DE10159455A1 - Expressionskassetten zur transgenen Expression von Nukleinsäuren - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Expressionskassetten und Vektoren, die pflanzliche konstitutive Promotoren enthalten, sowie die Verwendung dieser Expressionskassetten oder Vektoren zur transgenen Expression von Nukleinsäuresequenzen - bevorzugt Selektionsmarkern - in Organismen, bevorzugt in Pflanzen. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder Vermehrungsgut sowie die Verwendung derselben zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.

Description

• Die Erfindung betrifft Expressionskassetten und Vektoren, die pflanzliche konstitutive Promotoren enthalten, sowie die Verwendung dieser Expressionskassetten oder Vektoren zur transgenen Expression von Nukleinsäuresequenzen - bevorzugt Selektionsmarkern - in Organismen, bevorzugt in Pflanzen. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder Vermehrungsgut, sowie die Verwendung derselben zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
• Ziel biotechnologischer Arbeiten an Pflanzen ist die Herstellung von Pflanzen mit verbesserten Eigenschaften zum Beispiel zur Steigerung der landwirtschaftlichen Produktivität. Die Herstellung transgener Pflanzen ist eine grundlegende Technik der Pflanzenbiotechnologie und damit eine unerlässliche Voraussetzung für die pflanzliche Grundlagenforschung, sowie für die Herstellung von Pflanzen mit verbesserten, neuen Eigenschaften für die Landwirtschaft, zur Qualitätssteigerung bei Nahrungsmitteln oder zur Produktion bestimmter Chemikalien oder Pharmazeutika (Dunwell JM, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No: 487-96). Oft sind die natürlichen Abwehrmechanismen der Pflanze zum Beispiel gegen Pathogene unzureichend. Die Einführung fremder Gene aus Pflanzen, Tieren oder mikrobiellen Quellen kann die Abwehr verstärken. Beispiele sind der Schutz gegen Insektenfraß in Tabak durch Expression des Bacillus thuringiensis Endotoxin unter Kontrolle des 35S CaMV Promotors (Vaeck et al. (1987) Nature 328: 33-37) oder der Schutz des Tabaks gegen Pilzbefall durch Expression einer Chitinase aus der Bohne unter Kontrolle des CaMV Promotors (Broglie et al. (1991) Science 254: 1194-1197). Ferner kann durch die Einführung fremder Gene eine Herbizidresistenz erzielt werden, was die Anbaubedingungen optimiert und Ernteverluste verringert (Ott KH et al. (1996) J Mol Biol 263(2): 359-368). Auch kann die Qualität der Erzeugnisse verbessert werden. So kann die Haltbarkeit und Lagerfähigkeit von Ernteerzeugnissen zum Beispiel durch Inaktivierung bestimmter Reifungsgene erhöht werden. Gezeigt wurde dies zum Beispiel an der Tomate durch Inaktivierung der Polygalacturonase (Hamilton AJ et al. (1995) Curr Top Microbiol Immunol 197: 77-89).
• Eine Grundvoraussetzung für die transgene Expression bestimmter Gene in Pflanzen ist die Bereitstellung pflanzenspezifischer Promotoren. Verschiedene pflanzliche Promotoren sind bekannt. Dabei kann zwischen konstitutiven Promotoren, die eine lokal und zeitlich nur wenig beschränkte Expression in verschiedenen Teilen einer Pflanze ermöglichen, und spezifischen Promotoren, die eine Expression nur in bestimmten Teilen oder Zellen einer Pflanze (z. B. Wurzel, Samen, Pollen, Blättern etc.) oder nur zu bestimmten Zeitpunkten der Entwicklung gestatten, unterschieden werden. Konstitutive Promotoren werden beispielsweise für die Expression sogenannter Selektionsmarker verwendet. Selektionsmarker (z. B. Antibiotika- oder Herbizidresistenzgene) erlauben es, das Transformationsereignis aus der Vielzahl der nicht transformierten, aber ansonsten identischen pflanzlichen Individuen herauszufiltern.
• Konstitutive in Pflanzen aktive Promotoren sind bislang relativ selten geschrieben. Zu nennen sind der TR-Doppelpromotor aus Agrobacterium tumefaciens, die Promotoren der vakuolären ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991) sowie der Ppc1 Promotor aus Mesembryanthemum cryctallinum (Cushman et al. (1993) Plant Mol Biol 21: 561-566).
• Die derzeit in Pflanzen überwiegend verwendeten konstitutiven Promotoren sind fast ausschließlich virale oder aus Agrobacterium isolierte Promotoren. Dabei handelt es sich im einzelnen um den Nopalinsynthase (nos) Promotor (Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12(20): 7831-7846), den Mannopinsynthase (mas) promotor (Comai et al. (1990) Plant Mol Biol 15 (3): 373-381) und den Octopinsynthase (ocs) Promotor (Leisner and Gelvin (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(5): 2553-2557) aus Agrobacterium tumefaciens oder der CaMV35S Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaikvirus. Letzterer ist der am häufigsten verwendete Promotor in Expressionssystemen mit ubiquitärer und andauernder Expression (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812; Battraw and Hall (1990) Plant Mol Biol 15: 527-538; Benfey et al. (1990) EMBO J 9(69): 1677-1684; US 5,612,472). Der häufig als konstitutiver Promoter angewandte CaMV 35S Promotor zeigt jedoch Variationen in der Aktivität in unterschiedlichen Pflanzen und in unterschiedlichen Geweben derselben Pflanze (Atanassova et al. (1998) Plant Mol Biol 37: 275-85; Battraw and Hall (1990) Plant Mol Biol 15: 527-538; Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-646; Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901-3907). Ein weiterer Nachteil des 35S Promotors ist, das bei einer Infektion mit dem Blumenkohlmosaikvirus und seinen typischen pathogenen Varianten die Expression des Transgens verändert wird. So sind Pflanzen, die das BAR Gen unter der Kontrolle des 35S Promotors exprimieren nicht mehr resistent nach Infektion mit dem Virus, der in der Natur typischerweise vorkommt (Al-Kaff et al. (2000) Natur Biotechnology 18: 995-99).
• Als Alternative zum CaMV 35S Promotor aus dem Bereich viraler Promotoren wurde der Sugarcane bacilliform badnavirus (ScBV) beschrieben (Schenk et al. (1999) Plant Mol Biol 39(6): 1221-1230), der ein dem CamV ähnliches Expressionsmuster vermittelt. Die Aktivität des ScBV Promotors wurde in transienten Expressionsanalysen mit verschiedenen zweikeimblättrigen Pflanzen, darunter Nicotiana tabacum und N. benthamiana, Sonnenblume und Raps, und einkeimblättrigen Pflanzen, hier anhand von Banane, Mais und Hirse, analysiert. In den transienten Analysen in Mais war das ScBV Promotor vermittelte Expressionsniveau vergleichbar mit dem des Ubiquitin-Promotors aus Mais (s. unten). Weiterhin wurde die ScBV Promotor vermittelte Expressionsrate in transgenen Bananen- und Tabakpflanzen getestet und zeigte in beiden Pflanzenspezies im wesentlichen konstitutive Expression.
• Als gängige Promotoren zur Expression von Selektionsmarkern in Pflanzen werden vor allem der nos-Promotor, aber auch der mas- und ocs-Promotor verwendet, die allesamt aus Agrobacterium- Stämmen isoliert wurden.
• Der Verwendung viraler Sequenzen wird seitens des Verbrauchers oft mit großem Vorbehalt begegnet. Diese Bedenken werden nicht zuletzt durch Untersuchungen genährt, die die Sicherheit des 35S CaMV Promotors - aufgrund eines möglichen horizontalen Gentransfers bedingt durch einen Rekombinations-"Hot Spot" - in Frage stellen (Ho MW et al. (1999) Microbial Ecology in Health and Disease 11: 194-197; Cummins J et al. (2000) Nature Biotechnology 18: 363). Ein Ziel künftiger biotechnologischer Arbeiten an Pflanzen ist daher der Ersatz viraler genetischer Elemente durch regulatorische pflanzliche Elemente, um so nah wie möglich am pflanzlichen System zu bleiben.
• Aufgrund der herrschenden Bedenken hinsichtlich viraler Promotoren gibt es umfangreiche Bemühungen, diese durch pflanzliche Promotoren zu ersetzen. Ein den viralen Elementen vergleichbarer Promotor pflanzlicher Herkunft ist bislang jedoch noch nicht beschrieben worden.
• Beschrieben wurde ein pflanzlicher Ubiquitin-Promotor aus Arabidopsis thaliana (Callis et al. (1990) J Biol Chem 265: 12486-12493; Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-747). Entgegen den Befunden in den genannten Artikeln, ergaben eigene Untersuchungen, dass der Arabidopsis Ubiquitin Promotor für die Expression von Selektionsmarkergenen ungeeignet ist und seine allgemeine Anwendbarkeit aus diesem Grund in Frage gestellt werden muss (s. Vergleichsbeispiel 1 und 3).
• Das vom Mais-Ubiquitin Promotor vermittelte Expressionsmuster wurde für die Ubi-1 and Ubi-2 Promotoren aus Mais beschrieben (Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18(4): 675-689). Während der Ubi-1 Promotor in Mais und anderen monokotylen Pflanzen gute Expressionsaktivität aufweist, zeigt er in dikotylen Tabakpflanzen nur 10% der Aktivität, die in vergleichbaren Experimenten mit dem viralen 35S Promotor erzielt worden war. Ferner wurde gezeigt, dass der Mais Ubi-1 Promotor für die Überexpression von Genen in monokotylen Pflanzensystemen geeignet ist und darüber hinaus auch hinreichend stark ist, um eine Herbizid-Resistenz durch Expression von Selektionsmarkern zu vermitteln (Christensen and Quail (1996) Transgenic Res 5(3): 213-218). Für dikotyle Expressionssysteme erwies sich der Ubi-1 promotor als ungeeignet.
• Ein Vergleich der Organspezifität und Stärke verschiedener konstitutiver Promotoren wurde von Holtorf (Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29(4): 637-646) anhand stabil transformierter Arabidopsis-Pflanzen durchgeführt. Die Studie umfasste u. a. den CaMV35S-Promotor, den blattspezifischen Thionin-Promotor aus Gerste und den Arabidopsis Ubiquitin-Promotor (UBQ1). Die höchste Expressionsrate zeigte der CaMV35S-Promotor. Anhand der Verwendung eines zusätzlichen translationalen Enhancers (TMV omega element) konnte die Expressionsrate des Promotors bei unveränderter Organspezifität um das Zwei- bis Dreifache gesteigert werden. Der blattspezifische Thionin-Promotor aus Gerste war in der Mehrzahl der transformierten Linien inaktiv, während der UBQ1 Promotor aus Arabidopsis mittlere Expressionsraten ergab.
• McElroy und Mitarbeiter berichteten von einem auf dem Reis Actin 1 (Act1) Promotor basierenden Konstrukt zur Transformation monokotyler Pflanzen (McElroy et al. (1991) Mol Gen Genet 231: 150-160). Insgesamt wurde aus den zuvor beschriebenen Untersuchungen geschlussfolgert, dass die auf dem Act1-Promotor basierenden Expressionsvektoren dazu geeignet sind, eine hinreichend starke und konstitutive Expression von Fremd-DNA in transformierten Zellen monokotyler Pflanzen zu steuern.
• Als konstitutiver Promotor ist ferner der Promotor einer S-Adenosyl-L-Methionin Synthetase beschrieben (WO 00/37662). Nachteilig ist hier vor allem eine Abhängigkeit der Expressionstärke von der Methioninkonzentration (siehe WO 00/37662; Fig. 7).
• WO 99/31258 beschreibt chimäre, konstitutive pflanzliche Promotoren, die sich aus verschiedenen Elementen verschiedener Promotoren mit komplementären Expressionsmustern zusammensetzen, so dass die Kombination einzelner Gewebespezifitäten additiv zu einem konstitutiven Expressionsmuster führt.
• Die Ferredoxin NADPH Oxidoreduktase (FNR) ist ein Protein der Elektronentransportkette und reduziert NADP+ zu NADPH. Experimente in Spinat mit dem Spinat-FNR Promotor, der mit dem GUS Gen fusioniert wurde, deuten auf ein lichtinduzierbares Element im FNR Promotor (Oelmüller et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 237: 261-72). Aufgrund seiner Funktion wäre für den Promotor ein streng blattspezifisches Expressionsmuster zu erwarten gewesen. Aufgrund des gewebeabhängigen Expressionsmusters wäre der Promotor schlecht geeignet für die Expression von Selektionsmarkern. Hier ist eine Selektion in möglichst allen Gewebeteilen erforderlich, um eine effiziente Selektion zu gewährleisten.
• Der Promotor des Triose-Phosphat-Translokators (TPT) sollte aufgrund seiner Funktion während der Photosynthese vorwiegend blattspezifisch sein. Beschrieben sind die cDNAs von Kartoffel (Schulz et al. (1993) Mol Gen Genet 238: 357-61), Blumenkohl (Fischer et al. (1997) Plant Cell 9: 453-62), Raps (WO 97/25346) und (Mais Kammerer B (1998) The Plant Cell 10: 105-117). Kammerer et al. zeigen, dass die Mais TPT mRNA Expression stark in den Blättern und den Staubgefäßen erfolgt. Keine Expression ist hingegen im Stengel oder den Wurzeln zu beobachten. Aufgrund des gewebeabhängigen Expressionsmusters wäre der Promotor schlecht für die Expression von Selektionsmarkern geeignet. Hier ist eine Selektion in möglichst allen Gewebeteilen erforderlich, um eine effiziente Selektion zu gewährleisten.
• Die im Stand der Technik beschriebenen, sogenannten "konstitutiven" Promotoren weisen einen oder mehrere der nachfolgenden Nachteile auf:
  
• 1. Mangelhafte Homogenität der Expression:
  Die bekannten, sogenannten "konstitutiven" Promotoren zeigen vielfach eine unterschiedliche Expressionshöhe je nach Gewebe- oder Zelltyp. Zudem ist die Expressionseigenschaft oft stark von dem Insertionsort des Wirtsgenoms abhängig. Dies hat zur Folge, dass die durch heterologe Expression zu erzielenden Effekte nicht in dem gleichen Ausmaß homogen in der Pflanze erreicht werden können. Es kann zu Unter- oder Überdosierungen kommen. Dies kann sich nachteilig auf das Pflanzenwachstum oder den Pflanzenwert auswirken.
• 2. Mangelhaftes Zeitprofil:
  Die im Stand der Technik bekannten sogenannten "konstitutiven" Promotoren zeigen oft eine nicht konsistente Aktivität während der Entwicklung eines Gewebes. Damit können zum Beispiel in der frühen Phase der somatischen Embryogenese keine wünschenswerten Effekte (wie Selektion) erzielt werden, was gerade hier - aufgrund der Empfindlichkeit des Embryos gegen in vitro Bedingungen und Stressfaktoren - vorteilhaft wäre.
• 3. Mangelnde Anwendbarkeit auf viele Pflanzenarten:
  Die im Stand der Technik beschriebenen sogenannten "konstitutiven" Promotoren sind oft nicht in allen Arten in gleicher Weise aktiv.
• 4. Beim Vorliegen mehrerer Expressionskassetten mit jeweils dem gleichen "konstitutiven" Promotor in einem Organismus kann es zu Wechselwirkungen zwischen denselben und sogar zum Abschalten ("Gene Silencing") einzelner Expressionskassetten kommen (Mette et al. (1999) EMBO J. 18: 241-248).
• 5. Promotoren viralen Ursprungs können durch Virusinfektionen der transgenen Pflanze beeinflusst werden und die gewünschte Eigenschaft dann nicht mehr ausprägen (Al-Kaff et al. (2000) Natur Biotechnology 18: 995-99).
• 6. Die öffentliche Akzeptanz gegenüber der Verwendung von Promotoren und Elementen aus pflanzlichen Systemen ist höher als bei viralen Systemen.
• 7. Die Zahl der für die Expression von Selektionsmarkern in Pflanzen geeigneten Promotoren ist gering und sie sind gewöhnlicher Weise viralen oder bakteriellen Ursprungs.
• 8. Pollen/Antheren-Expression: Die genannten Promotoren (wie beispielsweise 35S CaMV) zeigen eine starke Aktivität im Pollen oder den Staubbeuteln (Antheren). Dies kann unvorteilhafte Auswirkungen auf die Umwelt haben. So hatte eine unspezifische Expression von Bacillus thuringiensis Endotoxinen nicht nur den gewünschten Effekt auf Fraßinsekten durch Expression in der Wurzel, sondern auch infolge einer Expression im Pollen bedeutende Schäden im Bestand des Monarchfalters zur Folge, der den Pollen als Hauptnahrungsquelle nutzt (Losey JE et al. (1999) Nature 399, 214).
• Ein idealer konstitutiver Promotor sollte möglichst zahlreiche der nachfolgenden Eigenschaften haben:
  
• a) Möglichst homogene lokale und zeitliche Genexpression d. h. eine Expression in möglichst vielen Zelltypen oder Geweben eines Organismus während der verschiedenen Phasen des Entwicklungszyklus. Gewünscht wird ferner eine effiziente Selektion in dedifferentierten Zellen (verschiedenen Kallus- Phasen) aus einer Gewebekultur und weiteren Entwicklungsstadien, die für die Gewebekultur geeignet sind.
• b) Möglichst breite Anwendbarkeit auf verschiedene Pflanzenarten bzw. Anwendbarkeit auf Arten, in denen mit den bisher bekannten "konstitutiven" Promotoren keine Expression erreicht werden kann.
• c) Um eine Kombination von mehreren Transgenen in einer Pflanze zu realisieren, ist es wünschenswert, mehrere Transformationen hintereinander zu schalten oder Konstrukte mit mehreren Promotor-Kassetten zu verwenden, ohne dass durch die mehrmalige Verwendung identischer regulatorischer Sequenzen Silencing-Effekte erzeugt werden.
• d) Einen pflanzlichen Ursprung zur Vermeidung von Akzeptanzproblemen beim Konsumenten und eventuellen zukünftigen Zulassungsproblemen.
• e) Nebenaktivitäten eines Promotors in den Antheren/Pollen sind nicht wünschenswert, zum Beispiel um Umweltschäden zu vermeiden (s. o.).
• Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand also in der Bereitstellung von pflanzlichen regulatorischen Sequenzen, die möglichst viele der oben genannten Eigenschaften erfüllen, vor allem eine ubiguitäre und entwicklungsunabhängige (konstitutive) Expression einer zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz - bevorzugt kodierend für einen Selektionsmarker - vermitteln. Trotz verschiedener pflanzlicher Promotoren für die eine konstitutive Expression zumindest in einzelnen Arten beansprucht wird, wurde bislang kein Promotor mit den oben aufgezählten gewünschten Eigenschaften beschrieben. Es bestand daher die Aufgabe, entsprechende Promotoren zu identifizieren.
• Diese Aufgabe wurde gelöst durch Bereitstellung von Expressionskassetten basierend auf den Promotoren eines putativen Ferredoxin Gens (infolge pFD "putative Ferredoxin") aus Arabidopsis thaliana, des Ferredoxin NADPH Oxidoreduktase (infolge FNR) Gens aus Arabidopsis thaliana und des Triose-Phosphat Translokator (TPT) Gens aus Arabidopsis thaliana:
  
