ES2290326T3 - Procedimiento para determinar la posicion en el ciclo celular. - Google Patents
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Abstract
Una construcción informadora de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula informadora de célula viva detectable unida de manera operativa a y bajo el control de: i) al menos un elemento de control de expresión específico de fase del ciclo celular, ii) un elemento de control de destrucción, y iii) un elemento de control de localización espacial específico de fase del ciclo celular.
Description
Procedimiento para determinar la posición en el
ciclo celular.
La presente invención se refiere a un
procedimiento nuevo, no destructivo y dinámico para determinar la
posición en el ciclo celular de células vivas.
La división de células eucariotas tiene lugar a
través de un ciclo celular altamente regulado que comprende fases
consecutivas denominadas G1, S, G2 y M. La interrupción del ciclo
celular o del control del ciclo celular puede dar como resultado
anormalidades celulares o estados de enfermedad tales como cáncer
que surgen de múltiples cambios genéticos que transforman células
con crecimiento limitado en células muy invasivas que no responden
al control normal del crecimiento. La transición de células normales
a células cancerosas puede surgir por la pérdida de la función
correcta en la replicación del ADN y los mecanismos de reparación de
ADN. Todas las células que se dividen están sometidas a un número
de mecanismos de control, conocidos como puntos de control del
ciclo celular, que mantienen la integridad genómica deteniendo o
induciendo la destrucción de células aberrantes. La investigación
de la progresión y control del ciclo celular es por consiguiente de
gran interés en el diseño de fármacos anticáncer. (Flatt, P. M. y
Pietenpol, J. A. Drug Metab. Rev. (2000),
32(3-4), 283-305;
Buolamwini, J. K. Current Pharmaceutical Design, (2000), 6,
379-392).
La determinación precisa del estado del ciclo
celular es un requerimiento clave para investigar procesos celulares
que afectan al ciclo celular o que dependen de la posición en el
ciclo celular. Tales medidas son particularmente vitales en las
aplicaciones de selección de fármacos en las que:
- i)
- se desean sustancias que modifican la progresión del ciclo celular directa o indirectamente; por ejemplo, para investigación como potenciales tratamientos anticáncer;
- ii)
- deben comprobarse los efectos no deseados en el ciclo celular de los candidatos a fármacos; y/o
- iii)
- se sospecha que un agente es activo o inactivo hacia células en una fase particular del ciclo celular.
Tradicionalmente, se ha determinado el estado
del ciclo celular para poblaciones celulares por medio de citometría
de flujo usando tinciones fluorescentes que tiñen el contenido de
ADN del núcleo celular (Barlogie, B. y col., Cancer Res., (1983),
43(9), 3982-3997). La citometría de flujo da
una información cuantitativa del contenido de ADN de las células y
por consiguiente permite la determinación del números relativos de
células en las fases G1, S y G2 + M del ciclo celular. Sin embargo,
este análisis es un procedimiento destructivo, no dinámico y
requiere la toma de muestra en serie de una población para
determinar el estado del ciclo celular con el tiempo. Además, las
técnicas convencionales de citometría de flujo examinan el total de
la población celular en una muestra y dan datos limitados en
células individuales, lo que excluye el estudio del estado del ciclo
celular de diferentes tipos celulares que pueden estar presentes
dentro de la muestra bajo análisis.
El documento EP 798386 describe un procedimiento
para el análisis del ciclo celular en subpoblaciones celulares
presentes en muestras celulares heterogéneas. Este procedimiento usa
la incubación secuencial de la muestra con anticuerpos monoclonales
marcados fluorescentemente para identificar tipos celulares
específicos y un fluorocromo que se une específicamente a los
ácidos nucleicos. Esto permite la determinación de la distribución
en el ciclo celular de subpoblaciones de células presentes en la
muestra. Sin embargo, como este procedimiento usa citometría de
flujo, continúa dando sólo datos no dinámicos y requiere la
realización de medidas en serie en muestras separadas de células
para determinar variaciones en el estado del ciclo celular de una
población celular con el tiempo tras la exposición a un agente bajo
investigación para los efectos en la progresión del ciclo
celular.
Otra desventaja de las técnicas de citometría de
flujo se refiere a la asignación indirecta, e inferida de la
posición en el ciclo celular de las células en base al contenido de
ADN. Dado que el contenido de ADN de los núcleos celulares varía a
través del ciclo celular en una manera razonablemente predecible,
por ejemplo las células en G2 o M tienen el doble de contenido de
ADN que las células en G1, y las células que están realizando
síntesis de ADN en fase S tienen una cantidad intermedia de ADN, es
posible controlar la distribución relativa de células entre
diferentes fases del ciclo celular. Sin embargo, la técnica no
permite precisión en la determinación de la posición en el ciclo
celular de cualquier célula individual debido a la ambigüedad en la
asignación de células a las fases G2 o M y a más imprecisión que
surge de la variación inherente en el contenido de ADN entre célula
y célula dentro de una población que puede excluir la discriminación
precisa entre células que están cerca de los límites entre fases
adyacentes del ciclo celular. Además, las variaciones en el
contenido de ADN y la tinción del ADN entre diferentes tipos
celulares de diferentes tejidos u organismos requieren que la
técnica esté optimizada para cada tipo celular, y puede complicar
las comparaciones directas de datos entre tipos de células o entre
experimentos (Herman, Cancer (1992), 68(6),
1553-1556). Por consiguiente, la citometría de
flujo es adecuada para examinar la distribución total del ciclo
celular de células dentro de una población, pero no puede usarse
para controlar el estado preciso del ciclo celular de una célula
individual con el tiempo.
La progresión del ciclo celular está
ajustadamente controlada por la expresión temporal y espacial
definida, localización y destrucción de un número de reguladores
del ciclo celular que exhiben un comportamiento altamente dinámico
durante el ciclo celular (Pines, J., Nature Cell Biology, (1999), 1,
E73-E79). Por ejemplo, en etapas específicas del
ciclo celular algunas proteínas traslocan desde el núcleo hacia el
citoplasma, o viceversa, y algunas se degradan rápidamente. Para
detalles de componentes de control e interacciones del ciclo celular
conocidos, véase Kohn, Molecular Biology of the Cell (1999), 10,
2703-2734.
Uno de los reguladores del ciclo celular más
ampliamente caracterizados en células humanas es la ciclina B1,
cuya expresión y destrucción temporal y espacial controla la
transición de la célula de G2 a M y su salida de M. La expresión de
ciclina B1 está dirigida por un promotor específico de fase del
ciclo celular que inicia la expresión al final de la fase S y llega
a un pico durante G2. Una vez expresada, esta proteína se traslada
constantemente entre el núcleo y el citoplasma durante la fase G2,
pero es principalmente citoplasmática porque su tasa de exportación
es mucho mayor que la de importación. Al comienzo de la mitosis, la
ciclina B1 transloca rápidamente dentro del núcleo, cuando su tasa
de importación aumenta sustancialmente, y disminuye su exportación,
de una manera dependiente de fosforilación (Figura 1). Por
consiguiente, la localización de la ciclina B1 en la célula puede
usarse para marcar la transición de la fase G2 a mitosis. Una vez
que la célula alcanza la metafase, o, más precisamente, cuando se
satisface el punto de control de montado de husos, la ciclina B1 se
degrada rápidamente. La destrucción de ciclina B1 continúa durante
la siguiente fase G1 pero se detiene una vez que la célula comienza
la replicación de ADN. Estos acontecimientos se han visualizado en
tiempo real por microinyección de ciclina B1 marcada
fluorescentemente en células vivas (Clute y Pines, Nature Cell
Biology, (1999), 1, 82-87).
Los elementos que controlan la expresión y la
destrucción temporales han sido dilucidados en una serie de
estudios. Se ha mostrado que la biosíntesis de ciclina B1 es
controlada a nivel de la transcripción por una secuencia promotora
que confina la expresión hacia las fases S tardía y G2 del ciclo
celular (Piaggio y col., Exp. Cell Research, (1995), 216,
396-402; Cogswell y col., Mol. Cell. Biology,
(1995), 15, 2782-2790). Se ha mostrado que la
destrucción de ciclina B1 en el momento adecuado en fase M está
controlada por una secuencia de 9 aminoácidos, denominada caja de
la destrucción (caja D) qué apunta a la proteína para proteolisis
vía ubiquitinilación. La expresión de una proteína ciclina de
fusión B-GFP de Drosophila dirigida por un
promotor constitutivo de poliubiquitina (Huang y Raff, EMBO
Journal, (1999), 18 (8), 2184-2195) ha mostrado que
la ciclina B marcada fluorescentemente imita el comportamiento de
la ciclina B endógena en ser degradada en el final de la metafase.
Estudios (Hagting y col., Current Biology, (1999), 9,
680-689) que usan ciclina B1-GFP
humana han mostrado que los cambios temporales en la localización
citoplasmática y nuclear de la ciclina B1 con la progresión del
ciclo celular es dependiente de una señal nuclear de exportación
(NES), cuya fosforilación conduce a la importación nuclear.
Otros puntos de control del ciclo celular se
regulan de manera similar por mecanismos de control temporal y
espacial y muchos de los componentes e interrelaciones han sido
dilucidadas (Pines, J., Nature Cell Biology (1999), 1,
E73-E79).
Se han descrito una serie de procedimientos que
hacen uso de ciertos componentes de los mecanismos de control del
ciclo celular para proporcionar procedimientos que analizan o
explotan el estado de proliferación celular.
Mateus, C. y Avery, S. (Yeast (2000), 16,
1313-1323) describen la expresión de una proteína
GFP desestabilizada en levadura como gen informador para estudiar
la expresión genética mediada por el ciclo celular. La construcción
está constituida por una GFP fusionada al dominio PEST del extremo C
terminal de la ciclina CLn2 G1 de levadura y expresada bajo el
control del promotor de CLn2. Cuando se expresa en cultivos
síncronos de células de levadura se observó que esta construcción
da una cinética de expresión coherente con aquella informada
previamente para CLn2; la aparición de GFP vía activación del
promotor de CLn2 y degradación de la GFP desestabilizada vía
degradación dependiente de ubiquitina.
