JP2004520033A - 分化拘束された成熟樹状細胞の調製用補助組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、分化拘束された成熟樹状細胞(DC)の製造方法、具体的にはDCの成熟化に使用されるリボゾーム及び/又は膜細菌抽出物の混合物に関する。
【0002】
樹状細胞は、特異的外部抗原に対する一次及び二次両免疫応答を刺激し得る最も強力な抗原提示細胞として定義されている(Hart "Dendric cells: unique leucocyte populations which control the primary immune response" Blood, 1997, vol.90, p3245)。in vivoでは、末梢で抗原捕獲した未成熟樹状細胞は、リンパ管を通ってリンパ系器官のT細胞ゾーンへと移動し、そこで、MHC分子との関連でこれらの抗原に由来するエピトープを提示し、抗原特異的ナイーブT細胞を活性化し、増殖させる。
【0003】
刺激されたリンパ球は、樹状細胞のタイプ及び既に存在していたサイトカインのパターンにより、細胞傷害性又は補助的なリンパ細胞となり得、また制御性又は抑制性リンパ細胞となり得る。
【0004】
移動の間に、樹状細胞は成熟過程を経て、形態的にも表現型においても変化する。成熟化は、DCの抗原捕獲能の低下及び抗原提示能の増大を誘導する。成熟過程のDCは、共刺激分子をさらに高いレベルで発現し、表面上にCD83を発現するようになり、さらにエフェクターT細胞サブタイプを刺激するサイトカインを産生し、移動能を獲得する(総説として、"Immunobiology of dendritic cells", Banchereau et al., 2000, Ann. Rev. Immunol., 18: 767-811を参照)。
【0005】
ex vivoで大量の樹状細胞を調製する可能性が最近提唱され、その後、これらの細胞を免疫療法において、そして細胞性ワクチンとして使用することに対する関心が高まってきている。
【0006】
樹状細胞は、種々の組織源又は血液若しくは骨髄に存在する前駆体から得ることができる。未成熟樹状細胞は、血液細胞から、所定の培養条件を用いて単球を分化させるとにより得ることもできる(Boyer et al., "Generatino of phagocytic MAK and MAC-DC for therapeutic use: Characterization and in vitro functional properties", Exp. Hematol. 1999, vol. 27, pp751-761)。樹状細胞前駆体の増殖は、ヒト血液中のCD34+細胞小画分中にも認められており(Inaba et al. "Identification of proliferating dendritic cells precursors in mouse blood", 1992, J. Exp. Med., vol. 175, p1157)、これらの細胞を分化させる方法が開発されている。
【0007】
例えばIL−13の存在下、血中の単球から分化させた後、樹状細胞は未成熟な表現型を提示する。すなわち、飲作用又は貪食作用による抗原捕獲については強力であり、低レベルの共刺激分子CD80を呈し、そして表面マーカーCD83を発現しない(Boyer et al., 1999)。
【0008】
成熟樹状細胞は、未成熟樹状細胞よりも強力な免疫調節物質である。具体的には、樹状細胞のin vivo免疫応答誘導能は、それらの成熟度に相関する(Labeur M. S et al. "Generation of tumour immunity by bone-marrow derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage", J Immunol., 1999, 162, 168-175)。
【0009】
