ES2292168T3 - Adn que codifica el receptor de bradiquinina b1. - Google Patents

Abstract

SE HAN CLONADO Y CARACTERIZADO DNAS QUE CODIFICAN PARA RECEPTORES B{SUB,1} DE BRADIQUININA, PROCEDENTES DE CELULAS DE MAMIFEROS. EL RECEPTOR RECOMBINANTE ES CAPAZ DE FORMAR RECEPTORES QUE SE UNEN A DES-ARG{SUP,10}KALIDINA, Y OTROS LIGANDOS ESPECIFICOS DE B{SUB,1}. EL DNA SE HA EXPRESADO EN CELULAS HUESPED RECOMBINANTES, QUE PRODUCEN PROTEINA RECOMBINANTE ACTIVA. ADEMAS, LAS CELULAS HUESPED RECOMBINANTES, SE UTILIZAN PARA ESTABLECER UN METODO DE IDENTIFICACION DE MODULADORES DE LA ACTIVIDAD RECEPTORA, Y SE IDENTIFICAN DICHOS MODULADORES.

Description

ADN que codifica el receptor de bradiquinina B_{1}.

Antecedentes de la invención

Se han definido dos subtipos de receptores de bradiquinina de mamíferos, B_{1} y B_{2}, según sus propiedades farmacológicas (A. Dray, M. Perkins, TINS 16, 99-104 (1993), D. Proud, A. P. Kaplan, Annual Review Immunology 6, 49-83 (1988)). El nonapéptido bradiquinina (BK) y el decapéptido Lys-BK (calidina) se liberan a partir de la gran proteína precursora quininógeno mediante la acción proteolítica de calicreínas. Debido a su rápida degradación, se supone que estas hormonas peptídicas median efectos locales. Tanto la BK como la calidina activan el receptor B_{2}. Estos agonistas del receptor B_{2} se degradan después mediante una carboxipeptidasa para producir los agonistas del receptor B_{1} des-Arg^{9}BK y des-Arg^{10}calidina o mediante la enzima convertidora de angiotensina (ACE) para producir péptidos inactivos. Se ha observado el fenómeno de la transformación proteolítica de un compuesto desde selectividad B_{2} a selectividad B_{1} no sólo para los agonistas endógenos de quinina, sino también para varios antagonistas peptídicos sintéticos (K. Wirth, y col., European Journal of Pharmacology 205, 217-218 (1991), D. Regoli, y col., European Journal of Pharmacology 127, 219-224 (1986)). La BK y la calidina actúan como agonistas equipotentes en el subtipo de receptor de bradiquinina B_{2}. Por el contrario, la BK es totalmente inactiva en el subtipo de receptor de bradiquinina B_{1}. Aunque tradicionalmente se ha utilizado la des-Arg^{9}BK para estudiar el receptor B_{1}, parece ser que el agonista más potente del receptor B_{1} es la des-Arg^{10}calidina (D. Regoli, y col., European Journal of Pharmacology 127, 219-224 (1986)).

La bradiquinina y la calidina, actuando a través del receptor B_{2} presente en el músculo liso y en ciertas neuronas, producen una hipotensión pronunciada y son potentes mediadores del dolor y de la inflamación (A. Dray, anteriormente; D. Proud, anteriormente). Por el contrario, el receptor B_{1} no se detecta en la mayoría de los tejidos normales y parece que actúa predominantemente en afecciones fisiopatológicas (A. Dray, anteriormente). El receptor B_{1} se descubrió en un principio por la respuesta contráctil a des-Arg^{9}BK que se observó en tiras aórticas de conejo sólo después de una prolongada incubación ex vivo (D. Regoli, J. Barabe, W. K. Park, Canadian Journal of Physiology and Pharmacology 55, 855-867 (1977); D. Regoli, F. Marceau, J. Barabe, Canadian Journal of Physiology and Pharmacology 56, 674-677 (1978); D. Regoli, J. Barabe, Pharmacological Reviews 32, 1-46 (1980)). Se ha publicado la síntesis de novo de los receptores B_{1} in vivo después del tratamiento con lipopolisacárido bacteriano (LPS) (D. C. Regoli, R. Marceau, J. Lavigne, European Journal of Pharmacology 71, 105-115 (1981)), y en modelos animales de artritis antigénica (S. G. Farmer, B. A. McMillan, S. N. Meeker, R. M. Burch, Agents and Action 34, 191-193 (1991)). Los estudios in vitro han implicado a varias citocinas, más particularmente a la interleuquina-1 (IL-1) y la IL-2, como mediadores que inducen la expresión de receptores B_{1} (D. Regoli, anteriormente; D. Deblois, J. Bouthillier, F. Marceau, British Journal of Pharmacology 93, 969-977(1988); D. deBlois, J. Bouthillier, F. Marceau, British Journal of Pharmacology 103, 1057-1066 (1991); D. deBlois, J. Bouthillier, R. Marceau, Immunopharmacology 17, 187-198 (1989)). Estos resultados, junto con el descubrimiento de que la activación del receptor de bradiquinina B_{1} en macrófagos de ratón provoca la liberación de citocinas (R. M. Burch, J. R. Connor, C. W. Tiffany, Agents and Action 27, 258-260 (1989); C. W. Tiffany, R. M. Burch, FEBS letters 247, 189-192 (1989)), sugieren que el receptor B_{1} puede ser un importante mediador de la inflamación crónica. De forma significativa, se ha demostrado recientemente que el antagonista del receptor de bradiquinina B_{1} des-Arg^{9}[Leu^{8}]BK alivia la hiperalgesia en modelos animales de inflamación persistente (A. Dray, anteriormente; M. N. Perkins, D. Kelly, British Journal of Pharmacology 110, 1441-1444 (1993); M. N. Perkins, E. Campbell, A. Dray, Pain 53, 191-197 (1993)). Por lo tanto, un conjunto de evidencias implican al receptor de bradiquinina B_{1} en la fisiopatología de la inflamación. Se sabe relativamente poco del papel del receptor B_{1} en tejidos sanos, aunque tanto el receptor B_{1} como el B_{2} pueden desempeñar un papel fisiológico en la función renal (N.-E. Rhaleb, y col., European Journal of Pharmacology 162, 419-427 (1989); M. Lortie, D. Regoli, N.-E. Rhaleb, G. E. Plante, American Journal of Physiology 262, 872-876 (1992)). La inducibilidad aparente del receptor B_{1} en afecciones patológicas puede proporcionar una ventana terapéutica para el uso de antagonistas del receptor B_{1} en el tratamiento de la inflamación crónica.

La clonación del receptor de bradiquinina B_{2} reveló que este receptor es un miembro de la superfamilia de receptores acoplados a proteína G (A. E. McEachem, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 7724-7728 (1991); S. J. Powell, y col., Genomics 15, 435-438 (1993); J. F. Hess, J. A. Borkowski, G. S. Young, C. D. Strader, R. W. Ransom, Biochem. and Biophys. Res. Comm. 184, 260-268 (1992); D. Eggerickx, E. Raspe, D. Bertrand, G. Vassart, M. Parmentier, Biochem. Biophys. Res. Comm. 187, 1306-1313 (1992)). El receptor de bradiquinina B_{2} de rata se clonó usando un sistema de expresión de oocito de Xenopus (A. E. McEachem, y col., anteriormente) que aprovechaba la capacidad del receptor B_{2} para actuar mediante proteínas G para activar la fosfolipasa C y movilizar Ca^{2+} (R. M. Burch, J. Axelrod, Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 6374-6378 (1987); S. R. Slivka, P. A. Insel, J. Biol. Chem 263, 14640-14647 (1988)). Recientemente, también se ha demostrado que el receptor de bradiquinina B_{1} en células mesangiales de rata y de aorta de conejo cultivadas activa la fosfolipasa C conduciendo a la movilización de Ca^{2+} (K. A. Schneck, anteriormente; M. Issandou, J.-M. Darbon, Journal of Biological Chemistry 259, 9263-9268 (1991); M. M. Tropea, D. Gummelt, M. S. Herzig, L. M. F. Leeb-Lundberg, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 264, 930-937 (1993)). Además, se detectaron actividades de los receptores de bradiquinina B_{1} y B_{2} cuando se inyectó ARNm de la línea celular de fibroblastos humanos WI-38 en oocitos de Xenopus laevis (E. Phillips, M. J. Conder, S. Bevan, P. Mclntyre, M. Webb, Journal of Neurochemistry 58, 243-249 (1992). La similitud entre los ligandos de los dos subtipos de receptores de bradiquinina sugiere una similitud entre los genes de los receptores B_{1} y B_{2}. No obstante, los resultados del análisis de Inmunotransferencia de Southern genómico indicaron que estos dos receptores no son muy homólogos (A. E. McEachem, y col., anteriormente; J. F. Hess, y col., Molecular Pharmacology 45, 1-8 (1994). Por lo tanto, a fin de clonar el receptor B_{1} humano, se adquirió una estrategia de clonación de expresión en oocitos de Xenopus utilizando la fotoproteína aecuorina como un indicador de la movilización de Ca^{2+} (K. Sandberg, A. J. Markwick, D. P. Trinh, K. J. Catt, FEBS Letters 241, 177-180 (1988); E. Giladi, E. R. Spindel, BioTechniques 10, 744-747 (1991). Se aisló un clon de ADNc que codifica un receptor acoplado a proteína G con una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de 36% con la del receptor de bradiquinina B_{2}. Las propiedades farmacológicas de este receptor clonado que se expresa en células de mamífero demuestran que es un receptor de bradiquinina B_{1}.

