ES2289529T3 - Casetes de expresion para la expresion transgenica bi-direccional de los acidos nucleicos en vegetales. - Google Patents
Casetes de expresion para la expresion transgenica bi-direccional de los acidos nucleicos en vegetales. Download PDFInfo
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Abstract
Un casete de expresión transgénica para la expresión de dos secuencias de ácidos nucleicos en una célula vegetal que comprende al menos una secuencia reguladora seleccionada del grupo que consiste de a) el promotor mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2, b) equivalentes funcionales del promotor mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2 que tiene una identidad de al menos 80% a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 o 2 y que tiene sustancialmente la misma actividad del promotor que el promotor mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2, c) equivalentes funcionales del promotor mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2 que comprende al menos 25 nucleótidos consecutivos de las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 1 o 2 y que tienen sustancialmente la misma actividad del promotor que el promotor mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2, y d) fragmentos equivalentes funcionalmente de las secuencias a) o b) o c), que tienen al menos 25 nucleótidos consecutivos de dichas secuencias a) o b) o c) y tienen sustancialmente la misma actividad del promotor que el promotor mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2, donde dicha secuencia reguladora se sitúa entre dos secuencias de ácidos nucleicos y es heteróloga en relación con dichas secuencias de ácidos nucleicos y es funcionalmente asociada a dichas secuencias de ácidos nucleicos de tal manera que la expresión de dos diferentes secuencias de ácido ribonucléico se produce en al menos una célula vegetal, donde dichas secuencias de ácido ribonucléico se seleccionan a partir de las secuencias de ácido ribonucléico codificadas por: i) secuencias de aminoácidos o ii) secuencias de ácido ribonucléico que producen una reducción en la expresión de al menos un gen endógeno de dicha célula vegetal.
Description
Casetes de expresión para la expresión
transgénica bi-direccional de los ácidos nucleicos
en vegetales.
La invención se relaciona con casetes y vectores
de expresión que comprenden promotores bidireccionales de
vegetales, y con el uso de estos casetes o vectores de expresión
para la expresión transgénica de las secuencias de ácidos nucleicos
en organismos vegetales. La invención además se relaciona con
organismos de vegetales transgénicos transformados con estos
casetes o vectores de expresión, con los cultivos, partes o material
de propagación derivados de estos, y con el uso de los mismos para
producir alimentos humanos y animales, semillas, productos
farmacéuticos o químicos finos.
La producción de plantas transgénicas es una
técnica fundamental de biotecnología vegetal y de esta manera
prerrequisito indispensable para la investigación fundamental en los
vegetales, y para producir plantas que han mejorado, las
propiedades novedosas para la agricultura, para incrementar la
calidad de los alimentos humanos o para producir productos químicos
o farmacéuticos particulares. Un prerrequisito básico para la
expresión transgénica de genes particulares en plantas es la
condición de los promotores específicos de la planta. Varios
promotores de plantas son conocidos. Los promotores constitutivos
que se utilizan en la actualidad predominantemente en plantas son
casi exclusivamente promotores virales o promotores aislados del
Agrobacterium tal como, por ejemplo, el promotor del virus
mosaico del coliflor CaMV355 (Odell et al. (1985) Nature
313:810-812). El aumento de la complejidad del
trabajo en biotecnología vegetal con frecuencia requiere la
transformación con una pluralidad de construcciones de expresión.
El uso múltiple de uno y el mismo promotor es especialmente
problemático en plantas, porque la presencia múltiple de secuencias
reguladoras idénticas puede dar lugar a que la actividad del gen se
intercambie completamente (silenciador) (Kumpatla et al.
(1998) TIBS 3:97-104; Selker (1999) Cell
97:157-160). De esta manera existe un incremento de
la necesidad de promotores novedosos. Una manera alternativa de
ocuparse de este problema es el uso de los promotores así llamados
"bidireccional", i.e. secuencias reguladoras que resultan en
la transcripción de las secuencias de ADN en dirección 3' en ambas
direcciones. Es posible en este caso por ejemplo que se introduzca
un gen diana y un gen marcador en una célula bajo el control de una
secuencia de ADN.
A la fecha, la expresión transgénica bajo el
control de promotores bidireccionales ha sido descrita escasamente.
La producción de promotores bidireccionales a partir de promotores
polares para la expresión de ácidos nucleicos en plantas por medio
de fusión con otros elementos transcripcionales se ha descrito (Xie
M (2001) Nature Biotech 19: 677-679). El promotor
35S así mismo se ha convertido en un promotor bidireccional (Dong J
Z et al. (1991) BIO/TECHNOLOGY 9: 858-863).
WO 02/64804 describe la construcción de un promotor bidireccional
complejo basado en la fusión de los elementos promotores
potenciadores y nucleares de varias secuencias virales (CaMV 35S,
CsVMV) y de plantas (Act2, PRb1b). US20020108142 describe una
secuencia reguladora a partir de un intrón de la proteína IV como
la transferencia del fosfatidilinositol a partir del Lotus japonicus
(PLP-IV; GenBank Acc. No.: AF367434) y el uso de
esta como promotor bidireccional. Este fragmento intrón tiene una
actividad transcripcional solamente en la zona de infección de los
nódulos. Otros tejidos, raíces, hojas o flores no muestran
ninguna
mancha.
mancha.
Los promotores de plantas que permiten expresión
bidireccional, ubicua (i.e. sustancialmente
tejido-no específico) y constitutiva en plantas no
han sido revelados a la fecha.
WO 03/006660 describe un promotor de un gen
ferredoxina putativo, y las construcciones de expresión, vectores y
plantas transgénicas que comprenden este promotor. La secuencia
flanqueante-5' aislada de 836 bp combinada al gen
de glucuronidasa sorprendentemente muestra un patrón de expresión
constitutiva en tabaco transgénico. La secuencia corresponde a un
segmento de secuencia en el cromosoma 4 de Arabidopsis
thaliana según lo depositado en GenBank bajo elthe Acc. No.
Z97337 (versión Z97337.2; par de bases 85117 a 85952; el gen inicial
a bp 85953 se anota con fuerte similaridad a la ferredoxina
[2Fe-2S] I, "Nostoc muscorum"). La actividad
detectable en las anteras del polen del brote de la flor cerrada
fue solamente débil, y en las flores maduras fue cero. Contrario al
prejuicio derivado de los descubrimientos de literatura contra la
conveniencia del promotor para la expresión eficiente de marcadores
de selección (por ejemplo basado en la especificidad presumida de la
hoja o la función en transporte de electrón fotosintético), fue
posible demostrar la selección altamente eficiente por combinación
con, por ejemplo, el gen resistente de la kanamicina (nptII). WO
03/006660 describe simplemente el uso como promotor constitutivo
"normal". No se revela, el uso como promotor bidireccional.
Con el fin de integrar un número máximo de genes
en un genoma vegetal vía un complejo de transferencia, es necesario
limitar el número y tamaño de secuencias reguladoras para expresar
los ácidos nucleicos transgénicos. Los promotores que actúan
bidireccionalmente contribuyen a lograr este objeto. Es
particularmente ventajoso utilizar un promotor bidireccional cuando
sus actividades se presentan coordinadas en la misma fuerza y se
localizan en un fragmento de ADN corto. Dado que hay poca aceptación
para el uso de secuencias virales para la expresión en plantas
transgénicas, es ventajoso utilizar secuencias reguladoras que son
igualmente de plantas.
El objeto en el cual la presente invención se
basó fue proporcionar los casetes de expresión transgénica que
comprenden secuencias reguladoras de plantas que median la expresión
bidireccional, ubicua y desarrollo-independiente
(constitutivo) de dos secuencias de ácidos nucleicos que se deben
expresar transgénicamente.
\newpage
Este objeto se logra por la presente invención.
El primer aspecto de la invención por consecuencia se relaciona con
casetes de expresión para la expresión transgénica de dos secuencias
de ácidos nucleicos en una célula vegetal que comprende al menos
una secuencia reguladora seleccionada del grupo que consiste de
a) el promotor mostrado en la SEQ ID NO: 1 o
2,
b) equivalentes funcionales del promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2 que tiene una identidad de al menos
80% a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 o 2 y que tiene
sustancialmente la misma actividad del promotor que el promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2,
b) equivalentes funcionales del promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2 que comprende al menos 25
nucleótidos consecutivos de las secuencias mostradas en la SEQ ID
NO: 1 o 2 y que tiene sustancialmente la misma actividad del
promotor que el promotor mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2, y
c) fragmentos equivalentes funcionalmente de las
secuencias a) o b) o c), que tienen al menos 25 nucleótidos
consecutivos de dichas secuencias a) o b) o c) y tienen
sustancialmente la misma actividad del promotor que el promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2, donde dicho elemento regulador se
sitúa entre dos secuencias de ácidos nucleicos y es heterogéneo en
relación con dicha secuencia de ácidos nucleicos y se une
funcionalmente a dichas secuencias de ácidos nucleicos de tal
manera que la expresión de dos diferentes secuencias de ácido
ribonucléico se producen en al menos una célula vegetal, donde
dichas secuencias de ácido ribonucléico se seleccionan de las
secuencias de ácido ribonucléico codificadas por
i) secuencias de aminoácidos o
ii) secuencias de ácido ribonucléico que
producen una reducción en la expresión de al menos un gen endógeno
de dicha célula vegetal.
La invención adicionalmente se relaciona con un
proceso para la expresión transgénica de dos secuencias de ácido
ribonucléico en células vegetales, donde un casete de expresión que
comprende al menos una secuencia reguladora seleccionada del grupo
que consiste de
a) el promotor mostrado en la SEQ ID NO: 1 o
2,
b) equivalentes funcionales del promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2 que tiene una identidad de al menos
80% a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 o 2 y que tiene
sustancialmente la misma actividad del promotor que el promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2,
b) equivalentes funcionales del promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2 que comprende al menos 25
nucleótidos consecutivos de las secuencias mostradas en la SEQ ID
NO: 1 o 2 y que tienen sustancialmente la misma actividad del
promotor que el promotor mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2, y
c) fragmentos equivalentes funcionalmente de las
secuencias a) o b) o c), que tienen al menos 25 nucleótidos
consecutivos de dichas secuencias a) o b) o c) y tienen
sustancialmente la misma actividad del promotor que el promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2, se introducen en al menos una
célula vegetal, donde dicho elemento regulador se sitúa entre dos
secuencias de ácidos nucleicos y es heterogéneo en relación con
dicha secuencia de ácidos nucleicos y se une funcionalmente a
dichas secuencias de ácidos nucleicos de tal manera que la expresión
de dichas dos diferentes secuencias de ácido ribonucléico se
produce en al menos la citada célula vegetal, donde dichas
secuencias de ácido ribonucléico se seleccionan de las secuencias de
ácido ribonucléico codificadas por
i) secuencias de aminoácidos o
ii) secuencias de ácido ribonucléico que
producen una reducción en la expresión de al menos un gen endógeno
de dicha célula vegetal.
La secuencia de ADN empleada en la presente
invención como promotor bidireccional corresponde a la región
intergen entre un gen de ferredoxina (FD) putativo y un gen de
O-acetilserina liasa (OASTL) putativo en
Arabidopsis thaliana.
Ha sido posible lograr particularmente buenos
resultados en plantas de la familia Brassicaceae tal como, por
ejemplo, arabidopsis o semilla oleaginosa de colza. Sin embargo,
también fue posible lograr muy buenos resultados (especialmente
sobre la expresión de marcadores de selección) en otras especies de
plantas (tal como, por ejemplo, tabaco). La expresión
"actividad" es sustancialmente independiente de la naturaleza
del ácido nucleico en dirección 3'. El uso del promotor
bidireccional es apropiado tanto para la expresión de marcadores de
selección como para cualquier otro ácido nucleico.
En una modalidad preferida, por consecuencia,
las dos secuencias de ácidos nucleicos que se expresan
transgénicamente y se incluyen en los casetes de expresión de la
invención, o las secuencias de ácido ribonucléico expresadas en el
proceso de la invención, son diferentes. "Diferente" significa
a este respecto que las secuencias de ácido ribonucléico que se
expresan transgénicamente iniciando de ambos lados del promotor
bidireccional difieren una de la otra en al menos una base. Las dos
secuencias de ácidos nucleicos preferiblemente codifican para
proteínas diferentes, preferiblemente para proteínas que difieren en
función y/o actividad.
La invención hace posible incrementar el número
de unidades de transcripción con un número reducido de secuencias
promotor. En el caso de fusiones de traducción también es posible
regular más de dos proteínas. Una ventaja particular de esta
invención es que la expresión de estos transgenes múltiples tiene
lugar simultánea y sincronizadamente bajo el control del promotor
bidireccional. El promotor es particularmente apropiado para
coordinar la expresión de los ácidos nucleicos. Así, es posible
expresar simultáneamente
i) proteína diana y marcador de selección o
proteína indicadora
ii) marcador de selección y proteína
indicadora
ii) dos proteínas diana, por ejemplo a partir de
la misma ruta metabólica
iii) ARN sentido y antisentido
iv) varias proteínas de defensa contra
patógenos
y muchas más, y producen efectos mejorados en
las plantas.
"Expresión" comprende la transcripción de
la secuencia de ácidos nucleicos que se expresa transgénicamente,
pero también puede - en el caso de un marco de lectura abierto en
la orientación sentido - incluir la traducción del ARN transcrito
de la secuencia de ácidos nucleicos que se expresa transgénicamente
en un polipéptido correspondiente.
"Casete de expresión para la expresión
transgénica de ácidos nucleicos o proceso para la expresión
transgénica de ácidos nucleicos" comprende todas aquellas
construcciones o procesos producidos por métodos de ingeniería
genética, en las cuales cualquiera
a) uno de los promotores de la invención (por
ejemplo el promotor mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2 o un equivalente
funcional de estos), o
b) la secuencia de ácidos nucleicos que se
expresan bajo el control de dicho promotor, o
c) (a) y (b)
no están en su ambiente genético natural (i.e.
en su locus del cromosoma natural) o han sido modificados por
métodos de ingeniería genética, esto es posible para que la
modificación sea por ejemplo una sustitución, adición, deleción,
inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótido. En una
modalidad preferida, la secuencia de ácidos nucleicos que se
expresa bajo el control de uno de los promotores de la invención es
heteróloga en relación con dicho promotor, i.e. no está naturalmente
bajo el control de estos, pero dicho control se ha producido de una
manera no-natural (por ejemplo mediante procesos de
ingeniería genética).