El documento WO 00/29602 describe el uso de un
promotor de ciclina A para dirigir la expresión de GFP como un
marcador seleccionable para la división de células madre
transgénicas para permitir que las células en división sean
aisladas de un fondo de células que no se dividen por clasificación
de células activadas por fluorescencia. Mientras que este
procedimiento permite la identificación y la selección de células
que han progresado más allá de cierta etapa en el ciclo celular, no
da información sobre el estado del ciclo celular de ninguna célula
dada, con excepción de la información histórica de que la célula ha
pasado o no ha pasado por la fase G2 del ciclo celular en un cierto
tiempo en el pasado.
El documento US 6048693 describe un
procedimiento para seleccionar compuestos que afectan las proteínas
reguladoras del ciclo celular, en el que la expresión de un gen
informador está unida a los elementos de control que actúan por
acción de ciclinas u otras proteínas de control del celular. En este
procedimiento, la expresión temporal de un producto de un gen
informador se dirige de una manera específica del ciclo celular y
los compuestos que actúan sobre uno o más componentes de control
del celular pueden aumentar o disminuir los niveles de expresión.
Puesto que el sistema del ensayo no contiene ningún elemento para la
destrucción del producto de gen informador ni para la destrucción
de cualquier señal que se surja del gene informador, el
procedimiento no puede dar información sobre el posición dentro del
ciclo celular de cualquier célula en el ensayo e informa solamente
sobre perturbaciones generales de los mecanismos de control del
ciclo celular.
\newpage
Los documentos US 5849508 y US 6103887 describen
procedimientos para determinar el estado proliferativo de células
por medio de anticuerpos que se unen a ciclina A. Estos
procedimientos proporcionan los medios para determinar el
porcentaje de células en proliferación en una población de prueba
con relación a una población del control.
El documento US 6159691 se refiere a un
procedimiento para ensayar reguladores supuestos de la progresión
del ciclo celular. En este procedimiento, se usan señales de
localización nuclear (NLS) derivadas de los factores de
transcripción específicos de las fases del ciclo celular
DP-3 y E2F- 1 para ensayar la actividad de los
compuestos que actúan como agonistas o antagonistas para aumentar o
para disminuir la localización nuclear de una NLS fusionada a un
marcador detectable.
Una serie de investigadores han estudiado el
ciclo celular usando las moléculas informadoras tradicionales que
requieren que las células sean fijadas o lisadas. Por ejemplo Hauser
y Bauer (Plant and Soil, 2000, 226, pág.1-10)
usaron \beta-glucuronidasa (GUS) para estudiar la
división celular en un meristema de planta y Brandeis y Hunt (EMBO
J., 1996, vol. 15, pág. 5280-5289) usaron proteínas
de fusión de cloramfenicol acetiltransferasa (CAT) para estudiar
variaciones en los niveles de ciclina. Aunque estos procedimientos
proporcionan medios para estudiar la posición dentro del ciclo
celular de una célula particular (usando GUS) o el estado medio del
ciclo celular de una población de las células (usando CAT) ambos
procedimientos son destructivos. Ninguno de los dos procedimientos
permite el análisis repetido de una célula específica en el tiempo y
por consiguiente no son convenientes para seguir la progresión de
una célula a través del ciclo celular.
Ninguno de los procedimientos precedentes, que
usan componentes del mecanismo de control del ciclo celular,
proporcionan los medios para determinar el estado del ciclo celular
de una célula individual o de una población de células. Por
consiguiente, se necesitan procedimientos que permitan la
determinación de la posición dentro del ciclo celular de una única
célula viva de manera no destructiva, que permita investigar la
misma célula en repetidas ocasiones en el tiempo, y que permitan el
estudio de los efectos de agentes con efectos potencialmente
deseados o indeseados sobre el ciclo celular. Además, resulta
deseable determinar la posición dentro del ciclo celular a partir
de una sonda controlada directamente por los componentes de control
del ciclo celular, más que indirectamente a través de contenido de
ADN o de otros marcadores indirectos posición en el ciclo celular
como se describió anteriormente. La presente invención describe un
procedimiento que usa componentes clave de la maquinaria reguladora
del ciclo celular en combinaciones definidas para proporcionar
medios para determinar el estado del ciclo celular para células
vivas individuales de mamífero en un procedimiento no destructivo
que proporciona lecturas dinámicas de resultados.
La presente invención proporciona construcciones
de ADN, y líneas celulares que contienen tales construcciones, que
exhiben activación y destrucción de una molécula informadora
detectable de una manera específica de las fases del ciclo celular,
por unión directa de la señal informadora que cambia a expresión y
destrucción temporal y espacial de los componentes del ciclo
celular. Esto mejora notablemente la precisión de la determinación
del estado de la fase del ciclo celular y permite el control
continuo de la progresión del ciclo celular en células
individuales. Además, se ha encontrado que pueden aislarse los
elementos de control claves y abstraerse de los elementos
funcionales del mecanismo de control del ciclo celular para permitir
el diseño de informadores de las fases del ciclo celular que están
regulados dinámicamente y funcionan conjuntamente con los
componentes endógenos del control del ciclo celular, pero
independientemente de ellos, y proporcionan por lo tanto los medios
para controlar la posición dentro del ciclo celular sin influenciar
o interferir con la progresión natural del ciclo celular.
Por consiguiente, en un primer aspecto de la
invención, se proporciona una construcción de informador de ácido
nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica
una molécula informadora detectable de célula viva unida
operativamente a y bajo el control de:
- i)
- al menos un elemento de control de expresión específico de fase del ciclo celular,
- ii)
- un elemento de control de destrucción, y
- iii)
- un elemento de control de localización espacial específico de fase del ciclo celular,
definiendo expresión como todos los
procedimientos involucrados en la biosíntesis de una proteína a
partir de un gen. Se entenderá además que el término "célula
viva", en relación con moléculas informadoras, define a una
molécula informadora que produce una señal detectable en células
vivas y por consiguiente es adecuada para uso en sistemas de
detección por imágenes de células vivas.
En un segundo aspecto de la invención, se
proporciona un procedimiento in vitro para determinar la
posición dentro del ciclo celular de una célula de mamífero que
comprende:
a) expresar una construcción informadora de
ácido nucleico en una célula que comprende una secuencia de ácido
nucleico que codifica una molécula informadora de célula viva
detectable unida operativamente a y bajo el control de:
- i)
- al menos un elemento de control de la expresión específico de fase del ciclo celular,
- ii)
- un elemento de control de destrucción,
- iii)
- un elemento de control de localización espacial específico de fase del ciclo celular;
en el que dicha construcción informadora se
expresa en una célula en un punto predeterminado en el ciclo
celular; y
b) determinar la posición dentro del ciclo
celular controlando las señales emitidas por la molécula
informadora.
\vskip1.000000\baselineskip
De manera adecuada, la construcción informadora
de ácido nucleico es una construcción de ADN.
El elemento de control de expresión específico
de fase del ciclo celular es típicamente una secuencia de ADN que
controla la transcripción y/o traducción de una o más secuencias de
ácidos nucleicos y permite el control de expresión específico del
ciclo celular. Puede usarse adecuadamente cualquier elemento de
control de expresión específicamente activo en una o más fases del
ciclo celular para crear la construcción informadora de la posición
en el ciclo.
De manera adecuada, el elemento de control de
expresión específico de fase del ciclo celular puede seleccionarse
de promotores específicos del ciclo celular y de otros elementos que
influyen en el control de la transcripción o traducción de una
manera específica del ciclo celular. Donde el elemento de control de
expresión es un promotor, la elección del promotor dependerá de la
fase del ciclo celular seleccionada para el estudio.
Los promotores adecuados incluyen: promotor de
ciclina B1 (Cogswell y col., Mol. Cell Biol., (1995), 15(5),
2782-2790, Hwang y col., J. Biol. Chem., (1995), 270
(47), 28419-28424, Piaggio y col., Exp. Cell Res.,
(1995), 216 (2), 396-402); Promotor de Cdc25B
(Korner y col., J. Biol. Chem., (2001), 276 (13),
9662-9669); promotor de ciclina A2 (Henglein y col.,
Proc. Nat. Acad. Sci. EEUU, (1994), 91 (12),
5490-5494, Zwicker y col., Embo J., (1995),
14(18), 4514-4522); promotor de Cdc2 (Tommasi
y Pfeifer, Mol. Cell Biol., (1995), 15(12),
6901-6913, Zwicker y col., Embo J. (1995),
14(18), 4514-4522), promotor de Cdc25C
(Korner y Muller, J. Biol. Chem., (2000), 275(25),
18676-18681, Korner y col., Nucl. Acids Res.,
(1997), 25(24), 4933-4939); promotor de
ciclina E (Botz y col., Cell Biol. (1996), 16(7),
3401-3409, Korner y Muller, J. Biol. Chem., (2000),
275(25), 18676-18681); promotor de Cdc6
(Hateboer y col., Mol. Cell Biol., (1998), 18(11),
6679-6697, Yan y col., Proc. Nat. Acad. Sci. EEUU,
(1998), 95(7), 3603-3608); promotor de DHFR
(Shimada y col., J. Biol. Chem., (1986), 261(3),
1445-1452, Shimada y Nienhuis, J. Biol. Chem.,
(1985), 260(4), 2468-2474) y promotores de
histonas (van Wijnen y col., Proc. Nat. Acad. Sci. EEUU, (1994), 91,
12882-12886).
De manera adecuada, el elemento de control de
expresión específico de fase del ciclo celular puede seleccionarse
de elementos IRES específicos del ciclo celular y de otros elementos
que influyen en el control de la traducción de una manera del
específica del ciclo celular. Un elemento IRES es un sitio interno
de entrada ribosomal que permite la unión de un ribosoma y que
tenga lugar el inicio de la traducción en una región del ARNm que
no es una región rematada en 5'. Un elemento IRES específico de
ciclo celular restringe el inicio de la traducción independiente
del remate a una etapa específica del ciclo celular (Sachs, A. B.,
Cell, (2000), 101, 243-245). Donde el elemento de
control de expresión se selecciona para ser un IRES, su selección
dependerá adecuadamente de la fase del ciclo celular bajo estudio.