• 1. Promotor eines putativen Ferredoxin (pFD) aus Arabidopsis thaliana
  Bei der Analyse des Arabidopsis Genoms wurde der ORF eines putativen Ferredoxingens identifiziert. Die isolierte 836 bp 5'-flankierende Sequenz fusioniert mit dem Gen der Glucuronidase zeigte in transgenem Tabak überraschenderweise ein konstitutives Expressionsmuster. Die Sequenz entspricht einem Sequenzabschnitt auf Chromosom 4 von Arabidopsis thaliana wie er in der GenBank unter der Acc.-No. Z97337 hinterlegt ist (Version Z97337.2; Basenpaar 85117 bis 85952; das Gen beginnend ab bp 85953 ist mit "strong similarity to ferredoxin [2Fe-2S] I, Nostoc muscorum" annotiert). (Das Gen ist nicht zu verwechseln mit dem unter der GenBank Acc.-No: X51370 annotierten A. thaliana Gen für Preferredoxin; Vorst O et al. (1990) Plant Mol Biol 14(4): 491-499).
  In den Antheren/Pollen der geschlossenen Blütenknospen konnte nur eine schwache Aktivität, in reifen Blüten gar keine mehr detektiert werden. Entgegen den aus den Literaturbefunden abgeleiteten Vorbehalten gegen eine Eignung des Promotors zur effektiven Expression von Selektionsmarkern (zum Beispiel aufgrund der vermuteten Blattspezifität oder der Funktion im photosynthetischen Elektronentransport), konnte eine hocheffiziente Selektion durch Kombination mit beispielsweise dem Kanamycin-Resistenzgen (nptII) demonstriert werden.
• 2. Ferredoxin NADPH Oxidoreduktase (FNR) Promotor aus Arabidopsis thaliana
  Ausgehend von den Informationen über die FNR-kodierende cDNA aus N. tabacum (GenBank Acc.-No.: Y14032) wurde in der Arabidopisdatenbank nach einem homologen Gen gesucht. Entsprechend dieser Sequenzinformationen wurden Primer synthetisiert. Der über PCR aus genomischer DNA von Arabidopsis thaliana amplifizierte Promotor (635 bp), von dem eine blattspezifische Expression erwartet wurde, zeigte in transgenen Tabakpflanzen eine überraschend ubiquitäre und vom Insertionsort unabhängige Expression.
  Die Promotorsequenz entspricht teilweise einem Sequenzabschnitt auf Chromosom 5 von Arabidopsis thaliana wie er in der GenBank unter der Acc.-No. AB011474 hinterlegt ist (Version AB011474.1 vom 27.12.2000; Basenpaar 70127 bis 69493; das Gen beginnend ab bp 69492 ist mit "ferredoxin-NADP+ reductase" annotiert).
  In den Pollen konnte keine Aktivität detektiert werden. Entgegen den aus den Literaturbefunden abgeleiteten Vorbehalten gegen eine Eignung des Promotors zur effektiven Expression von Selektionsmarkern (zum Beispiel aufgrund der vermuteten Blattspezifität oder der Funktion im photosynthetischen Elektronentransport), konnte eine hocheffiziente Selektion durch Kombination mit beispielsweise dem Phosphinothricin- Resistenzgen (bar/pat) demonstriert werden.
• 3. Triose-Phosphat Translokator (TPT) Promotor aus Arabidopsis thaliana
  Ein 2038 bp langes PCR Fragment wurde amplifiziert ausgehend von Arabidopsis Genbankdaten vom Chromosom V, clone MCL19. Die Promotorsequenz entspricht zum Teil einem Sequenzabschnitt auf Chromosom 5 von Arabidopsis thaliana wie er in der GenBank unter der Acc.-No. AB006698 hinterlegt ist (Version AB006698.1 vom 27.12.2000; Basenpaar 53242 bis 55281; das Gen beginnend ab bp 55282 ist mit "phosphate/triose- phosphate translocator" annotiert).
  Transgene Tabakpflanzen zeigten überraschender Weise nicht nur eine starke Aktivität in zahlreichen Pflanzenteilen. In den Pollen konnte keine Aktivität detektiert werden. Entgegen den aus den Literaturbefunden abgeleiteten Vorbehalten gegen eine Eignung des Promotors zur effektiven Expression von Selektionsmarkern (zum Beispiel aufgrund der vermuteten Blattspezifität), konnte eine hocheffiziente Selektion durch Kombination mit beispielsweise dem Phosphinothricin- Resistenzgen (bar/pat) demonstriert werden.
  Das ubiguitäre Expressionsmuster, vor allem aber auch die Fähigkeit des TPT Promotors hinsichtlich der Expression von Selektionsmarkern stellt eine große Überraschung für den Fachmann dar, da der Triosephosphattranslokator verantwortlich für den Austausch von C3 Zuckerphosphaten zwischen Cytosol und Plastiden in photosynthetischen Blättern ist. Der TPT ist in der inneren Chloroplasten Membran lokalisiert. Farblose Plastiden enthalten typischerweise Hexosetransporter über den der C6-Zuckerphosphat Austausch erfolgt. Es ist nicht zu erwarten, dass solche Gene in den frühen Callus und Embryogenese Stadien aktiv sind (Stitt (1997) Plant Metabolism, 2nd ed., Dennis eds. Longman Press, Harlow, UK, 382-400).
• Sowohl der pFD, FNR als auch der TPT Promotor erwiesen sich als hinreichend stark, um Nukleinsäuresequenzen insbesondere Selektionsmarkergene erfolgreich zu exprimieren. Ferner erwiesen sich verschiedene Deletionsvarianten der oben genannten Promotoren, insbesondere eine verkürzte Variante des pFD Promotors (699 bp) und des TPT Promotors (1318 bp), als geeignet die Expression von beispielsweise Selektionsmarkern wie der Kanamycin-Resistenz (nptII) zu gewährleisten.
• Weiterhin wurden im Rahmen der genannten Arbeiten der Arabidopsis thaliana Ubiquitin-Promotor (Holtorf et al. (1995) Plant Mol Biol 29: 637-646) und der Squalen Synthase-Promotor (Kribii et al. (1997) Eur J Biochem 249: 61-69) untersucht, die aber beide überraschenderweise nicht geeignet waren, Selektionsmarkergen- Expression zu vermitteln, obwohl die Literaturdaten der Ubiquitin-Promotoren aus Monokotylen (siehe oben) hatten vermuten lassen, dass insbesondere der Ubiquitin-Promotor einer dikotylen Pflanze als Promotor eines Selektionsmarkersystems hätte funktionieren müssen (siehe Vergleichsbeispiele 1 und 3). Ähnliches gilt für den Squalensynthase-Promotor, dessen Charakterisierung hätte erwarten lassen, dass ausreichend hohe Expressionsraten für die erfolgreiche Steuerung eines Selektionsmarkergens erzielt werden können (Del Arco and Boronat (1999) 4th European Symposium on Plant Isoprenoids, 21.-23.4.1999, Barcelona, Spanien) (siehe Vergleichsbeispiele 2 und 3).
• Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft daher Expressionskassetten zur transgenen Expression von Nukleinsäuren umfassend
  
• a) einen Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3,
• b) ein funktionelles Äquivalent oder äquivalentes Fragment von a), das im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie a) besitzt,
wobei a) oder b) funktionell mit einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind.
• Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur transgenen Expression von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäuresequenz in funktioneller Verknüpfung mit
  
• a) einem Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3, oder
• b) einem funktionellen Äquivalent oder äquivalente Fragment von a), das im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten wie a) besitzt,
transgen exprimiert wird.
• Expression umfasst die Transkription der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz, kann aber - im Falle eines offenen Leserasters in "sense"-Orientierung - auch die Translation der transkribierten RNA der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz in ein korrespondierendes Polypeptid mit einschließen.
• Expressionskassette zur transgenen Expression von Nukleinsäuren oder Verfahren zur transgenen Expression von Nukleinsäuren umfasst alle solche durch gentechnische Methoden zustande gekommene Konstruktionen oder Verfahren, in denen entweder
  
• a) ein Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 oder ein funktionelles Äquivalent oder äquivalentes Fragment derselben, oder
• b) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz, oder
• c) (a) und (b)
sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung (d. h. an ihrem natürlichen chromosomalen Locus) befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitution, Addition, Deletion, Inversion oder Insertion eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann.
• Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten, von ihnen abgeleitete Vektoren oder die erfindungsgemäßen Verfahren können funktionelle Äquivalente zu den unter SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 beschriebenen Promotorsequenzen umfassen. Funktionell äquivalente Sequenzen umfassen auch all die Sequenzen, die von dem komplementären Gegenstrang der durch SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 definierten Sequenzen abgeleitet sind und im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität aufweisen.
• Funktionelle Äquivalente in bezug auf die erfindungsgemäßen Promotoren meint insbesondere natürliche oder künstliche Mutationen der unter SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 beschriebenen Promotorsequenzen sowie deren Homologen aus anderen Pflanzengattungen und -arten, welche weiterhin im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität aufweisen.
• Eine Promotoraktivität wird im wesentlichen als gleich bezeichnet, wenn die Transkription eines bestimmten zu exprimierenden Gens unter Kontrolle eines bestimmten von SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 abgeleiteten Promotors unter ansonsten unveränderten Bedingungen eine Lokalisation innerhalb der Pflanze aufweist, die zu mindestens 50%, bevorzugt mindestens 70%, besonders bevorzugt mindesten 90% ganz besonders bevorzugt mindestens 95% deckungsgleich ist mit einer Vergleichsexpression erhalten unter Verwendung eines des durch SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 beschriebenen Promotors. Dabei kann die Expressionshöhe sowohl nach unten als auch nach oben im Vergleich zu einem Vergleichswert abweichen. Bevorzugt sind dabei solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA oder dem infolge translatierten Protein, unter ansonsten unveränderten Bedingungen quantitativ um nicht mehr als 50%, bevorzugt 25%, besonders bevorzugt 10% sich von einem Vergleichswert erhalten mit einem durch SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 beschriebenen Promotor unterscheidet. Besonders bevorzugt sind solche Sequenzen, deren Expressionshöhe, gemessen anhand der transkribierten mRNA oder dem infolge translatierten Protein, unter ansonsten unveränderten Bedingungen quantitativ um mehr als 50%, bevorzugt 100%, besonders bevorzugt 500%, ganz besonders bevorzugt 1000% eines Vergleichswert erhalten mit dem durch SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 beschriebenen Promotor übersteigt. Bevorzugt ist als Vergleichswert die Expressionshöhe der natürlichen mRNA des jeweiligen Gens oder des natürlichen Genproduktes. Bevorzugt ist ferner als Vergleichswert die Expressionshöhe erhalten mit einer beliebigen, aber bestimmten Nukleinsäuresequenz, bevorzugt solchen Nukleinsäuresequenzen, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1): 29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23(5): 912-8, 1997), die Chloramphenicoltransferase, eine Luziferase (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10: 324-414) oder die β-Galactosidase, ganz besonders bevorzugt ist die β-Glucuronidase (Jefferson et al. (1987) EMBO J. 6: 3901-3907).
• Ansonsten unveränderte Bedingungen bedeutet, dass die Expression, die durch eine der zu vergleichenden Expressionskassetten initiiert wird, nicht durch Kombination mit zusätzlichen genetischen Kontrollsequenzen, zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, modifiziert wird. Unveränderte Bedingungen bedeutet ferner, dass alle Rahmenbedingungen wie beispielsweise Pflanzenart, Entwicklungsstadium der Pflanzen, Zuchtbedingungen, Assaybedingungen (wie Puffer, Temperatur, Substrate etc.) zwischen den zu vergleichenden Expressionen identisch gehalten werden.
• Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversionen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation eines Promotors gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung überflüssiger DNA oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen, zum Beispiel weiterer regulatorischer Sequenzen, sein.
• Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z. B. Transitionen und Transversionen, in Frage kommen, können an sich bekannte Techniken, wie in vitro-Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Durch Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "blunt ends" können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Zu analogen Ergebnissen kann man auch unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid-Primer kommen.
• Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleinsäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
  Gap Weight: 12;
  Length Weight: 4;
  Average Match: 2,912;
  Average Mismatch: -2,003.
• Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 50% auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 50% aufweist.
• Funktionelle Homologe zu den obengenannten Promotoren zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Expressionskassetten umfasst bevorzugt solche Sequenzen, die eine Homologie aufweisen von mindestens 50%, bevorzugt 70%, vorzugsweise mindestens 80%, besonders bevorzugt mindestens 90%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95%, am meisten bevorzugt 99% über eine Länge von von mindestens 100 Basenpaaren, bevorzugt mindestens 200 Basenpaaren, besonders bevorzugt von mindestens 300 Basenpaaren, ganz besonders bevorzugt von mindestens 400 Basenpaaren, am meistens bevorzugt von mindestens 500 Basenpaaren.
• Weitere Beispiele für die in den erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren zum Einsatz kommenden Promotorsequenzen lassen sich beispielsweise in verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie beispielsweise Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthium anuus, Linum sativum durch Homologievergleiche in Datenbanken leicht auffinden.
• Funktionelle Äquivalente meint ferner DNA Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit der Nukleinsäuresequenz kodierend für einen Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 oder der zu ihr komplementären Nukleinsäuresequenzen hybridisieren und die im wesentlichen gleichen Eigenschaften haben. Standardhybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint sowohl stringente als auch weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9.57 oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.
• Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2 × SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0.2 × SSC bei 50°C bevorzugt bei 65°C) (20 × SSC: 0,3 M Natriumcitrat, 3 M NaCl, pH 7.0). Darüber hinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und nur der andere variiert werden.
• Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben:
  
• 1. Hybridisierungsbedingungen mit zum Beispiel
  • a) 4 × SSC bei 65°C, oder
  • b) 6 × SSC, 0.5% SDS, 100 µg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA bei 65°C, oder
  • c) 4 × SSC, 50% Formamid, bei 42°C, oder
  • d) 6 × SSC, 0.5% SDS, 100 µg/ml denaturierte, fragmentierte Lachssperma-DNA, 50% Formamid bei 42°C, oder
  • e) 2 × oder 4 × SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung), oder
  • f) 2 × oder 4 × SSC, 30 bis 40% Formamid bei 42°C (schwach stringente Bedingung).
  • g) 6 × SSC bei 45°C, oder,
  • h) 50% Formamid, 4 × SSC bei 42°C, oder
  • i) 50% (vol/vol) Formamid, 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,5, 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrate bei 42°C, oder
  • j) 0,05 M Natriumphosphatpuffer pH 7,0, 2 mM EDTA, 1% BSA und 7% SDS.
• 2. Waschschritte mit zum Beispiel
  • a) 0,1 × SSC bei 65°C, oder
  • b) 0,1 × SSC, 0,5% SDS bei 68°C, oder
  • c) 0,1 × SSC, 0,5% SDS, 50% Formamid bei 42°C, oder
  • d) 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 42°C, oder
  • e) 2 × SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung), oder
  • f) 40 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,0, 1% SDS, 2 mM EDTA.
• Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer funktioneller Äquivalente umfasst bevorzugt die Einführung von Mutationen in einen Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3. Eine Mutagenese kann ungerichtet ("random") erfolgen, wobei die mutagenisierten Sequenzen anschließend bezüglich ihrer Eigenschaften nach einer "trial- by-error" Prozedur durchmustert werden. Besonders vorteilhafte Selektionskriterien umfassen beispielsweise eine erhöht Resistenz gegenüber einem Selektionsmarker, die Höhe der resultierenden Expression der eingeführten Nukleinsäuresequenz.
• Alternativ können nicht-essentielle Sequenzen eines erfindungsgemäßen Promotors deletiert werden ohne die genannten Eigenschaften signifikant zu beeinträchtigen. Derartige Deletionsvarianten stellen funktionell äquivalente Fragmente der Promotoren beschrieben durch SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 dar. Beispielhaft sei für derartige Deletionsmutanten oder funktionell äquivalente Fragmente die verkürzte pFD-Promotorsequenz (pFDs) gemäß SEQ ID NO: 4 oder die verkürztet TPT-Promotorsequenz gemäß SEQ ID NO: 27 zu nennen, die als funktionell äquivalente Teile ihrer jeweiligen Ausgangspromotoren ausdrücklich mit umfasst sind.
• Die Eingrenzung der Promotorsequenz auf bestimmte, essentielle regulatorische Regionen kann auch mit Hilfe von Suchroutine zur Suche von Promotorelementen vorgenommen werden. Oft sind in den für die Promotoraktivität relevanten Regionen bestimmte Promotorelemente gehäuft vorhanden. Diese Analyse kann beispielsweise mit Computerprogrammen wie dem Programm PLACE ("Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements") vorgenommen werden (K. Higo et al., (1999) Nucleic Acids Research 27: 1, 297-300) oder der BIOBASE Datenbank "Transfac" (Biologische Datenbanken GmbH, Braunschweig).
• Verfahren zur Mutagenisierung von Nukleinsäuresequenzen sind dem Fachmann bekannt und schließen beispielhaft die Verwendung von Oligonukleotiden mit einer oder mehr Mutationen im Vergleich zu der zu mutierenden Region ein (z. B. im Rahmen einer "Site- specific mutagenesis"). Typischerweise kommen Primer mit ungefähr 15 bis ungefähr 75 Nukleotiden oder mehr zum Einsatz, wobei bevorzugt ca. 10 bis ca. 25 oder mehr Nukleotidreste an beiden Seiten der zu verändernden Sequenz lokalisiert sind. Details und Durchführung besagter Mutageneseverfahren sind dem Fachmann geläufig (Kunkel et al., Methods Enzymol, 154: 367-382, 1987; Tomic et al. (1990) Nucl Acids Res 12: 1656; Upender, Raj, Weir (1995) Biotechniques 18(1): 29-30; US 4,237,224). Eine Mutagenese kann auch durch Behandlung von beispielsweise Vektoren, die eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten, mit mutagenisierenden Agentien wie Hydroxylamin realisiert werden.
• Die in den erfindungsgemäßen Expressionskassetten enthaltenen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben einem der erfindungsgemäßen Promotoren funktionell verknüpft sein.
• Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung eines Promotors, der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz, je nach Anordnung der Nukleinsäuresequenzen zu sense oder anti-sense RNA, erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz hinter der als Promotor fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
• Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind. Zwischen beide Sequenzen können aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signalpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen.
• Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Expressionskassetten 5'-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen der erfindungsgemäßen Promotoren und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.
• Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressionsteuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH (1991) J Biol Chem 266(26): 17131-17135) und Hitzestress (Schöffl F et al. (1989) Molecular & General Genetics 217(2-3): 246-53) beschrieben.
• Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E.coli Bakterien ermöglichen. Als Pflanzenpromotoren kommen im Prinzip alle oben beschriebenen Promotoren in Frage. Vorstellbar ist zum Beispiel, dass eine bestimmte Nukleinsäuresequenz durch einen Promotor (zum Beispiel einen der erfindungsgemäßen Promotoren) in einem Pflanzengewebe als sense-RNA transkribiert und in das entsprechende Protein translatiert wird, während die gleiche Nukleinsäuresequenz durch einen anderen Promotor mit einer anderen Spezifität in einem anderen Gewebe zu anti-sense-RNA transkribiert und das entsprechende Protein herunterreguliert wird. Dieses kann durch eine erfindungsgemäße Expressionskassette realisiert werden, indem der eine Promotor vor die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz positioniert wird und der andere Promotor dahinter.
• Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untranslatierte Region, Introns oder die nichtkodierende 3'-Region von Genen, bevorzugt der pFD, FNR oder TPT-Gene. Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Sie können ferner die Gewebespezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J. 15: 435-440). Umgekehrt unterdrückt die 5'-untranslatierte Region des opaque-2 Gens die Expression. Eine Deletion der entsprechenden Region führt zu einer Erhöhung der Genaktivität (Lohmer 5 et al. (1993) Plant Cell 5: 65-73). Die unter SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 angegebene Nukleinsäuresequenz enthält den Abschnitt der pFD, FNR oder TPT- Gene, der den Promotor und die 5'-untranslatierte Region bis vor das ATG-Startcodon des jeweiligen Proteins repräsentiert.
• McElroy und Mitarbeiter (McElroy et al. (1991) Mol Gen Genet 231(1): 150-160) berichteten von einem auf dem Reis Actin 1 (Act1) Promotor basierenden Konstrukt zur Transformation monokotyler Pflanzen. In transgenen Reiszellen führte die Verwendung des Act1-Introns in Kombination mit dem 35S-Promotor zu einer gegenüber dem isolierten 35S-Promotor um das Zehnfache gesteigerten Expressionsrate. Eine Optimierung der Sequenzumgebung der Translations-Initiationsstelle des Reportergen-Gens (GUS) resultierte in einer vierfachen Steigerung der GUS-Expression in transformierten Reiszellen. Eine Kombination der optimierten Translations-Initiationsstelle und des Act1-Introns resultierte in einer 40-fachen Steigerung der GUS-Expression durch den CaMV35S-Promotor in transformierten Reiszellen; ähnliche Ergebnisse wurden anhand von transformierten Maiszellen erzielt. Insgesamt wurde aus den zuvor beschriebenen Untersuchungen geschlussfolgert, dass die auf dem Act1-Promotor basierenden Expressionsvektoren dazu geeignet sind, eine hinreichend starke und konstitutive Expression von Fremd-DNA in transformierten Zellen monokotyler Pflanzen zu steuern.
• Die Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien in einer der erfindungsgemäßen Expressionskassetten enthalten sein.
• Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel der natürliche Promotor eines bestimmten Gens gegen einen der erfindungsgemäßen Promotoren ausgetauscht werden. Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebespezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der Expressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B. (1998) Methods. 14(4): 381-92). Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.
• Der einzuführende Promotor kann mittels homologer Rekombination vor das transgen zu exprimierende Zielgen platziert werden, indem der Promotor mit DNA-Sequenzen verknüpft wird, die zum Beispiel zu endogenen Sequenzen homolog sind, die dem Leseraster des Zielgens vorgelagert sind. Derartige Sequenzen sind als genetische Kontrollsequenzen zu verstehen. Nachdem eine Zelle mit dem entsprechenden DNA-Konstrukt transformiert wurde, können die beiden homologen Sequenzen interagieren und so die Promotorsequenz an dem gewünschten Ort vor dem Zielgen platzieren, so dass die Promotorsequenz nun in funktioneller Verknüpfung mit dem Zielgen steht und eine erfindungsgemäße Expressionskassette bildet. Die Auswahl der homologen Sequenzen bestimmt den Insertionsort des Promotors. Hierbei kann die Expressionskassette durch homologe Rekombination mittels einer einfachen oder einer doppelt-reziproken Rekombination generiert werden. Bei der einfach reziproken Rekombination wird nur eine einzelne Rekombinationssequenz verwendet und es erfolgt die Insertion der gesamten eingeführten DNA. Bei der doppelt-reziproken Rekombination ist die einzuführende DNA durch zwei homologe Sequenzen flankiert und es erfolgt die Insertion des flankierten Bereiches. Letzteres Verfahren ist geeignet, um wie oben beschrieben den natürlichen Promotor eines bestimmten Gens gegen einen der erfindungsgemäßen Promotoren auszutauschen und so den Expressionsort und -zeitpunkt dieses Gens zu modifizieren. Diese funktionelle Verknüpfung stellt eine erfindungsgemäße Expressionskassette dar.
• Zur Selektion erfolgreich homolog rekombinierter oder auch transformierter Zellen ist es in der Regel erforderlich, einen selektionierbaren Marker zusätzlich einzuführen, der den erfolgreich rekombinierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid), einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84).
• Homologe Rekombination ist ein relativ seltenes Ereignis in höheren Eukaryoten, vor allem in Pflanzen. Zufällige Integrationen in das Wirtsgenom überwiegen. Eine Möglichkeit die zufällig integrierten Sequenzen zu entfernen und so Zellklone mit einer korrekten homologen Rekombination anzureichern, besteht in der Verwendung eines sequenzspezifischen Rekombinationssystems wie in US 6,110,736 beschrieben. Dieses besteht aus drei Elementen: zwei Paaren von spezifischen Rekombinationssequenzen und einer sequenzspezifischen Rekombinase. Diese Rekombinase katalysiert eine Rekombination lediglich zwischen den beiden Paaren von spezifischen Rekombinationsequenzen. Das eine Paar dieser spezifischen DNA-Sequenzen wird außerhalb der zu integrierenden DNA-Sequenz, d. h. außerhalb der beiden homologen DNA-Sequenzen lokalisiert. Im Falle einer korrekten homologen Rekombination werden diese Sequenzen nicht mit in das Genom übertragen. Im Falle einer zufälligen Integration insertieren sie in der Regel zusammen mit dem Rest des Konstruktes. Unter Einsatz einer speziellen Rekombinase und eines Konstruktes enthaltend ein zweites Paar der spezifischen Sequenzen können die zufällig insertierten Sequenzen herausgeschnitten oder durch Inversion inaktiviert werden, während die korrekt über homologe Rekombination insertierten Sequenzen im Genom verbleiben. Eine Vielzahl von sequenzspezifischen Rekombinationssystemen kann verwendet werden, beispielhaft sind das Cre/lox-System des Bacteriophagen P1, das FLP/FRT System der Hefe, die Gin Recombinase des Mu Phagen, die Pin Rekombinase aus E.coli und das R/RS System des pSR1 Plasmids genannt. Bevorzugt sind das Bacteriophagen P1 Cre/lox und das Hefe FLP/FRT System. Hier interagiert die Rekombinase (Cre oder FLP) spezifisch mit ihren jeweiligen Rekombinationssequenzen (34 bp lox-Sequenz bzw. 47 bp FRT-Sequenz) um die zwischengelagerten Sequenzen zu deletieren oder zu invertieren. Das FLP/FRT und cre/lox Rekombinasesystem wurde bereits in pflanzlichen Systemen angewendet (Odell et al. (1990) Mol Gen Genet 223: 369-378).
• Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale sowie - vorzugsweise - solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignalen aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al. (1984) EMBO J 3: 835ff) oder funktionelle Äquivalente davon. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin-Synthase)-Terminator und der NOS (Nopalin- Synthase)-Terminator.
• Dem Fachmann ist eine Vielzahl von Nukleinsäuren bzw. Proteinen bekannt, deren rekombinante Expression gesteuert durch die erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Verfahren vorteilhaft ist. Ferner sind dem Fachmann eine Vielzahl von Genen bekannt, durch deren Reprimierung oder Ausschaltung mittels Expression einer entsprechenden antisense-RNA ebenfalls vorteilhafte Effekte erreicht werden können. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend für vorteilhafte Effekte seien zu nennen:
  