ポリIC、CD40リガンド、抗CD40抗体、エンドトキシン類、生菌体、培養上清及びTNFαを含む作動性サイトカインの混合物など、研究目的でDCの成熟化に使用されるいくつかの公知作用物質が存在する。しかし、ペプチドをパルスした後又は特定の抗原を負荷した後その表面上に外来抗原を提示している細胞を用いて、患者に成熟樹状細胞をワクチン接種するための臨床治験は、開発中である。したがって、所定の免疫調節能を有する分化拘束された樹状細胞を得るために、再現性のある臨床用等級の成熟条件の開発が要求される。
【0010】
マイコバクテリウム・ボビス・バシルス・カルメッテ−ゲリン(BCG:Mycobacteirum bovis bacillus Calmette-Guerin)が樹状細胞を活性化することが示されている(Kim et al., "Enhanced antigen-presenting activity and tumour necrosis factor α-independent activation of dendritic cells following treatment with Mycobacteirum bovis bacillus Calmette-Guerin", Immunology, 1999, vol. 97, pp626-633)。しかし、BCGは生きた弱毒化菌株であり、細胞性ワクチン中のその使用は、安全性の懸念を含めいくつかの欠点がある。
【0011】
Ribomunyl(登録商標)(国際非専売名又は一般名:細菌リボゾーム及び膜画分、膜プロテオグリカン)は、その非特異的な自然の免疫刺激作用で知られている。これは、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)由来のプロテオグリカン(1回用量の凍結乾燥物中0.015mg)及び4種の異なる細菌株、クレブシエラ・ニューモニエ(35部)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)(30部)、ストレプトコッカス・ピオゲネスA群(Streptococcus pyogenes group A)(30部)及びヘモフィリス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)(5部)由来の、70%RNAを含有するリボゾーム画分(1回用量の凍結乾燥物中リボゾーム抽出物0.01mg)の両方を含有する。プロテオグリカンは、アジュバント又は非特異的免疫刺激薬として作用し、リボゾームの免疫原性は、リボゾームに天然に結合しているペプチド、又は膜及び細胞質リボゾームに結合しているエピトープに起因する(Clot et al., "Pharmacology of ribosomal immunotherapy", Drugs, 1997, vol. 54, suppl. 1, pp.33-36)。RBLとも呼ばれるRibomunyl(登録商標)は、粘膜性免疫応答を誘発する(Bene & Faure, "From Peyer's patches to tonsils", Drugs, 1997, 54, suppl. 1, pp.24-28)。RBLが多形核細胞(PMN)及びマクロファージに作用することにより全身性の自然免疫応答を刺激し、いくつかのサイトカイン(IL−1、IL−6、IL−8、TNFα、CSF)の産生を増大し、そしてナチュラルキラー細胞の活性化ができるようにすることが明らかにされた。
【0012】
本発明の目的は、未成熟樹状細胞から成熟樹状細胞を調製する新規な方法に関する。この方法は、培養培地中で、未成熟樹状細胞を、リボゾーム及び/又は膜画分細菌混合物を含む成熟化剤に接触させる工程を含む。
【0013】
「成熟化」とは、未成熟な高度貪食性樹状細胞に対する作用であって、細胞の表現型及び/又は機能的変化に至らせる作用と定義される。これに伴う表現型の変化とは、CD80、CD86、CD83、クラスI及びIIMHC分子の細胞表面での発現の増大、及びCD14の表面での発現の低下である。機能的変化とは、貪食性の喪失、移動能の獲得、同種異系間のT細胞刺激効率の上昇、及びサイトカイン及びケモカインの発現特性の変化、具体的にはIL−12分泌の増大であり得る。DCによるIL−12産生は、DCのin vivo機能には、必須である。それは、このサイトカインがin vivoで免疫応答をTh1経路に偏向させることが示されているためである。Th1タイプの応答は、抗原特異的CD8+Tリンパ球の刺激が関与する免疫応答と考えられており、一方Th2タイプの応答は、むしろ抗体応答の刺激、及び最終的には抗原に対する細胞傷害性リンパ球の不応答性が関与する。
