ES2287956T3 - Nanoparticulas que tienen oligonucleotidos unidos a las mismas y usos de las mismas. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION PROPORCIONA PROCEDIMIENTOS DE DETECCION DE UN ACIDO NUCLEICO QUE CONSISTEN EN PONER EN CONTACTO UN ACIDO NUCLEICO CON UNO O MAS TIPOS DE PARTICULAS SOBRE LAS CUALES SE UNEN OLIGONUCLEOTIDOS. EN UNA REALIZACION DE LA INVENCION DEL PROCEDIMIENTO, LOS OLIGONUCLEOTIDOS ESTAN UNIDOS A NANOPARTICULAS Y TIENEN SECUENCIAS COMPLEMENTARIAS A PORCIONES DE LA SECUENCIA DEL ACIDO NUCLEICO. COMO RESULTADO DE LA HIBRIDACION DE DICHOS OLIGONUCLEOTIDOS SOBRE LAS NANOPARTICULAS DEL ACIDO NUCLEICO, SE PRODUCE UN CAMBIO DETECTABLE (PREFERIBLEMENTE UN CAMBIO DE COLOR). LA INVENCION PROPORCIONA ASIMISMO COMPOSICIONES Y EQUIPAMIENTOS QUE COMPRENDEN DICHAS NANOPARTICULAS. FINALMENTE, LA INVENCION PROPORCIONA UN PROCEDIMIENTO DE SEPARACION DE UN ACIDO NUCLEICO SELECCIONADO, DE OTROS ACIDOS NUCLEICOS.
Description
Nanopartículas que tienen oligonucleótidos
unidos a las mismas y usos de las mismas.
La invención se refiere a métodos para detectar
ácidos nucleicos, sean naturales o sintéticos, y estén modificados
o no modificados. Esta invención también se refiere a métodos de
nanofabricación. Finalmente, la invención se refiere a métodos para
separar un ácido nucleico seleccionado de otros ácidos
nucleicos.
El desarrollo de métodos para detectar y
secuenciar ácidos nucleicos es crítico para el diagnóstico de
enfermedades genéticas, bacterianas, y virales. Véase Mansfield,
E.S. et al. Molecular and Cellular Probes, 9,
145-156 (1995). Actualmente, hay una diversidad de
métodos usados para detectar secuencias de ácido nucleico
específicas. Id. Sin embargo, estos métodos son complicados,
consumen mucho tiempo y/o requieren el uso de un equipo
especializado y caro. Un método simple, rápido para detectar ácidos
nucleicos que no requiera el uso de dicho equipo sería claramente
deseable.
Se ha desarrollado una diversidad de métodos
para ensamblar coloides metálicos y semiconductores en
nanomateriales. Estos métodos se han centrado en el uso de
moléculas enlazadoras covalentes que tienen funcionalidades en
extremos opuestos con afinidades químicas por los coloides de
interés. Uno de los enfoques más satisfactorios hasta la fecha,
Brust et al., Adv. Mater., 7, 795-797
(1995), implica el uso de coloides de oro y química de adsorción de
tiol bien establecida, Bain & Whitesides, Angew. Chem. Int.
Ed. Engl., 28, 506-512 (1989) y Dubois
& Nuzzo, Annu. Rev. Phys. Chem., 43,
437-464 (1992). En este enfoque, se usan
alcanoditioles lineales como moléculas enlazadoras de partículas.
Los grupos tiol en cada extremo de la molécula enlazadora se unen
covalentemente por sí mismos a las partículas coloidales para formar
estructuras agregadas. Los inconvenientes de este método son que el
proceso es difícil de controlar y los ensamblajes se forman de forma
irreversible. Son necesarios métodos para controlar
sistemáticamente el proceso de ensamblaje si las propiedades de los
materiales de estas estructuras tienen que explotarse
completamente.
Se ha reconocido la utilidad potencial del ADN
para la preparación de biomateriales y en métodos de
nanofabricación. En este trabajo, los investigadores se han
centrado en el uso de propiedades de reconocimiento molecular
específicas de secuencia de oligonucleótidos para diseñar
estructuras de impresión con formas geométricas y tamaños bien
definidos. Shekhtman et al., New J. Chem., 17,
757-763 (1993); Shaw & Wang, Science,
260, 533-536 (1993); Chen et al., J. Am
Chem. Soc., 111, 6402-6407 (1989); Chen
& Seeman, Nature, 350, 631-633
(1991); Smith y Feigon, Nature, 356,
164-168 (1992); Wang et al., Biochem.,
32, 1899-1904 (1993); Chen et al.,
Biochem., 33, 13540-13546 (1994); Marsh
et al., Nucleic Acids Res., 23,
696-700 (1995); Mirkin, Annu. Review Biophys.
Biomol. Struct., 23, 541-576 (1994);
Wells, J. Biol. Chem., 263, 1095-1098
(1988); Wang et al., Biochem., 30,
5667-5674 (1991). Sin embargo, la teoría para
producir estructuras de ADN lleva la ventaja de confirmación
experimental. Seeman et al., New J. Chem., 17,
739-755 (1993).
El documento US5384265
(Geo-Centers, Inc.) describe la detección de dianas
de ácido nucleico con la ayuda de moléculas de ADN que están
marcadas con partículas metálicas coloidales. La detección se
realiza por la actividad catalítica de dichas partículas.
El documento US5521289 (Nanoprobes, Inc.)
describe el uso de pequeñas nanopartículas fabricadas por ejemplo
de oro como marcadores en la detección de por ejemplo ácidos
nucleicos.
El documento EP0526912A2 (Enzo Biochem, Inc.)
describe un método para la detección de material genético diana
basado en dos segmentos polinucleotídicos monocatenarios marcados.
Se usan micro- y macropartículas.
El documento US5508164 (Dekalb Genetics
Corporation) describe un método para el marcaje magnético de un
cromosoma. Las partículas magnéticas pueden comprender oro
coloidal.
La invención proporciona métodos para detectar
ácidos nucleicos. En una realización, el método comprende poner en
contacto un ácido nucleico con uno o más tipos de nanopartículas que
tienen oligonucleótidos unidos a las mismas (conjugados
nanopartícula-oligonucleótido). El ácido nucleico
tiene al menos dos partes, y los oligonucleótidos en cada uno de
los tipos de nanopartículas tienen una secuencia complementaria a la
secuencia de una de las partes del ácido nucleico. El contacto
tiene lugar en condiciones eficaces para permitir la hibridación de
los oligonucleótidos en las nanopartículas con el ácido nucleico. La
hibridación de los oligonucleótidos en las nanopartículas con el
ácido nucleico provoca un cambio detectable.
En otra realización, el método comprende poner
en contacto un ácido nucleico con al menos dos tipos de
nanopartículas que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas. Los
oligonucleótidos son el primer tipo de nanopartículas tienen una
secuencia complementaria a una primera parte de la secuencia del
ácido nucleico. Los oligonucleótidos en el segundo tipo de
nanopartículas tienen una secuencia complementaria a una segunda
parte de la secuencia del ácido nucleico. El contacto tiene lugar
en condiciones eficaces para permitir la hibridación de los
oligonucleótidos en las nanopartículas con el ácido nucleico, y se
observa un cambio detectable conseguido por esta hibridación.
En una realización adicional, el método
comprende proporcionar un sustrato que tenga un primer tipo de
nanopartículas unidas al mismo. El primer tipo de nanopartículas
tiene oligonucleótidos unidos a las mismas, y los oligonucleótidos
tienen una secuencia complementaria a una primera parte de la
secuencia de un ácido nucleico. El sustrato se pone en contacto con
el ácido nucleico en condiciones eficaces para permitir la
hibridación de los oligonucleótidos en las nanopartículas con el
ácido nucleico. Después, se proporciona un segundo tipo de
nanopartículas que tiene oligonucleótidos unidos a las mismas. Los
oligonucleótidos tienen una secuencia complementaria a una o más
partes diferentes de la secuencia del ácido nucleico, y el ácido
nucleico unido al sustrato se pone en contacto con el segundo tipo
de conjugados nanopartícula-oligonucleótido en
condiciones eficaces para permitir la hibridación de los
oligonucleótidos en el segundo tipo de nanopartículas con el ácido
nucleico. Puede observarse un cambio detectable en este punto. El
método puede comprender adicionalmente proporcionar un
oligonucleótido de unión que tenga una secuencia seleccionada que
tenga al menos dos partes, siendo la primera parte complementaria a
al menos una parte de la secuencia de los oligonucleótidos en el
segundo tipo de nanopartículas. El oligonucleótido de unión se pone
en contacto con el segundo tipo de conjugados de
nanopartícula-oligonucleótido unidos al sustrato en
condiciones eficaces para permitir la hibridación del
oligonucleótido de unión a los oligonucleótidos en las
nanopartículas. Después, un tercer tipo de nanopartículas que tiene
oligonucleótidos unidos a las mismas, teniendo los oligonucleótidos
una secuencia complementaria a la secuencia de una segunda parte del
oligonucleótido de unión, se pone en contacto con el
oligonucleótido de unión unido al sustrato en condiciones eficaces
para permitir la hibridación del oligonucleótido de unión con los
oligonucleótidos en las nanopartículas. Finalmente, se observa el
cambio detectable producido por estas hibridaciones.
En otra realización más, el método comprende
poner en contacto un ácido nucleico con un sustrato que tenga
oligonucleótidos unidos al mismo, teniendo los oligonucleótidos una
secuencia complementaria a una primera parte de la secuencia del
ácido nucleico. El contacto tiene lugar en condiciones eficaces para
permitir la hibridación de los oligonucleótidos en el sustrato con
el ácido nucleico. Después, el ácido nucleico unido al sustrato se
pone en contacto con un primer tipo de nanopartículas que tienen
oligonucleótidos unidos a las mismas, teniendo los oligonucleótidos
una secuencia complementaria a una segunda parte de la secuencia
del ácido nucleico. El contacto tiene lugar en condiciones eficaces
para permitir la hibridación de los oligonucleótidos en las
nanopartículas con el ácido nucleico. A continuación, el primer tipo
de conjugados nanopartícula-oligonucleótido unidos
al sustrato se pone en contacto con un segundo tipo de
nanopartículas que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas,
teniendo los oligonucleótidos en el segundo tipo de nanopartículas
una secuencia complementaria a al menos una parte de la secuencia
de los oligonucleótidos en el primer tipo de nanopartículas,
teniendo lugar el contacto en condiciones eficaces para permitir la
hibridación de los oligonucleótidos en el primer y segundo tipos de
nanopartículas. Finalmente, se observa un cambio detectable
producido por estas hibridaciones.
En otra realización, el método comprende poner
en contacto un ácido nucleico con un sustrato que tenga
oligonucleótidos unidos al mismo, teniendo los oligonucleótidos una
secuencia complementaria a una primera parte de la secuencia del
ácido nucleico. El contacto tiene lugar en condiciones eficaces para
permitir la hibridación de los oligonucleótidos en el sustrato con
el ácido nucleico. Después, el ácido nucleico unido al sustrato se
pone en contacto con liposomas que tienen oligonucleótidos unidos a
los mismos, teniendo los oligonucleótidos una secuencia
complementaria a una parte de la secuencia del ácido nucleico. Este
contacto tiene lugar en condiciones eficaces para permitir la
hibridación de los oligonucleótidos en los liposomas con el ácido
nucleico. A continuación, los conjugados
liposoma-oligonucleótido unidos al sustrato se ponen
en contacto con un primer tipo de nanopartículas que tienen al
menos un primer tipo de oligonucleótidos unidos a las mismas. El
primer tipo de oligonucleótidos tiene un grupo hidrófobo unido al
extremo no unido a las nanopartículas, y el contacto tiene lugar en
condiciones eficaces para permitir la unión de los oligonucleótidos
en las nanopartículas a los liposomas como resultado de
interacciones hidrófobas. Puede observarse un cambio detectable en
este punto. El método puede comprender adicionalmente poner en
contacto el primer de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido unidos a los liposomas
con un segundo tipo de nanopartículas que tienen oligonucleótidos
unidos a las mismas. El primer tipo de nanopartículas tiene un
segundo tipo de oligonucleótidos unidos a las mismas que tienen una
secuencia complementaria a al menos una parte de la secuencia de
los oligonucleótidos en el segundo tipo de nanopartículas, y
teniendo los oligonucleótidos en el segundo tipo de nanopartículas
una secuencia complementaria a al menos una parte de la secuencia
del segundo tipo de oligonucleótidos en el primer tipo de
nanopartículas. El contacto tiene lugar en condiciones eficaces
para permitir la hibridación de los oligonucleótidos en el primer y
segundo tipos de nanopartículas. Después, se observa un cambio
detectable.
En otra realización más, el método comprende
proporcionar nanopartículas que tienen oligonucleótidos unidos a
las mismas y proporcionar uno o más tipos de oligonucleótidos de
unión. Cada uno de los oligonucleótidos de unión tiene dos partes.
La secuencia de una parte es complementaria a la secuencia de una de
las partes del ácido nucleico, y la secuencia de la otra parte es
complementaria a la secuencia de los oligonucleótidos en las
nanopartículas. Los conjugados
nanopartícula-oligonucleótido y los oligonucleótidos
de unión se ponen en contacto en condiciones eficaces para permitir
la hibridación de los oligonucleótidos en las nanopartículas con
los oligonucleótidos de unión. El ácido nucleico y los
oligonucleótidos de unión se ponen en contacto en condiciones
eficaces para permitir la hibridación de los oligonucleótidos de
unión con el ácido nucleico. Después, se observa un cambio
detectable. Los conjugados
nanopartícula-oligonucleótido pueden ponerse en
contacto con los oligonucleótidos de unión antes de ponerse en
contacto con el ácido nucleico, o los tres pueden ponerse en
contacto simultáneamente.
En otra realización, el método comprende poner
en contacto un ácido nucleico con al menos dos tipos de partículas
que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas. Los
oligonucleótidos en el primer tipo de partículas tienen una
secuencia complementaria a una primera parte de la secuencia del
ácido nucleico y tienen moléculas donantes de energía en los
extremos no unidos a las partículas. Los oligonucleótidos en el
segundo tipo de partículas tienen una secuencia complementaria a
una segunda parte de la secuencia del ácido nucleico y tienen
moléculas aceptoras de energía en los extremos no unidos a las
partículas. El contacto tiene lugar en condiciones eficaces para
permitir la hibridación de los oligonucleótidos en las partículas
con el ácido nucleico, y se observa un cambio detectable conseguido
por esta hibridación. Las moléculas donantes y aceptoras de energía
pueden ser moléculas fluorescentes.
La invención proporciona adicionalmente kits
para detectar ácidos nucleicos. En una realización, el kit comprende
al menos un recipiente, albergando el recipiente al menos dos tipos
de nanopartículas que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas.
Los oligonucleótidos en el primer tipo de nanopartículas tienen una
secuencia complementaria a la secuencia de una primera parte de un
ácido nucleico. Los oligonucleótidos en el segundo tipo de
nanopartículas tienen una secuencia complementaria a la secuencia
de una segunda parte del ácido nucleico.
Como alternativa, el kit puede comprender al
menos dos recipientes. El primer recipiente alberga nanopartículas
que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas que tienen una
secuencia complementaria a la secuencia de una primera parte de un
ácido nucleico. El segundo recipiente alberga nanopartículas que
tienen oligonucleótidos unidos a las mismas que tienen una
secuencia complementaria a la secuencia de una segunda parte del
ácido nucleico.
En una realización adicional, el kit comprende
al menos un recipiente. El recipiente alberga nanopartículas
metálicas o semiconductoras que tienen oligonucleótidos unidos a las
mismas. Los oligonucleótidos tienen una secuencia complementaria
aparte de un ácido nucleico y tienen moléculas fluorescentes unidas
a los extremos de los oligonucleótidos no unidos a las
nanopartículas.
En otra realización más, el kit comprende un
sustrato, teniendo el sustrato unido al mismo nanopartículas,
teniendo las nanopartículas oligonucleótidos unidos a las mismas que
tienen una secuencia complementaria a la secuencia de una primera
parte de un ácido nucleico. El kit también incluye un primer
recipiente que alberga nanopartículas que tienen oligonucleótidos
unidos a las mismas que tienen una secuencia complementaria a la
secuencia de una segunda parte del ácido nucleico. El kit incluye
adicionalmente un segundo recipiente que alberga un oligonucleótido
de unión que tiene una secuencia seleccionada que tiene al menos dos
partes, siendo la primera parte complementaria a al menos una parte
de la secuencia de los oligonucleótidos en las nanopartículas en el
primer recipiente. El kit también incluye un tercer recipiente que
alberga nanopartículas que tienen oligonucleótidos unidos a las
mismas, teniendo los oligonucleótidos una secuencia complementaria a
la secuencia de una segunda parte del oligonucleótido
de unión.
de unión.
En otra realización, el kit comprende un
sustrato que tiene oligonucleótidos unidos al mismo que tienen una
secuencia complementaria a la secuencia de una primera parte de un
ácido nucleico, un primer recipiente que alberga nanopartículas que
tienen oligonucleótidos unidos a las mismas que tienen una secuencia
complementaria a la secuencia de una segunda parte del ácido
nucleico, y un segundo recipiente que alberga nanopartículas que
tienen oligonucleótidos unidos a las mismas que tienen una secuencia
complementaria a al menos una parte de los oligonucleótidos unidos
a las nanopartículas en el primer recipiente.
En otra realización más, el kit comprende un
sustrato, un primer recipiente que alberga nanopartículas, un
segundo recipiente que alberga un primer de tipo de oligonucleótidos
que tienen una secuencia complementaria a la secuencia de una
primera parte de un ácido nucleico, un tercer recipiente que alberga
un segundo tipo de oligonucleótidos que tienen una secuencia
complementaria a la secuencia de una segunda parte del ácido
nucleico, y un cuarto recipiente que alberga a un tercer tipo de
oligonucleótidos que tienen una secuencia complementaria a al menos
una parte de la secuencia del segundo tipo de oligonucleótidos.
En una realización adicional, el kit comprende
un sustrato que tiene oligonucleótidos unidos al mismo que tienen
una secuencia complementaria a la secuencia de una primera parte de
un ácido nucleico. El kit también incluye un primer recipiente que
alberga liposomas que tienen oligonucleótidos unidos a los mismos
que tienen una secuencia complementaria a la secuencia de una
segunda parte del ácido nucleico y un segundo recipiente que
alberga nanopartículas que tienen al menos un primer tipo de
oligonucleótidos unidos a las mismas, teniendo el primer tipo de
oligonucleótidos un grupo hidrófobo unido al extremo no unido a las
nanopartículas de modo que las nanopartículas puedan unirse a los
liposomas por interacciones hidrófobas. El kit puede comprender
adicionalmente un tercer recipiente que alberga un segundo tipo de
nanopartículas que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas,
teniendo los oligonucleótidos una secuencia complementaria a al
menos una parte de la secuencia de un segundo tipo de
oligonucleótidos unidos al primer tipo de nanopartículas. El segundo
tipo de oligonucleótidos unidos al primer tipo de nanopartículas
tiene una secuencia complementaria a la secuencia de los
oligonucleótidos en el segundo tipo de nanopartículas.
En una realización adicional, el kit comprende
un primer recipiente que alberga nanopartículas que tienen
oligonucleótidos unidos a las mismas. El kit también incluye uno o
más recipientes adicionales, albergando cada recipiente un
oligonucleótido de unión. Cada oligonucleótido de unión tiene una
primera parte que tiene una secuencia complementaria a al menos una
parte de la secuencia de oligonucleótidos en las nanopartículas y
una segunda parte que tiene una secuencia complementaria a la
secuencia de una parte de un ácido nucleico a detectar. Las
secuencias de las segundas partes de los oligonucleótidos de unión
pueden ser diferentes siempre que cada secuencia sea complementaria
a una parte de la secuencia del ácido nucleico a detectar.
En otra realización más, el kit comprende un
recipiente que alberga un tipo de nanopartículas que tienen
oligonucleótidos unidos a las mismas y uno o más tipos de
oligonucleótidos de unión. Cada uno de los tipos de oligonucleótidos
de unión tiene una secuencia que comprende al menos dos partes. La
primera parte es complementaria a la secuencia de los
oligonucleótidos en las nanopartículas, por lo que los
oligonucleótidos de unión se hibridan con los oligonucleótidos en
las nanopartículas en el recipiente o recipientes. La segunda parte
es complementaria a la secuencia de una parte del ácido
nucleico.