• - Erleichterte Herstellung eines transgenen Organismus beispielsweise durch die Expression von Selektionsmarkern
• - Erzielen einer Resistenz gegen abiotische Stressfaktoren (Hitze, Kälte, Trockenheit, erhöhte Feuchtigkeit, Umweltgifte, UV-Strahlung)
• - Erzielen einer Resistenz gegen biotische Stressfaktoren (Pathogene, Viren, Insekten und Krankheiten)
• - Verbesserung von Nahrungs- oder Futtereigenschaften
• - Verbesserung der Wachstumsrate oder des Ertrages.
• Nachfolgend seien einige konkrete Beispiele für Nukleinsäuren genannt, deren Expression die gewünschten vorteilhaften Effekte bietet:
• 1. Selektionsmarker:
  Selektionsmarker umfasst sowohl positive Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen ein Antibiotikum, Herbizid oder Biozid verleihen, als auch negative Selektionsmarker, die eine Sensitivität gegen eben diese verleihen, als auch Marker die dem transformierten Organismus einen Wachstumsvorteil gewähren (beispielsweise durch Expression von Schlüsselgenen der Cytokinbiosynthese; Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 94: 2117-2121). Bei der positiven Selektion gedeihen nur die Organismen, die den entsprechenden Selektionsmarker exprimieren, während bei der negativen Selektion eben diese eingehen. Bei der Herstellung transgener Pflanzen ist die Verwendung eines positiven Selektionsmarkers bevorzugt. Bevorzugt ist ferner die Verwendung von Selektionsmarkern, die Wachstumsvorteile verleihen. Negative Selektionsmarker können vorteilhaft verwendet werden, wenn es darum geht, bestimmte Gene oder Genomabschnitte aus einem Organismus zu entfernen (beispielsweise im Rahmen eines Kreuzungsprozesses).
• Der mit der Expressionskassette eingebrachte selektionierbare Marker verleiht den erfolgreich rekombinierten oder transformierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid wie Phosphinothricin, Glyphosat oder Bromoxynil), einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum, wie zum Beispiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Dem Fachmann sind zahlreiche derartiger Selektionsmarker und die für diese kodierenden Sequenzen bekannt. Nachfolgend seien beispielhaft jedoch nicht einschränkend zu nennen:
i) Positive Selektionsmarker
• Der mit der Expressionskassette eingebrachte selektionierbare Marker verleiht den erfolgreich rekombinierten oder transformierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid wie Phosphinothricin, Glyphosat oder Bromoxynil), einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder ein Antibiotikum, wie zum Beispiel Tetracycline, Ampicillin, Kanamycin, G 418, Neomycin, Bleomycin oder Hygromycin. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84). Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft als Selektionsmarker seien genannt:
  
