la presente invención es una
reacción de amplificación de los ácidos nucleicos, que se puede
realizar de manera cuantitativa como, por ejemplo, la reacción en
cadena de la polimerasa. En una forma de realización preferida de
la presente invención se puede usar PCR en tiempo real para
cuantificar el nivel de ARNm marcadores en muestras de displasias de
tumores (células o muestras tisulares).
En otra forma de realización preferida de la
invención la detección del nivel de los productos del gen INK4a y/o
del gen del marcador de proliferación se realiza determinando el
nivel de la expresión de una proteína o de fragmentos de la misma.
La determinación del producto del gen del marcador a nivel proteico
se puede realizar, por ejemplo, en una reacción que comprende un
agente de unión específico para la detección del polipéptido
marcador particular.
Los agentes de unión se pueden usar en muchas
técnicas de detección diferentes, por ejemplo, en
inmunotransferencia Western, ELISA o inmunoprecipitación.
Generalmente la detección de polipéptidos basada en agentes de
unión se puede realizar también tanto in vitro como
directamente in situ, por ejemplo, en el transcurso de una
reacción de tinción inmunoquímica. Se puede usar cualquier otro
procedimiento para determinar la cantidad de polipéptidos
particulares en muestras biológicas según la presente
invención.
Los procedimientos inmunocitoquímicos de
visualización para su uso en el contexto de la presente invención
suelen comprender, por ejemplo, la tinción de preparaciones
citológicas o histológicas con colorantes cromógenos o
fluorescentes. La tinción puede, por ejemplo, comprender la unión
de las moléculas que se van a detectar a un primer agente de unión,
que en sí mismo es detectado por un segundo agente de unión, que
puede estar marcado. En ciertas formas de realización el primer
agente de unión puede ser un ácido nucleico o un agente de unión
proteico (por ejemplo, un anticuerpo) y el agente de unión
secundario puede ser, por ejemplo, un anticuerpo secundario que
reconoce al primer agente de unión.
Se pueden aplicar cualesquiera procedimientos
conocidos en la técnica para realizar la tinción citoquímica o
histoquímica en el transcurso de un procedimiento de la presente
invención.
Los agentes de unión que se usan en el contexto
de la presente invención para la detección del nivel de
polipéptidos de INK4a como los polipéptidos p16^{INK4a} o p14ARF
y los polipéptidos marcadores de proliferación como, por ejemplo,
los polipéptidos mcm5, mcm2, Ki67, Ki-S5, PCNA o
Ki-S2, pueden comprender anticuerpos y fragmentos
de unión a antígenos, anticuerpos híbridos bifuncionales,
peptidomiméticos que contienen epítopos mínimos de unión a
antígenos, anticulinas (anticalina™), etc.
Se dice que un anticuerpo o un agente de unión a
un antígeno reacciona específicamente si reacciona a un nivel
detectable con una proteína descrita en esta solicitud, y no
reacciona significativamente con otras proteínas. Los anticuerpos
que se pueden usar en la presente invención pueden ser anticuerpos
monoclonales o policlonales. Como se usa en esta solicitud, el
término anticuerpo o anticuerpo monoclonal incluye moléculas
intactas, así como fragmentos de anticuerpos. Además, los
anticuerpos que se pueden usar en la presente invención incluyen
anticuerpos quiméricos, monocatenarios y humanizados.
Según la presente invención, los agentes de unión
se pueden usar solos o en combinación. Por medio de una
combinación es posible conseguir un mayor grado de sensibilidad. El
término anticuerpo, preferentemente, se refiere a anticuerpos que
están formados esencialmente por anticuerpos monoclonales mezclados
con diferentes especificidades epitópicas, así como preparaciones
de anticuerpos monoclonales distintos.
Los anticuerpos monoclonales se hacen a partir de
fragmentos que contienen antígenos del polipéptido de la invención
usando diversas técnicas conocidas a los que tienen conocimientos
ordinarios en la materia; véase, por ejemplo: Harlow y Lane,
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1988. En una de esas técnicas se inyecta inicialmente
un inmunógeno que comprende el polipéptido antigénico o una parte
sintética del mismo en una amplia variedad de mamíferos (por
ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas y cabras). En esta etapa
los polipéptidos de esta invención pueden actuar como inmunógenos
sin modificación. De manera alternativa, particularmente para
polipéptidos relativamente cortos, se puede desencadenar una
respuesta inmunitaria superior si el polipéptido está unido a una
proteína transportadora, como albúmina sérica bovina o hemocianina
de lapa californiana. El inmunógeno se inyecta en el huésped
animal, preferentemente según un régimen predeterminado que
incorpora una o más inmunizaciones de refuerzo, y se extrae sangre
periódicamente a los animales. Los anticuerpos policlonales
específicos de los polipéptidos se pueden purificar posteriormente
a partir de dichos antisueros mediante, por ejemplo, cromatografía
de afinidad usando el polipéptido unido a un soporte sólido
adecuado.
En el contexto de la presente invención no se
tiene necesariamente que responder a si se expresa en las células
uno u otro marcador de proliferación. En ciertas formas de
realización la pregunta principal puede ser si se expresa algún
marcador de proliferación. Por eso en el transcurso de los
experimentos se eligió un procedimiento que da la misma señal de
fluorescencia como indicación de la presencia de un marcador de
proliferación. Este procedimiento es adecuado para mejorar la
sensibilidad de la detección de las características de
proliferación celular. Cuando sea necesario, se puede aplicar el
procedimiento para obtener una señal detectable para tres, cuatro o
incluso más moléculas marcadoras de las características de la
proliferación celular. De manera análoga, en ciertas circunstancias
puede ocurrir lo mismo para los productos de expresión del gen
INK4a. Se debe comprender que, en caso necesario, pueden ser
deseables diferentes señales de tinción para diferentes moléculas
marcadoras de proliferación. Los procedimientos se pueden aplicar a
las necesidades del experimento correspondiente.
Según la presente invención, los productos del
gen INK4a y/o los productos del gen del marcador de proliferación
se pueden detectar simultáneamente. En este contexto
simultáneamente, según la presente invención, significa
literalmente en el mismo instante o en el mismo procedimiento de
prueba, en el que las etapas detección aisladas son consecutivas en
el tiempo.