En otra realización alternativa, el kit
comprende al menos tres recipientes. El primer recipiente alberga
nanopartículas. El segundo recipiente alberga un primer
oligonucleótido que tiene una secuencia complementaria a la
secuencia de una primera parte de un ácido nucleico. El tercer
recipiente alberga un segundo oligonucleótido que tiene una
secuencia complementaria a la secuencia de una segunda parte del
ácido nucleico. El kit puede comprender adicionalmente un cuarto
recipiente que alberga un oligonucleótido de unión que tiene una
secuencia seleccionada que tiene al menos dos partes, siendo la
primera parte complementaria a al menos una parte de la secuencia
del segundo oligonucleótido, y un quinto recipiente que alberga un
oligonucleótido que tiene una secuencia complementaria a la
secuencia de una segunda parte del oligonucleótido de unión.
En otra realización, el kit comprende uno o dos
recipientes, albergando el recipientes o recipientes dos tipos de
partículas. El primer tipo de partículas que tiene oligonucleótidos
unidos a las mismas que tiene una secuencia complementaria a una
primera parte de la secuencia de un ácido nucleico y tiene moléculas
donantes de energía unidas a los extremos no unidos a las
nanopartículas. El segundo tipo de partículas que tiene
oligonucleótidos unidos a los mismos que tiene una secuencia
complementaria a una segunda parte de la secuencia de un ácido
nucleico y tiene moléculas aceptoras de energía unidas a los
extremos no unidos a las nanopartículas. Los donantes y aceptores de
energía pueden ser moléculas fluorescentes.
La invención también proporciona un sustrato que
tiene nanopartículas unidas al mismo. Las nanopartículas pueden
tener oligonucleótidos unidos a las mismas que tienen una secuencia
complementaria a la secuencia de una primera parte de un ácido
nucleico.
La invención proporciona adicionalmente un
método de nanofabricación. El método comprende proporcionar al
menos un tipo de oligonucleótido de enlace que tenga una secuencia
seleccionada, teniendo la secuencia de cada tipo de oligonucleótido
de enlace al menos dos partes. El método comprende adicionalmente
proporcionar uno o más tipos de nanopartículas que tengan
oligonucleótidos unidos a las mismas, teniendo los oligonucleótidos
en cada tipo de nanopartículas una secuencia complementaria a una
parte de la secuencia de un oligonucleótido de enlace. Los
oligonucleótidos de enlace y las nanopartículas se ponen en contacto
en condiciones eficaces para permitir la hibridación de los
oligonucleótidos en las nanopartículas a los oligonucleótidos de
enlace de modo que se forme un nanomaterial o nanoestructura
deseado.
La invención proporciona otro método de
nanofabricación. Este método comprende proporcionar al menos dos
tipos de nanopartículas que tengan oligonucleótidos unidos a las
mismas. Los oligonucleótidos en el primer tipo de nanopartículas
tienen una secuencia complementaria a la de los oligonucleótidos en
el segundo tipo de nanopartículas. Los oligonucleótidos en el
segundo tipo de nanopartículas tienen una secuencia complementaria a
la de los oligonucleótidos en el primer tipo de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido. El primer y segundo
tipos de nanopartículas se ponen en contacto en condiciones
eficaces para permitir la hibridación de los oligonucleótidos en las
nanopartículas entre sí de modo que se forme un nanomaterial o
nanoestructura deseado.
La invención proporciona adicionalmente
nanomateriales o nanoestructuras compuestos de nanopartículas que
tienen oligonucleótidos unidos a las mismas, manteniéndose las
nanopartículas juntas por conectores oligonucleotídicos.
La invención también proporciona una composición
que comprende al menos dos tipos de nanopartículas que tienen
oligonucleótidos unidos a las mismas. Los oligonucleótidos en el
primer tipo de nanopartículas tienen una secuencia complementaria a
la secuencia de una primera parte de un ácido nucleico o un
oligonucleótido de enlace. Los oligonucleótidos en el segundo tipo
de nanopartículas tienen una secuencia complementaria a la
secuencia de una segunda parte del ácido nucleico u oligonucleótido
de enlace.
La invención proporciona adicionalmente un
ensamblaje de recipientes que comprenden un primer recipiente que
alberga nanopartículas que tienen oligonucleótidos unidos a las
mismas, y un segundo recipiente que alberga nanopartículas que
tienen oligonucleótidos unidos a las mismas. Los oligonucleótidos
unidos a las nanopartículas en el primer recipiente tienen una
secuencia complementaria a la de los oligonucleótidos unidos a las
nanopartículas en el segundo recipiente. Los oligonucleótidos
unidos a las nanopartículas en el segundo recipiente tienen una
secuencia complementaria a la de los oligonucleótidos unidos a las
nanopartículas en el primer recipiente.
La invención también proporciona una
nanopartícula que tiene una pluralidad de diferentes
oligonucleótidos unidos a la misma.
\newpage
Finalmente, la invención proporciona un método
para separar un ácido nucleico seleccionado que tiene al menos dos
partes de otros ácidos nucleicos. El método comprende proporcionar
uno o más tipos de nanopartículas que tengan oligonucleótidos
unidos a las mismas, teniendo los oligonucleótidos en cada uno de
los tipos de nanopartículas una secuencia complementaria a la
secuencia de una de las partes del ácido nucleico seleccionado. Los
ácidos nucleicos seleccionados y otros ácidos nucleicos se ponen en
contacto con las nanopartículas en condiciones eficaces para
permitir la hibridación de los oligonucleótidos en las
nanopartículas con el ácido nucleico seleccionado de modo que las
nanopartículas hibridadas con el ácido nucleico seleccionado se
agreguen y precipiten.
Como se usa en este documento, un "tipo de
oligonucleótidos" se refiere a una pluralidad de moléculas
oligonucleotídicas que tienen la misma secuencia. Un "tipo de
nanopartículas que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas"
se refiere a una pluralidad de nanopartículas que tienen el mismo
tipo o tipos de oligonucleótidos unidos a ellas. "Nanopartículas
que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas" algunas veces
también se refiere a "conjugados
nanopartícula-oligonucleótido" o, en el caso de
los métodos de detección de la invención, "sondas
nanopartícula-oligonucleótido", "sondas de
nanopartículas", o sólo "sondas".
Figura 1: Diagrama esquemático que ilustra la
formación de agregados de nanopartículas combinando nanopartículas
que tienen oligonucleótidos complementarios unidos a las mismas,
estando mantenidas las nanopartículas mantenidas juntas en los
agregados como resultado de la hibridación de los oligonucleótidos
complementarios. X representa cualquier anclaje covalente (tal como
-S(CH_{2})_{3}OP(O)(O^{-})-, donde S está
unido a una nanopartícula de oro). En busca de simplicidad de la
Figura 1 y algunas figuras posteriores, solamente se muestra un
oligonucleótido a unir a cada partícula pero, de hecho, cada
partícula tiene varios oligonucleótidos unidos a la misma. Además,
es importante observar que en la Figura 1 y en posteriores figuras,
los tamaños relativos de las nanopartículas de oro en los
oligonucleótidos no están dibujados a escala.
Figura 2: Diagrama esquemático que ilustra un
sistema para detectar ácido nucleico usando nanopartículas que
tienen oligonucleótidos unidos a las mismas. Los oligonucleótidos en
las dos nanopartículas tienen secuencias complementarias a dos
partes diferentes del ADN monocatenario mostrado. Como consecuencia,
hibridan con el ADN que produce cambios detectables (que forma
agregados y produce un cambio de color).
Figura 3: Diagrama esquemático de una variación
del sistema mostrado en la Figura 2. Los oligonucleótidos en las dos
nanopartículas tienen secuencias complementarias a las dos partes
diferentes del ADN monocatenario mostrado que están separadas por
una tercera parte que no es complementaria a los oligonucleótidos en
las nanopartículas. También se muestra un oligonucleótido de relleno
opcional que puede usarse para hibridar con la parte no
complementaria del ADN monocatenario. Cuando el ADN, las
nanopartículas y los oligonucleótidos de relleno se combinan, las
nanopartículas se agregan, con la formación de conectores
oligonucleótidos con mella, bicatenarios.
Figura 4: Diagrama esquemático que ilustra la
agregación reversible de nanopartículas que tienen oligonucleótidos
unidos a las mismas como resultado de la hibridación y
deshibridación con un oligonucleótido de enlace. El oligonucleótido
de enlace ilustrado es un ADN bicatenario que tiene extremos
sobresalientes (extremos adhesivos) que son complementarios a los
oligonucleótidos unidos a las nanopartículas.
Figura 5: Diagrama esquemático que ilustra la
formación de agregados de nanopartículas combinando nanopartículas
que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas con oligonucleótidos
de enlace que tienen secuencias complementarias a los
oligonucleótidos unidos a las nanopartículas.
Figura 6: Cubetas que contienen dos tipos de
coloides de oro, que tienen cada uno un oligonucleótido diferente
unido a los mismos y un oligonucleótido bicatenario de enlace con
extremos adhesivos complementarios a los oligonucleótidos unidos a
las nanopartículas (véase la Figura 4). Cubeta A - a 80ºC, que está
por encima de la Tm del ADN de enlace; deshibridado (térmicamente
desnaturalizado). El color es rojo oscuro. Cubeta B - después de
enfriar a temperatura ambiente, que está por debajo de la Tm del ADN
de enlace; tiene lugar la hibridación, y las nanopartículas se han
agregado, pero los agregados no han precipitado. El color es
púrpura. Cubeta C - después de varias horas a temperatura ambiente,
las nanopartículas agregadas se han sedimentado en la parte inferior
de la cubeta. La solución es transparente, y el precipitado es gris
rosáceo. El calentamiento de B o C provocará A.
Figura 7: Un gráfico de absorbancia frente a
longitud de onda en nm que muestran los cambios en la absorbancia
cuando las nanopartículas de oro que tienen oligonucleótidos unidos
a las mismas se agregan debido a la hibridación con oligonucleótidos
de enlace después de bajar la temperatura, como se ilustra en la
Figura 4.
Figuras 8A-B: La Figura 8A es un
gráfico del cambio en la absorbancia frente a la temperatura/tiempo
para el sistema ilustrado en la Figura 4. A bajas temperaturas, las
nanopartículas de oro que tienen oligonucleótidos unidos a las
mismas se agregan debido a la hibridación con oligonucleótidos de
enlace (véase la Figura 4). A elevada temperatura (80ºC), las
nanopartículas se deshibridan. El cambio de la temperatura en el
tiempo muestra que esto es un proceso reversible. La Figura 8B es un
gráfico de cambio en la absorbancia frente a la temperatura/tiempo
realizado del mismo modo usando una solución acuosa de
nanopartículas de oro no modificadas. Los cambios reversibles
observados en la Figura 8A no se observan.
Figuras 9A-B: Imágenes de
Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM). La Figura 9A es una
imagen TEM de nanopartículas de oro agregadas mantenidas juntas por
hibridación de los oligonucleótidos en las nanopartículas de oro con
oligonucleótidos de enlace. La Figura 9B es una imagen TEM de un
agregado bidimensional que muestra el orden de las nanopartículas
unidas.
Figura 10: Diagrama esquemático que ilustra la
formación de conectores oligonucleotídicos de triple cadena
térmicamente estables entre nanopartículas que tienen un motivo
pirimidina:purina:pirimidina. Dichos conectores de triple cadena son
más adhesivos que los conectores bicatenarios. En la Figura 10, una
nanopartícula tiene un oligonucleótido unido a la misma que está
compuesto todo de purinas, y la otra nanopartícula tiene un
oligonucleótido unido a la misma que está compuesto todo de
pirimidinas. El tercer oligonucleótido para formar el conector de
triple cadena (no unido a una nanopartícula) está compuesto de
pirimidinas.
Figura 11: Diagrama esquemático que ilustra la
formación de agregados de nanopartículas combinando nanopartículas
que tienen oligonucleótidos complementarios unidos a las mismas,
estando mantenidas las nanopartículas juntas en los agregados como
resultado de la hibridación de los oligonucleótidos complementarios.
En la Figura 11, los círculos representan las nanopartículas, las
fórmulas son secuencias oligonucleotídicas, s es un enlace
tio-alquilo, y los garabatos en los círculos
representan otras moléculas oligonucleotídicas de la misma secuencia
que la indicada que cubren la superficie de las nanopartículas. Los
múltiples oligonucleótidos en los dos tipos de nanopartículas pueden
hibridar entre sí, conduciendo a la formación de una estructura
agregada.
Figura 12: Diagramas esquemáticos que ilustran
sistemas para detectar ácido nucleico usando nanopartículas que
tienen oligonucleótidos unidos a las mismas. Se ilustran los
conjugados 1 y 2 oligonucleótido-nanopartícula y las
dianas oligonucleotídicas monocatenarias 3, 4, 5, 6 y 7. En la
Figura 12, los círculos representan las nanopartículas, las fórmulas
son secuencias oligonucleotídicas, y las líneas discontinuas
representan enlaces de conexión de
nucleótidos.
nucleótidos.
Figuras 13A-B: Diagramas
esquemáticos que ilustran sistemas para detectar ADN (ADN analito)
usando nanopartículas y un sustrato transparente.
Figuras 14A-B: La Figura 14A es
un gráfico de absorbancia frente a longitud de onda en nm que
muestra los cambios en la absorbancia cuando nanopartículas de otro
que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas (una población de la
cual está en solución y una población de la cual está unida a un
sustrato transparente como se ilustra en la Figura 13B) se agregan
debido a la hibridación con oligonucleótidos de enlace. La Figura
14B es un gráfico del cambio en la absorbancia para el sistema
hibridado mencionado en la Figura 14A según aumenta la temperatura
(fusión).
Figura 15: Diagramas esquemáticos que ilustran
sistemas para detectar ácido nucleico usando nanopartículas que
tienen oligonucleótidos unidos a las mismas. Se ilustran los
conjugados 1 y 2 oligonucleótido-nanopartícula y las
dianas oligonucleotídicas monocatenarias 3, 4, 5, 6, 7 y 8. En la
Figura 15, los círculos representan las nanopartículas, las fórmulas
son secuencias oligonucleotídicas, y S representa el enlazador
tio-alquilo.
Figura 16: Diagramas esquemáticos que ilustran
sistemas para detectar ácido nucleico usando nanopartículas que
tienen oligonucleótidos unidos a las mismas. Se ilustran los
conjugados 1 y 2 oligonucleótido-nanopartícula, las
dianas oligonucleotídicas monocatenarias de diferentes longitudes, y
los oligonucleótidos de relleno de diferentes longitudes. En la
Figura 16, los círculos representan las nanopartículas, las fórmulas
son secuencias oligonucleotídicas, y S representa el enlace
tio-alquilo.
Figura 17: Diagramas esquemáticos que ilustran
conjugados nanopartícula-oligonucleótido y sistemas
para detectar ácido nucleico usando nanopartículas que tienen
oligonucleótidos unidos a las mismas. En la Figura 17, los círculos
representan las nanopartículas, las líneas rectas representan
cadenas oligonucleotídicas (bases no mostradas), dos líneas
paralelas poco espaciadas representan segmentos dúplex, y las letras
en minúscula indican secuencias de nucleótidos específicas (a es
complementario a a', b es complementario a b', etc.).
Figura 18: Diagrama esquemático que ilustra un
sistema para detectar ácido nucleico usando liposomas (círculo doble
grande), nanopartículas (círculos oscuros pequeños) y un sustrato
transparente. En la Figura 18, los cuadrados rellenos representan
grupos colesterilo, los garabatos representan oligonucleótidos, y
las escaleras representan oligonucleótidos bicatenarios
(hibridados).
Figuras 19A-B: La Figura 19A es
un gráfico de absorbancia frente a longitud de onda en nm que
muestra cambios en la absorbancia cuando conjugados nanopartícula de
oro-oligonucleótido se ensamblan en múltiples capas
en el sustrato transparente como se ilustra en la Figura 13A. La
Figura 19B es un gráfico del cambio en la absorbancia para el
sistema hibridado mencionado en la Figura 19A según aumenta la
temperatura (fusión).
Figuras 20A-B: Ilustraciones de
esquemas usando oligonucleótidos marcados con fluorescencia unidos a
nanopartículas de inactivación metálicas o semiconductoras (Figura
20A) o a partículas no semiconductoras, no metálicas (Figura
20B).
Las nanopartículas útiles en la práctica de la
invención incluyen materiales coloidales metálicos (por ejemplo,
oro, plata, cobre y platino), semiconductores (por ejemplo CdSa y
CdS) y magnéticos (por ejemplo, ferromagnetita). Otras
nanopartículas útiles en la práctica de la invención incluyen ZnS,
ZnO, TiO_{2}, Agl, AgBr, Hgl_{2}, PbS, PbSe, ZnTe, CdTe,
In_{2}S_{3}, In_{2}Se_{3}, Cd_{3}P_{2},
Cd_{3}As_{2}, InAs y GaAs. El tamaño de las nanopartículas es
preferiblemente de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 150 nm
(diámetro medio), más preferiblemente de aproximadamente 5 a
aproximadamente 50 nm, mucho más preferiblemente de aproximadamente
10 a aproximadamente 30 nm.
Los métodos para fabricar nanopartículas
metálicas, semiconductoras y magnéticas son bien conocidos en la
técnica. Véase, por ejemplo, Schmid, G. (ed.) Clusters and
Colloids (VCH, Weinheim, 1994); Hayat, M.A. (ed.) Colloidal
Gold: Principles, Methods, and Applications (Academic Press, San
Diego, 1991); Massart, R., IEEE Taransactions On Magnetics,
17, 1247 (1981); Ahmadi, T.S. et al., Science,
272, 1924 (1996); Henglein, A. et al., J. Phys.
Chem., 99, 14129 (1995); Curtis, A.C., et al.,
Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 27, 1530 (1988).
Los métodos para fabricar nanopartículas de ZnS,
ZnO, TiO_{2}, AgI, AgBr, HgI_{2}, PbS, PbSe, ZnTe, CdTe,
In_{2}S_{3}, In_{2}Se_{3}, Cd_{3}P_{2},
Cd_{3}As_{2}, InAs y GaAs son bien conocidos en la técnica.
Véase, por ejemplo, Weller, Angew, Chem. Int. Ed. Engl.,
32, 41 (1993); Henglein, Top. Curr. Chem.,
143, 113 (1988); Henglein, Chem. Rev., 89, 1861
(1989); Brus, Appl. Phys. A., 53, 465 (1991);
Bahncmann, en Photochemical Conversion and Storage of Solar
Energy (eds. Pelizetti and Schiavello 1991), página 251; Wang y
Herron, J. Phys. Chem., 95, 525 (1991); Olshavsky
et al., J. Am. Chem. Soc., 112, 9438 (1990); Ushida
et al., J. Phys. Chem., 95, 5382 (1992).
Las nanopartículas adecuadas también están
disponibles en el mercado de, por ejemplo, Ted Pella, Inc. (oro),
Amersham Corporation (oro) y Nanoprobes, Inc. (oro).
Actualmente se prefieren nanopartículas de oro
para su uso en la detección de ácidos nucleicos. Las partículas
coloidales de oro tienen elevados coeficientes de extinción para las
bandas que dan lugar a sus colores preciosos. Estos colores
intensos cambian con el tamaño de partícula, concentración,
distancia entre partículas, y grado de agregación y forma
(geometría) de los agregados, haciendo a estos materiales
particularmente atractivos para ensayos colorimétricos. Por
ejemplo, la hibridación de oligonucleótidos unidos a nanopartículas
de oro con oligonucleótidos y ácidos nucleicos provoca un cambio de
color inmediato visible a simple vista (véanse, por ejemplo, los
Ejemplos).
Las nanopartículas de oro también se prefieren
actualmente para su uso en la nanofabricación por las mismas
razones dadas anteriormente y a causa de su estabilidad, facilidad
de formación de imágenes por microscopía electrónica, y modificación
bien caracterizada con funcionalidades tiol (véase a
continuación).
Las nanopartículas, los oligonucleótidos o ambos
se funcionalizan para unir los oligonucleótidos a las
nanopartículas. Dichos métodos son conocidos en la técnica. Por
ejemplo, los oligonucleótidos funcionalizados con alcanotioles en
sus extremos 3' o extremos 5' se unen fácilmente a nanopartículas de
oro. Véase Whitesides, Proceedings of the Robert A. Welch
Foundation 39th Conference On Chemical Research Nanophase
Chemistry, Houston, TX, páginas 109-121 (1995).
Véase también, Mucic et al. Chem. Commun.