Resumen de la invención

Se ha clonado, expresado y caracterizado el receptor de bradiquinina B_{1}. Se han aislado clones de ADN funcionales que codifican el receptor usando un sistema de expresión recombinante. Se describen las propiedades farmacológicas y estructurales de la proteína, así como las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos. La proteína recombinante es útil para identificar moduladores del receptor. Los moduladores que se identifican en este procedimiento son útiles como agentes terapéuticos. Los moduladores, como se describen en este documento, incluyen, pero sin limitación, agonistas, antagonistas, supresores e inductores.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 - Muestra la secuencia de ADN del receptor de bradiquinina B_{1} humano.

Figura 2 - Muestra la secuencia de aminoácidos del receptor de bradiquinina B_{1} humano.

Figura 3 - Presenta las unidades relativas de luz en respuesta a bradiquinina 100 nM (barras blancas) y a des-Arg^{10}calidina 20 nM (barras rayadas) con números de fracción crecientes (disminuyendo en tamaño). Se inyectaron oocitos con un volumen igual de ARNm poli (A)+ IMR-90 inducido por IL-1\beta fraccionado por tamaños en un gradiente de sacarosa y se expusieron a agonistas de bradiquinina. Las unidades relativas de luz que se obtienen con bradiquinina 100 nM se dividieron por 50 para permitir la representación de los dos conjuntos de datos en el mismo gráfico. En la parte superior de la figura se muestra una señal que indica los marcadores de tamaño de ARN que se fraccionaron en un gradiente paralelo.

Figura 4, paneles A y B - Muestran las señales en un luminómetro de oocitos individuales en respuesta a des-Arg^{10}calidina 20 nM. El panel A muestra la señal que se obtiene usando el ARNm poli (A)+ total aislado a partir de células IMR-90 inducidas por IL-1\beta. El panel B muestra la señal que se obtiene usando ARNc del clon 33E9.

Figura 5 - Se muestran desplazamientos de [^{3}H]des-Arg^{10}calidina 1 nM de células COS-7 que expresan el receptor de bradiquinina B_{1} humano mediante concentraciones crecientes de los compuestos. Símbolos de los compuestos: des-Arg^{10}calidina (q), des-Arg ^{10}[Leu^{9}]calidina (\Delta), calidina (*), HOE 140 (u), des-Arg^{9}bradiquinina (O), y bradiquinina (X).

Descripción detallada

La presente invención se refiere a ADN que codifica un receptor de bradiquinina B_{1} (B1) que se aísla de células productoras de B_{1}. B_{1}, como se usa en este documento, se refiere a la proteína que puede funcionar específicamente como receptor de bradiquinina de subtipo B_{1}.

No se conocían previamente las secuencias de aminoácidos y de ADN de B_{1}. Las células capaces de producir B_{1} incluyen, pero sin limitación, células de músculo liso aórtico. Las líneas celulares que pueden producir B_{1} incluyen, pero sin limitación, la IMR-90 y la WI-38. Las células preferidas para la presente invención son las células IMR-90.

Pueden también ser adecuadas otras células y líneas celulares para su uso para aislar ADNc de B_{1}. La selección de células adecuadas puede hacerse mediante exploración de la actividad de B_{1} en células completas o en extractos de células. Se conocen en la técnica procedimientos para detectar la actividad de B_{1} y para medir la capacidad para unirse a ligandos que se sabe que interaccionan con el subtipo de receptor B_{1}, tales como des-Arg^{10}calidina, des-Arg^{9}bradiquinina, des-Arg^{10}Leu^{9}calidina, y des-Arg^{9}Leu^{8}bradiquinina, o para medir la hidrólisis de fosfatidil inositol, la liberación de las reservas de Ca^{2+} intracelular, o la liberación de ácido araquidónico mediada por des-Arg^{10}calidina o des-Arg^{9}bradiquinina. Las células que presentan actividad de B_{1} en tales ensayos pueden ser adecuadas para el aislamiento de ADN de B_{1}.

Debido a que el código genético es degenerado, puede usarse más de un codón para codificar un aminoácido concreto y, por lo tanto, la secuencia de aminoácidos puede estar codificada por uno cualquiera de un conjunto de oligonucleótidos de ADN similares. Sólo uno de los miembros del conjunto será idéntico a la secuencia de B_{1}, pero será capaz de hibridar con el ADN de B_{1} aun en presencia de oligonucleótidos de ADN con emparejamientos erróneos en condiciones apropiadas. En condiciones alternativas, los oligonucleótidos de ADN mal emparejados pueden todavía hibridar con el ADN de B_{1} para permitir la identificación y el aislamiento del ADN codificante de B_{1}.

Puede usarse ADN que codifique B_{1} de un organismo concreto para aislar y purificar homólogos de B_{1} a partir de otros organismos. Para conseguir esto, el primer ADN de B_{1} puede mezclarse con una muestra que contenga ADN que codifique homólogos de B_{1}, en condiciones de hibridación apropiadas. Puede aislarse el complejo de ADN hibridado y puede purificarse el ADN que codifica el ADN homólogo a partir del mismo.

Se sabe que hay una cantidad sustancial de redundancia en los diversos codones que codifican aminoácidos específicos. Por lo tanto, esta invención se dirige también a las secuencias de ADN que contienen codones alternativos que codifican la traducción final del aminoácido idéntico. Para los fines de esta memoria descriptiva, una secuencia que tiene uno o más codones reemplazados se definirá como una cierta variación degenerada. Las mutaciones en la secuencia de ADN o en la proteína traducida no tienen necesariamente que alterar sustancialmente las propiedades físicas finales de la proteína que se expresa. Por ejemplo, la sustitución de leucina por valina, de lisina por arginina, o de glutamina por asparagina puede no generar un cambio en la funcionalidad del polipéptido.

Puede usarse cualquiera de una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica para clonar molecularmente el ADN de B_{1}. Estos procedimientos incluyen, pero sin limitación, la expresión funcional directa de los genes B_{1} después de la construcción de una biblioteca de ADNc o de ADN genómico que contiene B_{1} en un sistema vector de expresión apropiado. Otro procedimiento es explorar una biblioteca de ADNc o de ADN genómico que contiene B_{1} generada en un bacteriófago o en un vector lanzadera plasmídico con una sonda oligonucleotídica marcada diseñada a partir de la secuencia de aminoácidos de las subunidades B_{1}. Un procedimiento adicional consiste en la exploración de una biblioteca de ADNc o de ADN genómico que contiene B_{1} generada en un bacteriófago o en un vector lanzadera plasmídico con un ADN parcial que codifica el receptor B_{1}. Este ADN parcial se obtiene mediante la amplificación específica por PCR de fragmentos de ADN de B_{1} mediante el diseño de cebadores oligonucleotídicos degenerados a partir de la secuencia de aminoácidos del receptor B_{1} purificado. Otro procedimiento es aislar ARN de células productoras de B_{1} y traducir el ARN en una proteína mediante un sistema de traducción in vitro o in vivo. La traducción del ARN en un péptido o una proteína dará como resultado la producción de al menos una porción de la proteína B_{1} que puede identificarse, por ejemplo, mediante la actividad de la proteína receptora B_{1} o mediante su reactividad inmunológica con un anticuerpo anti-B1. En este procedimiento, pueden analizarse combinaciones de ARN aislado de células productoras de B_{1} para la presencia de un ARN que codifique al menos una porción de la proteína B_{1}. Puede realizarse un fraccionamiento adicional de la combinación de ARN para purificar el ARN de B_{1} de ARN que no sea de B_{1}. Puede analizarse el péptido o proteína producido por este procedimiento para proporcionar secuencias de aminoácidos que, a su vez, se usan para proporcionar cebadores para la producción de ADNc de B_{1}, o el ARN que se usa para la traducción puede analizarse para proporcionar secuencias de nucleótidos que codifiquen B_{1} y producir sondas para la producción de ADNc de B_{1}. Estos procedimientos se conocen en la técnica y pueden encontrarse en, por ejemplo, Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989.

Es fácilmente evidente para los expertos en la materia que pueden ser útiles otros tipos de bibliotecas, así como bibliotecas construidas a partir de otras células o tipos de células, para el aislamiento de ADN codificante de B_{1}. Otros tipos de bibliotecas incluyen, pero sin limitación, bibliotecas de ADNc obtenidas a partir de otras células o líneas celulares distintas de las células IMR-90, y bibliotecas de ADN genómico.

Es fácilmente evidente para los expertos en la materia que pueden construirse bibliotecas de ADNc adecuadas a partir de células o de líneas celulares que tengan actividad de B_{1}. La selección de células o de líneas celulares para usar en la construcción de una biblioteca de ADNc para aislar ADNc de B_{1}, puede realizarse midiendo primero la actividad de B_{1} asociada a la célula usando el ensayo de unión de ligandos que se describe con detalle en este documento.

La construcción de bibliotecas de ADNc puede realizarse mediante técnicas convencionales bien conocidas en este campo. Pueden encontrarse técnicas de construcción de bibliotecas de ADNc bien conocidas en, por ejemplo, Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

Es también fácilmente evidente para los expertos en la materia que también puede aislarse el ADN que codifica B_{1} a partir de una biblioteca de ADN genómico adecuada. Puede realizarse la construcción de bibliotecas de ADN genómico mediante técnicas convencionales bien conocidas en este campo. Pueden encontrarse técnicas de construcción de bibliotecas de ADN genómico bien conocidas en Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).