El procedimiento de detección según la presente
invención puede comprender además un procedimiento de tinción
citoquímica que da una tinción cromógena o fluorescente de células
o compartimentos celulares. Esos procedimientos de tinción son
conocidos a los expertos en la materia y pueden comprender, por
ejemplo, tinción de estructuras acidófilas o basófilas o de
regiones subcelulares (por ejemplo, núcleo, mitocondrias, aparato
de Golgi, citoplasma, etc.) o de moléculas específicas (cromosomas,
lípidos, glucoproteínas, polisacáridos, etc.) de las muestras
citológicas. También se pueden emplear colorantes fluorescentes
como DAPI, quinacrina, cromomicina, etc. Además, se pueden aplicar
colorantes cromógenos como Azan, naranja de acridina, hematoxilina,
eosina, rojo Sudán, colorantes de tiamina (azul de toluidina,
tionina). En otras formas de realización se pueden usar en el
transcurso de un procedimiento como el que se describe en esta
solicitud procedimientos de tinción como tinción de Papanicolau,
tinción de Giemsa, tinción de hematoxilina-eosina,
tinción de van Gieson, tinción de Schiff (usando reactivo de
Schiff), procedimientos de tinción empleando precipitación de
metales (como, por ejemplo, plata en procedimientos de tinción que
emplean nitrato de plata) o tinciones insolubles como, por ejemplo,
azul de Turnbull (u otros cianuros metálicos insolubles). Se debe
comprender que los colorantes y procedimientos de tinción citados
son ejemplos de los procedimientos que se pueden aplicar, y que se
puede aplicar cualquier otro procedimiento conocido en la técnica a
un procedimiento como el que se describe en esta solicitud.
Los procedimientos de tinción pueden producir
tinciones cromógenas para el examen con microscopia óptica o
tinciones fluorescentes para el examen con microscopia de
fluorescencia. En otra forma de realización de la presente
invención se pueden usar procedimientos emisores de radiación,
procedimientos que emplean sustancias que alteran la transmisión de
la radiación u otros medios de contraste para visualizar las
condiciones citológicas de una muestra (por ejemplo, la generación
de una impresión óptica por medios como generación de imágenes
(micro)autorradiográfica o (micro) radiográfica) en un
procedimiento según la presente invención.
Todos los procedimientos de tinción y
visualización se pueden usar para el análisis no sólo en
procedimientos microscópicos sino también en procedimientos de
análisis automatizado como citometría de flujo, análisis
microscópico automatizado (computarizado o asistido por ordenador)
o cualquier otro procedimiento para el análisis de muestras
citológicas teñidas.
El análisis de los resultados de la tinción o de
la visualización de los diferentes procedimientos se puede
realizar en una sola etapa de análisis o en diferentes etapas
sucesivas. Por ejemplo, el examen con microscopia óptica de una
muestra se puede realizar antes o después del examen con
microscopia de fluorescencia de la muestra. En la microscopia de
fluorescencia el análisis de diferentes tinciones con diferentes
longitudes de onda de excitación se puede realizar de manera
simultánea o secuencial. Se pueden emplear otros procedimientos de
visualización de manera simultánea o secuencial a los
procedimientos que se han citado.
Puede haber varias circunstancias en las que
serán adecuadas combinaciones de diferentes procedimientos de
tinción. Por ejemplo, en los casos en los que no se pueden
conseguir resultados satisfactorios de tinción citológica mediante
tinción inmunoquímica, puede ser adecuada la aplicación adicional
de técnicas de tinción citológica general.
Una muestra según el procedimiento de la presente
invención puede comprender cualquier muestra que comprende
células. Las muestras pueden comprender, por ejemplo, secreciones,
frotis, líquidos corporales y muestras de células o de tejidos.
En una forma de realización de la presente
invención las muestras comprenden células del tracto anogenital,
del aparato respiratorio o de la piel y sus anejos. En ciertas
formas de realización las células pueden ser células de cuello
uterino, vagina, vulva, pene, ano, recto, árbol bronquial, pulmón,
peritoneo, espacio peritoneal, espacio nasofaríngeo, cavidad oral o
piel. En ciertas formas de realización de la presente invención la
muestra puede ser una muestra histológica, una biopsia o una
muestra citológica como, por ejemplo, un frotis, un exudado, un
lavado, y un líquido corporal que contiene células (esputo,
secreción, saliva, etc.). En ciertas formas de realización de la
presente invención las muestras pueden comprender células
infectadas por el virus del papiloma. En ciertas formas de
realización las muestras pueden comprender frotis cervicales,
lavados broncoalveolares, etc.
En ciertas formas de realización especiales de la
presente invención la muestra se puede preparar como una
preparación en monocapa o en capa fina de una muestra citológica.
Los procedimientos correspondientes para la preparación de una
preparación en monocapa o en capa fina en citología son conocidos a
los expertos en la materia. En una forma de realización la
preparación puede comprender, por ejemplo, la tecnología ThinPrep.
Otros procedimientos comprenden frotis convencionales, o
procedimientos que emplean suspensiones de células para la
preparación de las muestras citológicas.
La preparación de una muestra puede comprender,
por ejemplo, obtener una muestra de un tejido, de un líquido
corporal o de células de un paciente. Según la presente invención
la preparación de la muestra también puede comprender varias etapas
de preparaciones ulteriores de la muestra, como preparación de
disecciones, preparación de suspensiones celulares, extensión o
aplicación de las células que se van a examinar a portaobjetos
microscópicos, preparación de matrices tisulares, aislamiento de
polipéptidos o de ácidos nucleicos, preparación de péptidos o
ácidos nucleicos de fase sólida fija o preparación de cuentas,
membranas o portaobjetos a los que se unen de manera covalente o no
covalente las moléculas que se van a determinar.
En ciertas formas de realización de la presente
invención el procedimiento se puede realizar de manera
automatizada. La automatización del procedimiento se puede
conseguir mediante tinción y análisis automatizado de muestras
histológicas o citológicas en una superficie sólida mediante
procedimientos microscópicos. En otra forma de realización la
automatización puede comprender un análisis mediante cítometría de
flujo de la tinción de las células en solución.
Las lesiones displásicas a las que se puede
aplicar el procedimiento de la presente invención comprenden
cualquier lesión displásica caracterizada por sobreexpresión de los
productos del gen INK4a como, por ejemplo, p16^{INK4a} o p14ARF.
En ciertas formas de realización esas lesiones son displasias
asociadas a infecciones por virus del papiloma como, por ejemplo,
VPH. En una forma de realización el VPH puede ser un subtipo de
VPH de alto riesgo, como VPH16, VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH39,
VPH45, VPH51, VPH52, VPH56, VPH58, VPH59, VPH66, VPH68, etc. En una
forma de realización las lesiones displásicas que se pueden
detectar según la presente invención comprenden lesiones
anogenitales, lesiones del tracto respiratorio, lesiones de la
cabeza y del cuello o lesiones de la piel y de sus anejos. Esas
lesiones pueden comprender, por ejemplo, displasias de ano o recto,
vulva, vagina, cuello del útero o pene, árbol bronquial, pulmón,
cavidad oral o espacio nasofaríngeo.