555-557 (1996) (describe un método para unir ADN 3'
tiol a superficies de oro planas; este métodos puede usarse para
unir oligonucleótidos a nanopartículas). El método de alcanotiol
también puede usarse para unir oligonucleótidos a otros coloides
metálicos, semiconductores y magnéticos y a las otras
nanopartículas numeradas anteriormente. Otros grupos funcionales
para unir oligonucleótidos a superficies sólidas incluyen grupos
fosforotioato (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº
5.472.881 para la unión de
oligonucleótido-fosforotioatos a superficies de
oro), alquilsiloxanos sustituidos (véase, por ejemplo, Burwell,
Chemical Technology, 4, 370-377 (1974)
y Matteucci y Caruthers, J. Am. Chem. Soc., 103,
3185-3191 (1981) para unir oligonucleótidos a
superficies de sílice y vidrio, y Grabar et al., Anal.
Chem., 67, 735-743 para unir
aminoalquilsiloxanos y para una unión similar de
mercaptoalquilsiloxanos). Los oligonucleótidos terminados con un
tionucleósido 5' o un tionucleósido 3' también pueden usarse para
unir oligonucleótidos a superficies sólidas. Las nanopartículas de
oro pueden unirse a oligonucleótidos usando oligonucleótidos
marcados con biotina y coloides de oro conjugados con
estreptavidina; la interacción
biotina-estreptavidina une los coloides al
oligonucleótido. Shaiu et al., Nuc. Acids Res., 21, 99
(1993). Las siguientes referencias describen otros métodos que
pueden emplearse para unir oligonucleótidos a nanopartículas: Nuzzo
et al., J. Am. Chem. Soc., 109, 2358 (1987)
(disulfuros en oro); Allara y Nuzzo, Langmuir, 1, 45 (1985)
(ácidos carboxílicos en aluminio); Allara y Tompkins, J. Colloid
Interface Sci., 49, 410-421 (1974)
(ácidos carboxílicos en cobre), Iler, The Chemistry Of
Silica, Capítulo 6, (Wiley 1979) (ácidos carboxílicos en
sílice); Timmons y Zisman, J. Phys. Chem., 69,
984-990 (1965) (ácidos carboxílicos en platino);
Soriaga y Hubbard, J. Am. Chem. Soc., 104, 3937
(1982) (compuestos de anillo aromático en platino); Hubbard, Acc.
Chem. Res., 13, 177 (1980) (sulfolanos, sulfóxidos y
otros disolventes funcionalizados en platino); Hickman et al., J.
Am. Chem. Soc., 111, 7271 (1989) (isonitrilos en
platino) Maoz y Sagiv, Langmuir, 3, 1045 (1987)
(silanos en sílice); Maoz y Sagiv, Langmuir, 3, 1034
(1987) (silanos en sílice); Wasserman et al., Langmuir,
5, 1074 (1989) (silanos en sílice); Eltekova y Eltekov,
Langmuir, 3, 951 (1987) (ácidos carboxílicos
aromáticos, aldehídos, alcoholes y grupos metoxi en dióxido de
titanio y sílice); Lec et al., J. Phys. Chem., 92,
2597 (1988) (fosfatos rígidos en metales).
Cada nanopartícula tendrá una pluralidad de
oligonucleótidos unidos a la misma. Como resultado, cada conjugado
nanopartícula-oligonucleótido puede unirse a una
pluralidad de oligonucleótidos o ácidos nucleicos que tienen la
secuencia complementaria.
Los oligonucleótidos de secuencias definidas se
usan para una diversidad de propósitos en la práctica de la
invención. Los métodos para preparar oligonucleótidos de una
secuencia predeterminada son bien conocidos. Véase, por ejemplo,
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª
ed. 1989) y F. Eckstein (ed.) Oligonucleotides and
Analogues, 1ª Ed. (Oxford University Press, Nueva York, 1991).
Se prefieren métodos de síntesis en fase sólida tanto para
oligorribonucleótidos como oligodesoxirribonucleótidos (los métodos
bien conocidos para sintetizar ADN también son útiles para
sintetizar ARN). Los oligorribonucleótidos y
oligodesoxirribonucleótidos también pueden prepararse
enzimáticamente.
La invención proporciona métodos para detectar
ácidos nucleicos. Puede detectarse cualquier tipo de ácido
nucleico, y los métodos pueden usarse, por ejemplo, para el
diagnóstico de una enfermedad y para secuenciar ácidos nucleicos.
Los ejemplos de ácidos nucleicos que pueden detectarse por los
métodos de la invención incluyen genes (por ejemplo, un gen
asociado con una enfermedad particular), ARN y ADN viral, ADN
bacteriano, ADN fúngico, ADNc, ARNm, ARN y fragmentos de ADN,
oligonucleótidos, oligonucleótidos sintéticos, oligonucleótidos
modificados, ácidos nucleicos monocatenarios y bicatenarios, ácidos
nucleicos naturales y sintéticos, etc. Por tanto, ejemplos de los
usos de los métodos para detectar ácidos nucleicos incluyen: el
diagnóstico y/o control de enfermedades virales (por ejemplo, virus
de la inmunodeficiencia humana, virus de la hepatitis, herpes virus,
citomegalovirus, y virus de Epstein-Barr),
enfermedades bacterianas (por ejemplo, tuberculosis, enfermedad de
Lyme, H. pylori, infecciones por Escherichia coli,
infecciones por Legionella, infecciones por
Mycoplasma, infecciones por Salmonella), enfermedades
transmitidas por vía sexual (por ejemplo, gonorrea), trastornos
hereditarios (por ejemplo, fibrosis quística, distrofia muscular de
Duchene, fenilcetonuria, anemia de células falciformes), y cánceres
(por ejemplo, genes asociados con el desarrollo del cáncer); en
medicina forense; en secuenciación de ADN; para pruebas de
paternidad, para la autenticación de líneas celulares; para
controlar la terapia génica, y para muchos otros propósitos.
Los métodos para detectar ácidos nucleicos
basados en observar un cambio de color a simple vista son baratos,
rápidos, simples, robustos (los reactivos son estables), no
requieren equipo especializado o caro, y no requieren ningún
instrumento. Estos los hace particularmente adecuados para su uso
en, por ejemplo, laboratorios de investigación y analíticos en
secuenciación de ADN, en el campo para detectar la presencia de
patógenos específicos, en el consultorio del doctor para una
identificación rápida de una infección para ayudar a prescribir un
fármaco para el tratamiento, y en los hogares y centros de salud
para exploración de primera línea barata.
El ácido nucleico a detectar puede aislarse por
métodos conocidos, o puede detectarse directamente en células,
muestras tisulares, fluidos biológicos (por ejemplo, saliva, orina,
sangre, suero), soluciones que contienen componentes de PCR,
soluciones que contienen grandes excesos de oligonucleótidos o ADN
de elevado peso molecular, y otras muestras, como también se conoce
en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed. 1989) y B.D. Hames and
S.J. Higgins, Eds., Gene Probes 1 (IRL Press, Nueva York,
1995). Los métodos para preparar ácidos nucleicos para la detección
con sondas de hibridación son bien conocidos en la técnica. Véase,
por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (2ª ed. 1989) y B.D. Hames y S.J. Higgins, Eds., Gene
Probes 1 (IRL Press, Nueva York, 1995).
Si un ácido nucleico está presente en pequeñas
cantidades, puede amplificarse por métodos conocidos en la técnica.
Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (2ª ed. 1989) y B.D. Hames and S.J. Higgins,
Eds., Gene Probes 1 (IRL Press, Nueva York, 1995). Se
prefiere la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa
(PCR).
Un método de acuerdo con la invención para
detectar ácido nucleico comprende poner en contacto un ácido
nucleico con uno o más tipos de nanopartículas que tienen
oligonucleótidos unidos a las mismas. El ácido nucleico a detectar
tiene al menos dos partes. Las longitudes de estas partes y la
distancia o distancias, si las hay, entre ellas se eligen de modo
que cuando los oligonucleótidos en las nanopartículas hibriden con
el ácido nucleico, suceda un cambio detectable. Estas longitudes y
distancias pueden determinarse empíricamente y dependerán del tipo
de partícula usada y su tamaño y el tipo de electrolito que estará
presente en soluciones usadas en el ensayo (ciertos electrolitos
afectan a la conformación de los ácidos nucleicos).
Además, cuando tiene que detectarse un ácido
nucleico en presencia de otros ácidos nucleicos, las partes del
ácido nucleico a las que los oligonucleótidos en las nanopartículas
tienen que unirse deben elegirse de modo que contengan suficiente
secuencia única de modo que la detección del ácido nucleico sea
específica. También se conocen en la técnica directrices para hacer
esto.
Aunque los ácidos nucleicos pueden contener
secuencias de repetición suficientemente cercanas entre sí de modo
que sólo necesite usarse un tipo de conjugado
oligonucleótido-nanopartícula, esto será un caso
raro. En general, las partes elegidas del ácido nucleico tendrán
diferentes secuencias y se pondrán en contacto con nanopartículas
que llevan dos o más oligonucleótidos diferentes, preferiblemente
unidos a diferentes nanopartículas. Un ejemplo de un sistema para
la detección de ácido nucleico se ilustra en la Figura 2. Como puede
observarse, un primer oligonucleótido unido a una primera
nanopartícula tiene una secuencia complementaria a una primera
parte de la secuencia diana en el ADN monocatenario. Un segundo
oligonucleótido unido a una segunda nanopartícula tiene una
secuencia complementaria a una segunda parte de la secuencia diana
en el ADN. Podrían dirigirse partes adicionales del ADN con
nanopartículas correspondientes. Véase la Figura 17. Dirigir varias
partes de un ácido nucleico aumenta la magnitud del cambio
detectable.
El contacto de los conjugados
nanopartícula-oligonucleótido con el ácido nucleico
tiene lugar en condiciones eficaces para la hibridación de los
oligonucleótidos en las nanopartículas con la secuencia o secuencias
diana del ácido nucleico. Estas condiciones de hibridación son bien
conocidas en la técnica y pueden optimizarse para el sistema
particular empleado. Véase, por ejemplo, Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed. 1989).
Preferiblemente se emplean condiciones de hibridación rigurosas.
Puede obtenerse una hibridación más rápida
congelando y descongelando una solución que contenga el ácido
nucleico a detectar y los conjugados
nanopartícula-oligonucleótido. La solución puede
congelarse de cualquier modo conveniente, tal como colocándolo en
un baño de alcohol con hielo seco durante un tiempo suficiente para
que la solución se congele (generalmente aproximadamente 1 minuto
para 100 \mul de solución). La solución debe descongelarse a una
temperatura por debajo de la temperatura de desnaturalización
térmica, que puede ser convenientemente temperatura ambiente para
la mayoría de las combinaciones de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido y ácidos nucleicos.
La hibridación se completa y puede observarse el cambio detectable,
después de descongelar la solución.
La velocidad de hibridación también puede
aumentarse calentando la solución que contiene el ácido nucleico a
detectar y los conjugados
nanopartícula-oligonucleótido a una temperatura por
debajo de la temperatura de disociación (Tm) para el complejo
formado entre los oligonucleótidos en las nanopartículas y el ácido
nucleico diana. Como alternativa, puede conseguirse una hibridación
rápida calentando por encima de la temperatura de disociación (Tm) y
permitiendo que se enfríe la solución.
La velocidad de hibridación también puede
aumentarse aumentando la concentración salina (por ejemplo, NaCl de
0,1 M a 0,3 M).
El cambio detectable que sucede después de la
hibridación de los oligonucleótidos en las nanopartículas con el
ácido nucleico puede ser un cambio de color, la formación de
agregados de las nanopartículas, o la precipitación de las
nanopartículas agregadas. Los cambios de color pueden observarse a
simple vista o espectroscópicamente. La formación de agregados de
las nanopartículas puede observarse por microscopía electrónica o
por nefelometría. La precipitación de las nanopartículas agregadas
puede observarse a simple vista o microscópicamente. Los cambios
preferidos son observables a simple vista. Es particularmente
preferido un cambio de color observable a simple vista.
La observación de un cambio de color a simple
vista puede hacerse más fácilmente frente a un fondo de color de
contraste. Por ejemplo, cuando se usan nanopartículas de oro, la
observación de un cambio de color se ve facilitada aplicando
puntualmente una muestra de la solución de hibridación sobre una
superficie blanca sólida (tal como placas TLC de sílice o aluminio,
papel de filtro, membranas de nitrato de celulosa, y membranas de
nylon, preferiblemente una placa TLC de sílice C-18)
y permitiendo que la mancha se seque. Inicialmente, la mancha
retiene el color de la solución de hibridación (que varía de
rosa/rojo, y en ausencia de hibridación,
purpúreo-rojo/púrpura, si ha habido hibridación). Al
secarse a temperatura ambiente u 80ºC (la temperatura no es
crítica), se desarrolla una mancha azul si los conjugados
nanopartícula-oligonucleótido se han unido por
hibridación con el ácido nucleico diana antes de formar la mancha.
En ausencia de hibridación (por ejemplo, porque el ácido nucleico
no está presente), la mancha es rosa. Las manchas azul y rosa son
estables y no cambian con enfriamiento o calentamiento posterior o
con el tiempo. Proporcionan un registro permanente adecuado del
ensayo. No son necesarias otras etapas (tales como separación de
conjugados nanopartícula-oligonucleótido hibridados
y no hibridados) para observar el cambio de color.
Un método alternativo para visualizar fácilmente
los resultados de ensayo sería aplicar puntualmente una muestra de
sondas de nanopartículas hibridadas con un ácido nucleico diana en
un filtro de fibra de vidrio (por ejemplo, Borosilicate Microfiber
Filter, tamaño de poro de 0,7 \mum, calidad FG75, para su uso con
nanopartículas de oro de 13 nm de tamaño), retirando el líquido a
través del filtro. El posterior aclarado con agua lava el exceso de
sondas no hibridadas a través del filtro, dejando detrás una mancha
observable que comprende los agregados generados por hibridación de
las sondas de nanopartícula con el ácido nucleico diana (retenidas
porque estos agregados son mayores que los poros del filtro). Esta
técnica puede proporcionar mayor sensibilidad, ya que puede usarse
un exceso de sondas de nanopartícula. Desafortunadamente, las sondas
de nanopartícula se adhieren a todas las demás superficies que se
han intentado (portaobjetos de sílice, placas de fase inversa, y
membranas de nylon, nitrocelulosa, celulosa y otras membranas),
haciendo de los filtros de fibra de vidrio la única superficie
sólida conocida hasta la fecha que puede emplearse en dicho formato
de lavado.
Un aspecto importante del sistema de detección
ilustrado en la Figura 2 es que obtener un cambio detectable
depende de la hibridación cooperativa de dos oligonucleótidos
diferentes a una secuencia diana dada en el ácido nucleico. Los
desapareamientos en cualquiera de los dos oligonucleótidos
desestabilizarán la conexión entre partículas. Es bien sabido que
un desapareamiento en el apareamiento de bases tiene un efecto
desestabilizante mucho mayor en la unión de una corta sonda
oligonucleotídica que en la unión de una sonda oligonucleotídica
larga. La ventaja de este sistema ilustrado en la Figura 2 es que
utiliza la discriminación de bases asociada con una secuencia diana
y una sonda largas (dieciocho pares de bases en el ejemplo ilustrado
en la Figura 2), que aún tiene la sensibilidad característica de
una corta sonda oligonucleotídica (nueve pares de bases en el
ejemplo ilustrado en la Figura 2).
La secuencia diana del ácido nucleico puede ser
contigua, como la Figura 2, o las dos partes de la secuencia diana
pueden separarse por una tercera parte que no es complementaria a
los oligonucleótidos en las nanopartículas, como se ilustra en la
Figura 3. En el último caso, se tiene la opción de usar un
oligonucleótido de relleno que está libre en solución y que tiene
una secuencia complementaria a la de esta tercera parte (véase la
Figura 3). Cuando el oligonucleótido de relleno hibrida con la
tercera parte del ácido nucleico, se crea un segmento bicatenario,
alterando de este modo la distancia media entre las nanopartículas
y, por consiguiente, el color. El sistema ilustrado en la Figura 3
puede aumentar la sensibilidad del método de detección.
Algunas realizaciones del método para detectar
ácido nucleico utilizan un sustrato. Empleando un sustrato, el
cambio detectable (la señal) puede amplificarse y aumentarse la
sensibilidad del ensayo.
Puede usarse cualquier sustrato que permita la
observación del cambio detectable. Los sustratos adecuados incluyen
superficies sólidas transparentes (por ejemplo, vidrio, cuarzo,
plástico y otros polímeros), una superficie sólida opaca (por
ejemplo, superficies sólidas blancas, tales como placas de sílice
TLC, papel de filtro, filtros de fibra de vidrio, membranas de
nitrato de celulosa, membranas de nylon), y superficies sólidas
conductoras (por ejemplo, óxido de indio-estaño
(ITO)). El sustrato puede ser de cualquier forma o grosor, pero
generalmente será plano y delgado. Se prefieren sustratos
transparentes tales como vidrio (por ejemplo, portaobjetos de
vidrio) o plástico (por ejemplo, pocillos de placas de
microtitulación).
En una realización, los oligonucleótidos se unen
al sustrato. Los oligonucleótidos pueden unirse a los sustratos
como se describe en, por ejemplo, Chrisey et al., Nucleic Acids
Res., 24, 3031-3039 (1996); Chrisey et
al., Nucleic Acids Res., 24, 3040-3047
(1996); Mucic et al., Chem. Commun., 555 (1996);
Zimmermann y Cox, Nucleic Acids Res., 22, 492 (1994);
Bottomley et al., J. Vac. Sci. Technol. A, 10, 591
(1992); y Hegner et al., FEBS Lett., 336, 452
(1993).
Los oligonucleótidos unidos al sustrato tienen
una secuencia complementaria a una primera parte de la secuencia
del ácido nucleico a detectar. El ácido nucleico se pone en contacto
con el sustrato en condiciones eficaces para permitir la
hibridación de los oligonucleótidos en el sustrato con el ácido
nucleico. De este modo, el ácido nucleico llega a unirse al
sustrato. Preferiblemente se lava cualquier ácido nucleico no unido
del sustrato antes de añadir conjugados
nanopartícula-oligonucleótido.
A continuación, el ácido nucleico unido al
sustrato se pone en contacto con un primer tipo de nanopartículas
que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas. Los
oligonucleótidos tienen una secuencia complementaria a una segunda
parte de la secuencia del ácido nucleico, y el contacto tiene lugar
en condiciones eficaces para permitir la hibridación de los
oligonucleótidos en las nanopartículas con el ácido nucleico. De
este modo, el primer tipo de nanopartícula llega a unirse al
sustrato. Después de que los conjugados
nanopartícula-oligonucleótido se hayan unido al
sustrato, el sustrato se lava para retirar cualquier conjugado
nanopartícula-oligonucleótido y ácido nucleico no
unidos.
Los oligonucleótidos en el primer tipo de
nanopartículas pueden tener todos la misma secuencia o pueden tener
diferentes secuencias que hibriden con diferentes partes del ácido
nucleico a detectar. Cuando se usan oligonucleótidos que tienen
diferentes secuencias, cada nanopartícula puede tener todos los
diferentes oligonucleótidos unidos a la misma o, preferiblemente,
los diferentes oligonucleótidos se unen a diferentes nanopartículas.
La Figura 17 ilustra el uso de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido diseñados para
hibridar con múltiples partes de un ácido
nucleico.
nucleico.
Finalmente, el primer tipo de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido unidos al sustrato se
pone en contacto con un segundo tipo de nanopartículas que tienen
oligonucleótidos unidos a las mismas. Estos oligonucleótidos tienen
una secuencia complementaria a al menos una parte de la secuencia o
secuencias de los oligonucleótidos unidos al primer tipo de
nanopartículas, y el contacto tiene lugar en condiciones eficaces
para permitir la hibridación de los oligonucleótidos en el primer
tipo de nanopartículas con las del segundo tipo de nanopartículas.
Después de que las nanopartículas se hayan unido, el sustrato se
lava preferiblemente para retirar cualquier conjugado
nanopartícula-oligonucleótido no unido.
La combinación de hibridaciones produce un
cambio detectable. Los cambios detectables son iguales que los
descritos anteriormente, excepto en que las múltiples hibridaciones
provocan una amplificación del cambio detectable. En particular,
como cada una del primer tipo de nanopartículas tiene múltiples
oligonucleótidos (que tienen la misma o diferente secuencias)
unidos a las mismas, cada uno del primer tipo de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido puede hibridar con
una pluralidad del segundo tipo de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido. Además, el primer
tipo de conjugados nanopartícula-oligonucleótido
puede hibridar con más de una parte del ácido nucleico a detectar.