A fin de clonar el gen B_{1} mediante los procedimientos anteriores, puede ser necesaria la secuencia de aminoácidos de B_{1}. Para conseguir esto, la proteína B_{1} puede purificarse y determinarse su secuencia de aminoácidos parcial mediante secuenciación manual o secuenciadores automáticos. No es necesario determinar la secuencia de aminoácidos completa, sino que se determina la secuencial lineal de dos regiones de 6 a 8 aminoácidos de la proteína para la producción de cebadores para la amplificación por PCR de un fragmento parcial de ADN de B_{1}.

Una vez que se han identificado secuencias de aminoácidos adecuadas, se sintetizan las secuencias de ADN capaces de codificarlas. Debido a que el código genético es degenerado, puede usarse más de un codón para codificar un aminoácido concreto y, por lo tanto, la secuencia de aminoácidos puede estar codificada por uno cualquiera de un conjunto de oligonucleótidos de ADN similares. Sólo un miembro del conjunto será idéntico a la secuencia de B_{1}, pero será capaz de hibridar con el ADN de B_{1} aun en presencia de oligonucleótidos de ADN con emparejamientos erróneos en condiciones apropiadas. En condiciones alternativas, los oligonucleótidos de ADN mal emparejados pueden todavía hibri-
dar con el ADN de B_{1} lo suficiente como para permitir la identificación y el aislamiento del ADN codificante de B_{1}.

La B_{1} purificada biológicamente activa puede tener diferentes formas físicas. B_{1} puede existir como un polipéptido naciente de longitud completa o no procesado, o como polipéptidos parcialmente procesados o combinaciones de polipéptidos procesados. El polipéptido naciente completo B_{1} puede modificarse de manera post-traduccional mediante sucesos de escisión proteolítica específicos que producen la formación de fragmentos del polipéptido naciente de longitud completa. Un fragmento, o una asociación física de fragmentos pueden tener la actividad biológica completa asociada con B_{1} (unión específica de des-Arg^{10}calidina y des-Arg^{9}bradiquinina), sin embargo, el grado de actividad de B_{1} puede variar entre fragmentos B_{1} individuales y fragmentos de polipéptidos B_{1} físicamente asociados.

Se ha descubierto que la forma de B_{1} sustancialmente pura obtenida de fuentes naturales o a partir de células huésped recombinantes de acuerdo con los procedimientos de purificación que se describen en este documento, es un polipéptido codificado por un ARNm sencillo. Se descubrió que el polipéptido B_{1} tenía un peso molecular aparente de aproximadamente 40,4 kDa.

El ADN de B_{1} clonado obtenido por los procedimientos que se describen en este documento puede expresarse de manera recombinante mediante clonación molecular en un vector de expresión que contenga un promotor adecuado y otros elementos reguladores de la transcripción adecuados, y transferirse a células huésped procariotas o eucariotas para producir B_{1} recombinante. Se describen con detalle técnicas para tales manipulaciones en Sambrook, J., y col., anteriormente, y se conocen bien en la técnica.

Los vectores de expresión se definen en este documento como secuencias de ADN que se requieren para la transcripción de las copias clonadas de genes y la traducción de sus ARNm en un huésped apropiado. Tales vectores pueden usarse para expresar genes eucariotas en una diversidad de huéspedes tales como bacterias, algas verdeazuladas, células de plantas, células de insectos, células de hongos y células de animales.

Los vectores específicamente diseñados permiten el transporte de ADN entre huéspedes tales como entre bacterias-levaduras, o bacterias-células animales, o bacterias-células de hongos o bacterias-células de invertebrados. Un vector de expresión apropiadamente generado debe contener: un origen de la replicación para la replicación autónoma en células huésped, marcadores de selección, un número limitado de sitios de enzimas de restricción útiles, un potenciador para producir un alto número de copias y promotores activos. Un promotor se define como una secuencia de ADN que dirige a la ARN polimerasa para que se una al ADN e inicie la síntesis de ARN. Un promotor potente es uno que provoca el inicio de síntesis de ARNm a una alta frecuencia. Los vectores de expresión pueden incluir, pero sin limitación, vectores de clonación, vectores de clonación modificados y plásmidos específicamente diseñados o virus.

Pueden usarse una diversidad de vectores de expresión de mamíferos para expresar B_{1} recombinante en células de mamíferos. Los vectores de expresión de mamíferos disponibles en el mercado que pueden ser adecuados para la expresión recombinante de B_{1} incluyen, pero sin limitación, pcDNA3 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1(R-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) y \lambdaZD35 (ATCC 37565).

Pueden usarse una diversidad de vectores de expresión bacterianos para expresar B_{1} recombinante en células bacterianas. Los vectores de expresión bacterianos disponibles en el mercado que pueden ser adecuados para la expresión de B_{1} recombinante incluyen, pero sin limitación, pET11a (Novagen), lambda gt 11 (Invitrogen), pcDNAII (Invitrogen) y pKK223-3 (Pharmacia).

Pueden usarse una diversidad de vectores de expresión de células de hongos para expresar B_{1} recombinante en células de hongos. Los vectores de expresión de células de hongos disponibles en el mercado que pueden ser adecuados para la expresión de B_{1} recombinante incluyen, pero sin limitación, pYES2 (Invitrogen) y vector de expresión de Pichia (Invitrogen).

Pueden usarse una diversidad de vectores de expresión de células de insectos para expresar B_{1} recombinante en células de insectos. Los vectores de expresión de células de insectos disponibles en el mercado que pueden ser adecuados para la expresión de B_{1} recombinante incluyen, pero sin limitación, pBlue Bac m (Invitrogen).

Puede usarse un vector de expresión que contiene ADN que codifica B_{1} para la expresión de B_{1} en una célula huésped recombinante. Las células huésped recombinantes pueden ser procariotas o eucariotas, incluyendo, pero sin limitación, bacterias tales como E. coli, células de hongos tales como levaduras, células de mamíferos que incluyen, pero sin limitación, líneas celulares de origen humano, bovino, porcino, de monos y de roedores, y células de insectos que incluyen, pero sin limitación, líneas celulares procedentes de Drosophila y de gusanos de seda. Las líneas celulares procedentes de especies de mamíferos que pueden ser adecuadas y que están disponibles en el mercado incluyen, pero sin limitación, células L L-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), células L L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/ 3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) y MRC-5 (ATCC CCL 171).

El vector de expresión puede introducirse en células huésped mediante una cualquiera de varias técnicas que incluyen, pero sin limitación, transformación, transfección, lipofección, fusión de protoplastos y electroporación. Las células que contienen vectores de expresión se propagan de manera clonal y se analizan individualmente para determinar si producen proteína B_{1}. La identificación de clones de células huésped que expresen B_{1} puede realizarse por diversos medios que incluyen, pero sin limitación, la reactividad inmunológica con anticuerpos anti-B1 y la presencia de actividad de B_{1} asociada a células huésped, tal como la unión de ligandos específicos de B_{1} o la transducción de señales que se define como una respuesta mediada por la interacción de ligandos específicos de B_{1} con el receptor.

También puede realizarse la expresión de ADN de B_{1} usando ARNm sintético producido in vitro o ARNm nativo. Puede traducirse eficazmente ARNm sintético o ARNm aislado de células productoras de B_{1} en diversos sistemas sin células, incluyendo, pero sin limitación, extractos de germen de trigo y extractos de reticulocitos, así como traducirse eficazmente en sistemas basados en células, incluyendo, pero sin limitación, y prefiriéndose, la microinyección en oocitos de rana.

Para determinar la(s) secuencia(s) de ADN de B_{1} que producen niveles óptimos de actividad de B_{1} y/o de proteína B_{1}, pueden generarse moléculas de ADN de B_{1} que incluyen, pero sin limitación, las siguientes: la fase de lectura abierta de longitud completa del ADN de B_{1} (que codifica una proteína de aproximadamente 40,4 kDa = aproximadamente de la base 209 a aproximadamente la base 1267) y diversas construcciones que contienen porciones de ADN que codifican la proteína B_{1}. Todas las construcciones pueden diseñarse para que no contengan ninguna, o para que contengan todas o porciones de la región no traducida 5' ó 3' del ADN de B_{1}. Puede determinarse la actividad de B_{1} y los niveles de expresión de proteína después de la introducción, tanto individual como en combinación, de estas construcciones en células huésped apropiadas. Después de la determinación del casete de ADN de B_{1} que produce la expresión óptima en ensayos transitorios, esta construcción de ADN de B_{1} se transfiere a una diversidad de vectores de expresión, para la expresión en células huésped que incluyen, pero sin limitación, células de mamíferos, células de insectos, E. coli y células de levaduras tales como S. cerevisiae.

Pueden analizarse tanto los niveles de actividad del receptor B_{1} como los niveles de proteína B_{1} en células huésped transfectantes y en oocitos no humanos microinyectados mediante los procedimientos siguientes. Un procedimiento para evaluar la actividad del receptor B_{1} implica la medición directa de la unión de ligandos específicos. En el caso de células huésped recombinantes, esto implica la transfección o la cotransfección de plásmidos que contienen el ADN de B_{1}. En el caso de oocitos no humanos, implica la inyección de ARN de B_{1} sintéticos o nativos. Se mide la actividad de B_{1} después de un periodo apropiado de tiempo que permita la expresión. Un procedimiento para la detección de la actividad de B_{1} implica la medición directa de la actividad de B_{1} en células completas o en lisados celulares preparados a partir de células huésped transfectadas con ADN de B_{1} u oocitos no humanos inyectados con ARN de B_{1}. La actividad de B_{1} se mide mediante las características de la unión del ligando específico del receptor B_{1} o mediante la respuesta a la movilización de calcio o a la hidrólisis de fosfatidil inositol mediada por moduladores específicos de B_{1} en células huésped que expresan ADN o ARN de B_{1}. Los moduladores, como se describen en este documento, incluyen, pero sin limitación, agonistas, antagonistas, supresores e inductores.