Los casetes de expresión de la invención,
vectores derivados de estos o los procesos de la invención pueden
comprender equivalentes funcionales para las secuencias promotor
descritas en la SEQ ID NO: 1 o 2. Las secuencias equivalentes
funcionalmente también comprenden todas las secuencias derivadas de
la cadena equivalente complementaria de las secuencias definidas
por la SEQ ID NO: 1 o 2, y tienen sustancialmente la misma actividad
del promotor. Equivalentes funcionales en relación con los
promotores de la invención significa en particular mutaciones
naturales o artificiales de las secuencias promotor descritas en la
SEQ ID NO: 1 o 2, y sus homólogos a partir de otros géneros y
especies de plantas que tendrán sustancialmente la misma actividad
del promotor.
Una actividad del promotor se refiere como la
misma sustancialmente si la transcripción de un gen particular que
se expresa bajo el control de un promotor particular derivado de la
SEQ ID NO: 1 o 2 bajo condiciones que son por otra parte iguales,
muestra una localización dentro de la planta que es al menos 50%,
preferiblemente al menos 70%, se prefiere particularmente al menos
90%, se prefiere muy particularmente al menos 95% coincidente con
una expresión comparativa obtenida utilizando un promotor descrito
por la SEQ ID NO: 1 o 2. Es posible en este caso que el nivel de
expresión difiera hacia abajo y hacia arriba de un valor de
comparación. Las secuencias preferidas a este respecto son aquellas
cuyo nivel de expresión, medido por medio del mARN transcrito o la
proteína traducida posteriormente, bajo condiciones que son por otra
parte iguales, difiere cuantitativamente por no más del 50%,
preferiblemente 25%, se prefiere particularmente 10% a partir de un
valor de comparación obtenido con un promotor descrito por la SEQ
ID NO: 1 o 2. Las secuencias preferidas particularmente son aquellas
cuyo nivel de expresión, medido por medio del mARN transcrito o la
proteína traducida posteriormente, bajo condiciones que son por
otra parte iguales, excede cuantitativamente por más del 50%,
preferiblemente 100%, se prefiere particularmente 500%, se prefiere
muy particularmente 1000% de un valor de comparación obtenido con
el promotor descrito por la SEQ ID NO: 1. El valor de comparación
preferido es el nivel de expresión del mARN natural del gen
particular o del producto del gen natural. Otro valor de comparación
preferido es el nivel de expresión obtenido con cualquier secuencia
de ácidos nucleicos definida, preferiblemente aquellas secuencias
de ácidos nucleicos que codifican para las proteínas fácilmente
cuantificables. Se da preferencia muy particularmente a este
respecto a las proteínas indicadoras (Schenborn E & Groskreutz D
(1999) Mol Biotechnol 13(1):29-44) tal como
la "proteína fluorescente verde" (GFP) (Chui W L et al.,
Curr Biol 1996, 6:325-330; Leffel S M et
al., Biotechniques. 23(5):912-8, 1997),
cloramfenicol transferasa, luciferasa (Millar et al., Plant
Mol Biol Rep 1992 10:324-414) o
\beta-galactosidasa, con preferencia muy
particular para la \beta-glucuronidasa (Jefferson
et al. (1987) EMBO J. 6:3901-3907).
Las condiciones que son por otra parte iguales
significa que la expresión iniciada por uno de los casetes de
expresión para ser comparada no se modifica por combinación con
secuencias control genéticas adicionales, por ejemplo secuencias
control. Las condiciones iguales significan que todas las
condiciones generales tal como, por ejemplo, especies de plantas,
etapa de desarrollo de la planta, condiciones de cultivo,
condiciones de ensayo (tal como solución reguladora, temperatura,
sustratos etc.) se mantienen idénticas entre las expresiones que se
comparan.
Las mutaciones comprenden sustituciones,
adiciones, deleciones, inversiones o inserciones de uno o más
residuos de nucleótidos. Así, la presente invención también
comprende por ejemplo las secuencias de ácidos nucleicos que son
obtenidas por modificación de un promotor según se muestra en la SEQ
ID NO: 1 o 2. El propósito de una modificación de este tipo puede
ser la delimitación adicional de la secuencia contenida en esta o,
por ejemplo, de otra manera la inserción de otros sitios de
división de enzima de restricción, deleción de ADN redundante o la
adición de otras secuencias, por ejemplo otras secuencias
reguladoras.
Donde las inserciones, deleciones de
sustituciones tales como, por ejemplo, son apropiadas las
transiciones y transversiones, es posible utilizar técnicas
conocidas per se, tal como mutagénesis in vitro,
reparación del cebador, restricción o ligadura. Los extremos
complementarios de los fragmentos se pueden hacer disponibles
ligando mediante manipulaciones tales como, por ejemplo, restricción
de, retro-consumo o rellenando las protrusiones
para los extremos romos. También se pueden obtener resultados
análogos utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
usando cebadores de oligonucleótidos específicos.
La identidad entre dos ácidos nucleicos
significa la identidad de la secuencia de ácidos nucleicos sobre la
longitud de la secuencia total en cada caso, que se calcula por
comparación con la ayuda del algoritmo del programa GAP (Wisconsin
Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer
Group (GCG), Madison, USA), fijando los siguientes parámetros:
- Peso Hueco: 12
- Peso Longitud: 14
- Promedio Apareamiento: 2,912
- Promedio Desapareamiento: -2,003
Por ejemplo, una secuencia que tiene una
identidad de al menos 50% basado en los ácidos nucleicos con la
secuencia de SEQ ID NO: 1 significa una secuencia que tiene una
identidad de al menos 50% en comparación con la secuencia SEQ ID
NO: 1 por el anterior programa de algoritmo con el conjunto de
parámetros de arriba.
Los equivalentes funcionales con el promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 1 preferiblemente comprenden aquellas
secuencias que tienen una identidad de al menos 80%, preferiblemente
90%, se prefiere particularmente al menos 95%, se prefiere muy
particularmente al menos 98%, más preferiblemente 99%, con la
secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 y adicionalmente exhiben
sustancialmente la misma actividad del promotor como la secuencia
mostrada en la SEQ ID NO: 1.
Los equivalentes funcionales para el promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 2 preferiblemente comprenden aquellas
secuencias que tienen una identidad de al menos 80%, preferiblemente
90%, se prefiere particularmente al menos 95%, se prefiere muy
particularmente al menos 98%, más preferiblemente 99%, a la
secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2 y adicionalmente exhiben
sustancialmente la misma actividad del promotor que la secuencia
mostrada en la SEQ ID NO: 2.
Ejemplos adicionales de las secuencias promotor
empleadas en los casetes o vectores de expresión de la invención se
pueden encontrar fácilmente por ejemplo en varios organismos cuya
secuencia genómica se conoce, tal como, por ejemplo, a partir de
Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum
tuberosum, Helianthium annuus, Linum sativum por comparaciones
de identidad en bases de datos.
El proceso para producir equivalentes
funcionales de la invención preferiblemente comprende la
introducción de mutaciones en un promotor mostrado en la SEQ ID NO:
1. Una mutagénesis puede tomar lugar aleatoriamente, en el caso que
las secuencias sometidas a mutagénesis posteriormente se protegen
por sus propiedades por un procedimiento de prueba por error. Un
criterio de selección particularmente ventajoso comprende por
ejemplo una resistencia aumentada para un marcador de selección, el
nivel de la expresión resultante de la secuencia de ácidos nucleicos
introducida.
En otra modalidad de la invención es posible que
los elementos reguladores esenciales de los promotores de la
invención para ser aislados de una manera dirigida y empleada como
tal o en combinación con otros elementos reguladores. Por
consiguiente, un aspecto de la invención comprende los equivalentes
funcionales del promotor mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2 que
comprenden al menos 25, preferiblemente al menos 50, se prefiere
particularmente al menos 100, se prefiere muy particularmente al
menos 200, más preferiblemente al menos 400 nucleótidos consecutivos
de las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 1 o 2 y tienen
sustancialmente la misma actividad del promotor que el promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2.
Alternativamente, las secuencias no esenciales
de uno de los promotores de la invención pueden ser suprimidas sin
deteriorar significantemente las propiedades mencionadas. Otro
aspecto de la invención por consecuencia comprende los fragmentos
equivalentes funcionalmente de una de las secuencias promotor de la
invención que tienen al menos 25, preferiblemente al menos 50, se
prefiere particularmente al menos 100, se prefiere muy
particularmente al menos 200, más preferiblemente al menos 400
nucleótidos consecutivos de una de las secuencias promotor de la
invención y tienen sustancialmente la misma actividad del promotor
que el promotor mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2.
La delimitación de la secuencia promotor para
las particulares regiones reguladoras esenciales también se puede
abordar con la ayuda de una rutina de investigación para investigar
a los elementos promotores. Con frecuencia, los elementos
promotores particulares se presentan en grandes números en las
regiones relevantes para la actividad del promotor. Este análisis
se puede abordar por ejemplo usando programas de ordenador tal como
el programa PLACE ("Plant Cis-acting Regulatory
ADN Elements") (Higo K et al. (1999) Nucleic Acids Res
27:1, 297-300) o la base de datos BIOBASE
"Transfac" (Biologische Datenbanken GmbH, Braunschweig).
Los procesos para la mutagénesis de las
secuencias de ácidos nucleicos son conocidos por trabajadores
expertos e incluyen a modo de ejemplo el uso de oligonucleótidos
que tienen una o más mutaciones comparadas con la región que se va
a mutar (por ejemplo dentro del esqueleto de una mutagénesis de
sitio específico). Los cebadores que tienen aproximadamente 15 a
aproximadamente 75 nucleótidos o más, se emplean típicamente, con
preferiblemente cerca de 10 a aproximadamente 25 o más residuos de
nucleótido que se localizan en ambos lados de la secuencia que será
modificada. Los detalles y el procedimiento para dichos procesos de
mutagénesis son familiares para los trabajadores expertos (Kunkel
et al. (1987) Methods Enzymol 154:367-382;
Tomic et al. (1990) Nucl Acids Res 12:1656; Upender et
al. (1995) Biotechniques 18(1):29-30;
U.S. Pat. No. 4,237,224). Una mutagénesis también se puede lograr
por el tratamiento de, por ejemplo, vectores que comprenden una de
las secuencias de ácidos nucleicos de la invención con agentes de
mutagénisis tal como hidroxilamina.
Las secuencias de ácidos nucleicos que se
presentan en los casetes de expresión de la invención y que se
expresan transgénicamente, se pueden unir funcionalmente a otras
secuencias control genéticas además de uno de los promotores de la
invención.
Un enlace funcional significa por ejemplo
configuración secuencial de un promotor, de la secuencia de ácidos
nucleicos que se expresan transgénicamente y, si es apropiado, otros
elementos reguladores tal como, por ejemplo, una terminación de tal
manera que cada uno de los elementos reguladores es capaz de cumplir
a cabalidad su función en la expresión transgénica de la secuencia
de ácidos nucleicos, dependiendo de la configuración de las
secuencias de ácidos nucleicos para dar el ARN sentido o
antisentido. Un enlace directo en el sentido químico no es
absolutamente necesario para este. Las secuencias control genéticas
tal como, por ejemplo, secuencias control también son capaces de
aplicar su función a partir de las posiciones remotas o aún de otras
moléculas de ADN en la secuencia diana. Las configuraciones
preferidas son aquellas en las cuales la secuencia de ácidos
nucleicos que se expresa transgénicamente se sitúa detrás de la
secuencia que actúa como promotor, así que las dos secuencias se
unen covalentemente juntas. En esta conexión, la distancia entre la
secuencia promotor y la secuencia de ácidos nucleicos que se
expresa transgénicamente es preferiblemente menos de 200 pares de
bases, se prefiere particularmente menos de 100 pares de bases, se
prefiere muy particularmente menos de 50 pares de bases.
La producción de un enlace funcional se puede
lograr utilizando técnicas de recombinación y clonación
convencionales según lo descrito por ejemplo en Maniatis T et
al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. and in Silhavy T J et
al. (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. y en Ausubel F M et al.
(1987) Current Protocols en Molecular Biology, Greene Publishing
Assoc. and Wiley Interscience. Sin embargo, otras secuencias que
tienen por ejemplo la función de un enlace con sitios de división
de enzima de restricción particular o de un péptido único también
se puede situar entre las dos secuencias. La inserción de las
secuencias también puede conducir a la expresión de proteínas de
fusión.
El término secuencias control genéticas debe ser
entendido en general y significa todas las secuencias que tienen
una influencia en proporcionar la existencia de la función del
casete de expresión transgénica de la invención. Las secuencias
control genéticas modifican por ejemplo la transcripción y
traducción en organismos procariotas o eucariotas. Los casetes de
expresión de la invención preferiblemente abarcan como secuencia
control genética adicional uno de los promotores de la invención en
dirección 5' de la secuencia particular de ácidos nucleicos que se
expresa transgénicamente, y una secuencia de terminación en
dirección 3', y si es apropiado otros elementos reguladores
comunes, en cada caso funcionalmente ligados a la secuencia de
ácidos nucleicos que se expresan transgénicamente.
Las secuencias control genéticas también
comprenden además promotores, elementos promotores o promotores
mínimos que son capaces de modificar la propiedades que controlan
la expresión. Es posible de esta manera por ejemplo a través de las
secuencias control genéticas para la expresión de tejido específico
tomar lugar además en dependencia de factores de estrés particular.
Los elementos correspondientes se describen por ejemplo por estrés
hídrico, ácido abscísico (Lam E y Chua N H, (1991) J Biol Chem
266(26):17131-17135) y estrés por calor
(Schoffl F et al. (1989) Mol Gen Genetics
217(2-3):246-53).
Una posibilidad adicional es para otros
promotores que hacen posible la expresión en más tejidos vegetales
o en otros organismos tal como, por ejemplo, bacteria E. coli
que se une funcionalmente a la secuencia de ácidos nucleicos que se
expresa. Apropiados promotores de plantas son en principio todos los
promotores descritos arriba. Es concebible por ejemplo que una
secuencia de ácidos nucleicos particular se describe por un promotor
(por ejemplo uno de los promotores de la invención) en un tejido
vegetal como ARN sentido y se traduce en la proteína
correspondiente, mientras la misma secuencia de ácidos nucleicos se
transcribe por otro promotor con una diferente especificidad en un
tejido diferente en ARN antisentido, y la proteína correspondiente
inhibe la expresión. Esto se puede implementar por un casete de
expresión de la invención por el promotor que se sitúa delante de
la secuencia de ácidos nucleicos que se expresan transgénicamente, y
el otro promotor detrás.