【0014】
「分化拘束されたDC」とは、免疫応答を、明瞭にTh1免疫刺激又は免疫調節へと方向付ける成熟DCと定義される。
【0015】
「リボゾーム抽出物」とは、リボゾーム画分、具体的には一本鎖及び/又は二本鎖リボ核酸を含む細菌抽出物と定義される。リボゾーム抽出物又は画分は、細菌培養物から精製又は部分精製された、リボゾームを含有するあらゆる抽出物に相当する。このような抽出物の調製方法は、培養後得られた細菌を溶解する工程、及び全溶解物から細菌リボゾームを含有する画分を、具体的には遠心分離又は濾過により分離する工程を少なくとも含む。
【0016】
「膜抽出物」とは、膜画分に富んだ細菌抽出物と定義される。膜抽出物又は膜画分は、細菌培養物から精製又は部分精製された、膜を含有するあらゆる抽出物又は画分に相当する。このような抽出物の調製方法は、培養後得られた細菌を溶解するステップ、及び細菌の膜を含有する画分を、具体的には遠心分離又は濾過により分離する工程を少なくとも含む。
【0017】
様々な細菌の画分を、Haeuw J.F. et al.(Eur. J. Biochem., 255, 446-454, 1998)に記載の方法又はPierre Fabre S.A.により出願された米国特許第4,249,540号に記載の方法などの、当業者に公知の方法によって調製することができる。
【0018】
「細菌混合物」とは、膜及びリボゾーム画分を含む、おそらくは種々の細菌株に由来する細菌抽出物の混合物と定義される。
【0019】
「成熟化培地」とは、成熟化剤が添加されている、細胞の生存及び分化に適する培養培地と定義され、培養培地は、補充される場合が多い。
【0020】
本発明の実施態様によれば、成熟樹状細胞の調製方法は、成熟化剤がリボゾーム及び/又は膜画分細菌混合物ならびにインターフェロン−γ(IFN−γ)を含むことを特徴とする。インターフェロン−γは、成熟化剤に対して相乗効果を有し、DCの成熟化特性及びその刺激表現型を増大させる。樹状細胞の「刺激表現型」は、Th1応答を誘導し、細胞傷害性Tリンパ球に有利なサイトカインプロフィールを分泌することと定義される。
【0021】
本発明の別の実施態様によれば、上記方法は、未成熟樹状細胞を、クレブシエラ・ニューモニエ由来の膜画分を含む成熟化剤と接触させることを特徴とする。このような成熟化剤を、成熟化培地中、約0.01〜約100μg/mL、好ましくは約0.1〜約10μg/mLの濃度で使用してもよい。
【0022】
本発明の別の実施態様では、上記方法は、細菌株、クレブシエラ・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネスA群、及びヘモフィリア・インフルエンザ由来のリボゾーム画分を含む成熟化剤を未成熟樹状細胞と接触させることを特徴とする。このような成熟化剤を、成熟化培地中、約0.01〜約100μg/mL、好ましくは約0.1〜約10μg/mLの濃度で使用してもよい。
【0023】
本発明の具体的な実施態様では、未成熟樹状細胞を、成熟化培地中、約0.01〜100μg/mL、好ましくは約0.1〜約10μg/mLで使用されるリボゾーム及び膜抽出物細菌混合物を含む成熟化剤と接触させる。
【0024】
本発明の別の具体的な実施態様では、成熟化剤はRibomunyl(登録商標、Inava Laboratory, Pierre Fabre)である。
【0025】