• - DNA Sequenzen, die für Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT) kodieren, welche die freie Aminogruppe des Glutaminsynthaseinhibitors Phosphinothricin (PPT) acetylieren und damit eine Detoxifizierung des PPT erreichen (de Block et al. 1987, EMBO J. 6, 2513-2518) (auch Bialophos®-Resistenzgen (bar) genannt). Das bar Gen kodierend für eine Phosphinothricinacetyltransferase (PAT) kann aus beispielsweise Streptomyces hygroscopicus oder S. viridochromogenes isoliert werden. Entsprechende Sequenzen sind dem Fachmann bekannt (aus Streptomyces hygroscopicus GenBank Acc.-No.: X17220 und X05822, aus Streptomyces viridochromogenes GenBank Acc.-No.: M 22827 und X65195; US 5,489,520). Ferner sind synthetische Gene beispielsweise für die Expression in Plastiden beschrieben AJ028212. Ein synthetisches Pat Gen ist beschrieben bei Becker et al. (1994) The Plant J 5: 299-307. Ganz besonders bevorzugt ist ebenfalls die Expression des Polypeptides gemäß SEQ ID NO: 5, beispielsweise kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4. Die Gene verleihen Resistenz gegen das Herbizid Bialaphos® oder Glufosinat und sind vielbenutzte Marker in transgenen Pflanzen (Vickers JE et al. (1996) Plant Mol Biol Reporter 14: 363-368; Thompson CJ et al. (1987) EMBO J 6: 2519-2523).
• - 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP Synthasegene), die eine Resistenz gegen Glyphosat® (N-(phosphonomethyl)glycin) verleihen. Das unselektive Herbizid Glyphosat hat die 5-Enolpyruvyl-3-phosphoshikimatsynthase (EPSPS) als molekulares Target. Diese hat eine Schlüsselfunktion in der Biosynthese aromatischer Aminosäuren in Mikroben und Pflanzen, jedoch nicht in Säugern (Steinrucken HC et al. (1980) Biochem Biophys Res Commun 94: 1207-1212; Levin JG und Sprinson DB (1964) J Biol Chem 239: 1142-1150; Cole DJ (1985) Mode of action of glyphosate; A literature analysis, p. 48-74. In: Grossbard E und Atkinson D (eds.) The herbicide glyphosate. Buttersworths, Boston). Glyphosat-tolerante EPSPS Varianten werden bevorzugt als Selektionsmarker verwendet (Padgette SR et al. (1996). New weed control opportunities: development of soybeans with a Roundup Ready™ gene. In: Herbicide Resistant Crops (Duke 50, ed.), pp. 53-84. CRC Press, Boca Raton, FL; Saroha MK und Malik VS (1998) J Plant Biochemistry and Biotechnology 7: 65-72). Das EPSPS Gen des Agrobacterium sp. strain CP4 hat eine natürliche Toleranz gegen Glyphosat, die auf entsprechende transgene Pflanzen transferiert werden kann. Das CP4 EPSPS Gen wurde aus Agrobacterium sp. strain CP4 kloniert (Padgette SR et al. (1995) Crop Science 35(5): 1451-1461). 5-Enolpyrvylshikimate-3-phosphatesynthasen, die Glyphosat-tolerant sind, wie beispielsweise beschrieben in US 5,510,471; US 5,776,760; US 5,864,425; US 5,633,435; US 5,627; 061; US 5,463,175; EP 0 218 571, sind bevorzugt, wobei die jeweils in den Patenten beschriebenen Sequenzen auch in der GenBank hinterlegt sind. Weitere Sequenzen sind beschrieben unter GenBank Accession X63374. Ferner ist das aroA Gen bevorzugt (M10947 S. typhimurium aroA locus 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (aroA protein) gene).
• - Das für das Glyphosat® degradierende Enzyme kodierende gox Gen (Glyphosatoxidoreduktase). GOX (beispielsweise die Glyphosatoxidoreductase aus Achromobacter sp.) katalysiert die Spaltung einer C-N Bindung im Glyphosat, welches so zu Aminomethylphosphonsäure (AMPA) und Glyoxylat umgesetzt wird. GOX kann dadurch eine Resistenz gegen Glyphosat vermitteln (Padgette SR et al. (1996) J Nutr. 1996 Mar; 126(3): 702-16; Shah D et al. (1986) Science 233: 478-481).
• - das deh Gen (kodierend für eine Dehalogenase, die Dalapon® inaktiviert), (GenBank Acc.-No.: AX022822, AX022820 sowie WO 99/27116)
• - bxn Gene, die für Bromoxynil® degradierende Nitrilaseenzyme kodieren. Beispielsweise die Nitrilase aus Klebstella ozanenae. Sequenzen sind in der GenBank beispielsweise unter den Acc.-No: E01313 (DNA encoding bromoxynil specific nitrilase) und J03196 (K. pneumoniae bromoxynilspecific nitrilase (bxn) gene, complete cds) zu finden.
• - Neomycinphosphotransferasen verleihen eine Resistenz gegen Antibiotika (Aminoglykoside) wie Neomycin, G418, Hygromycin, Paromomycin oder Kanamycin, indem sie durch eine Phosphorylierungsreaktion deren inhibierende Wirkung reduzieren. Besonders bevorzugt ist das nptII Gen. Sequenzen können aus der GenBank erhalten werden (AF080390 Minitransposon mTn5-GNm; AF080389 Minitransposon mTn5-Nm, complete sequence). Zudem ist das Gen bereits Bestandteil zahlreicher Expressionsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden (AF234316 pCAMBIA-2301; AF234315 pCAMBIA-2300, AF234314 pCAMBIA-2201). Das NPTII Gen kodiert für eine Aminoglycosid-3'O-phosphotransferase aus E.coli, Tn5 (GenBank Acc.-No: U00004 Position 1401-2300; Beck et al. (1982) Gene 19 327-336).
• - das DOG®1-Gen. Das Gen DOG®1 wurde aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae isoliert (EP 0 807 836). Es codiert für eine 2-Desoxyglukose-6-phosphat Phosphatase, die Resistenz gegenüber 2-DOG verleiht (Randez-Gil et al. 1995, Yeast 11, 1233-1240; Sanz et al. (1994) Yeast 10: 1195-1202, Sequenz: GenBank Acc.-No.: NC001140 chromosom VIII, Saccharomyces cervisiae Position 194799-194056).
• - Sulfonylharnstoff- und Imidazolinon inaktivierende Acetolactatsynthasen, die eine Resistenz gegen Imidazolinon/Sulfonylharnstoff-Herbizide verleihen. Beispielhaft seien für Imidazolinon-Herbizide die Wirkstoffe Imazamethabenzmethyl, Imazzamox, Imazapyr, Imazaquin, Imazethapyr zu nennen. Für Sulfonylharnstoff-Herbizide seien beispielhaft Amidosulforon, Azimsulfuron, Chlorimuronethyl, Chlorsulfuron, Cinosulfuron, Imazosulforon, Oxasulforon, Prosulforon, Rimsulforon, Sulfosulforon zu nennen. Dem Fachmann sind zahlreiche weitere Wirkstoffe der genannten Klassen bekannt. Geeignet sind beispielsweise die unter der GenBank Acc-No.: X51514 hinterlegte Sequenz für das Arabidopsis thaliana Csr 1.2 Gen (EC 4.1.3.18) (Sathasivan K et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18(8): 2188). Acetolactatesynthasen die eine Resistenz gegen Imidazolinon-Herbizide verleihen sind ferner beschrieben unter den GenBank Acc.-No.:
  • a) AB049823 Oryza sativa ALS mRNA for acetolactate synthase, complete cds, herbicide resistant biotype
  • b) AF094326 Bassia scoparia herbicide resistant acetolactate synthase precursor (ALS) gene, complete cds
  • c) X07645 Tobacco acetolactate synthase gene, ALS SuRB (EC 4.1.3.18)
  • d) X07644 Tobacco acetolactate synthase gene, ALS SuRA (EC 4.1.3.18)
  • e) A19547 Synthetic nucleotide mutant acetolactate synthase
  • f) A19546 Synthetic nucleotide mutant acetolactate synthase
  • g) A19545 Synthetic nucleotide mutant acetolactate synthase
  • h) I05376 Sequence 5 from Patent EP 0257993
  • i) I05373 Sequence 2 from Patent EP 0257993
  • j) AL133315
  Bevorzugt ist die Expression einer Acetolactatsynthase gemäß SEQ ID NO: 7, beispielsweise kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6.
• - Hygromycinphosphotransferasen (X74325 P. pseudomallei gene for hygromycin phosphotransferase) die eine Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin verleihen. Das Gen ist Bestandteil zahlreicher Expressionsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden (AF294981 pINDEX4; AF234301 pCAMBIA-1380; AF234300 pCAMBIA-1304; AF234299 pCAMBIA-1303; AF234298 pCAMBIA-1302; AF354046 pCAMBIA-1305.; AF354045 pCAMBIA-1305.1)
• - Resistenzgene gegen
  • 1. Chloramphenicol (Chloramphenicolacetyltransferase),
  • 2. Tetracyclin, verschiedene Resistenzgene sind beschrieben z. B. X65876 S. ordonez genes class D tetA and tetR for tetracycline resistance and repressor proteins X51366 Bacillus cereus plasmid pBC16 tetracycline resistance gene. Zudem ist das Gen bereits Bestandteil zahlreicher Expressionsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden
  • 3. Streptomycin, verschiedene Resistenzgene sind beschrieben z. B. mit der GenBank Acc.-No.: AJ278607 Corynebacterium acetoacidophilum ant gene for streptomycin adenylyltransferase.
  • 4. Zeocin, das entsprechende Resistenzgen ist Bestandteil zahlreicher Klonierungsvektoren (z. B. L36849 Cloning vector pZEO) und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden.
  • 5. Ampicillin (β-Lactamase Gen; Datta N, Richmond MH. (1966) Biochem J. 98(1): 204-9; Heffron F et al (1975) J. Bacteriol 122: 250-256; das Amp Gen wurde zuerst zur Herstellung des E. coli Vektors pBR322 kloniert; Bolivar F et al. (1977) Gene 2: 95-114). Die Sequenz ist Bestandteil zahlreicher Klonierungsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden.
• - Gene wie die Isopentenyltransferase aus Agrobacterium tumefaciens (strain: PO22) (Genbank Acc.-No.: AB025109). Das ipt Gen ist ein Schlüsselenzym der Cytokin-Biosynthese. Seine Überexpression erleichtert die Regeneration von Pflanzen (z. B. Selektion auf Cytokin-freiem Medium). Das Verfahren zur Nutzung des ipt Gens ist beschrieben (Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 94: 2117-2121; Ebinuma H et al. (2000) Selection of Marker-free transgenic plants using the oncogenes (ipt, rol A, B, C) of Agrobacterium as selectable markers, In Molecular Biology of Woody Plants. Kluwer Academic Publishers).
  Verschiedene weitere positive Selektionsmarker, die den transformierten Pflanzen einen Wachstumsvorteil gegenüber nicht-transformierten verleihen, sowie Verfahren zu ihrer Verwendung sind u. a. beschrieben in EP-A 0 601 092. Beispielhaft sind zu nennen β-Glucuronidase (in Verbindung mit z. B. Cytokininglucuronid), Mannose-6-phosphat-Isomerase (in Verbindung mit Mannose), UDP-Galaktose-4-Epimerase (in Verbindung mit z. B. Galactose), wobei Mannose-6-phosphat-Isomerase in Verbindung mit Mannose besonders bevorzugt ist.
ii) Negative Selektionsmarker
• Negative Selektionsmarker ermöglichen beispielsweise die Selektion von Organismen mit erfolgreich deletierten Sequenzen, die das Markergen umfassen (Koprek T et al. (1999) The Plant Journal 19(6):719-726). Bei der negativen Selektion wird beispielsweise durch den in die Pflanze eingebrachten negativen Selektionsmarker eine Verbindung, die ansonsten für die Pflanze keine nachteilige Wirkung hat, in eine Verbindung mit nachteiliger Wirkung umgesetzt. Ferner sind Gene geeignet, die per se eine nachteilige Wirkung haben, wie zum Beispiel TK thymidine kinase (TK), Diphtheria Toxin A Fragment (DT-A), das codA Genprodukt kodierend für eine Cytosindeaminase (Gleave AP et al. (1999) Plant Mol Biol. 40(2): 223-35; Perera RJ et al. (1993) Plant Mol Biol 23(4): 793-799; Stougaard J; (1993) Plant J 3: 755-761), das Cytochrom P450 Gen (Koprek et al. (1999) Plant J 16: 719-726), Gene kodierend für eine Haloalkan Dehalogenase (Naested H (1999) Plant J. 18: 571-576), das iaaH Gen (Sundaresan V et al. (1995) Genes & Development 9: 1797-1810) oder das tms2 Gen (Fedoroff NV & Smith DL 1993, Plant J 3: 273-289).
• Die jeweils für die Selektion verwendeten Konzentrationen der Antibiotika, Herbizide, Biozide oder Toxine müssen an die jeweiligen Testbedingungen bzw. Organismen angepasst werden. Beispielhaft seien für Pflanzen zu nennen Kanamycin (Km) 50 mg/l, Hygromycin B 40 mg/l, Phosphinothricin (Ppt) 6 mg/l.
• Ferner können funktionelle Analoga der genannten Nukleinsäuren kodierend für Selektionsmarker exprimiert werden. Funktionelle Analoga meint hier all die Sequenzen, die im wesentlichen die gleiche Funktion haben d. h. zu einer Selektion transformierter Organismen befähigt sind. Dabei kann das funktionelle Analogon sich in anderen Merkmalen durchaus unterscheiden. Es kann zum Beispiel eine höhere oder niedrigere Aktivität haben oder auch über weitere Funktionalitäten verfügen.
• 2. Verbesserter Schutz der Pflanze gegen abiotische Stressfaktoren wie Trockenheit, Hitze, oder Kälte zum Beispiel durch Überexpression von "antifreeze"-Polypeptiden aus Myoxocephalus Scorpius (WO 00/00512), Myoxocephalus octodecemspinosus, dem Arabidopsis thaliana Transkriptionsaktivator CBF1, Glutamatdehydrogenasen (WO 97/12983, WO 98/11240), Calcium-abhängigen Proteinkinasegenen (WO 98/26045), Calcineurinen (WO 99/05902), Farnesyltransferasen (WO 99/06580), Pei ZM et al., (Science 1998, 282: 287-290, Ferritin (Deak M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 192-196), Oxalatoxidase (WO 99/04013; Dunwell JM Biotechnology and Genetic Engeneering Reviews 1998, 15: 1-32), DREB1A-Faktor (dehydration response element B 1A; Kasuga M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 276-286), Genen der Mannitol- oder Trehalosesynthese wie der Trehalosephosphatsynthase oder der Trehalosephosphatphosphatase (WO 97/42326), oder durch Inhibition von Genen wie der Trehalase (WO 97/50561). Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für den transkriptionellen Aktivator CBF1 aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: U77378) oder das "antifreeze protein" aus Myoxocephalus octodecemspinosus (GenBank Acc.-No.: AF306348) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
• 3. Expression von Stoffwechselenzymen zur Verwendung im Futter- und Nahrungsmittelbereich, zum Beispiel die Expression von Phytase und Cellulasen. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren wie die künstliche für eine mikrobielle Phytase kodierende cDNA (GenBank Acc.-No.: A19451) oder funktionelle Äquivalente derselben.
• 4. Erreichen einer Resistenz zum Beispiel gegen Pilze, Insekten, Nematoden und Krankheiten durch gezielte Absonderung oder Anreicherung bestimmter Metaboliten oder Proteine in der Epidermis des Embryos. Beispielhaft seien genannt Glucosinolate (Abwehr von Herbivoren), Chitinasen oder Glucanasen und andere Enzyme die die Zellwand von Parasiten zerstören, Ribosom-inaktivierende Proteine (RIPs) und andere Proteine der pflanzlichen Resistenz- und Stressreaktion, wie sie bei Verletzung oder mikrobiellem Befall von Pflanzen oder chemisch durch zum Beispiel Salicylsäure, Jasmonsäure oder Ethylen induziert werden, Lysozyme aus nicht-pflanzlichen Quellen wie zum Beispiel T4 Lysozym oder Lysozm aus verschiedenen Säugern, insektizide Proteine wie Bacillus thuringiensis Endotoxin, α-Amylaseinhibitor oder Proteaseinhibitoren (cowpea Trypsininhibitor), Glucanasen, Lectine wie Phytohemagglutinin, Schneeglöckchenlectin, Weizenkeimagglutinin, RNAsen oder Ribozyme. Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die chit42 Endochitinase aus Trichoderma harzianum (Gen- Bank Acc.-No.: 578423) oder für das N-hydroxylierende, multifunktionelle Cytochrom P-450 (CYP79) Protein aus Sorghum bicolor (GenBank Acc.-No.: U32624) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
• Bekannt ist die Akkumulation von Glucosinolaten in Pflanzen der Gattung der Cardales insbesondere der Ölsaaten zum Schutz vor Schädlingen (Rask L et al. (2000) Plant Mol Biol 42: 93-113; Menard R et al. (1999) Phytochemistry 52: 29-35), die Expression des Bacillus thuringiensis Endotoxin unter Kontrolle des 35S CaMV Promotors (Vaeck et al. (1987) Nature 328: 33-37) oder der Schutz des Tabaks gegen Pilzbefall durch Expression einer Chitinase aus der Bohne unter Kontrolle des CaMV Promotors (Broglie et al. (1991) Science 254: 1194-1197).
• Durch Expression des Lectins Agglutinin aus Schneeglöckchen (Galanthus nivalis) kann eine Resistenz gegen Schädlinge wie den Reisschädling Nilaparvata lugens beispielsweise in transgenen Reispflanzen erreicht werden (Rao et al. (1998) Plant J. 15(4): 469-77). Nilaparvata lugens zählt zu den Phloemsaugenden Schädlingen und fungiert darüberhinaus als Überträger bedeutender Virus-bedingter Pflanzenkrankheiten.
• Die Expression synthetischer cryIA(b) and cryIA(c) Gene, die für Lepidopteren-spezifische delta-Endotoxine aus Bacillus thuringiensis kodieren, kann in verschiedenen Pflanzen eine Resistenz gegen Schadinsekten bewirken. So kann in Reis eine Resistenz gegen zwei der wichtigsten Reisschädlinge, den gestreiften Stengelbohrer (Chilo suppressalis) und den gelben Stengelbohrer (Scirpophaga incertulas), erzielt werden (Cheng X et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(6): 2767-2772; Nayak P et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6): 2111-2116).
• 5. Expression von Genen, die eine Akkumulation von Feinchemikalien, wie von Tocopherolen, Tocotrienolen oder Carotinoiden bewirken. Beispielhaft sei die Phytoendesaturase genannt. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Phytoendesaturase aus Narcissus pseudonarcissus (GenBank Acc.-No.: X78815) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
• 6. Produktion von Nutraceuticals wie zum Beispiel polyungesättigten Fettsäuren wie beispielsweise Arachidonsäure oder EP (Eicosapentaensäure) oder DHA (Docosahexaensäure) durch Expression von Fettsäureelongasen und/oder -desaturasen oder Produktion von Proteinen mit verbessertem Nahrungswert wie zum Beispiel mit einem hohen Anteil an essentiellen Aminosäuren (z. B. das methioninreiche 2S Albumingen der Brasilnuss). Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für das methioninreiche 2S Albumin aus Bertholletia excelsa (GenBank Acc.-No.: AB044391), die Δ6-Acyllipiddesaturase aus Physcomitrella patens (GenBank Acc.-No.: AJ222980; Girke et al 1998, The Plant Journal 15: 39-48), die Δ6-Desaturase aus Mortierella alpina (Sakuradani et al 1999 Gene 238: 445-453), die Δ5-Desaturase aus Caenorhabditis elegans (Michaelson et al. 1998, FEBS Letters 439: 215-218), die Δ5-Fettsäuredesaturase (des-5) aus Caenorhabditis elegans (GenBank Acc.-No.: AF078796), die Δ5-Desaturase aus Mortierella alpina (Michaelson et al. JBC 273: 19055-19059), die Δ6-Elongase aus Caenorhabditis elegans (Beaudoin et al. 2000, PNAS 97: 6421-6426), die Δ6-Elongase aus Physcomitrella patens (Zank et al. 2000, Biochemical Society Transactions 28: 654-657) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
• 7. Produktion von Feinchemikalien (wie beispielsweise Enzymen) und Pharmazeutika (wie zum Beispiel Antikörpern oder Vakzinen wie beschrieben bei Hood EE, Jilka JM. (1999) Curr Opin Biotechnol. 10(4): 382-6; Ma JK, Vine ND (1999) Curr Top Microbiol Immunol 236: 275-92). Beispielweise konnte rekombinantes Avidin aus Hühnereiweiß und bakterieller β-Glucuronidase (GUS) in großen Maßstab in transgenen Maispflanzen produziert werden (Hood et al. (1999) Adv Exp Med Biol 464: 127-47 Review). Diese rekombinanten Proteine aus Maispflanzen werden von der Firma Sigma (Sigma Chemicals Co) als hochreine Biochemikalien vertrieben.
• 8. Erreichen einer erhöhten Speicherfähigkeit in Zellen, die normalerweise weniger Speicherproteine oder -lipide enthalten mit dem Ziel, den Ertrag an diesen Substanzen zu erhöhen, zum Beispiel durch Expression eine Acetyl-CoA Carboxylase. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Acetyl-CoA Carboxylase (Accase) aus Medicago sativa (GenBank Acc.-No.: L25042) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.
• Weitere Beispiele für vorteilhafte Gene sind zum Beispiel genannt bei Dunwell JM, Transgenic approaches to crop improvement, J Exp Bot. 2000; 51 Spec No; Seite 487-96.
• Ferner können funktionelle Analoga der genannten Nukleinsäuren bzw. Proteine exprimiert werden. Funktionelle Analoga meint hier all die Sequenzen, die im wesentlichen die gleiche Funktion haben d. h. zu der Funktion (zum Beispiel einer Substratumsetzung oder einer Signaltransduktion) befähigt sind wie auch das beispielhaft genannte Protein. Dabei kann das funktionelle Analogon sich in anderen Merkmalen durchaus unterscheiden. Es kann zum Beispiel eine höhere oder niedrigere Aktivität haben oder auch über weitere Funktionalitäten verfügen. Funktionelle Analoga meint ferner Sequenzen, die für Fusionsproteine bestehend aus einem der bevorzugten Proteine und anderen Proteinen zum Beispiel einem weiteren bevorzugten Protein oder aber auch einer Signalpeptidsequenz kodieren.
• Die Expression der Nukleinsäuren unter Kontrolle der Erfindungsgemäßen Promotoren ist in jedem gewünschten Zellkompartiment, wie z. B. dem Endomembransystem, der Vakuole und den Chloroplasten möglich. Durch Nutzung des sekretorischen Weges sind gewünschte Glykosylierungsreaktionen, besondere Faltungen u. ä. möglich. Auch die Sekretion des Zielproteins zur Zelloberfläche bzw. die Sezernierung ins Kulturmedium, beispielsweise bei Nutzung suspensionskultivierter Zellen oder Protoplasten ist möglich. Die dafür notwendigen Targetsequenzen können sowohl in einzelnen Vektorvariationen berücksichtigt werden als auch durch Verwendung einer geeigneten Klonierungsstrategie gemeinsam mit dem zu klonierenden Zielgen in den Vektor mit eingebracht werden. Als Targetsequenzen können sowohl geneigene, sofern vorhanden, oder heterologe Sequenzen genutzt werden. Zusätzliche, heterologe zur funktionellen Verknüpfung bevorzugte aber nicht darauf beschränkte Sequenzen sind weitere Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, in Mitochondriem, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten; sowie Translationsverstärker wie die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711) und dergleichen. Das Verfahren, an sich nicht in den Plastiden lokalisierte Proteine, gezielt in die Plastiden zu transportieren, ist beschrieben (Klosgen RB und Weil JH (1991) Mol Gen Genet 225(2): 297-304; Van Breusegem F et al. (1998) Plant Mol Biol 38(3): 491-496). Bevorzugte Sequenzen sind:
  
• a) kleine Untereinheit (SSU) der Ribulosebisphosphatcarboxylase (Rubisco ssu) aus Erbse, Mais, Sonnenblume
• b) Transitpeptide abgeleitet von Genen der pflanzlichen Fettsäurebiosynthese wie das Transitpeptid des plastidären "Acyl Carrier Protein" (ACP), die Stearyl-ACP-Desaturase, β-Ketoacyl-ACP Synthase oder die Acyl-ACP-Thioesterase.
• c) das Transitpeptid für GBSSI ("Granule Bound Starch Synthase I").
• d) LHCP II Gene.
• Die Zielsequenzen können mit anderen, von dem Transitpeptid kodierenden Sequenzen verschiedenen, Targeting-Sequenzen verknüpft sein, um eine subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten zu gewährleisten. Ferner können Translationsverstärker wie die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693-8711) und dergleichen zum Einsatz kommen.
• Dem Fachmann ist ferner bekannt, dass er die oben beschriebenen Gene nicht direkt unter Verwendung der für diese Gene kodierenden Nukleinsäuresequenzen exprimieren oder zum Beispiel durch antisense reprimieren muss. Er kann auch zum Beispiel künstliche Transkriptionsfaktoren vom Typ der Zinkfingerproteine verwenden (Beerli RR et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(4): 1495-500). Diese Faktoren lagern sich in den regulatorischen Bereichen der zu exprimierenden oder zu reprimierenden endogenen Gene an und bewirken, je nach Gestaltung des Faktors, eine Expression oder Repression des endogenen Gens. So kann man die gewünschten Effekte auch durch Expression eines entsprechenden Zinkfinger- Transkriptionsfaktors unter Kontrolle eines der erfindungsgemäßen Promotoren erreichen.
• Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten können ebenso zur Unterdrückung bzw. Reduktion von Replikation oder/und Translation von Targetgenen durch "gene silencing" eingesetzt werden.
• Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten können auch eingesetzt werden, um Nukleinsäuren zu exprimieren, die sogenannte "antisense" Effekte vermitteln und so beispielsweise zur Verminderung der Expression eines Zielproteins befähigt sind.
• Bevorzugte Gene bzw. Proteine, deren Suppression einen vorteilhaften Phänotyp bedingt, umfassen beispielhaft, aber nicht einschränkend:
  
• a) Polygalakturonase zur Verhinderung von Zellabbau und "Matschig"-werden von Pflanzen und Früchten beispielsweise Tomaten. Bevorzugt werden dazu Nukleinsäuresequenzen wie die des Polygalakturonase-Gens der Tomate (GenBank Acc.-No.: X14074) oder dessen Homologe aus anderen Gattungen und Arten verwendet.
• b) Verminderung der Expression von allergenen Proteinen wie beispielsweise beschrieben bei Tada Y et al. (1996) FEBS Lett 391(3): 341-345 oder Nakamura R (1996) Biosci Biotechnol Biochem 60(8): 1215-1221.
• c) Veränderung der Blütenfarbe durch Suppression der Expression von Enzymen der Anthocyanbiosynthese. Entsprechende Vorgehensweisen sind beschrieben (beispielsweise bei Forkmann G, Martens S. (2001) Curr Opin Biotechnol 12(2): 155-160). Bevorzugt werden dazu Nukleinsäuresequenzen wie die der Flavonoid-3'-hydroxylase (GenBank Acc.-No.: AB045593), der Dihydroflavanol-4-reduktase (GenBank Acc.-No.: AF017451), der Chalconisomerase (GenBank Acc.-No.: AF276302), der Chalconsynthase (GenBank Acc.-No.: AB061022), der Flavanone-3-beta- hydroxylase (GenBank Acc.-No.: X72592) oder der Flavonesynthase II (GenBank Acc.-No.: AB045592) oder deren Homologe aus anderen Gattungen und Arten verwendet.
• d) Verschiebung des Amylose/Amylopektingehaltes in Stärke durch Suppression des Verzweigungsenzyms Q, das für die α-1,6-glykosidische Verknüpfung verantwortlich ist. Entsprechende Vorgehensweisen sind beschrieben (beispielsweise bei Schwall GP et al. (2000) Nat Biotechnol 18(5): 551-554). Bevorzugt werden dazu Nukleinsäuresequenzen wie die des Starch branching enzyme II der Kartoffel (GenBank Acc.-No.: AR123356; US 6,169,226) oder dessen Homologe aus anderen Gattungen und Arten verwendet.
• Eine "antisense" Nukleinsäure meint zunächst eine Nukleinsäuresequenz die ganz oder teilweise zu zumindest einem Teil des "sense"-Stranges besagten Zielproteins komplementär ist. Dem Fachmann ist bekannt, dass er alternativ die cDNA oder das korrespondierende Gen als Ausgangsmatrize für entsprechende antisense-Konstrukte verwenden kann. Bevorzugt ist die "antisense" Nukleinsäure komplementär zu dem kodierenden Bereich des Zielproteins oder einem Teil desselben. Die "antisense" Nukleinsäure kann aber auch zu der nicht-kodierenden Region oder einem Teil derselben komplementär sein. Ausgehend von der Sequenzinformation zu einem Zielprotein, kann eine antisense Nukleinsäure unter Berücksichtigung der Basenpaarregeln von Watson und Crick in der dem Fachmann geläufigen Weise entworfen werden. Eine antisense Nukleinsäure kann komplementär zu der gesamten oder einem Teil der Nukleinsäuresequenz eines Zielproteins sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die antisense Nukleinsäure ein Oligonukleotid mit einer Länge von zum Beispiel 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotiden.
• Die antisense Nukleinsäure umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform α-anomere Nukleinsäuremoleküle. α-Anomere Nukleinsäuremoleküle bilden besondere doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA in denen im Unterschied zu den normalen β-Einheiten die Stränge parallel zu einander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15: 6625-6641).
• Ebenso umfasst ist die Verwendung der oben beschriebenen Sequenzen in sense-Orientierung, was wie dem Fachmann geläufig ist, zu einer Kosuppression führen kann. In Tabak, Tomate und Petunie ist demonstriert worden, dass die Expression von sense- RNA zu einem endogenen Gen, die Expression desselben vermindern oder ausschalten kann, ähnlich wie es für antisense Ansätze beschrieben wurde (Goring et al. (1991) Proc. Natl Acad Sci USA, 88: 1770-1774; Smith et al. (1990) Mol Gen Genet 224: 447-481; Napoli et al. (1990) Plant Cell 2: 279-289; Van der Krol et al. (1990) Plant Cell 2: 291-299). Dabei kann das eingeführte Konstrukt das zu vermindernde Gen ganz oder nur teilweise repräsentieren. Die Möglichkeit zur Translation ist nicht erforderlich.
• Ganz besonders bevorzugt ist auch die Verwendung von Verfahren wie der Genregulation mittels doppelsträngiger RNA ("doublestranded RNA interference"). Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann bekannt und im Detail beschrieben (z. B. Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43: 401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391: 806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364). Auf die in den angegebenen Zitaten beschriebenen Verfahren und Methoden wird ausdrücklich Bezug genommen. Hier wird durch gleichzeitige Einbringung von Strang- und Gegenstrang eine hocheffiziente Unterdrückung nativer Gene bewirkt.
• Vorteilhaft kann die antisense-Strategie mit einem Ribozym-Verfahren gekoppelt werden. Ribozyme sind katalytisch aktive RNA Sequenzen, die gekoppelt an die antisense Sequenzen, die Zielsequenzen katalytisch spalten (Tanner NK. FEMS Microbiol Rev. 1999; 23 (3): 257-75). Dies kann die Effizienz einer anti-sense Strategie erhöhen. Die Expression von Ribozymen zur Verminderung bestimmter Proteine ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in EP-A1 0 291 533, EP-A1 0 321 201 und EP-A1 0 360 257. Geeignete Zielsequenzen und Ribozyme können zum Beispiel wie bei Steinecke (Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al eds Academic Press, Inc. (1995), 449-460) beschrieben, durch Sekundärstrukturberechnungen von Ribozym- und Ziel-RNA sowie durch deren Interaktion bestimmt werden (Bayley CC et al., Plant Mol Biol. 1992; 18(2): 353-361; Lloyd AM and Davis RW et al., Mol Gen Genet. 1994 Mar; 242(6): 653-657). Beispielhaft sind "hammerhead"-Ribozyme zu nennen (Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334: 585-591). Bevorzugte Ribozyme basieren auf Derivaten der Tetrahymena L-19 IVS RNA (US 4,987,071; US 5,116,742). Weitere Ribozyme mit Selektivität für eine L119 mRNA können selektioniert werden (Bartel D und Szostak JW (1993) Science 261: 1411-1418).
• In einer weiteren Ausführungsform kann Verminderung der Zielprotein-Expression unter Verwendung von Nukleinsäureseguenzen bewirkt werden, die komplementär zu regulativen Elementen der Zielprotein-Gene sind, mit diesen eine triple-helikale Struktur ausbilden und so die Gen-Transkription verhindern (Helene C (1991) Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84; Helene C et al. (1992) Ann NY Acad Sci 660: 27-36; Maher LJ (1992) Bioassays 14(12): 807-815).
• Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten und die von ihnen abgeleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten.
• Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder von diesen abgeleitete Vektoren oder Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:
  