Otro aspecto de la presente invención es un kit
de prueba para realizar el procedimiento según la presente
invención. El kit puede ser, por ejemplo, un kit de diagnóstico o
un kit de investigación.
Así, un kit de la presente invención comprende al
menos una o más sondas para la detección de la presencia o
ausencia y/o el nivel de la sobreexpresión de al menos un producto
del gen INK4a y al menos un producto de un gen de un marcador de
proliferación celular en muestras biológicas, en el que los
componentes del kit se proporcionan de tal manera que permiten la
detección simultánea de al menos un producto del gen INK4a y al
menos un producto de un gen de un marcador de proliferación celular
en una sola célula de las muestras y en el que se generan al menos
dos señales detectables distinguibles, de las que al menos una
señal detectable es indicadora del nivel de expresión de al menos
un producto del gen INK4a y al menos otra señal detectable es
indicadora del nivel de expresión de al menos un gen de un marcador
de proliferación celular.
Los reactivos para la detección de los productos
del gen del marcador pueden incluir cualquier agente capaz de
unirse a los productos del gen del marcador. Esos reactivos pueden
incluir proteínas, polipéptidos, ácidos nucleicos, ácidos nucleicos
unidos a péptidos, glucoproteínas, proteoglucanos, polisacáridos y
lípidos.
Las muestras del producto del gen INK4a y del
producto del gen del marcador de proliferación para realizar un
control positivo pueden comprender, por ejemplo, ácidos nucleicos
en forma aplicable, como una solución o una sal, péptidos en forma
aplicable, muestras de sección de tejidos o células positivas.
En una forma de realización preferida de la
invención la detección de los productos del gen del marcador se
realiza a nivel de polipéptidos. En esta forma de realización los
agentes de unión pueden ser, por ejemplo, anticuerpos específicos
de los productos del gen del marcador o de fragmentos del
mismo.
En otra forma de realización del kit de prueba la
detección de los productos del gen del marcador se realiza a nivel
del ácido nucleico. En esta forma de realización de la invención el
reactivo para la detección puede ser, por ejemplo, una sonda de
ácidos nucleicos o un cebador inverso complementario a dichos
ácidos nucleicos indicadores.
Así, el problema a resolver era obtener un
procedimiento para discriminar entre células displásicas y otras
células que carecían de potencial de crecimiento maligno. El
procedimiento se puede aplicar a cualquier etapa de las displasias
y puede ser especialmente útil en las etapas tempranas, cuando los
procedimientos diagnósticos citológicos que se basan en la
sobreexpresión de p16^{INK4a} precisan más información para la
identificación de las células metaplásicas.
Además, la presente invención proporciona un kit
para realizar el procedimiento según la presente invención.
Figura
1
La Figura 1 muestra la tinción de una displasia
grave usando anticuerpos dirigidos frente a p16^{INK4a}; para los
detalles experimentales, véase el Ejemplo 1; la inmunorreactividad
a p16^{INK4a} produce fluorescencia verde. Casi todas las células
de la lesión están teñidas positivamente de manera difusa en el
citoplasma y en los núcleos.
\newpage
Figura
2
La Figura 2 muestra la tinción de una displasia
grave usando anticuerpos dirigidos frente a Ki67; para los
detalles experimentales, véase el Ejemplo 1; la inmunorreactividad
a Ki67 produce fluorescencia roja. Muchas células de la displasia
muestran positividad nuclear para Ki67.
Figura
3
La Figura 3 muestra la tinción de una displasia
grave usando anticuerpos dirigidos frente a Ki67 y anticuerpos
dirigidos frente a p16^{INK4a}; para los detalles experimentales,
véase el Ejemplo 1; la inmunorreactividad a Ki67 produce
fluorescencia roja; la inmunorreactividad a p16^{INK4a} produce
fluorescencia verde; el solapamiento de la fluorescencia roja y
verde produce fluorescencia amarilla. Muchas células de la
displasia muestran positividad nuclear para Ki67 además de la
positividad para p16^{INK4a}, y de esta manera se produce
fluorescencia amarilla.
Figura
4
La Figura 4 muestra la tinción de una metaplasia
escamosa usando anticuerpos dirigidos frente a p16^{INK4a}; para
los detalles experimentales, véase el Ejemplo 1; la
inmunorreactividad a p16^{INK4a} produce fluorescencia verde;
algunas células de la metaplasia se tiñen positivamente de manera
difusa en el citoplasma y en los núcleos.
Figura
5
La Figura 5 muestra la tinción de una metaplasia
escamosa usando anticuerpos dirigidos frente a Ki67; para los
detalles experimentales, véase el Ejemplo 1; la inmunorreactividad
a Ki67 produce fluorescencia roja. Muchas células de la metaplasia
escamosa muestran positividad nuclear para Ki67. Las áreas que se
han identificado como positivas por la expresión de p16^{INK4a}
no muestran tinción positiva para Ki67, lo que indica ausencia de
expresión del antígeno en estas áreas.
Figura
6
La Figura 6 muestra la tinción de una displasia
grave usando anticuerpos dirigidos frente a Ki67 y anticuerpos
dirigidos frente a p16^{INK4a}; para los detalles experimentales,
véase el Ejemplo 1; la inmunorreactividad a Ki67 produce
fluorescencia roja; la inmunorreactividad a p161^{INK4a} produce
fluorescencia verde; el solapamiento de la fluorescencia roja y
verde produce fluorescencia amarilla. Las áreas que expresan
positivamente p16^{INK4a} no muestran ninguna tinción positiva
para Ki67, lo que indica ausencia de expresión del antígeno en estas
áreas. Ninguna célula de la muestra da lugar a fluorescencia
amarilla.
Los siguientes ejemplos se dan sólo con fines
ilustrativos y no pretenden limitar el ámbito de la invención que
se describe en esta solicitud. Con el objetivo ilustrativo, los
procedimientos que se describen en esta solicitud se ejemplifican
usando preparaciones histológicas. Los ejemplos histológicos
pretenden juzgar si las células teñidas de una o de otra manera se
deben clasificar como displásicas o metaplásicas. Los
procedimientos se pueden transferir fácilmente a las muestras
citológicas alterando el protocolo de manera adecuada. Estas
alteraciones son conocidas a las personas que tienen conocimientos
normales de la materia.
