WO2010089098A1 - Verfahren und mittel für die tuberkulose diagnostik - Google Patents

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Definitions

  • Tuberculosis is one of the three most common infectious diseases in the world caused by mycobacteria, in particular Mycobacterium tuberculosis (M.L), by droplet transmission.
  • M.L Mycobacterium tuberculosis
  • One-third of the world's population is considered infected, meaning that around 2 billion people worldwide carry the bacterium.
  • the route of infection is via inhaled bacteria, which are transmitted by coughing, sneezing or speaking.
  • the WHO the number of new infections per year is 8-9 million cases with 2-3 million deaths. Even in the most advanced countries, the cure for adequate therapy is below 80%.
  • this information is not available for non-industrialized countries, which are much lower due to lack of sanitary measures and access to appropriate medical care. Due to the increasing
  • TBC diagnostics has long been the standard in medicine, with different test procedures being used, depending on the situation and location.
  • tuberculin skin test with purified tuberculin was performed to diagnose latent TBC.
  • Mendel Mantoux skin test which in turn has proved to be not always safe.
  • a number of molecular biological and immunological tests have been developed in recent years, the aim of which was to improve and secure diagnostics.
  • U.S. Patents 7,122,196 and No. 7,087,713 describes antibodies capable of detecting TBC polypeptides and DNA sequences.
  • Patent 7,115,361 discloses a method for detecting a mycobacterial CD8 T cell II response using antigenic TBC peptides. Detection of a M. tuberculosis specific rpoB sequence is described by amplification technique in US Patent 7,094,542. Oligonucleotides for amplifying M. tw ⁇ ercw / os / s-specific nucleic acid sequences and their use for the detection of M. tuberculosis are described in US Patent 7,009,041. 'Iüscher also on a amplification method for detecting M. tuberculosis-specific nucleic acid sequences is based in U.S. Patent 5,908,744 described method.
  • Another detection technique for the detection of pathogens is based on gold colloids, as disclosed in WO 1998/004740 and in US Pat. No. 7,323,309.
  • the colouration based on the plasmon resonance inherent coloration is used, which changes due to particle size conditionally.
  • particle agglomeration occurs, which manifests itself in a color change.
  • the disadvantage of the methods based on this principle is the low color depth of the colloids, which is usually masked by the intrinsic staining of the clinical samples (blood, sputum, faeces, urine), as well as in the complicated detection procedure (see J.-Nam et al., J.Amer.Chem.Soc, Vol. 126, 5932, 2004).
  • the QuantiFERON TB Gold Test from Cellestis (Australia) and the T-Spot TB Test (Oxford-Immunotec, GB) have recently become more popular Proven practice.
  • This test is based on the detection of interferon-gamma (IFN- ⁇ ) secretion by stimulation of sensitized T-effector cells using specific mycobacterial antigens (eg ESAT-6: early secretory antigen target, CFP-10: culture filtrate protein). comes about.
  • IFN- ⁇ interferon-gamma
  • test method in any case relies on a correspondingly high-tech laboratory infrastructure ,
  • Bio-Vita is (EP 0966544), which is based on a complex formation of a gold-labeled antibody-binding protein with a TBC antigen. In case of infection, this complex is detected by a colored band.
  • the procedure is not recommended as an alternative to the tuberculin skin test (Pulmonology, Vol. 59, 681, 2005). All methods known from the prior art have in common that they depend either on a highly technical laboratory infrastructure or on reagents which do not allow simple application without adequate laboratory equipment.
  • the object of the present invention is to provide, by providing easy-to-use methods, the possibility of carrying out rapid and sensitive diagnostics also in non-high-tech laboratories or nursing stations, as are widely used in third-world countries.
  • the starting point of the invention are magnetic and non-magnetic nanoparticles and microparticles, which undergo specific binding (complexing) with the mycobacteria (pathogen) due to special coatings.
  • the complexation of the bacteria leads to a change in the optical and magnetic properties, which is used for sensitive detection by simple methods.
  • Magnetic (Fe 3 O 4 ), iron oxide (Fe 2 O 3 ) or iron oxyhydroxide (FeOOH) are preferably used as magnetic nanoparticles.
  • the presentation of such substances are well known and can either by precipitation - usually for this iron (III) and iron (II) saline solutions with varying molar ratios (2: 1, 0.5: 1 to 4: 1) by adding from bases or by addition of heat to correspondingly colloidal magnetic dispersions (hereinafter also referred to as "magnetic colloid”), decomposition of corresponding metal carbonyls or sintering processes .
  • the particle sizes are generally in the range from 10 to 300 nm.
  • the particle sizes of the magnetic colloids prepared with the aid of the aforementioned preparation method are known to depend on the concentration of the base, the type of base, the temperature, the stirring method and the salt ratio and the ion concentration.