En este caso, puede usarse un promotor expresado de manera
constitutiva (por ejemplo, CMV o SV40) o inducible (por ejemplo.
sistema pTet-on pTet-off, Clontech)
para controlar la transcripción del ARNm bicistrónico (Sachs, A.
B., Cell, (2000), 101, 243-245). Como alternativa,
puede usarse un elemento IRES no dependiente de las fases del ciclo
celular (por ejemplo, los IRES de EMCV hallados en vectores pIRES,
BD Clontech) conjuntamente con un elemento promotor específico del
ciclo celular. Como alternativa, puede obtenerse control más exacto
de la expresión del informador usando un promotor específico de fase
del ciclo celular conjuntamente con un elemento IRES específico de
fase del ciclo celular.
Los elementos IRES adecuados para uso en la
invención incluyen: G2-IRES (Cornelis y col., Mol.
Cell, (2000), 5(4), 597-605); IRES de HCV
(Honda y col., Gastroenterology, (2000), 118,
152-162); IRES de ODC (Pyronet y col., Mol. Cell,
(2000), 5, 607-616); IRES de c-myc
(Pyronnet y col., Mol. Cell, (2000), 5(4),
607-616) e IRES de p58 PITSLRE (Cornelis y col.,
Mol. Cell, (2000), 5(4), 597-605).
La Tabla 1 enumera algunos elementos de control
de expresión de preferencia que pueden usarse de acuerdo con la
invención, e indica la fase del ciclo celular en la que se activa
cada elemento.
El elemento de control de destrucción es una
secuencia de ADN que codifica un motivo de proteína que controla la
destrucción de proteínas que contienen esa secuencia. De manera
adecuada, el elemento de control de destrucción puede estar mediado
por el ciclo celular: caja D de ciclina B1 (Glotzer y col., Nature,
(1999), 349, 132-138, Yamano y col, EMBO J.,
(1998), 17(19), 5670-5678, Clute y Pines,
Nature Cell Biology, (1999), 1, 82-87); extremo
N-terminal de ciclina A (den Elzen y Pines, J. Cell
Biol., (2001), 153(1), 121-136, Geley y col.,
J. Cell Biol., (2001), 153, 137-148); caja KEN
(Pfleger y Kirschner, Genes Dev, (2000), 14(6),
655-665), Ciclina E (Yeh y col., Biochem Biophys
Res Commun., (2001) 281, 884-890), ciclina de Cln2
de S. cerevisiae (Berset y col., Mol. Cell Biol., (2002),
pág. 4463-4476) y p27Kip (Montagnili y col., Genes
Dev. (1999), 13(9), 1181-1189, Nakayama y
col., EMBO J., (2000), 19(9), 2069-2081,
Tomoda y col., Nature, (1999), 398(6723),
160-165).
La Tabla 2 enumera elementos de control de
destrucción que pueden usarse según la invención e indica la fase
del ciclo celular en la que se activa cada elemento.
Como alternativa, el elemento de control de
destrucción puede no estar mediado por el ciclo celular, tales como
secuencias PEST como describieron Rogers y col., Science, (1986),
234, 364-368. Los ejemplos de elementos de control
de destrucción no mediados por el ciclo celular incluyen secuencias
derivadas de caseína, ornitina descarboxilasa y proteínas que
reducen la semivida de las proteínas. El uso de tales secuencias de
control de destrucción no mediadas por el ciclo celular en el
procedimiento de la invención proporciona los medios para
determinar el tiempo de persistencia del informador del ciclo
celular tras la inducción de expresión por un promotor específico
del ciclo celular.
De manera adecuada, la molécula informadora de
célula viva codificada por la secuencia de ácido nucleico puede
seleccionarse del grupo constituido por proteínas fluorescentes y
enzimas. Las proteínas fluorescentes adecuadas incluyen la Proteína
Fluorescente Verde (GFP) de Aequorea victoria y derivados de
GFP tales como análogos de GFP funcionales en los que la secuencia
de aminoácidos de GFP natural ha sido alterada por deleción, adición
o sustitución de aminoácidos. Los análogos de GFP adecuados para
uso en la presente invención incluyen EGFP (Cormack, B. P. y col,
Gene, (1996), 173, 33-38); EYFP y ECFP (documento US
6066476, Tsien, R. y col.); F64L-GFP (documento US
6172188, Thastrup, O. y col.); BFP, (documento US 6077707, Tsien, R.
y col.). Otras proteínas fluorescentes incluyen DsRed, HcRed y
otras proteínas fluorescentes nuevas (BD Clontech y Labas, Y.A. y
col., Proc. Natl. Acad. Sci EEUU (2002), 99,
4256-4261) y Renilla GFP (Stratagene). Las enzimas
informadoras adecuadas son aquellas que son capaces de generar una
señal detectable (por ejemplo fluorescente o luminiscente) en un
sustrato para esa enzima. Las enzimas/sustratos particularmente
adecuados incluyen: nitrorreductasa/Cy-Q (como está
descrita en el documento WO 01/57237) y
\beta-lactamasa/CCF4.
La construcción informadora de ácido nucleico
incluye un elemento de control de localización espacial específico
de fase del ciclo celular que comprende una secuencia de ADN que
codifica un motivo de proteína que es capaz de controlar la
localización subcelular de la proteína de una manera específica del
ciclo celular. Tal elemento de control de localización es necesario
para determinar la localización subcelular del informador para
asegurar su funcionamiento y/o destrucción eficaz. Es posible una
determinación más exacta de la posición en el ciclo celular usando
un elemento de control de localización ya que éste permitirá medir
tanto la intensidad como la localización de la señal
informadora.
Los elementos de control de localización
espacial adecuados incluyen aquellos que regulan la localización de
una proteína de control del ciclo celular, por ejemplo la ciclina B1
CRS.
El término, unido operativamente indica que los
elementos están organizados para funcionar conjuntamente para el
objetivo previsto, por ejemplo la transcripción inicia en un
promotor y progresa a través de la secuencia de ADN que codifica la
proteína fluorescente de la invención. La Figura 2 (2A/2B/2C)
ilustra la construcción general de una construcción de ADN según la
invención.
En un aspecto de preferencia de la invención, la
construcción comprende un promotor de ciclina B1, una caja (caja D)
de destrucción de ciclina B1, una secuencia de retención
citoplasmática (CRS) de ciclina B1 y una proteína fluorescente verde
(GFP).
En un ejemplo particular según la presente
invención, la construcción informadora de ácido nucleico comprende
un vector de expresión que comprende los siguientes elementos:
a) un esqueleto de vector que comprende:
- i)
- un origen de replicación bacteriano; y
- ii)
- un gen de resistencia a fármacos bacteriano;
b) un elemento de control de expresión
específico de fase del ciclo celular;
c) un elemento de control de destrucción;
d) un elemento de control de localización
espacial específico de fase del ciclo celular; y
e) una secuencia de ácido nucleico que codifica
una molécula informadora.
\vskip1.000000\baselineskip
Opcionalmente, la construcción informadora de
ácido nucleico contiene además un gen eucariota de resistencia a
fármacos, de preferencia un gen de resistencia a fármacos de
mamífero.
Los vectores de expresión pueden también
contener otras secuencias de ácido nucleico, tales como señales de
poliadenilación, señales de empalme de donador/empalme de aceptor,
secuencias intervinientes, secuencias potenciadoras de
transcripción, secuencias potenciadoras de traducción y similares.
Opcionalmente, el gen de resistencia a fármacos y el gen informador
pueden estar unidos operativamente por un sitio interno de entrada
de ribosomas (IRES), que es específico de ciclo celular (Sachs, y
col., Cell, (2000), 101, 243-245) o independiente
del ciclo celular (Jang y col., J. Virology, (1988), 62,
2636-2643 y Pelletier y Sonenberg, Nature, (1988),
334, 320-325), más que los dos genes siendo
conducidos por promotores separados. Cuando se usa un elemento IRES
no específico del ciclo celular pueden usarse los vector
pIRES-neo y pIRES-puro, disponibles
comercialmente en Clontech.
En una forma de realización particular del
primer aspecto, la construcción informadora de ácido nucleico está
montada de una secuencia de ADN que codifica el promotor de ciclina
B1 unido operativamente a las secuencias de ADN que codifican 171
aminoácidos del extremo amino terminal de ciclina B1 y de una
secuencia de ADN que codifica una proteína fluorescente verde (GFP)
(Figura 3). Los motivos que controlan la localización y la
destrucción de ciclina B1 han sido todos mapeados hasta
aproximadamente 150 aminoácidos en el extremo amino terminal de la
molécula. Por consiguiente, puede construirse un marcador artificial
del ciclo celular usando solamente secuencias del extremo amino
terminal de ciclina B1, el que no interferirá con la progresión del
ciclo celular puesto que carece de una secuencia específica,
denominada caja de ciclina, (Nugent y col., J. Cell Sci. , (1991),
99, 669-674) que es necesaria para unir y activar
una quinasa acompañante. Los motivos reguladores clave necesarios
de la secuencia del extremo amino terminal de ciclina B1 son: i) un
motivo de nueve aminoácidos denominado caja de destrucción (caja
D). Este es necesario para apuntar la ciclina B1 a la maquinaria de
ubiquitinación y, conjuntamente con al menos un resto lisina
C-terminal, es también necesario para la
degradación específica de ciclo celular; ii) una señal de
exportación nuclear de aproximadamente diez aminoácidos (NES). Este
motivo es reconocido, directa o indirectamente, por exportina 1 y es
suficiente para mantener la carga de ciclina B1 en el citoplasma
durante la interfase; iii) aproximadamente cuatro sitios de
fosforilación específicos de mitosis que están localizados
adyacentes al NES y confieren rápida importación y una exportación
nuclear reducida en la mitosis. Cuando está expresada en una célula
eucariota, la construcción exhibirá expresión y destrucción
específicas de ciclo celular del informador de GFP paralela a la
expresión y degradación endógena de la ciclina B1. Por lo tanto, la
medida de la intensidad de fluorescencia de GFP permite la
identificación de células en la fase G2/M del ciclo celular (Figura
4). Además, puesto que el producto fluorescente de la construcción
imitará la localización espacial de la ciclina B1 endógena, el
análisis de la distribución subcelular de fluorescencia permite
asignar con más precisión la posición dentro del ciclo celular. En
la profase, la ciclina B1 rápidamente transloca dentro del núcleo,
por consiguiente puede usarse la localización exacta de la
fluorescencia de GFP en la célula para discriminar las células en
transición desde interfase hacia mitosis. Una vez que una célula
alcanza la metafase, y se satisface el punto de control de montaje
del huso, la ciclina B1 se degrada muy rápidamente, y por
consiguiente puede usarse la desaparición de la fluorescencia de
GFP para identificar las células en fase
M-media.