Secciones de muestras tisulares del cuello del
útero fijadas en formalina e incluidas en parafina se tiñeron con
inmunofluorescencia usando de anticuerpos específicos para
p16^{INK4a} y Ki67.
Las secciones tisulares se rehidrataron mediante
incubación en xileno y etanol graduado, y se transfirieron a agua
bidestilada. Se realizó la retirada de los antígenos con tampón
citrato 10 mM (pH 6,0) para p16^{INK4a} y Ki67. Posteriormente los
portaobjetos se calentaron en un baño de agua durante 40 min a
95ºC-98ºC. Se enfriaron los portaobjetos a TA
durante 20 min, se transfirieron a tampón de lavado
(Tris-HC1 50 mM, NaCl 150 nM, Tween
20/DakoCytomation: nº de código: S3006, al 0,05%).
Para evitar la unión inespecífica del anticuerpo
secundario (especie: cabra), las muestras se incubaron con suero de
cabra al 10% durante 30 min a TA.
Posteriormente se incubaron los portaobjetos con
los anticuerpos primarios, anticuerpo de ratón
anti-p16^{INK4a} humano (3,48 \mug/ml) y
anticuerpo de conejo anti-Ki67 (1:25) durante 30
min a TA, las preparaciones se lavaron con tampón de lavado y se
colocaron en un baño de tampón limpio durante 5 min. Se eliminó el
exceso de tampón y cada muestra se cubrió con 200 \mul del
reactivo secundario, que contenía anticuerpos de cabra
anti-ratón conjugados con AlexaFluor®488 y
anticuerpos de cabra anti-conejo conjugados con
AlexaFluor®546 y posteriormente se incubó durante 30 min a TA. Los
portaobjetos se lavaron dos veces como se ha indicado antes y se
montaron directamente con un medio de montaje especial para
fluorescencia.
El examen microscópico de los portaobjetos
muestra que las células inmunorreactivas a p16^{INK4a} y que
también son inmunorreactivas a Ki67 se pueden encontrar sólo en
muestras que se pueden identificar microscópicamente como muestras
de lesiones displásicas. Las células que se tiñen con la reacción
específica para p16^{INK4a}, que se originan en metaplasias, no
se tienen por la reacción específica para Ki67. El examen
microscópico de la tinción del marcador de proliferación celular
muestra que las células metaplásicas que sobreexpresan
p16^{INK4a} no son inmunorreactivas con los anticuerpos dirigidos
frente a Ki67. Por el contrario, las muestras que contienen áreas
de tejido displásico contienen células que son inmunorreactivas a
Ki67 y a anticuerpos dirigidos frente a p16^{INK4a}. Por lo
tanto, al contrario que en las displasias, en las metaplasias no se
pueden teñir doblemente las células usando los anticuerpos
específicos de Ki67 y p16^{INK4a}.
Las Figuras 1-6 muestran los
resultados de la tinción para una displasia grave del cuello del
útero y para una metaplasia escamosa usando anticuerpos dirigidos
frente a Ki67 y anticuerpos dirigidos frente a p16^{INK4a}. La
inmunorreactividad a Ki67 produce fluorescencia roja, la
inmunorreactividad a p161^{INK4a} produce fluorescencia verde y el
solapamiento de la fluorescencia roja y verde produce fluorescencia
amarilla. En la muestra displásica (figuras 1-3)
muchas células de la displasia muestran positividad nuclear para
Ki67, además de positividad para p16^{INK4a}, y así producen
fluorescencia amarilla (véase la Figura 3). Por el contrario, en la
muestra metaplásica (Figuras 4-6) las zonas que
expresan positivamente p16^{INK4a} no muestran ninguna tinción
positiva para Ki67, lo que indica ausencia de expresión del
antígeno en estas zonas. En esta muestra se puede observar la doble
tinción (Figura 6), y así ninguna célula de la muestra produce
fluorescencia amarilla.
Los resultados muestran que la doble tinción de
las células con reactivos específicos para Ki67 permite
discriminar las metaplasias que sobreexpresan p16^{INK4a} de las
displasias.
Se puede analizar semicuantitativamente el nivel
de ARNm de p16^{INK4a} y de mcm2 en frotis del cuello del útero
en una reacción de tinción in situ. La reacción de tinción
se realiza como sigue:
Para la rehidratación, los frotis fijados con
aerosol se incuban en EtOH limpio al 50% en un dispositivo
basculante. La película de PEG que se produce por el procedimiento
de fijación se elimina mediante lavado intensivo. Después, los
frotis se lavan con agua bidestilada. Los frotis se incuban con
proteinasa K (10 \mug/ml en STF) durante 10 min a 37ºC.
Posteriormente los portaobjetos se transfieren a tampón de lavado
(STF/Tween20 al 0,1%) y finalmente la zona que contenía las células
se rodean con un lápiz lipídico.
La mezcla de hibridación se prepara mezclando 50
\mul de tampón de hibridación para uso inmediato (DAKO A/S,
Glostrup, Dinamarca) con aproximadamente 5-10 pmol
de las sondas. Las sondas son oligonucleótidos de secuencias
complementarias a los respectivos ARNm marcados con biotina y
digoxigenina.
La mezcla de hibridación se calienta a 95ºC y
posteriormente se equilibra a 37ºC. Después de los procedimientos
de ebullición los frotis se incuban cada uno de ellos con 50 \mul
de la mezcla de hibridación durante cuatro horas a 42ºC. Las
muestras se lavan con volúmenes en exceso de los tampones de lavado
dos veces en 2 x CSE a 37ºC durante 15 min y una vez en 1 x CSE a
37ºC durante 15 min. Posteriormente los frotis se lavan dos veces a
temperatura ambiente en 2 x CSE. Después de este procedimiento de
lavado las disecciones se incuban durante 30 min con tampón de
bloqueo (NEN, Blockingbuffer) a temperatura ambiente.
Posteriormente se incuba durante una hora con
estreptavidina-fosfatasa alcalina diluida al 1:100
(en tampón de bloqueo, véase más arriba) y con anticuerpos
monoclonales de ratón anti-digoxigenina marcados
con HRP (Molecular Probes). Posteriormente los frotis se lavan dos
veces en 1 x STF/TritonX-100 al 0,1% durante 10 min
a temperatura ambiente, seguido de una etapa de lavado con 1 x STF
y MgCl_{2} 50 mM (pH 9,2) durante 10 min a temperatura ambiente.