La proteína puede recuperarse después de la expresión de B_{1} en una célula huésped recombinante para proporcionar B_{1} en forma purificada. Están disponibles y son adecuados para usar varios procedimientos de purificación de B_{1}. Como se describe en este documento, la B_{1} recombinante puede purificarse a partir de lisados y extractos de células mediante diversas combinaciones de, o la aplicación individual de fraccionamiento salino, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de adsorción en hidroxiapatita y cromatografía de interacción hidrófoba.

Además, la B_{1} recombinante puede separarse de otras proteínas celulares mediante el uso de una columna de inmunoafinidad generada con anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para B_{1} naciente de longitud completa o para fragmentos polipeptídicos de B_{1}.

Se purifican anticuerpos monoespecíficos contra B_{1} a partir de antisuero de mamíferos que contiene anticuerpos reactivos contra B_{1} o se preparan como anticuerpos monoclonales reactivos con B_{1} usando la técnica de Kohler y Milstein, Nature 256, 495-497 (1975). Un anticuerpo monoespecífico, como se usa en este documento, se define como una única especie de anticuerpos o como múltiples especies de anticuerpos con características de unión homogéneas para B_{1}. La unión homogénea, como se usa en este documento, se refiere a la capacidad de la especie de anticuerpo para unirse a un antígeno o epítopo específico, tal como los que se asocian con la B_{1}, como se ha descrito anteriormente. Se obtienen anticuerpos específicos de B_{1} por inmunización de animales tales como ratones, ratas, cobayas, conejos, cabras, caballos y similares, siendo los conejos los preferidos, con concentraciones apropiadas de B_{1} con o sin un adyuvante inmune.

Se recoge suero preinmune antes de la primera inmunización. Cada animal recibe entre aproximadamente 0,1 \mug y aproximadamente 1000 \mug de B_{1} asociada con un adyuvante inmune aceptable. Tales adyuvantes aceptables incluyen, pero sin limitación, el completo de Freund, el incompleto de Freund, precipitado de alumbre, emulsión de agua en aceite que contiene Corynebacterium parvum y ARNt. La inmunización inicial está constituida por B_{1} en, preferiblemente, adyuvante completo de Freund en múltiples sitios, bien por vía subcutánea (SC), por vía intraperitoneal (IP) o por ambas. Se extrae sangre de cada animal a intervalos regulares, preferiblemente semanalmente, para determinar el título de anticuerpos. Los animales pueden o no recibir inyecciones de refuerzo después de la inmunización inicial. A los animales que reciben inyecciones de refuerzo se les administra generalmente una cantidad equivalente de antígeno en adyuvante incompleto de Freund por la misma vía. Las inyecciones de refuerzo se administran a intervalos de aproximadamente tres semanas hasta que se obtengan títulos máximos. Se extrae sangre de los animales aproximadamente 7 días después de cada inmunización de refuerzo o aproximadamente semanalmente después de una única inmunización, se recogen los sueros y se almacenan alícuotas a aproximadamente -20ºC.

Los anticuerpos monoclonales (mAb) reactivos con B_{1} se generan por inmunización de ratones endogámicos, preferiblemente Balb/c, con B_{1}. Los ratones se inmunizan por vía IP o SC con aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 10 \mug, preferiblemente aproximadamente 1 \mug, de B_{1} en aproximadamente 0,5 ml de tampón o suero salino incorporado en un volumen igual de un adyuvante aceptable, como se ha analizado anteriormente. Se prefiere adyuvante completo de Freund. Los ratones reciben una inmunización inicial en el día 0 y se dejan descansar de aproximadamente 3 a aproximadamente 30 semanas. Se administran una o más inmunizaciones de refuerzo a los ratones inmunizados con aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 \mug de B_{1} en una solución tampón tal como suero salino tamponado con fosfato por vía intravenosa (IV). Se obtienen linfocitos de ratones positivos a anticuerpos, preferiblemente linfocitos de bazo, mediante la extracción de bazos de ratones inmunizados mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Se producen células de hibridoma mezclando los linfocitos de bazo con una pareja de fusión apropiada, preferiblemente células de mieloma, en condiciones que permitan la formación de hibridomas estables. Las parejas de fusión pueden incluir, pero sin limitación: mielomas de ratón P3/NS 1/Ag 4-1; MPC-11; S-194 y Sp 2/0, prefiriéndose Sp 2/0. Las células productoras de anticuerpos y las células de mieloma se fusionan en polietilenglicol, de peso molecular de aproximadamente 1000, a concentraciones de aproximadamente 30% a aproximadamente 50%. Se seleccionan células de hibridoma fusionadas mediante desarrollo en Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con hipoxantina, timidina y aminopterina mediante procedimientos conocidos en la técnica. Se recogen los fluidos sobrenadantes de pocillos de crecimiento positivo en los días aproximadamente 14, 18, y 21 y se explora su producción de anticuerpos mediante un inmunoensayo tal como inmunoradioensayo en fase sólida (SPIRA) usando B_{1} como antígeno. Los fluidos de cultivo se analizan también en el ensayo de precipitación de Ouchterlony para determinar el isotipo del mAb. Las células de hibridoma de pocillos positivos a anticuerpos se clonan mediante una técnica tal como la técnica de ágar blando de MacPherson, Soft Agar Techniques in Tissue Culture Methods and Applications, Kruse y Paterson, Eds., Academic Press, 1973.

Se producen anticuerpos monoclonales in vivo mediante la inyección en ratones Balb/c sensibilizados con pristano, aproximadamente 0,5 ml por ratón, de aproximadamente 2 x 10^{6} a aproximadamente 6 x 10^{6} células de hibridoma aproximadamente 4 días después de la sensibilización. Se recoge el fluido ascítico aproximadamente 8-12 días después de la transferencia de células y se purifican los anticuerpos monoclonales mediante técnicas conocidas en la
técnica.

La producción in vitro de mAb anti-B_{1} se realiza cultivando el hibridoma en DMEM que contiene aproximadamente 2% de suero bovino fetal para obtener cantidades suficientes del mAb específico. El mAb se purifica mediante técnicas conocidas en este campo.

Los títulos de anticuerpo de fluidos ascíticos o de cultivo del hibridoma se determinan mediante diversos ensayos serológicos o inmunológicos que incluyen, pero sin limitación, precipitación, aglutinación pasiva, técnica de anticuerpo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y técnicas de radioinmunoensayo (RIA). Se usan ensayos similares para detectar la presencia de B_{1} en fluidos corporales o en tejidos y extractos de células.

Es fácilmente evidente para los expertos en la materia que los procedimientos descritos anteriormente para la producción de anticuerpos monoespecíficos pueden utilizarse para producir anticuerpos específicos para fragmentos polipeptídicos B_{1} o para polipéptido naciente B_{1} de longitud completa. En concreto, es fácilmente evidente para los expertos en la materia que pueden generarse anticuerpos monoespecíficos que sean específicos para el receptor completamente funcional o para fragmentos del mismo.

Se fabrican columnas de afinidad de anticuerpos B_{1} añadiendo los anticuerpos a Affigel-10 (Biorad), un soporte de gel que se activa con ésteres de N-hidroxisuccinimida de modo que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el soporte de perlas de gel de agarosa. Los anticuerpos se acoplan después al gel mediante enlaces amida con el brazo espaciador. Los ésteres activados restantes se inactivan después con etanolamina HCl 1 M (pH 8). La columna se lava con agua y después con glicina HCl 0,23 M (pH 2,6) para retirar cualquier anticuerpo no conjugado o proteína extraña. La columna se equilibra después con suero salino tamponado con fosfato (pH 7,3) y se pasan lentamente los sobrenadantes de cultivos celulares o extractos celulares que contienen B_{1} a través de la columna. La columna se lava después con suero salino tamponado con fosfato hasta que la densidad óptica (A_{280}) cae hasta el valor inicial, y después la proteína se eluye con glicina HCl 0,23 M (pH 2,6). La proteína B_{1} purificada se dializa después contra suero salino tamponado con fosfato.

Se ha demostrado anteriormente que la línea celular de fibroblastos embrionarios humanos IMR-90 expresa el receptor de bradiquinina de subtipo B_{1} (R. H. Goldstein, M. Wall, Journal of Biological Chemistry 259, 9263-9268 (1984)). Una caracterización farmacológica más detallada reveló la presencia de aproximadamente 5000 sitios de unión de alta afinidad por el agonista de B_{1} [^{3}H]des-Arg^{10}calidina y aproximadamente 70000 sitios de unión de alta afinidad por el agonista de B_{2} [^{3}H]bradiquinina por célula. Se demostró la capacidad del receptor B_{1} expresado en células IMR-90 para movilizar Ca^{2+} en respuesta a des-Arg^{10}calidina usando FURA-2 como un indicador. Además, se descubrió que el tratamiento de células IMR-90 con la citocina IL-1\beta estimulaba el número de receptores de bradiquinina B_{1} aproximadamente 7 veces. Según estos datos, se usan células IMR-90 inducidas por IL-1\beta como fuente de ARNm para clonación de expresión.