  • surface-active substances such as surfactants or emulsifiers, are added to the magnetic nanoparticles, which prevents settling of the colloid in the aqueous phase.
  • Such stabilized colloidal dispersions or magnetic colloids are also known under the name “ferrofluids.” They are also commercially available today (Ferrofluidics Corp., USA, Advanced Magnetics, USA, Taibo Co, Japan, Liquids Research Ltd, Wales, Schering AG, Germany ).
  • This category includes ferromagnetic and superparamagnetic substances.
  • This class of compounds includes, for example, all iron (II) and iron (III) oxides of the formula FeO, Fe 2 Ch and iron mixed oxides of the formula Fe 3 ⁇ 4 and ferrites of the general formula Mei -x Zn x Fe 2 ⁇ 4 , where Me is cobalt or Nickel can be.
  • Other compounds which are also ferromagnetic in nature and basically meet the conditions of the invention are nickel, cobalt, gadolinium and the rare earth metals dysprosium, holmium and terbium and ferromagnetic alloys of non-ferromagnetic elements.
  • Compounds of this type which are also generally known as "Heusler alloys" have, for example, the composition Cu 2 AlMn or Cu 2 SnMn, as well as alloys of iron, nickel, cobalt, aluminum, copper, neodymium and boron partially very high coercive force as hard magnetic materials are used, meet basically also the prerequisites required above.
  • the abovementioned materials in the compositions and processes according to the invention, they have a particle size of from 10 to 300 nm, preferably from 50 to 200. This ensures that the magnetic colloids are present in the polymer matrix in the subsequent encapsulation by a functional polymer in finely disperse form.
  • the agents according to the invention is encapsulating the nanoparticles in a functional polymer shell (matrix).
  • the polymer matrix must fulfill the following conditions: (i) chemical functionality and (ii) biocompatibility.
  • the chemical functionality enables the chemical coupling of such bioligands in the form of antibodies, for example, capable of complementary binding with the surface structures of the bacterium.
  • Biocompatibility meets the requirements for the use of magnetic particles in the diagnostic field.
  • As a guideline for the biocompatibility in the selection of the relevant polymer matrices at least 90% maintenance of the cell integrity and cell morphology of HeLa cells after five hours of incubation was used. Polymers that meet these requirements usually belong to the class of hydrogels whose biocompatibility is primarily composed of the high molecular weight
  • Polymers meeting the above criteria are polysaccharide and oligosaccharides, polysaccharide derivatives such as hyaluronates, alginates, dextran, agarose, dextrin, starch, heparin, hydroxyethylcellulose, furthermore synthetic polymers such as polyvinyl alcohol, polyacrylic acid, polyurethanes, silica gels, polyoxyethylenes, polylactides, Polyglycolides, polycyanoacrylates,
  • an aqueous polymer solution in which the magnetic colloid is dispersed is suspended in a water-immiscible phase (organic phase) and then crosslinked with a suitable bi- or trifunctional crosslinker (U.S. Patents 6,204,033 and 4,345,588).
  • Suitable organic phases are oils with a viscosity of 50 to 200 cp (20 ° C.) or organic solvents into which the polymer is generally dispersed as a 1-20%, preferably as a 2 to 10%, solution together with the magnetic colloid .
  • the polymer phase is then covalently solidified by addition of crosslinkers to spherical particles, the magnetic colloid being physically encapsulated in the polymer matrix.
  • Paraffin oils, vegetable oils, silicone oils or organic solvents such as xylene, chloroform, butanol, heptanol, toluene, benzene, ethyl acetate, hexane, heptane, octane and mixtures thereof have proven particularly suitable as the organic phase.
  • various process-technical measures can be used which enable the synthesis of both nanoparticulate and microparticulate particles.
  • emulsifiers examples include: polyoxyethylene adducts, polyoxyethylene sorbitol esters, polyethylene-propylene oxide block copolymers, alkylphenoxypolyethoxyethanols, fatty alcohol glycol ether phosphoric esters, sorbitan fatty acid esters, polyoxyethylene alcohols, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters or polyoxyethylene acids.
  • volume ratios of organic phase to polymer / magnetic colloid phase vary between 10: 1 and 60: 1, that of the polymer phase to the colloid phase usually between 1: 0.5 and 1: 4, preferably between 1: 1 and 1: 3, wherein the polymer-magnetic colloid ratio is determined by the respective amount of the solid content in the colloid.
  • the solids content in the polymer is consistently 20 to 60% (w / w). This variable magnetic colloid content is important for the adjustment of the magnetic response or the magnetic attractive behavior of the particles in a magnetic field, which is crucial for the differential detection of the complexes and represents one of the inventive unique selling points.