本発明の別の実施態様では、未成熟樹状細胞を、リボゾーム及び膜抽出物細菌混合物ならびにインターフェロン−γを10〜10000UI/mL、好ましくは約100〜約1000UI/mLの用量で含む成熟化剤に接触させる。IFN−γの成熟化作用増強能を試験し、特に樹状細胞のIL−12分泌に効果的であることが見出された(実施例3参照)。Ribomunyl(登録商標、RBL)のみを含む成熟化剤、又はRBL及びIFN−γを含む成熟化剤、又は抗CD40と併用するポリI:Cなどの公知の成熟化剤と樹状細胞との接触がサイトカイン分泌に及ぼす作用を比較すると、RBL及びIFN−γと細胞の接触により、IL−12分泌レベルは他の成熟化剤で得られるものより優るようになり、RBLと細胞の接触により、他の成熟化剤より優れたIL−10分泌を誘導した(実施例3を参照)。IL−12分泌レベルとIL−10分泌レベルの比は、RBL及びIFN−γの両方を用いると、細胞は、効果的に免疫刺激成熟樹状細胞表現型へと分化拘束されることを示している。
【0026】
一方、成熟化剤として例えばRBLのみを用いて、IL−10分泌レベルが高く、IL−12分泌レベルが低いDC細胞を取得すると、結果として興味深い免疫制御特性、具体的には自己免疫疾患を制御する性質を有する成熟樹状細胞が得られる。
【0027】
本発明は、抗原負荷成熟樹状細胞の調製方法にも関する。細胞を、貪食作用、飲作用、親和性による結合、融合、核酸(DNA、RNA)移入又は受容体介在による取り込みにより、当業者に公知の方法に従って、抗原負荷させてもよい。樹状細胞培養培地は、腫瘍標的細胞若しくは細胞破片、又はそれに対する免疫応答が期待される特異的ペプチドを含む溶解性又は微粒子状抗原としてもよい。培養培地には、免疫応答の調節が望まれるペプチド又はタンパク質をコードする遺伝物質を補充してもよく、このような遺伝物質は、樹状細胞をトランスフェクションさせ得るベクターに連結される。
【0028】
細胞が貪食作用により抗原を取り込むことが望ましい場合には、樹状細胞成熟化因子を添加する前に未成熟樹状細胞の培養物に抗原を添加することが好ましい。微粒子状抗原、細胞溶解物又は免疫複合体を用いるときは、貪食作用が望ましいかもしれない。溶解性ペプチド抗原を用いるときは、成熟化後に、樹状細胞に抗原を曝露することが好ましい。
【0029】
本発明は、本明細書記載の方法に従って得ることができる樹状細胞にも関する。
【0030】
未成熟樹状細胞は、当業者に公知のいかなる方法でも得られる。例えば、単球由来樹状細胞を特許出願WO94/26875、WO96/22781又はWO97/44441に従って調製することができる。樹状細胞は、Banchereau et al("Immunobiology of dendritic cells" Annu. Rev. Immunol., 2000, 18:767-911)に従って調製してもよい。
【0031】
本発明の方法に従って得ることができる樹状細胞は、正確なT細胞サブポピュレーションに作用することができる。これは、本発明の樹状細胞が、Th2/Th1免疫応答を刺激又は調節し得ることを意味する。DCは、T細胞のin vivo抗原特異的増殖を誘導することができ、抗原特異的細胞傷害性及び免疫刺激を上昇させ、又はin vivo制御性T細胞を誘導し、それにより抗原特異的細胞傷害性T細胞を抑制し、特異的抗原に対する不応答へと導く。成熟樹状細胞の免疫刺激能と免疫制御能とのバランスは、未成熟細胞に適用した成熟化条件及びこうした条件に置かれたDCのタイプに依存する。
【0032】
誘導された免疫応答の特徴は、特定の病原体又は腫瘍に対するin vivo臨床免疫応答が最終的にこれらの病原体又は腫瘍を減少させ、又は除去する点にある。In vitroでは、樹状細胞について、この応答を、抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球の免疫刺激アッセイにおいて測定してもよい。本発明に従って処理された樹状細胞の機能性を、標的認識能として、及びサイトカイン及びケモカインの放出を分析することにより測定してもよい。免疫応答の制御は、自己免疫疾患の場合、症状の軽減又は消失によって、臨床的に観察される。In vitroでは、免疫応答を制御し得る抗原提示細胞は、刺激性サイトカイン(IL−1、IL−12、IFN−γ)分泌の低下及び特定の抑制性サイトカイン(IL−10、TGF−β)分泌の増加により特徴付けられる。
【0033】