Posteriormente se realiza la reacción de tinción con ELF 97 fosfato
(Molecular Probes) durante 10 s a 7 min a temperatura ambiente. El
exceso de sustrato se lava tres veces con 1 x
STF/TritonX-100 al 0,1% durante 10 min a temperatura
ambiente. En una segunda etapa de tinción la sección se incuba con
tiramidas- Alexa-Fluor 594 durante 10 s a 7 min. El
exceso de sustrato se lava tres veces con 1 x
STF/TritonX-100 al 0,1% durante 10 min a
temperatura ambiente. Finalmente los frotis se sumergen en agua
destilada y se incluyen con medio de montaje de fluorescencia
(DakoCytomation). Posteriormente las disecciones teñidas se pueden
analizar mediante microscopia de fluorescencia.
El examen microscópico de los portaobjetos
muestra que las células positivas para la expresión de
p16^{INK4a} y que también expresan mcm2 sólo se pueden encontrar
en muestras que se pueden identificar microscópicamente como
muestras de lesiones displásicas. Las células que se tiñen con la
reacción específica para p16^{INK4a} y que se pueden identificar
como metaplasias no se tiñen con la reacción específica para mcm2.
El examen microscópico de la hibridación de ARNm muestra que las
células metaplásicas que sobreexpresan p16^{INK4a} no expresan
significativamente ARNm de mcm2. por el contrario, las células
displásicas se pueden teñir mediante hibridación in situ con
sondas específicas de mcm2 y con sondas dirigidas frente a
p16^{INK4a}. Por lo tanto, al contrario que en las células
displásicas, en las células metaplásicas no se puede observar doble
tinción usando las sondas específicas para Ki67 y p16^{INK4a}.
Los resultados muestran que la doble tinción de
las células con reactivos específicos para mcm2 permite
discriminar las metaplasias que sobreexpresan p16^{INK4a} de las
displasias.
Las muestras citológicas fijadas con Merckofix®
(frotis convencionales y citología basada en líquido (ThinPreps®))
del cuello del útero se tiñeron con inmunofluorescencia usando
anticuerpos específicos para p16^{INK4a} y
Ki-S2.
Los frotis convencionales y las muestras
citológicas basadas en líquido (ThinPreps®) se rehidrataron en
etanol (50%) durante 10 min y se transfirieron a agua bidestilada.
La recuperación de los antígenos se realizó con tampón citrato 10
mM (pH 6,0) para p161NK4a y Ki67. posteriormente los portaobjetos se
calentaron en un baño de agua durante 40 min a
95ºC-98ºC. Los portaobjetos se enfriaron a TA
durante 20 min, se transfirieron a tampón de lavado
(Tris-HC1 50 mM, NaCl 150 nM, Tween
20/DakoCytomation: nº de código: S3006, al 0,05%) y finalmente las
muestras se rodearon con un lápiz lipídico.
Para evitar la unión inespecífica del anticuerpo
secundario (especie: cabra), las muestras se incubaron con suero de
cabra al 10% durante 30 min a TA.
Posteriormente se incubaron los portaobjetos con
los anticuerpos primarios, anticuerpos de ratón
anti-p16^{INK4a} humano (clon E6H4) (3,48
\mug/ml) y anticuerpo de conejo anti-Ki67 (1:25)
durante 30 min a TA, las preparaciones se lavaron con tampón de
lavado y se colocaron en un baño de tampón limpio durante 5 min. Se
eliminó el exceso de tampón y cada muestra se cubrió con 200 \mul
del reactivo secundario, que contenía anticuerpos de cabra
anti-ratón conjugados con AlexaFluor®488 y
anticuerpos de cabra anti-conejo conjugados con
AlexaFluor®546 y posteriormente se incubó durante 30 min a TA. Los
portaobjetos se lavaron dos veces como se ha indicado antes y se
montaron directamente con un medio de montaje especial para
fluorescencia.
El examen microscópico de los portaobjetos
muestra que las células inmunorreactivas a p16^{INK4a} y que
también son inmunorreactivas a Ki-S2 se pueden
identificar microscópicamente como células displásicas. Las células
que se tiñen con la reacción específica para p16^{INK4a}, y que
no se tiñen por la reacción específica para Ki-S2,
se pueden clasificar por un anatomopatólogo experimentado como
metaplásicas o de origen endometrial. El examen microscópico de la
tinción del marcador de proliferación celular muestra que las
células metaplásicas que sobreexpresan p16^{INK4a} no son
inmunorreactivas con los anticuerpos dirigidos frente a
Ki-S2. Por el contrario, las células displásicas son
inmunorreactivas a Ki-S2 y a anticuerpos dirigidos
frente a p16^{INK4a}. Por lo tanto, al contrario que las células
displásicas, en las metaplasias no se puede teñir doblemente
ninguna célula usando los anticuerpos específicos de
Ki-S2 y de p16^{INK4a}.
Los resultados muestran que la doble tinción de
las células con reactivos específicos para Ki-S2
permite discriminar las células metaplásicas que sobreexpresan
p16^{INK4a} de las células displásicas.
Las células contenidas en las muestras de lavado
broncoalveolar de los pacientes se prepararon según la tecnología
ThinPrep. Las muestras citológicas fijadas con Merckofix® de los
lavados de los pacientes con carcinoma microcítico de pulmón
diagnosticado se tiñeron con inmunofluorescencia usando anticuerpos
específicos de p16^{INK4a}, Ki67 y PCNA.
En este experimento se usó un procedimiento que
no discrimina entre la tinción que se origina por la
inmunorreactividad frente a los dos marcadores de proliferación
PCNA y Ki67. En el contexto de la presente invención no es
necesario responder a si se expresa uno u otro marcador de
proliferación en las células. La pregunta principal es si se
expresa algún marcador de proliferación. Por lo tanto, en el
transcurso de los experimentos se eligió un procedimiento que da la
misma señal fluorescencia como indicación de la presencia de un
marcador de proliferación. Este procedimiento es adecuado para
mejorar la sensibilidad de la detección de las características de
proliferación celular. Cuando sea necesario se puede aplicar el
procedimiento para obtener una señal detectable para tres, cuatro o
incluso más moléculas marcadoras características de la
proliferación celular. De manera análoga, en ciertas circunstancias
puede ocurrir lo mismo con los productos de expresión del gen
INK4a. Se debe comprender que en algunas situaciones pueden ser
deseables señales de tinción diferentes para diferentes moléculas
marcadoras de proliferación. Los procedimientos se pueden aplicar a
las necesidades del experimento correspondiente.