Las secuencias control genéticas además
comprenden también la región 5'-no traducida,
intrones o la región 3' no codificada de los genes, preferiblemente
del gen pFD y/o del gen OASTL. Se ha mostrado que las regiones no
traducidas pueden jugar una función significante en la regulación de
la expresión del gen. Así, se ha demostrado que las secuencias
5'-no traducidas pueden mejorar la expresión
transitoria de genes heterólogos. Pueden además promover la
especificidad del tejido (Rouster J et al. (1998) Plant J.
15:435-440.). Inversamente, la región
5'-no traducida del gen opaco-2
suprime la expresión. La deleción de la región correspondiente
conduce a un incremento en la actividad del gen (Lohmer S et
al. (1993) Plant Cell 5:65-73). La secuencia de
ácidos nucleicos indicada bajo SEQ ID NO: 2 comprende el segmento
del gen FD y del gen OASTL que representa el promotor y la región
5'-no traducida hasta el codón inicial ATG de la
proteína respectiva. Un intrón esta presente en la región 5' no
traducida del gen OASTL, como se puede comprobar por la estructura
de los clones de cADN. Los límites del intrón se localizan a 14 bp
(lado 3' del intrón) y 281 bp (lado 5' del intrón). La numeración
de los pares de bases correspondientes a la numeración del promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 2. El intrón tiene una fuerte función que
promueve la expresión en ambas direcciones de la transcripción. La
razón de esto podría ser la existencia de un mejorador en esta
región.
En una modalidad preferida, por consecuencia, el
promotor bidireccional de la invención se describe por la secuencia
mostrada en la SEQ ID NO: 2 o por las secuencias que tienen una
identidad de al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, se
prefiere particularmente al menos 95%, se prefiere muy
particularmente al menos 98%, más preferiblemente al menos 99% a la
secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2.
Otras secuencias 5'-no
traducidas e intrones con la función que promueve la expresión son
conocidos por los trabajadores expertos. McElroy y coworkers
(McElroy et al. (1991) Mol Gen Genet
231(1):150-160) reportaron en una
construcción basado en el promotor actina 1 (Act1) del arroz para
transformar las plantas monocotiledóneas. El uso del intrón Act1 en
combinación con el promotor 35S en células de arroz transgénico
conduce a un índice de expresión que se incrementó
diez-veces comparado con el promotor 35S aislado. La
optimización del ambiente de la secuencia del sitio de iniciación
de la traducción del gen indicador (GUS) resultó en un incremento
de cuatro-veces en la expresión GUS en las células
de arroz transformadas. La combinación del sitio de iniciación de
la traducción optimizada y del intrón Act1 resultó en un incremento
de 40-veces en la expresión GUS por el promotor
CaMV 35S en las células de arroz transformadas; resultados similares
se han obtenido con células de maíz transformadas. Total, se
concluyó de las investigaciones descritas arriba, que los vectores
de expresión basadas en el promotor Act1 son apropiados para
controlar la expresión suficientemente fuerte y constitutiva de ADN
extraño en células de plantas monocotiledóneas transformadas.
El casete de expresión puede comprender una o
más así llamadas secuencias control funcionalmente unidas al
promotor, que hace posible aumentar la expresión transgénica de la
secuencia de ácidos nucleicos. También es posible insertar las
secuencias ventajosas adicionales, tal como otros elementos
reguladores o de terminación, en el extremo 3' de las secuencias de
ácidos nucleicos que se expresan transgénicamente. Las secuencias de
ácidos nucleicos que se expresan transgénicamente pueden estar en
una o más copias en uno de los casetes de expresión de la
invención.
Las secuencias control adicionalmente significan
aquellas que hacen posible la recombinación o inserción homóloga en
el genoma de un organismo huésped o que permiten la deleción del
genoma. Es posible en la recombinación homóloga por ejemplo para el
promotor natural de un gen particular que se reemplazará por uno de
los promotores de la invención. Los métodos tales como la
tecnología creaox permiten la deleción
tejido-específico, la cual es inducible en algunas
circunstancias, del casete de expresión a partir del genoma del
organismo huésped (Sauer B. (1998) Methods.
14(4):381-92). En este caso, secuencias
flanqueantes particulares se ligan (secuencias lox) al gen diana y
posteriormente se hace posible la deleción por medio de
recombinasa-cre.
El promotor que se introducirá se puede colocar
por medio de recombinación homóloga delante del gen diana que se
expresa transgénicamente ligando el promotor a las secuencias de ADN
que son, por ejemplo, secuencias homólogas a endógenas que preceden
el marco de lectura del gen diana. Tales secuencias se deben
considerar como secuencias control genéticas. Después de que una
célula ha sido transformada con la construcción de ADN apropiado,
las dos secuencias homólogas pueden interactuar y de esta manera
colocar la secuencia promotor en el sitio deseado delante del gen
diana, así que la secuencia promotor ahora se une funcionalmente al
gen diana y forma un casete de expresión de la invención. La
selección de las secuencias homólogas determina el sitio de la
inserción del promotor. Es posible en este caso que el casete de
expresión sea generado por recombinación homóloga por medio de
recombinación recíproca sencilla o doble. En la recombinación
recíproca sencilla hay uso de solamente una secuencia de
recombinación sencilla, y se inserta el ADN introducido completo. En
la recombinación recíproca doble el ADN que se introduce se
flanquea por dos secuencias homólogas, y la región flanqueante se
inserta. El último proceso es apropiado para reemplazar, según lo
descrito arriba, el promotor natural de un gen particular por uno
de los promotores de la invención y de esta manera modificar la
localización y medir el tiempo de la expresión del gen. Este enlace
funcional representa un casete de expresión de la invención.
Para seleccionar con éxito las células
recombinadas homólogamente o transformadas de otra manera es
generalmente necesario además introducir un marcador seleccionable.
Varios marcadores apropiados se mencionan abajo. El marcador de
selección permite la selección de transformadas de células no
transformadas. La recombinación homóloga es un evento relativamente
raro en eucariotas superiores, especialmente en plantas. Las
integraciones al azar en el genoma huésped predominante. Una
posibilidad de deleción de secuencias integradas aleatoriamente y
de esta manera enriquecer los clones celulares que tienen una
recombinación homóloga correcta consiste en usar un sistema de
recombinación secuencia-específica según lo descrito
en la Patente U.S. No. 6,110,736.
Las señales de poliadenilación apropiadas como
secuencias control son señales de poliadenilación vegetal y -
preferiblemente - aquellas a partir del Agrobacterium
tumefaciens. En una modalidad preferida particularmente, el
casete de expresión comprende una secuencia de terminación que es
funcional en las plantas. Las secuencias de terminación que son
funcionales en plantas significan en general secuencias capaces de
producir la terminación de la transcripción de una secuencia de ADN
en plantas. Ejemplos de secuencias de terminación apropiadas son la
terminación OCS (octopina sintasa) y la terminación NOS (nopalina
sintasa). Sin embargo, se prefieren particularmente las secuencias
de terminación de plantas. Las secuencias de terminación de plantas
significan en general secuencias que son un constituyente de un gen
vegetal natural. Se da particular preferencia a este respecto a la
terminación del gen inhibidor catepsina D de la patata (GenBank
Acc. No.: X74985) o de la terminación del gen de la proteína del
almacenamiento de alubia de campo VfLEIB3 (GenBank Acc. No.:
Z26489). Estas terminaciones son al menos equivalentes a las
terminaciones virales o T-ADN descritas en el
oficio.
El trabajador experto está consciente de un gran
número de ácidos nucleicos y proteínas cuya expresión recombinante
es ventajosa bajo el control de los casetes de expresión o los
procesos de la invención. Los trabajadores expertos adicionalmente
están conscientes de una gran cantidad de genes a través de cuya
represión o cambio completo por medio de la expresión de un ARN
antisentido apropiado es posible así mismo lograr efectos
ventajosos. Ejemplos no-restrictivos de efectos
ventajosos que pueden ser mencionados son:
- facilitar la producción de un organismo
transgénico por ejemplo a través de la expresión de marcadores de
selección
- lograr la resistencia a factores de estrés
abiótico (calor, frío, aridez, incremento de la humedad, toxinas
ambientales, radiación UV)
- lograr la resistencia a factores de estrés
bióticos (patógenos, virus, insectos y enfermedades)
- mejora de las propiedades en alimento humano o
animal
- mejora en la velocidad de crecimiento de la
producción.
Algunos ejemplos de ácidos nucleicos cuya
expresión proporciona los deseados efectos ventajosos se pueden
mencionar abajo:
El marcador de selección abarca los marcadores
de selección positivos que confieren resistencia a un antibiótico,
herbicida o biocida, y los marcadores de selección negativos que
confieren sensibilidad al último exactamente, y los marcadores que
proporcionan los organismos transformados con una ventaja de
crecimiento (por ejemplo a través de expresión de genes clave de la
biosíntesis de la citoquina; Ebinuma H et al. (2000) Proc
Natl Acad Sci USA 94:2117-2121). En el caso de
selección positiva, solamente prosperan los organismos que expresan
el correspondiente marcador de selección, mientras que en el caso de
selección negativa es precisamente estos los que perecen. El uso de
un marcador de selección positivo es preferido en la producción de
plantas transgénicas. Adicionalmente se prefiere utilizar
marcadores de selección que confieren ventajas en el crecimiento.
Los marcadores de selección negativos se pueden utilizar
ventajosamente si la intención es suprimir los genes particulares o
secciones del genoma de un organismo (por ejemplo como parte de un
proceso de cruzamiento).
El marcador seleccionable introducido con el
casete de expresión confiere resistencia a un biocida (por ejemplo
un herbicida tal como fosfinotricina, glifosato o bromoxinilo), un
inhibidor de metabolismo tal como 2-deoxiglucosa
6-fosfato (WO 98/45456) o un antibiótico tal como,
por ejemplo, kanamicina, G 418, bleomicina, higromicina, en las
células recombinadas o transformadas con éxito. El marcador de
selección permite la selección de células transformadas a partir de
células transformadas de no transformadas (McCormick et al.
(1986) Plant Cell Rep 5:81-84). Los marcadores de
selección preferidos particularmente son aquellos que confieren
resistencia a los herbicidas. El trabajador experto es consciente
de numerosos marcadores de selección de este tipo y las secuencias
codificadas por estos. Los ejemplos no-restrictivos
se pueden mencionar abajo:
El marcador seleccionable introducido con el
casete de expresión confiere resistencia a un biocida (por ejemplo
un herbicida tal como fosfinotricina, glifosato o bromoxinilo), un
inhibidor de metabolismo tal como 2-deoxiglucosa
6-fosfato (WO 98/45456) o un antibiótico tal como,
por ejemplo, tetraciclina, ampicilina, kanamicina, G 418,
neomicina, bleomicina o higromicina, en las células transformadas
con éxito. El marcador de selección permite la selección de células
transformadas a partir de no transformadas (McCormick et al.
(1986) Plant Cell Rep 5:81-84). Los marcadores de
selección preferidos particularmente son aquellos que confieren
resistencia a los herbicidas. Ejemplos de marcadores de selección
que pueden ser mencionados son:
- secuencias de ADN que se codifican por
fosfinotricina acetiltransferasas (PAT; también llamado gen de
resistencia bialofos (bar)) y producen desintoxicación del
herbicida fosfinotricina (PPT) (de Block et al. (1987) EMBO
J 6:2513-2518). Apropiados genes bar se pueden
aislar de, por ejemplo, Streptomyces hygroscopicus o S.
viridochromogenes. Las secuencias correspondientes son
conocidas por trabajadores expertos (GenBank Acc. No.: X17220,
X05822, M22827, X65195; Patente U.S. No. 5,489,520). También se
describen los genes sintéticos por ejemplo para la expresión en
plastidios AJ028212. Un gen Pat sintético se describe en Becker
et al. (1994) Plant J 5:299-307. Los genes
confieren resistencia al herbicida bialofos y son un marcador
ampliamente usado en plantas transgénicas (Vickers J E et
al. (1996) Plant Mol Biol Rep 14:363-368;
Thompson C J et al. (1987) EMBO J
6:2519-2523).
6:2519-2523).
- Los genes
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (genes EPSP sintasa) que confieren resistencia al glifosato
(N-(fosfonometil) glicina) (Steinrucken H C et al. (1980)
Biochem Biophys Res Commun 94:1207-1212; Levin J G
y Sprinson D B (1964) J Biol Chem 239:1142-1150;
Cole D J (1985) Mode of action of glyphosate; A literature
analysis, p. 48-74. In: Grossbard E and Atkinson D
(eds.). El herbicida glifosato. Buttersworths, Boston.). Las
variantes de la tolerancia del glifosato EPSPS se utilizan
preferiblemente como marcadores de selección (Padgette S R et
al. (1996). Nuevas oportunidades de control de maleza:
desarrollo de soja con un gen Roundup Ready.TM. En: Herbicide
Resistant Crops (Duke S O ed.), pp. 53-84. CRC
Press, Boca Raton, Fla.; Saroha M K und Malik V S (1998) J Plant
Biochem Biotechnol 7:65-72). El gen EPSPS de la cepa
CP4 del Agrobacterium sp. tiene una tolerancia al glifosato
natural que se puede transferir a plantas transgénicas apropiadas
(Padgette S R et al. (1995) Crop Science
35(5):1451-1461). Las
5-Enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasas que son tolerantes al glifosato se describen por ejemplo
en la Patente U.S. No. 5,510,471; Patente U.S. No. 5,776,760;
Patente U.S. No. 5,864,425; Patente U.S. No. 5,633,435; Patente
U.S. No. 5,627,061; Patente U.S. No. 5,463,175; EP 0 218 57 Otras
secuencias se describen bajo GenBank Accession X63374.
Adicionalmente se prefiere el gen aroA (Ml 0947).
- el gen gox (óxido reductasa glifosato de
Achromobacter sp.) codificado por las enzimas que degradan el
glifosato. GOX puede conferir resistencia al glifosato (Padgette S
R et al. (1996) J Nutr. 126(3):702-16;
Shah D et al. (1986) Science 233:
478-481).
- el gen deh (codificado por una dehalogenasa
que inactiva el dalapon), (GenBank Acc. No.: AX022822, AX022820 y
WO99/27116)
- los genes bxn que se codifican por las enzimas
nitralasa que degradan el bromoxinilo. Por ejemplo la nitralasa de
Klebsiella ozanenae. Las secuencias deben ser encontradas en
GenBank por ejemplo bajo el Acc. No: E01313 y J03196.