La expresión de la construcción en una población
de células no sincronizadas dará lugar a que cada célula exhiba
expresión y destrucción cíclicas del producto fluorescente de la
construcción, dando como resultado un patrón continuo de centelleo
de fluorescencia desde todas las células en la población. El
análisis de la intensidad de fluorescencia de cada célula con el
tiempo da por consiguiente información dinámica sobre el estado del
ciclo celular de cada célula como se ilustra en la Figura 4.
Otras formas de realización de la construcción
informadora de ácido nucleico según el primer aspecto pueden
construirse seleccionando elementos de control alternativos
adecuados del ciclo celular, por ejemplo de aquellos mostrados en
las Tablas 1 y 2, para diseñar informadores de fases del ciclo
celular que informen una sección deseada del ciclo celular.
La construcción y el uso de vectores de
expresión y plásmidos son bien conocidos por aquellos expertos en
la técnica. Virtualmente puede usarse cualquier vector de expresión
de célula de mamíferos asociado a los marcadores del ciclo celular
descritos en este documento. Los ejemplos de esqueletos de vectores
adecuados que incluyen genes bacterianos y de mamíferos de
resistencia a fármacos y un origen de replicación bacteriano
incluyen, pero no se limitan a: pCI-neo (Promega),
pcDNA (Invitrogen) y pTriEx1 (Novagen). Los genes bacterianos de
resistencia a fármacos adecuados incluyen los genes que codifican
las proteínas que confieren resistencia a antibióticos que
incluyen, pero no se limitan a: ampicilina, kanamicina, tetraciclina
y cloranfenicol. Los marcadores eucariotas de selección de fármacos
incluyen agentes tales como neomicina, higromicina, purimicina,
zeocina, ácido micofenólico, histidinol, gentamicina y
metotrexato.
La construcción de ADN puede prepararse por
técnicas convencionales de biología molecular recombinante de
restricción, digestión, unión, transformación y purificación de
plásmidos por procedimientos familiares para aquellos expertos en
la técnica y están descritos en Sambrook, J. y col., (1989),
Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory Press. Como alternativa, puede prepararse la construcción
de manera sintética por medio de procedimientos establecidos, por
ejemplo el procedimiento de fosforamidita descrito por Beaucage y
Caruthers, (Tetrahedron Letters, (1981), 22,
1859-1869) o el procedimiento descrito por Matthes
y col. (EMBO J., (1984), 3, 801-805). Según el
procedimiento de fosforamidita, se sintetizan oligonucleótidos, por
ejemplo en un sintetizador automático de ADN, se purifica, hibrida,
une y clona en vectores adecuados. La construcción de ADN puede
prepararse también por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
usando cebadores específicos, por ejemplo, como está descrito en el
documento US4683202 o como describieron Saiki y col., (Science,
(1988), 239, 487-491). Puede encontrarse una
revisión de procedimientos de PCR en PCR Protocols, (1990), Academic
Press, San Diego, California, EEUU.
Durante la preparación de la construcción de
ADN, debe unirse la secuencia del gen que codifica el informador en
el marco con el elemento de control de destrucción específico de
fase del ciclo celular y el elemento de control de localización
espacial. La construcción de ADN resultante puede a continuación
colocarse bajo el control de uno o más elementos de control de
expresión específicos de fases del ciclo celular.
En un tercer aspecto, se proporciona una célula
huésped, que no es una célula embrionaria humana, transfectada con
una construcción informadora de ácido nucleico según la presente
invención. La célula huésped a la que se le introduce la
construcción o el vector de expresión que contiene tal construcción,
puede ser cualquier célula de mamífero capaz de expresar la
construcción.
La construcción informadora de ADN preparada
puede transfectarse dentro de una célula huésped usando técnicas
bien conocidas por los expertos. Un enfoque es permeabilizar
temporalmente las células usando procedimientos químicos o físicos.
Estas técnicas pueden incluir: electroporación
(Tur-Kaspa y col., Mol. Cell Biol. (1986), 6,
716-718; Potter y col., Proc. Nac. Acad. Sci. EEUU,
(1984), 81, 7161-7165), un procedimiento basado en
fosfato de calcio (por ejemplo Graham y Var der Eb, Virology,
(1973), 52, 456-467 y Rippe y col., Mol. Cell Biol.,
(1990), 10, 689-695) o microinyección directa.
Como alternativa, pueden usarse procedimientos
basados en lípidos catiónicos (por ejemplo el uso de Superfect
(Qiagen) o Fugene6 (Roche)) para introducir ADN dentro de las
células (Stewart y col., Human Gene Therapy, (1992), 3, 267;
Torchilin y col., FASEB J., (1992), 6, 2716; Zhu y col., Science,
(1993), 261, 209-211; Ledley y col., J. Pediatrics,
(1987), 110, 1; Nicolau y col., Proc. Nat. Acad. Sci., EEUU, (1983),
80, 1068; Nicolau y Sene, Biochem. Biophys. Acta, (1982), 721,
185-190), Jiao y col., Biotechnology, (1993), 11,
497-502) describen el uso de protocolos de
transferencia de genes mediado por bombardeo para transferir y
expresar genes en tejidos cerebrales que pueden usarse también para
transferir ADN al interior de células huésped.
Otro procedimiento alternativo para transfectar
la construcción de ADN dentro de las células usa la capacidad
natural de los virus para entrar en las células. Tales
procedimientos incluyen vectores y protocolos de transfección
basados en, por ejemplo, virus Herpes simplex (Patente de EEUU
5288641), citomegalovirus (Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol.,
(1992), 158, 1), virus vaccinia (Baichwal y Sudgen, 1986, en Gene
Transfer, ed. R. Kucherlapati, Nueva York, Plenum Press, pág.
117-148), y adenovirus y virus adenoasociados
(Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol., (1992), 158,
97-129).
Los ejemplos de células huésped recombinantes
adecuadas incluyen células HeLa, células Vero, células de ovario de
Hámster Chino (CHO), U2OS, COS, BHK, HepG2, NIH 3T3 MDCK, RIN,
HEK293 y otras líneas celulares de mamíferos que se cultivan in
vitro. Tales líneas celulares están disponibles en la American
Tissue Culture Collection (ATCC), Bethesda, Maryland, EEUU. En la
presente invención también se pretende incluir células, diferentes
de células embrionarias humanas, de líneas celulares primarias que
se han establecido tras eliminar células de un mamífero seguido por
el cultivo de las células durante un período de tiempo limitado.
Pueden usarse también líneas celulares que
exhiben expresión estable de un informador de posición en el ciclo
celular para establecer xenoinjertos o células generadas por
ingeniería genética en animales huésped usando procedimientos
convencionales. (Krasagakis, K. J. y col., Cell Physiol., (2001),
187 (3), 386-391; Paris, S. y col., Clin. Exp.
Metastasis, (1999), 17(10), 817-822). Los
xenoinjertos de líneas celulares tumorales generadas para expresar
informadores de posición en el ciclo celular permitirán establecer
sistemas modelo para estudiar la división, estasis y metástasis de
células tumorales y seleccionar nuevos fármacos anticáncer.
El uso de líneas celulares generadas por
ingeniería genética o tejidos transgénicos que expresan un
informador de posición en el ciclo celular como aloinjertos en un
animal huésped permitirá estudiar los mecanismos que afectan la
tolerancia o el rechazo de transplantes de tejidos (Pye D. y Watt,
D. J., J. Anat., (2001), 198 (Pt2), 163-173; Brod,
S. A., y col., Transplantation (2000), 69(10),
2162-2166).
Para llevar a cabo el procedimiento para
determinar la posición en el ciclo celular de una célula según el
segundo aspecto, pueden cultivarse células transfectadas con la
construcción informadora de ADN bajo condiciones y durante un
período de tiempo suficiente para permitir la expresión de una
molécula informadora en una etapa específica del ciclo celular.
Típicamente, la expresión de la molécula informadora se producirá
entre 16 y 72 horas post transfección, pero puede variar
dependiendo de las condiciones de cultivo. Si la molécula
informadora está basada en una secuencia de proteína fluorescente
verde, el informador puede tomar un tiempo definido para plegarse
en una conformación que es fluorescente. Este tiempo depende de la
secuencia primaria del derivado de la proteína fluorescente verde
usado. La proteína informadora fluorescente puede también cambiar de
color con el tiempo (véase por ejemplo, Terskikh, Science, (2000),
290, 1585-1588) en cuyo caso es necesaria el
análisis de imágenes en intervalos de tiempo especificados tras la
transfección.
La posición en el ciclo celular de las células
puede determinarse controlando la expresión de la molécula
informadora y detectando señales emitidas por un informador usando
un dispositivo de detección adecuado. Si la molécula informadora
produce una señal fluorescente, puede usarse entonces un microscopio
de fluorescencia convencional, o un microscopio de fluorescencia
confocal. Si la molécula informadora produce luminiscencia, puede
usarse entonces un dispositivo adecuado tal como un luminómetro.