• a) Reportergene, die für leicht guantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz, des Expressionsortes oder -zeitpunktes gewährleisten. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Gene kodierend für Reporter-Proteine (siehe auch Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1): 29-44) wie
  • - "green fluorescence protein" (GFP) (Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechnigues. 23(5): 912-8, 1997; Sheen et al. (1995) Plant Journal 8(5): 777-784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6): 2122-2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12): 5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16: 267-271; WO 97/41228).
  • - Chloramphenicoltransferase (Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828),
  • - Luziferase (Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10: 324-414; Ow et al. (1986) Science, 234: 856-859); erlaubt Bioluminescenzdetektion.
  • - β-Galactosidase, kodiert für ein Enzym für das verschiedenen chromogene Substrate zur Verfügung stehen.
  • - β-Glucuronidase (GUS) (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907) oder das uidA Gen, das ein Enzym für verschiedene chromogene Substrate kodiert.
  • - R-Locus Genprodukt: Protein, das die Produktion von Anthocyaninpigmenten (rote Färbung) in pflanzlichen Gewebe reguliert und so eine direkte Analyse der Promotoraktivität ohne Zugabe zusätzlicher Hilfsstoffe oder chromogener Substrate ermöglicht (Dellaporta et al., In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11: 263-282, 1988).
  • - β-Lactamase (Sutcliffe (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75: 3737-3741), Enzym für verschiedene chromogene Substrate (z. B. PADAC, eine chromogenes Cephalosporin).
  • - xylE Genprodukt (Zukowsky et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80: 1101-1105), Catecholdioxygenase, die chromogene Catechole umsetzen kann.
  • - Alpha-Amylase (Ikuta et al. (1990) Biotechnol 8: 241-242).
  • - Tyrosinase (Katz et al. (1983) J Gen Microbiol 129: 2703-2714), Enzym, das Tyrosin zu DOPA und Dopaquinon oxidiert, die infolge das leicht nachweisbare Melanin bilden.
  • - Aequorin (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3): 1259-1268), kann in der Calciumsensitiven Bioluminescenzdetektion verwendet werden.
• b) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in zum Beispiel E. coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2^nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
• c) Elemente zum Beispiel "Bordersequenzen", die einen Agrobakterien-vermittelten Transfer in Pflanzenzellen für die Übertragung und Integration ins Pflanzengenom ermöglichen, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.
• d) Multiple Klonierungsregionen (MCS) erlauben und erleichtern die Insertion eines oder mehrerer Nukleinsäuresequenzen.
• Dem Fachmann sind verschiedene Wege bekannt, um zu einer erfindungsgemäßen Expressionskassette zu gelangen. Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt beispielsweise durch Fusion eines der erfindungsgemäßen Promotoren (oder eines funkionellen Äquivalentes) oder funktionell äquivalenten Teils gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 oder eines funktionellen Äquivalentes mit einer zu exprimierenden Nukleotidsequenz, gegebenenfalls einer für ein Transitpeptid kodierenden Sequenz, vorzugsweise ein chloroplastenspezifisches Transitpeptid, welches vorzugsweise zwischen dem Promotor und der jeweiligen Nukleotidsequenz angeordnet ist, sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience beschrieben sind.
• Unter einer Expressionskassette sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen der Promotor, ohne dass er zuvor mit einer zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpft wurde, zum Beispiel über eine gezielte homologe Rekombination oder eine zufällige Insertion in ein Wirtsgenom eingeführt wird, dort regulatorische Kontrolle über mit ihm dann funktionell verknüpfte Nukleinsäuresequenzen übernimmt und die transgene Expression derselben steuert. Durch Insertion des Promotors - zum Beispiel durch eine homologe Rekombination - vor eine für ein bestimmtes Polypeptid kodierende Nukleinsäure erhält man eine erfindungsgemäße Expressionskassette, die die Expression des bestimmten Polypeptides in der Pflanze steuert. Ferner kann die Insertion des Promotors auch derart erfolgen, dass antisense-RNA zu der für ein bestimmtes Polypeptid kodierenden Nukleinsäure exprimiert wird. Damit wird die Expression des bestimmten Polypeptides in Pflanzen herunterreguliert oder ausgeschaltet.
• Analog kann auch eine transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz zum Beispiel durch eine homologe Rekombination hinter den endogenen, natürlichen Promotor plaziert werden, wodurch man eine erfindungsgemäße Expressionskassette erhält, die die Expression der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz in den Keimblättern des pflanzlichen Embryos steuert.
• Erfindungsgemäß sind ferner Vektoren, die die oben beschriebenen Expressionskassetten enthalten. Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobakterien sein.
• Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Organismen, transformiert mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Expressionskassette oder einem erfindungsgemäßen Vektor, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile - wie zum Beispiel bei pflanzlichen Organismen Blätter, Wurzeln usw. - oder Vermehrungsgut abgeleitet von solchen Organismen.
• Unter Organismus, Ausgangs- oder Wirtsorganismen werden prokaryotische oder eukaryotische Organismen, wie beispielsweise Mikroorganismen oder pflanzliche Organismen verstanden. Bevorzugte Mikroorganismen sind Bakterien, Hefen, Algen oder Pilze.
• Bevorzugte Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyanobakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis.
• Bevorzugt sind vor allem Mikroorganismen, welche zur Infektion von Pflanzen und damit zur Übertragung der erfindungsgemäßen Kassetten befähigt sind. Bevorzugte Mikroorganismen sind solche aus der Gattung Agrobakterium und insbesondere der Art Agrobakterium tumefaciens.
• Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Hansenula oder Pichia.
• Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria oder weitere in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1, 2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 beschriebene Pilze.
• Als transgene Organismen bevorzugte Wirts- oder Ausgangsorganismen sind vor allem Pflanzen. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches. Eingeschlossen sind ferner die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zellkulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
• Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen sind bevorzuge Wirtsorganismen für die Herstellung transgener Pflanzen. Die Expression von Genen ist ferner vorteilhaft bei allen Schmuckpflanzen, Nutz- oder Zierbäumen, Blumen, Schnittblumen, Sträuchern oder Rasen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moose); Pteridophyten wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden; Gymnospermen wie Koniferen, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen; Algen wie Chlorophyceae, Phaeophpyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Bacillariophyceae (Diatomeen) und Euglenophyceae.
• Bevorzugt sind Pflanzen nachfolgender Pflanzenfamilien:
  Amaranthaceae, Asteraceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Papilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Rubiaceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanacea, Sterculiaceae, Tetragoniacea, Theaceae, Umbelliferae.
• Bevorzugte monokotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel der Familie der Gramineae wie Reis, Mais, Weizen oder andere Getreidearten wie Gerste, Hirse, Roggen, Triticale oder Hafer sowie dem Zuckerrohr sowie alle Arten von Gräsern.
• Bevorzugte dikotyle Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel
  
• - Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes oder Calendula und andere mehr,
• - Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art sativa (Salat) und andere mehr,
• - Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten napus (Raps), campestris (Rübe), oleracea cv Tastie (Kohl), oleracea cv Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Emperor (Broccoli) und weitere Kohlarten; und der Gattung Arabidopsis, ganz besonders die Art thaliana sowie Kresse oder Canola und andere mehr,
• - Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini und andere mehr,
• - Leguminosae besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) Soja sowie Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss und andere mehr
• - Rubiaceae, bevorzugt der Unterklasse Lamüdae wie beispielsweise Coffea arabica oder Coffea liberica (Kaffestrauch) und andere mehr,
• - Solanaceae besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate) und die Gattung Solanum, ganz besonders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) sowie Tabak oder Paprika und andere mehr,
• - Sterculiaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispielsweise Theobroma cacao (Kakaostrauch) und andere mehr,
• - Theaceae, bevorzugt der Unterklasse Dillenüdae wie beispielsweise Camellia sinensis oder Thea sinensis (Teestrauch) und andere mehr,
• - Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota (Karotte)) und Apium (ganz besonders die Art graveolens dulce (Selarie)) und andere mehr; und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annum (Pfeffer) und andere mehr,
sowie Lein, Soja, Baumwolle, Hanf, Flachs, Gurke, Spinat, Möhre, Zuckerrübe und den verschiedenen Baum-, Nuss- und Weinarten, insbesondere Banane und Kiwi.
• Umfasst sind ferner Schmuckpflanzen, Nutz- oder Zierbäumen, Blumen, Schnittblumen, Sträuchern oder Rasen. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen Angiospermen, Bryophyten wie zum Beispiel Hepaticae (Leberblümchen) und Musci (Moose); Pteridophyten wie Farne, Schachtelhalm und Lycopoden; Gymnospermen wie Koniferen, Cycaden, Ginkgo und Gnetalen, die Familien der Rosaceae wie Rose, Ericaceae wie Rhododendrons und Azaleen, Euphorbiaceae wie Weihnachtssterne und Kroton, Caryophyllaceae wie Nelken, Solanaceae wie Petunien, Gesneriaceae wie das Usambaraveilchen, Balsaminaceae wie das Springkraut, Orchidaceae wie Orchideen, Iridaceae wie Gladiolen, Iris, Freesie und Krokus, Compositae wie Ringelblume, Geraniaceae wie Geranien, Liliaceae wie der Drachenbaum, Moraceae wie Ficus, Araceae wie Philodendron und andere mehr.
• Am meisten bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Tagetes erecta, Calendula officinalis und Brassica napus sowie alle Gattungen und Arten, die als Nahrungs- oder Futtermittel zum Einsatz kommen, wie die beschriebenen Getreidearten, oder sich zur Herstellung von Ölen eignen, wie Ölsaaten (wie zum Beispiel Raps), Nussarten, Soja, Sonnenblume, Kürbis und Erdnuss.
• Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Beispiel Algen oder Cyanobakterien, sowie Moose.
• Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella.
• Die Herstellung eines transformierten Organismus oder einer transformierten Zelle erfordert, dass die entsprechende DNA in die entsprechende Wirtszelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (siehe auch Keown et al. 1990 Methods in Enzymology 185: 527-537). So kann die DNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden.
• Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion.
• Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden. Diese Stämme enthalten ein Plasmid (Ti bzw. Ri Plasmid), das auf die Pflanze nach Agrobacterium-Infektion übertragen wird. Ein Teil dieses Plasmids, genannt T-DNA (transferred DNA), wird in das Genom der Pflanzenzelle integriert.
• Die Agrobacterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone, diploide Pflanzenzellen geeignet, wohingegen die direkten Transformationstechniken sich für jeden Zelltyp eignen.
• Die Einführung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette in Zellen, bevorzugt in pflanzliche Zellen, kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden.
• In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Einführung der Expressionskassette mittels Plasmidvektoren realisiert. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen.
• Im Falle von Injektion oder Elektroporation von DNA in pflanzliche Zellen sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.
• Transformationstechniken sind für verschiedene monokotyle und dikotyle pflanzliche Organismen beschrieben. Ferner stehen verschiedene mögliche Plasmidvektoren für die Einführung fremder Gene in Pflanzen zur Verfügung, die in der Regel einen Replikationsursprung für eine Vermehrung in E.coli und ein Markergen für eine Selektion transformierter Bakterien enthalten. Beispiele sind pBR322, pUC Reihe, M13mp Reihe, pACYC184 etc.
• Die Expressionskassette kann in den Vektor über eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Das entstandene Plasmid wird zunächst in E.coli eingeführt. Korrekt transformierte E.coli werden selektioniert, gezüchtet und das rekombinante Plasmid mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen.
• Transformierte Zellen d. h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionierbarer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide zu verleihen vermag. Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Beispiel sind das bar Gen, dass Resistenz gegen das Herbizid Phosphinothricin verleiht (Rathore KS et al.,Plant Mol Biol. 1993 Mar; 21(5): 871-884), das nptII Gen, dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht.
• Je nach Methode der DNA-Einführung können weitere Gene auf dem Vektorplasmid erforderlich sein. Werden Agrobacteria verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Wenn zum Beispiel ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette verbunden. Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). Das Selektionsmarkergen erlaubt eine Selektion transformierter Agrobacteria und ist zum Beispiel das nptII Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden.
• Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46 and An et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. U.S.A.).
• Für den Transfer der DNA in die pflanzliche Zelle werden pflanzliche Explantate mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert. Ausgehend von infiziertem Pflanzenmaterial (z. B. Blatt-, Wurzel- oder Stengelteile, aber auch Protoplasten oder Suspensionen von Pflanzenzellen) können ganze Pflanzen unter Verwendung eines geeigneten Mediums, dass zum Beispiel Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, regeneriert werden. Die erhaltenen Pflanzen können dann auf die Präsenz der eingeführten DNA, hier der erfindungsgemäßen Expressionskassette, durchmustert werden. Sobald die DNA in das Wirtsgenom integriert ist, ist der entsprechende Genotyp in der Regel stabil und die entsprechende Insertion wird auch in den Nachfolgegenerationen wiedergefunden. In der Regel enthält die integrierte Expressionskassette einen Selektionsmarker, der der transformierten Pflanze eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid), einen Metabolismusinhibitor wie 2-DOG oder ein Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinothricin etc. verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.
• Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von Kung SD und Wu R, Academic Press (1993), S. 128-143 sowie in Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42: 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobakterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12: 8711f.).
• Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zellmassen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden.
• Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten Nukleinsäuren kann beispielsweise in vitro durch Sprossmeristemvermehrung unter Verwendung einer der oben beschriebenen Selektionsmethoden ermittelt werden.
• Erfindungsgemäß sind ferner von den oben beschriebenen transgenen Organismen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc. -, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte.
• Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemäße, genetisch veränderte Pflanzen können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Aufbereitung als Nahrungsmittel oder Futtermittel verwendet werden.
• Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der oben beschriebenen erfindungsgemäßen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc. -, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
• Bevorzugt ist ferner ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemikalien in Wirtsorganismen, wobei ein Wirtsorganismus mit einer der oben beschriebenen Expressionskassetten oder Vektoren transformiert wird und diese Expressionskassette ein oder mehrere Strukturgene enthält, die für die gewünschte Feinchemikalie kodieren oder die Biosynthese der gewünschten Feinchemikalie katalysieren, der transformierte Wirtsorganismus gezüchtet wird und die gewünschte Feinchemikalie aus dem Züchtungsmedium isoliert wird. Dieses Verfahren ist für Feinchemikalien wie Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche und synthetische Geschmacks-, Aroma- und Farbstoffe breit anwendbar. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Tocopherolen und Tocotrienolen sowie Carotinoiden. Die Züchtung der transformierten Wirtsorganismen sowie die Isolierung aus den Wirtsorganismen bzw. aus dem Züchtungsmedium erfolgt mittels der dem Fachmann bekannten Verfahren. Die Produktion von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Antikörpern oder Vakkzinen ist beschrieben bei Hood EE Jilka JM (1999) Curr Opin Biotechnol 10(4): 382-6; Ma JK Vine ND (1999) Curr Top Microbiol Immunol 236: 275-92.
Sequenzen
• 1. SEQ ID NO: 1
  Promotor and 5'-untranslatierte Region des Arabidopsis thaliana pFD-Promotors.
• 2. SEQ ID NO: 2
  Promotor and 5'-untranslatierte Region des Arabidopsis thaliana FNR-Promotors.
• 3. SEQ ID NO: 3
  Promotor and 5'-untranslatierte Region des Arabidopsis thaliana TPT-Promotors (2038 bp).
• 4. SEQ ID NO: 4
  Promotor and 5'-untranslatierte Region des verkürzten Arabidopsis thaliana pFDs-Promotors
• 5. SEQ ID NO: 5
  Nukleinsäure kodierend für eine Phosphinothricinacetyltransferase.
• 6. SEQ ID NO: 6
  Aminosäuresequenz kodierend für eine Phosphinothricinacetyltransferase.
• 7. SEQ ID NO: 7
  Nukleinsäure kodierend für eine Acetolactatsynthase.
• 8. SEQ ID NO: 8
  Aminosäuresequenz kodierend für eine Acetolactatsynthase.
• 9. SEQ ID NO: 9 - Oligonukleotid-Primer pWL35
  5'-GTC GAC GAA TTC GAG AGA CAG AGA GAC GG-3'
• 10. SEQ ID NO: 10 - Oligonukleotid-Primer pWL36
  5'-GTC GAC GGT ACC GAT TCA AGC TTC ACT GC-3'
• 11. SEQ ID NO: 11 - Oligonukleotid-Primer pFD1
  5'-GAG AAT TCG ATT CAA GCT TCA CTG-3'
• 12. SEQ ID NO: 12 - Oligonukleotid-Primer pFD2
  5'-CCA TGG GAG AGA CAG AGA GAC G-3'
• 13. SEQ ID NO: 13 - Oligonukleotid-Primer pFD3
  5'-acggatccgagagacagagagacggagacaaaa-3'
• 14. SEQ ID NO: 14 - Oligonukleotid-Primer pFD5 5'-gcggatccaacactcttaacaccaaatcaaca-3'
• 15. SEQ ID NO: 15 - Oligonukleotid-Primer L-FNR ara
  5'-GTCGACGGATCCGGTTGATCAGAAGAAGAAGAAGAAGATGAACT-3'
• 16. SEQ ID NO: 16 - Oligonukleotid-Primer R-FNR ara
  5'-GTCGACTCTAGATTCATTATTTCGATTTTGATTTCGTGACC-3'
• 17. SEQ ID NO: 17 - Oligonukleotid-Primer L-TPTara
  5'-AAGTCGACGGATCCATAACCAAAACAACTCTGATCATGTACGTACCCATT-3'
• 18. SEQ ID NO: 18 - Oligonukleotid-Primer R-TPTara
  5'-AGACGTCGACTCTAGATGAAATCGAAATTCAGAGTTTTGATAGTGAGAGC-3'
• 19. SEQ ID NO: 19 - Oligonukleotid-Primer ubi5
  5'-CCAAACCATGGTAAGTTTGTCTAAAGCTTA-3'
• 20. SEQ ID NO: 20 - Oligonukleotid-Primer ubi3
  5'-CGGATCCTTTTGTGTTTCGTCTTCTCTCACG-3'
• 21. SEQ ID NO: 21 - Oligonukleotid-Primer sqs5
  5'-GTCTAGAGGCAAACCACCGAGTGTT-3'
• 22. SEQ ID NO: 22 - Oligonukleotid-Primer sqs3
  5'-CGGTACCTGTTTCCAGAAAATTTTGATTCAG-3'
• 23. SEQ ID NO: 23
  Binärplasmid pSUN3 (Sungene GmbH & Co KGaA)
• 24. SEQ ID NO: 24
  Binärplasmid pSUN5NPTTI (Sungene GmbH & Co KGaA)
• 25. SEQ ID NO: 25
  Binärplasmid pSUN3PatNos (Sungene GmbH & Co KGaA)
• 26. SEQ ID NO: 26 Oligonukleotidprimer 5-TPTara
  5'-AAGTCGACGGATCCTGATAGCTTATACTCAAATTCAACAAGTTAT-3'
• 27. SEQ ID NO: 27
  Verkürzter Promotor and 5'-untranslatierte Region des Arabidopsis thaliana TPT-Promotors (1318 bp).
Beispiele Allgemeine Methoden
• Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophoresen, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467).
Beispiel 1 Isolierung von genomischer DNA aus Arabidopsis thaliana (CTAB-Methode)
• Zur Isolierung genomischer DNA aus Arabidopsis thaliana werden ca. 0,25 g Blattmaterial junger Pflanzen im vegetativen Stadium in flüssigem Stickstoff zu feinem Pulver gemörsert. Das pulverisierte Pflanzenmaterial wird zusammen mit 1 ml 65°C-warmem CTAB I-Puffer (CTAB: Hexadecyltrimethylammoniumbromid, auch genannt Cetyltrimethylammoniumbromid; Sigma Kat.-Nr.: H6269) und 20 µl β-Mercaptoethanol in einen vorgewärmten zweiten Mörser gegeben und nach vollständiger Homogenisierung wird der Extrakt in ein 2 ml Eppendorf-Gefäß überführt und für 1 h bei 65°C unter regelmäßiger, vorsichtiger Durchmischung inkubiert. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wird der Ansatz mit 1 ml Chloroform/Octanol (24 : 1, mit 1 M Tris/HCl, pH 8,0 ausgeschüttelt) durch langsames Invertieren extrahiert und zur Phasentrennung für 5 min bei 8.500 rpm (7.500 × g) und Raumtemperatur zentrifugiert. Anschließend wird die wässrige Phase erneut mit 1 ml Chloroform/Octanol extrahiert, zentrifugiert und durch Invertieren mit 1/10 Volumen auf 65°C vorgewärmtem CTAB II-Puffer sorgfältig gemischt. Anschließend wird der Ansatz durch vorsichtiges Schwenken mit 1 ml Chloroform/Octanol-Gemisch (siehe oben) versetzt und zur erneuten Phasentrennung für 5 min bei 8.500 rpm (7.500 × g) und Raumtemperatur zentrifugiert. Die wässrige untere Phase wird in ein frisches Eppendorff- Gefäß überführt und die obere organische Phase wird in einem frischen Eppendorff-Gefäß erneut für 15 min bei 8.500 rpm (7.500 × g) und Raumtemperatur zentrifugiert. Die hieraus resultierende wässrige Phase wird mit der wässrigen Phase des vorherigen Zentrifugationsschrittes vereinigt und der gesamte Ansatz mit exakt demselben Volumen vorgewärmtem CTAB III-Puffer versetzt. Es folgt eine Inkubation bei 65°C, bis die DNA in Flocken ausfällt. Dies kann bis zu 1 h dauern oder durch Inkubation bei 37°C über Nacht erfolgen. Das aus dem anschließenden Zentrifugationsschritt (5 min. 2000 rpm (500 × g), 4°C) resultierende Sediment wird mit 250 µl auf 65°C vorgewärmtem CTAB IV-Puffer versetzt und für mindestens 30 min bzw. bis zur vollständigen Auflösung des Sediments bei 65°C inkubiert. Anschließend wird die Lösung zur Fällung der DNA mit 2,5 Volumina eiskaltem Ethanol vermischt und für 1 h bei -20°C inkubiert. Alternativ kann der Ansatz mit 0.6 Volumina Isopropanol vermischt und ohne weitere Inkubation sofort für 15 min bei 8.500 rpm (7.500 × g) und 4°C zentrifugiert werden. Die sedimentierte DNA wird durch Invertieren des Eppendorff-Gefäßes zweimal mit je 1 ml 80%igem eiskaltem Ethanol gewaschen, nach jedem Waschschritt erneut zentrifugiert (5 min. 8.500 rpm (7.500 × g), 4°C) und anschließend für ca. 15 min luftgetrocknet. Abschließend wird die DNA in 100 µl TE mit 100 µg/ml RNase resuspendiert und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die DNA Lösung ist nach einer weiteren Inkubationsphase über Nacht bei 4°C homogen und kann für weiterführende Experimente verwendet werden.
Lösungen für CTAB Lösung I (für 200 ml)
• 100 mM Tris/HCl pH 8,0 (2,42 g)
  1,4 M NaCl (16,36 g)
  20 mM EDTA (8,0 ml von 0,5 M Stammlösung)
  2% (w/v) CTAB (4,0 g)
• Jeweils vor der Verwendung werden frisch zugesetz: 2% β-Mercaptoethanol (20 µl für 1 ml Lösung I). Lösung II (für 200 ml) 0,7 M NaCl (8,18 g)
  10% (w/v) CTAB (20 g) Lösung III (für 200 ml) 50 mM Tris/HCl pH 8,0 (1,21 g)
  10 mM EDTA (4 ml 0,5 M von 0,5 M Stammlösung)
  1% (w/v) CTAB (2,0 g) Lösung IV (High-salt TE) (für 200 ml) 10 mM Tris/HCl pH 8,0 (0,242 g)
  0,1 mM EDTA (40 µl 0.5 M Stammlösung)
  1 M NaCl (11,69 g) Chloroform/Octanol (24 : 1) (für 200 ml) 192 ml Chloroform
  8 ml Octanol
• Die Mischung wird 2 × mit 1 M TrisHCl pH 8,0 ausgeschüttelt und vor Licht geschützt gelagert.
Beispiel 2 Transformation von Tabak und Raps
• Die Transformation von Tabak erfolgte über Infektion mit Agrobacterium tumefaciens. gemäß der von Horsch entwickelten Methode (Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231). Alle zur Transformation verwendeten Konstrukte wurden anhand der Gefrier/Tau- Methode (wiederholtes Auftauen und Einfrieren) in Agrobacterium tumefaciens transformiert. Die das gewünschte Konstrukt enthaltenden Agrobacterium-Kolonien wurden auf Mannitol/Glutamat- Medium mit 50 µg/ml Kanamycin, 50 µg/ml Ampicilin und 25 µg/ml Rifampicin selektioniert.
• Zur Transformation von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN) wurden 10 ml einer unter Selektion gewachsenen Übernachtkultur von Agrobacterium turne faciens abzentrifugiert, der Überstand verworfen, und die Bakterien im gleichen Volumen Antibiotika-freien Mediums resuspendiert. In einer sterilen Petrischale wurden Blattscheiben steriler Pflanzen (Durchmesser ca. 1 cm) in dieser Bakterienlösung gebadet. Anschließend wurden die Blattscheiben in Petrischalen auf MS-Medium (Murashige und Skoog (1962) Physiol Plant 15: 473ff.) mit 2% Saccharose und 0.8% Bacto- Agar ausgelegt. Nach 2-tägiger Inkubation im Dunkeln bei 25°C wurden sie auf MS-Medium mit 100 mg/l Kanamycin, 500 mg/l Claforan, 1 mg/l Benzylaminopurin (BAP), 0,2 mg/l Naphtylessigsäure (NAA), 1,6% Glukose und 0.8% Bacto-Agar übertragen und die Kultivierung (16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit) fortgesetzt. Wachsende Sprosse wurden auf hormonfreies MS-Medium mit 2% Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0,8% Bacto-Agar überführt.
• Die Transformation von Raps erfolgte mittels der Petiolentransformation nach Moloney et al. (Moloney, M. M., Walker, J. M. & Sharma, K. K.: High efficiency transformation of Brassica napus using Agrobacterium vectors. Plant Cell Reports 8, 238-242. 1989).
Beispiel 3 Untersuchungen zur Eignung des putativen Ferredoxin (pFD) Promotors a) Klonierung des pFD Promotors aus Arabidopsis thaliana
• Der putative Ferredoxin-Promotor wurde mittels PCR aus genomischer Arabidopsis thaliana DNA mit den Primern pWL35 und pWL36 amplifiziert. Der Primer pWL35 beginnt mit den in Fettdruck hervorgehobenen SalI und EcoRI Restriktionsschnittstellen unmittelbar vor der kodierenden Region des pFD-Gens. Der Primer pWL36 beginnt mit den in Fettdruck hervorgehobenen SalI und Asp718 Restriktionsschnittstellen.
  