- neomicina fosfotransferasas confieren
resistencia a los antibióticos (aminoglicósidos) tal como neomicina,
G418, higromicina, paromonicina o kanamicina reduciendo su efecto
de inhibición a través de una reacción de fosforilación. El gen
nptII se prefiere particularmente. Las secuencias se pueden obtener
del GenBank (AF080390 minitransposon mTn5-GNm;
AF080389 minitransposon mTn5-Nm, secuencia
completa). Además, el gen ya es un componente de numerosos vectores
de expresión y se puede aislar de estos utilizando los procesos
familiares a los trabajadores expertos (tal como, por ejemplo,
reacción en cadena de la polimerasa) (AF234316
pCAMBIA-2301; AF234315 pCAMBIA-2300,
AF234314 pCAMBIA-2201). El gen NPTII codifica para
una aminoglicosido 3'O-fosfotransferasa de la E.
coli, Tn5 (GenBank Acc. No: U00004 Posición
1401-2300; Beck et al. (1982) Gene 19
327-336).
- el gen DOG^{R} El gen DOG^{R}1 se aisló de
la levadura Saccharomyces cerevisiae (EP 0 807 836).
Codificado por una
2-deoxiglucosa-6-fosfato
fosfatasa que confiere resistencia al 2-DOG
(Randez-Gil et al. 1995, Yeast 11,
1233-1240; Sanz et al. (1994) Yeast
10:1195-1202, secuencia: GenBank Acc. No.: NC001140
cromosoma VIII, Saccharomyces cervisiae position
194799-194056).
- acetolactato sintasas que inactivan la
sulfonilurea - e imidazolinona- que confieren resistencia a los
herbicidas imidazolinona/sulfonilurea. Apropiados ejemplos son las
secuencias depositadas bajo GenBank Acc No.: X51514 para el gen
Arabidopsis thaliana Csr 2 (EC 4.3.18) (Sathasivan K et
al. (1990) Nucleic Acids Res. 18(8):2188). Las
acetolactato sintasas que confieren resistencia a los herbicidas de
imidazolinona también se describen bajo GenBank Acc. No.: AB049823,
AF094326, X07645, X07644, A19547, A19546, A19545, I05376, I05373,
AL133315.
- higromicina fosfotransferasas (X74325 gen
P. pseudomallei para higromicina fosfotransferasa) que
confieren resistencia al antibiótico higromicina. El gen es un
constituyente de numerosos vectores de expresión y se puede aislar
de estos utilizando procesos familiares a los trabajadores expertos
(tal como, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa)
(AF294981 pINDEX4; AF234301 pCAMBIA-1380; AF234300
pCAMBIA-1304; AF234299 pCAMBIA-1303;
AF234298 pCAMBIA-1302; AF354046
pCAMBIA-1305; AF354045
pCAMBIA-1305.1)
- Genes de resistencia para
a) cloramfenicol (cloramfenicol
acetiltransferasa),
b) tetraciclina, varios genes de resistencia se
describen, por ejemplo Genes tetA y tetR de ordonez X65876 S. clase
D para la resistencia a la tetraciclina y el gen de resistencia a la
tetraciclina de las proteínas represor X51366 Bacillus
cereus plasmid pBC16. Además, el gen ya es un constituyente de
numerosos vectores de expresión y se puede aislar de estos
utilizando procesos familiares a los trabajadores expertos (tal
como, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa)
c) estreptomicina, varios genes de resistencia
se describen, por ejemplo con el gen de la hormiga
Corynebacterium acetoacidophilum GenBank Acc. No.: AJ278607
para estreptomicina adenililtransferasa.
d) zeocina, el correspondiente gen de
resistencia es un constituyente de numerosos vectores de clonación
(por ejemplo L36849 cloning vector pZEO) y se puede aislar de estos
utilizando procesos familiares a los trabajadores expertos (tal
como, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa).
e) ampicilina (gen
\beta-lactamasa; Datta N, Richmond M H. (1966)
Biochem J. 98(1):204-9; Heffron F et
al (1975) J. Bacteriol 122: 250-256; el gen Amp
primero fue clonado para preparar el vector de E. coli
pBR322; Bolivar F et al. (1977) Gene
2:95-114). La secuencia es un constituyente de
numerosos vectores de clonación y se puede aislar de estos
utilizando procesos familiares a los trabajadores expertos (tal
como, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa).
- Los genes tal como la isopenteniltransferasa
del Agrobacterium tumefaciens (cepa:PO22) (Genbank
Acc. No.: AB025109). El gen ipt es una enzima clave en la
biosíntesis de la citoquina. La sobre expresión de estos facilita
la regeneración de plantas (por ejemplo selección en medio libre de
citoquina). El proceso para utilizar el gen ipt se describe
(Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA
94:2117-2121; Ebinuma H et al. (2000)
Selección de las plantas transgénicas libres de marcador utilizando
los onco-genes (ipt, rol A, B, C) del Agrobacterium
como marcadores seleccionables, In Molecular Biology of Woody
Plants. Kluwer Academic Publishers).
Varios otros marcadores de selección positivos
que confieren una ventaja de crecimiento en las plantas
transformadas comparadas con las no transformadas, y los procesos
para su uso se describen inter alia en EP-A 0
601 092. Ejemplos que podrían ser mencionados son
\beta-glucuronidasa (en conjunción con, por
ejemplo, citoquinina glucorinida),
manosa-6-fosfato isomerasa (en
conjunción con manosa), UDP-galactosa
4-epimerasa (en conjunción con, por ejemplo,
galactosa), con la preferencia particular para
manosa-6-fosfato isomerasa en
conjunción con manosa.
Los marcadores de selección negativos permiten
por ejemplo seleccionar organismos con secuencias suprimidas con
éxito que contienen el gen marcador (Koprek T et al. (1999)
Plant J 19(6):719-726). En el caso de
selección negativa, por ejemplo un compuesto que no tiene de otra
manera ningún efecto desventajoso para la planta se convierte en un
compuesto que tiene un efecto desventajoso por el marcador de
selección negativo introducido en la planta. También son apropiados
los genes que per se tienen un efecto desventajoso, tales
como, por ejemplo, timidina quinasa (TK), fragmento toxina A de
difteria (DT-A), el producto del gen codA codificado
por una citosina deaminasa (Gleave A P et al. (1999) Plant
Mol Biol. 40(2):223-35; Perera R J et
al. (1993) Plant Mol. Biol 23(4):
793-799; Stougaard J (1993) Plant J
3:755-761), el gen P450citocromo (Koprek et
al. (1999) Plant J 16:719-726), los genes
codificados por un haloalcano dehalogenasa (Naested H (1999) Plant J
18:571-576), el gen iaaH (Sundaresan V et
al. (1995) Genes & Development 9:1797-1810)
o el gen tms2 (Fedoroff N V & Smith D L (1993) Plant J
3:273-289).
Las concentraciones usadas en cada caso para la
selección de antibióticos, herbicidas, biocidas o toxinas se deben
adaptar a las condiciones u organismos particulares de la prueba.
Ejemplos que se pueden mencionar para las plantas son kanamicina
(Km) 50 mgA, higromicina B 40 mg/l, fosfinotricina (ppt) 6 mgA.
También es posible expresar análogos funcionales
de dichos ácidos nucleicos codificados por marcadores de selección.
Los análogos funcionales significan a este respecto todas las
secuencias que tienen sustancialmente la mismo función, i.e. son
capaces de seleccionar organismos transformados. Es además
perfectamente posible para el análogo funcional diferir en otras
características. Puede por ejemplo tener una actividad mayor o
menor o de otra manera poseer otras funcionabilidades.
2. Protección mejorada de la planta contra
factores de estrés abióticos tal como aridez, calor, o frío por
ejemplo a través de sobre expresión de polipéptidos anticongelantes
del Myoxocephalus Scorpius (WO 00/00512), Myoxocephalus
octodecemspinosus, el activador de transcripción CBF1 de
Arabidopsis thaliana, glutamato dehidrogenasas (WO 97/12983,
WO 98/11240), dependientes de los genes de calcio proteína quinasa
(WO 98/26045), calcineurinas (WO 99/05902), farnesiltransferasas
(WO 99/06580), Pei Z M et al., Science 1998, 282:
287-290), ferritina (Deak M et al., Nature
Biotechnology 1999, 17:192-196), oxalato oxidasa (WO
99/04013; Dunwell J M Biotechnology y Genetic Engeneering Reviews
1998, 15:1-32), factor DREB1A (dehydration response
elemento B 1A; Kasuga M et al., Nature Biotechnology 1999,
17:276-286), genes de manitol o síntesis de
trehalosa tal como trehalosa-fosfato sintasa o
trehalosa-fosfato fosfatasa (WO 97/42326), o
inhibición de los genes tal como de trehalasa (WO 97/50561). Los
ácidos nucleicos preferidos particularmente son aquellos codificados
por el activador transcripcional CBF1 a partir del Arabidopsis
thaliana (GenBank Acc. No.: U77378) de la proteína
anticongelante del Myoxocephalus octodecemspinosus (GenBank
Acc. No.: AF306348) o equivalentes funcionales de estos.
3. Expresión de enzimas metabólicas para
utilizar en los sectores de alimento animal y humano, por ejemplo
la expresión de fitasa y celulasas. Se da particular preferencia a
los ácidos nucleicos tal como el cADN artificial codificado por un
fitasa microbiana (GenBank Acc. No.: A19451) o equivalentes
funcionales de estos.
4. Lograr la resistencia por ejemplo a hongos,
insectos, nematodos y enfermedades a través de la secreción o
acumulación dirigida de metabolitos o proteínas particulares en la
epidermis del embrión. Ejemplos que pueden ser mencionados son los
glucosinolatos (defensa contra herbívoros), quitinasas o glucanasas
y otras enzimas que destruyen la pared celular de los parásitos,
las proteínas que inactivan los ribosomas (RIPs) y otras proteínas
de la resistencia de las plantas y respuestas de estrés, como se
inducen en lesión o ataque microbiano de plantas o químicamente
por, por ejemplo, ácido salicílico, ácido jasmónico o etileno,
lisozimas a partir de fuentes no-vegetales tal
como, por ejemplo, lisozima T4 o lisozima de varios mamíferos,
proteínas insecticidas tal como endotoxina del Bacillus
thuringiensis, inhibidor \alpha-amilasa o
inhibidores de proteasa (inhibidor tripsina cowpea), glucanasas,
lecitinas tal como fitohemaglutinina, aglutinina de germen de trigo,
RNAsas o ribozimas. Los ácidos nucleicos preferidos particularmente
son aquellos codificados por la endoquitinasa chit42 a partir del
Trichoderma harzianum (GenBank Acc. No.: S78423) o para la
N-hidroxilación, proteínas (CYP79)
P-450 citocromo multifuncionales a partir del Sorgo
bicolor (GenBank Acc. No.: U32624) o equivalentes funcionales de
estos.
5. La acumulación de glucosinolatos en plantas
del género Cardales, especialmente las semillas de aceite para
proteger de las plagas (Rask L et al. (2000) Plant Mol Biol
42:93-113; Menard R et al. (1999)
Phytochemistry 52:29-35), la expresión de la
endotoxina Bacillus thuringiensis bajo el control del
promotor 35S CaMV (Vaeck et al. (1987) Nature
328:33-37) o protección del tabaco contra el ataque
de hongos por expresión de una quitinasa de alubia bajo el control
del promotor CaMV (Broglie et al. (1991) Science
254:1194-119, se conoce.
La expresión de los genes cryIA(b) y
cryIA(c) sintéticos que se codifican por el
lepidoptera-específico
delta-endotoxinas del Bacillus thuringiensis
puede producir resistencia a plagas de insectos en varias plantas.
Así, es posible lograr la resistencia en arroz a dos de las
principales plagas del arroz, el barrenador rayado del tallo
(Chilo suppressalis) y el barrenador amarillo del tallo
(Scirpophaga incertulas) (Cheng X et al. (1998) Proc
Natl Acad Sci USA 95(6):2767-2772; Nayak P
et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA
94(6):2111-2116).
5. Expresión de genes que producen la
acumulación de productos químicos finos tal como de tocoferoles,
tocotrienoles o carotenos. Un ejemplo que puede ser mencionado es
fitoeno desaturasa. Los ácidos nucleicos que se codifican por la
fitoeno desaturasa del Narcissus pseudonarcissus (GenBank
Acc. No.: X78815) o se prefieren equivalentes funcionales de
estos.
6. Producción de nutracéuticos tal como, por
ejemplo, ácidos grasos poliinsaturados tal como, por ejemplo, ácido
araquidónico o EP (ácido eicosapentaenoico) o DHA (ácido
docosahexaenoico) por expresión de elongasas y/o desaturasas de
ácidos grasos o producción de proteínas que tienen un valor
nutricional mejorado tal como, por ejemplo, que tienen un alto
contenido de amionoácidos esenciales (por ejemplo el gen de albúmina
2S rico en metionina de la nuez del Brasil). Los ácidos nucleicos
preferidos son aquellos que se codifican por el albúmina 2S rico en
metionina a partir del Bertholletia excelsa (GenBank Acc.
No.: AB044391), la \Delta6-acillipid desaturasa
del Physcomitrella patens (GenBank Acc. No.: AJ222980; Girke
et al. (1998) Plant J 15:3948), la
\Delta6-desaturasa del Mortierelia alpina
(Sakuradani et al. (1999) Gene 238:445-453),
la \Delta5-desaturasa del Caenorhabditis
elegans (Michaelson et al. 1998, FEBS Letters
439:215-218), la \Delta5-ácido graso desaturasa
(des-5) del Caenorhabditis elegans (GenBank
Acc. No.: AF078796), la \Delta5-desaturasa del
Mortierella alpina (Michaelson et al. J Biol Chem
273:19055-19059), la
\Delta6-elongasa del Caenorhabditis elegans
(Beaudoin et al. (2000) Proc Natl. Acad Sci USA
97:6421-6426), la \Delta6-elongasa
del Physcomitrella patens (Zank et al. (2000)
Biochemical Society Transactions 28:654-657) o
equivalentes funcionales de estos.
7. Producción de productos químicos finos (tal
como, por ejemplo, enzimas) y farmacéuticos (tal como, por ejemplo,
anticuerpos o vacunas según lo descrito en Hood E E, Jilka J M.
(1999) Curr Opin Biotechnol. 10(4):382-6; Ma
J K, Vine N D (1999) Curr Top Microbiol Immunol
236:275-92). Ha sido posible por ejemplo producir
avidina recombinante del huevo de gallina blanco y
\beta-glucuronidasa bacteriana (GUS) a gran escala
en plantas transgénicas de maíz (Hood et al. (1999) Adv Exp
Med Biol 464:127-47). Estas proteínas recombinantes
de las plantas de maíz se comercializan como productos bioquímicos
de alta pureza por Sigma Chemicals Co.