Se aisló un clon de ADNc que codificaba un receptor de bradiquinina B_{1} humano a partir de una biblioteca de ADNc de fibroblastos IMR-90 mediante clonación de expresión. Se utilizó la fotoproteína aecuorina como un indicador de la capacidad del agonista del receptor B_{1} des-Arg^{10}calidina de mediar la movilización de Ca^{2+} en oocitos de Xenopus laevis inyectados con ARN procedente de IMR-90. Se aisló un único clon con un inserto de aproximadamente 1307 pb que contiene una fase de lectura abierta que codifica una proteína de aproximadamente 353 aminoácidos con las características de un receptor acoplado a proteína G. La secuencia de aminoácidos del receptor de bradiquinina B_{1} tiene una identidad de aproximadamente 36% con la secuencia de aminoácidos del receptor de bradiquinina B_{2}. El receptor de bradiquinina B_{1} que se expresa en células COS-7 presenta una alta afinidad de unión por [^{3}H]des-Arg^{10}calidina y una baja afinidad por bradiquinina. El antagonista del receptor B_{1} des-Arg^{10}[Leu^{9}]calidina desplaza eficazmente a [^{3}H]des-Arg^{10}calidina del receptor clonado, mientras que el antagonista del receptor B_{2} HOE 140 (Hock, F.J. y col. British Journal of Pharmacology 102, 769-773 (1991)) no lo hace. Por lo tanto, el receptor expresado tiene las características farmacológicas del receptor de subtipo B_{1}. Se ha implicado al receptor de bradiquinina B_{1} en inflamación crónica e hiperalgesia, mientras que el receptor B_{2} parece mediar respuestas inflamatorias agudas y algésicas. La disponibilidad del receptor de bradiquinina B_{1} humano clonado permite la identificación de moduladores útiles en enfermedades y afecciones mediadas por B_{1} tales como hiperalgesia, así como procesos inflamatorios agudos y crónicos.

La presente invención se dirige también a procedimientos para la selección de compuestos que modulen la expresión de ADN o de ARN que codifica B_{1}, así como la función de la proteína B_{1} in vivo. Pueden ser compuestos que modulen estas actividades ADN, ARN, péptidos, proteínas o moléculas orgánicas no proteicas. Los compuestos pueden modular incrementando o atenuando la expresión de ADN o de ARN que codifica B_{1}, o la función de la proteína B_{1}. Pueden detectarse compuestos que modulen la expresión de ADN o de ARN que codifica B_{1} o la función de la proteína B_{1} mediante una diversidad de ensayos. El ensayo puede ser un ensayo simple "sí/no" para determinar si hay un cambio en la expresión o la función. El ensayo puede convertirse en cuantitativo mediante la comparación de la expresión
o de la función de una muestra de ensayo con los niveles de expresión o de función en una muestra convencional.

Pueden fabricarse kits que contengan ADN de B_{1}, anticuerpos contra B_{1} o proteína B_{1}. Tales kits se usan para detectar ADN que hibride con ADN de B_{1} o para detectar la presencia de proteína o de fragmentos peptídicos B_{1} en una muestra. Tal caracterización es útil para una diversidad de propósitos que incluyen, pero sin limitación, análisis forenses y estudios epidemiológicos.

Las moléculas de ADN, moléculas de ARN, proteínas recombinantes y anticuerpos de la presente invención pueden usarse para explorar y medir niveles de ADN de B_{1}, de ARN de B_{1} o de proteína B_{1}. Las mismas proteínas recombinantes, moléculas de ADN, moléculas de ARN y anticuerpos se prestan a la formulación de kits adecuados para la detección y la tipificación de B_{1}. Un kit de ese tipo comprenderá un vehículo compartimentado adecuado para mantener en confinamiento cerrado al menos un depósito. El vehículo comprenderá adicionalmente reactivos tales como proteína B_{1} recombinante o anticuerpos anti-B1 adecuados para detectar B_{1}. El vehículo puede también contener un medio para la detección tal como antígeno marcado o sustratos enzimáticos o similares.

Pueden sintetizarse las secuencias nucleotídicas que son complementarias a la secuencia de ADN codificante de B_{1} para terapia antisentido. Estas moléculas antisentido pueden ser ADN, derivados estables de ADN tales como fosforotioatos o metilfosfonatos, ARN, derivados estables de ARN tales como 2'-O-alquil-ARN, u otros oligonucleótidos antisentido miméticos de B_{1}. Pueden introducirse moléculas antisentido de B_{1} en células mediante microinyección, encapsulación en liposomas o mediante expresión a partir de vectores que contengan la secuencia antisentido. La terapia antisentido de B_{1} puede ser particularmente útil para el tratamiento de enfermedades en las que sea beneficioso reducir la actividad de B_{1}.

Puede usarse terapia génica de B_{1} para introducir B_{1} en células de órganos objetivo. El gen B_{1} puede ligarse con vectores virales que medien la transferencia del ADN de B_{1} mediante infección de células huésped receptoras. Los vectores virales adecuados incluyen retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, herpesvirus, virus vaccinia, poliovirus y similares. Como alternativa, el ADN de B_{1} puede transferirse a células para terapia génica mediante técnicas no virales que incluyen transferencia de ADN dirigida mediada por receptor usando conjugados ligando-ADN o conjugados adenovirus-ligando-ADN, lipofección por fusión de membranas o microinyección directa. Estos procedimientos y variaciones de los mismos son adecuados para la terapia génica de B_{1} ex vivo así como in vivo. La terapia génica de B_{1} puede ser particularmente útil para el tratamiento de enfermedades en las que es beneficioso elevar la actividad de B_{1}.

Pueden formularse composiciones farmacéuticamente útiles que comprendan ADN de B_{1}, ARN de B_{1} o proteína B_{1}, o moduladores de la actividad del receptor B_{1}, de acuerdo con procedimientos conocidos tales como mediante la adición de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Pueden encontrarse ejemplos de tales vehículos y procedimientos de formulación en Remington's Pharmaceutical Sciences. Para generar una composición farmacéuticamente aceptable para la administración eficaz, tales composiciones contendrán una cantidad eficaz de proteína, ADN, ARN o modulador.

Las composiciones terapéuticas o diagnósticas importantes se administran a un individuo en cantidades suficientes para tratar o diagnosticar trastornos relacionados con B_{1}. La cantidad eficaz puede variar de acuerdo con una diversidad de factores tales como el estado, el peso, el sexo y la edad del individuo. Otros factores incluyen el modo de administración.

Pueden proporcionarse las composiciones farmacéuticas al individuo por una diversidad de vías tales como subcutánea, tópica, oral e intramuscular.

Pueden usarse solos compuestos identificados de acuerdo con los procedimientos que se describen en este documento a dosificaciones apropiadas que se definen mediante ensayos de rutina a fin de obtener una inhibición óptima del receptor B_{1} o de su actividad, minimizando al mismo tiempo cualquier toxicidad potencial. Además, puede ser deseable la coadministración o la administración secuencial de otros agentes.

Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención.

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Ejemplo 1 Aislamiento de ARN Inyecciones de oocitos

Se realizó la inyección de ARNm o de ARNc en oocitos de Xenopus mediante una modificación de los protocolos establecidos (A. Coleman, Transcription and Translation: A Practical Approach. B. D. Hanes, S. J. Higgins, Eds., (1984); Y. Masu, y col., Nature 329, 836-838 (1987)). Se extrajeron por cirugía oocitos de Xenopus laevis (Xenopus uno) albinos o pigmentados anestesiados con tricaína a 0,17%. Los lóbulos ováricos extirpados se separaron con pinzas de joyero y después se introdujeron en OR-2 (NaCl 82,5 mM, KCl 2 mM, MgCl_{2} 1 mM, HEPES 5 mM a pH 7,4) que contenía 2 mg/ml de colagenasa B (Boehringer Mannheim) durante 2 horas a temperatura ambiente con un cambio del tampón a la hora. Los oocitos aislados se lavaron repetidamente en OR-2 hasta que el sobrenadante permanecía transparente. Se seleccionaron oocitos en fase 5 y 6 y se cultivaron durante toda la noche en OR-2 suplementado (OR-2 que contiene CaCl_{2} 1,8 mM, gentamicina 0,5 mg/ml y teofilina 0,5 mM). Inicialmente, se inyectaron oocitos con 46 nl de ARN a una concentración de 1 ó 2 mg/ml en H_{2}O, y una vez que el tamaño del conjunto se redujo a menos de 30 clones, la concentración de ARNc se redujo a 40 ng/ml. Se inyectó el ARN usando un inyector de oocitos automático Nanoject (Drummond Scientific) y se extrajeron agujas de inyección de capilares Drummond de 3,5'' (8,89 cm) usando un extractor Flaming/Brown Micropipette (Sutter Instruments). De dos a tres días después de la inyección de ARN, se inyectaron oocitos con 92 ng de aecuorina (Friday Harbor Photoproteins) resuspendidos en 46 nl de EDTA 1 mM, como se ha descrito anteriormente (K. Sandberg, A. J. Markwick, D. P. Trinh, K. J. Catt, FEBS Letters 241, 177-180 (1988); E. Giladi, E. R. Spindel, BioTechniques 10, 744-747 (1991)). Al día siguiente, se estimularon oocitos individuales colocados en pocillos de una placa de microtitulación que contenía 225 \mul de OR-2 con agonistas peptídicos y se midió la fotorrespuesta a la aecuorina usando un luminómetro de placa de microtitulación ML3000 (Dynatech). Los oocitos se estimularon con varios péptidos (Peninsula Laboratories) como se describe en el texto y en las leyendas de las figuras.