  Primer pWL35 (SEQ ID NO: 9)
  5' GTC GAC GAA TTC GAG AGA CAG AGA GAC GG 3'
  Primer pWL36 (SEQ ID NO: 10)
  5' GTC GAC GGT ACC GAT TCA AGC TTC ACT GC 3' Reaktionsansatz 1 µl Genomische Arabidopsis DNA (ca. 250 ng)
  0,5 µl Tth-Polymerase (2 U/µl)
  3 µl Mg(OAc)₂ (25 mM, final conc. 1,5 mM Mg²⁺)
  15,2 µl 3,3 × Puffer
  4 µl dNTPs (jeweils 2,5 mM, Takara, Endkonzentration: jeweils 200 µM)
  24,3 µl H₂O. PCR-Bedingungen 1 Zyklus mit 3 min. bei 95°C
  10 Zyklen mit 94°C für 10 sec, 50°C für 20 sec und 72°C für 1 min.
  20 Zyklen mit 94°C für 10 sec, 65°C für 20 sec und 72°C für 1 min.
  1 Zyklus mit 72°C für 5 min.,
  anschließend Kühlung auf 4°C bis zur Weiterverarbeitung.
b) Konstruktion der pFD-Promotor-GUS-Expressionskassette
• Das pFD-Promotor PCR-Produkt wurde in den Vektor pCRII (Invitrogen) kloniert und anschließend mittels der durch das Primerpaar eingeführten SalI-Restriktionsschnittstellen isoliert und gelelektrophoretisch gereinigt. Für die Fusion mit dem GUS Gen wurde das ca. 850 bp umfassende pFD-Promotorfragment in den SalI- geschnittenen Binärvektor pBI101.2 (Clontech Inc.) kloniert und die Orientierung des Fragments wurde anschließend anhand von Restriktionsanalysen unter Verwendung der Endonukleasen BglII und BamHI verifiziert. Das resultierende Plasmid pFD::GUS wurde in Tabak transformiert. Die erzeugten Tabakpflanzen wurden pFD : GUS genannt.
c) Konstruktion der pFD-Promotor-nptII-Expressionskassette
• Der putative Ferredoxin-Promotor wurde mittels PCR aus genomischer Arabidopsis thaliana DNA amplifiziert. Dabei wurden über die Primer die Restriktionsstellen EcoRI und NcoI angefügt.
  
  Primer pFD1 (SEQ ID NO: 11)
  5' GAG AAT TCG ATT CAA GCT TCA CTG C
  Primer pFD2 (SEQ ID NO: 12)
  5' CCA TGG GAG AGA CAG AGA GAC G. Reaktionsansatz 37,5 µl H₂O
  5,0 µl 10 × Reaktionspuffer (Endkonzentration Mg²⁺ 1,5 mM)
  4,0 µl dNTP mix (jeweils 2,5 mM)
  1,0 µl Primer pFD1 (10 µM)
  1,0 µl Primer pFD2 (10 µM)
  0,5 µl Taq-Polymerase (Takara, 2 U/µl)
  1,0 µl genomischer Arabidopsis DNA (ca. 250 ng) PCR-Bedingungen 1 Zyklus mit 3 min. bei 94°C
  10 Zyklen mit 94°C für 10 sec, 48°C für 20 sec und 72°C für 1 min
  25 Zyklen mit 94°C für 10 sec, 65°C für 20 sec und 72°C für 1 min
  1 Zyklus mit 72°C für 5 min.
• Das PCR Produkt wurde in das Plasmid pCRII (Invitrogen) subkloniert. Das Plasmid pCAMBIA 2300 (CAMBIA, GPO Box 3200, Canberra ACT 2601, Australia; GenBank Acc.-No: AF234315; Binary vector pCAMBIA-2300, complete sequence; Hajdukiewicz P et al. (1994) Plant Mol Biol 25(6): 989-994) wurde mit EcoRI/NcoI geschnitten und das pFD Promotorfragment als EcoRI/NcoI Fragment aus dem pCRII Plasmid in diesen Vektor umkloniert. Dabei wurde der 35S Promotor aus dem Cambiavektor entfernt. Das resultierende Plasmid wurde als pFD-Promotor : NPTII bezeichnet und in Tabak transformiert.
d) Ergebnisse der GUS Analyse der transgenen Tabakpflanzen
• Im Rahmen histochemischer Untersuchungen zeigten transgene pFD::GUS Tabakpflanzen eine starke GUS-Färbung in "source"-Blättern und eine schwache GUS-Färbung in den Geweben aller Blütenorgane. Eine starke Färbung im Wurzelgewebe wurde nur bei in vitro- Pflanzen beobachtet, deren Wurzeln der Belichtung ausgesetzt waren. Anhand von Blattscheiben, die aus als pFD::GUS-positiv identifizierten Pflanzen ausgestanzt worden waren, wurde Kalluswachstum induziert. Das Kallusgewebe sowie die sich daraus entwickelnden Pflanzensprosse zeigten eine GUS-Färbung, die in ihrer Intensität der GUS-Färbung von CaMV35S::GUS (in pCambia 1304; CAMBIA, GPO Box 3200, Canberra ACT 2601, Australia; GenBank Acc.-No.: AF234300, Binary vector pCAMBIA-1304, complete sequence, Hajdukiewicz P et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25(6): 989-994) (1994) transgenen Pflanzen vergleichbar war. In der unten aufgeführten Tabelle (Tab. 3) wurden die Daten zur Quantifizierung der GUS-Aktivität in den Antheren (Staubbeuteln) und "source"- Blättern ausgewählter transgener pFD::GUS Tabakpflanzen zusammengestellt. Tabelle 3 Quantifizierung der GUS-Aktivität in den Antheren und "source"-Blättern ausgewählter transgener pFD::GUS Tabakpflanzen
  