  • Suitable crosslinkers for solidifying the polymer droplets into spherical particles are difunctional and trifunctional substances which can react with the functional groups (hydroxyl, carboxyl, amino groups, for example) of the various polymer matrices.
  • these are: alkyl dihalides, glutaraldehyde, di- and triisocyanates, divinylsulfone, cyanogen bromide, triallyl isocyanurate, divinylethyleneurea, epichlorohydrin, 2-chloro-1-methylpyridinium iodide, 1,4-butanediol divinyl ether, divinylsuccinate, divinyl glutarate, divinyl adipate.
  • the Concentration of the crosslinker is usually between 0.1-5 mol%, based on the polymer content.
  • the suspension polymerization can also be used in order to encapsulate the magnetic colloids in a defined manner.
  • water-soluble vinyl monomer are suspended individually or in a mixture in an organic phase which is immiscible with the monomers, and then free-radically polymerized with the addition of suitable stabilizers. Methods of this type are known from the literature (see Paine et al., Macromolecules, 23j 3104, 1990).
  • monomers water-soluble monomers such as e.g.
  • the suspension phases consistently correspond to the water-immiscible organic phases used in the suspension crosslinking. Also come here the same suspension stabilizers used as in the aforementioned crosslinking process.
  • the proportions of polymer to magnetic colloid and organic phase to the aqueous phase are analogous to those in the aforementioned crosslinking process.
  • Another object of the invention relates to colored or fluorescent particles.
  • These consist basically of the same polymer sheaths as those of the abovementioned magnetic particles, the difference being that the dyes or fluorescent dyes ("markers") are encapsulated in the polymer sheath instead of the magnetic colloids
  • the term "colored” also includes fluorescent and quantum dot-containing particles in the following text Virtually all water-soluble substances can be used which bring about intensive coloring of the particles. Since the diagnosis is partly carried out in whole blood, preferably those dyes or fluorescent dyes are used which have a good contrast to the blood such as methylene blue, Oregon Green, malachite green, Eriochrom black T, Indian yellow, saffron, crystal violet, fuchsin, Erioglaucin A. Acridine orange, RiboGreen.
  • quantum dots Another class of substances which are suitable for marking the particles and have extremely strong fluorescence are the so-called quantum dots. These are semiconductor nanocrystals, predominantly with a size in the range of 2 to 10 nm, which are formed from elements of groups II-VI, HI-V or IV-VI. Nonlimiting examples of this are: CdS, CdSe, ZnS, ZnSe, CdTe, MgS, ZnTe.
  • the peculiarity of these materials is their very high fluorescence intensity and the precise setting of the emissions due to the variable band gaps between valence and conductor band, the latter being determined by the size of the particles. Thus, with decreasing crystallite size, the emissions are shifted towards the shorter-wave visible spectrum (blue shift) and vice versa.
  • the basis for the use of the agents according to the invention is the specific complexation of the mycobacteria by the magnetic and / or colored particles, wherein the magnetic particles act as catcher and the colored particles as marker probes.
  • complexation defines the specific or complementary, noncovalent binding of the magnetic and / or the colored particles to the cell wall structures of the bacteria or bacterial antigens.
  • the polymer matrix of the particles is primarily covalently coupled with antibodies or antibody fragments, also referred to below as "catcher structures", “scavengers” or “bio-ligands”, which are capable of the cell wall structures (epitopes) or
  • Antigens that are secreted in the course of infection by the pathogen to make a complementary bond are antibodies against lipoarabinomannan, mannosylated lipoarabinomannan, mycolic acid, arabinogalactan, peptidoglycolipid, trehalose-6-phosphate phosphatase, cord factor, glycolipid, 19 kDa antigen, 38 kDa antigen, 14 kDa (TB68 epitope) Antigen, heat shock protein HSP 65, 14 kDa antigen, 27 kDa antigen and 25 kDa antigen or the 40 kDa antigen.
  • Receptor-analogous structures in the context of the invention are receptors on the surfaces of such cells, to which the Mt. binds and triggers the phagocytosis and thus the primary infection in the target cell.
  • These include the complement receptors CR1, CR3 and CR4 of the macrophages, the macrophage mannose receptor (MR) and the surface protein A receptor (SPA-R).
  • the receptors can be bound to the probes individually as well as in combination with the other capture structures.
  • the combinatorial immobilization of the receptors and / or antibodies improves the number of possible complementary interactions between catcher / marker probes and pathogens and thus increases the probability of the binding relevant to the detection.