La inyección de un ARNm poli (A)^{+} obtenido a partir de células IMR-90 inducidas con IL-1\beta en oocitos de Xenopus laevis produjo una luminiscencia mediada por aecuorina en respuesta al agonista de B_{1} des-Arg^{10}calidina o al agonista de B_{2} BK (Figura 3). El ARNm poli (A)^{+} se fraccionó por tamaños sobre un gradiente de sacarosa, las fracciones se inyectaron en oocitos y se analizó la capacidad de los oocitos para responder a BK o des-Arg^{10}calidina. Los transcritos de los receptores B_{1} y B_{2} se separaron claramente mediante el fraccionamiento por tamaños. El ARNm que mediaba la respuesta a des-Arg^{10}calidina presentaba un tamaño aparente de 1,6-1,8 kb, mientras que el ARNm que mediaba la respuesta a BK tenía un tamaño aparente de 4,4-4,6 kb. El tamaño aparente del ARNm que codifica la respuesta a bradiquinina coincide con el tamaño del transcrito del receptor de bradiquinina B_{2} determinado anteriormente (A. E. McEachern, y col., Proc. Natl. Acad. Sci: 88, 7724-7728 (1991); J. F. Hess, y col., Molecular Pharmacology 45, 1-8(1994)).

Ejemplo 2 Fraccionamiento de ARN

Se desarrollaron células IMR-90 (ATCC CCL 186) en MEM suplementado con suero bovino fetal a 10%, glutamina, aminoácidos no esenciales, piruvato sódico, penicilina y estreptomicina (Gibco). Dos horas y media antes de la extracción de ARNm, se expusieron células IMR-90 a 200 pg/ml de IL-1\beta (R & D Systems). Se purificó el ARNm de estas células usando el sistema de aislamiento de ARNm PolyAtract (Promega) y se resuspendió en H_{2}O a una concentración de 2 mg/ml.

El ARNm de IMR-90 se fraccionó por tamaños en un gradiente continuo de sacarosa de 6 a 20% en PIPES 15 mM (pH 6,5), EDTA 5 mM y N-lauroilsarcosina a 0,25%. Se calentaron 480 \mug de ARNm de células IMR-90 inducidas con IL-1\beta a 65ºC durante 3 minutos, rápidamente se enfriaron en hielo, y se cargaron en el gradiente. El ARN se fraccionó por tamaños mediante centrifugación a 18ºC durante 19 horas a 77.000 x g. Se recogieron fracciones de cada gradiente (450 \mul) del fondo del tubo y se controló su absorbancia a 260 DO. Las fracciones se precipitaron con etanol dos veces y se resuspendieron a una concentración final de 1 \mug/\mul. La determinación de los tamaños de ARN se basó en el patrón de migración de 80 \mug de marcadores de ARN de 9,49-0,24 kb (BRL) cargados en un gradiente en paralelo.

Construcción de bibliotecas

Se utilizó una fracción máxima de ARN de un gradiente de sacarosa que produjo una respuesta a des-Arg^{10}calidina para generar una biblioteca de ADNc. La biblioteca se construyó en el vector de expresión de mamíferos pcDNA3 usando una combinación de hexámeros aleatorios y oligo dT para cebar la síntesis de la primera cadena de ADNc. La síntesis de la primera cadena de ADNc de aproximadamente 3 \mug de ARNm seleccionado por tamaño de fracción 14 se cebó con 50 ng de hexámeros aleatorios y con 400 ng de un oligonucleótido oligo dT Not I y se sintetizó con la transcriptasa inversa BRL Superscript II (Gibco-BRL). Después de la síntesis de la segunda cadena se ligaron adaptadores Bst XI/Eco RI (Invitrogen) en sus extremos y se pasó el ADNc a través de una columna de exclusión por tamaños BRLcDNA (Gibco-BRL). Se clonó el ADNc en el sitio Bst XI del pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) que contiene un polienlazador modificado. El ADN plasmídico se transformó células XL-1 Blue (Stratagene). La biblioteca contenía más de 90% de insertos con un tamaño de inserto medio de 1,9 kb.

La biblioteca se sembró en placa en combinaciones de aproximadamente 5000 clones que se usaron para sintetizar ARNc usando la ARN polimerasa de T7. Las colonias se sembraron en filtros de selección Colony/Plaque (NEN/Dupont) que se colocaron sobre placas de agar de Luria-Bertani (LB) suplementadas con 100 \mug/ml de ampicilina (Sigma). Se hicieron filtros réplica, las colonias bacterianas se rasparon en caldo LB, y se preparó una disolución madre en glicerol congelada. El ADN plasmídico se generó usando el sistema de purificación de ADN Wizard (Promega). Se linealizó el ADN plasmídico con Not I y se sintetizó el ARNc usando la ARN polimerasa de T7 con el kit de inserción de caperuzas de ARN mCAP (Stratagene).

De las veinticinco combinaciones de ARNc que se inyectaron en oocitos de Xenopus, 11 presentaban luminiscencia mediada por aecuorina en respuesta a des-Arg^{10}calidina. La combinación que producía la respuesta más robusta se volvió a sembrar en placas y se fraccionó en 25 combinaciones de aproximadamente 800 clones. Ocho combinaciones presentaron respuesta a des-Arg^{10}calidina. La combinación positiva más fuerte se examinó adicionalmente usando electrofisiología para controlar el canal de Cl sensible a Ca^{2+}. La des-Arg^{10}calidina produjo una respuesta que fue bloqueada por el antagonista del receptor B_{1} des-Arg^{10}[Leu]^{9}calidina. Después, esta combinación se subdividió en 32 combinaciones de aproximadamente 25 clones individuales. Se identificaron dos combinaciones positivas, que contenían 14 y 34 clones. Se preparó el ARNc de clones individuales y se analizó en oocitos de Xenopus. Se descubrió que tres clones individuales provocaban una respuesta a des-Arg^{10}calidina (Figuras 4 A y B). El análisis de restricción, la inmunotransferencia de Southern y el análisis preliminar de la secuencia de ADN indicaron que estos clones individuales eran similares. Se escogió un clon, el 33E9, para análisis, expresión y caracterización farmacológica adicional de la secuencia de ADN. Se determinó la secuencia de ADN de ambas cadenas mediante secuenciación manual usando Sequenase (USB) o mediante secuenciación automática usando una unidad de secuenciación ABI 373A (Perkin Elmer).

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Estructura primaria del receptor B1

La secuencia de ADN del clon de aproximadamente 1307 pb 33E9 contiene una fase de lectura abierta de aproximadamente 1059 pb (Figuras 1 y 2). La metionina iniciadora propuesta en el nucleótido aproximadamente 209 se ajusta a la secuencia de Kozak (M. Kozak, Journal of Cell Biology 108, 229-241 (1989)) en la posición +4 pero no en la posición -3. La supuesta secuencia 5' no traducida de aproximadamente 208 nucleótidos contiene una región de identidad de nucleótidos relativamente alta con una gran diversidad de secuencias de ADN humanas, sugiriendo un elemento repetitivo humano. El elemento repetitivo aparente parece ser una porción auténtica del transcrito de ARNm ya que se detectó en diversos clones obtenidos independientemente de ADNc. La identidad de secuencia de ADN entre la fase de lectura abierta del clon 33E9 y el ADN que codifica el receptor B_{2} humano (S. J. Powell, y col., Genomics 15, 435-438 (1993); J. F. Hess, J. A. Borkowski, G. S. Young, C. D. Strader, R W. Ransom, Biochem. and Biophys. Res. Comm. 184, 260-268(1992); D. Eggerickx, E. Raspe, D. Bertrand, G. Vassart M. Parmentier, Biochem. Biophys. Res. Comm. 187, 1306-1313 (1992)) es de 54%. Esto coincide con la incapacidad de los análisis genómicos de inmunotransferencia de Southern para detectar este gen (A. E. McEachem, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 7724-7728 (1991); J. F. Hess, y col., Molecular Pharmacology 45, 1-8 (1994)).

La secuencia de aminoácidos propuesta codificada mediante la fase de lectura abierta tiene una identidad de 36% con la del receptor de bradiquinina B_{2}. Una representación de la hidrofobicidad de la secuencia de aminoácidos revela los siete dominios transmembrana potenciales que son característicos de los receptores acoplados a proteína G (H. G. Dohlman, J. Thomer, M. G. Caron, R. J. Lefkowitz, Ann. Rev. Biochem. 60, 653-688 (1991); C. D. Strader, I. S. Sigal, R.A.F. Dixon, FASEB 3, 1825-1832 (1989)). También están presentes en la secuencia dos restos Cys conservados que se ha propuesto que forman un puente disulfuro entre el primer y el segundo bucle extracelular en casi todos los receptores acoplados a proteína G. Hay dos sitios de glicosilación ligados a N potenciales en el dominio N-terminal de la secuencia y un sitio supuesto para glicosilación ligada a N en la región del segundo bucle extracelular. Están presentes sitios de fosforilación de proteína quinasa C potenciales en el dominio intracelular 2 y en la cola carboxi-terminal. En otros receptores acoplados a proteína G se han implicado sitios de fosforilación potenciales similares en la desensibilización a corto plazo del receptor después de la estimulación con el agonista.