Las secciones tisulares se rehidrataron mediante
incubación en xileno y etanol graduado, y se transfirieron a agua
bidestilada. Los frotis convencionales y las muestras citológicas
basadas en líquidos (ThinPreps) se rehidrataron en etanol (50%)
durante 10 min y se transfirieron a agua bidestilada. Se realizó la
retirada de los antígenos con tampón citrato 10 mM (pH 6,0) para
p16^{INK4a}, Ki67 y PCNA. Posteriormente los portaobjetos se
calentaron en un baño de agua durante 40 min a
95ºC-98ºC. Los portaobjetos se enfriaron a TA
durante 20 min, se transfirieron a tampón de lavado
(Tris-HC1 50 mM, NaCl 150 nM, Tween
20/DakoCytomation: nº de código: S3006, al 0,05%) y finalmente las
muestras se rodearon con un lápiz lipídico.
Para evitar la unión inespecífica del anticuerpo
secundario (especie: cabra), las muestras se incubaron con suero de
cabra al 10% durante 30 min a TA.
Posteriormente se incubaron los portaobjetos con
los anticuerpos primarios, anticuerpos de ratón
anti-p16^{INK4a} humano (3,48 \mug/ml),
anticuerpos de conejo anti-Ki67 y anticuerpos de
conejo anti-PCNA (cada uno de ellos a 1:25) durante
30 min a TA, las preparaciones se lavaron con tampón de lavado y se
colocaron en un baño de tampón limpio durante 5 min. Se eliminó el
exceso de tampón y cada muestra se cubrió con 200 \mul del
reactivo secundario, que contenía anticuerpos de cabra
anti-ratón conjugados con AlexaFluor®488 y
anticuerpos de cabra anti-conejo conjugados con
AlexaFluor®546 y posteriormente se incubó durante 30 min a TA. Los
portaobjetos se lavaron dos veces como se ha indicado antes y se
montaron directamente con un medio de montaje especial para
fluorescencia.
El examen microscópico de los portaobjetos
muestra que las células inmunorreactivas a p16^{INK4a} y que
también son inmunorreactivas a Ki67 o PCNA se pueden identificar
microscópicamente como células de cáncer microcítico de pulmón. Las
células que se tiñen con la reacción específica para p16^{INK4a},
que se originan en metaplasias, no se tiñen por la reacción
específica para Ki67 y PCNA. El examen microscópico de la tinción
del marcador de proliferación celular muestra que las células
metaplásicas que sobreexpresan p16^{INK4a} no son
inmunorreactivas a los anticuerpos dirigidos frente a Ki67 y PCNA.
Por el contrario, las muestras que contienen células displásicas
contienen células que son inmunorreactivas a Ki67/PCNA y a
anticuerpos dirigidos frente a p16^{INK4a}. Por lo tanto, al
contrario que en las displasias, en las metaplasias no se pueden
teñir triplemente las células usando los anticuerpos específicos de
Ki67, PCNA y p16^{INK4a}.
Los resultados muestran que la triple tinción de
las células con reactivos específicos para Ki67/PCNA permite
discriminar las metaplasias que sobreexpresan p16^{INK4a} de las
displasias.
Las muestras citológicas (suspensiones celulares
en STF, pH 7,4) del cuello del útero se tiñeron con fluorescencia
usando anticuerpos específicos para p14ARF y Ki67 y oligosondas
para mcm5 y se evaluaron mediante análisis de FACS fluorescente en
tres colores.
Las células se centrifugaron, el sobrenadante se
decantó y se fijó y permeabilizó con 100 ml de Permeafix (Ortho
Diagnostic, Raptan, NJ, EE.UU.) durante una hora a temperatura
ambiente. Las células se lavaron en STF estéril a pH 7,4, se
granularon y se volvieron a suspender en 100 ml de Permeafix
durante una hora a temperatura ambiente. Las células se lavaron en
STF estéril a pH 7,4, se granularon y se volvieron a suspender en
STF estéril. Se incubaron con anticuerpos
anti-p14ARF conjugados con PE y anticuerpos
anti-Ki67 conjugados con PE-Cy5
durante una hora a + 4ºC. Las células se lavaron en STF estéril a
pH 7,4, se granularon y se volvieron a suspender en 100 ml de
Permeafix durante 30 min a temperatura ambiente. Las células se
lavaron en STF estéril a pH 7,4, se granularon mediante
centrifugación, y posteriormente se lavaron otra vez en 2 x citrato
salino estándar (CSE). Después de la centrifugación, el gránulo
celular se volvió suspender en solución de hibridación (2 x CSE,
formamida al 30%, espermatozoides de salmón sonicados y ADN de
transferencia de levadura) que contenía 500 ng de sondas de
oligonucleótidos específicas de mcm5 marcadas en los dos extremos
con 5-carboxi-fluoresceína. La
hibridación intercelular se realizó a 42ºC durante una hora,
seguida de lavados sucesivos en 2 x CSE y
TritonX-100 al 0,5% y 1 x SCC y
TritonX-100 al 0,5% a 42ºC. Para el análisis las
células se volvieron a suspender en STF a pH 8,3 y se analizaron en
un citómetro de flujo (FACScan, Becton Dickinson, IS). Para cada
análisis se recogieron 30.000-100.000
acontecimientos sincronizados. El análisis de los datos se realizó
usando CellQuest (Becton Dickinson, IS).
El análisis del citómetro de flujo muestra que
las células inmunorreactivas a p14ARF y que también son
inmunorreactivas a Ki67 y/o reactivas a las oligosondas de mcm5
sólo se pudieron identificar en muestras de pacientes que tenían
lesiones displásicas del cuello del útero. Las muestras de mujeres
que no tenían lesiones displásicas no mostraron tinción simultánea
de p14ARF con Ki67 ni mcm5. Los resultados muestran que la tinción
doble o triple de las células con reactivos específicos para Ki67
y/o mcm5 permite discriminar las células no displásicas que
sobreexpresan p14ARF de las células displásicas que sobreexpresan
p14ARF.
Claims (38)
1. Un procedimiento para discriminar las células
displásicas que sobreexpresan los productos del gen INK4a de otras
células que expresan productos del gen INK4a a un nivel detectable
en muestras biológicas, que comprende la determinación en un
procedimiento de prueba citológico o histológico de la coexpresión
de al menos dos moléculas marcadoras en al menos una sola célula,
en el que al menos una molécula marcadora es un producto de
expresión codificado por el gen INK4a y al menos otra molécula
marcadora es un marcador de proliferación celular, en el que la
sobreexpresión de al menos un producto del gen INK4a y la expresión
de al menos un marcador de proliferación celular activa a una un
nivel detectable en dicha célula única es indicadora del estado
displásico de la célula y en el que la sobreexpresión de al menos
un producto del gen INK4a y la expresión de al menos un marcador
de senescencia, diferenciación celular terminal, apoptosis o
detención del ciclo celular a un nivel detectable en dicha célula
única es indicadora del estado no displásico de la célula.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en
el que se detecta un conjunto de dos o más marcadores de
proliferación celular.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1 ó
2, en el que al menos un producto del gen INK4a tiene un peso
molecular entre 13 y 19 kDa.