8. Lograr un incremento de habilidad de
almacenamiento en células que normalmente contienen pocas proteínas
o lípidos de almacenamiento con el propósito de aumentar la
producción de estas sustancias, por ejemplo por la expresión de una
acetil-CoA carboxilasa. Los ácidos nucleicos
preferidos son aquellos que se codifican por la
acetil-CoA carboxilasa (accase) del Medicago sativa
(GenBank Acc. No.: L25042) o equivalentes funcionales de
estos.
estos.
Otros ejemplos de genes ventajosos se mencionan
por ejemplo en Dunwell J M (2000) J Exp Bot. 51 Spec No:
487-96.
También es posible expresar análogos funcionales
de dichos ácidos nucleicos y proteínas. Los análogos funcionales
significan a este respecto todas las secuencias que tienen
sustancialmente la misma función, i.e. son capaces de la función
(por ejemplo una conversión del sustrato o la transducción señal)
como la mencionada proteína por medio de ejemplo también. Además es
perfectamente posible para el análogo funcional diferir en otras
características. Puede tener por ejemplo una actividad superior o
inferior o de otra manera poseer otras funcionabilidades. Los
análogos funcionales también significan secuencias que se codifican
para las proteínas de fusión que consisten de una de las proteínas
preferidas y otras proteínas, por ejemplo una proteína preferida
adicional o de otra manera una secuencia de péptido señal.
La expresión de los ácidos nucleicos bajo el
control de los promotores de la invención es posible en cualquier
compartimiento celular deseado tal como, por ejemplo, el sistema de
endomembrana, la vacuola y los cloroplastos. Las reacciones de
glicosilación, especialmente plegamientos y similares, son posibles
utilizando la ruta secretora. La secreción de la proteína diana en
la superficie celular o secreción en el medio de cultivo, por
ejemplo en el uso de células o protoplastos cultivadas en
suspensión, también es posible. Las secuencias diana necesarias
para este propósito se pueden considerar de esta manera en
variaciones del vector individual y ser introducidas, junto con el
gen diana que se clonarán, en el vector a través del uso de una
apropiada estrategia de clonación. Es posible utilizar como
secuencias diana tanto el gen-intrínseco, donde este
presente, como secuencias heterólogas. Las secuencias heterólogas
adicionales que se prefieren para el enlace funcional, pero no
restringido a este, son secuencias diana adicionales para asegurar
la localización subcelular en apoplastos, en la vacuola, en
plastidios, en la mitocondria, en el retículo endoplasmático (ER),
en el núcleo celular, en elaioplastos u otros compartimientos; y
mejoradores de la traducción tal como la secuencia líder 5' del
virus del mosaico del tabaco (Gallie et al. (1987) Nucl
Acids Res 15 8693-8711) y similares. Se describe el
proceso para las proteínas de transporte que no se localizan per
se en los plastidios de una manera dirigida en los plastidios
(Klosgen R B & Weil J H (1991) Mol Gen Genet
225(2):297-304; Van Breusegem F et al.
(1998) Plant Mol Biol 38(3):491-496). Las
secuencias preferidas son:
a) subunidad pequeña (SSU) de la
ribulosa-bisfosfato carboxilasa (Rubisco ssu) a
partir del guisante, maíz, girasol
b) los péptidos de transito derivados de genes
de la biosíntesis de ácido graso vegetal tal como el péptido de
transito de la proteína transportadora acil plastídica (ACP), la
estearil-ACP desaturasa,
\beta-cetoacil-ACP sintasa ola
acil-ACP tioesterasa
c) el péptido de transito para GBSSI (gránulo de
almidón unido al almidón sintasa 1)
d) genes LHCP II.
Las secuencias diana se pueden unir a otras
secuencias diana que difieren de las secuencias que codifican el
péptido de transito con el fin de asegurar una localización
subcelular en el apoplasto, en la vacuola, en plastidios, en la
mitocondria, en el retículo endoplasmático (ER), en el núcleo
celular, en elaioplastos u otros compartimientos. También es
posible emplear mejoradores de traducción tal como la secuencia
líder 5' del virus del mosaico del tabaco (Gallie et al.
(1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711) y similares.
El trabajador experto también es consciente que
no necesita expresar los genes descritos arriba directamente por el
uso de las secuencias de ácidos nucleicos codificadas por estos
genes, ni reprimirlos por ejemplo por anti-sentido.
También puede utilizar por ejemplo factores de transcripción
artificial del tipo de proteínas con dedo de cinc (Beerli R R et
al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA
97(4):1495-500). Estos factores unidos en
las regiones reguladoras de los genes endógenos que se expresan o
reprimen y resultan, dependiendo del diseño del factor, en la
expresión o represión del gen endógeno. Así, los efectos deseados
también se pueden lograr por la expresión de un factor apropiado de
la transcripción del dedo de cinc bajo el control de uno de los
promotores de la invención.
Los casetes de expresión de la invención se
pueden emplear además para suprimir o reducir la replicación o/y
traducción de los genes diana por el silenciador génico.
Los casetes de expresión de la invención también
se pueden emplear para expresar los ácidos nucleicos que median los
así llamados efectos antisentido y son de esta manera capaces por
ejemplo de reducir la expresión de una proteína diana.
A modo de ejemplo, los genes y proteínas
preferidos, cuya supresión es la condición para un fenotipo
ventajoso comprenden, pero no restrictivamente:
a) poligalacturonasa para prevenir la
degradación celular y sensiblería de plantas y frutas, tomates por
ejemplo. Preferiblemente se utilizan para este propósito las
secuencias de ácidos nucleicos tal como aquellas del gen de
poligalacturonasa del tomate (GenBank Acc. No.: X14074) o sus
homólogos de otros géneros y especies.
b) reducción en la expresión de proteínas
alergénicas según lo descrito por ejemplo en Tada Y et al.
(1996) FEBS Lett 391(3):341-345 o Nakamura R
(1996) Biosci Biotechnol Biochem
60(8):1215-122
c) cambio del color de flores por supresión de
la expresión de enzimas de biosíntesis antociana. Los procedimientos
correspondientes se describen (por ejemplo en Forkmann G, Martens
S. (2001) Curr Opin Biotechnol
12(2):155-160). Preferiblemente se utilizan
para este propósito las secuencias de ácidos nucleicos como aquellas
de la flavonoido 3'-hidroxilasa (GenBank Acc. No.:
AB045593), de la dihidroflavanol 4-reductasa
(GenBank Acc. No.: AF017451), de chalcona isomerasa (GenBank Acc.
No.: AF276302), de chalcona sintasa (GenBank Acc. No.: AB061022), de
flavonona 3-beta-hidroxilasa
(GenBank Acc. No.: X72592) o de flavona sintasa II (GenBank Acc.
No.: AB045592) o sus homólogos de otros géneros y especies.
d) cambio del contenido amilosa/amilopectina en
almidón por supresión de la enzima Q de ramificación que es
responsable del enlace
\alpha-1,6-glicosídico. Los
procedimientos correspondientes se describen (por ejemplo en
Schwall G P et al. (2000) Nat Biotechnol
18(5):551-554). Preferiblemente se utilizan
para este propósito las secuencias de ácidos nucleicos como
aquellas del almidón de la enzima II de ramificación de patata
(GenBank Acc. No.: AR123356; Patente U.S. No. 6,169,226) o sus
homólogos de otros géneros y especies.
Un ácido nucleico "antisentido" significa
en primer lugar una secuencia de ácidos nucleicos que es total o
parcialmente complementaria a al menos parte de la cadena sentido de
dicha proteína diana. El trabajador experto es consciente que puede
utilizar alternativamente el cADN o el gen correspondiente como
plantilla inicial para las construcciones antisentido
correspondientes. El ácido nucleico antisentido es preferiblemente
complementario a la región codificada de la proteína diana o una
parte de este. El ácido nucleico antisentido puede, sin embargo,
también ser complementario a la región no-codificada
de una parte de estos. Iniciando de la información de la secuencia
para una proteína diana, un ácido nucleico antisentido se puede
diseñar de una manera familiar a los trabajadores expertos teniendo
en consideración las reglas de par de bases de Watson y Crick. Un
ácido nucleico antisentido puede ser complementario al total o una
parte de la secuencia de ácidos nucleicos de una proteína diana. En
una modalidad preferida, el ácido nucleico antisentido es un
oligonucleótido con una longitud de por ejemplo 15, 20, 25, 30, 35,
40, 45 o 50 nucleótidos.
En una modalidad preferida, el ácido nucleico
antisentido comprende las moléculas
\alpha-anoméricas del ácido nucleico. Las
moléculas \alpha-anoméricas del ácido nucleico
forma en particular híbridos bicatenarios con ARN complementario en
las cuales las cadenas corren paralelo una a la otra, en contraste a
las unidades \beta normales (Gaultier et al. (1987)
Nucleic Acids Res 15:6625-6641). El uso de las
secuencias descritas arriba en el sentido de orientación se abarca
así mismo y puede, como es familiar a los trabajadores expertos,
conducir a la co-supresión. La expresión de ARN
sentido a un gen endógeno puede reducir o cambiar completamente su
expresión, similar a aquellos descritos para estrategias antisentido
(Goring et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA
88:1770-1774; Smith et al. (1990) Mol Gen
Genet 224:447-481; Napoli et al. (1990) Plant
Cell 2:279-289; Van der Krol et al. (1990)
Plant Cell 2:291-299). Es por otra parte para que la
construcción introducida represente el gen que se reducirá
completamente o solo en parte. La posibilidad de traducción es
innecesaria.
También se prefiere muy particularmente utilizar
los procesos tal como regulación del gen por medio de ARN
bicatenario (interferencia de ARN bicatenario). Los procesos
correspondientes son conocidos a los trabajadores expertos y
descritos en detalle (por ejemplo Matzke M A et al. (2000)
Plant Mol Biol 43:401-415; Fire A. et al
(1998) Nature 391:806-811; WO 99/32619; WO 99/53050;
WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364).
La referencia expresa se hace a los procesos y métodos descritos en
las referencias indicadas. La supresión altamente eficiente de los
genes nativos se produce aquí a través de la introducción simultánea
de cadena y cadena complementaria.
Es posible y ventajoso asociar la estrategia
antisentido con un proceso de ribozima. Las ribozimas son secuencias
de ARN activas catalíticamente que, se asocian a las secuencias
antisentido, catalíticamente dividen las secuencias diana (Tanner N
K. FEMS Microbiol Rev. 1999; 23 (3):257-75). Esto
puede incrementar la eficiencia de una estrategia antisentido. La
expresión de ribozimas para reducir las proteínas particulares se
conoce por los trabajadores expertos y descritos por ejemplo en
EP-A1 0 291 533, EP-A1 0 321 201 y
EP-A1 0 360 257. Las secuencias diana y las
ribozimas apropiadas se pueden determinar según lo descrito por
Steinecke (Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et
al. eds. Academic Press, Inc. (1995), 449-460)
por cálculos secundarios de la estructura del ARN del ribozima y
ARN diana y por la interacción de estos (Bayley C C et al.,
Plant Mol Biol. 1992; 18(2):353-361; Lloyd A
M y Davis R W et al., Mol Gen Genet. 1994 March;
242(6):653-657). Ejemplos que podrían ser
mencionados son ribozimas de cabeza de martillo (Haselhoff y
Gerlach (1988) Nature 334:585-591). Las ribozimas
preferidas se basan en los derivados de la tetrahimena
L-19 IVS ARN (Patente U.S. No. 4,987,071; Patente
U.S. No. 5,116,742). Otras ribozimas que tienen selectividad para
un mARN L119 se pueden seleccionar (Bartel D y Szostak J W (1993)
Science 261:1411-1418).
En otra modalidad, la expresión de la proteína
diana se puede reducir utilizando las secuencias de ácidos
nucleicos que son complementarias a los elementos reguladores de las
genes de proteínas diana, forma con la última una estructura
helicoidal triple y de esta manera prevenir la transcripción del gen
(Helene C (1991) Anticancer Drug Des.
6(6):569-84; Helene C et al. (1992)
Ann NY Acad Sci 660:27-36; Maher L J (1992)
Bioassays 14(12):807-815).
Los promotores bidireccionales de la invención
son particularmente ventajosos cuando se emplean para regular las
dos enzimas de una ruta metabólica.
2'-Metil-6-fitilhidroquinona
metiltransferasa y homogentisato
fitil-pirofosfato-transferasa, por
ejemplo, se pueden expresar simultáneamente vía uno de los
promotores bidireccionales de la invención, causando un incremento
en los tocoferoles. Además, la inhibición de homogentisato
dioxigenasa (por ejemplo por expresión de un dsARN correspondiente)
y la sobre expresión de la tirosina aminotransferasa conduce a un
incremento en el contenido del tocoferol. En el metabolismo
carotenoide, la inhibición de \alpha-ciclasa y la
sobre expresión de \beta-ciclasa conduce a un
cambio en el contenido de \alpha-caroteno y
\beta-caroteno.
Es posible prevenir los efectos silenciadores
pos-transcripcionales por inhibición en paralelo de
la transcripción del gen SDE3 y la sobre expresión de la proteína
recombinante (WO 02/063039).
Las partes activas inmunológicamente de los
anticuerpos también se pueden expresar ventajosamente utilizando
los promotores de la invención. Así, por ejemplo, la cadena pesada
de un anticuerpo IgG1 se puede expresar en una dirección, y la
cadena ligera en la otra dirección. Las dos forman un anticuerpo
funcional después de la traducción (WO 02/101006).
Otra posibilidad es expresar simultáneamente
iones transportadores relacionados con el estrés (WO 03/057899)
junto con los genes herbicidas para incrementar la tolerancia de
efectos ambientales.
Muchas enzimas consisten de dos o más
subunidades, ambas de las cuales son necesarias para el
funcionamiento. Es posible por medio de uno de los promotores
bidireccionales de la invención expresar dos subunidades
simultáneamente. Un ejemplo de estos es la sobre expresión de las
subunidades \alpha y \beta de la hormona humana que estimula el
folículo.
Una construcción que consiste de un gen para un
marcador de selección y un gen indicador es particularmente valiosa
para establecer los sistemas de transformación, cuando se regulan
por este promotor bidireccional.