Ribomunyl(登録商標)及びIFNγで処理した後の樹状細胞の細胞形態は、樹状突起の存在により特徴付けられ、これは未成熟樹状細胞上には見ることはできない(Banchereau et al., 2000)。
【0034】
RBL単独又はRBL+インターフェロンγのいずれかを含む成熟化剤と40時間接触させた後、細胞の表現型をフローサイトメトリーにより解析したところ、例えばCD83発現パターン(図3参照)により立証されるように、樹状細胞集団は部分的にのみ成熟化されていることが明らかにされている。こうした部分的成熟は、樹状細胞が患者に注射された後、in vivoでの成熟化プロセスを完遂することをおそらく可能にする。具体的には、そのような細胞は、注射部位からリンパ節に効率的に移動し得る。このような性質により、in vivo治療への応用の興味ある可能性が開かれるかもしれない。
【0035】
本明細書中に引用する実施例は、40時間にわたる樹状細胞と成熟化剤との接触を示す。しかし、本発明の方法は、所望される樹状細胞の成熟化レベルに従って、未成熟樹状細胞を成熟化剤と18時間、又はより短い時間、接触させる工程を含んでもよい。
【0036】
本発明の方法に従って得ることができる樹状細胞は、免疫療法及びワクチン学に使用し得る。細胞を患者に投与することが可能であり、細胞及び添加物は臨床用等級のものである。
【0037】
本発明は、活性物質として、本明細書に記載の方法に従って得ることができる樹状細胞を含有する医薬組成物にも関する。
【0038】
本発明は、活性物質として、本明細書に記載の方法に従って得ることができる樹状細胞を含有する細胞性ワクチン組成物にも関する。
【0039】
記載された方法に従って調製される抗原提示細胞を含有する医薬組成物、細胞性ワクチン組成物及び免疫療法薬を、皮内、皮下、静脈内、リンパ内、リンパ節内、粘膜内又は筋肉内投与を含む、様々な生薬的形態で患者に投与してもよい。注射される単回投与量中の樹状細胞の数は、患者当たり約106〜約109細胞、好ましくは約107〜約108細胞とする。例として、患者は、連続する6週間、各週1回の注射を受けてもよい。
【0040】
図面の説明
図1:樹状細胞成熟化におけるRibomunyl(登録商標)の用量応答
未成熟DCを、0.001〜10μg/mLの用量範囲のRibomunylの存在下、40時間インキュベートした。成熟化を追跡するため、抗CD83抗体、抗CD86及び抗HLA ABC抗体で染色し、蛍光をフローサイトメーターで解析した。
【0041】
X軸は、成熟化培地中のRibomunylの使用用量をmg/mLで示す。マーカーの発現は、CD86及びHLA−ABCマーカーについては、平均蛍光強度任意単位(左Y軸)で、CD83マーカーについては、マーカーを発現している細胞のパーセンテージ(右Y軸)で表した。明色及び濃色のヒストグラムは、それぞれCD86の発現及びHLA−ABCの発現に相当し、曲線はCD83マーカーを発現する細胞のパーセンテージを示す。
【0042】
図2:種々の成熟化条件におけるDCの回収率及び致死率
未成熟DCを標準的試薬である抗CD40(3μg/mL)及びポリ(I:C)(100μg/mL)の存在下、臨床用等級の試薬Ribomunyl(1μg/mL)又はRibomunyl(1μg/mL)及びIFN−γ1000UI/mLの存在下、40時間インキュベートした。培養後の細胞の回収率は、Malassezスライド上で顕微鏡下、生存細胞を計数することにより評価した。細胞の生存率は、TOPRO−3テクノロジー(Molecular Probes)を用いたFACSにより測定した。
【0043】
X軸は、用いられた異なる成熟化条件を表し、Y軸は、回収された細胞のパーセンテージ、又は細胞の致死率のパーセンテージを示す。ヒストグラムは、細胞回収率に相当し、菱形は細胞致死率のパーセンテージに相当する。
【0044】
図3:成熟化処理をしないDC及び種々の成熟化剤とインキュベートした後のDCの表現型のFACSによる解析
未成熟DCを標準的試薬である抗CD40(3μg/mL)及びポリ(I:C)(100μg/mL)存在下、臨床用等級試薬Ribomunyl(1μg/mL)又はRibomunyl(1μg/mL)及びIFN−γ1000UI/mLの存在下、40時間インキュベートした。実線は、イソタイプ対照に相当する。点線は、検体解析に相当する。