4. Un procedimiento según las reivindicaciones 1
a 3, en el que al menos un producto del gen INK4a es seleccionado
de un grupo que comprende p16^{INK4a} y p14ARF.
5. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones procedentes, en el que al menos un marcador de
proliferación celular se selecciona de un grupo que comprende un
marcador de proliferación necesaria para el mantenimiento de la
proliferación celular, un marcador de proliferación que participa
en la replicación del ADN, un marcador de proliferación que es un
miembro de la horquilla de replicación o que la codifica, un
marcador de senescencia, un marcador de detención del ciclo celular
y un marcador de apoptosis.
6. El procedimiento según la reivindicación 5, en
el que el producto génico necesario para el mantenimiento de la
proliferación celular es una molécula seleccionada de un grupo que
comprende moléculas Ki67, moléculas Ki-S5 y
moléculas Ki-S2.
7. El procedimiento según la reivindicación 5, en
el que el producto génico que participa en la replicación del ADN
se selecciona de un grupo que comprende helicasas o subunidades de
las mismas, moléculas del ciclo de división celular (cdc),
moléculas fosfatasa y moléculas cinasa.
8. El procedimiento según la reivindicación 7, en
el que las helicasas o las subunidades de las mismas se
seleccionan de un grupo que comprende MCM2, MCM3, MCM4, MCM5, MCM6,
MCM7 y HELAD1.
9. El procedimiento según la reivindicación 7, en
el que las moléculas cdc, las cinasas y las fosfatasas se
seleccionan de un grupo que comprende proteín cinasa CDC6 y CDC7,
Dbf14, proteín fosfatasa CDC14, CDC45 y MCM10.
10. El procedimiento según la reivindicación 5,
en el que las moléculas que participan en la horquilla de
replicación se seleccionan de un grupo que comprende PCNA y
POLD.
11. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1-10, en el que el producto génico
es un polipéptido o una molécula de ácido nucleico.
12. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que además se detecta al menos
otra molécula marcadora para mejorar la evaluación del diagnóstico
o del pronóstico.
13. Un procedimiento según la reivindicación 12,
en el que la molécula marcadora adicional es al menos otra
molécula marcadora de proliferación.
14. Un procedimiento según la reivindicación 12 ó
13, en el que la molécula marcadora adicional se selecciona de un
grupo que comprende un marcador de senescencia, un marcador de
apoptosis, un marcador de detención del ciclo celular, un marcador
de la diferenciación terminal de las células, un marcador de
infección vírica, un marcador de actividad vírica, una proteína
reguladora del ciclo celular, un producto génico necesario para el
mantenimiento de la proliferación celular, un producto génico que
participa en la replicación de ADN, un producto génico que es un
miembro de la horquilla de replicación.
15. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que se aplica además un
procedimiento de tinción citológica que emplea al menos un
colorante que se selecciona de un grupo que comprende DAPI,
quinacrina, cromomicina, Azan, naranja de acridina, hematoxilina,
eosina, rojo Sudán, azul de toluidina y tionina, o un procedimiento
de tinción que se selecciona de un grupo que comprende tinción de
Papanicolau, tinción de Giemsa, tinción de
hematoxilina-eosina, tinción de van Gieson, tinción
de Schiff, tinción con precipitados metálicos, tinción con azul de
Turnbull y tinción con cianuros metálicos.
16. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que las células displásicas son
células de una lesión cancerosa o precancerosa.
17. El procedimiento según la reivindicación 16,
en el que las células displásicas son células de una displasia que
se asocian a un virus del papiloma.
18. El procedimiento según la reivindicación 17,
en el que el virus del papiloma es un virus del papiloma humano de
alto riesgo que se selecciona de un grupo que comprende VPH16,
VPH18, VPH31, VPH33, VPH35, VPH39, VPH45, VPH51, VPH52, VPH56,
VPH58, VPH59, VPH66 y VPH68.
19. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, en el que la lesión se selecciona de un
grupo que comprende una lesión del tracto anogenital, una lesión
del aparato respiratorio y una lesión de la piel y de sus
anejos.
20. El procedimiento según la reivindicación 17 ó
19, en el que la lesión se selecciona de un grupo que comprende
una lesión del cuello del útero, una lesión de la vagina, una
lesión de la vulva, una lesión del pene, una lesión del ano, una
lesión del recto, una lesión del árbol bronquial, una lesión del
pulmón, una lesión del espacio peritoneal, una lesión del espacio
nasofaríngeo, una lesión de la cavidad oral o una lesión de la
piel.
21. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la muestra biológica es una
muestra que contiene células que se originan en el tracto
anogenital, en el aparato respiratorio o en la piel y sus
anejos.
22. Un procedimiento según la reivindicación 21,
en el que las células son células que se originan en el cuello del
útero, la vagina, la vulva, el pene, el ano, el recto, el árbol
bronquial, el pulmón, el espacio nasofaríngeo, la cavidad oral o la
piel.
23. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la muestra biológica es una
preparación citológica o histológica.
24. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la detección de los
productos del gen INK4a y/o las moléculas marcadoras de
proliferación celular se realiza usando al menos una sonda que
reconoce específicamente al menos una de las moléculas respectivas
que se van a detectar.
25. Un procedimiento según la reivindicación 24,
en el que al menos una sonda tiene una marca detectable.
26. Un procedimiento según la reivindicación 25,
en el que al menos una marca se selecciona del grupo que comprende
un radioisótopo, un compuesto bioluminiscente, un compuesto
quimioluminiscente, un compuesto fluorescente, un quelato metálico
o un enzima.
27. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 26, en el que al menos una sonda es una
proteína y/o un ácido nucleico.
28. Un procedimiento según la reivindicación 27,
en el que al menos una sonda es un anticuerpo dirigido frente a un
producto génico codificado por INK4a o un producto de un gen de un
marcador de proliferación celular.
29. El procedimiento según la reivindicación 28,
que comprende un procedimiento de tinción inmunocitoquímica.
30. El procedimiento según la reivindicación 25 ó
26, en el que al menos una sonda es un ácido nucleico que se
hibrida específicamente con un producto del gen INK4a o con un
producto de un gen de un marcador de proliferación celular.
31. El procedimiento según la reivindicación 30,
que comprende una reacción de hibridación in situ.