La amplificación proporcionada por las múltiples hibridaciones puede
hacer al cambio detectable desde el primer momento o puede aumentar
la magnitud del cambio detectable. Esta amplificación aumenta la
sensibilidad del ensayo, permitiendo la detección de pequeñas
cantidades de ácido nucleico.
Si se desea, pueden formarse capas adicionales
de nanopartículas por adiciones sucesivas del primer y segundo
tipos de conjugados nanopartícula-oligonucleótido.
De este modo, la cantidad de nanopartículas inmovilizada por
molécula de ácido nucleico diana puede aumentarse adicionalmente con
un aumento correspondiente a la intensidad de la señal.
Además, en lugar de usar el primer y segundo
tipos de conjugados nanopartícula-oligonucleótido
diseñados para hibridar entre sí directamente, podrían usarse
nanopartículas que tienen oligonucleótidos que servirían para
unirse a nanopartículas juntos como consecuencia de la hibridación
con oligonucleótidos de unión.
Los métodos para fabricar las nanopartículas y
los oligonucleótidos y para la unión de los oligonucleótidos a las
nanopartículas se han descrito anteriormente. Las condiciones de
hibridación son bien conocidas en la técnica y pueden optimizarse
fácilmente para el sistema particular empleado (véase
anteriormente).
Un ejemplo de este método para detectar ácido
nucleico (ADN analito) se ilustra en la Figura 13A. La combinación
de hibridaciones produce áreas oscuras donde los agregados de
nanopartícula se unen al sustrato por el ADN analito. Estas áreas
oscuras pueden observarse fácilmente a simple vista usando luz
ambiental, preferiblemente viendo el sustrato contra un fondo
blanco. Como puede observarse fácilmente a partir de la Figura 13,
este medio proporciona un método para amplificar un cambio
detectable.
En otra realización, las nanopartículas se unen
al sustrato. Las nanopartículas pueden unirse a sustratos como se
describe en, por ejemplo, Grabar et al., Analyt. Chem.,
67, 73-743 (1995); Bethell et al., J.
Electroanal. Chem., 409, 137 (1996); Bar et al.,
Langmuir, 12, 1172 (1996); Colvin et al., J. Am. Chem.
Soc., 114, 5221 (1992).
Después de que las nanopartículas se hayan unido
al sustrato, los oligonucleótidos se unen a las nanopartículas.
Esto puede conseguirse del mismo modo descrito anteriormente para la
unión de los oligonucleótidos a nanopartículas en solución. Los
oligonucleótidos unidos a las nanopartículas tienen una secuencia
complementaria a una primera parte de la secuencia de un ácido
nucleico.
El sustrato se pone en contacto con el ácido
nucleico en condiciones eficaces para permitir la hibridación de
los oligonucleótidos en las nanopartículas con el ácido nucleico. De
este modo, el ácido nucleico llega a unirse al sustrato. El ácido
nucleico no unido se lava preferiblemente del sustrato antes de
añadir conjugados nanopartícula-oligonucleótido
adicionales.
Después, se proporciona un segundo tipo de
nanopartículas que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas.
Estos oligonucleótidos tienen una secuencia complementaria a una
segunda parte de la secuencia del ácido nucleico, y el ácido
nucleico unido al sustrato se pone en contacto con el segundo tipo
de conjugados nanopartícula-oligonucleótido en
condiciones eficaces para permitir la hibridación de los
oligonucleótidos en el segundo tipo de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido con el ácido nucleico.
De este modo, el segundo tipo de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido llega a unirse al
sustrato. Después de que se hayan unido las nanopartículas, se lava
cualquier conjugado nanopartícula-oligonucleótido y
ácido nucleico no unidos del sustrato. Puede detectarse un cambio
(por ejemplo, cambio de color) en este punto.
Los oligonucleótidos en el segundo tipo de
nanopartículas pueden tener todos la misma secuencia o pueden tener
diferentes secuencias que hibriden con diferentes partes del ácido
nucleico a detectar. Cuando se usan oligonucleótidos que tienen
diferentes secuencias, cada nanopartícula puede tener todos los
diferentes oligonucleótidos unidos a ella o, preferiblemente, los
diferentes oligonucleótidos pueden unirse a diferentes
nanopartículas. Véase la Figura 17.
A continuación, se pone en contacto un
oligonucleótido de unión que tiene una secuencia seleccionada que
tiene al menos dos partes, siendo la primera parte complementaria a
al menos una parte de la secuencia de los oligonucleótidos en el
segundo tipo de nanopartículas, con el segundo tipo de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido unidos al sustrato en
condiciones eficaces para permitir la hibridación del
oligonucleótido de unión a los oligonucleótidos en las
nanopartículas. De este modo, el oligonucleótido de unión llega a
unirse al sustrato. Después de que se hayan unido los
oligonucleótidos de unión, se lavan los oligonucleótidos de unión no
unidos del sustrato.
Finalmente, se proporciona un tercer tipo de
nanopartículas que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas. Los
oligonucleótidos tienen una secuencia complementaria a la secuencia
de una segunda parte del oligonucleótido de unión. Los conjugados
nanopartícula-oligonucleótido se ponen en contacto
con el oligonucleótido de unión unido al sustrato en condiciones
eficaces para permitir la hibridación del oligonucleótido de unión a
los oligonucleótidos en las nanopartículas. Después de que se hayan
unido las nanopartículas, se lavan los conjugados
nanopartícula-oligonucleótido no unidos del
sustrato.
La combinación de hibridaciones produce un
cambio detectable. Los cambios detectables son iguales que los
descritos anteriormente, excepto en que las múltiples hibridaciones
provocan una amplificación del cambio detectable. En particular,
como cada una del segundo tipo de nanopartículas tiene múltiples
oligonucleótidos (que tienen la misma o diferentes secuencias)
unidos a las mismas, cada uno del segundo tipo de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido puede hibridar con una
pluralidad del tercer tipo de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido (a través del
oligonucleótido de unión). Además, el segundo tipo de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido puede hibridar con
más de una parte del ácido nucleico a detectar. La amplificación
proporcionada por las múltiples hibridaciones puede hacer al cambio
detectable desde el primer momento o puede aumentar la magnitud del
cambio detectable. La amplificación aumenta la sensibilidad del
ensayo, permitiendo la detección de pequeñas cantidades de ácido
nucleico.
Si se desea, pueden formarse capas adicionales
de nanopartículas por adiciones sucesivas de los oligonucleótidos
de unión y el segundo y tercer tipos de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido. De este modo, las
nanopartículas inmovilizadas por molécula de ácido nucleico diana
pueden aumentarse adicionalmente con un aumento correspondiente en
la intensidad de la señal.
\newpage
Además, el uso del oligonucleótido de unión
puede eliminarse, y el segundo y tercer tipos de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido puede diseñarse de
modo que hibriden directamente entre sí.
Los métodos para fabricar las nanopartículas y
los oligonucleótidos y para unir los oligonucleótidos a las
nanopartículas se han descrito anteriormente. Las condiciones de
hibridación son bien conocidas en la técnica y pueden optimizarse
fácilmente para el sistema particular empleado (véase
anteriormente).
Un ejemplo de este método para detectar ácido
nucleico (ADN analito) se ilustra en la Figura 13B. La combinación
de hibridaciones produce áreas oscuras donde los agregados de
nanopartículas se unen al sustrato por ADN analito. Estas áreas
oscuras pueden observarse fácilmente a simple vista como se ha
descrito anteriormente. Como puede observarse a partir de la Figura
13B, esta realización del método de la invención proporciona otro
medio para amplificar el cambio detectable.
Otro esquema de amplificación emplea liposomas.
En este esquema, los oligonucleótidos se unen a un sustrato. Los
sustratos adecuados son los descritos anteriormente, y los
oligonucleótidos pueden unirse a los sustratos como se ha descrito
anteriormente. Por ejemplo, cuando el sustrato es vidrio, esto puede
conseguirse condensando los oligonucleótidos a través de grupos
fosforilo o ácido carboxílico con grupos aminoalquilo en la
superficie del sustrato (para una química relacionada véase Grabar
et al., Anal. Chem., 67, 735-743
(1995)).
Los oligonucleótidos unidos al sustrato tienen
una secuencia complementaria a una primera parte de la secuencia
del ácido nucleico a detectar. El ácido nucleico se pone en contacto
con el sustrato en condiciones eficaces para permitir la
hibridación de los oligonucleótidos en el sustrato con el ácido
nucleico. De este modo el ácido nucleico llega a unirse al
sustrato. Cualquier ácido nucleico no unido se lava preferiblemente
del sustrato antes de añadir componentes adicionales del
sistema.
A continuación, el ácido nucleico unido al
sustrato se pone en contacto con liposomas que tienen
oligonucleótidos unidos a los mismos. Los oligonucleótidos tienen
una secuencia complementaria a una segunda parte de la secuencia
del ácido nucleico, y el contacto tiene lugar en condiciones
eficaces para permitir la hibridación de los oligonucleótidos en
los liposomas con el ácido nucleico. De este modo los liposomas
llegan a unirse al sustrato. Después de que los liposomas se hayan
unido al sustrato, el sustrato se lava para retirar cualquier
liposoma y ácido nucleico no
unidos.
unidos.
Los oligonucleótidos en los liposomas pueden
tener todos la misma secuencia o pueden tener diferentes secuencias
que hibriden con diferentes partes del ácido nucleico a detectar.
Cuando se usan oligonucleótidos que tienen diferentes secuencias,
cada liposoma puede tener todos los oligonucleótidos diferentes
unidos al mismo o los diferentes oligonucleótidos pueden unirse a
diferentes liposomas.
Para preparar conjugados
oligonucleótido-liposoma, los oligonucleótidos se
unen a un grupo hidrófobo, tal como colesterilo (véase, Letsinger
et al., J. Am. Chem. Soc., 115,
7535-7536 (1993)), y los conjugados
oligonucleotídicos hidrófobos se mezclan con una solución de
liposomas para formar liposomas con conjugados oligonucleotídicos
hidrófobos anclados en la membrana (véase, Zhang et al.,
Tetrahedron Lett., 37, 6243-6246
(1996)). La carga de los conjugados oligonucleotídicos hidrófobos en
la superficie de los liposomas puede controlarse controlando la
proporción de conjugados oligonucleotídicos hidrófobos a liposomas
en la mezcla. Se ha observado que los liposomas que tienen
oligonucleótidos unidos por interacción hidrófoba de grupos
colesterilo colgantes son eficaces para dirigir polinucleótidos
inmovilizados en una membrana de nitrocelulosa (Id.). Se usaron
grupos de fluoresceína anclados en la membrana de liposoma como
grupo informador. Sirvieron de forma eficaz, pero su sensibilidad
estaba limitada por el hecho de que la señal desde la fluoresceína
en regiones de elevada concentración local (por ejemplo, en la
superficie del liposoma) está debilitada por
auto-inactivación.
Los liposomas se preparan por métodos bien
conocidos en la técnica. Véase, Zhang et al., Tetrahedron
Lett., 37, 6243 (1996). Los liposomas generalmente son
aproximadamente 5-50 veces el tamaño (diámetro) de
las nanopartículas usadas en posteriores etapas. Por ejemplo, para
nanopartículas de aproximadamente 13 nm de diámetro, preferiblemente
se usan liposomas de aproximadamente 100 nm de diámetro.
Los liposomas unidos al sustrato se ponen en
contacto con un primer tipo de nanopartículas que tienen al menos
un primer tipo de oligonucleótidos unidos a las mismas. El primer
tipo de oligonucleótidos tiene un grupo hidrófobo unido al extremo
no unido a las nanopartículas, y el contacto tiene lugar en
condiciones eficaces para permitir la unión de los oligonucleótidos
en las nanopartículas a los liposomas como resultado de
interacciones hidrófobas. Puede observarse un cambio detectable en
este punto.
El método puede comprender adicionalmente poner
en contacto el primer tipo de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido unidos a los
liposomas con el segundo tipo de nanopartículas que tienen
oligonucleótidos unidos a las mismas. El primer tipo de
nanopartículas tiene un segundo tipo de oligonucleótidos unidos a
las mismas que tiene una secuencia complementaria a al menos una
parte de la secuencia de los oligonucleótidos en el segundo tipo de
nanopartículas, y los oligonucleótidos en el segundo tipo de
nanopartículas tienen una secuencia complementaria a al menos una
parte de la secuencia del segundo tipo de oligonucleótidos en el
primer tipo de nanopartículas. El contacto tiene lugar en
condiciones eficaces para permitir la hibridación de los
oligonucleótidos en el primer y segundo tipos de nanopartículas.
Esta hibridación generalmente se realizará a temperaturas suaves
(por ejemplo, 5ºC a 60ºC), de modo que se emplean condiciones (por
ejemplo, NaCl 0,3-1,0 M) que conducen a hibridación
a temperatura ambiente. Después de la hibridación, se lavan los
conjugados nanopartícula-oligonucleótido no unidos
del sustrato.
La combinación de hibridaciones produce un
cambio detectable. Los cambios detectables son iguales que los
descritos anteriormente, excepto en que las múltiples hibridaciones
provocan la amplificación del cambio detectable. En particular,
como cada uno de los liposomas tiene múltiples oligonucleótidos (que
tienen la misma o diferentes secuencias) unidos a los mismos, cada
uno de los liposomas puede hibridar con una pluralidad del primer
tipo de conjugados nanopartícula-oligonucleótido.
De forma similar, como cada una del primer tipo de nanopartículas
tiene múltiples oligonucleótidos unidos a las mismas, cada uno del
primer tipo de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido puede hibridar con
una pluralidad del segundo tipo de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido. Además, los
liposomas pueden hibridar con más de una parte del ácido nucleico a
detectar. La amplificación proporcionada por las múltiples
hibridaciones puede hacer al cambio detectable desde el primer
momento o puede aumentar la magnitud del cambio detectable. Esta
amplificación aumenta la sensibilidad del ensayo, permitiendo la
detección de pequeñas cantidades de ácido nucleico.
Si se desea, pueden formarse capas adicionales
de nanopartículas por adiciones sucesivas del primer y segundo
tipos de conjugados nanopartícula-oligonucleótido.
De este modo, la cantidad de nanopartículas inmovilizada por
molécula de ácido nucleico diana puede aumentarse adicionalmente con
un aumento correspondiente en la intensidad de la señal. También
puede obtenerse una potenciación adicional empleando tinción con
plata de nanopartículas de oro (Bassell, et al., J. Cell
Biol., 126, 863-876 (1994);
Braun-Howland et al., Biotechniques,
13, 928-931 (1992)).
Además, en lugar de usar el segundo y tercer
tipos de conjugados nanopartícula-oligonucleótido
diseñados para hibridar entre sí directamente, podrían usarse
nanopartículas que tienen oligonucleótidos que servirían para poner
las nanopartículas juntas como consecuencia de la hibridación con
oligonucleótidos de unión.
Los métodos para fabricar las nanopartículas y
los oligonucleótidos y para unir los oligonucleótidos a las
nanopartículas se han descrito anteriormente. Puede usarse una
mezcla de oligonucleótidos funcionalizados en un extremo para la
unión a las nanopartículas y con o sin un grupo hidrófobo en el otro
extremo en el primer tipo de nanopartículas. La proporción relativa
de estos oligonucleótidos unidos a la nanopartícula promedio se
controlará por la proporción de las concentraciones de los dos
oligonucleótidos en la mezcla. Las condiciones de hibridación son
bien conocidas en la técnica y pueden optimizarse fácilmente para el
sistema particular empleado (véase anteriormente).
Un ejemplo de este método para detectar ácido
nucleico se ilustra en la Figura 18. La hibridación del primer tipo
de conjugados nanopartícula-oligonucleótido con los
liposomas puede producir un cambio detectable. En el caso de
nanopartículas de oro, puede observarse un color rosa/rojo o un
color púrpura/azul si las nanopartículas están suficientemente
cerca entre sí. La hibridación del segundo tipo de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido al primer tipo de
conjugados nanopartícula-oligonucleótido producirá
un cambio detectable. En el caso de nanopartículas de oro, se
observará un color púrpura/azul. Todos estos cambios de color pueden
observarse a simple vista.
Cuando se emplea un sustrato, puede unirse una
pluralidad de los tipos iniciales de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido u oligonucleótidos al
sustrato en una serie para detectar múltiples partes de un ácido
nucleico diana, para detectar múltiples ácidos nucleicos
diferentes, o ambos. Por ejemplo, puede proporcionarse un sustrato
con filas de manchas, conteniendo cada mancha un diferente tipo de
oligonucleótido o conjugado
oligonucleótido-nanopartícula diseñado para unirse
a una parte de un ácido nucleico diana. Se aplica una muestra que
contiene uno o más ácidos nucleicos a cada mancha, y el resto del
ensayo se realiza en uno de los modos descritos anteriormente
usando conjugados oligonucleótido-nanopartícula
apropiados, conjugados oligonucleótido-liposoma y
oligonucleótidos de unión.
Un conjugado
nanopartícula-oligonucleótido que puede usarse en un
ensayo para cualquier ácido nucleico se ilustra en la Figura 17,
partes IV y V. Esta "sonda universal" tiene oligonucleótidos de
una única secuencia unida a la misma. Estos oligonucleótidos pueden
hibridar con un oligonucleótido de unión que tiene una secuencia
que comprende al menos dos partes. La primera parte es
complementaria a al menos una parte de la secuencia de los
oligonucleótidos en las nanopartículas. La segunda parte es
complementaria a una parte de la secuencia del ácido nucleico a
detectar. Puede usarse una pluralidad de oligonucleótidos de unión
que tienen la misma primera parte y diferentes segundas partes, en
cuyo caso la "sonda universal", después de la hibridación con
los oligonucleótidos de unión, puede unirse a múltiples partes del
ácido nucleico a detectar o a diferentes dianas de ácido
nucleico.
En otra realización más, los oligonucleótidos
unidos a nanopartículas metálicas y semiconductoras pueden tener
una molécula fluorescente unida al extremo no unido a las
nanopartículas. Las nanopartículas metálicas y semiconductoras son
inactivadores de fluorescencia conocidos, dependiendo la magnitud
del efecto de inactivación de la distancia entre las nanopartículas
y la molécula fluorescente. En el estado no hibridado, los
oligonucleótidos unidos a las nanopartículas interaccionan con las
nanopartículas, de modo que se observará una inactivación
significativa. Véase la Figura 20A. Después de la hibridación con
un ácido nucleico diana, la molécula fluorescente llegará a
espaciarse desde las nanopartículas, disminuyendo la inactivación de
la fluorescencia. Véase la Figura 20A. Oligonucleótidos más largos
deben dar lugar a cambios mayores en la fluorescencia, al menos
hasta que los grupos fluorescentes se hayan movido suficientemente
lejos de las superficies de las nanopartículas de modo que ya no se
observe un aumento en el cambio. Las longitudes útiles de los
oligonucleótidos pueden determinarse empíricamente. Pueden usarse
nanopartículas metálicas y semiconductoras que tengan
oligonucleótidos marcados con fluorescencia unidos a las mismas en
cualquiera de los formatos de ensayo descritos anteriormente,
incluyendo los realizados en solución o en sustratos.
Los métodos para marcar oligonucleótidos con
moléculas fluorescentes y medir la fluorescencia son bien conocidos
en la técnica. Las moléculas fluorescentes adecuadas también son
bien conocidas en la técnica e incluyen las fluoresceínas,
rodaminas y Rojo Texas. Los oligonucleótidos se unirán a las
nanopartículas como se ha descrito anteriormente.
En otra realización más, pueden usarse dos tipos
de oligonucleótidos marcados con fluorescencia unidos a dos
partículas diferentes. Las partículas adecuadas incluyen partículas
poliméricas, tales como partículas de poliestireno, partículas de
polivinilo, partículas de acrilato y metacrilato, partículas de
vidrio, partículas de látex, perlas de Sepharose y otras partículas
similares bien conocidas en la técnica. Los métodos para unir
oligonucleótidos a dichas partículas son bien conocidos en la
técnica. En particular, está disponible una amplia diversidad de
grupos funcionales en las partículas o pueden incorporarse en dichas
partículas. Los grupos funcionales incluyen ácidos carboxílicos,
aldehídos, grupos amino, grupos ciano, grupos etileno, grupos
hidroxilo, grupos mercapto, y similares. También pueden usarse
nanopartículas, incluyendo nanopartículas metálicas y
semiconductoras.
Los dos fluoróforos se denominan d y
a para donante y aceptor. Es bien conocida en la técnica una
diversidad de moléculas fluorescentes útiles en dichas
combinaciones y están disponibles en, por ejemplo, Molecular Probes.