Los casetes de expresión de la invención y los
vectores derivados de estos pueden comprender elementos funcionales
adicionales. El término elemento funcional debe ser entendido en
general y significar todos los elementos que tienen una influencia
en la producción, multiplicación o función de los casetes de
expresión de la invención o vectores u organismos derivados de
estos. Ejemplos no-restrictivos que pueden ser
mencionados son:
Los genes indicadores o proteínas codificados
por las proteínas fácilmente cuantificables y se garantiza vía un
color intrínseco o una actividad enzímica una valoración de la
eficiencia de la transformación o del sitio o tiempo de expresión
(Schenborn E, Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13(1):2944).
Ejemplos que podrían ser mencionados son:
-Proteína fluorescente verde (GFP) (Chui W L
et al., Curr Biol 1996, 6:325-330; Leffel S M
et al., Biotechniques. 23(5):912-8,
1997; Sheen et al. (1995) Plant Journal
8(5):777-784; Haseloff et al. (1997)
Proc Natl Acad Sci USA 94(6):2122-2127;
Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA
93(12):5888-5893; Tian et al. (1997)
Plant Cell Rep 16:267-271; WO 97/41228).
- cloramfenicol transferasa (Fromm et al.
(1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:5824-5828),
- luciferasa (Millar et al. (1992) Plant
Mol Biol Rep 10:324-414; Ow et al. (1986)
Science, 234:856-859); permite la detección de
bioluminescencia.
- \beta-galactosidasa,
codificada por una enzima para la cual varios sustratos cromogénicos
están disponibles.
-.\beta-glucuronidasa (GUS)
(Jefferson et al. (1987) EMBO J 6:3901-3907)
o el gen uidA el cual codifica una enzima por varios sustratos
cromogénicos.
- proteína del producto de gen
R-locus que regula la producción de pigmentos de
antocianina (coloración roja) en tejidos vegetales y de esta manera
hace posible el análisis directo de la actividad del promotor sin
adicionar auxiliares adicionales o sustratos cromogénicos
(Dellaporta et al., In: Chromosome Structure y Function:
Impact de New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium
11:263-282, 1988).
- \beta-lactamasa (Sutcliffe
(1978) Proc Natl Acad Sci USA 75:3737-3741), enzima
para varios sustratos cromogénicos (por ejemplo PADAC, una
cefalosporina cromogénica).
- producto del gen xyIE (Zukowsky et al.
(1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:1101-1105), catecol
dioxigenasa, que puede convertir los catecoles cromogénicos.
- \alpha-amilasa (Ikuta et
al. (1990) Biol Technol. 8:241-242).
- tirosinasa (Katz et al. (1983) J Gen
Microbiol 129:2703-2714), enzima que oxida la
tirosina a DOPA y dopaquinona que posteriormente forma la melanina
fácilmente detectable.
- aequorina (Prasher et al. (1985)
Biochem Biophys Res Commun 126(3):1259-1268),
se puede utilizar en la detección de bioluminescencia sensible al
calcio.
b) Orígenes de la replicación que garantiza una
multiplicación de los casetes o vectores de expresión de la
invención en, por ejemplo, E. coli. Ejemplos que pueden ser
mencionados son ORI (origen de la replicación de ADN), el pBR322
ori o el P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A
Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
c) Elementos por ejemplo "secuencias del
borde" que hacen posible la transferencia
agrobacteria-mediada en células vegetales para la
transferencia e integración en el genoma vegetal, tal como, por
ejemplo, el borde izquierdo o derecho de la región
T-ADN o la vir.
d) Regiones de clonación múltiple (MCS) permiten
y facilitan la inserción de una o más secuencias de ácidos
nucleicos.
El trabajador experto es consciente de varias
maneras de obtener un casete de expresión de la invención. La
producción de un casete de expresión de la invención tiene lugar por
ejemplo por fusión de uno de los promotores de la invención (o un
equivalente funcional o parte funcionalmente equivalente según lo
mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2 o un equivalente funcional con una
secuencia de ácidos nucleicos que se expresan, si es apropiado con
una secuencia codificada por un péptido de transito, preferiblemente
un péptido de transito cloroplasto-específico que
se sitúa preferiblemente entre el promotor y la secuencia respectiva
de ácidos nucleicos, y con una señal de terminación o
poliadenilación. Las técnicas de recombinación y clonación
convencionales se utilizan para este propósito (según lo descrito
arriba).
Sin embargo, y el casete de expresión también
significa las construcciones en las cuales el promotor, sin
previamente haber sido unidos funcionalmente a una secuencia de
ácidos nucleicos que se expresan, se introduce en un genoma
huésped, por ejemplo vía una recombinación homóloga dirigida o una
inserción al azar, aquí asume control regulador de las secuencias
de ácidos nucleicos que luego se unen funcionalmente a este, y
controla la expresión transgénica de estos. La inserción del
promotor - por ejemplo por recombinación homóloga - delante de un
ácido nucleico codificado por un polipéptido particular resulta en
un casete de expresión de la invención que controla la expresión
del polipéptido particular en la planta. La inserción del promotor
también puede tomar lugar por la expresión de ARN antisentido al
ácido nucleico codificado por un polipéptido particular. La
expresión del polipéptido particular en plantas de esta manera
inhibe la expresión o intercambia completamente.
También es posible análogamente para que una
secuencia de ácidos nucleicos sea expresada transgénicamente para
ser colocada, por ejemplo por recombinación homóloga, detrás del
endógeno, promotor natural, resultando en un casete de expresión de
la invención que controla la expresión de la secuencia de ácidos
nucleicos que se expresan transgénicamente.
Vectores que comprenden los casetes de expresión
descritos arriba también son de acuerdo con la invención. Los
vectores pueden ser por ejemplo plásmidos, cosmidos, fagos, virus o
de otra manera agrobacteria.
Otro aspecto de la invención se relaciona con
organismos transgénicos transformados con al menos un casete de
expresión de la invención o un vector de la invención, y células,
cultivos celulares, tejidos, partes - tales como, por ejemplo,
hojas, raíces etc. de organismos vegetales - o material de
propagación derivados de tales organismos.
Organismo, huéspedes iniciales u organismos
significan organismos procariotas o eucariotas tal como, por
ejemplo, microorganismos u organismos vegetales. Los
microorganismos preferidos son bacterias, levaduras, algas u
hongos.
Las bacterias preferidas son bacterias del
género Escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium,
Alcaligenes o cianobacterias por ejemplo del género Synechocystis.
Se prefieren particularmente los microorganismos aquellos que son
capaces de infectar las plantas y de esta manera transferir los
casetes de la invención. Microorganismos preferidos son aquellas
del género Agrobacterium y en particular de la especie
Agrobacterium tumefaciens.
Las levaduras preferidas son Candida,
Saccharomyces, Hansenula o Pichia. Los hongos preferidos son
Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria u
otros hongos descritos en Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No.
1, 2 (1995) en la página 15, tabla 6.
Los organismos huéspedes o iniciales preferidos
como organismos transgénicos son en particular plantas. Se incluyen
para los propósitos de la invención son todos los géneros y especies
de plantas superiores e inferiores del reino vegetal. También se
incluyen las plantas maduras, semillas, brotes y semilleros, y
partes derivadas de estos, material de propagación y cultivos, por
ejemplo cultivos celulares. Las plantas maduras significan plantas
en cualquier etapa de desarrollo más allá del semillero. El
semillero significa una planta joven, inmadura en una etapa de
desarrollo
precoz.
precoz.
Las plantas anuales, perennes monocotiledoneas y
dicotiledóneas son organismos huéspedes preferidos para producir
plantas transgénicas. Las plantas de las siguientes familias de
plantas se prefieren: Amaranthaceae, Asteraceae, Brassicaceae,
Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae,
Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae,
Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Saxifragaceae,
Scrophulariaceae, Solanacea, Sterculiaceae, Tetragoniacea,
Theaceae, Umbelliferae.
Las plantas monocotiledóneas preferidas se
refieren en particular a las plantas monocotiledóneas de cosecha
tales como, por ejemplo, de la familia Gramineae, tal como arroz,
maíz, trigo u otras especies de cereales tales como cebada, mijo,
centeno, triticale o avena, y azúcar de caña y todas las especies de
hierbas.
Las plantas dicotiledóneas preferidas se
seleccionan en particular de las plantas dicotiledóneas de cosecha
tales como, por ejemplo,
- Asteraceae tales como girasol, tagetes o
caléndula y muchas otras,
- Compositae, especialmente del género Lactuca,
muy especialmente de las especies sativa (lechuga) y muchas
otras,
- Cruciferae, especialmente el género Brassica,
muy especialmente las especies napus (semilla oleaginosa de colza),
campestris (remolacha), oleracea cv Tastie (repollo),
oleracea cv Snowball Y (coliflor) y oleracea cv
Emperor (brócoli) y otras especies brassica; y del género
Arabidopsis, muy especialmente las especies thaliana y muchas
otras,
- Cucurbitaceae tales como melón, calabaza o
calabacín y muchas otras,
- Leguminosae, especialmente el género Glycine,
muy especialmente las especies max (soja), soja y alfalfa,
guisante, frijol o maní y muchas otras
- Rubiaceae, preferiblemente de la subclase
Lamiidae tales como, por ejemplo, Coffea arabica o Coffea
liberica (arbusto de café) y muchas otras,
- Solanaceae, especialmente el género
Lycopersicon, muy especialmente las especies esculentum (tomate) y
el género Solanum, muy especialmente las especies tuberosum
(patata) y melongena (aubergine), y tabaco o pimentón y muchas
otras,
- Sterculiaceae, preferiblemente de la subclase
Dilleniidae tal como, por ejemplo, Theobroma cacao (planta
de cacao) y muchas otras,
- Theaceae, preferiblemente de la subclase
Dilleniidae tales como, por ejemplo, Camellia sinensis o
Thea sinensis (arbusto del té) y muchas otras,
- Umbelliferae, especialmente el género Daucus
(muy especialmente las especies carota (zanahoria) y Apium (muy
especialmente las especies graveolens dulce (apio) y muchas otras; y
el género Capsicum, muy especialmente las especies annum (pimienta)
y muchas otras,
y lino, soja, algodón, cáñamo (lino), pepino,
espinaca, zanahoria, remolacha azucarera y las especies de varios
árboles, nuez y vid, especialmente frutas de banana y kiwi.
Se da preferencia a Nicotiana tabacum,
Tagetes erecta y Calendula officinalis, y todos los
géneros y especies utilizadas como alimentos humanos o animales,
tal como las especies de cereales descritos, o son apropiadas para
la producción de aceites, tal como las semillas oleaginosas (tal
como colza), especies de nueces, soja, girasol, calabaza y maní.
Se da más preferencia a todas las plantas de la
familia Brassicaceae, muy especialmente las especies Brassica tal
como Brassica napus (semilla oleaginosa de colza),
campestris (remolacha), oleracea cv Tastie (repollo),
oleracea cv Snowball Y (coliflor) y oleracea cv
Emperor (brócoli) y otras especies brassica; y del género
Arabidopsis, muy especialmente la especie thaliana.
Los organismos vegetales para los propósitos de
la invención son adicionalmente otros organismos aptos en forma
fotosintética activos tal como, por ejemplo, algas o bacteria ciano,
y musgos. Las algas preferidas son algas verdes tal como, por
ejemplo, algas del género Haematococcus, Phaedactylum
tricomatum, Volvox o Dunaliella. Se da particular preferencia a
las algas tales como Chlorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae,
Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae (diatoms) y
Euglenophyceae.
La producción de un organismo transformado o de
una célula transformada requiere la introducción del ADN apropiado
en la célula huésped apropiada. Un gran número de métodos está
disponible para este proceso, que se refiere como la transformación
(ver también Keown et al. (1990) Methods in Enzymology
185:527-537). Así, por ejemplo, el ADN se puede
introducir directamente por microinyección o por bombardeo con
micropartículas cubiertas de ADN. La célula también se puede
permeabilizar químicamente, por ejemplo con polietilen glicol, así
que el ADN puede entrar en la célula por difusión. El ADN también
puede tener lugar por fusión de protoplastos con otras unidades que
contienen ADN tal como minicélulas, células, lisosomas o liposomas.
La electroporación es otro método apropiado para introducir el ADN,
en el cual las células se permeabilizan en forma reversible por un
pulso eléctrico.
En el caso de plantas, se utilizan los métodos
descritos para la transformación y regeneración de las plantas a
partir de tejidos vegetales o células vegetales para la
transformación transitoria o estable. Los métodos apropiados son en
particular transformación de protoplastos por absorción de
polietilen glicol-ADN inducido, el proceso
biolistico usando una pistola génica, el así llamado método de
bombardeo de partículas, electroporación, incubación de embriones
secos en solución que contienen ADN y microinyección.
Además de estas técnicas de transformación
"directa", también es posible realizar una transformación por
infección bacteriana con Agrobacterium tumefaciens o
Agrobacterium rhizogenes. Estas cepas comprenden un
plásmido (plásmido Ti o Ri) que se transfiere a la planta después de
la infección con agrobacterium. Parte de este plásmido,
llamado T-ADN (ADN transferido), se integra en el
genoma de la célula vegetal.
La transformación mediada por
Agrobacterium es más apropiada para las células vegetales
dicotiledóneas, diploides, mientras que las técnicas de
transformación directa son apropiadas para cada tipo de célula.
La introducción de un casete de expresión de la
invención en las células, preferiblemente en células vegetales, se
puede lograr ventajosamente por el uso de vectores.
En una modalidad ventajosa, la introducción del
casete de expresión se logra por medio de vectores plásmidos. Los
vectores preferidos son aquellos que hacen posible la integración
estable del casete de expresión en el genoma huésped.
En el caso de inyección o electroporación de ADN
en las células vegetales, ningún requisito especial se debe
encontrar por el plásmido usado. Un plásmido simple tal como
aquellos de la serie pUC se puede utilizar. Si las plantas
completas se deben regenerar a partir de las células transformadas,
es necesario que un gen marcador seleccionable adicional este
presente en el plásmido.
Las técnicas de transformación se describen para
varios organismos vegetales monocotiledóneos y dicotiledóneos.
Además, varios posibles vectores de plásmidos están disponibles para
introducir genes foráneos en plantas, que ordinariamente comprenden
un origen de replicación para la replicación en E. coli y un
gen marcador para la selección de bacterias transformadas. Ejemplos
son pBR322, serie pUC, serie Ml 3 mp, pACYC184 etc.
El casete de expresión se puede introducir en el
vector vía un apropiado sitio de división de restricción. El
plásmido resultante primero se introduce en el E. coli. El
E. coli correctamente transformado se selecciona y cultiva,
y el plásmido recombinante se aísla por métodos familiares para los
trabajadores expertos. El análisis de restricción y secuenciación
se puede utilizar para verificar la etapa de clonación.