Usando estas técnicas, puede determinarse la proporción de células
que expresan la molécula informadora. Si la construcción de ADN
contiene elementos de control de translocación y las células se
examinan usando un microscopio, puede también determinarse la
localización del informador. En el procedimiento según la presente
invención, puede medirse adecuadamente la fluorescencia de células
transformadas o transfectadas con la construcción de ADN por medios
ópticos en por ejemplo; un espectrofotómetro, un fluorímetro, un
microscopio de fluorescencia, un dispositivo de imágenes de carga
acoplada enfriado (CCD) (tal como un escáner generador de imágenes o
un sensor de área de imágenes), un seleccionador de células
activadas por fluorescencia, un microscopio confocal o un
dispositivo de exploración confocal, en los que pueden determinarse
las propiedades de las células en cultivo como exploraciones de
excitación y emisión de luz.
En la forma de realización de la invención en la
que la construcción informadora de ácido nucleico comprende un gen
de resistencia a fármacos, tras la transfección y expresión del gen
de resistencia a fármacos (usualmente 1-2 días),
pueden seleccionarse las células que expresan el gen informador
modificado cultivando las células en presencia de un antibiótico
para el que las células transfectadas son resistentes debido a la
presencia de un gen marcador seleccionable. La finalidad de añadir
el antibiótico es seleccionar células que expresan el gen
informador y que tienen, en algunos casos, integrado el gen
informador, con su promotor asociado, elementos IRES, secuencias
potenciadoras y de terminación en el genoma de la línea celular.
Tras la selección, puede aislarse una línea celular clónica que
expresa la construcción usando técnicas convencionales.
Posteriormente puede cultivarse la línea celular clónica bajo
condiciones convencionales y expresará la molécula informadora y
producirá una señal detectable en un punto específico del ciclo
celular.
Las células transfectadas con la construcción
informadora de ácido nucleico según la presente invención pueden
crecer en ausencia y/o en presencia de un compuesto de prueba
constituido por un fármaco, ácido nucleico, hormona, proteína o
péptido a estudiar y cuyo efecto sobre el ciclo celular de una
célula quiere determinarse. Determinando la proporción de células
que expresan la molécula informadora y, opcionalmente, la
localización de la señal dentro de la célula, es posible determinar
el efecto del compuesto de prueba en el ciclo celular de las
células, por ejemplo, si el compuesto de prueba detiene a las
células en una etapa particular del ciclo celular, o si el efecto
es la aceleración o deceleración de la división celular.
Por consiguiente, en un cuarto aspecto, se
proporciona un procedimiento in vitro para determinar el
efecto de un compuesto de prueba constituido por un fármaco, ácido
nucleico, hormona, proteína o péptido sobre la posición en el ciclo
celular de una célula de mamífero, que comprende:
a) expresar en una célula en ausencia y en
presencia de dicho compuesto de prueba una construcción informadora
de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que
codifica una molécula informadora de célula viva detectable unida
operativamente a y bajo el control de:
- i)
- al menos un elemento de control de la expresión específico de fase del ciclo celular,
- ii)
- un elemento de control de destrucción, y
- iii)
- un elemento de control de localización espacial específico de fase del ciclo celular;
en el que dicha construcción informadora se
expresa en una célula en un punto predeterminado en el ciclo
celular; y
b) determinar la posición dentro del ciclo
celular controlando las señales emitidas por la molécula informadora
en el que una diferencia entre las señales emitidas medidas en
ausencia y en presencia de dicho compuesto de prueba es indicativa
del efecto de dicho compuesto de prueba sobre la posición en el
ciclo celular de dicha célula.
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En un quinto aspecto, se proporciona un
procedimiento in vitro para determinar el efecto de un
compuesto de prueba constituido por un fármaco, ácido nucleico,
hormona, proteína o péptido sobre la posición en el ciclo celular de
una célula de mamífero, que comprende:
a) expresar en la célula en ausencia y en
presencia del compuesto de prueba una construcción informadora de
ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que
codifica una molécula informadora de célula viva detectable unida
operativamente a y bajo el control de:
- i)
- al menos un elemento de control de la expresión específico de fase del ciclo celular,
- ii)
- un elemento de control de destrucción, y
- iii)
- un elemento de control de localización espacial específico de fase del ciclo celular;
en el que dicha construcción informadora se
expresa en una célula en un punto predeterminado en el ciclo
celular; y
b) determinar la posición dentro del ciclo
celular controlando las señales emitidas por la molécula
informadora,
c) comparar la señal emitida en presencia del
compuesto de prueba con un valor conocido para la señal emitida en
ausencia del compuesto de prueba;
en el que una diferencia entre la señal emitida
medida en presencia del compuesto de prueba y el valor conocido en
ausencia del compuesto de prueba es indicativa del efecto del
compuesto de prueba sobre la posición en el ciclo celular de dicha
célula.
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En un sexto aspecto, se proporciona un
procedimiento in vitro para determinar el efecto de un
compuesto de prueba constituido por un fármaco, ácido nucleico,
hormona, proteína o péptido sobre la posición en el ciclo celular de
una célula de mamífero, que comprende:
a) proporcionar células que contienen una
construcción informadora de ácido nucleico que comprende una
secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula informadora
de célula viva detectable unida de manera operativa a y bajo el
control de:
- i)
- al menos un elemento de control de la expresión específico de fase del ciclo celular,
- ii)
- un elemento de control de destrucción, y
- iii)
- un elemento de control de localización espacial específico de fase del ciclo celular;
en el que dicha construcción informadora se
expresa en una célula en un punto predeterminado en el ciclo
celular;
b) cultivar la primera y segunda población de
las células respectivamente en presencia y en ausencia del compuesto
de prueba y bajo condiciones que permitan la expresión de la
construcción informadora de ácido nucleico; y
c) medir las señales emitidas por la molécula
informadora en la primera y en la segunda población;
en el que una diferencia entre las señales
emitidas medidas en la primera y la segunda población es indicativa
del efecto del compuesto de prueba sobre la posición en el ciclo
celular de la célula.
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El término compuesto de prueba pretende
significar un agente tal como un fármaco, hormona, proteína,
péptido, ácido nucleico y similar, al que está expuesto la célula.
Como alternativa, el compuesto de prueba puede ser un agente tal
como un ácido nucleico, péptido o proteína expresado en la célula
bajo estudio. Por ejemplo, las células transfectadas con las
construcciones informadoras de ácido nucleico según la presente
invención pueden usarse para determinar si la expresión de ADNc que
contiene construcciones que codifican proteínas bajo estudio tienen
un efecto sobre la posición en el ciclo celular de una célula. Una
serie de ADNc, insertada en un vector de expresión de mamífero,
puede transfectarse transitoriamente en una célula que expresa de
manera estable el informador de posición en el ciclo celular.
Controlando la expresión y localización de la construcción
informadora de ácido nucleico en estas células transfectadas, es
posible determinar los efectos de las proteínas codificadas por los
ADNc en el ciclo
celular.
celular.
Las construcciones informadoras de posición en
el ciclo celular de ácido nucleico según la presente invención
pueden usarse también en un procedimiento para determinar el efecto
de la posición en el ciclo celular sobre un proceso celular, o para
determinar el efecto de la posición en el ciclo celular en la acción
de una sustancia de prueba sobre un proceso celular. Es bien sabido
que muchos procesos celulares, incluyendo aquellos que responden a
estímulos externos, están influenciados por el ciclo celular de
forma que funcionan o responden de manera diferente en diferentes
etapas del ciclo celular. Por ejemplo, se ha mostrado que los
receptores de endotelina se expresan en diferentes niveles durante
diferentes fases del ciclo celular (Okazawa y col., J. Biol. Chem.,
(1998), 273, 12584-12592) y por consiguiente la
sensibilidad de las células a la apoptosis inducida por endotelina
varía con la posición en el ciclo celular. De manera similar, las
respuestas celulares de movilización de Ca^{2+} a la vasopresina
difieren según la posición en el ciclo celular (Abel y col., J.
Biol. Chem., (2000), 275, 32543.32551) debido a variaciones en la
ruta de transducción de señales que usa diferentes proteínas G en
diferentes fases del ciclo celular. El uso de construcciones
informadoras de posición en el ciclo celular permitirá medir
variaciones de célula a célula en ensayos biológicos usando un
informador de ensayo adecuado, para correlacionar con la señal de
un informador de posición en el ciclo celular para determinar si
alguna variación en la señal del ensayo correlaciona con la señal
del informador de posición en el ciclo celular y por lo tanto
determinar cualquier dependencia del ciclo celular en la señal del
ensayo. Por ejemplo, pueden idearse ensayos en los que la cantidad
de un ligando marcada con fluorescencia roja unido a un receptor de
la superficie celular esté correlacionada con el estado del ciclo
celular determinado usando un informador GFP de posición en el
ciclo celular. Por proceso celular, se entiende los procesos
normales que sufren las células vivas e incluye: biosíntesis,
captación, transporte, unión a receptores, metabolismo, fusión,
respuesta bioquímica, crecimiento y
muerte.
muerte.
Pueden usarse dos o más construcciones de ácido
nucleico informadoras de posición en el ciclo celular en combinación
en aplicaciones que incluyen informar sobre la transición a través
de dos o más fases del ciclo celular dentro de la misma célula.
Para lograr tal informe doble o múltiple, se producen dos o más
construcciones diferentes y se expresan en la misma célula, en la
que cada construcción informadora comprende una combinación
diferente de elementos de control unidos a un informador
distinguible y diferente. Por ejemplo, la expresión celular de una
construcción que comprende un promotor de ciclina B1 y caja D de
ciclina B1 unido de manera operativa a GFP en combinación con la
expresión en la misma célula de una segunda construcción que
comprende un promotor de ciclina A2 y caja D de ciclina B1 unido de
manera operativa a proteína fluorescente azul (BFP) permitirá
discriminar células en fase S (fluorescencia azul) de células en
fase G2/M (fluorescencia azul y verde).