Una combinación atractiva es fluoresceína como donante y Rojo Texas
como aceptor. Los dos tipos de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido con d y
a unidos se mezclan con el ácido nucleico diana, y se mide la
fluorescencia en un fluorímetro. La mezcla se excitará con luz de
longitud de onda que excita d, y la mezcla se controlará
para la fluorescencia de a. Después de la hibridación,
d y a se pondrán en proximidad (véase la Figura
20B).
En el caso de partículas no metálicas, no
semiconductoras, la hibridación se mostrará por un cambio en la
fluorescencia de la de d a la de a y por la aparición
de fluorescencia para a además de la de d. En ausencia
de hibridación los fluoróforos estarán demasiado alejados para que
la transferencia de energía sea significativa, y solamente se
observará la fluorescencia de d.
En el caso de nanopartículas metálicas y
semiconductoras, se mostrará ausencia de hibridación por la ausencia
de fluorescencia debida a d o a a causa de la
inactivación (véase anteriormente). La hibridación se mostrará por
un aumento en la fluorescencia debida a a.
Como se apreciará, las partículas y
nanopartículas descritas anteriormente que tienen oligonucleótidos
marcados con moléculas fluorescentes aceptoras y donantes unidas
pueden usarse en los formatos de ensayo descritos anteriormente,
incluyendo los realizados en solución y en sustratos. Para formatos
en solución, las secuencias oligonucleotídicas se eligen
preferiblemente de modo que se unan al ácido nucleico diana como se
ilustra en la Figura 15. En los formatos mostrados en las Figuras
13A-B y 18, los oligonucleótidos de unión pueden
usarse para unir las moléculas fluorescentes aceptoras y donantes
en las dos nanopartículas en proximidad. Además, en el formato
ilustrado en la Figura 13A, los oligonucleótidos unidos al sustrato
pueden marcarse con d. Además, en principio, pueden usarse otros
marcadores además de las moléculas fluorescentes, tales como
moléculas quimioluminiscentes, que darán una señal detectable o un
cambio en la señal detectable después de la hibridación.
La invención también proporciona kits para
detectar ácidos nucleicos. En una realización, el kit comprende al
menos un recipiente, albergando el recipiente al menos dos tipos de
nanopartículas que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas. Los
oligonucleótidos en el primer tipo nanopartículas tienen una
secuencia complementaria a la secuencia de una primera parte de un
ácido nucleico. Los oligonucleótidos en el segundo tipo de
nanopartículas tienen una secuencia complementaria a la secuencia
de una segunda parte del ácido nucleico. El recipiente puede
comprender adicionalmente oligonucleótidos de relleno que tienen una
secuencia complementaria a una tercera parte del ácido nucleico,
estando localizada la tercera parte entre la primera y segunda
partes. El oligonucleótido de relleno también puede proporcionarse
en un recipiente diferente.
En una segunda realización, el kit comprende al
menos dos recipientes. El primer recipiente alberga nanopartículas
que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas que tienen una
secuencia complementaria a la secuencia de una primera parte de un
ácido nucleico. El segundo recipiente alberga nanopartículas que
tienen oligonucleótidos unidos a las mismas que tienen una
secuencia complementaria a la secuencia de una segunda parte del
ácido nucleico. El kit puede comprender adicionalmente un tercer
recipiente que alberga un oligonucleótido de relleno que tiene una
secuencia complementaria a una tercera parte del ácido nucleico,
estando localizada la tercera parte entre la primera y segunda
partes.
En otra realización alternativa, los kits pueden
tener los oligonucleótidos y nanopartículas en recipientes
diferentes, y los oligonucleótidos tendrían que unirse a las
nanopartículas antes de realizar un ensayo para detectar un ácido
nucleico. Los oligonucleótidos y/o las nanopartículas pueden
funcionalizarse de modo que los oligonucleótidos puedan unirse a
las nanopartículas. Como alternativa, los oligonucleótidos y/o
nanopartículas pueden proporcionarse en el kit sin grupos
funcionales, en cuyo caso deben funcionalizarse antes de realizar el
ensayo.
En otra realización, el kit comprende al menos
un recipiente. El recipiente alberga nanopartículas metálicas o
semiconductores que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas. Los
oligonucleótidos tienen una secuencia complementaria a una parte de
un ácido nucleico y tienen moléculas fluorescentes unidas a los
extremos de los nucleótidos no unidos a las nanopartículas.
En otra realización más, el kit comprende un
sustrato, teniendo el sustrato unido al mismo nanopartículas. Las
nanopartículas tienen oligonucleótidos unidos a las mismas que
tienen una secuencia complementaria a la secuencia de una primera
parte de un ácido nucleico. El kit también incluye un primer
recipiente que alberga nanopartículas que tienen oligonucleótidos
unidos a las mismas que tienen una secuencia complementaria a la
secuencia de una segunda parte del ácido nucleico. Los
oligonucleótidos pueden tener la misma o diferentes secuencias,
pero cada uno de los oligonucleótidos tiene una secuencia
complementaria a una parte del ácido nucleico. El kit incluye
adicionalmente un segundo recipiente que alberga un oligonucleótido
de unión que tiene una secuencia seleccionada que tiene al menos
dos partes, siendo la primera parte complementaria a al menos una
parte de la secuencia de los oligonucleótidos en las nanopartículas
en el primer recipiente. El kit también incluye un tercer
recipiente que alberga nanopartículas que tienen oligonucleótidos
unidos a las mismas, teniendo los oligonucleótidos una secuencia
complementaria a la secuencia de una segunda parte del
oligonucleótido de unión.
En otra realización, el kit comprende un
sustrato que tiene oligonucleótidos unidos al mismo que tienen una
secuencia complementaria a la secuencia de una primera parte de un
ácido nucleico. El kit también incluye un primer recipiente que
alberga nanopartículas que tienen oligonucleótidos unidos a las
mismas que tienen una secuencia complementaria a la secuencia de
una segunda parte del ácido nucleico. Los oligonucleótidos pueden
tener la misma o diferentes secuencias, pero cada uno de los
oligonucleótidos tiene una secuencia complementaria a una parte del
ácido nucleico. El kit incluye adicionalmente un segundo recipiente
que alberga nanopartículas que tienen oligonucleótidos unidos a las
mismas que tienen una secuencia complementaria a al menos una parte
de los oligonucleótidos unidos a las nanopartículas en el primer
recipiente.
En otra realización más, los kits pueden tener
el sustrato, oligonucleótidos y nanopartículas en recipientes
diferentes. El sustrato, oligonucleótidos y nanopartículas tendrían
que unirse apropiadamente entre sí antes de realizar un ensayo para
detectar un ácido nucleico. El sustrato, oligonucleótidos y/o las
nanopartículas pueden funcionalizarse para facilitar esta unión.
Como alternativa, el sustrato, oligonucleótidos y/o nanopartículas
puede proporcionarse en el kit sin grupos funcionales, en cuyo caso
deben funcionalizarse antes de realizar el ensayo.
En una realización adicional, el kit comprende
un sustrato que tiene oligonucleótidos unidos al mismo que tienen
una secuencia complementaria a la secuencia de una primera parte de
un ácido nucleico. El kit también incluye un primer recipiente que
alberga liposomas que tienen oligonucleótidos unidos a los mismos
que tienen una secuencia complementaria a la secuencia de una
segunda parte del ácido nucleico y un segundo recipiente que
alberga nanopartículas que tienen al menos un primer tipo de
oligonucleótidos unidos a las mismas, teniendo el primer tipo de
oligonucleótidos un grupo colesterilo unido al extremo no unido a
las nanopartículas de modo que las nanopartículas puedan unirse a
los liposomas por interacciones hidrófobas. El kit puede comprender
adicionalmente un tercer recipiente que alberga un segundo tipo de
nanopartículas que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas,
teniendo los oligonucleótidos una secuencia complementaria a al
menos una parte de la secuencia de un segundo tipo de
oligonucleótidos unidos al primer tipo de nanopartículas. El segundo
tipo de oligonucleótidos unidos al primer tipo de nanopartículas
tiene una secuencia complementaria a la secuencia de los
oligonucleótidos en el segundo tipo de nanopartículas.
En una realización adicional, el kit puede
comprender un primer recipiente que alberga nanopartículas que
tienen oligonucleótidos unidos a las mismas. El kit también incluye
uno o más recipientes adicionales, albergando cada recipiente un
oligonucleótido de unión. Cada oligonucleótido de unión tiene una
primera parte que tiene una secuencia complementaria a al menos una
parte de la secuencia de oligonucleótidos en las nanopartículas y
una segunda parte que tiene una secuencia complementaria a la
secuencia de una parte de un ácido nucleico a detectar. Las
secuencias de las segundas partes de los oligonucleótidos de unión
pueden ser diferentes siempre que cada secuencia sea complementaria
a una parte de la secuencia del ácido nucleico a detectar.
En otra realización, el kit comprende un
recipiente que alberga un tipo de nanopartículas que tienen
oligonucleótidos unidos a las mismas y uno o más tipos de
oligonucleótidos de unión. Cada uno de los tipos de oligonucleótidos
de unión tiene una secuencia que comprende al menos dos partes. La
primera parte es complementaria a la secuencia de los
oligonucleótidos en las nanopartículas, por lo que los
oligonucleótidos de unión hibridan con los oligonucleótidos en las
nanopartículas en el o los recipientes. La segunda parte es
complementaria a la secuencia de una parte del ácido nucleico.
En otra realización, los kits pueden comprender
uno o dos recipientes que albergan dos tipos de partículas. El
primer tipo de partículas que tiene oligonucleótidos unidos a las
mismas que tiene una secuencia complementaria a la secuencia de una
primera parte de un ácido nucleico. Los oligonucleótidos se marcan
con un donante de energía en los extremos no unidos a las
partículas. El segundo tipo de partículas que tiene oligonucleótidos
unidos a las mismas que tiene una secuencia complementaria a la
secuencia de una segunda parte de un ácido nucleico. Los
oligonucleótidos se marcan con un aceptor de energía en los extremos
no unidos a las partículas. Los donantes y aceptores de energía
pueden ser moléculas fluorescentes.
Los kits también pueden contener otros reactivos
y artículos útiles para detectar ácido nucleico. Los reactivos
pueden incluir reactivos de PCR, reactivos de hibridación, tampones,
etc. Otros artículos que pueden proporcionarse como parte del kit
incluyen una superficie sólida (para visualizar la hibridación) tal
como una placa de sílice TLC, jeringas, pipetas, cubetas,
recipientes, y un termociclador (para controlar las temperaturas de
hibridación y deshibridación). Los reactivos para funcionalizar los
nucleótidos o nanopartículas también pueden incluirse en el kit.
La precipitación de nanopartículas agregadas
proporciona un medio para separar un ácido nucleico seleccionado de
otros ácidos nucleicos. Esta separación puede usarse como una etapa
en la purificación del ácido nucleico. Las condiciones de
hibridación son las descritas anteriormente para detectar un ácido
nucleico. Si la temperatura está por debajo de la Tm (la
temperatura a la que la mitad del oligonucleótido está unido a su
cadena complementaria) para la unión de los oligonucleótidos en las
nanopartículas al ácido nucleico, entonces se necesita tiempo
suficiente para que el agregado sedimente. La temperatura de
hibridación (por ejemplo, medida por Tm) varía con el tipo de sal
(NaCl o MgCl_{2}) y su concentración. Las composiciones salinas y
concentraciones se seleccionan para promover la hibridación de los
oligonucleótidos en las nanopartículas al ácido nucleico a
temperaturas de trabajo adecuadas sin inducir la agregación de los
coloides en ausencia del ácido nucleico.
La invención también proporciona un método de
nanofabricación. El método comprender proporcionar al menos un tipo
de oligonucleótido de enlace que tenga una secuencia seleccionada.
Un oligonucleótido de enlace usado para la nanofabricación puede
tener cualquier secuencia deseada o puede ser monocatenario o
bicatenario. También puede contener modificaciones químicas en la
base, azúcar, o secciones de la estructura. Las secuencias elegidas
para los oligonucleótidos de enlace y sus longitudes y cadenas
contribuirán a la rigidez o flexibilidad del nanomaterial o
nanoestructura resultante, o una parte del nanomaterial o
nanoestructura. Se contempla el uso de un único tipo de
oligonucleótido de enlace, así como mezclas de dos o más diferentes
tipos de oligonucleótidos de enlace. La cantidad de diferentes
oligonucleótidos de enlace usados y sus longitudes contribuirá a las
formas, tamaños de poro y otras características estructurales de
los nanomateriales y nanoestructuras resultantes.
La secuencia de un oligonucleótido de enlace
tendrá al menos una primera parte y una segunda parte para la unión
a oligonucleótidos en nanopartículas. La primera, segunda o más
partes de unión del oligonucleótidos de enlace pueden tener la
mismas o diferentes secuencias.
Si todas las partes de unión de un
oligonucleótido de enlace tienen la misma secuencia, solamente
necesitará usarse un único tipo de nanopartícula con
oligonucleótidos que tengan una secuencia complementaria unidos a
la misma para formar un nanomaterial o nanoestructura. Si las dos o
más partes de unión de un oligonucleótido de enlace tienen
diferentes secuencias, entonces deben usarse dos o más conjugados
nanopartícula-oligonucleótido. Véase, por ejemplo,
la Figura 17. Los oligonucleótidos en cada una de las nanopartículas
tendrán una secuencia complementaria a una de las dos o más partes
de unión de la secuencia del oligonucleótido de unión. La cantidad,
secuencia o secuencias y longitud o longitudes de las partes de
unión y la distancia o distancias, si las hay, entre ellas
contribuirá a las propiedades estructurales y físicas de los
nanomateriales y nanoestructuras resultantes. Por supuesto, si el
oligonucleótido de unión comprende dos o más partes, las secuencias
de las partes de unión deben elegirse de modo que no sean
complementarias entre sí para evitar que tengan una parte del
nucleótido de enlace unida a otra parte.
Los oligonucleótidos de enlace y conjugados
nanopartícula-oligonucleótido se ponen en contacto
en condiciones eficaces para la hibridación de los oligonucleótidos
unidos a las nanopartículas con los oligonucleótidos de enlace de
modo que se forma un nanomaterial o nanoestructura deseado donde las
nanopartículas se mantengan juntas por conectores
oligonucleotídicos. Estas condiciones de hibridación son bien
conocidas en la técnica y pueden optimizarse para un esquema de
nanofabricación particular (véase anteriormente). Se prefieren
condiciones de hibridación rigurosas.
La invención también proporciona otro método de
nanofabricación. Este método comprende proporcionar al menos dos
tipos de conjugados nanopartícula-oligonucleótido.
Los oligonucleótidos en el primer tipo de nanopartículas tienen una
secuencia complementaria a la de los oligonucleótidos en el segundo
tipo de nanopartículas. Los oligonucleótidos en el segundo tipo de
nanopartículas tienen una secuencia complementaria a la de los
oligonucleótidos en el primer tipo de nanopartículas. Los
conjugados nanopartícula-oligonucleótido se ponen en
contacto en condiciones eficaces para permitir la hibridación de
los oligonucleótidos en las nanopartículas entre sí de modo que se
forme un nanomaterial o nanoestructura deseado donde las
nanopartículas se mantienen juntas por conectores
oligonucleotídicos. De nuevo, estas condiciones de hibridación son
bien conocidas en la técnica y pueden optimizarse para un esquema
de nanofabricación particular.
En ambos métodos de nanofabricación de la
invención, se contempla el uso de nanopartículas que tienen uno o
más tipos diferentes de oligonucleótidos unidos a las mismas. La
cantidad de diferentes oligonucleótidos unidos a una nanopartícula
y las longitudes y secuencias de uno o más oligonucleótidos
contribuirá a la rigidez y características estructurales de los
nanomateriales y nanoestructuras resultantes.
Además, el tamaño, forma y composición química
de las nanopartículas contribuirá a las propiedades de los
nanomateriales y nanoestructuras resultantes. Estas propiedades
incluyen propiedades ópticas, propiedades
opto-electrónicas, estabilidad en diversas
soluciones, variación del tamaño de poro y de canal, capacidad de
separar moléculas bioactivas funcionando como filtro, etc. Se
contempla el uso de mezclas de nanopartículas que tienen diferentes
tamaños, formas y/o composiciones químicas, así como el uso de
nanopartículas que tienen tamaños, formas y composición química
uniformes.
En cualquier método de fabricación, las
nanopartículas en el nanomaterial o nanoestructura resultante se
mantienen juntas por conectores oligonucleotídicos. Las secuencias,
longitudes, y cadenas de los conectores oligonucleotídicos, y la
cantidad de diferentes conectores oligonucleotídicos presentes
contribuirán a la rigidez y propiedades estructurales del
nanomaterial o nanoestructura. Si un conector oligonucleotídico es
parcialmente bicatenario, su rigidez puede aumentarse por el uso de
un oligonucleótido de relleno como se ha descrito anteriormente en
relación al método de detección de ácido nucleico. La rigidez de un
conector oligonucleotídico completamente bicatenario puede
aumentarse por el uso de uno o más oligonucleótidos de refuerzo que
tienen secuencias complementarias de modo que se unan al conector
oligonucleotídico bicatenario para formar conectores
oligonucleotídicos de triple cadena. También se contempla el uso de
conectores oligonucleotídicos de cuatro cadenas basados en cuartetos
de desoxiguanosina y desoxicitidina.
Se ilustran en las figuras varios de una
diversidad de sistemas para organizar nanopartículas basados en
hibridación de oligonucleótidos. En un sistema simple (Figura 1) un
conjunto de nanopartículas tiene oligonucleótidos con una secuencia
definida y otro conjunto de nanopartículas tiene oligonucleótidos
con una secuencia complementaria. Al mezclar los dos conjuntos de
conjugados nanopartícula-oligonucleótido en
condiciones de hibridación, los dos tipos de partículas se enlazan
por conectores oligonucleotídicos bicatenarios que sirven como
espaciadores para colocar las nanopartículas a distancias
seleccionadas.
Un sistema atractivo para espaciar
nanopartículas implica la adición de un oligonucleótido de unión
libre como se ilustra en la Figura 2. La secuencia del
oligonucleótido de enlace tendrá al menos una primera parte y una
segunda parte para unir los oligonucleótidos en las nanopartículas.
Este sistema es básicamente igual que el utilizado en el método de
detección de ácido nucleico, excepto en que la longitud del
oligonucleótido de enlace añadido puede seleccionarse para que sea
igual a las longitudes combinadas de los oligonucleótidos unidos a
las nanopartículas. El sistema relacionado ilustrado en la Figura 3
proporciona un medio adecuado para adaptar la distancia entre las
nanopartículas sin tener que cambiar los conjuntos de conjugados
nanopartícula-oligonucleótido empleados.
Una elaboración adicional del esquema para crear
espacios definidos entre nanopartículas se ilustra en la Figura 4.
En este caso se emplea un segmento bicatenario de ADN o ARN que
contiene extremos sobresalientes como el oligonucleótido de enlace.
La hibridación de los segmentos monocatenarios, sobresalientes del
oligonucleótido de enlace con los oligonucleótidos unidos a las
nanopartículas produce múltiples enlaces cruzados de los
oligonucleótidos bicatenarios entre las nanopartículas.
Pueden generarse nanomateriales y
nanoestructuras más rígidos, o partes de los mismos, empleando
conectores oligonucleotídicos de triple cadena entre
nanopartículas. En la formación de la cadena triple, se puede
explotar el motivo pirimidina:purina:pirimidina (Moser, H.E. y
Dervan, P.B. Science, 283, 645-650
(1987)) o el motivo purina:purina:pirimidina (Pilch, D.S. et al.
Biochemistry, 30, 6081-6087 (1991)). Un
ejemplo de la organización de las nanopartículas generando
conectores de triple cadena por el motivo
pirimidina:purina:pirimidina se ilustra en la Figura 10. En el
sistema mostrado en la Figura 10, se conjuga un conjunto de
nanopartículas con una cadena definida que contiene nucleósidos de
pirimidina y el otro conjunto se conjuga con un oligonucleótido
complementario que contiene nucleósidos de purina. La unión de los
oligonucleótidos está diseñada de modo que las nanopartículas se
separen por el oligonucleótido bicatenario formado en la
hibridación. Después, se añade al sistema un oligonucleótido de
pirimidina libre con una orientación opuesta a la de la cadena de
pirimidina unida a la nanopartícula antes de, simultáneamente con,
o justo después de mezclar las nanopartículas. Como la tercera
cadena en este sistema se mantiene por apareamiento de bases de
Hoogsteen, la triple cadena es relativamente inestable
térmicamente. Los enlaces covalentes que abarcan la anchura del
dúplex son conocidos por estabilizar los complejos de triple cadena
(Salunke, M., Wu, T., Letsinger, R.L., J. Am, Chem. Soc.