  
• Die Antheren der reifen Blüten zeigen keine Promotoraktivität. Bei geschlossenen Blüten ist sie schwach ausgeprägt.
e) Ergebnisse der Analyse der Kanamycinresistenz der transgenen Tabakpflanzen
• Für die Untersuchung der pFD-Promotor gestützten Vermittlung von Resistenz gegen Kanamycin wurde das pFD-Promotor : NPTII Plasmid in Tabak transformiert. Die selektive Regeneration der Tabakpflänzchen erfolgte auf Kanamycin (100 mg/l). Die aus den sich entwickelnden Sprossknospen regenerierten Pflanzen enthielten das Kanamycin, was zeigte, dass der pFD Promotor das NPTII Genexprimiert hat und somit die Selektion ermöglichte. Die Ergebnisse demonstrieren, dass die isolierte Nukleinsäuresequenz die gewünschten vorteilhaften Promotoreigenschaften besitzt, d. h. sie zeigt eine Promotoraktivität, die geeignet ist Selektionsmarker effektiv zu exprimieren und weist eine nur geringe Aktivität im Pollen auf. Die Aktivität in den Antheren beträgt in der Regel weniger als 10% der Aktivität in den Source-Blättern.
f) Herstellung von Deletionsvarianten des pFD Promotors
• Eine weitere Variante des pFD Promotors stellt die Deletion pFD- short (pFds) dar. Dazu wurde der Abschnitt von Basenpaar 137 bis 837 des pFD Promotors unter Verwendung nachfolgender Primer amplifiziert:
  pFD3 (SEQ ID NO: 13):
  5'-acggatccgagagacagagagacggagacaaaa-3'
  pFD5 (SEQ ID NO: 14):
  5'gcggatccaacactcttaacaccaaatcaaca-3'. Reaktionsansatz 37,5 µl H₂O
  5,0 µl 10 × Reaktionspuffer ("genomic PCR")
  4,0 µl dNTP mix (jeweils 2,5 mM)
  2,2 µl 25 mM Mg(OAc)₂ (Endkonzentration 1,1 mM)
  1,0 µl Primer pFD3 (10 µM)
  1,0 µl Primer pFD5 (10 pH)
  0,5 µl Pfu-turbo Polymerase Mix
  1,0 µl Genomische Arabidopsis DNA (ca. 250 ng). PCR-Bedingungen 1 Zyklus mit 5 min. bei 95°C
  25 Zyklen mit 94°C für 30 sec, 50°C für 60 sec und 72°C für 1 min.
  1 Zyklus mit 50°C für 60 sec, 72°C für 10 min.,
  anschließend Kühlung auf 4°C bis zur Weiterverarbeitung.
• Die Primer enthielten Erkennungssequenzen für das Restriktionsenzym BamHI. Nach Spaltung des PCR Produktes mit BamHI wurde es in das Plasmid pGUSINT37 (s. o.), das ebenfalls BamHI geschnitten und dephosphoryliert wurde, ligiert. Mit dem resultierenden Konstrukt pFDsGUSINT wurden Tabakblätter mit der Biolistics (BioRad) beschossen. Dabei wurden Microcarrier (25 µg Gold, Heraeus 0,3 bis 3 µm) mit 10 µg Plasmid DNA, 2,5 M CaCl₂, und 0,1 M Spermidine behandelt, mit Alkohol gewaschen und bei einem Vakuum von 26 inch und einem Druck von 1100 psi auf die Blätter, die auf MS-Medium lagen, geschossen. Die Explantate wurden anschließend für 24 h in MS-Medium mit 2% Sucrose inkubiert und dann mit X-gluc histochemisch gefärbt. Blaue Spots zeigten die Aktivität des Promotors.
g) Fusion des pFds Promotors mit dem NPTII Gen
• Als BamHI Fragment wird der pFDs Promotor aus pFDsGUSINT herausgeschnitten und seine Enden mittels Klenow-"Fill-In" geglättet. Das erhaltene Fragment wird vor das NPTII Gen des Plasmids pSUNSNPTII (SEQ ID NO: 24), EcoRV geschnitten und dephosphoryliert, kloniert. Das Plasmid pSUNSNPTII ist ein Derivat des Plasmids pSUN3 (SEQ ID NO: 23), welches neben einer nosP/Pat Kassette noch ein promotorloses NPTII Gen enthält. Mit diesem Konstrukt ist es möglich Promotoren auf ihre Fähigkeit zur Expression von NPTII zu testen. Parallel kann die Selektion auf Phosphinothricin enthaltenden Medium erfolgen.
• Das resultierende Plasmid pSun5FdsNPTII wird in Tabak transformiert. Regenerierte und selektierte Sprosse zeigten, dass der pFDs Promotor die Selektion auf NPTII erlaubt.
Beispiel 4 Untersuchungen zur Eignung des Ferredoxin NADPH Oxidoreduktase (FNR) Promotors a) Klonierung des FNR Promotors aus Arabidopsis thaliana
• Die putative Promotorregion des FNR-Gens wurde unter Verwendung der Oligonukleotidprimer L-FNRara und R-FNRara aus genomischer DNA amplifiziert, wobei das ATG-Startcodon des FNR-Gens ausgespart und vier putative Stop-Codons des stromaufwärts gelegenen offenen Leserahmens beibehalten wurden. Anhand der Primer L-FNRara und R-FNRara wurde der FNR-Promotor als ein 635 bp großes Fragment entsprechend dem Abschnitt des Klons K2A18.15 von Position 69493 bis Position 70127 (beide Nukleotide inklusive) mittels PCR aus genomischer Arabidopsis thaliana DNA amplifiziert. Der Primer L-FNRara beginnt mit den in Fettdruck hervorgehobenen SalI und BamHI Restriktionsschnittstellen und befindet sich stromaufwärts vor den vier Stop-Codons des dem FNR-Promotor vorgeschalteten Gens. Der Primer R-FNRara beginnt mit den in Fettdruck hervorgehobenen SalI und XbaI Restriktionsschnittstellen unmittelbar vor dem ATG-Startcodon des FNR-Gens.
  Primer L-FNR ara (44 mer) (SEQ ID NO: 15):
  5' GTC GAC GGA TCC GGT TGA TCA GAA GAA GAA GAA GAA GAT GAA CT 3'
  Primer R-FNR ara (41 mer) (SEQ ID NO: 16):
  5' GTC GAC TCT AGA TTC ATT ATT TCG ATT TTG ATT TCG TGA CC 3'.
• Zur Amplifizierung des FNR-Promotors wurde ein sogenanntes "touchdown" PCR-Protokoll unter Verwendung des "Advantage Genomic Polymerase Mix" (Clontech Laboratories, Inc. Katalog-Nr. #8418-1) benutzt. Der obengenannte Polymerase-Mix enthält eine thermostabile DNA-Polymerase aus Thermus thermophilus (Tth DNA Polymerase), gemischt mit einem kleineren Anteil der "Vent Proofreading 3'-5' Polymerase", und den Tth Start Antikörper, der "hot-start" PCR ermöglicht. Reaktionsansatz 36,8 µl H₂O
  5 µl 10 × Reaktionspuffer ("genomic PCR")
  1 µl dNTP mix (jeweils 2,5 mM)
  2,2 µl 25 mM Mg(OAc)₂ (Endkonzentration 1,1 mM)
  1 µl Primer L-FNR ara (10 µM)
  1 µl Primer R-FNR ara (10 µM)
  1 µl 50 × Polymerase Mix
  2 µl Genomische Arabidopsis DNA (ca. 500 ng) PCR-Bedingungen 1 Zyklus mit 1 min. bei 94°C
  10 Zyklen mit 94°C für 30 sec und 70°C für 3 min.
  32 Zyklen mit 94°C für 30 sec und 65°C für 3 min.
  1 Zyklus mit 65°C für 4 min.,
  anschließend Kühlung auf 4°C bis zur Weiterverarbeitung.
b) Konstruktion der FNR-Promotor-GUS-Expressionskassette
• Das FNR-Promotor PCR-Produkt wurde nach Gel-elektrophoretischer Auftrennung und Reinigung aus dem Gel mit dem Quiagen-PCR-Reinigungskit per TA-Klonierung in den Vektor pCRIl (Invitrogen) kloniert. Das Promotorfragment wurde anschließend aus dem resultierenden Plasmid pATFNR1 mittels der durch das Primerpaar eingeführten XbaI und BamHI-Restriktionsschnittstellen durch Verdau mit XbaI/BamHI isoliert und gelelektrophoretisch gereinigt. Für die Fusion mit dem GUS Gen wurde das ca. 600 bp umfassende FNR-Promotorfragment in den XbaI/BamHI-restringierten Binärvektor pBI101 kloniert. Die korrekte Insertion des richtigen Fragments im resultierenden Plasmid pATFNR-Bi wurde anschließend anhand einer Restriktionsanalyse unter Verwendung der Endonukleasen EcoRV verifiziert. Das Plasmid pATFNR-Bi wurde zur Tabaktransformation verwendet.
• Für die Transformation in Raps wurde der FNR Promoter als SalI Fragment des Plasmids pCR_ATFNR in den mit SalI und XhoI geschnittenen Vektor pS3NitGUS, den Nitrilase Promotor ersetzend, kloniert.
c) Konstruktion der FNR-Promotor-PAT-Expressionskassette
• Für die Untersuchung der FNR-Promotor gestützten Vermittlung von Resistenz gegen Phosphinothricin wurde der FNR-Promotor als Sall Fragment aus dem Plasmid pATFNR1 vor das Phosphinothricin Resistenzgen in das SalI geschnittene Plasmid pSUN3PatNos (SEQ ID NO: 25) kloniert.
d) Konstruktion der FNR-Promoter-NptII-Expressionskassette
• Für die Vermittlung von Resistenz gegen Kanamycin wurde der FNR Promotor als SalI Fragment vor das NptII-Resistenzgen in das XhoI geschnittene, dephosphorylierte Plasmid pSUNSNptIICat (Sungene GmbH & Co KGaA, SEQ ID NO: 24) kloniert. Das resultierende Plasmid mit der Bezeichnung pS5FNRNptII wurde in Tabak und in Raps transformiert.
e) Ergebnisse der GUS Analyse der transgenen Tabakpflanzen Qualitative Daten
• Transgene FNR::GUS-Tabakpflanzen zeigten starke GUS-Expression in allen grünen Geweben, vor allem in, "source"-Blättern, Blattstielen und Internodien sowie allen Blütenorganen voll entwickelter Blüten (Ovarium, Stigma, Kelch- und Kronblätter) mit Ausnahme von Pollen, der keine GUS-Aktivität zeigte; eine geringe Färbungsintensität wurde in Antheren detektiert. Bei der ersten Analyse von Blattscheibchen von 80 in vitro-Pflanzen zeigten 70 Pflanzen eine starke GUS-Färbung mit geringer Variation in der Färbeintensität zwischen den individuellen Pflanzen. Das wurde als Hinweis darauf gewertet, dass der FNR-Promotor ein Element enthält, dassfür limitierte Positionseffekte sorgt. In den Gewebekulturpflanzen war die GUS-Aktivität der FNR::GUS Pflanzen deutlich geringer als die der TPT::GUS Pflanzen. Transgene Rapspflanzen zeigten das gleiche Färbemuster.
• Samenmaterial (F1) der Linien FNR 13, FNR 45 und FNR 28 wurde bezüglich seiner GUS-Aktivität analysiert. Dabei zeigte sich, dass weder in ruhenden Samen noch in ausgebrachten Keimlingen (3.5 Tage nach Aussaat) GUS-Aktivität detektiert werden konnte. In späteren Keimlingsstadien (6 und 10 Tage nach Aussaat) wurde starke GUS-Aktivität in Keimblättern und im oberen Bereich der Keimlingsachse detektiert, wogegen keine GUS-Färbung in den Wurzeln gefunden wurde. Bei Keimlingen, die im Dunkeln angezogen wurden, war die GUS-Aktivität auf die Kotyledonen beschränkt und war insgesamt geringer als bei lichtgekeimten Sämlingen.
Quantitative Daten
• Die quantitative Untersuchung der GUS-Aktivität in FNR::GUS transgenen Tabakpflanzen (transformiert mit Plasmid pATFNR-Bi) wurde an den ersten voll entwickelten Blättern von Tabakpflanzen 21 Tage nach dem Transfer von der Gewebekultur ins Gewächshaus analysiert. Die Daten entsprechen dem Mittelwert von vier unabhängigen Messungen. Tabelle 4 Quantifizierung der GUS-Aktivität in Blattmaterial ausgewählter transgener FNR::GUS Tabakpflanzen (transformiert mit Plasmid pATFNR-Bi)
  
  
f) Ergebnisse der Analyse der Phosphinothricinresistenz der transgenen Tabakpflanzen
• Das Plasmid pSUN3FNRPat wurde unter Verwendung des Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA101 zur Tabaktransformation, wie unter 3. beschrieben, verwendet. Die selektive Regeneration der Tabakpflänzchen erfolgte einerseits auf Phosphinothricin (5 mg/l) und andererseits zur Kontrolle auf Kanamycin (100 mg/l). 97% der Explantate, die unter Kanamycindruck (nosP : NPTII) und 40% der Explantate, die unter Phosphinothricindruck (FNR : Bar) selektiert wurden, entwickleten Sprossknospen. Die unter Phosphinotricindruck regenerierten Pflanzen enthielten sowohl das Kanamycin als auch das Phosphinothricingen was zeigte, dass der FNR Promotor das Phosphinothricinacetyltransferase Gen exprimiert hat und somit die Selektion ermöglichte. Die Ergebnisse demonstrieren, dass die isolierte Nukleinsäuresequenz die gewünschten vorteilhaften Promotoreigenschaften besitzt, d. h. sie zeigt eine Promotoraktivität, die geeignet ist, Selektionsmarker effektiv zu exprimieren und weist keine Aktivität im Pollen auf.
g) Ergebnisse der Analyse der Kanamycinresistenz der transgenen Tabak- und Rapspflanzen
• Für die Untersuchung der FNR-Promotor gestützten Vermittlung von Resistenz gegen Kanamycin wurde der FNR-Promotor mit dem NptII Gen kombiniert. Das resultierende Konstrukt pS5FNRNptII wurde in den Agrobakterium tumefaciens Stamm GV3101[mp90] für die Transformation in Tabak und Raps transformiert.
• Die resultierenden Stämme sind für die Transformation, wie unter Beispiel 2 beschrieben, eingesetzt worden. Die selektive Regeneration wurde in Gegenwart von 100 mg/l (bzw. 18 mg/l für Raps) Kanamycin erreicht. Die unter Kanamycindruck regenerierten Pflanzen enthielten sowohl das Kanamycin als auch das Phosphinothricingen was zeigte, dass der FNR Promotor das NptII Gen exprimiert hat und somit die Selektion der Pflanzen ermöglichte.
• Die Ergebnisse demonstrieren, dass die isolierte Nukleinsäuresequenz die gewünschten vorteilhaften Promotoreigenschaften besitzt, d. h. sie zeigt eine Promotoraktivität, die geeignet ist, Selektionsmarker effektiv zu exprimieren und weißt keine Aktivität im Pollen auf.
Beispiel 5 Untersuchungen zur Eignung des Triose-Phosphat Translokator (TPT) Promotors a) Klonierung des TPT Promotor aus Arabidopsis thaliana
• Die putative Promotor-Region des TPT-Gens aus Arabidopsis thaliana wurde durch Amplifizierung mit den Oligonukleotid- Primern L-TPTara und R-TPTara isoliert, wobei das ATG-Startcodon des TPT-Gens ausgespart wurde. Anhand der Primer L-TPTara und R-TPTara wurde der TPT-Promotor als ein 2038 bp großes Fragment mittels PCR aus genomischer Arabidopsis thaliana DNA amplifiziert (SEQ ID NO: 3). Der Primer L-TPTara beginnt mit den in Fettdruck hervorgehobenen SalI und BamHI Restriktionsschnittstellen. Der Primer R-TPTara beginnt mit den in Fettdruck hervorgehobenen AatII, SalI und XbaI Restriktionsschnittstellen unmittelbar vor dem ATG-Startcodon des TPT-Gens.
  Primer L-TPTara (SEQ ID NO: 17):
  5' AAG TCG ACG GAT CCA TAA CCA AAA GAA CTC TGA TCA TGT ACG TAC CCA TT 3'
  Primer R-TPTara (SEQ ID NO: 18):
  5' AGA CGT CGA CTC TAG ATG AAA TCG AAA TTC AGA GTT TTG ATA GTG AGA GC 3'.
• Zur Amplifizierung des TPT-Promotors wurde ein sogenanntes "touchdown" PCR-Protokoll unter Verwendung des "Advantage Genomic Polymerase Mix" (Clontech Laboratories, Inc. Katalog-Nr. #8418-1) benutzt. Der obengenannte Polymerase-Mix enthält eine thermostabile DNA-Polymerase aus Thermus thermophilus (Tth DNA polymerase), gemischt mit einem kleineren Anteil der "Vent proofreading 3'-5' Polymerase", und dem Tth Start Antikörper, der "hot-start" PCR ermöglicht. Reaktionsansatz 36,8 µl H₂O
  5 µl 10 × Reaktionspuffer ("genomic PCR")
  1 µl dNTP mix (jeweils 2,5 mM)
  2,2 µl 25 mM Mg(OAc)₂ (Endkonzentration 1,1 mM)
  1 µl Primer L-FNR ara (10 µM)
  1 µl Primer R-FNR ara (10 µM)
  1 µl 50 × Polymerase Mix
  2 µl Genomische Arabidopsis DNA (ca. 500 ng) PCR-Bedingungen 1 Zyklus mit 1 min. bei 94°C
  10 Zyklen mit 94°C für 30 sec und 70°C für 3 min.
  32 Zyklen mit 94°C für 30 sec und 65°C für 3 min.
  1 Zyklus mit 65°C für 4 min.,
  anschließend Kühlung auf 4°C bis zur Weiterverarbeitung.
b) Konstruktion der TPT-Promotor-GUS-Expressionskassette
• Das TPT-Promotor PCR-Produkt wurde nach Gel-elektrophoretischer Auftrennung und Reinigung aus dem Gel mit dem Quiagen-PCR-Reinigungskit per TA-Klonierung in den Vektor pCRII (Invitrogen) kloniert. Das Promotorfragment wurde anschließend aus dem resultierenden Plasmid pATTPT mittels der durch das Primerpaar eingeführten SalI und XbaI-Restriktionsschnittstellen isoliert und gelelektrophoretisch gereinigt. Für die Fusion mit dem GUS Gen wurde das ca. 2,0 kb umfassende TPT-Promotorfragment in den SalI/XbaI-restringierten Binärvektor pBI101 kloniert. Die korrekte Insertion des richtigen Fragments im resultierenden Plasmid pATTPT-Bi wurde anschließend anhand einer Restriktionsanalyse unter Verwendung der Endonukleasen HindIII verifiziert. Das Plasmid pATTPT-Bi wurde zur Tabaktransformation verwendet.
• Für die Transformation in Raps wurde der TPT Promoter als SalI Fragment des Plasmids pATTPT in den mit SalI und XhoI geschnittenen Vektor pS3NitGUS, den Nitrilase Promotor ersetzend, kloniert.
c) Konstruktion der TPT-Promotor-PAT-Expressionskassette
• Für die Untersuchung der TPT-Promotor gestützten Vermittlung von Resistenz gegen Phosphinothricin wurde der TPT-Promotor als SalI Fragment aus dem Plasmid pATTPT vor das Phosphinothricin Resistenzgen in das SalI geschnittene Plasmid pSUN3PatNos kloniert. Das resultierende Plasmid pSUN3TPTPat wurde unter Verwendung des Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA101 zur Tabaktransformation verwendet. Die selektive Regeneration der Tabakpflänzchen erfolgte einerseits auf Phosphinothricin (5 mg/l) und andererseits zur Kontrolle auf Kanamycin (100 mg/l).
d) Konstruktion der TPT-Promoter-NptII-Expressionskassette
• Für die Vermittlung von Resistenz gegen Kanamycin wurde der TPT Promotor als SalI Fragment vor das NptII-Resistenzgen in das XhoI geschnittene, dephosphorylierte Plasmid p5unSNptIICat (Sungene GmbH & Co KGaA; SEQ ID NO: 24) kloniert. Das resultierende Plasmid mit der Bezeichnung pSSTPTNptII wurde in Tabak und in Raps transformiert.
e) Ergebnisse der GUS Analyse der transgenen Tabakpflanzen Qualitative Daten
• Transgene TPT::GUS-Tabakpflanzen zeigten starke GUS-Expression in allen grünen Geweben, vor allem in "source"-Blättern, hier insbesondere in den Trichomen und den Blütenorganen junger und voll entwickelter Blüten. Die GUS-Aktivität im Bereich der Blüten war am stärksten in den Ovarien und im Stigma; die Färbung der Kelch- und Kronblätter war etwas schwächer. In den Antheren war die GUS- Aktivität am geringsten. Im Pollen was keine GUS-Aktivität zu detektieren. Transgene Rapspflanzen zeigten das gleiche Färbemuster.
• Bei der ersten Analyse von Blattscheibchen von 80 in vitro- Pflanzen zeigten 22 Pflanzen überhaupt keine Färbung und 22 Pflanzen eine starke GUS-Färbung nach nur dreistündiger Färbung. Die übrigen Pflanzen zeigten eine große Bandbreite verschieden intensiver GUS-Färbungen bei den individuellen Pflanzen. In den Gewebekulturpflanzen war die GUS-Aktivität der TPT::GUS Pflanzen deutlich stärker als die der FNR::GUS Pflanzen. Samenmaterial (F1) der Linien TPT 55 und TPT 60 wurden bezüglich ihrer GUS- Aktivität analysiert. Dabei zeigte sich, dass sowohl in ruhenden Samen als auch in ausgebrachten Keimlingen (3.5 Tage nach Aussaat) eine starke GUS-Aktivität detektiert werden konnte. In späteren Keimlingsstadien (6 und 10 Tage nach Aussaat) wurde die stärkste GUS-Aktivität in Keimblättern und im oberen Bereich der Keimlingsachse detektiert und eine schwächere GUS-Färbung in den Wurzeln. Keimlinge, die im Dunkeln angezogen wurden, zeigten ein unverändertes GUS-Färbemuster.
Quantitative Daten
• Die quantitative Untersuchung der GUS-Aktivität in TPT::GUS transgenen Tabakpflanzen (transformiert mit Plasmid pAT-TPT-Bi) wurde an den ersten voll entwickelten Blättern von Tabakpflanzen 19 Tage nach dem Transfer von der Gewebekultur ins Gewächshaus analysiert. Die Daten entsprechen dem Mittelwert von vier unabhängigen Messungen. Tabelle 5 Quantifizierung der GUS-Aktivität in Blattgewebe ausgewählter transgener TPT::GUS Tabakpflanzen (transformiert mit Plasmid pAT-TPT-Bi). WT2: Kontrollwerte von untransformierten Wildtyp-Pflanzen
  