Las construcciones informadoras de posición en
el ciclo celular y los procedimientos de ensayo según la presente
invención pueden usarse en una diversidad de aplicaciones
adicionales, por ejemplo:
i) Las células transfectadas con las
construcciones informadoras de posición en el ciclo celular de la
presente invención pueden usarse para determinar el efecto del
ciclo celular en la expresión, translocación o distribución
subcelular de un segundo marcador en un ensayo múltiple. Por
ejemplo, si se está estudiando la translocación intracelular de un
informador fluorescente hacia la membrana plasmática y se encuentra
que un compuesto de prueba da como resultado la translocación en un
porcentaje de células, entonces, usando células transfectadas con
una construcción según la invención, es posible determinar si la
translocación fue dependiente del ciclo celular.
Por consiguiente, en un séptimo aspecto de la
invención se proporciona un procedimiento in vitro para
determinar el efecto del ciclo celular de mamífero sobre la
expresión, translocación o distribución subcelular de un primer
informador detectable conocido por variar en respuesta a un
compuesto de prueba constituido por un fármaco, ácido nucleico,
hormona, proteína o péptido, que comprende:
a) expresar en la célula en presencia de un
compuesto de prueba una segunda construcción informadora de ácido
nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica
una molécula informadora de célula viva detectable unida de manera
operativa a y bajo el control de:
- i)
- un elemento de control de la expresión específico de fase del ciclo celular,
- ii)
- un elemento de control de destrucción, y
- iii)
- un elemento de control de localización espacial específico de fase del ciclo celular; en el que dicha construcción informadora se expresa en una célula en un punto predeterminado en el ciclo celular;
b) determinar la posición en el ciclo celular
controlando las señales emitidas por la segunda molécula
informadora;
c) controlar las señales emitidas por el primer
informador detectable,
en el que la relación entre la posición en el
ciclo celular determinada en la etapa b) y la señal emitida por el
primer informador detectable es indicativa de si la expresión,
translocación o distribución subcelular del primer informador
detectable es o no es dependiente del ciclo celular. El término
"compuesto de prueba" debe entenderse como se describió
anteriormente en este documento en relación con el cuarto, quinto y
sexto aspecto de la presente invención.
ii) Los informadores de posición en el ciclo
celular de la presente invención pueden usarse en combinación con
análisis de marcadores o fenómenos celulares endógenos relacionados
con el ciclo celular, para obtener más información sobre el estado
del ciclo celular de una célula individual o población de células.
Por ejemplo, es bien sabido que el complejo de Golgi tiene una
morfología distintiva en células de mamífero, comprendiendo una
estructura similar a una cinta adyacente al núcleo, y que se
producen cambios distintivos en la estructura del Golgi a medida
que la célula sufre mitosis ya que la estructura de cinta se
convierte en grupos de vesículas y túbulos dispersados por toda la
célula mitótica. (Lowe y col., Trends Cell Biol., (1998),
8(1) 40-44). El análisis de la morfología de
los componentes celulares, tales como el aparato de Golgi, que varía
de una manera conocida con la progresión del ciclo celular, por
ejemplo por medio del uso de tinciones fluorescentes específicas,
puede usarse en combinación con un informador de posición en el
ciclo celular para permitir el análisis con más detalle de la
progresión del ciclo celular.
iii) Los informadores de posición en el ciclo
celular según la presente invención pueden usarse también para
controlar el estado y la progresión del ciclo celular en
aplicaciones in vivo. Por ejemplo, la introducción de una
construcción de ADN que codifica un informador del ciclo celular en
especímenes vivos tales como oocitos de Xenopus, y organismos vivos
tales como C. elegans y Drosophila, vía transfección
de células individuales o células múltiples puede lograrse por
microinyección (Krone P. H., y Heikkila J. J., Development, (1989),
106(2), 271-281), inyección balística (Horard
B. y col., Insect Mol. Biol., (1994), 3(4),
61-65, y otros procedimientos bien conocidos por
los expertos. La introducción de construcciones informadoras del
ciclo celular en tales especímenes permitirá la investigación de la
progresión y control del ciclo celular en la progenie celular de
las células transfectadas. Probablemente la información de los
informadores sea de valor significativo en el estudio del
crecimiento y desarrollo en organismos modelo.
iv) Los informadores de la presente invención
pueden usarse en la generación de organismos transgénicos, es
decir, donde el ADN que codifica el informador de posición en el
ciclo celular está expresado de manera estable en todas las células
de un organismo o animal. Tales organismos transgénicos pueden
generarse por microinyección de ADN en embriones tempranos,
generalmente en uno de los pronúcleos de un huevo recién
fertilizado. (Bishop J. O., Reprod. Nutr. Dev., (1996),
36(6), 607-618). Pueden usarse técnicas
transgénicas para incorporar informadores de posición en el ciclo
celular en una variedad de especies huésped a partir de organismos
simples tales como C. elegans (Daniells, C. y col., Mutat.
Res., (1998), 399(1), 55-64) a organismos más
complejos tales como ratones y ratas (Sills, R. C., y col.,
Toxicol. Lett., (2001), 20(1-3),
187-198). El establecimiento de expresión
transgénica estable de un informador de posición en el ciclo celular
en todas las células de un organismo transgénico permitirá
determinar el estado del ciclo celular en cualquier tipo de célula
dentro, o aislada, del organismo, incluyendo líneas celulares
cultivadas derivadas del organismo. Por consiguiente, en un octavo
aspecto de la presente invención, se proporciona un organismo
transgénico no humano que comprende una célula como se describió
anteriormente.
La invención se ilustra además por referencia a
los siguientes ejemplos y figuras en las que:
La Figura 1 es un diagrama esquemático que
ilustra la regulación de ciclina B1 durante la progresión del ciclo
celular. El ciclo celular avanza en la dirección de la flecha con la
expresión de ciclina B1 dirigida por un promotor específico de fase
del ciclo celular que inicia la expresión al final de la fase S y
tiene un pico durante G2 (A). Al comienzo de la mitosis (B) la
ciclina B1 transloca desde el citoplasma hacia el núcleo y desde
metafase en adelante (C) la proteína se degrada específicamente.
La Figura 2 es un diagrama esquemático que
ilustra las construcciones de ácido nucleico informadoras de
posición en el ciclo celular según la presente invención y en las
que, 2ª usa un promotor específico de fase del ciclo celular y
ningún elemento IRES, 2B usa un elemento IRES para facilitar la
selección de mamífero, y 2C contiene un promotor constitutivo o
inducible de mamífero y un IRES específico de fase del ciclo celular
como elemento de control de la expresión. En cada caso A representa
un control de expresión específico de fase del ciclo celular
(promotor), B representa un elemento de control de destrucción
específico de fase del ciclo celular, C representa un elemento de
control de localización específico de fase del ciclo celular, D
representa un gen informador, E representa un elemento IRES no
específico de ciclo celular, F representa un marcador seleccionable
de mamífero, G representa un promotor constitutivo de mamífero y H
representa un elemento IRES específico de ciclo celular.
La Figura 3 muestra una construcción de ADN para
determinar la fase G2/M del ciclo celular, que contiene un promotor
de ciclina B1 (A), caja de destrucción de ciclina B1 (caja D) (B),
CRS de ciclina B1 (C) y un informador de GFP (D).
La Figura 4 ilustra la expresión de una
construcción de ácido nucleico que expresa el marcador de fase G2/M
del ciclo celular en una población de células no sincronizadas. Cada
célula exhibe expresión y destrucción cíclicas del producto
fluorescente de la construcción, dando como resultado un patrón de
"centelleo" de fluorescencia desde todas las células en la
población. El análisis de la intensidad de fluorescencia de cada
célula en los tiempos 1, 2, 3 y 4 da información dinámica del estado
de posición celular de cada célula.
La Figura 5 es un diagrama de barras que muestra
el efecto de los agentes que bloquean el ciclo sobre la
fluorescencia de GFP a partir de un marcador de fase del ciclo
celular según la invención. A representa células inhibidas en
mitosis por demecolchicina, B representa células de control y C
representa células inhibidas en fase G1/S por mimosina;
La Figura 6 es una serie de fotografías de
lapsos de tiempo que muestran una célula a la que se le inyectó la
construcción descrita en el Ejemplo 1 y sufriendo mitosis según el
Ejemplo 3.
La Figura 7 es una serie de fotografías de
lapsos de tiempo que muestran una célula U2-OS que
expresa la construcción descrita en el Ejemplo 1 sufriendo mitosis
según el Ejemplo 4. En el panel A sobre la izquierda está en fase G2
del ciclo celular, en el panel B ha entrado en profase, en el panel
C la célula está en metafase, en el panel D la célula está en
telofase y en el panel E las dos células hijas no son fluorescentes
y están en fase G1.
La Figura 8 es un gráfico que muestra la
fluorescencia relativa de una célula U2-OS y su
progenie que expresan de manera estable la construcción descrita en
el Ejemplo 1 según el Ejemplo 4. La célula sufre mitosis (B) en 34
horas dividiéndose en dos nietas (1.1 y 1.2) y la Hija 2 sufre
mitosis en 42 horas (C) dividiéndose en nietas (2.1 y 2.2). Las
flechas en negrita muestran el aumento en la fluorescencia de las
células hijas durante la fase G2 y previo a la mitosis.
La Figura 9 es un análisis FACS de una línea
celular U2-OS que expresa de manera estable una
construcción que contiene eGFP según el Ejemplo 5. El gráfico
superior muestra un histograma de tinción con yoduro de propidio con
FL3A (fluorescencia roja) trazada en el eje X frente a número de
células con esa fluorescencia en el eje Y. Este gráfico ilustra que
la proporción de células en G1, S y G2/M son como se esperaban. El
gráfico inferior es un trazado de puntos de las mismas células
mostrando FL3A (roja) en el eje X y FL1H (fluorescencia verde) en el
eje Y. El patrón diagonal (en cajas) indica que las células en G2/M
tienen más fluorescencia verde que las células en fase S que a su
vez tienen más fluorescencia que las células en fase G1.