32. El procedimiento según la reivindicación 30,
que comprende una reacción de amplificación de un ácido
nucleico.
33. El procedimiento según la reivindicación 32,
en el que la reacción de amplificación de un ácido nucleico es
PCR, NASBA o LCR.
34. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que las reacciones de detección
que usan sondas de ácidos nucleicos y sondas de polipéptidos se
realizan simultáneamente.
35. Un kit para realizar un procedimiento según
una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un kit
de diagnóstico o un kit de investigación, que comprende al menos
una o más sondas para la detección de la presencia o ausencia y/o el
nivel de la sobreexpresión de al menos un producto del gen INK4a y
al menos un producto de un gen de un marcador de proliferación
celular en muestras biológicas, en el que los componentes del kit
se proporcionan de tal manera que permiten la detección simultánea
de al menos un producto del gen INK4a y al menos un producto de un
gen de un marcador de proliferación celular en una sola célula de
las muestras, y en el que se generan al menos dos señales
detectables distinguibles, de las que al menos una señal detectable
es indicadora del nivel de expresión de al menos un producto del
gen INK4a y al menos otra señal detectable es indicadora del nivel
de expresión de al menos un gen de un marcador de proliferación
celular.
36. Un kit según la reivindicación 35, en el que
los productos del gen INK4a se seleccionan de un grupo que
comprende p16^{INK4a} y p14ARF.
37. Un kit según la reivindicación 35 ó 36, en el
que los productos del gen del marcador de proliferación celular se
seleccionan de un grupo que comprende CDC6, MCM3, MCM3, MCM4, MCMS,
MCM6, MCM7, proteín cinasa CDC7, Dbf4, proteín fosfatasa CDC14,
CDC45 y MCM10, Ki67, Ki-S2, PCNA y POLD.
38. El kit según las reivindicaciones 35 a 37 que
además comprende al menos uno de los siguientes:
- a.
- Una muestra de p16^{INK4a} para realizar una reacción de un control positivo.
- b.
- Una muestra de p14ARF para realizar una reacción de un control positivo.
- c.
- Una muestra de Ki67 para realizar una reacción de un control positivo.
- d.
- Una muestra de Ki-S2 para realizar una reacción de un control positivo.
- e.
- Una muestra de MCM5 para realizar una reacción de un control positivo.
- f.
- Una muestra de MCM2 para realizar una reacción de un control positivo.
- g.
- Una muestra de PCNA para realizar una reacción de un control positivo.
- h.
- Reactivos para la detección de la presencia o ausencia y/o el nivel de p16^{INK4a}.
- i.
- Reactivos para la detección de la presencia o ausencia y/o la el nivel de p14ARF.
- j.
- Reactivos para la detección de la presencia o ausencia y/o el nivel de Ki67.
- k.
- Reactivos para la detección de la presencia o ausencia y/o el nivel de Ki-S2.
- l.
- Reactivos para la detección de la presencia o ausencia y/o el nivel de MCM5.
- m.
- Reactivos para la detección de la presencia o ausencia y/o la concentración de MCM2.
- n.
- Reactivos para la detección de la presencia o ausencia y/o el nivel de PCNA.
- o.
- Una o más muestras de productos del gen INK4a para realizar reacciones de controles positivos.
- p.
- Una o más muestras de productos de un gen de un marcador de proliferación celular para realizar reacciones de controles positivos.
- q.
- Uno o más reactivos para la detección de la presencia o ausencia y/o el nivel de otros productos del gen INK4a.
- r.
- Y uno o más reactivos para la detección de la presencia o ausencia y/o el nivel de otros productos de un gen de un marcador de proliferación celular.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP02024030A EP1416278B1 (en) | 2002-10-28 | 2002-10-28 | Method for improved diagnosis of dysplasias |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2231633T3 true ES2231633T3 (es) | 2005-05-16 |
Family
ID=32087956
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02024030T Expired - Lifetime ES2231633T3 (es) | 2002-10-28 | 2002-10-28 | Procedimiento para un diagnostico mejorado de las displasias. |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1416278B1 (es) |
| AT (1) | ATE283484T1 (es) |
| DE (1) | DE60202081T2 (es) |
| DK (1) | DK1416278T3 (es) |
| ES (1) | ES2231633T3 (es) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8131476B2 (en) | 2006-08-07 | 2012-03-06 | General Electric Company | System and method for co-registering multi-channel images of a tissue micro array |
| US8060348B2 (en) | 2006-08-07 | 2011-11-15 | General Electric Company | Systems for analyzing tissue samples |
| EP2224244A1 (en) * | 2009-02-26 | 2010-09-01 | Universität des Saarlandes | A diagnostic in-vitro method or assay for diagnosing chronic obstructive pulmonary disease (COPD) |
| US9315848B2 (en) | 2010-08-18 | 2016-04-19 | Technion Research And Development Foundation Ltd. | Volatile organic compounds for detecting cell dysplasia and genetic alterations associated with lung cancer |
| CN109969079B (zh) * | 2019-03-05 | 2022-02-22 | 天津博顿电子有限公司 | 一种新能源汽车警示行人的装置 |
-
2002
- 2002-10-28 DK DK02024030T patent/DK1416278T3/da active
- 2002-10-28 EP EP02024030A patent/EP1416278B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-28 ES ES02024030T patent/ES2231633T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-10-28 AT AT02024030T patent/ATE283484T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-10-28 DE DE60202081T patent/DE60202081T2/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE283484T1 (de) | 2004-12-15 |
| EP1416278B1 (en) | 2004-11-24 |
| DK1416278T3 (da) | 2005-03-21 |
| DE60202081D1 (de) | 2004-12-30 |
| DE60202081T2 (de) | 2005-12-08 |
| EP1416278A1 (en) | 2004-05-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2391893T3 (es) | Método para el diagnóstico mejorado de las displasias | |
| US11155878B2 (en) | Method for discrimination of metaplasias from neoplastic or preneoplastic lesions | |
| JP2013150616A5 (es) | ||
| JP4545189B2 (ja) | 子宮頸部疾患を検出するための方法及び組成物 | |
| JP5819851B2 (ja) | Ｈｐｖ関連の癌の治療及びスクリーニングのための細胞に基づいた高処理能力ｈｐｖ免疫アッセイ | |
| US20030219726A1 (en) | Detection of abnormalities leading to cervical malignancy | |
| ES2231633T3 (es) | Procedimiento para un diagnostico mejorado de las displasias. | |
| MX2010005476A (es) | Metodo de diagnostico para la deteccion temprana de cancer cervico uterino mediante la deteccion de la proteina eag1 como marcador de lesiones intraepiteliales cervicales. |