  
f) Ergebnisse der Analyse der Phosphinothricinresistenz der transgenen Tabakpflanzen
• Das Plasmid pSUN3TPTPat wurde unter Verwendung des Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA101 zur Tabaktransformation, wie unter 3. beschrieben, verwendet. Die selektive Regeneration der Tabakpflänzchen erfolgte einerseits auf Phosphinothricin (5 mg/l) und andererseits zur Kontrolle auf Kanamycin (100 mg/l). 97% der Explantate, die unter Kanamycindruck und 70% der Explantate, die unter Phosphinothricindruck selektiert wurden, entwickelten Sproßknospen. Die unter Phosphinotricindruck regenerierten Pflanzen enthielten sowohl das Kanamycin als auch das Phosphinothricingen was zeigte, dass der TPT Promotor das Phosphinothricinacetyltransferase Gen exprimiert hat und somit die Selektion ermöglichte. Die Ergebnisse demonstrieren, dass die isolierte Nukleinsäuresequenz die gewünschten vorteilhaften Promotoreigenschaften besitzt, d. h. sie zeigt eine Promotoraktivität, die geeignet ist Selektionsmarker effektiv zu exprimieren und weist keine Aktivität im Pollen auf.
g) Ergebnisse der Analyse der Kanamycinresistenz der transgenen Tabak- und Rapspflanzen
• Für die Untersuchung der TPT-Promotor gestützten Vermittlung von Resistenz gegen Kanamycin wurde der TPT-Promotor mit dem NptII Gen kombiniert. Das resultierende Konstrukt pS5TPTNptII wurde in den Agrobakterium tumefaciens Stamm GV3101[mp90] für die Transformation in Tabak und Raps transformiert.
• Die resultierenden Stämme sind für die Transformation, wie unter Beispiel 2 beschrieben, eingesetzt worden. Die selektive Regeneration wurde in Gegenwart von 100 mg/l (bzw. 18 mg/l für Raps) Kanamycin erreicht. Die unter Kanamycindruck regenerierten Pflanzen enthielten sowohl das Kanamycin als auch das Phosphinothricingen was zeigte, dass der TPT Promotor das NptII Gen exprimiert hat und somit die Selektion der Pflanzen ermöglichte.
• Die Ergebnisse demonstrieren, dass die isolierte Nukleinsäuresequenz die gewünschten vorteilhaften Promotoreigenschaften besitzt, d. h. sie zeigt eine Promotoraktivität, die geeignet ist, Selektionsmarker effektiv zu exprimieren und weißt keine Aktivität im Pollen auf.
h) Klonierung des verkürzten TPT Promotors (STPT)
• Die verkürzte putative Promotorregion des TPT-Gens (STPT) aus Arabidopsis thaliana wurde durch Amplifikation mittels PCR unter Verwendung der Primer 5-TPTara (SEQ-ID NO: 26) und R-TPTara (s. o., SEQ ID NO: 18) aus dem Plasmid pATTPT isoliert (SEQ ID NO: 27). Reaktionsansatz 37,8 µl H₂O
  5 µl 10 × Reaktionspuffer ("genomic PCR")
  1 µl dNTP mix (jeweils 2,5 mM)
  2,2 µl 25 mM Mg(OAc)₂ (Endkonzentration 1,1 mM)
  1 µl Primer 5-TPTara (10 µM)
  1 µl Primer R-TPTara (10 µM)
  1 µl 50 × Polymerase Mix ("Advantage Genomic Polymerase Mix"; Clontech Lab., Inc.; Kat.-Nr.: #8418-1)
  1 µl pATTPT Plasmid DNA (1 ng). PCR-Bedingungen 1 Zyklus mit 5 min. bei 94°C
  25 Zyklen mit 94°C für 30 sec und 52°C für 1 min.
  1 Zyklus mit 52°C für 4 min.,
  anschließend Kühlung auf 4°C bis zur Weiterverarbeitung
  Primer 5-TPTara (SEQ-ID NO: 26)
  5'-AAG TCG ACG GAT CCT-GAT-AGC-TTA-TAC-TCA-AAT-TCA-ACA-AGT-TAT-3'.
• Das 1,3 kb große PCR-Produkt des verkürzten TPT-Promotors wurde nach gelelektrophoretischer Auftrennung und Reinigung aus dem Gel mit dem "SureClone Ligation Kit" (Amersham Pharmacia Biotech; Code-Nr.: 27-9300-01) in den SmaI geschnittenen und dephosphorylierten Vektor pUC18 kloniert. Das resultierende Plasmid trägt die Bezeichnung pATSTPT. Die Sequenz wurde mittels Sequenzierung überprüft.
i) Konstruktion der STPT-Promoter-NptII-Expressionskassette
• Für die Vermittlung von Resistenz gegen Kanamycin wurde der STPT Promotor (SEQ ID NO: 27) als SalI Fragment vor das NptII-Resistenzgen in das XhoI geschnittene, dephosphorylierte Plasmid pSun5NptIICat (Sungene GmbH & Co KGaA; SEQ ID NO: 24) kloniert. Das resultierende Plasmid mit der Bezeichnung pSSSTPTNptII wurde in Tabak und in Raps transformiert.
j) Ergebnisse der Analyse der Kanamycinresistenz der transgenen Tabak- und Rapspflanzen
• Für die Untersuchung der STPT-Promotor gestützten Vermittlung von Resistenz gegen Kanamycin wurde das Plasmid pSSSTPTNptII in den Agrobakterium tumefaciens Stamm GV3101[mp90] für die Transformation in Tabak und Raps transformiert. Der resultierenden Stamm ist für die Transformation, wie unter Beispiel 2 beschrieben, eingesetzt worden. Die selektive Regeneration wurde in Gegenwart von 100 mg/l (bzw. 18 mg/l für Raps) Kanamycin erreicht.
• Die Ergebnisse demonstrieren, dass die isolierte Nukleinsäuresequenz die gewünschten vorteilhaften Promotoreigenschaften besitzt, d. h. sie zeigt eine Promotoraktivität, die geeignet ist, Selektionsmarker effektiv zu exprimieren.
Vergleichsbeispiel 1 Untersuchungen zur Eignung des Ubiquitin-Promotors a) Klonierung des Ubiquitin Promotor aus Arabidopsis thaliana
• Der Ubiquitin Promotor wurde mittels PCR aus genomischer Arabidopsis thaliana DNA mit den Primern ubi5 und ubi3 amplifiziert.
  ubi5 (SEQ ID NO: 19):
  5'-CCAAACCATGGTAAGTTTGTCTAAAGCTTA-3'
  ubi3 (SEQ ID NO: 20):
  5'-CGGATCCTTTTGTGTTTCGTCTTCTCTCACG-3'. Reaktionsansatz 37,5 µl H₂O
  5 µl 10 × Reaktionspuffer ("genomic PCR")
  4 µl dNTP mix (jeweils 2,5 mM)
  2,2 µl 25 mM Mg(OAc)₂ (Endkonzentration 1,1 mM)
  1 µl Primer ubi3 (10 µM)
  1 µl Primer ubi5 (10 µM)
  0.5 µl Pfu-turbo polymerase mix
  1 µl Genomische Arabidopsis DNA (ca. 250 ng). PCR-Bedingungen 1 Zyklus mit 5 min. bei 94°C
  25 Zyklen mit 94°C für 30 sec, 52°C für 1 min. und 72°C für 1 min.
  1 Zyklus mit 52°C für 1 min. und 72°C für 10 min.,
  anschließend Kühlung auf 4°C bis zur Weiterverarbeitung.
• Das entstandene PCR Fragment wurde als HindIII/BamHI Fragment in das mit HindIII/BamHI geschnittene Plasmid pGUSINT37 kloniert (pUBI42GUS) und mittels Sequenzanalyse verifiziert.
b) Klonierung des Ubiquitin Promotors vor das PAT-Gen
• Für die Untersuchung der Ubiquitin-Promotor gestützten Vermittlung von Resistenz gegen Phosphinothricin wurde der Ubiquitin-Promotor als BamHI/HindIII Fragment vor das Phosphinothricin Resistenzgen in das BamHI/HindIII geschnittene Plasmid pSUN3Pat- Nos kloniert. Das resultierende Plasmid pSUN3UBIPat wurde unter Verwendung des Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA101 zur Tabaktransformation verwendet. Die selektive Regeneration der Tabakpflänzchen erfolgte einerseits auf Phosphinothricin (5 mg/l) und andererseits zur Kontrolle auf Kanamycin (100 mg/l).
c) Ergebnisse der Analyse der Phosphinothricinresistenz der transgenen Tabakpflanzen
• Im Gegensatz zur Selektion auf Kanamycin, die normal verlief, konnten unter Selektion auf Phosphinothricin keine Kalli oder Sprosse erhalten werden. So ist der Ubiquitin Promotor nicht geeignet für die Expression eines selektiven Markers für den Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Gentransfer mit anschließender Regeneration von Geweben.
Vergleichsbeispiel 2 Untersuchungen zur Eignung des Squalen Synthase (SQS) Promotors a) Klonierung des Squalen Synthase (SQS) Promotors aus Arabidopsis thaliana
• Der Squalen Synthase Promotor wurde mittels PCR aus genomischer Arabidopsis thaliana DNA mit den Primern sqs5 und sqs3 amplifiziert.
  sqs5 (SEQ ID NO: 21):
  5'-GTCTAGAGGCAAACCACCGAGTGTT-3'
  sqs3 (SEQ ID NO: 22):
  5'-CGGTACCTGTTTCCAGAAAATTTTGATTCAG-3'. Reaktionsansatz 37,5 µl H₂O
  5 µl 10 × Reaktionspuffer ("genomic PCR")
  4 µl dNTP mix (jeweils 2,5 mM)
  2,2 µl 25 mM Mg(OAc)₂ (Endkonzentration 1,1 mM)
  1 µl Primer sqs3 (10 µM) (10 µM)
  1 µl Primer sqs5 (10 µM)
  0,5 µl Pfu-turbo polymerase mix
  1 µl Genomische Arabidopsis DNA (ca. 250 ng). PCR-Bedingungen 1 Zyklus mit 5 min. bei 94°C
  25 Zyklen mit 94°C für 30 sec, 52°C für 1 min. und 72°C für 1 min.
  1 Zyklus mit 52°C für 1 min. und 72°C für 10 min.,
  anschließend Kühlung auf 4°C bis zur Weiterverarbeitung.
• Das entstandene PCR Fragment wurde als XbaII/BamHI Fragment in das mit XbaII/BamHI geschnittene Plasmid pGUSINT37 kloniert (pSQSPGUS) und mittels Sequenzanalyse verifiziert.
b) Klonierung des Squalen Synthase Promotors vor das PAT-Gen
• Für die Untersuchung der Squalen Synthase-Promotor gestützten Vermittlung von Resistenz gegen Phosphinothricin wurde der Squalen Synthase-Promotor als BamHI/SaII Fragment vor das Phosphinothricin Resistenzgen in das BamHI/SalI geschnittene Plasmid pSUN3PatNos kloniert. Das resultierende Plasmid pSUN3SQSPat wurde unter Verwendung des Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA101 zur Tabaktransformation verwendet. Die selektive Regeneration der Tabakpflänzchen erfolgte einerseits auf Phosphinothricin (5 mg/l) und andererseits zur Kontrolle auf Kanamycin (100 mg/l).
c) Ergebnisse der Analyse der Phosphinothricinresistenz der transgenen Tabakpflanzen
• Im Gegensatz zur Selektion auf Kanamycin, die normal verlief, konnten unter Selektion auf Phosphinothricin keine Kalli oder Sprosse erhalten werden. So ist der Ubiquitin Promotor nicht geeignet für die Expression eines selektiven Markers für den Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Gentransfer mit anschließender Regeneration von Geweben.
Vergleichsbeispiel 3 Testung der Promotoraktivität des Ubiquitin- und Sgualen Synthase-Promotors mittels Partikelkanone
• Um transient die Aktivität des Ubiquitin- und des Squalen Synthase-Promotors zu testen, wurden sterile Tabakblätter mit Plasmid-DNA der Plasmide pUBI42GUS, pSQSPGUS und pGUSIUT37 mit der Partikelkanone "Biolistics" von BioRad beschossen. Dabei wurden Microcarrier (25 µg Gold, Hereus 0,3 bis 3 µm) mit 10 µg Plasmid DNA, 2,5 M CaCl₂, und 0,1 M Spermidine behandelt, mit Alkohol gewaschen und bei einem Vakuum von 26 inch und einem Druck von 1100 psi auf die Blätter, die auf MS-Agarmedium lagen, geschossen. Die Explantate wurden anschließend für 24 h in MS- Medium mit 2% Sucrose inkubiert und dann mit X-gluc histochemisch gefärbt.
• Der Ubiguitin-Promotor und der Squalen Synthase-Promotor zeigten hierbei im Gegensatz zum Vergleichskonstrukt pGUSINT37, wo das GUS Gen unter der Kontrolle des 35S Promotors exprimiert wurde, nur sehr wenige und sehr schwache Punkte mit GUS-Färbung.
• Dies zeigt, dass die Aktivität des Ubiquitin- und des Squalen Synthase-Promotors deutlich schwächer ist, als die des CaMV35S- Promotors. SEQUENZPROTOKOLL
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  
  

Claims (30)

1. Expressionskassette zur transgenen Expression von Nukleinsäuren enthaltend

a) einen Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 oder

b) funktionelle Äquivalente oder äquivalente Fragmente von a), die im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten wie a) besitzen,

wobei a) oder b) funktionell mit einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind.

2. Expressionskassette nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das funktionell äquivalente Fragment ausgewählt ist aus der Gruppe von Sequenzen beschrieben durch SEQ ID NO: 4 und 27.

3. Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass

a) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen funktionell verknüpft ist, oder

b) die Expressionskassette zusätzliche Funktionselemente enthält, oder

c) a) und b) gegeben sind.

4. Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz

a) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz kodierten Proteins, oder

b) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz kodierter sense oder anti-sense-RNA ermöglicht.

5. Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus Nukleinsäuren kodierend für Selektionsmarker, Reportergene, Cellulasen, Chitinasen, Glucanasen, Ribosom- inaktivierende Proteine, Lysozyme, Bacillus thuringiensis Endotoxin, α-Amylaseinhibitor, Proteaseinhibitoren, Lektine, RNAasen, Ribozyme, Acetyl-CoA-carboxylasen, Phytasen, das 2S Albumin aus Bertholletia excelsa, "antifreeze"-Proteinen, Trehalosephosphatsynthase, Trehalosephosphatphosphatase, Trehalase, DREB1A-Faktor, Farnesyltransferasen, Ferritin, Oxalatoxidase, Calcium-abhängigen Proteinkinasen, Calcineurinen, Glutamatdehydrogenasen, das N-hydroxylierende, multifunktionelle Cytochrom P-450, den transkriptionellen Aktivator CBF1, Phytoendesaturasen, Polygalakturonasen, Flavonoid-3'-hydroxylasen, Dihydroflavanol-4-reduktasen, Chalconisomerasen, Chalconsynthasen, Flavanon-3-beta-hydroxylasen, Flavonsynthase II, Verzweigungsenzym Q, "Starch Branching" Enzyme.

6. Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe der Nukleinsäurensequenzen mit den Genbank Accession-Nuinmern U77378, AF306348, A19451, L25042, 578423, U32624, X78815, AJ002399, AF078796, AB044391, AJ222980, X14074, AB045593, AF017451, AF276302, AB061022, X72592, AB045592, AR123356.

7. Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus positiven Selektionsmarkern, negativen Selektionsmarkern und Faktoren die einen Wachstumsvorteil gewähren.

8. Expressionskassette nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Selektionsmarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, die eine Resistenz gegen Antibiotika, Metabolismus-Inhibitoren, Herbizide oder Biozide verleihen.

9. Expressionskassette nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Selektionsmarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, die eine Resistenz verleihen gegen Phosphinothricin, Glyphosat, Bromoxynil, Dalapon, 2-Desoxyglucose-6-phosphat, Tetracycline, Ampicillin, Kanamycin, G-418, Neomycin, Paromomycin, Bleomycin, Zeocin, Hygromycin, Chloramphenicol, Sulfonylharnstoff-Herbizide, Imidazolinon-Herbizide.

10. Transgene Expressionskassette nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Selektionsmarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Phosphinothricinacetyltransferasen, 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasen, Glyphosatoxidoreduktasen, Dehalogenase, Nitrilasen, Neomycinphosphotransferasen, DOG®1-Genen, Acetolactatsynthasen, Hygromycinphosphotransferasen, Chloramphenicolacetyltransferasen, Streptomycinadenylyltransferasen, β-Lactamasen, tetA Genen, tetR Genen, Isopentenyltransferasen, Thymidinkinasen, Diphthematoxin A, Cytosindeaminase (codA), Cytochrom P-450, Haloalkandehalogenasen, iaaH Gene, tms2 Gene, β-Glucuronidasen, Mannose-6-phosphat-Isomerasen, UDP-Galaktose-4-Epimerasen.

11. Transgene Expressionskassette nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Selektionsmarker kodiert wird durch Nukleinsäuresequenzen

a) beschrieben durch SEQ ID NO: 5 oder 6, oder

b) beschrieben durch oder enthalten in den Sequenzen beschrieben durch die GenBank Acc.-No.: X17220, X05822, M22827, X65195, AJ028212, X17220, X05822 M22827, X65195, AJ028212, X63374, M10947, AX022822, AX022820, E01313, J03196, AF080390, AF234316, AF080389, AF234315, AF234314, U00004, NC001140, X51514, AB049823, AF094326, X07645, X07644, A19547, A19546, A19545, I05376, I05373, X74325, AF294981, AF234301, AF234300, AF234299, AF234298, AF354046, AF354045, X65876, X51366, AJ278607, L36849, AB025109, AL133315.

12. Vektoren enthaltend eine Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.

13. Verfahren zur transgenen Expression von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäuresequenz in funktioneller Verknüpfung mit

a) einen Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3 oder

b) einem funktionellen Äquivalent oder äquivalenten Fragment von a), das im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten wie a) besitzt,

transgen exprimiert wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das funktionell äquivalente Fragment ausgewählt ist aus der Gruppe von Sequenzen beschrieben durch SEQ ID NO: 4 und 27.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass

a) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen funktionell verknüpft ist, oder

b) eine verwendete Expressionskassette zusätzliche Funktionselemente enthält, oder

c) a) und b) gegeben sind.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz

a) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz kodierten Proteins, oder

b) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz kodierter sense oder anti-sense-RNA ermöglicht.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus Nukleinsäuren kodierend für Selektionsmarker, Reportergene, Cellulasen, Chitinasen, Glucanasen, Ribosom-inaktivierende Proteine, Lysozyme, Bacillus thuringiensis Endotoxin, α-Amylaseinhibitor, Proteaseinhibitoren, Lektine, RNAasen, Ribozyme, Acetyl-CoA-carboxylasen, Phytasen, das 2S Albumin aus Bertholletia excelsa, "antifreeze"-Proteinen, Trehalosephosphatsynthase, Trehalosephosphatphosphatase, Trehalase, DREB1A-Faktor, Farnesyltransferasen, Ferritin, Oxalatoxidase, Calcium-abhängigen Proteinkinasen, Calcineurinen, Glutamatdehydrogenasen, das N-hydroxylierende, multifunktionelle Cytochrom P-450, den transkriptionellen Aktivator CBF1, Phytoendesaturasen, Polygalakturonasen, Flavonoid-3'-hydroxylasen, Dihydroflavanol-4-reduktasen, Chalconisomerasen, Chalconsynthasen, Flavanon-3-beta-hydroxylasen, Flavonsynthase II, Verzweigungsenzym Q, "Starch Branching" Enzyme.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 17, wobei die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe der Nukleinsäuresequenzen mit den Genbank Accession-Nummern U77378, AF306348, A19451, L25042, S78423, U32624, X78815, AJ002399, AF078796, AB044391, AJ222980, X14074, AB045593, AF017451, AF276302, AB061022, X72592, AB045592, AR123356.

19. Verfahren zur Selektion transformierter Organismen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäuresequenz kodierend für einen Selektionsmarker in funktioneller, transgener Verknüpfung mit

a) einem Promotor gemäß SEQ ID NO: 1, 2 oder 3, oder

b) einem funktionellen Äquivalent oder äquivalenten Fragment von a), das im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten wie a) besitzt,

in einen Organismus eingebracht wird, die Expression des Selektionsmarkers erfolgt und eine Selektion ausgeübt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Selektionsmarker ausgewählt ist aus den in den Ansprüchen 6, 7, 8, 9 oder 10 genannten Gruppen von Selektionsmarkern.

21. Transgener Organismus transformiert mit einer Expressionskassette gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 oder einem Vektor gemäß Anspruch 12.

22. Transgener Organismus nach Anspruch 21 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Hefen, Pilzen, tierischen und pflanzlichen Organismen.

23. Transgener Organismus nach einem der Ansprüche 21 oder 22 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Arabidopsis, Tomate, Tabak, Kartoffeln, Mais, Raps, Weizen, Gerste, Sonnenblumen, Hirse, Rübe, Roggen, Hafer, Zuckerrübe, Bohnengewächse und Soja.

24. Zellkulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut abgeleitet von einem transgenen Organismus nach einem der Ansprüche 21 bis 23.

25. Verwendung eines transgenen Organismus nach einem der Ansprüche 21 bis 23 oder von diesem abgeleitete Zellkulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut nach Anspruch 24 zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.

26. Verwendung nach Anspruch 25, wobei die Feinchemikalien Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, natürliche oder synthetische Geschmacks-, Aroma- oder Farbstoffe sind.

27. Verwendung nach Anspruch 25, wobei das Pharmazeutikum ein Antikörper, Enzym oder pharmazeutisch aktives Protein ist.

28. Verfahren zur Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemikalien in transgenen Organismen nach einem der Ansprüche 21 bis 23 oder von diesen abgeleiteten Zellkulturen, Teilen oder transgenes Vermehrungsgut nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass der transgene Organismus gezüchtet und das gewünschte Pharmazeutikum oder die gewünschte Feinchemikalie isoliert wird.

29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Feinchemikalien Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, natürliche oder synthetische Geschmacks-, Aroma- oder Farbstoffe sind.

30. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Pharmazeutikum ein Antikörper, Enzym oder pharmazeutisch aktives Protein ist.