La Figura 10 es un análisis FACS que muestra el
efecto de inhibidores del ciclo celular sobre la intensidad de
fluorescencia verde relativa de la línea celular estable descrita en
el Ejemplo 5 según el Ejemplo 6. Como en la Figura 9 los histogramas
(a la izquierda) muestran el número de células (eje Y) frente a FL3A
y los trazos de puntos (a la derecha) muestran las mismas células
trazadas con FL1H (eje Y) frente a FL3A (eje X). Los dos gráficos
superiores muestran células de control que no han sido tratadas con
un inhibidor del ciclo celular. Como puede verse estas células
muestran el típico perfil de ciclo celular (A) y tienen patrón
diagonal que indica que las células con más GFP están en la parte
G2/M del ciclo celular. Los dos gráficos del medio muestran células
que han sido bloqueadas en G2/M con colchicina (C). La mayoría de
estas células tienen una fluorescencia verde relativamente alta (D).
Los dos gráficos inferiores muestran células que han sido
parcialmente bloqueadas en G1/S por mimosina (E). La mayoría de
estas células tienen una fluorescencia verde relativamente baja
(F).
i) Se amplificó el tercio N terminal del ARNm de
ciclina B1 (aminoácidos 1-171), que codifica la caja
de destrucción de ciclina B1 y la NES con extremos HindIII y BamHI
usando técnicas convencionales de PCR y los siguientes
cebadores:
GGGAAGCTTAGGATGGCGCTCCGAGAGTCACCAGGAAC
{}\hskip0,5cmGCCGGATCCCACATATTCACTAGAAAGGTT.
ii) Se amplificó el gen para wtGFP con cebadores
diseñados para introducir sitios de restricción que facilitarán la
construcción de proteínas de fusión. Se clonó el producto de PCR en
pTARGET (Promega) según las instrucciones del fabricante y se
introdujeron mutaciones (F64L/S175G/E222G) usando el equipo de
mutagénesis dirigido a sitios QuikChange (Stratagene). Se
verificaron las construcciones por medio de secuenciación de ADN. A
continuación se clonó el ADN que codifica la GFP mutante secuencia
debajo de la región N terminal de ciclina B1 usando sitios de
restricción de BamHI y SalI.
iii) Se amplificó la región dependiente del
ciclo celular del promotor de ciclina B1 (-150 -> +182) con
sitios SalII y HindIII y se clonó secuencia arriba de la región N
terminal de ciclina B1 y la proteína de fusión de GFP.
iv) Se escindió el promotor y el ADN que
codifica la proteína recombinante y se clonó en lugar del promotor
de CMV en un corte de BglII/NheI de vector derivado de
pCI-Neo.
Se cultivaron células U2-OS
(ATCC HTB-96) en pocillos de una placa de
microvaloración de 96 pocillos. Se transfectaron las células con
una construcción informadora del ciclo celular preparada según el
Ejemplo 1, que comprende un promotor de ciclina B1 unido de manera
operativa a las secuencias que codifican la caja D de ciclina B1,
la CRS de ciclina B1, y GFP en un vector pCORON4004 (Amersham
Biosciences) usando Fugene 6 (Roche) como el agente de
transfección.
Tras 24 horas de cultivo, se expusieron las
células a bloqueadores específicos del ciclo celular mimosina
(bloquea en el límite de las fases G1/S) o demecolcina (bloquea en
fase M). Se expusieron las células de control al medio de cultivo
solo.
Se incubaron células durante otras 24 horas y a
continuación se analizó la expresión de GFP usando un escáner de
imágenes confocal con análisis automatizado de imágenes (IN Cell
Analysis System, Amersham Biosciences).
Como se muestra en la Figura 5, las células
expuestas a demecolcina mostraron aumento de fluorescencia en
comparación con células control mientras que las células expuestas a
mimosina mostraron disminución de fluorescencia en comparación con
las células control. Estos resultados son coherentes con el uso
propuesto del informador de fases del ciclo celular de la
invención. Las células bloqueadas en fase G1/S (tratadas con
mimosina), previo al tiempo de activación del promotor de ciclina
B1, muestran fluorescencia disminuida, mientras que las células
bloqueadas en fase M (tratadas con demecolcina), previo al tiempo de
acción de la caja D de ciclina B1, muestran fluorescencia
aumentada.
Estos resultados indican que los informadores de
fases del ciclo celular de la presente invención son adecuados para
detectar agentes que modulan la progresión del ciclo celular en un
sistema transitorio y además tales informadores permiten la
identificación de la fase del ciclo celular en la que están
bloqueadas las células.
Se microinyectaron células HeLa con la
construcción preparada según el Ejemplo 1 y se examinaron por
microscopía en lapsos de tiempo, como se muestra en la Figura 6. A
la izquierda se muestran imágenes de contraste de interferencia
diferencial (DIC) con la imagen de fluorescencia correspondiente a
la derecha. El marco A muestra una célula (con flecha) en metafase
que muestra fluorescencia brillante en el núcleo. Los marcos B y C
muestran la misma célula en tiempos posteriores en anafase (B) y
anafase tardía (C). Las imágenes DIC de B y C muestran la división
de la célula en dos células hijas (indicadas por 2 flechas), las
imágenes de fluorescencia correspondientes muestran la pérdida de
fluorescencia que acompaña la destrucción de la construcción
fluorescente a medida que progresa el ciclo celular.
Se transfectaron células U2-OS
(ATCC HTB-96) con la construcción descrita en el
Ejemplo 1 y se cultivaron durante varios meses en medio de cultivo
que contenía 1 mg/ml de geneticina para seleccionar células con
expresión estable de la construcción. Se tomó un número de clones
por medio de procedimientos convencionales (por ejemplo descritos
en Freshney, Capítulo 11 en Culture of Animal Cells, (1994)
Wiley-Liss Inc.) y se aisló un clon que contenía
células fluorescentes. Se mantuvo la línea celular a 37ºC en medio
de cultivo que contenía HEPES 25 nM y se tomó una imagen de
fluorescencia de las células cada 15 minutos durante un período de
24 horas usando una lámpara convencional de xenón a 488 nm. La
Figura 7 muestra 5 marcos de una porción de la imagen que indica
que la línea celular se comporta como se esperaba. Las células en G2
exhiben fluorescencia verde en el citoplasma, las células en
mitosis temprana tienen fluorescencia predominantemente en el núcleo
y tras la mitosis se degrada el gen del informador y las células
pierden su fluorescencia.
La Figura 8 muestra el destino de una célula del
mismo clon que se controló durante 48 horas y que sufrió dos
divisiones celulares para producir cuatro células nietas. Para cada
punto temporal se midió la intensidad promedio de cada una de las
progenies de las células y se trazó un gráfico frente al tiempo.
Como puede verse la célula original entra en mitosis a las -4
horas, una de las hijas se divide a las 32 horas y la otra a las 42
horas en el experimento. A medida que las células dejan la fase S y
entran en G2 hay un aumento estable en la intensidad promedio hasta
que la célula entra en mitosis cuando la célula vuelve al ciclo y la
intensidad promedio aumenta dramáticamente.
Se reemplazó la secuencia del informador de
proteína fluorescente verde en el vector descrito en el Ejemplo 1
con GFP potenciada (EGFP; Cormack, B. P. y col., Gene, (1996), 173,
33-38; BD Clontech) por medio de procedimientos
convencionales. El gen de EGFP es una forma más brillante de GFP que
contiene las mutaciones F64L y S65T. Además, EGFP contiene codones
que han sido alterados para optimizar la expresión en células de
mamífero. Se transfectó esta nueva construcción en células
U2-OS y se aislaron un número de colonias por
selección con geneticina seguida por la selección de células únicas
usando selección de células activadas por fluorescencia. Estos
clones mostraron fluorescencia más brillante que aquellos generados
en el Ejemplo 4 y como se esperaba, la intensidad de fluorescencia
y localización pareció variar según la fase del ciclo celular de la
célula.
Se prepararon las células para análisis FACS por
medio de procedimientos convencionales. Brevemente, se fijaron las
células y se permeabilizaron usando CytoFix/CytoPerm (Becton
Dickinson) según los procedimientos de los fabricantes. A
continuación se trataron las células con 50 \mug/ml de ARNasa y
Triton X-100 al 0,4% y se sometieron a
contratinción con 100 \mug/ml de yoduro de propidio. El grado de
tinción de yoduro de propidio es proporcional a la cantidad de ADN
en la célula y por consiguiente es una medida de la fase del ciclo
celular de la célula. Como puede verse en la Figura 9, como se
esperaba, el grado de tinción de yoduro de propidio rojo y la
cantidad de fluorescencia verde de GFP parece ser proporcional en
las células.
Se cultivaron las células preparadas en el
Ejemplo 5 en matraces de 25 cm^{3} tratados con demecolcina 100
ng/ml (Sigma) o mimosina 1 mM (Sigma) durante 24 horas. A
continuación se fijaron las células, se permeabilizaron y tiñeron
con yoduro de propidio como se describió en el Ejemplo 5. El
análisis FACS reveló que, como se esperaba, las células tratadas
con el análogo de colchicina se detuvieron en G2/M y las células
tratadas con mimosina se detuvieron en el límite de G1/S. Como
también se esperaba, las células que se detuvieron en G2/M fueron
más brillantes que las células detenidas en G1/S (Figura 10).
<110> Amersham Biosciences UK Ltd
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para Determinar la
Posición en el ciclo Celular
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PL0161
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/GB02/04258
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
12-09-2002
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggaagctta ggatggcgct ccgagtcacc aggaac
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccggatccc acatattcac tacaaaggtt
\hfill30
Claims (23)
1. Una construcción informadora de ácido
nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica
una molécula informadora de célula viva detectable unida de manera
operativa a y bajo el control de:
- i)
- al menos un elemento de control de expresión específico de fase del ciclo celular,
- ii)
- un elemento de control de destrucción, y
- iii)
- un elemento de control de localización espacial específico de fase del ciclo celular.
2. Una construcción según la reivindicación 1,
en la que dicho elemento de control de expresión controla la
transcripción de una manera específica del ciclo celular.
3. Una construcción según la reivindicación 1 o
la reivindicación 2, en la que el elemento de control de expresión
controla la traducción de una manera específica del ciclo
celular.
4. Una construcción según las reivindicaciones
1-3, en la que el elemento de control de expresión
se selecciona de un promotor específico del ciclo celular y un IRES
específico del ciclo celular.