114, 8768-8772, (1992). Letsinger, R.L. y Wu,
T. J. Am Chem. Soc., 117, 7323-7328
(1995). Prakash, G. y Kool, J. Am. Chem. Soc., 114,
3523-3527 (1992).
Para la construcción de nanomateriales y
nanoestructuras, puede ser deseable en algunos casos "bloquear"
el ensamblaje en el sitio por enlaces cruzados covalentes después
de la formación del nanomaterial o nanoestructura por hibridación
de los componentes oligonucleotídicos. Esto puede conseguirse
incorporando grupos funcionales que experimenten una reacción
irreversible desencadenada en los oligonucleótidos. Un ejemplo de un
grupo funcional para este propósito es un grupo
estilbenodicarboxamida. Se ha demostrado que dos grupos de
estilbenodicarboxamida alineados con oligonucleótidos hibridados
experimentan fácilmente reticulación con irradiación con luz
ultravioleta (340 nm) (Lewis, F.D. et al. (1995) J Am.
Chem. Soc. 117, 8785-8792).
Como alternativa, podría emplearse el
desplazamiento de un grupo
5'-O-tosilo de un oligonucleótido,
mantenido en la posición 3' a una nanopartícula por un grupo
mercaptoalquilo, con un grupo tiofosforilo en el extremo 3' de un
oligonucleótido mantenido en una nanopartícula por un grupo
mercaptoalquilo. En presencia de un oligonucleótido que hibrida con
ambos oligonucleótidos y, por lo tanto, pone el grupo tiofosforilo
en proximidad del grupo tosilo, el grupo tosilo se desplazará por
el grupo tiofosforilo, generando un oligonucleótido unido en los
extremos a dos nanopartículas diferentes. Para reacciones de
desplazamiento de este tipo, véase Herrlein et al., J. Am. Chem.
Soc., 177, 10151-10152 (1995). El hecho
de que los oligonucleótidos tiofosforilo no reaccionen con
nanopartículas de oro en las condiciones empleadas para unir
mercaptoalquil-oligonucleótidos a nanopartículas de
oro posibilita que se preparen conjugados nanopartícula de
oro-oligonucleótido anclados a través del grupo
mercapto a las nanopartículas y que contengan un grupo tiofosforilo
terminal libre para la reacción de acoplamiento.
Una reacción de acoplamiento relacionada para
bloquear el sistema de nanopartícula ensamblado en el sitio utiliza
el desplazamiento de bromuro de un bromoacetilaminonucleósido
terminal por un tiofosforil-oligonucleótido
terminal como se describe en Gryaznov y Letsinger, J. Am. Chem.
Soc., 115, 3808. Esta reacción procede de forma mucho
más parecida al desplazamiento de tosilato descrito anteriormente,
excepto en que la reacción es más rápida. Las nanopartículas que
tienen oligonucleótidos terminados con grupos tiofosforilo se
preparan como se ha descrito anteriormente. Para la preparación de
nanopartículas que tienen oligonucleótidos terminados con grupos
bromoacetilamino, primero se prepara un oligonucleótido terminado en
un extremo por un aminonucleósido (por ejemplo,
5'-amino-5'-desoxitimidina
o
3'-amino-3'-desoxitimidina)
y en el otro extremo por un grupo mercaptoalquilo. Las moléculas de
este oligonucleótido después se anclan a las nanopartículas a través
de los grupos mercapto, y el conjugado
nanopartícula-oligonucleótido después se convierte
en el derivado N-bromoacetilamino por reacción con
un agente acilante de bromoacetilo.
Un cuarto esquema de acoplamiento para bloquear
los ensamblajes en el sitio utiliza la oxidación de las
nanopartículas que llevan oligonucleótidos terminados por grupos
tiofosforilo. Se prefieren agentes oxidantes suaves, tales como
triyoduro potásico, ferricianuro potásico (véase, Gryaznov y
Letsinger, Nucleic Acids Research, 21, 1403) u
oxígeno.
Además, las propiedades de los nanomateriales y
nanoestructuras pueden alterarse incorporando en las cadenas
oligonucleotídicas de interconexión funciones orgánicas e
inorgánicas que se mantengan en el sitio por unión covalente a las
cadenas oligonucleotídicas. Se conoce bien una amplia diversidad de
estructuras, modificaciones de bases y azúcares (véase, por
ejemplo, Uhlmann, E., y Peyman, A. Chemical Rewievs,
90, 544-584 (1990)). También, las cadenas
oligonucleotídicas podrían reemplazarse por cadenas "de Ácido
Péptido Nucleico" (PNA), en la que las bases nucleotídicas se
mantienen por una estructura polipeptídica (véase, Wittung, P. et
al., Nature, 368, 561-563 (1994)).
Como puede observarse a partir de lo anterior,
el método de nanofabricación de la invención es extremadamente
versátil. Variando la longitud, secuencia y cadena de los
oligonucleótidos de unión, la cantidad, longitud y secuencia de las
partes de unión de los oligonucleótidos de enlace, de longitud,
secuencia y cantidad de los oligonucleótidos unidos a las
nanopartículas, el tamaño, forma y composición química de las
nanopartículas, la cantidad y tipos de diferentes oligonucleótidos
de enlace y nanopartículas usadas, y las cadenas de los conectores
oligonucleotídicos, pueden prepararse nanomateriales y
nanoestructuras que tienen un amplio intervalo de estructuras y
propiedades. Estas estructuras y propiedades pueden variarse
adicionalmente por reticulación adicional de los conectores
oligonucleotídicos, funcionalizando los oligonucleótidos, por
modificaciones en la estructura, base o azúcar de los
oligonucleótidos, o por el uso de ácidos
péptido-nucleicos.
Los nanomateriales y nanoestructuras que pueden
fabricarse por el método de nanofabricación de la invención
incluyen dispositivos mecánicos a nanoescala, membranas de
separación, bio-filtros, y biochips. Se contempla
que los nanomateriales y nanoestructuras de la invención pueden
usarse como detectores químicos, en ordenadores, para el suministro
de fármacos, para modificación de proteínas, y como moldes para la
biosíntesis/fabricación de nanoestructuras/ensamblaje dirigido de
otras estructuras. Véase en líneas generales, Seeman et al., New
J. Chem., 17, 739 (1993) para otras posibles
aplicaciones.
Debe observarse que el término "un" o
"una" entidad se refiere a uno o más de esa entidad. Por
ejemplo, "una característica" se refiere a una o más
características de al menos una característica. Por tanto, los
términos "un" (o "una"), "uno o más" y "al menos
uno" se usan de forma intercambiable en este documento. También
debe observarse que los términos "comprendiendo",
"incluyendo", y "teniendo" se han usado de forma
intercambiable.
Se prepararon coloides de oro (13 nm de
diámetro) por reducción de HAuCl_{4} con citrato como se describe
en Frens, Nature Phys. Sci., 241, 20 (1973) y Grabar,
Anal. Chem., 67, 735 (1995). En resumen, se lavaron
todos los objetos de cristal en agua regia (3 partes de HCl, 1 parte
de HNO_{3}), se aclararon con H_{2}O Nanopura, después se
secaron en horno antes de su uso. Se adquirió HAuCl_{4} y citrato
sódico de Aldrich Chemical Company. HAuCl_{4} acuoso (1 mM, 500
ml) se llevó a reflujo con agitación. Después, se añadió
rápidamente citrato sódico 38,8 mM (50 ml). El color de la solución
cambió de amarillo pálido a borgoña, y se continuó el reflujo
durante 15 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente, la
solución roja se filtró a través de un filtro de 1 micrómetro
Micron Separations Inc. Los coloides de Au se caracterizaron por
espectroscopía UV-vis usando un espectrofotómetro de
serie de diodos Hewlett Packard 8452A y por Microscopía Electrónica
de Transmisión (TEM) usando un microscopio electrónico de
transmisión Hitachi 8100. Las partículas de oro con diámetros de 13
nm producirán un cambio de color visible cuando se agregan con las
secuencias oligonucleotídicas diana y sonda en el intervalo de
10-35 nucleótidos.
Se sintetizaron oligonucleótidos a una escala de
1 micromol usando un sintetizador de ADN Milligene Expedite en modo
de una única columna usando química de fosforamidita. Eckstein, F.
(ed.) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach
(IRL Press, Oxford, 1991). Todas las soluciones se adquirieron de
Milligene (calidad de síntesis de ADN). La eficacia de acoplamiento
media varió del 98 al 99,8%, y el grupo protector dimetoxitritilo
(DMT) final no se escindió de los oligonucleótidos para ayudar en la
purificación.
Para
3'-tiol-oligonucleótidos, se
adquirió un soporte Tiol-Modifier C3
S-S CPG de Glen Research y se usó en el
sintetizador automático. Durante la escisión normal del soporte
sólido (16 h a 55ºC), se añadió ditiotreitol (DTT) 0,05 M a la
solución de NH_{4}OH para reducir el 3' disulfuro al tiol. Antes
de la purificación por cromatografía líquida de alta presión (HPLC)
en fase inversa, se retiró el exceso de DTT por extracción con
acetato de etilo.
Para
5'-tiol-oligonucleótidos, se
adquirió el reactivo
5'-Tiol-Modifier
C_{6}-fosforamidita de Glen Research, 44901
Falcon Place, Sterling, Va 20166. Los oligonucleótidos se
sintetizaron y el grupo protector DMT final se retiró. Después, se
añadió 1 ml de acetonitrilo seco a 100 \mumoles del
5'-Tiol Modifier
C_{6}-fosforamidita. Se mezclaron 200 \mul de
la solución de amidita y 200 \mul de activador (reciente del
sintetizador) y se introdujeron en la columna que contenía los
oligonucleótidos sintetizados aún en el soporte sólido por una
jeringa y bombeando hacia delante y hacia atrás a través de la
columna durante 10 minutos. Después se lavó el soporte (2 x 1 ml)
con acetonitrilo seco durante 30 segundos. Se introdujeron 700
\mul de una mezcla de I_{2} 0,016 M/H_{2}O/piridina (solución
oxidante) en la columna, y después se bombeó hacia delante y hacia
atrás a través de la columna con dos jeringas durante 30 segundos.
El soporte después se lavó con una mezcla 1:1 de
CH_{3}CN/piridina (2 x 1 ml) durante 1 minuto, seguido por un
lavado final con acetonitrilo seco (2 x 1 ml) con posterior secado
de la columna con un chorro de nitrógeno. El grupo protector de
tritilo no se retiró, que ayuda a la purificación.
Se realizó HPLC en fase inversa con un sistema
Dionex DX500 equipado con una columna hypersil Hewlett Packard ODS
(4,6 x 200 mm, 5 mm de tamaño de partícula) usando tampón
Et_{3}NH^{+} OAc^{-} 0,03 M (TEAA), pH 7, con un gradiente
del 1%/min del 95% de CH_{3}CN/5% de TEAA. El caudal fue 1 m/min
con detección UV a 260 nm. Se usó HPLC preparativa para purificar
los oligonucleótidos no modificados protegidos con DMT (elución a
27 min). Después de recoger y evaporar el tampón, se escindió el DMT
de los oligonucleótidos por tratamiento con ácido acético al 80%
durante 30 min a temperatura ambiente. La solución después se
evaporó casi a sequedad, se añadió agua, y se extrajo el DMT
escindido de la solución acuosa de oligonucleótido usando acetato de
etilo. La cantidad de oligonucleótidos se determinó por absorbancia
a 260 nm, y se evaluó la pureza final por HPLC en fase inversa
(tiempo de elución 14,5 min).
Se usó el mismo protocolo para la purificación
de los 3'-tiol-oligonucleótidos,
excepto en que se añadió DTT después de la extracción de DMT para
reducir la cantidad de disulfuro formado. Después de seis horas a
40ºC, se extrajo el DTT usando acetato de etilo, y se volvieron a
purificar los oligonucleótidos por HPLC (tiempo de elución 15
minutos).
Para la purificación de los oligonucleótidos
modificados con 5' tiol, se realizó HPLC preparativa en las mismas
condiciones que para los oligonucleótidos no modificados. Después de
la purificación, se retiró el grupo protector de tritilo añadiendo
150 \mul de una solución de AgNO_{3} 50 mM a la muestra de
oligonucleótido seca. La muestra se volvió de color blanco lechoso
cuando sucedió la escisión. Después de 20 minutos, se añadieron 200
\mul de una solución de 10 mg/ml de DTT para formar complejo con
Ag (tiempo de reacción de cinco minutos), y la muestra se
centrifugó para precipitar el complejo amarillo. La solución de
oligonucleótido (<50 OD) después se transfirió en la columna
NAP-5 de desalación (Pharmacia Biotech, Uppsala,
Suecia) para la purificación (contiene medio Sephadex
G-25 de Calidad ADN para desalar o intercambio de
tampón de oligonucleótidos de más de 10 bases). La cantidad de
oligonucleótido modificado con 5' tiol se determinó por
espectroscopía UV-vis midiendo la magnitud de la
absorbancia a 260 nm. La pureza final se evaluó realizando HPLC de
intercambio iónico con una columna Dionex Nucleopac
PA-100 (4 x 250) usando una solución de NaOH 10 mM
(pH 12) con un gradiente al 2%/min de NaOH 10 mM, solución de NaCl
1 M. Típicamente, se produjeron dos picos con tiempos de elución de
aproximadamente 19 minutos y 25 minutos (los tiempos de elución
dependen de la longitud de la cadena oligonucleotídica). Estos
picos corresponden a los oligonucleótidos tiol y disulfuro
respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se mezcló una solución acuosa de coloides de Au
17 nM (150 \mul), preparados como se ha descrito en la parte A
anterior, con 3'-tiol-TTTGCTGA 3,75
\muM (46 \mul), preparado como se ha descrito en la parte B y se
dejó reposar durante 24 h a temperatura ambiente en viales con
tapón Eppendorf de 1 ml. Se hizo reaccionar una segunda solución de
coloides con 3'-tiol-TACCGTTG 3,74
\muM (46 \mul). Obsérvese que estos oligonucleótidos son no
complementarios. Poco antes de su uso, se combinaron cantidades
iguales de cada una de las dos soluciones de nanopartículas. Como
los oligonucleótidos son no complementarios, no tuvo lugar la
reacción.
Las nanopartículas modificadas con
oligonucleótidos son estables a elevadas temperaturas (80ºC) y
elevadas concentraciones salinas (NaCl 1 M) durante días y no se ha
observado que experimenten crecimiento de partículas. La
estabilidad en las elevadas concentraciones salinas es importante,
ya que dichas condiciones son necesarias para las reacciones de
hibridación que forman la base de los métodos de detección y
nanofabricación de la invención.
Se sintetizaron dos oligonucleótidos (no
tiolados) como se ha descrito en la parte B del Ejemplo 1. Tenían
las siguientes secuencias:
3' ATATGCGCGA TCTCAGCAAA | [SEC ID Nº 1]; y |
3' GATCGCGCAT ATCAACGGTA | [SEC ID Nº 2]. |
La mezcla de estos dos oligonucleótidos en una
solución tamponada con fosfato 10 mM, de NaCl 1 M (pH 7,0), produjo
hibridación para formar un dúplex que tenía un saliente de 12 pares
de bases y dos extremos adhesivos de 8 pares de bases. Cada uno de
los extremos adhesivos tenía una secuencia que era complementaria a
la de uno de los oligonucleótidos unido a los coloides de Au
preparados en la parte C del Ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos de enlace preparados en la
parte A de este ejemplo (concentración final de 0,17 \muM después
de dilución con NaCl) se añadieron a los conjugados
nanopartícula-oligonucleótido preparados en la
parte C del Ejemplo 1 (concentración final 5,1 nM después de
dilución con NaCl) a temperatura ambiente. La solución después se
diluyó con NaCl acuoso (a una concentración final de 1 M) y se
tamponó a pH 7 con fosfato 10 mM, condiciones que son adecuadas
para la hibridación de los oligonucleótidos. Se observó un cambio de
color inmediato de rojo a púrpura, y se produjo una reacción de
precipitación. Véase la Figura 6. Después del transcurso de varias
horas, la solución llegó a ser transparente y se sedimentó un
precipitado gris rosáceo en la parte inferior del recipiente del
vaso de reacción. Véase la Figura 6.
Para verificar que este proceso implicaba tanto
los oligonucleótidos como los coloides, el precipitado se recogió y
resuspendió (agitando) en NaCl acuoso 1 M tamponado a pH 7.
Cualquiera de los oligonucleótidos no hibridados con las
nanopartículas se retiró de este modo. Después, se realizó un
experimento de disociación por temperatura/tiempo controlando la
absorbancia característica para los oligodesoxinucleótidos
hibridados (260 nm) y para los coloides agregados que reflejan la
distancia entre partículas de oro (700 nm). Véase la Figura 7. Se
registraron cambios en la absorbancia a 260 y 700 nm en un
Espectrofotómetro Perkin-Elmer Lambda 2
UV-vis usando un Peltier PTP-1
Temperature Controlled Cell Holder ciclando la temperatura a un
índice de 1ºC /minuto entre 0ºC y 80ºC. Las soluciones de ADN eran
de aproximadamente 1 unidad de absorbancia (OD), tamponadas a pH 7
usando tampón fosfato 10 mM y una concentración de NaCl 1 M.
Los resultados se muestran en la Figura 8A. Como
la temperatura se cicló entre 0ºC y 80ºC (que está 38ºC por encima
de la temperatura de disociación (T_{m}) para el dúplex (T_{m} =
42ºC)), hubo una excelente correlación entre las señales ópticas
tanto para los coloides como para los oligonucleótidos. El espectro
UV-vis para coloides de Au desnudos fue mucho menos
dependiente de la temperatura, Figura 8B.
Hubo un cambio óptico visible sustancial cuando
se calentó el precipitado oligonucleótido
polimérico-coloide por encima de su punto de
fusión. Esta solución transparente se volvió rojo oscuro según se
deshibridó el biomaterial polimérico para generar los coloides no
unidos que son solubles en la solución acuosa. El proceso fue
reversible, como se evidencia por los rastreos de temperatura en la
Figura 8A.
En un experimento de control, se demostró que un
dúplex 14-T:14-A era ineficaz para
inducir una agregación reversible de las partículas coloides de Au.
En otro experimento de control, se descubrió que un dúplex
oligonucleotídico de enlace con cuatro desapareamientos de pares de
bases en los extremos adhesivos no inducía agregación de partículas
reversible de nanopartículas modificadas con oligonucleótido
(preparadas como se describe en la parte C del Ejemplo 1 y que
reaccionaron como se ha descrito anteriormente). En un tercer
experimento de control, oligonucleótidos no tiolados que tienen
secuencias complementarias a los extremos adhesivos del
oligonucleótido de enlace y que reaccionaron con nanopartículas no
produjeron agregación reversible cuando se combinaron las
nanopartículas con el oligonucleótido de enlace.
Se obtienen evidencias adicionales del proceso
de polimerización/ensamblaje de estudios de Microscopía Electrónica
de Transmisión (TEM) del precipitado. Se realizó TEM en un
Microscopio Electrónico de Transmisión Hitachi 8100. Se preparó una
muestra típica echando gota a gota 100 \mul de solución de coloide
en una rejilla de carbono con agujeros. La rejilla, después, se
secó al vacío y se formaron imágenes de ella. Las imágenes TEM de
coloides de Au unidos por oligonucleótidos hibridados mostraron
grandes redes ensambladas de los coloides de Au, Figura 9. Los
coloides de Au desnudos no se agregan en condiciones comparables
sino que se dispersan o experimentan reacciones de crecimiento de
partículas. Hayat, Colloidal Gold: Principles, Methods, and
Applications (Academic Press, San Diego, 1991). Obsérvese que no
hay evidencias de crecimiento de las partículas coloidales en los
experimentos realizados hasta la fecha; los coloides hibridados
parecen ser remarcadamente regulares en el tamaño con un diámetro
medio de 13 nm.
Con TEM, se obtiene una superposición de capas,
haciendo difícil evaluar el grado de orden para los agregados
tridimensionales. Sin embargo, imágenes a escala más pequeña de
agregados una única capa, bidimensionales proporcionaron más
evidencias del proceso de auto-ensamblaje, Figura
9B. Pueden observarse ensamblajes compactados estrechamente de los
agregados con separaciones de partículas uniformes de
aproximadamente 60 \ring{A}. Esta distancia es algo más corta que
el espaciado estimado de 95 \ring{A} esperado para coloides
conectados por híbridos oligonucleotídicos rígidos con las
secuencias que se usaron. Sin embargo, a causa de las mellas del
dúplex obtenido después de hibridación de los oligonucleótidos en
las nanopartículas con los oligonucleótidos de enlace, estos no
eran híbridos rígidos y eran bastante flexibles. Debe observarse que
esto es una variable que puede controlarse reduciendo el sistema de
cuadro cadenas sobresalientes a tres (reduciendo de este modo la
cantidad de mellas) o usando triples cadenas en lugar de dúplex.