Ejemplo 3 Clonación de ADN genómico del receptor B1

Se ha construido una biblioteca de ADN genómico humano en el vector cosmídico sCOS usando ADN genómico aislado de células fibroblásticas HSF42 del prepucio humano (Chartrain, NA, y col. Journal of Biological Chemistry 269, 6765-6772 (1994)). La biblioteca de ADN recombinante construida a partir de ADN genómico de células humanas se siembra en placas sobre membranas de transferencia de exploración de la hibridación Colony/Plaque (Dupont/NEN) a una densidad de aproximadamente 30.000 colonias por placa. Las réplicas de las placas maestras se lisan y se procesan para hibridación usando protocolos convencionales (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989). El ADN se entrecruza con la membrana mediante UV con un Stratalinker (Stratagene). Los filtros se incuban toda la noche a 42ºC con una sonda radiomarcada en solución de hibridación de formamida a 50%, [SSC 5x, Denhardt's 5x, ADN 100 \mug/ml (Sigma)]. La sonda, un fragmento de ADN que contiene la secuencia codificante del receptor de bradiquinina B_{1} humano, se genera mediante marcado de cebadores aleatorio (Boehringer Mannheim Biochemicals) en presencia de [\alpha-^{32}P]dCTP (3000 Ci/mmol). Los filtros se lavaron a una rigurosidad final de SSC 0,1x, SDS a 0,1% a 42ºC. Los positivos se volvieron a explorar para aislar colonias individuales. Se prepara el ADN de las colonias positivas, se digiere con enzimas de restricción y se realiza análisis de inmunotransferencia de Southern para identificar fragmentos de restricción para subclonar. Se subclona un fragmento en pSP72 (Promega).

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Ejemplo 4 Clonación del ADNc de B1 en un vector de expresión de mamíferos Expresión y caracterización de células de mamíferos

Se consiguió la expresión transitoria del receptor de bradiquinina B_{1} clonado en células COS-7 mediante electroporación usando Biorad Gene Pulser. Tres días después de la transfección, las células se procesaron para un ensayo de unión de células completas como se ha publicado anteriormente (K. A. Schneck, J. F. Hess, G. Y. Stonesifer, R. W. Ransom, European Journal of Pharmacology-Molecular Pharmacology Sección 266, 277-292 (1994)) o se prepararon membranas como se ha descrito anteriormente (Huang, R.-R.C, Dehaven, R.N., Cheung, A.H., Diehl, R.E., Dixon, R.A.F., Strader, CD., Molecular-Pharmacology 37, 304-310 (1990)) y se midió la unión de radioligandos como sigue. Los estudios de desplazamiento se realizaron con [des-Arg^{10}], [3,4-^{3}H (N)]-calidina (NEN) 1 nM en presencia de concentraciones variables de compuestos competidores. Los ensayos de unión se realizaron a temperatura ambiente durante 45 minutos. Las reacciones se interrumpieron por filtración usando un colector de células Inotech sobre filtros de fibra de vidrio (Inotech) que se habían empapado brevemente en polietilenimina a 0,3%. Los filtros se lavaron cinco veces con 1 ml por pocillo de PBS frío y se contaron en un contador de centelleo líquido. Como alternativa, las reacciones se recogieron usando un colector de células Tomtec 96 sobre filtros de fibra de vidrio empapados previamente en polietilenimina a 0,3% (Pharmacia, tira de filtro impresa para usar con el 1205 Betaplate). El filtro se lavó cinco veces con un total de 10 ml por pocillo de PBS 1x frío, se secó y se selló en una bolsa (Pharmacia) que contenía líquido de centelleo. Se realizó un recuento usando un contador de centelleo líquido LKB1205 Betaplate.

Se transfectó el clon 33E9 de receptor de bradiquinina B_{1} en células COS-7 y se determinaron las propiedades farmacológicas del receptor expresado. Los datos de unión con [^{3}H]des-Arg^{10}calidina del análisis de saturación de Scatchard indicaron una K_{d} de aproximadamente 1,0 nM y una Bmáx de aproximadamente 120 fmol/mg de proteína. Las células COS-7 transfectadas de manera simulada no tenían ninguna unión específica con [^{3}H]des-Arg^{10}calidina.

Se evaluó la capacidad de diversos agonistas y antagonistas de receptores de bradiquinina para desplazar [^{3}H]des-Arg^{10}calidina 1 nM del receptor clonado (Fig. 5, Tabla 1). La CI_{50} para el desplazamiento de [^{3}H]des-Arg^{10}calidina 1 nM por bradiquinina del receptor clonado es >10 \muM. La baja afinidad de este receptor por bradiquinina y la alta afinidad por des-Arg^{10}calidina indican firmemente que este receptor de bradiquinina clonado es del subtipo B_{1}. Los estudios de competición de unión produjeron un orden de clasificación de afinidad por el receptor humano clonado para agonistas de quinina de des-Arg^{10}calidina > calidina > des-Arg^{9}bradiquinina >> bradiquinina. Éste es muy similar al orden de clasificación de potencia publicado para el receptor de bradiquinina B_{1} del conejo e idéntico al observado para el receptor B_{1} en células IMR-90 (Tabla 1). Tanto el receptor humano clonado como el receptor B_{1} en células IMR-90 presentan una afinidad relativamente baja por el agonista "clásico" del receptor B_{1} des-Arg^{9}bradiquinina, que se ha publicado que tiene una alta afinidad por el receptor B_{1} en la aorta de conejo (K. A. Schneck, J. F. Hess, G. Y. Stonesifer, R. W. Ransom, European Journal of Pharmacology-Molecular Pharmacology Sección 266, 277-282 (1994); D. Regoli, J. Barabe, Pharmacological Reviews 32, 1-46 (1980)). El receptor de bradiquinina B_{1} presente en la aorta humana también tiene una afinidad relativamente baja por des-Arg^{9}bradiquinina (>1000 nM, R.W.R, datos no publicados). Estos resultados, junto con la menor afinidad por des-Arg^{9}bradiquinina en relación con la des-Arg^{10}calidina en el conejo (K. A. Schneck, J. F. Hess, G. Y. Stonesifer, R. W. Ransom, European Journal of Pharmacology-Molecular Pharmacology Sección 266, 277-282 (1994); D. Regoli, J. Barabe, Pharmacological Reviews 32, 1-46 (1980)) sugieren que el ligando natural más potente para el receptor B_{1} es des-Arg^{10}calidina. Por lo tanto, el receptor B_{1} clonado en este documento parece ser el homólogo humano del receptor B_{1} presente en la aorta de conejo, y la menor afinidad del receptor humano por des-Arg^{9}bradiquinina parece ser una consecuencia de diferencias entre especies.

1

Se analizó también la capacidad de diversos antagonistas del receptor de bradiquinina para desplazar [^{3}H]des-Arg^{10}calidina 1 nM. El receptor clonado tiene una alta afinidad de unión por los antagonistas específicos de B_{1} des-Arg^{10}[Leu^{9}]calidina y des-Arg^{9}[Leu^{8}] bradiquinina (Fig. 5, Tabla 1). El potente agonista específico de B_{2} HOE 140 tiene una afinidad muy baja por el receptor clonado. Sin embargo, la retirada de la Arg C-terminal del HOE 140 produce un incremento significativo en la afinidad, como se espera para un receptor B_{1} (K. Wirth. y col., European Journal of Pharmacology 205, 217-218(1991)). Por lo tanto, la interacción del receptor clonado con antagonistas del receptor de bradiquinina coincide con la clasificación del receptor B_{1}.

En resumen, se ha utilizado una estrategia de clonación de expresión para aislar un clon que codifica un receptor de bradiquinina B_{1} humano. Este receptor se aisló por su capacidad, cuando se expresa en oocitos de Xenopus, para responder funcionalmente al agonista del receptor B_{1} des-Arg^{10}calidina. El receptor clonado es un receptor acoplado a proteína G que es más similar en su secuencia de aminoácidos al receptor de bradiquinina B_{2}. Las propiedades farmacológicas del receptor clonado que se expresa en células de mamíferos son características de la clasificación de receptores de bradiquinina B_{1}.

Ejemplo 5 Clonación del ADNc de B1 en vectores de expresión de E. coli

Se produce B_{1} recombinante en E. coli después de la transferencia del casete de expresión de B_{1} en vectores de expresión de E. coli, que incluyen, pero sin limitación, la serie pET (Novagen). Los vectores pET sitúan la expresión de B_{1} bajo el control del promotor del bacteriófago T7 estrictamente regulado. Después de la transferencia de esta construcción a un huésped de E. coli que contiene una copia cromosómica del gen de la ARN polimerasa de T7 dirigido mediante el promotor inducible lac, se induce la expresión de B_{1} cuando un sustrato de lac apropiado (IPTG) se añade al cultivo. Se determinan los niveles de B_{1} expresado mediante los ensayos que se describen en este
documento.

Se inserta el ADNc que codifica la fase de lectura abierta completa de B_{1} en el sitio Ndel de pET 11a. Se identifican construcciones en la orientación positiva mediante análisis de secuencia y se usan para transformar la cepa BL21 del huésped de expresión. Después se utilizan los transformantes para inocular cultivos para la producción de proteína B_{1}. Los cultivos pueden desarrollarse en medios M9 o ZB, cuya formulación conocen los expertos en la materia. Se induce la expresión de B_{1} después del crecimiento hasta una DO_{600}= 1,5 con IPTG 1 mM durante 3 horas
a 37ºC.

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Ejemplo 6 Clonación de ADNc de B1 en vectores para expresión en células de insecto

Se diseñan vectores de baculovirus, que proceden del genoma del virus AcNPV, para proporcionar un alto nivel de expresión de ADNc en la línea de células de insecto Sf9 (ATCC CRL Nº 1711). Se producen baculovirus recombinantes que expresan ADNc de B_{1} mediante los siguientes procedimientos convencionales (InVitrogen Maxbac Manual): se ligan las construcciones de ADNc de B_{1} con el gen de la poliedrina en una diversidad de vectores de transferencia de baculovirus, incluyendo el pAC360 y el vector BlueBac (InVitrogen). Se generan baculovirus recombinantes mediante recombinación homóloga después de la cotransfección del vector de transferencia de baculovirus y del ADN genómico linealizado de AcNPV [Kitts, P.A., Nuc. Acid. Res. 18, 5667 (1990)] en células Sf9. Se identifican virus pAC360 recombinantes por la ausencia de cuerpos de inclusión en células infectadas, y se identifican virus pBlueBac recombinantes según la expresión de \beta-galactosidasa (Summers, M. D. and Smith, G. E., Texas Agriculture Exp. Station Bulletin Nº 1555). Después de la purificación en placa, se mide la expresión de B_{1} mediante los ensayos que se describen en este documento.

