JP5408839B2 - 細胞周期解析方法 - Google Patents
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プレートの作成
HeLa細胞(ヒト子宮頸癌細胞)を培養し、トリプシン処理して細胞懸濁液を作成し、96ウェルマルチプレートに2×104/ウェルの濃度で植込んだ。約4時間後、細胞が接着したことを確認し、M期に細胞周期を同調させる薬剤ノコダゾールを段階希釈して処理した。37℃、5%CO2インキュベータ内で約16時間培養後、終濃度2%のパラホルムアルデヒドで固定した。
細胞周期特異的マーカーの免疫染色
1% BSA/0.1% Tween20/PBSでブロッキングした後、M期特異的マーカーとして知られるリン酸化ヒストンH3(セリン10)(Upstate社、カタログナンバー06-570)を200倍希釈して1次抗体とし、4℃で一晩反応させた。その後PBSで洗浄し、Alexa488 goat anti-rabbit IgG(Molecular Probes社、カタログナンバーA11008)を二次抗体として常温で1時間反応させた。
細胞核染色
二次抗体の染色後、PBSで洗浄し、5μM DRAQ5TM(Biostate社、カタログナンバーBOS-889-001-R200)を1000倍希釈して核を染色した。
イメージングサイトメータによるデータ取得
細胞周期特異的マーカーおよび核の染色を行ったプレートをイメージングサイトメータ(iCyteTM、OLYMPUS)を用いて画像取得し、目的とする核およびリン酸化ヒストンH3 (セリン10)の蛍光を確認した。その後、核染色の総蛍光量、リン酸化ヒストンH3 (セリン10)の総蛍光量、細胞数に関してデータを取得し、リン酸化ヒストンH3(セリン10)の割合を算出した結果を図2に示す。図2は、同じ条件を3つのウエルで行なった結果の平均値である。縦軸は細胞周期依存性生体分子総量/核染色総量、横軸は細胞周期をM期に同調させる試薬ノコダゾールの濃度である。本発明の方法を使用して測定した際、ノコダゾールの濃度が高くなればなるほど、M期の細胞割合が高くなることが分かる。本実施例ではノコダゾールの濃度依存的にM期の増加する様子を数値化(グラフ化)することを目的としている。ノコダゾールは細胞***期に微小管を阻害することで細胞をM期に同調させる試薬ですので、ノコダゾールの添加量を増やしていくとM期の細胞が増えていくこととなる。
図2において、ノコダゾールの濃度が高くなるにつれて、ノコダゾールがM期へ細胞を同調する効果に加えて、その後M期の細胞数が減少しているが、これは、細胞に毒性が現れ始めたことが原因であると考えられる。すなわち、細胞に毒性が現れると、細胞周期が停止したり、アポトーシスを起こしたりすることが原因と考えられる。
図1にイメージングサイトメータで取得した画像の一部拡大図を示したが、赤色蛍光は細胞核染色の蛍光を、緑色傾向はリン酸化ヒストンH3(セリン10)の蛍光を示している。ここでは核染色の蛍光強度により閾値を設定し、自動的に細胞の輪郭を描いており、細胞を塊として認識している部分があることがわかる。塊となって認識されている細胞の中にもリン酸化ヒストンH3(セリン10)(緑色蛍光を発している細胞)があるが、実際の解析の際は、細胞の面積が著しく大きく認識されているため、データから除外されてしまう。本発明ではこれらの細胞の蛍光強度を数値データとして捉え、リン酸化ヒストンH3(セリン10)の蛍光総量/核染色の蛍光総量でヒストンH3リン酸化の割合を算出した(図2)。これによって、塊となっている細胞からもリン酸化ヒストンH3の情報を引き出すことが出来、ノコダゾール処理の際の細胞周期におけるリン酸化ヒストンH3の変動過程をより明確に示すことが出来た。
Claims (5)
- 細胞集団中の細胞核を蛍光を用いて可視化する工程と、
前記細胞集団中の細胞内の特定の細胞周期に特異的に発現する生体分子を蛍光を用いて可視化する工程と、
前記細胞核の蛍光輝度に基づき細胞を認識する工程と、
前記細胞集団中の前記細胞核の蛍光輝度の総量と、前記細胞集団中の前記生体分子の蛍光輝度の総量とを同時に測定しこれらの比を算出することによって、前記細胞集団中の細胞における前記特定の細胞周期にある細胞の割合を同定する工程とを有し、前記細胞を認識する工程で複数の細胞が1つの塊の細胞として認識された場合にも、蛍光輝度の総量に基づく前記同定を行うことにより細胞の全数及び特定の細胞周期にある細胞の全数についての割合を把握するようにしたことを特徴とするインビトロで細胞周期を解析する方法。 - 前記細胞集団の画像解析を、顕微鏡、又はイメージングサイトメータにより行なう請求項1に記載の方法。
- 前記特定の細胞周期が、M期であり、当該M期に特異的に発現する生体分子が、リン酸化ヒストンH3(セリン10)、リン酸化ヒストンH3(セリン28)、リン酸化CENP-A(セリン7)、メチル化ヒストンH4(リジン20)、サイクリンB1、オーロラキナーゼからなる群から選択される少なくとも1種である請求項1又は2に記載の方法。
- 前記生体分子の蛍光による可視化を免疫蛍光染色により行なう請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生体分子の蛍光による可視化を蛍光蛋白質の細胞内への導入により行なう請求項1〜3項のいずれか1項に記載の方法。
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