Las células transformadas, i.e. aquellas que
contienen el ADN introducido integrado en el ADN de la célula
huésped, se pueden seleccionar de las
no-transformadas si un marcador seleccionable es un
constituyente del ADN introducido. Cualquier gen que es capaz de
conferir una resistencia a los antibióticos o herbicidas puede
actuar por ejemplo como marcador. Las células transformadas que
expresan tal gen marcador son capaces de sobrevivir en la presencia
de concentraciones de un apropiado antibiótico o herbicida que mata
unas células no-transformadas tipo salvaje. Un
ejemplo es el gen bar que confiere resistencia al herbicida
fosfinotricina (Rathore K S et al., Plant Mol Biol. 1993
March; 21(5):871-884), el gen nptII que
confiere resistencia a la kanamicina, el gen hpt que confiere
resistencia a la higromicina, o el gen EPSP que confiere resistencia
al herbicida glifosato.
Dependiendo del método de introducción del ADN,
otros genes pueden ser necesarios en el vector plásmido. Si se
utiliza una agrobacteria, el casete de expresión se debe integrar en
plásmidos especiales, ya sea en un vector intermedio (o vector
lanzadera) como en un vector binario. Si, por ejemplo, un plásmido
Ti o Ri se debe utilizar al menos el borde derecho, pero en más
casos el borde derecho y el izquierdo del T-ADN del
plásmido Ti o Ri se une como la región flanqueante al casete de
expresión que se introduce. Se utilizan preferiblemente los
vectores binarios. Los vectores binarios pueden replicar en E.
coli y en agrobacterium. Comprenden ordinariamente un gen
marcador de selección y un enlace o poliligador flanqueado por la
secuencia de T-ADN del borde derecho e izquierdo.
Se pueden transformar directamente en agrobacterium (Holsters et
al. (1978) Mol. Gen. Genet. 163:181-187). El
gen marcador de selección permite la selección de agrobacteria
transformada y es por ejemplo el gen nptII que confiere la
resistencia a la kanamicina. El agrobacterium que actúa como
organismo huésped en este caso debería contener ya un plásmido que
tiene la región vir. Esto es necesario para la transferencia del
T-ADN a la célula vegetal. Un agrobacterium
transformado de esta manera se puede utilizar para transformar las
células vegetales.
El uso de T-ADN para la
transformación de células vegetales se ha investigado intensivamente
y se describe (EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector
System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Chapter V;
Fraley et al. (1986) CRC Crit. Rev. Plant. Sci.,
4:1-46 and An et al. (1985) EMBO J.
4:277-287). Varios vectores binarios se conocen y
algunos son comercialmente disponibles tal como, por ejemplo, pBIN19
(Clontech Laboratories, Inc. U.S.A.).
El ADN se transfiere en la célula vegetal por el
co-cultivo de los explantes de plantas con
Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium
rhizogenes. Iniciando a partir del material vegetal infectado
(por ejemplo partes de hojas, raíces o tallos, pero también
protoplastos o suspensiones de células vegetales), es posible
regenerar las plantas completas por el uso de un medio apropiado que
puede comprender por ejemplo antibióticos o biocidas para la
selección de células transformadas. Las plantas resultantes luego se
pueden proteger por la presencia del ADN introducido, en este caso
el casete de expresión de la invención. Tan pronto como el ADN se
integra en el genoma huésped, el genotipo correspondiente es
usualmente estable y la correspondiente inserción también se
encuentra en las subsiguientes generaciones. El casete de expresión
integrado usualmente comprende un marcador de selección (ver
arriba). El marcador de selección permite la selección de células
transformadas a partir de células no transformadas (McCormick et
al. (1986) Plant Cell Rep 5:81-84). Las plantas
resultantes se pueden cultivar y cruzar de una manera usual. Dos o
más generaciones se deben cultivar con el fin de asegurar que la
integración genómica es estable y heredable.
Dichos procesos se describen por ejemplo en B.
Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic
Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by Kung S D
& Wu R, Academic Press (1993), pp. 128-143 y in
Potrykus I (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol
42:205-225). La construcción que se expresa es
preferiblemente clonada en un vector que es apropiado para
transformar el Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo
pBin19 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12:8711f.).
Tan pronto como una célula transformada vegetal
se ha producido, una planta completa se puede obtener utilizando
los procesos conocidos por los trabajadores expertos. Esto conlleva
a iniciar por ejemplo a partir de los cultivos de callos. La
formación del brote y raíz a partir de estos aún en masas celulares
sin diferencias se puede inducir de una manera conocida. Los brotes
resultantes se pueden plantar fuera y cultivar.
La efectividad de la expresión de los ácidos
nucleicos expresados transgénicamente se puede medir por ejemplo
in vitro por la propagación del meristemo del brote usando
uno de los métodos de selección descritos arriba.
También de acuerdo con la invención son las
células, cultivos celulares, partes - tal como, por ejemplo, raíces,
hojas etc. en el caso de organismos de vegetales transgénicos - y
material de propagación transgénica tal como semillas o frutas,
derivados de los organismos transgénicos descritos arriba.
Las plantas modificadas genéticamente de la
invención que se pueden consumir por humanos y animales también se
puede utilizar como alimento humano o alimento animal por ejemplo
directamente o después de procesar de una manera conocida per
se.
Otro aspecto de la invención se relaciona con el
uso de los organismos transgénicos de la invención descritos arriba
y de las células, cultivos celulares, partes - tales como, por
ejemplo, raíces, hojas etc. en el caso de organismos de vegetales
transgénicos - y materiales de propagación transgénica tales como
semillas o frutas derivadas de estos para producir alimentos
humanos o animales, productos farmacéuticos o químicos finos.
Se da preferencia adicional a un proceso para la
producción de productos farmacéuticos o químicos finos recombinantes
en organismos huéspedes, donde un organismo huésped se transforma
con uno de los casetes o vectores de expresión descritos arriba, y
este casete de expresión comprende uno o más genes estructurales que
se codifican para el deseado producto químico fino o catalizador de
la biosíntesis del deseado producto químico fino, los organismos
huésped transformados se cultivan, y el deseado producto químico
fino se aísla a partir del medio de cultivo. Este proceso es
ampliamente aplicable a los productos químicos finos tales como
enzimas, vitaminas, aminoácidos, azúcares, ácidos grasos,
saborizantes naturales y sintéticos, sustancias aromatizantes y
colorantes. La producción de tocoferoles y tocotrienoles, y de
carotenos se prefieren particularmente. El cultivo de los organismos
huéspedes transformados, y el aislamiento de los organismos
huéspedes o del medio de cultivo tiene lugar por medio de procesos
conocidos por los trabajadores expertos. La producción de productos
farmacéuticos tales como, por ejemplo, anticuerpos o vacunas se
describe en Hood E E, Jilka J M (1999). Curr Opin Biotechnol
10(4):382-6; Ma J K, Vine N D (1999). Curr
Top Microbiol Immunol 236:275-92.
1. SEQ ID NO: 1 Promotor bidireccional del
Arabidopsis thaliana. Región intergen entre el gen putativo
FD y el gen putativo OASTL hasta en cada caso el supuesto inicio de
la transcripción.
2. SEQ ID NO: 2 Promotor bidireccional del
Arabidopsis thaliana que incluye las regiones
5'-no traducidas del gen putativo FD y del gen
putativo OASTL hasta en cada caso el codón inicial ATG. Comparado
con la secuencia nativa, la presente secuencia comprende un C
adicional en la posición 4 comparado con la secuencia nativa de
Arabidopsis a través de la introducción de una secuencia de
reconocimiento BamHI.
3. SEQ ID NO: 3 Secuencia del plásmido pUH200.
El gen GUS se expresa en la dirección del gen FD, y el gen nptII en
la dirección del gen OASTL.
4. SEQ ID NO: 4 Secuencia del plásmido pUH201.
El gen GUS se expresa en la dirección del gen OASTL, y el gen nptII
en la dirección del gen FD.
5. SEQ ID NO: 5 Oligonucleótido cebador pFD3
- \quad
- 5'-acggatccgagagacagagagacggagacaaaa-3'
\newpage
6. SEQ ID NO: 6 Oligonucleótido cebador pFD4
- \quad
- 5'-gcggatccaagcttcactgcttaaattc-3'
Fig. 1: Representación diagramática de la unidad
bidireccional en los vectores UH200 y UH201. RB: borde derecho del
agrobacterium T-ADN; CATpA: inhibidor de terminación
de la catepsina D; nptII: gen neomicina fosfotransferasa II (gen de
resistencia de la kanamicina); FD: región intergen entre FD y gen
OASTL (+/-indica la dirección de lectura del gen FD); GUS: gen
\beta-glucuronidasa; 35SpA: terminación del gen
35S CaMV; LB: borde izquierdo del agrobacterium
T-ADN.
Fig. 2: Análisis de la actividad GUS en hojas de
plantas transgénicas de semilla oleaginosa de colza transformadas
con UH 200 (orientación del gen ferredoxina) o UH 201 (orientación
del gen OASTL) comparado con las plantas tipo salvaje (WT). Se
muestran los resultados de varias líneas de plantas de semilla
oleaginosa de colza UH200 o UH201 transformadas (identificadas por
el número de la línea respectiva en el eje de la x). La actividad
GUS se indica metilumbelliferona pmol (MU)/mg (proteína) min.
Síntesis química de oligonucleótidos, se puede
realizar por ejemplo de una manera conocida por el método de
fosfoamidita (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, page
896-897). Las etapas de clonación realizadas para
los propósitos de la presente invención, tal como, por ejemplo,
división de restricción, electroforesis en gel de agarosa,
purificación del fragmento de ADNs, transferencia de ácidos
nucleicos en membranas de nitrocelulosa y nylon, enlace de
fragmento de ADNs, transformación de células de E. coli,
cultivo de bacteria, replicación de fagos y se realizan análisis de
secuencia de ADN recombinante según lo descrito en Sambrook et
al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN
0-87969-309-6.
Moléculas recombinantes de ADN se secuenciaron por el método de
Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA
74:5463-5467) usando un secuenciador de ADN con
fluorescencia láser suministrado por ABI.
El ADN genómico a partir del Arabidopsis
thaliana, tabaco y semilla oleaginosa de colza se aisló usando
el kit DNeasy plant mini de Qiagen Cat. No. 60106 de acuerdo con el
protocolo.
La transformación del tabaco se conduce por la
infección con Agrobacterium tumefaciens de acuerdo
con el método desarrollado por Horsch (Horsch et al. (1985)
Science 227: 1229-1231). Todas las construcciones
utilizadas por la transformación se transformaron por el método
congelación/descongelación (repetida descongelación y congelación)
en Agrobacterium tumefaciens. Las colonias de
Agrobacterium que contienen la deseada construcción se
seleccionaron en medio YEB (extracto carne de bovino al 1% (Difco),
0.5% de enzima caseina hidrolizato, 0.1% de extracto de levadura
(Duchefa), 0.5% de sacarosa, MgSO_{4}2 mM, 1.5% de agar), medio
con 50 \mug/ml de kanamicina, 40 \mug /ml de gentamicina, 100
\mug /ml de espectinomicina y 25 \mug /ml de rifampicina.
Plantas de tabaco (Nicotiana tabacum L.
cv. Samsun N N) se transformaron centrifugando 10 ml de un cultivo
durante la noche de Agrobacterium tumefaciens
cultivado bajo selección, descartando el sobrenadante, y
resuspendiendo la bacteria en el mismo volumen de medio libre de
antibiótico. Discos de hojas de plantas estériles (diámetro
aproximadamente 1 cm) se bañaron en esta solución bacteriana en un
caja de Petri estéril. Los discos de hojas luego se colocaron sobre
medio MS (Murashige y Skoog (1962) Physiol Plant 15:473ff.) con 2%
de sacarosa y 0.8% de agar Bacto en cajas de Petri. Después de la
incubación a 25ºC en la oscuridad por 2 días, se transfirieron al
medio MS con 100 mg/l de kanamicina, 500 mg/l de Claforan, 1 mg/l de
bencilaminopurina (BAP), 0.2 mg/l de ácido naftilacético (NAA),
1.6% de glucosa y 0.8% de agar Bacto, y se continuo el cultivo (16
horas de luz/8 horas de oscuridad). Los brotes cultivados se
transfirieron al medio MS libre de hormonas con 2% de sacarosa, 250
mg/l de Claforan y 0.8% de agar Bacto. La semilla oleaginosa de
colza se transformó por medio de la transformación del pecíolo por
el método de Moloney et al. (Moloney M M et al. (1989)
Plant Cell Rep 8:238-242).
El promotor bidireccional putativo se amplificó
por PCR a partir del ADN genómico de Arabidopsis thaliana
utilizando los cebadores FD3 y FD4. Los nucleótidos en impresión de
negrilla para un sitio BamHI se unieron al cebador FD3. Un sitio
BamHI se introdujo en el cebador FD4 por inserción de un C
(negrilla) como diferencia de la secuencia genómica.
Cebador FD3: (SEQ ID NO: 5)
- \quad
- 5'-acggatccgagagacagagagacggagacaaaa-3'
Cebador FD4: (SEQ ID NO: 6)
- \quad
- 5'-gcggatccaagcttcactgcttaaattc-3'
Mezcla de Reacción:
- \quad
- 1 \mul de ADN
- \quad
- 37 \mul de H_{2}O
- \quad
- 5 \mul de 10 veces solución reguladora
- \quad
- 1 \mul de cebador FD3 10 \muM
- \quad
- 1 \mul de cebador FD4 10 \muM
- \quad
- 4 \mul de dNTP 2.5 mM
- \quad
- 1 \mul de polimerasa de ADN Pfu turbo (Stratagene)
Condiciones de PCR:
- \quad
- 1 ciclo con 5 min a 95ºC
- \quad
- 25 ciclos con 52ºC por 1 min, 72ºC por 1 min y 95ºC por 30 seg.
- \quad
- 1 ciclo con 72ºC por 10 min,
- \quad
- Subsiguiente enfriamiento a 4ºC hasta el próximo proceso.
El producto PCR que comprende el promotor FD se
dividió con la enzima de restricción BamHI y se unió en el vector
pGUSINT37 (SunGene), así mismo se dividió BamHI. La clonación no
dirigida resultó en los dos plásmidos pFD+GUS y
pFD-GUS en los cuales el fragmento promotor se
coloca delante del gen GUS en orientaciones opuestas en cada caso.