Se prepararon coloides de oro (diámetro de 13
nm) como se ha descrito en el Ejemplo 1. También se prepararon
tiol-oligonucleótidos
[HS(CH_{2})_{6}OP
(O)(O^{-})-oligonucleótido] como se ha descrito en
el Ejemplo 1.
Se descubrió que el método para unir
tiol-oligonucleótidos a nanopartículas de oro
descrito en el Ejemplo 1 no producía resultados satisfactorios en
algunos casos. En particular, cuando se usaban oligonucleótidos
largos, los conjugados oligonucleótido-coloide no
eran estables en presencia de un gran exceso de ADN de esperma de
salmón de elevado peso molecular usado como modelo para el ADN de
fondo que normalmente estaría presente en un sistema de
diagnóstico. La mayor exposición de los coloides a los
tiol-oligonucleótidos produjo conjugados
oligonucleótido-coloide que eran estables para el
ADN de esperma de salmón, pero los conjugados resultantes no
lograron hibridar satisfactoriamente. La experimentación adicional
condujo al siguiente procedimiento para unir
tiol-oligonucleótidos de cualquier longitud a
coloides de oro de modo que los conjugados fueran estables para un
ADN de elevado peso molecular e hibridaran satisfactoriamente.
Se mezcló 1 ml de solución de los coloides de
oro (17 nm) en agua con exceso de
tiol-oligonucleótido (de 28 bases de longitud)
(3,68 \muM) en agua, y se dejó que la mezcla reposara durante
12-24 horas a temperatura ambiente. Después, se
premezclaron 100 \mul de un tampón de hidrogenofosfato sódico 0,1
M, pH 7,0, y 100 \mul de NaCl 1,0 M y se añadieron. Después de 10
minutos, se añadieron 10 \mul de NaN_{3} acuoso al 1%, y se
dejó que la mezcla reposara durante 40 horas adicionales. Esta etapa
"de envejecimiento" se diseñó para aumentar el cubrimiento de
la superficie por los tiol-oligonucleótidos y para
desplazar las bases de los oligonucleótidos de la superficie de
oro. Se obtuvieron manchas rojas mejor definidas, algo más limpias
en ensayos posteriores si la solución se congelaba en un baño de
hielo seco después de 40 horas de incubación y después se
descongelaba a temperatura ambiente. De cualquier modo, la solución
después se centrifugó a 14.000 rpm en una centrífuga Eppendorf 5414
durante aproximadamente 15 minutos para dar un sobrenadante rosa muy
pálido que contenía la mayoría del oligonucleótido (como se indica
por la absorbancia a 260 nm) junto con un 7-10% del
oro coloidal (como se indica por la absorbancia de 520 nm), y un
residuo gelatinoso, oscuro, compacto en la parte inferior del tubo.
Se retiró el sobrenadante, y se resuspendió el residuo en
aproximadamente 200 \mul de tampón (fosfato 10 mM, NaCl 0,1 M) y
se volvieron a centrifugar. Después de la retirada de la solución
sobrenadante, el residuo se captó en 1,0 ml de tampón (fosfato 10
mM, NaCl 0,1 M) y 10 \mul de una solución acuosa al 1% de
NaN_{3}. Se ayudó a la disolución introduciéndola y sacándola de
una pipeta varias veces. La solución maestra roja resultante era
estable (es decir, permanecía roja y no se agregaba) en reposo
durante meses a temperatura ambiente, al aplicarla puntualmente en
placas de cromatografía de capa fina (TLC) de sílice (véase el
Ejemplo 4), y al añadir la NaCl 2 M, MgCl_{2} 10 mM, o soluciones
que contienen elevadas concentraciones de ADN de esperma de
salmón.
Los conjugados de
oligonucleótido-coloide de oro I y II ilustrados en
la Figura 11 se prepararon como se ha descrito en el Ejemplo 3. La
hibridación de estos dos conjugados fue extremadamente lenta. En
particular, la mezcla de las muestras de conjugados I y II en NaCl
acuoso 0,1 M o en MgCl_{2} 10 mM más NaCl 0,1 M y permitiendo que
la mezcla repose a temperatura ambiente durante un día produjo poco
o ningún cambio de color.
Se descubrieron dos modos de mejorar la
hibridación. En primer lugar, se obtuvieron resultados más rápidos
congelando la mezcla de conjugados I y II (cada uno contenía 15 nM
en una solución de NaCl 0,1 M) en un baño de alcohol
isopropílico-hielo seco durante 5 minutos y después
descongelando la mezcla a temperatura ambiente. La solución
descongelada mostraba un color azulado. Cuando se aplicaba
puntualmente 1 \mul de la solución en una placa de sílice
C-18 TLC convencional (Alltech Associates), se
observó inmediatamente un color azul intenso. La hibridación y
posterior cambio de color causado por el procedimiento de
congelación-descongelación era reversible. Al
calentar la solución hibridada a 80ºC, la solución se volvía roja y
producía una mancha rosa en una placa de TLC. La posterior
congelación y descongelación volvió al sistema a un estado hibridado
(azul) (tanto la solución como la mancha en una placa
C-18 TLC). En un experimento similar en el que no se
volvió a congelar la solución, la mancha obtenida en la placa
C-18 TLC era rosa.
Un segundo modo para obtener resultados más
rápidos es calentar los conjugados y la diana. Por ejemplo, en otro
experimento, se calentaron los conjugados de
oligonucleótido-coloide de oro y una secuencia diana
oligonucleotídica en una solución de NaCl 0,1 M rápidamente a 65ºC
y se dejó enfriar a temperatura ambiente durante un período de 20
minutos. Al aplicarla puntualmente sobre la placa de sílice
C-18 y secarla, se obtuvo una mancha azul
indicativa de hibridación. En contraste, la incubación de los
conjugados y la diana a temperatura ambiente durante una hora en
solución de NaCl 0,1 M no produjo un color azul indicativo de
hibridación. La hibridación es más rápida en
NaCl 0,3 M.
NaCl 0,3 M.
Los conjugados
oligonucleótido-coloide de oro 1 y 2 ilustrados en
la Figura 12 se prepararon como se ha descrito en el Ejemplo 3, y
la diana oligonucleotídica 3 ilustrada en la Figura 12 se preparó
como se ha descrito en el Ejemplo 2. Se adquirieron dianas
desapareadas y de deleción 4, 5, 6 y 7 de Northwestern University
Biotechnology Facility, Chicago, IL. Estos oligonucleótidos se
sintetizaron a una escala de 40 nmol y se purificaron en un
cartucho C18 de fase inversa (OPC). Su pureza se determinó
realizando HPLC de intercambio iónico.
Se consiguió hibridación selectiva calentando
rápidamente y después enfriando rápidamente a la temperatura
rigurosa. Por ejemplo, se realizó hibridación en 100 \mul de NaCl
0,1 M más MgCl_{2} 5 mM que contenía 15 nM de cada conjugado
oligonucleótido-coloide 1 y 2, y 3 nanomoles del
oligonucleótido diana 3, 4, 5, 6, ó 7, calentando a 74ºC, enfriando
a las temperaturas indicadas en la siguiente Tabla 1, e incubando la
mezcla a esta temperatura durante 10 minutos. Después se aplicó
puntualmente una muestra de 3 \mul de cada mezcla de reacción
sobre una placa de sílice C-18 TLC. Al secarse (5
minutos), apareció color azul intenso si había tenido lugar la
hibridación.
Los resultados se presentan en la siguiente
Tabla 1. Las manchas rosas significan un ensayo negativo (es decir,
que las nanopartículas no se juntaron por hibridación), y las
manchas azules significan un ensayo positivo (es decir, que las
nanopartículas se pusieron en proximidad debido a la hibridación que
implica los conjugados oligonucleótido-coloide).
Como puede observarse en la Tabla 1, la
hibridación a 60ºC dio una mancha azul solamente para la diana 3
completamente apareada. La hibridación a 50ºC produjo manchas
azules con las dianas tanto 3 como 6. La hibridación a 45ºC dio
manchas azules con las dianas 3, 5 y 6.
En una serie relacionada, se descubrió una diana
que contenía un único nucleótido desapareado T que da un ensayo
positivo a 58ºC (color azul) y un ensayo negativo (color rojo) a
64ºC con conjugados 1 y 2. En las mismas condiciones, la diana
completamente apareada (3) dio un ensayo positivo a ambas
temperaturas, mostrando que el ensayo puede discriminar entre una
diana que está completamente apareada y una que contiene una única
base desapareada.
Se consiguieron resultados similares usando un
método de hibridación diferente. En particular, se consiguió
hibridación selectiva congelando, descongelando y después calentando
rápidamente a la temperatura rigurosa. Por ejemplo, se realizó
hibridación en 100 \mul de NaCl 0,1 M que contenía 15 nM de cada
conjugado oligonucleótido-coloide 1 y 2, y 10
picomoles de oligonucleótido diana 3, 4, 5, 6, ó 7, congelando en un
baño de alcohol isopropílico con hielo seco durante 5 minutos,
descongelando a temperatura ambiente, después calentando rápidamente
a las temperaturas indicadas en la siguiente Tabla 2, e incubando
la mezcla a esta temperatura durante 10 minutos. Después se aplicó
puntualmente una muestra de 3 \mul de cada mezcla de reacción en
una placa de sílice C-18 TLC. Los resultados se
presentan en la Tabla 2.
Una importante característica de estos sistemas
fue que el cambio de color asociado con el cambio de temperatura
fue muy brusco, sucediendo sobre un intervalo de temperatura de
aproximadamente 1ºC. Esto indica una elevada cooperatividad en los
procesos de fusión y asociación que implican los conjugados coloides
y posibilitan que se discrimine fácilmente entre dianas
oligonucleotídicas que contienen una secuencia completamente
apareada y un único desapareamiento de par de bases.
El elevado grado de discriminación puede
atribuirse a dos características. La primera es que la alineación
de dos segmentos oligonucleotídicos de sonda relativamente corta (15
nucleótidos) en la diana es necesaria para una señal positiva. Un
desapareamiento en cualquier segmento es más desestabilizante que un
desapareamiento en una sonda más larga (por ejemplo, un
oligonucleótido de 30 bases de longitud) en un sistema de detección
de dos componentes comparable. En segunda lugar, la señal a 260 nm,
obtenida en hibridación de los oligonucleótidos diana con los
conjugados de nanopartícula en solución, se basa en nanopartícula,
no en ADN. Depende de la disociación de un ensamblaje de
nanopartículas organizado en una red polimérica por múltiples dúplex
oligonucleotídicos. Esto provoca un estrechamiento del intervalo de
temperatura que se observa para la disociación del agregado, en
comparación con desnaturalización térmica de ADN convencional. En
resumen, algunos dúplex en los agregados reticulados pueden
disociarse sin dispersar las nanopartículas en solución. Por lo
tanto, el intervalo de temperatura para la fusión del agregado es
muy estrecha (4ºC) en comparación con el intervalo de temperatura
asociado con la fusión del sistema comparable sin nanopartículas
(12ºC). Incluso más llamativo y ventajoso para este enfoque de
detección es el intervalo de temperatura para la respuesta
colorimétrica (<1ºC) que se observa en las placas de sílice
C-18. En principio, esta estrategia basada en
nanopartícula de tres componentes será más selectiva que cualquier
sistema de detección de dos componentes basado en una sonda de una
única cadena que hibrida con el ácido nucleico diana.
Se preparó una solución maestra que contenía 1
nmol de diana 3 en 100 \mul de tampón de hibridación (NaCl 0,3 M,
fosfato 10 mM, pH 7). Un \mul de esta solución corresponde a 10
picomoles de oligonucleótido diana. Se realizaron diluciones en
serie tomando una alícuota de la solución maestra y diluyéndola a la
concentración deseada con tampón de hibridación. La Tabla 3 muestra
la sensibilidad obtenida usando 3 \mul de una mezcla de sondas 1
y 2 con diferentes cantidades de diana 3. Después de realizar la
hibridación usando condiciones de
congelación-descongelación, se aplicaron
puntualmente alícuotas de 3 \mul de estas soluciones en placas
TLC C-18 para determinar el color. En la siguiente
Tabla 3, rosa significa un ensayo negativo, y azul significa un
ensayo positivo.
Este experimento indica que 10 femtomoles es el
límite inferior de detección para este sistema particular.
Se adsorbieron nanopartículas modificadas con
ADN en sustratos transparentes modificados como se muestra en la
Figura 13B, paneles 1-6. Este método implicaba la
unión de nanopartículas modificadas con ADN a nanopartículas que se
unieron a un sustrato de vidrio, usando interacciones de hibridación
de ADN.
Se adquirieron portaobjetos de microscopio de
vidrio de Fisher. Los portaobjetos se cortaron en trozos de
aproximadamente 5 x 15 mm, usando un lápiz de grabado con punta de
diamante. Los portaobjetos se limpiaron impregnándolos durante 20
minutos en una solución de H_{2}SO_{4}:H_{2}O_{2} 4:1 a
50ºC. Después se aclararon los portaobjetos con cantidades
abundantes de agua, después etanol, y se secaron en un chorro de
nitrógeno seco. Para funcionalizar la superficie del portaobjetos
con un silano terminado en tiol, los portaobjetos se impregnaron en
una solución etanólica de mercaptopropiltrimetoxisilano al 1% (en
volumen) desgasificada durante 12 horas. Los portaobjetos se
retiraron de las soluciones de etanol y se aclararon con etanol,
después con agua. Las nanopartículas se adsorbieron en la
superficie terminada en tiol de los portaobjetos impregnando en
soluciones que contenían las nanopartículas de oro de 13 nanómetros
de diámetro (preparación descrita en el Ejemplo 1). Después de 12
horas en las soluciones coloidales, se retiraron los portaobjetos y
se aclararon con agua. Los portaobjetos resultantes tienen un
aspecto rosa debido a las nanopartículas adsorbidas y muestran
perfiles de absorbancia UV-vis similares (pico de
absorbancia en plasmón superficial a 520 nm) a las soluciones
coloidales acuosas de nanopartículas de oro. Véase la Figura
14A.
Se unió el ADN a la superficie modificada de las
nanopartículas impregnando los portaobjetos de vidrio en solución
0,2 OD (1,7 \muM) que contenía oligonucleótido 3' tiol recién
purificado (3' tiol ATGCTCAACTCT [SEC ID Nº 33]) (sintetizado como
se ha descrito en los Ejemplos 1 y 3). Después de 12 horas de tiempo
de impregnado, los portaobjetos se retiraron y se aclararon con
agua.
Para demostrar la capacidad de una cadena de ADN
analito de unir nanopartículas al sustrato modificado, se preparó
un oligonucleótido de enlace. El oligonucleótido de enlace
(preparado como se describe en el Ejemplo 2) era de 24 pb de
longitud (5'TACGAGTTGAGAATCCTGAATGCG [SEC ID Nº 34]) con una
secuencia que contenía un extremo de 12 pb que era complementario
al ADN ya adsorbido en la superficie del sustrato (SEC ID Nº 33).
El sustrato después se impregnó en un tampón de hibridación (NaCl
0,5 M, tampón fosfato 10 mM pH 7) que contenía el oligonucleótido
de enlace (0,4 OD, 1,7 \muM) durante 12 horas. Después de la
retirada y aclarar con tampón similar, el sustrato se impregnó en
una solución que contenía nanopartículas de oro de 13 nm de diámetro
que se habían modificado con un oligonucleótido (TAGGACTTACGC 5'
tiol [SEC ID Nº 35]) (preparado como se ha descrito en el Ejemplo
3) que es complementario a la parte no hibridada del oligonucleótido
de enlace unido al sustrato. Después de 12 horas de impregnación,
el sustrato se retiró y aclaró con el tampón de hibridación. El
color del sustrato se había oscurecido a un color púrpura y la
absorbancia UV-vis a 520 nm aproximadamente se dobló
(Figura 14A).
Para verificar que las nanopartículas de oro
modificadas con oligonucleótidos se unían a la superficie modificada
del oligonucleótido/nanopartícula a través de interacciones de
hibridación de ADN con el oligonucleótido de enlace, se realizó una
curva de fusión. Para el experimento de fusión, se colocó el
sustrato en una cubeta que contenía 1 ml de tampón de hibridación y
se usó el mismo aparato usado en el Ejemplo 2, parte B. La señal de
absorbancia debida a las nanopartículas (520 nm) se controló según
aumentaba la temperatura del sustrato a un índice de 0,5ºC por
minuto. La señal de la nanopartícula disminuyó drásticamente cuando
la temperatura pasó los 60ºC. Véase la Figura 14B. Una primera
derivada de la señal mostró una temperatura de fusión de 62ºC, que
corresponde con la temperatura observada en las tres secuencias de
ADN hibridadas en solución sin nanopartículas. Véase la Figura
14B.
El sistema de detección ilustrado en la Figura
15 se diseño de modo que dos sondas 1 y 2 se alinearan de un modo
cola-con-cola en una diana
complementaria 4 (véase la Figura 15). Esto difiere del sistema
descrito en el Ejemplo 5 donde las dos sondas se alinean de forma
contigua en la cadena diana (véase la Figura 12).
Los conjugados 1 y 2
oligonucleótido-nanopartícula de oro ilustrados en
la Figura 15 se prepararon como se ha descrito en el Ejemplo 3,
excepto en que las nanopartículas se volvieron a dispersar en tampón
de hibridación (NaCl 0,3 M, fosfato 10 mM, pH 7). La concentración
final de conjugado nanopartícula-oligonucleótido se
estimó a 13 nM midiendo la reducción en la intensidad de la banda
de plasmón superficial a 522 nm que da lugar al color rojo de las
nanopartículas. Las dianas oligonucleotídicas ilustradas en la
Figura 15 se adquirieron del Northwestern University Biotechnology
Facility, Evanston, IL.
Cuando se mezclaron 150 \mul de tampón de
hibridación que contenía los conjugados 1 y 2
oligonucleótido-nanopartícula 13 nM con 60
picomoles (6 \mul) de diana 4, el color de la solución cambia
inmediatamente de rojo a púrpura. Este cambio de color sucede como
resultado de la formación de grandes redes poliméricas unidas al
oligonucleótidos de nanopartículas de oro, que conduce a un cambio
rojo en la resonancia de plasmón superficial de las nanopartículas.
Cuando la solución se dejó reposar durante 2 horas, se observó
precipitación de grandes agregados macroscópicos. Se realizó un
"análisis de fusión" de la solución con los agregados
suspendidos. Para realizar el "análisis de fusión", la
solución se diluyó a 1 ml con tampón de hibridación, y se registró
la señal óptica de los agregados a 260 nm a intervalos de un minuto
según se aumentaba la temperatura de 25ºC a 75ºC, con un tiempo de
mantenimiento de 1 minuto/grado. Coherente con la caracterización
del agregado como polímero de
oligonucleótido-nanopartícula, se observó una
transición brusca característica (anchura completa a la mitad del
máximo, FW_{1/2} de la primera derivada = 3,5ºC) con una
"temperatura de fusión" (T_{m}) de 53,5ºC. Esto se compara
bien con la T_{m} asociada con la transición más ancha observada
para oligonucleótidos sin nanopartículas (T_{m} = 54ºC,
FW_{1/2} = \sim13,5ºC). El "análisis de fusión" de la
solución de oligonucleótido sin nanopartículas se realizó en
condiciones similares que el análisis con nanopartículas, excepto en
que la temperatura se aumentó de 10-80ºC. Además,
la solución era de 1,04 \muM en cada componente de
oligonucleotídico.
Para ensayar la selectividad del sistema, la
T_{m} para el agregado formado a partir del complemento perfecto
4 de las sondas 1 y 2 se comparó con las T_{m} para agregados
formados a partir de dianas que contenían desapareamientos de una
base, deleciones o inserciones (Figura 15).