【0045】
図4:成熟DCのT細胞同種異系刺激
臨床用等級のRBL(1μg/mL)、RBL(1μg/mL)+IFN−γ(1000U/mL)、ポリI:C+抗CD40による処理、若しくはIFN−γ単独(1000UI/mL)による処理のいずれかによって成熟させたDC、又は未成熟DCに対して、同種異系の混合リンパ球培養反応(MLR)を行った。末梢血白血球抽出物中に存在する特定数の同種異系Tリンパ球とともに、CDを5日間インキュベートした。細胞増殖は、培養の最後の18時間に[メチル−3H]チミジン1μCiとインキュベートした細胞の[3H]チミジン取込みにより定量した。
【0046】
X軸は、種々のDC/T細胞比に相当し、Y軸は細胞の[3H]チミジン取込み量を示す。黒菱形は、無処理DC(=未成熟DC)により得られた値を表し、白丸は、IFN−γ処理による値、黒三角は、RBL単独で処理した細胞に相当し、白三角は、RBL+IFN−γにより処理した細胞に相当し、黒四角は、ポリI:C及び抗CD40で処理した細胞に相当する。
【0047】
図5:成熟DCのIL−12分泌
2×106個DC/mLで40時間細胞培養をした後、IL−12p70サイトカイン分泌について、培養上清を市販のELISAキットを用いてアッセイした。
X軸は、使用した種々の成熟化条件及び対照(無処理細胞)を示し、Y軸は、培養上清中のIL−12p70の量をpg/mLで示す。
【0048】
図6:成熟DCのIL−10分泌
2×106個DC/mLで40時間細胞培養をした後、IL−10サイトカイン分泌について、培養上清を市販のELISAキットを用いてアッセイした。
X軸は、使用した種々の成熟化条件及び対照(無処理細胞)を示し、Y軸は、培養上清中のIL−10の量をpg/mLで示す。
【0049】
実施例
実施例1:樹状細胞成熟化におけるRibomunyl(登録商標)の用量応答
樹状細胞
未成熟な樹状細胞(CD)を、特許出願WO97/44441及びBoyer et al.("Generation of phagocytic MAK and MAC-DC for therapeutic use: Characterization and in vitro functional properties" Exp. Hematol., 1999, 27, 751-761)の方法に従って、末梢血単球の培養により調製し、洗浄した。DCは、GM−CSF(Leucomax, Novartis Pharma)500U/mL及びIL−13(Sanofi Synthelabo)50ng/mLを補充したAIMV培地(完全AIMV培地)中で分化させ、7日間の培養の後洗浄した。その後、4%ヒトアルブミン及び10%ジメチルスルホキシド(DMSO)に2×107DC/mLを懸濁させ、液体窒素中で凍結させた。
【0050】
成熟化
成熟化の前日に、DCを解凍し、GM−CSFを500U/mL及びIL−13を50ng/mL含有する完全AIMV培地中に一晩放置した。Ribomunyl(RBL)(Inava Laboratory, Pierre Fabre)は、薬局で購入した。凍結RBLの各バイアルは、リボゾーム画分0.010mg及び膜画分0.015mgを含有していた。用時、RBLをAIMV培地(0.1mg/mL活性画分)に再懸濁させた。その後、2×106個DC/mLを0.001、0.01、0.1、1及び10μg/mLのRibomunyl存在下、40時間インキュベートした。
【0051】
細胞形態学
血液単球の分化及びRibomunyl+IFN−γによるさらなる処理により得られる樹状細胞の形態においては、成熟DCの特徴である樹状突起の出現を示したが、未成熟DCが観察されたときには、これらの樹状突起は見ることはできなかった(データを示さず)。
【0052】
表現型解析