Se inserta el ADNc que codifica la fase de lectura abierta completa de B_{1} en el sitio BamHI del pBlueBacll. Se identifican construcciones en la orientación positiva mediante análisis de secuencia, y se usan para transfectar células Sf9 en presencia de ADN lineal del AcNPV silvestre.

Se encuentra auténtico B_{1} activo en asociación con las células infectadas. Se extrae B_{1} activo de células infectadas por lisis hipotónica o con detergentes.

Como alternativa, se expresa el receptor B_{1} humano en la línea celular Drosophila Schneider 2 mediante cotransfección de las células Schneider 2 con un vector que contiene el ADN del receptor B_{1} cadena abajo y bajo el control de un promotor inducible de metalotioneína, y con un vector que codifica el gen de resistencia a neomicina G418. Después del desarrollo en presencia de G418, se obtienen células resistentes y se inducen para que expresen el receptor B_{1} mediante la adición de CuSO_{4}. Se consigue la identificación de moduladores del receptor B_{1} mediante ensayos que utilizan células completas o preparaciones de membrana.

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Ejemplo 7 Clonación de ADNc de B1 en un vector de expresión de levaduras

Se produce B_{1} recombinante en la levadura S. cerevisiae después de la inserción del cistrón de ADNc de B_{1} óptimo en vectores de expresión diseñados para dirigir la expresión intracelular o extracelular de proteínas heterólogas. En el caso de expresión intracelular, se ligan vectores tales como EmBLyex4 o similares con el cistrón B_{1} [Rinas, U. y col., Biotechnology 8, 543-545 (1990); Horowitz B. y col., J. Biol. Chem. 265, 4189-4192 (1989)]. Para la expresión extracelular, el cistrón B_{1} se liga en vectores de expresión de levaduras que se fusionan con una señal de secreción. Se determinan los niveles de B_{1} expresado mediante los ensayos que se describen en este documento.

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Ejemplo 8 Purificación de B1 recombinante

Puede purificarse B_{1} producido de manera recombinante mediante cromatografía de afinidad por anticuerpos.

Se fabrican columnas de afinidad con anticuerpos B_{1} añadiendo anticuerpos anti-B1 a Affigel-10 (Biorad), un soporte de gel que se preactiva con ésteres de N-hidroxisuccinimida de modo que los anticuerpos forman enlaces covalentes con el soporte de perlas de gel de agarosa. Los anticuerpos se acoplan después al gel mediante enlaces amida con el brazo espaciador. Los ésteres activados restantes se inactivan después con etanolamina HCl 1 M (pH 8). La columna se lava con agua y después con glicina HCl 0,23 M (pH 2,6) para retirar cualquier anticuerpo no conjugado o proteína extraña. La columna se equilibra después con suero salino tamponado con fosfato (pH 7,3) junto con agentes solubilizantes de membrana apropiados tales como detergentes, y se pasan lentamente los sobrenadantes de cultivos celulares o extractos celulares que contienen B_{1} solubilizado o subunidades de B_{1} a través de la columna. La columna se lava después con suero salino tamponado con fosfato junto con detergentes hasta que la densidad óptica (A_{280}) cae hasta la del fondo, y después la proteína se eluye con glicina HCl 0,23 M (pH 2,6) junto con detergentes. La proteína B_{1} purificada se dializa después contra suero salino tamponado con fosfato.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Linemeyer, David L.

\hskip3.9cm

Menke, John G.

\hskip3.9cm

Hess, John F.

\hskip3.9cm

Borkowski, Joseph A.

\hskip3.9cm

Bierillo, Kathleen K.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: ADN QUE CODIFICA EL RECEPTOR DE BRADIQUININA B1

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: John W. Wallen III

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(B)

CALLE: P.O. Box 2000

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(C)

CIUDAD: Rahway

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(D)

ESTADO: Nueva Jersey

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(E)

PAÍS: EEUU

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 07065

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(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: disco flexible

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(B)

ORDENADOR: compatible con PC IBM

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.25

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Wallen III, John W.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 35.403

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 19202

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELÉFONO: (908) 594-3905

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(B)

TELEFAX: (908) 594-4720

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 1

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1307 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 1

2

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(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 2

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 353 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 2

3

Claims (23)

1. Una molécula de ADN purificada que codifica una proteína del receptor de bradiquinina B_{1} humano en la que dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos como se presenta en la ID SEC Nº: 2.

2. Un vector de expresión para la expresión de un receptor de bradiquinina B_{1} humano en un huésped recombinante, en el que dicho vector contiene un gen recombinante que codifica una proteína del receptor de bradiquinina B_{1}, en el que dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos como se presenta en la ID SEC Nº: 2.

3. El vector de expresión de la reivindicación 2, conteniendo el vector de expresión una molécula de ADN recombinante que tiene una secuencia de nucleótidos que se presenta en la ID SEC Nº: 1.

4. Un procedimiento para la expresión de una proteína del receptor de bradiquinina B_{1} humano en una célula huésped recombinante, que comprende:

(a)

transferir el vector de expresión de la reivindicación 2 o de la reivindicación 3 a células huésped adecuadas; y

(b)

cultivar las células huésped de la etapa (a) en condiciones que permitan la expresión de la proteína del receptor de bradiquinina B_{1} humano a partir del vector de expresión.

5. Una célula huésped recombinante que contiene un gen clonado de manera recombinante que codifica una proteína del receptor de bradiquinina B_{1} humano, en la que dicha proteína comprende la secuencia de aminoácidos como se presenta en la ID SEC Nº: 2.

6. La célula huésped recombinante de la reivindicación 5, teniendo dicho gen que codifica la proteína del receptor de bradiquinina B_{1} humano la secuencia de nucleótidos que se presenta en la ID SEC Nº: 1.

7. Una molécula de ADN purificada que tiene una secuencia de nucleótidos como se presenta en la ID SEC Nº: 1.

8. Un procedimiento para identificar un compuesto que module la actividad del receptor de bradiquinina B_{1}, que comprende:

(a)

combinar el compuesto con un receptor de bradiquinina B_{1} humano que comprende la secuencia de aminoácidos como se presenta en la ID SEC Nº: 2; y

(b)

medir un efecto del compuesto sobre el receptor.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el efecto del compuesto sobre el receptor en la etapa (b) es inhibir o potenciar la unión de ligandos del receptor B_{1}.

10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el efecto del compuesto sobre el receptor es estimular o inhibir la transducción de señal mediada por receptores B_{1}.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que dicha transducción de señal se selecciona del grupo constituido por hidrólisis de fosfatidil inositol, liberación de las reservas de Ca^{2+} intracelular y liberación de ácido araquidónico.

12. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en el que el receptor de bradiquinina B_{1} de la etapa (a) está contenido en células que expresan un receptor de bradiquinina B_{1} recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos como se presenta en la ID SEC Nº: 2.

13. Una proteína del receptor de bradiquinina B_{1} humano sustancialmente libre de otras proteínas humanas, que comprende la secuencia de aminoácidos como se presenta en la ID SEC Nº: 2.

14. La proteína del receptor de bradiquinina B_{1} humano de la reivindicación 13 que está constituida por la secuencia de aminoácidos como se presenta en la ID SEC Nº: 2.

15. Un anticuerpo monoespecífico inmunológicamente reactivo con un receptor de bradiquinina B_{1}, comprendiendo el receptor de bradiquinina B_{1} la secuencia de aminoácidos como se presenta en la ID SEC Nº: 2, o una porción de la misma.

16. El anticuerpo de la reivindicación 15, en el que el anticuerpo bloquea la actividad del receptor de bradiquinina B_{1}.

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17. Un anticuerpo monoespecífico inmunológicamente reactivo con un receptor de bradiquinina B_{1}, estando constituido el receptor de bradiquinina B_{1} por la secuencia de aminoácidos como se presenta en la ID SEC Nº: 2, o por una porción de la misma.

18. El anticuerpo de la reivindicación 17, bloqueando el anticuerpo la actividad del receptor de bradiquinina B_{1}.

19. Una preparación de anticuerpos policlonales que es inmunológicamente reactiva con un receptor de bradiquinina B_{1}, comprendiendo el receptor de bradiquinina B_{1} la secuencia de aminoácidos como se presenta en la ID SEC Nº: 2, o una porción de la misma.

20. La preparación de anticuerpos policlonales de la reivindicación 19, bloqueando la preparación de anticuerpos la actividad del receptor de bradiquinina B_{1}.

21. Una preparación de anticuerpos policlonales que es inmunológicamente reactiva con un receptor de bradiquinina B_{1}, estando constituido el receptor de bradiquinina B_{1} por la secuencia de aminoácidos como se presenta en la ID SEC Nº: 2, o por una porción de la misma.

22. La preparación de anticuerpos policlonales de la reivindicación 21, bloqueando la preparación de anticuerpos la actividad del receptor de bradiquinina B_{1}.

23. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4 que comprende adicionalmente la etapa de proporcionar un lisado celular a partir de dichas células huésped recombinantes.