Significativamente, todos los agregados de
nanopartícula de oro-oligonucleótido que contenían
dianas imperfectas mostraban una desestabilización significativa,
medible cuando se comparaba con los agregados formados a partir de
complemento perfecto, como es evidente por los valores de T_{m}
para los diversos agregados (véase Figura 15). Las soluciones que
contienen las dianas imperfectas podrían distinguirse fácilmente de
la solución que contiene el complemento perfecto por su color
cuando se coloca en un baño de agua mantenido a 52,5ºC. Esta
temperatura está por encima de la T_{m} de los polinucleótidos
desapareados, de modo que solamente la solución con la diana
perfecta mostraba un color púrpura a esta temperatura. También se
realizó un "análisis de fusión" en la solución de sonda que
contenía la diana complementaria a la mitad. Se observó solamente un
aumento de un minuto en la absorbancia
260 nm.
260 nm.
A continuación, se añadieron 2 \mul (20
picomoles) de cada una de las dianas oligonucleotídicas (Figura 15)
a una solución que contenía 50 \mul de cada sonda (13 nM) en
tampón de hibridación. Después de reposar durante 15 minutos a
temperatura ambiente, las soluciones se transfirieron a un baño de
agua de temperatura controlada y se incubaron a las temperaturas
indicadas en la siguiente Tabla 4 durante cinco minutos. Después se
aplicó puntualmente una muestra de 3 \mul de cada mezcla de
reacción en una placa de sílice C-18. Se realizaron
dos experimentos de control para demostrar que la alineación de
ambas sondas en la diana es necesaria para desencadenar la
agregación y, por lo tanto, un cambio de color. El primer
experimento de control constaba de ambas sondas 1 y 2 sin diana
presente. El segundo experimento de control constaba de ambas sondas
1 y 2 con una diana 3 que es complementaria solamente a una de las
secuencias de sonda (Figura 15). Los resultados se presentan en la
siguiente Tabla 4. Las manchas rosas significan un ensayo negativo,
y las manchas azules significan un ensayo positivo.
Notablemente, la transición colorimétrica que
puede detectarse a simple vista sucede sobre menos de 1ºC,
permitiendo de este modo distinguir fácilmente la diana perfecta 4
de las dianas con desapareamientos (5 y 6), una deleción en el
extremo (7), una inserción de una base en el punto de la diana donde
coinciden las dos sondas oligonucleotídicas (8) (véase la Tabla 4).
Obsérvese que la T_{c} de transición colorimétrica está cercana en
temperatura, pero no idéntica, a la T_{m}. En ambos controles, no
hubo signos de agregación de partículas o inestabilidad en las
soluciones, como es evidente por el color rojo rosáceo que se
observó a todas las temperaturas, y mostraron manchas negativas
(rosas) en el ensayo de placa a todas las temperaturas (Tabla
4).
La observación de que la diana se inserción de
una base 8 puede diferenciarse de la diana completamente
complementaria 4 es verdaderamente remarcable dada la
complementariedad completa de la cadena de inserción con las dos
secuencias de sonda. La desestabilización del agregado formado a
partir de 8 y las sondas de nanopartícula parece deberse al uso de
dos sondas cortas y a la pérdida de adhesión de bases entre las dos
bases de timidina donde la cola de la sonda coincide cuando hibrida
con la diana completamente complementaria. Se observó un efecto
similar cuando se hibridó una diana que contiene una inserción de
tres pares de bases (CCC) a las sondas en condiciones comparables
(T_{m} = 51ºC). En el sistema descrito anteriormente en el Ejemplo
5, las dianas con inserciones de pases no podían distinguirse de la
diana completamente complementaria. Por lo tanto, el sistema
descrito en este ejemplo es muy favorable en términos de
selectividad. Este sistema también mostró la misma sensibilidad que
el sistema descrito en el Ejemplo 5, que es aproximadamente 10
femtomoles sin técnicas de amplificación.
Los resultados indican que cualquier
desapareamiento de una base a lo largo de la cadena diana puede
detectarse, junto con cualquier inserción en la cadena diana. Es
importante observar que el intervalo de temperatura sobre el que
puede detectarse un cambio de color es extremadamente brusco, y el
cambio sucede sobre un intervalo de temperatura muy estrecho. Esta
transición brusca indica que hay un gran grado de cooperatividad en
el proceso de fusión que implica la gran red de coloides que se
unen por las cadenas de oligonucleótido diana. Esto conduce la
remarcable selectividad que se muestra por los datos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un conjunto de experimentos que
implican la hibridación con oligonucleótidos dúplex "de
relleno". Los conjugados 1 y 2
nanopartícula-oligonucleótido ilustrados en la
Figura 16 se incubaron con dianas de diferentes longitudes (24, 48
y 72 bases de longitud) y oligonucleótidos de relleno
complementarios, como se ilustra en la Figura 16. Para todo lo
demás, las condiciones fueron como se han descrito en el Ejemplo 7.
Además, los oligonucleótidos y conjugados
nanopartícula-oligonucleótidos se prepararon como se
ha descrito en el Ejemplo 7.
Como se esperaba, las diferentes
soluciones de reacción tenían propiedades ópticas
marcadamente diferentes después de la hibridación debido a las
propiedades ópticas dependientes de la distancia de las
nanopartículas de oro. Véase la siguiente Tabla 5. Sin embargo,
cuando estas soluciones se aplicaron puntualmente sobre una placa
C-18 TLC, se desarrolló un color azul después de
secar a temperatura ambiente u 80ºC, independientemente de la
longitud del oligonucleótido diana y la distancia entre los
nanopartículas de oro. Véase la Tabla 5. Esto sucede probablemente
porque el soporte sólido potencia la agregación de los conjugados
oligonucleótido-nanopartícula hibridados. Esto
demuestra que aplicando puntualmente soluciones en la placa TLC, la
distancia entre las nanopartículas de oro puede ser sustancial (al
menos 72 bases), y la detección colorimétrica aún es posible.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los cambios de color observados en este y otros
ejemplos sucede cuando la distancia entre las nanopartículas de oro
(la distancia entre partículas) es aproximadamente igual o menor que
el diámetro de la nanopartícula. Por tanto, el tamaño de las
nanopartículas, el tamaño de los oligonucleótidos unidos a las
mismas, y el espaciado de las nanopartículas cuando están
hibridadas al ácido nucleico diana afectan al cambio de color que se
observará cuando los conjugados
oligonucleótido-nanopartícula hibridan con las
dianas de ácido nucleico para formar agregados. Por ejemplo, las
nanopartículas de oro con diámetros de 13 nm producirán un cambio de
color cuando se agregan usando oligonucleótidos unidos a las
nanopartículas diseñadas para hibridar con secuencias diana de
10-35 nucleótidos de longitud. El espaciado de la
nanopartículas cuando están hibridadas con el ácido nucleico diana
adecuado para dar un cambio de color variará con el grado de
agregación, como demuestran los resultados. Los resultados también
indican que la superficie sólida potencia la agregación adicional de
muestras ya agregadas, poniendo las nanopartículas de oro
cercanamente juntas.
El cambio de color observado con las
nanopartículas de oro se puede atribuir a un cambio y ensanchamiento
de la resonancia de plasmón superficial del oro. Este cambio de
color es poco probable para nanopartículas de oro de menos de
aproximadamente 4 nm de diámetro porque las longitudes de los
oligonucleótidos necesarias para la detección específica de ácido
nucleico excederían el diámetro de la nanopartícula.
\vskip1.000000\baselineskip
Se combinaron cinco microlitros de cada sonda 1
y 2 (Figura 12) a una concentración final de NaCl 0,1 M con tampón
(fosfato 10 mM, pH 7), y se añadió 1 microlito de orina humana a la
solución. Cuando esta solución se congeló, descongeló y después se
aplicó puntualmente en una placa TLC C-18, no se
desarrolló un color azul. A una solución similar que contenía 12,5
microlitros de cada sonda y 2,5 microlitros de orina humana, se
añadieron 0,25 microlitos (10 picomoles) de diana 3 (Figura 12). La
solución se congeló, descongeló y después se aplicó puntualmente en
una placa TLC C-18 y se obtuvo una mancha azul.
Se realizaron experimentos similares en
presencia de saliva humana. Se calentó una solución que contenía
12,5 microlitros de cada sonda 1 y 2 y 0,25 microlitros de diana 3
a 70ºC. Después de enfriar a temperatura ambiente, se añadieron 2,5
microlitros de una solución de saliva (saliva humana diluida 1:10
con agua). Después de que la solución resultante se congelara,
descongelara y se aplicara puntualmente en una placa TLC
C-18, se obtuvo una mancha azul, que indica
hibridación de las sondas con la diana. En experimentos de control
sin diana añadida, no se observaron manchas azules.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizó un ensayo como se ilustra en la
Figura 13A. Primero, se cortaron portaobjetos de vidrio de
microscopio, adquiridos de Fisher, en trozos de aproximadamente 5 x
15 mm, usando un lápiz de grabado con punta de diamante. Los
portaobjetos se limpiaron impregnándolos durante 20 minutos en una
solución de H_{2}SO_{4}:H_{2}O_{2} 4:1 a 50ºC. Después se
aclararon los portaobjetos con cantidades abundantes de agua,
después etanol, y se secaron en un chorro de nitrógeno seco. El ADN
modificado con tiol se adsorbió en los portaobjetos usando un
procedimiento modificado presentado en la bibliografía (Chrisey
et al., Nucleic Acids Res., 24,
3031-3039 (1996) y Chrisey et al., Nucleic Acids
Res., 24, 3040-3047 (1996)). Primero, los
portaobjetos se impregnaron en una solución al 1% de
trimetoxisililpropildietiltriamina (DETA, adquirida de United
Chemical Technologies, Bristol, PA) en ácido acético 1 mM en agua
Nanopura durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos
se aclararon con agua, después etanol. Después de secar con un
chorro de nitrógeno seco, los portaobjetos se cocieron a 120ºC
durante 5 minutos usando un bloque de calentamiento de temperatura
controlada. Los portaobjetos se dejaron enfriar, después se
impregnaron en una solución 1 mM de
4-(maleimidofenil)-butirato de succinimidilo (SMPB,
adquirido de Sigma Chemicals) en metanol:dimetilsulfóxido 80:20
durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de retirar la
solución de SMPB y aclarar con etanol, los sitios amina que no se
habían acoplado al reticulante SMPB se terminaron del siguiente
modo. Primero, los portaobjetos se impregnaron durante 5 minutos en
una solución de THF:piridina 8:1 que contenía
1-metil imidazol al 10%. Después los portaobjetos se
impregnaron en solución de THF:anhídrido acético 9:1 durante cinco
minutos. Estas soluciones de terminado se adquirieron de Glen
Research, Sterling, VA. Los portaobjetos se aclararon con THF,
después etanol, y finalmente agua.
El ADN se unión a las superficies impregnando
los portaobjetos de vidrio modificados en una solución 0,2 OD (1,7
\muM) que contenía oligonucleótido recién purificado (3' tiol
ATGCTCAACTCT [SEC ID Nº 33]). Después de 12 horas de tiempo de
impregnación, los portaobjetos se retiraron y se aclararon con
agua.
Para demostrar la capacidad de una cadena de ADN
analito de unir nanopartículas al sustrato modificado, se preparó
un oligonucleótido de enlace. El oligonucleótido de enlace era de 24
pb de longitud (5'TACGAGTTGA GAATCCTGAATGCG [SEC ID Nº: 34]) con
una secuencia que contenía un extremo de 12 pb que era
complementario al ADN ya adsorbido en la superficie del sustrato.
El sustrato después se impregnó en una solución de tampón de
hibridación (NaCl 0,5 M, tampón fosfato 10 mM pH 7) que contenía el
oligonucleótido de unión (0,4 OD, 1,7 \muM) durante 12 horas.
Después de retirar y aclarar con tampón similar, se impregnó el
sustrato en una solución que contenía nanopartículas de oro de 13
nm de diámetro que se habían modificado con un oligonucleótido
(TAGGACTTACGC 5' tiol [SEC ID Nº 35]) que es complementario a la
parte no hibridada del oligonucleótido de enlace unido al sustrato.
Después de 12 horas de impregnación, se retiró el sustrato y se
aclaró con el tampón de hibridación. El color del sustrato de
vidrio había cambiado de transparente e incoloro a un color rosa
transparente. Véase la Figura 19A.
Se añadieron capas adicionales de nanopartículas
a los portaobjetos impregnando los portaobjetos en una solución del
oligonucleótido de enlace como se ha descrito anteriormente y
después impregnando en una solución que contenía nanopartículas de
oro de 13 nanómetros que tenían oligonucleótidos (3' tiol
ATGCTCAACTCT [SEC ID Nº 33]) unidos a las mismas. Después de
impregnar durante 12 horas, los portaobjetos se retiraron de la
solución de nanopartículas y se aclararon e impregnaron en tampón
de hibridación como se ha descrito anteriormente. El color del
portaobjetos había llegado a ser notablemente más rojo. Véase la
Figura 19A. Se añadió una capa final de nanopartículas repitiendo
los procedimientos de impregnación de oligonucleótido de enlace y
nanopartículas usando nanopartículas de oro de 13 nanómetros que se
habían modificado con un oligonucleótido (TAGGACTTACGC 5' tiol [SEC
ID Nº: 35]) como la capa final de nanopartículas. De nuevo, el color
se oscureció, y aumentó la absorbancia UV-vis a 520
nm. Véase la Figura 19A.
Para verificar que las nanopartículas de oro
modificadas con oligonucleótidos se habían unido a la superficie
modificada con oligonucleótido a través de interacciones de
hibridación de ADN con el oligonucleótido de enlace, se realiza una
curva de fusión. Para el experimento de fusión, se colocó un
portaobjetos en una cubeta que contenía 1,5 ml de tampón de
hibridación, y se usó un aparato similar al usado en el Ejemplo 2,
parte B. La señal de absorbancia debida a las nanopartículas (520
nm) se controló a cada grado según se aumentaba la temperatura del
sustrato de 20ºC a 80ºC, con un tiempo de mantenimiento de 1 minuto
a cada grado íntegro. La señal de las nanopartículas disminuyó
drásticamente cuando la temperatura pasaba de 52ºC. Véase la Figura
19B. Una primera derivada de la señal mostró una temperatura de
fusión de 55ºC, que corresponde con la temperatura observada para
los conjugados oligonucleótido-nanopartícula y los
oligonucleótidos de enlace hibridados en solución. Véase la Figura
19B.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: MIRKIN, CHAD A.
\vskip0.500000\baselineskip
- LETSINGER, ROBERT L.
\vskip0.500000\baselineskip
- MUCIC, ROBERT C.
\vskip0.500000\baselineskip
- STORHOFF, JAMES J.
\vskip0.500000\baselineskip
- ELGHANIAN, ROBERT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NANOPARTÍCULAS QUE TIENEN OLIGONUCLEÓTIDOS UNIDOS A LAS MISMAS Y USOS DE LAS MISMAS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 35
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: SHERIDAN ROSS P.C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1700 LINCOLN STREET, SUITE 3500
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: DENVER
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: COLORADO
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: U.S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 08203
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: CROOK, WANNELL M.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 31.071
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 3501-14-PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (303) 863-9700
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (303) 863-0223
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /des= "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAACGACTCT AGCGCGTATA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGGCAACTA TACGCGCTAG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTTGAGATT TCCCTC
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGGGAAATC TCAAGG
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACTTGCGCT AATGGCGA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGTTGCGCT TTACGGCTAA TGGCGA
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTCCTTCCC TTTTC
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /Desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAAAGGGAA GGAGA
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTTTTCCCTT CCTCT
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAACGACTCT AGCGCGTATA GTTGCCAT
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGGCAACTA TACGCGCTAG AGTCGTTT
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /Desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCTATCGACC ATGCT
\hfill15
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCATGGTCG ATAGGAAACG ACTCTAGCGC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCTAGAGT CGTTT
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCATGGTCG ATAGGATGGC AACTATACGC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGATAGGA AACGACTCTA GCGC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCATGGTTG ATAGGAAACG ACTCTAGCGC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCATGTTTG ATAGGAAACG ACTCTAGCGC
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTCAACTCG TA
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCATTCAGG AT
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: desc/ = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACGAGTTGA GAGAGTGCCC ACAT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACGAGTTGA GAATCCTGAA TGCG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACGAGTTGA GAATCCTGAA TGCT
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACGAGTTGA GACTCCTGAA TGCG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACGAGTTGA GAATCCTGAA TGC
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACGAGTTGA GACATCCTGA ATGCG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACGAGTTGA GAATCCTGAA TGCG
\hfill24
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCATTCAGG AT
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACGAGTTGA GACCGTTAAG ACGAGGCAAT CATGCAATCC TGAATGCG
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGCATGATTG CCTCGTCTTA ACGG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 72 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTGTCCCGTA AAGCGTCCAA TATATGCATG ATTGCCTCGT CTTAACGG
\hfill48
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCTCAACTCG TA
\hfill12
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTACGAGTTGA GAATCCTGAA TGCG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 12 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "hipotética"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCATTCAGG AT
\hfill12
Claims (16)
1. Un método para detectar una diana de ácido
nucleico que tiene al menos dos partes, que comprende:
proporcionar uno o más tipos de nanopartículas
de oro que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas, teniendo los
oligonucleótidos una secuencia complementaria a las secuencias dos o
más partes de la diana de ácido nucleico, y teniendo las
nanopartículas un tamaño de 5 a 150 nm;
poner en contacto la diana de ácido nucleico y
la nanopartículas en condiciones eficaces para permitir la
hibridación de los oligonucleótidos en las nanopartículas con la
diana de ácido nucleico; y
observar un cambio de color detectable provocado
por la interacción entre las nanopartículas que se están poniendo en
proximidad por hibridación de los oligonucleótidos en las
nanopartículas con la diana de ácido nucleico.
2. El método de la reivindicación 1 que
comprende:
proporcionar al menos dos tipos de
nanopartículas que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas,
teniendo los oligonucleótidos en el primer de tipo de nanopartículas
una secuencia complementaria a una primera parte de la secuencia de
la diana de ácido nucleico, teniendo los oligonucleótidos en el
segundo tipo de nanopartículas una secuencia complementaria a una
segunda parte de la secuencia de la diana de ácido nucleico.
3. El método de la reivindicación 1 que
comprende:
proporcionar al menos un tipo de nanopartículas
que tienen oligonucleótidos unidos a las mismas, teniendo los
oligonucleótidos secuencias que son complementarias a diferentes
partes de la diana de ácido nucleico.
4. El método de la reivindicación 2, en el que
las condiciones de contacto incluyen congelar y descongelar, o en el
que las condiciones de contacto incluyen calentar.
5. El método de la reivindicación 2, en el que
el cambio detectable se observa en una superficie sólida.
6. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 2 ó 5, en el que cambio detectable es un cambio de
color observable a simple vista.
7. El método de la reivindicación 2, en el
que:
la diana de ácido nucleico tiene una tercera
parte localiza entre la primera y segunda partes, y las secuencias
de los oligonucleótidos en las nanopartículas no incluyen secuencias
complementarias a esta tercera parte de la diana de ácido nucleico;
y
la diana de ácido nucleico se pone en contacto
adicionalmente con un oligonucleótido de relleno que tiene una
secuencia complementaria a esta tercera parte de la diana de ácido
nucleico, teniendo lugar el contacto en condiciones eficaces para
permitir la hibridación del oligonucleótido de relleno con la diana
de ácido nucleico.
8. El método de la reivindicación 2, en el que
la diana de ácido nucleico es ARN o ADN viral, un gen asociado con
una enfermedad, un ADN bacteriano, un ADN fúngico, un ADN sintético,
un ARN sintético, un ARN natural o sintético estructuralmente
modificado, o un ADN natural o sintético estructuralmente
modificado.
9. El método de la reivindicación 2, en el que
la diana de ácido nucleico es de una fuente biológica.
10. El método de la reivindicación 2, en el que
la diana de ácido nucleico es un producto de una amplificación de
reacción en cadena de la polimerasa.
11. El método de la reivindicación 2, en el que
la diana de ácido nucleico es un fragmento obtenido por escisión de
ADN con una enzima de restricción.
12. El método de la reivindicación 2, en el que
la diana de ácido nucleico se pone en contacto con el primer y
segundo tipos de nanopartículas simultáneamente.
13. El método de la reivindicación 2, en el que
la diana de ácido nucleico se pone en contacto e hibrida con los
oligonucleótidos en el primer tipo de nanopartículas antes de
ponerse en contacto con el segundo tipo de
nano-
partículas.
partículas.
14. El método de la reivindicación 14, en el que
el primer tipo de nanopartículas está unido a un sustrato.
\newpage
15. El método de la reivindicación 1, en el que
las diferentes partes de la diana de ácido nucleico tienen una
secuencia de repetición.
16. El método de la reivindicación 1, en el que
las partes diferente de la diana de ácido nucleico tienen diferentes
secuencias.
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