成熟化を追跡するために、CD83、CD86及びHLA−ABCマーカーの発現についてDCを解析した。DCを、ウシ胎児血清1%を補充したリン酸緩衝生理食塩液に4×106細胞/mLで懸濁させた。細胞懸濁液100μL(各チューブ4×105細胞)をフルオロクロム結合モノクローナル抗体:PE−結合抗CD83mAb 10μL、PE結合抗CD86mAb 10μL又はFITC結合抗HLA−ABC(Immunotech, Marseille, 仏国)10μLとともに、氷上暗所で30分間インキュベートした。その後、細胞をPBSで再び洗浄し、1400rpm、20℃で5分間遠心分離し、3nMTO−PRO3を含有するPBSに再懸濁させ、解析から死細胞を排除した。
【0053】
フローサイトメトリー解析を、CellQuestソフトウェアを備えたBecton Dickinsonサイトメーターを用いて行った。
【0054】
結果:
結果を図1に示す。CD86マーカー発現及びHLA−ABCマーカー発現は、平均蛍光強度任意単位で表し(左Y軸)、CD83マーカー発現は、そのマーカーを発現する細胞のパーセンテージで表す(右Y軸)。
【0055】
1ng/mL〜10μg/mLの範囲のRibomunyl(登録商標)で試験を行い、可能な限り低い毒性にて40時間培養した後にCD成熟化を誘導し得るRBLの最適濃度を評価した。
【0056】
1ng/mL〜0.1μg/mの範囲では、CD14、CD83、HLA−AB及びCD86の発現に基づく成熟化は達成されなかった。1μg/mLを超えると、CD83発現の出現、CD86及びHLA−ABCの上方制御が見られた。細胞致死率は、使用したRBL濃度に関わらず、上昇しなかった(示さず)。したがって、その後の研究にはRBL用量1μg/mLで40時間の成熟化を選択した。
【0057】
実施例2:種々の条件により調製されたDCの解析:細胞の形態、回収率、致死率及びT細胞増殖誘導能
【0058】
細胞
未成熟樹状細胞は、実施例1の記載のとおりに調製した。
2×106個のDCを、標準的試薬である抗CD40(3μg/mL)及びポリ(I:C)(100μg/mL)存在下、臨床用等級試薬Ribomunyl(登録商標)(RBL、1μg/mL)又はRBL(1μg/mL)及びIFN−γ(Imukin、1000UI/mL)の存在下、40時間インキュベートした。24穴プレート中、2×106個DC/mLで培養を行った。
【0059】
細胞回収率及び致死率
培養後の細胞回収率を、Malassezスライド上で生存細胞を計数することにより評価した。細胞の生存率は、トリパンブルー排除により評価した。細胞の生存率は、TOPRO−3を用いるFACSによっても測定した。
【0060】
表現型解析
DCの表現型を実施例1と同じマーカーであるCD83,CD86及びHLA−ABCを用い、実施例1と同じ条件を用いて、CD14マーカー(FITC結合抗CD14mAb 10μL、Becton Dickinson)を加えて、二重染色フローサイトメトリー解析によりDCの表現型を決定した。
【0061】
同種異系混合リンパ球培養反応(MLR)
種々の数のDC(無処理DC、臨床等級試薬処理DC又はポリI:C+抗CD40処理DC)を、固定数の同種異系Tリンパ球とともに5日間インキュベートした。細胞増殖は、培養の最後の18時間に[メチル−3H]チミジン1μCiとインキュベートした細胞の[3H]チミジン取込みにより定量した。
【0062】
結果:
細胞回収率及び致死率
40時間のRBL処理後に収集されたDCの数は、無処理DCよりも1.5倍少なかった(図2)。細胞致死率は、回収された細胞のパーセンテージで表した。
【0063】
RBL又はRBL+IFN−γで処理した後の細胞の回収率は、無処理細胞の回収率に劣り、IFN−γの添加では、細胞回収率は有意には変化せず、ポリI:C+抗CD40処理後の細胞回収率よりも依然優れていた。
【0064】
表現型解析
DCの表現型(図3)は、RBL又はRBL+IFN−γで処理した後、細胞表面上のCD83マーカーの増加を示した。RBL処理後、CD83発現の二峰性パターンは、CD83発現レベルの異なる、2種の細胞集団が存在することを示す。RBL+IFN−γ処理細胞上のCD83発現レベルは、ポリI:C+抗CD40処理細胞のレベルに匹敵し、この結果は、細胞が成熟したことを示す。
【0065】
同種異系混合リンパ球培養反応(MLR)