El plásmido pFD+GUS contiene el promotor en la dirección de
transcripción del gen ferredoxina putativo, y el plásmido
pFD-GUS en la orientación del comentado gel
O-acetilserina tiol-liasa (OASTL,
cisteina sintasa).
Para analizar ambas direcciones de expresión,
los genes del marcador de selección NptII y de la glucuronidasa
indicadora se colocaron bajo el control del promotor bidireccional
en las construcciones. Para este propósito, los plásmidos pFD+GUS y
pFD-GUS se dividieron con EcoRI/SalI y clonaron en
el vector pS5NptIICat (derivado del vector pSUN; WO 02/00900). Los
plásmidos resultantes UH200 (SEQ ID NO: 3) contienen el gen GUS bajo
el control de los elementos transcripcionales que actúan en la
dirección del gen ferredoxina, y el gen NptII bajo el control de
los elementos transcripcionales que actúan en la dirección del gen
OASTL. En el plásmido UH201 (SEQ ID NO: 4), el gen GUS está bajo el
control de los factores dirigidos OASTL y el gen NptII está bajo el
control de los elementos que controlan el gen ferredoxina (ver Fig.
1). Ambas construcciones se transformaron en la cepa agrobacterium
GV3101 [pMP90] y se transformaron en tabaco y semilla oleaginosa de
colza de acuerdo con los protocolos.
La regeneración selectiva de la plántula de
tabaco se conduce en 100 mg/l de kanamicina. 86% de los explantes
de los que fueron transformados con la construcción UH200
desarrollaron plúmulas. 89% de los brotes cortados enraizaron en el
medio que contiene kanamicina, y todos fueron transgénicos de
acuerdo con los análisis PCR. 70% de los explantes del experimento
de transformación con UH201 desarrollaron plúmulas, de las cuales el
90% enraizaron. Una vez más, el análisis PCR reveló que las
plántulas contienen la construcción apropiada y son de esta manera
transgénicas. Este ejemplo mostró que ambas orientaciones promotor
son apropiadas de la misma manera para expresar los marcadores de
selección durante la regeneración selectiva del tabaco.
La regeneración selectiva de los brotes de
semilla oleaginosa de colza se conduce en 18 mgA de kanamicina. La
eficiencia de la transformación fue 11% para la construcción UH200 y
10% para UH201. Al mismo tiempo, la eficiencia de la transformación
bajo el control del promotor de nopalina sintasa se encontró que era
el 8%. Este ejemplo mostró que la regeneración selectiva ambos bajo
el control del promotor en la dirección OASTL (UH200) y la
dirección FD (UH201) es comparable con el nosP normalmente
usado.
Las dos orientaciones del promotor han mostrado
las mismas especificidades del tejido, con la excepción en polen,
en las plantas transgénicas de tabaco y de semilla oleaginosa de
colza (tabla 1). Mientras que no se encontró ninguna actividad en
el polen en la semilla oleaginosa de colza, el polen del tabaco
mostró una coloración azul distinta y de esta manera actividad del
promotor. La expresión GUS regulada por ambas orientaciones se
encontró predominantemente en tejido verde. Ninguna expresión fue
detectable en las raíces y pétalos. La actividad GUS fue detectable
aún en estados muy inmaduros del desarrollo de la semilla en la
semilla oleaginosa de colza.
La actividad del promotor durante la
regeneración selectiva se continúo tiñendo los brotes jóvenes con
X-Gluc. Los brotes transgénicos mostraron una
tinción azul intenso. Este experimento una vez más mostró la misma
actividad del promotor bidireccional en ambas orientaciones.
Para el análisis cuantitativo de la fuerza del
promotor FD, se investigaron en paralelo, material de hoja y
semilla a partir de plantas transgénicas de ambas construcciones. El
ensayo GUS cuantitativo se realizó de acuerdo con el procedimiento
de Jefferson con MUG y 4-metilumbelliferona como
estándar. Una cantidad similar de la actividad GUS se detectó en
las semillas de las plantas de ambas orientaciones. La expresión se
midió claramente en material de hoja en ambas direcciones, pero la
intensidad fue menos uniforme que en el material de semilla.
La semilla oleaginosa de colza se transformó -
según lo descrito arriba - así mismo con las construcciones UH200 y
UH201. El análisis GUS cuantitativo de material de hoja de plantas
transgénicas de semilla oleaginosa de colza mostró que las dos
direcciones del promotor mostraron una actividad idéntica. La Fig. 2
muestra los valores para las líneas individuales. El nivel de
expresión corresponde a los otros promotores polares de plantas.
\vskip1.000000\baselineskip
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aspirante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
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gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones
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respecto.
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<110> SunGene GmbH&Co.KGaA
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Casetes de expresión para la
expresión transgénica bi-direccional de los ácidos
nucleicos en vegetales
\vskip0.400000\baselineskip
<130> AE 20030535
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patente versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 429
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(429)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 836
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> promotor
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (344)..(772)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Intron
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(281)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 1st intrón del gen OASTL
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 5'UTR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (773)..(836)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5'UTR del gen FD
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 5'UTR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(343)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5'-UTR del gen OASTL
que comprende intrón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11533
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vector de expresión UH200
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11533
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Vector de expresión UH201
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacggatccga gagacagaga gacggagaca aaa
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggatccaa gcttcactgc ttaaattc
\hfill28
Claims (17)
1. Un casete de expresión transgénica para la
expresión de dos secuencias de ácidos nucleicos en una célula
vegetal que comprende al menos una secuencia reguladora seleccionada
del grupo que consiste de
a) el promotor mostrado en la SEQ ID NO: 1 o
2,
b) equivalentes funcionales del promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2 que tiene una identidad de al menos
80% a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 o 2 y que tiene
sustancialmente la misma actividad del promotor que el promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2,
c) equivalentes funcionales del promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2 que comprende al menos 25
nucleótidos consecutivos de las secuencias mostradas en la SEQ ID
NO: 1 o 2 y que tienen sustancialmente la misma actividad del
promotor que el promotor mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2, y
d) fragmentos equivalentes funcionalmente de las
secuencias a) o b) o c), que tienen al menos 25 nucleótidos
consecutivos de dichas secuencias a) o b) o c) y tienen
sustancialmente la misma actividad del promotor que el promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2, donde dicha secuencia reguladora se
sitúa entre dos secuencias de ácidos nucleicos y es heteróloga en
relación con dichas secuencias de ácidos nucleicos y es
funcionalmente asociada a dichas secuencias de ácidos nucleicos de
tal manera que la expresión de dos diferentes secuencias de ácido
ribonucléico se produce en al menos una célula vegetal, donde dichas
secuencias de ácido ribonucléico se seleccionan a partir de las
secuencias de ácido ribonucléico codificadas por:
- i)
- secuencias de aminoácidos o
- ii)
- secuencias de ácido ribonucléico que producen una reducción en la expresión de al menos un gen endógeno de dicha célula vegetal.
2. El casete de expresión de acuerdo con la
reivindicación 1, donde las dos secuencias de ácidos nucleicos que
se expresan transgénicamente son diferentes y codifican por una de
las siguientes combinaciones
i) marcador de selección y proteína
indicadora
ii) proteína diana y marcador de selección o
proteína indicadora
ii) dos proteínas diana de la misma ruta
metabólica
iii) ARN sentido y antisentido
iv) varias proteínas de defensa contra los
patógenos.
3. El casete de expresión de acuerdo con la
reivindicación 1 o 2, donde al menos una de las secuencias de
ácidos nucleicos que se expresa transgénicamente se selecciona de
ácidos nucleicos codificados por marcadores de selección, genes
indicadores, celulasas, quitinasas, glucanasas, proteínas que
inactivan los ribosomas, lisozimas, endotoxinas Bacillus
thuringiensis, inhibidores de \alpha-amilasa,
inhibidores de proteasa, lecitinas, ARNasas, ribozimas,
acetil-CoA carboxilasas, fitasas, 2S albúmina de
Bertholletia excelsa, proteínas anticongelantes,
trehalosa-fosfato sintasas,
trehalosa-fosfato fosfatasas, trehalasas, factor
DREB1A, farnesil transferasas, ferritina, oxalato oxidasas,
proteína quinasas dependientes del calcio, calcineurinas, glutamato
dehidrogenasas, citocromo P-450 multifuncional
N-hidroxilación, activador transcripcional CBF1,
fitoeno desaturasas, poligalacturonasas, flavonoidas
3'-hidroxilasas, dihidroflavanol
4-reductasas, chalcona isomerasas, chalcona
sintasas, flavonona
3-beta-hidroxilasas, flavona sintasa
II, enzima Q de ramificación, enzimas de ramificación de
almidón.
4. El casete de expresión transgénica de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde al menos una de
las secuencias de ácidos nucleicos que se expresa transgénicamente
se selecciona del grupo que consiste de marcadores de selección
positivos, marcadores de selección negativos y factores que
proporcionan una ventaja en el crecimiento.
5. El casete de expresión transgénica de acuerdo
con la reivindicación 2 o 4, donde el marcador de selección se
escoge del grupo que consiste de proteínas que confieren una
resistencia a los antibióticos, inhibidores del metabolismo,
herbicidas o biocidas.
6. El casete de expresión transgénica de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 2, 4 o 5, donde el marcador
de selección se escoge del grupo que consiste de proteínas que
confieren una resistencia a la fosfinotricina, glifosato,
bromoxinilo, dalapon, 2-deoxiglucosa
6-fosfato, tetraciclina, ampicilina, kanamicina, G
418, neomicina, paromonicina, bleomicina, zeocina, higromicina,
cloramfenicol, herbicidas de sulfonilurea, herbicidas de
imidazoli-
nona.
nona.
7. El casete de expresión transgénica de acuerdo
con cualquiera de las reivindicaciones 2 o 4 a 6, donde el marcador
de selección se selecciona del grupo que consiste de fosfinotricina
acetiltransferasas,
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasas, glifosato oxidoreductasas, dehalogenasa, nitrilasas,
neomicina fosfotransferasas, genes DOG^{R}1, acetolactato
sintasas, higromicina fosfotransferasas, cloramfenicol
acetiltransferasas, estreptomicina adenililtransferasas,
\beta-lactamasas, genes tetA, genes tetR,
isopenteniltransferasas, timidina quinasas, toxina A de la difteria,
citosina deaminasa (codA), citocromo P450, haloalcano
dehalogenasas, genes iaaH, genes tms2,
\beta-glucuronidasas, manosa-
6-fosfato isomerasas, UDP-galactosa
4-epimerasas.
8. Un vector de expresión transgénica que
comprende un casete de expresión de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7.
9. Un organismo vegetal transgénico transformado
con un casete de expresión transgénica de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7 o con un vector de expresión transgénica
de acuerdo con la reivindicación 8.
10. El organismo vegetal transgénico de acuerdo
con la reivindicación 9, seleccionado del grupo que consiste de
arabidopsis, tomate, tabaco, patatas, maíz, semilla oleaginosa de
colza, trigo, cebada, girasoles, mijo, remolacha, centeno, avena,
remolacha azucarera, frijol y soja.
11. Una célula, cultivo celular, parte o
material de propagación transgénica derivados de un organismo
vegetal transgénico de acuerdo con la reivindicación 9 o 10.
12. Un proceso para la expresión transgénica de
dos secuencias de ácido ribonucléico en células vegetales, donde un
casete de expresión que comprende al menos una secuencia reguladora
seleccionada de un grupo que consiste de
a) el promotor mostrado en la SEQ ID NO: 1 o
2,
b) equivalentes funcionales del promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2 que tiene una identidad de al menos
80% a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 o 2 y que tiene
sustancialmente la misma actividad del promotor que el promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2,
c) equivalentes funcionales del promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2 que comprende al menos 25
nucleótidos consecutivos de las secuencias mostradas en la SEQ ID
NO: 1 o 2 y que tienen sustancialmente la misma actividad del
promotor que el promotor mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2, y
d) fragmentos equivalentes funcionalmente de las
secuencias a) o b) o c), que tienen al menos 25 nucleótidos
consecutivos de dichas secuencias a) o b) o c) y tienen
sustancialmente la misma actividad del promotor que el promotor
mostrado en la SEQ ID NO: 1 o 2, se introducen en al menos una
célula vegetal, donde dicha secuencia reguladora se sitúa entre dos
secuencias de ácidos nucleicos y es heteróloga en relación con dicha
secuencia de ácidos nucleicos y se une funcionalmente a dichas
secuencias de ácidos nucleicos de tal manera que la expresión de
las citadas dos diferentes secuencias de ácido ribonucléico se
produce en al menos dicha célula vegetal, donde dichas secuencias
de ácido ribonucleico se seleccionan de las secuencias de ácido
ribonucléico codificadas por
- i)
- secuencias de aminoácidos o
- ii)
- secuencias de ácido ribonucléico que producen una reducción en la expresión de al menos un gen endógeno de dicha célula vegetal.
13. El proceso de acuerdo con la reivindicación
12, donde las dos secuencias de ácidos nucleicos que se expresan
transgénicamente son diferentes y codifican por una de las
siguientes combinaciones
i) marcador de selección y proteína
indicadora
ii) proteína diana y marcador de selección o
proteína indicadora
ii) dos proteínas diana de la misma ruta
metabólica
iii) ARN sentido y antisentido
iv) varias proteínas de defensa contra
patógenos.
14. El proceso de acuerdo con la reivindicación
12 o 13, donde al menos una de las secuencias de ácidos nucleicos
que se expresa transgénicamente se selecciona de los ácidos
nucleicos según lo definido en cualquiera de las reivindicaciones 3
a 7.
15. El uso de un organismo vegetal transgénico
de acuerdo con la reivindicación 9 o 10 o de cultivos celulares,
partes o material de propagación transgénica derivados de estos de
acuerdo con la reivindicación 11 para producir alimentos humanos o
animales, semillas, productos farmacéuticos o químicos finos.
16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15,
donde los productos químicos finos son anticuerpos, enzimas,
proteínas activas farmacéuticamente, vitaminas, aminoácidos,
azúcares, ácidos grasos saturados o insaturados, saborizantes,
sustancias aromatizantes o colorantes naturales o sintéticos.
17. Un proceso para producir productos
farmacéuticos o químicos finos en organismos de vegetales
transgénicos de acuerdo con la reivindicación 9 o 10 o cultivos
celulares, partes o material de propagación transgénica derivados
de estos de acuerdo con la reivindicación 11, que comprenden el
cultivo del organismo vegetal transgénico y el aislamiento del
deseado producto farmacéutico o del deseado producto químico
fino.
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