5. Una construcción según la reivindicación 4,
en la que dicho promotor se selecciona del grupo constituido por
promotor de ciclina B1, promotor de Cdc25B, promotor de ciclina A2,
promotor de Cdc2, promotor de Cdc25C, promotor de ciclina E,
promotor de Cdc6, promotor de DHFR y promotores de histonas.
6. Una construcción según la reivindicación 4 o
la reivindicación 5, en la que dicho IRES se selecciona del grupo
constituido por G2-IRES, IRES de HCV, IRES de ODC,
IRES de c-myc e IRES de p58 PITSLRE.
7. Una construcción según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho elemento de control de
destrucción se selecciona del grupo constituido por caja D de
ciclina B1, extremo N terminal de ciclina A, caja KEN, ciclina E y
p27Kip1.
8. Una construcción según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho elemento de control de
localización espacial específico de fase del ciclo celular es la
secuencia de retención citoplasmática (CRS) de ciclina B1 incluyendo
su NES.
9. Una construcción según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en la que dicha molécula informadora de
célula viva se selecciona del grupo constituido por proteína
fluorescente y enzima.
10. Una construcción según la reivindicación 9,
en la que dicha proteína fluorescente se selecciona de Proteína
Fluorescente Verde (GFP) y un análogo funcional de GFP en el que la
secuencia de aminoácidos de GFP natural ha sido alterada por
deleción, adición o sustitución de aminoácidos.
11. Una construcción según la reivindicación 9,
en la que dicho informador de enzima se selecciona del grupo
constituido por una \beta-lactamasa y
nitrorreductasa.
12. Una construcción según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11 que comprende un promotor de ciclina B1, una
caja de destrucción (caja D) de ciclina B1, una secuencia de
retención citoplasmática (CRS) de ciclina B1 y una proteína
fluorescente verde (GFP).
13. Una construcción informadora de ácido
nucleico que comprende un vector de expresión que comprende:
a) un esqueleto de vector que comprende:
- i)
- un origen de replicación bacteriano; y
- ii)
- un gen de resistencia a fármacos bacteriano;
b) un elemento de control de expresión
específico de fase del ciclo celular;
c) un elemento de control de destrucción;
d) un elemento de control de localización
espacial específico de fase del ciclo celular; y
e) una secuencia de ácido nucleico que codifica
una molécula informadora.
14. Una construcción según la reivindicación 13
que además contiene un gen eucariota de resistencia a fármacos.
15. Una célula huésped, que no es una célula
embrionaria humana, transfectada con una construcción según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
16. Un procedimiento in vitro para
determinar la posición en el ciclo celular de una célula de
mamífero, que comprende:
a) expresar en una célula una construcción
informadora de ácido nucleico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14; y
b) determinar la posición en el ciclo celular
controlando señales emitidas por la molécula informadora.
17. Un procedimiento in vitro para
determinar el efecto de un compuesto de prueba constituido por un
fármaco, ácido nucleico, hormona, proteína o péptido sobre la
posición en el ciclo celular de una célula de mamífero, que
comprende:
a) expresar en dicha célula en ausencia y en
presencia de dicho compuesto de prueba una construcción informadora
de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que
codifica una molécula informadora de célula viva detectable unida de
manera operativa a y bajo el control de:
- i)
- un elemento de control de la expresión específico de fase del ciclo celular,
- ii)
- un elemento de control de destrucción, y
- iii)
- un elemento de control de localización espacial específico de fase del ciclo celular;
en el que dicha construcción informadora se
expresa en una célula en un punto predeterminado en el ciclo
celular; y
b) determinar la posición dentro del ciclo
celular controlando las señales emitidas por la molécula
informadora, en el que una diferencia entre las señales emitidas
medidas en ausencia y en presencia de dicho compuesto de prueba es
indicativa del efecto de dicho compuesto de prueba sobre la posición
en el ciclo celular de dicha célula.
18. Un procedimiento in vitro para
determinar el efecto de un compuesto de prueba constituido por un
fármaco, ácido nucleico, hormona, proteína o péptido sobre la
posición en el ciclo celular de una célula de mamífero, que
comprende:
a) expresar en dicha célula en presencia de
dicho compuesto de prueba una construcción informadora de ácido
nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica
una molécula informadora de célula viva detectable unida de manera
operativa a y bajo el control de:
- i)
- un elemento de control de la expresión específico de fase del ciclo celular,
- ii)
- un elemento de control de destrucción, y
- iii)
- un elemento de control de localización espacial específico de fase del ciclo celular;
en el que dicha construcción informadora se
expresa en una célula en un punto predeterminado en el ciclo
celular; y
b) determinar la posición en el ciclo celular
controlando las señales emitidas por la molécula informadora,
c) comparar la señal emitida en presencia del
compuesto de prueba con un valor conocido para la señal emitida en
ausencia del compuesto de prueba;
en el que una diferencia entre la señal emitida
medida en presencia del compuesto de prueba y dicho valor conocido
en ausencia del compuesto de prueba es indicativa del efecto de
dicho compuesto de prueba sobre la posición en el ciclo celular de
dicha célula.
19. Un procedimiento in vitro para
determinar el efecto de un compuesto de prueba constituido por un
fármaco, ácido nucleico, hormona, proteína o péptido sobre la
posición en el ciclo celular de una célula de mamífero, que
comprende:
a) proporcionar células que contienen una
construcción informadora de ácido nucleico que comprende una
secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula informadora de
célula viva detectable unida de manera operativa a y bajo el control
de:
- i)
- un elemento de control de la expresión específico de fase del ciclo celular,
- ii)
- un elemento de control de destrucción, y
- iii)
- un elemento de control de localización espacial específico de fase del ciclo celular;
en el que dicha construcción informadora se
expresa en una célula en un punto predeterminado en el ciclo
celular;
b) cultivar la primera y segunda población de
dichas células respectivamente en presencia y en ausencia del
compuesto de prueba y bajo condiciones que permitan la expresión de
la construcción informadora de ácido nucleico; y
c) medir las señales emitidas por la molécula
informadora en la primera y en la segunda población;
en el que una diferencia entre las señales
emitidas medidas en dicha primera y segunda poblaciones es
indicativa del efecto del compuesto de prueba sobre la posición en
el ciclo celular de dicha célula.
20. Un procedimiento in vitro para
determinar el efecto del ciclo celular de mamífero sobre la
expresión, translocación o distribución subcelular de un primer
informador detectable que se sabe que varía en respuesta a un
compuesto de prueba constituido por un fármaco, ácido nucleico,
hormona, proteína o péptido, que comprende:
a) expresar en dicha célula en presencia de un
compuesto de prueba una segunda construcción informadora de ácido
nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica
una molécula informadora de célula viva detectable unida de manera
operativa a y bajo el control de:
- i)
- un elemento de control de la expresión específico de fase del ciclo celular,
- ii)
- un elemento de control de destrucción, y
- iii)
- un elemento de control de localización espacial específico de fase del ciclo celular;
en el que dicha construcción informadora se
expresa en una célula en un punto predeterminado en el ciclo
celular;
b) determinar la posición en el ciclo celular
controlando las señales emitidas por la segunda molécula
informadora; y
c) controlar las señales emitidas por el primer
informador detectable,
en el que la relación entre la posición en el
ciclo celular determinada en la etapa b) y la señal emitida por el
primer informador detectable es indicativa de si la expresión,
translocación o distribución subcelular del primer informador
detectable es o no es dependiente del ciclo celular.
21. El procedimiento in vitro de
cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que dicha
construcción informadora de ácido nucleico comprende la
construcción de la reivindicación 12.
22. El procedimiento in vitro según
cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, en el que dicho
compuesto de prueba es un agente seleccionado de un péptido o
proteína que se expresa en la célula bajo estudio.
23. Un organismo transgénico no humano que
comprende una célula según la reivindicación 15.
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US7745123B2 (en) * | 2004-07-23 | 2010-06-29 | Ge Healthcare Uk Limited | Cell cycle reporting cell line |
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AU2005263993B2 (en) * | 2004-07-23 | 2009-11-12 | Ge Healthcare Uk Limited | Cell cycle reporting cell line |
JP5408839B2 (ja) * | 2006-10-20 | 2014-02-05 | オリンパス株式会社 | 細胞周期解析方法 |
EP2275567A1 (en) * | 2009-07-15 | 2011-01-19 | Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn | Nucleic acid expression construct and its use as a cell proliferation marker |
AU2012284259A1 (en) | 2011-07-15 | 2014-03-06 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for manipulating translation of protein isoforms from alternative initiation start sites |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US5288641A (en) * | 1984-06-04 | 1994-02-22 | Arch Development Corporation | Herpes Simplex virus as a vector |
US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
FR2658204A1 (fr) * | 1990-02-12 | 1991-08-16 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouvelles compositions de cycline a humaine, sequence nucleotidique correspondante, et agents de detection ou de diagnostic de mutations hepatocellulaires induites par le virus hbv. |
US6159691A (en) * | 1996-05-15 | 2000-12-12 | Prolifix Limited | Assay for a putative regulator of cell cycle progression |
US6124128A (en) * | 1996-08-16 | 2000-09-26 | The Regents Of The University Of California | Long wavelength engineered fluorescent proteins |
US6048693A (en) * | 1996-10-16 | 2000-04-11 | Bittech, Inc. | Phenotypic assays of cyclin/cyclin-dependent kinase function |
US6461813B2 (en) * | 1998-09-21 | 2002-10-08 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Multiparameter FACS assays to detect alterations in cell cycle regulation |
DE19831420A1 (de) * | 1998-07-14 | 2000-01-20 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Expressionssysteme enthaltend chimäre Promotoren mit Bindungsstellen für rekombinante Transkriptionsfaktoren |
US6764852B2 (en) * | 1999-01-26 | 2004-07-20 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw | Internal ribosome entry site, vector containing same and uses thereof |
GB0002261D0 (en) * | 2000-02-02 | 2000-03-22 | Amersham Pharm Biotech Uk Ltd | Fluorescent detection method & reagent |
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