図4は、混合リンパ球培養反応において、RBL処理DCが、無処理DC又はIFN−γ単独処理DCよりも、5倍強力な刺激細胞であったことを示す。この刺激は、ポリI:C+抗CD40処理DCによるものと近似している。
【0066】
RBLにIFN−γを添加しても、DCの同種異系T細胞増殖誘発能は有意には増大しなかった。
【0067】
実施例3:種々の条件下で成熟させた樹状細胞のサイトカイン分泌
細胞
未成熟樹状細胞を、実施例1に記載のとおりに調製した。2×106個のDCを、前記実施例と同じ条件で成熟させた。
【0068】
サイトカイン検出
2×106個DC/mLで40時間細胞培養した後、培養上清を、IL−12p70及びIL−10サイトカインの分泌について市販のELISAによりアッセイを行った。
【0069】
サイトカインの産生を、DC培養上清中、IL−12p70(MAB611、BAF219)及びIL−10(MAB217、BAF217)に特異的にマッチさせた抗体を用いて測定した。アッセイは、製造業者の取扱い説明書(R&D systems)に従って行った。
【0070】
結果
RBL処理は、少量のIL−12p70の産生を誘導する。DCにIFN−γ及びRBLを添加すると、IL−12p70細胞分泌の10倍の増加が誘導される。この値は、ポリI:C+抗CD40処理で得られる値より4倍高かった(図5)。
【0071】
RBLは、大量のIL−10分泌を誘導した。DCにIFN−γ及びRBLを添加すると、RBL処理細胞によるIL−10分泌に比べ、細胞により分泌されるIL−10のレベルが有意に低下した。高レベルのIL−12p70がRBL+IFN−γ処理DCの上清中に検出された。RBL処理DCにより産生された高レベルのIL−10は、IFN−γの添加により有意に低下した(図6)。
【図面の簡単な説明】
【0072】
【図1】樹状細胞成熟化におけるRibomunyl(登録商標)用量応答を示す。
【図2】種々の成熟化条件におけるDCの回収率及び致死率を示す。
【図3】成熟化処理をしないDC及び種々の成熟化剤とインキュベートした後のDCの表現型のFACSによる解析を示す。
【図4】成熟DCのT細胞同種異系刺激を示す。
【図5】成熟DCのIL−12分泌を示す。
【図6】成熟DCのIL−10分泌を示す。
Claims (11)
- 未成熟樹状細胞から成熟樹状細胞を調製するための、リボゾーム及び/又は膜画分細菌混合物を含む成熟化剤の使用。
- 成熟化剤が、インターフェロン−γならびにリボゾーム及び/又は膜画分細菌混合物を含む、請求項1記載の使用。
- 未成熟樹状細胞からの成熟樹状細胞の調製方法であって、培養培地中で未成熟樹状細胞を、リボゾーム及び/又は膜画分細菌混合物を含む成熟化剤に接触させる工程を含む方法。
- 成熟化剤が、インターフェロン−γならびにリボゾーム及び/又は膜画分細菌混合物を含むことを特徴とする、請求項3記載の成熟樹状細胞の調製方法。
- 膜画分が細菌株クレブシエラ・ニューモニエ由来のものである、請求項3又は4記載の成熟樹状細胞の調製方法。
- リボゾーム画分が細菌株クレブシエラ・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネスA群及びヘモフィリス・インフルエンザ由来のものである、請求項3〜5のいずれか1項記載の成熟樹状細胞の調製方法。
- 前記成熟化剤が、成熟化培地中で約0.01〜約100μg/mL、好ましくは約0.1〜約10μg/mLの用量で用いられるリボゾーム及び/又は膜抽出物細菌混合物を含む、請求項3〜6のいずれか1項記載の成熟樹状細胞の調製方法。
- 前記成熟化剤が、成熟化培地中で約10〜10000UI/mL、好ましくは約100〜約1000UI/mLの用量で使用されるインターフェロン−γを含む、請求項3〜7のいずれか1項記載の成熟樹状細胞の調製方法。
- 請求項3〜8のいずれか1項記載の方法により得ることができる樹状細胞。
- 活性物質として請求項9記載の樹状細胞を薬学的に許容し得るビヒクルとともに含有する医薬組成物。
- 活性物質として請求項9の樹状細胞を含む細胞性ワクチン組成物。
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