  • Suitable coupling agents are, for example: cyanogen bromide, carbodiimides, hexamethylene diisocyanate, tosyl chloride, tresyl chloride, 2-fluoro-1-methylpyridinium-toluene 4-sulfonate, epichlorohydrin, N-hydroxysuccinimide, chlorocarbonate, isonitrile, hydrazide, glutaraldehyde, l, r, -carbonyl-diimidazole, 1,4-butanediol diglycidyl ether
  • the couplings of the bioligands via so-called spacer molecules are particularly advantageous , heterobifunctional, reactive compounds that can chemically bind both with the functional groups of the matrix (carboxyl, hydroxyl, sulfhydryl, amino groups) and with the bioligand, examples of
  • the combinatorial use of the magnetic and the marker particles surprisingly opens up a series of novel diagnostic applications whose unique feature is the simple visual detection of a complex formed without the aid of special analyzers.
  • the extremely high sensitivity of the diagnostic methods according to the invention results from the fact that per test a more than ten thousand-fold excess of particles can be used with a variety of immobilized Bioliganden that can react with the corresponding antigens of the pathogen. As a result, the reaction equilibrium is shifted entirely to the side of the pathogen-magnetic particle complex, resulting in the enormous detection sensitivity of the process. In other words, only a few pathogens or antigens are required to be able to detect it.
  • a pathogen magnetic particle cluster is formed, which is due to the significantly increased magnetic moment in comparison to the base particles using a conventional hand magnets within a few seconds in the form of a clearly visible particle spot (patch) manifested on the test tube wall.
  • This behavior of the magnetic particles referred to as the differential magnetic attraction, means that the magnetic particle-pathogen cluster formed has a markedly increased magnetic moment with respect to the base particles due to the presence of several magnetic particles and thus with the help of a magnet placed on the sample tube within a few seconds to the tube wall migrates to form a clearly visible particle speckle. In contrast, the starting particles are not attracted by the magnet within this period.
  • the attraction times vary analogously to the viscosity of the sample and are in the range of 30 (gastric juice, low viscosity) up to 240 seconds (sputum, blood, tissue sample). This purely visual proof does not require any optical or other technical-analytical aids.
  • Magnetic microparticles (particle size 5 to 30 ⁇ m) form in the sample (eg blood, urine, serum or sputum) a pathogen-magnetic particle cluster which, after appropriate separation by a conventional hand magnet, can be detected either visually or with the aid of a conventional microscope is.
  • a further embodiment of the diagnostic method according to the invention consists of using magnetic and colored / fluorescent polymer particles, on whose surface a respective antibody directed against a different epitope of interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ) are statistically coupled.
  • IFN- ⁇ interferon- ⁇
  • the basis of the test procedure is the detection of IFN- ⁇ produced by stimulation of T-effector cells due to incubation with mycobacterial antigens, e.g. ESAT-6 and / or CFP-10 is distributed. This process is the basis of the T SPOT-TB process (Oxford Immunotec, Oxford, UK), which has been on the market for some time.
  • the IFN- ⁇ formed can be formed by forming a particle cluster composed of several crosslinked particles, which can be detected either by settling in the sample tube or by differential magnetic attraction.
  • Different combinations are suitable for this test procedure, depending on whether the detection in the sputum, Urine, whole blood or serum is performed. Possible combinations are: (i) magnetic particles and colored particles, especially suitable for whole blood, (ii) nanoparticles and microparticles, (iii) two magnetic particles suitable for high viscosity sputum.
  • the particle sizes which are particularly suitable for these embodiments are in the range from 0.8 to 10 ⁇ m, the particle sizes being used in accordance with the viscosities of the respective samples. Particle sizes of 3-10 microns and larger are preferably used in higher viscosity media because the magnetic attraction of these particles results in faster detection due to the higher magnetic moment to nanoparticles.
  • Another embodiment is the use of only one type of particle to which the two anti-IFN- ⁇ antibodies are immobilized simultaneously in a random manner. It is crucial in this embodiment that the immobilization density of the antibodies remains low in order to (a) obtain the steric accessibility for the IFN- ⁇ and (b) to suppress intraparticular crosslinking by the cytokine.
  • Particularly suitable for this embodiment are microparticles with a size> 3 microns, whose concentration is chosen so that the reaction is largely shifted in the direction of clustering.
  • test can be carried out in a tube, (ii) only a few pipetting steps are necessary, and
  • the magnetic fraction is separated by means of a neodymium-boron-iron hand magnet and washed ten times alternately with petroleum ether and ethanol. This is followed by washing five times with PBS buffer. There are obtained polymer particles with a mean size of 0.943 microns.
  • the recovered particle fraction is then suspended in 3 ml of 0.1 M Na phosphate buffer, pH 8.2, and activated with the addition of 0.5 ml 12% glutaraldehyde solution over a period of 2 hours at room temperature. The fraction is washed several times with redistilled water with the aid of magnetic separation.
  • the washed fraction is dissolved in a mixture consisting of 2 ml of 0.05 M phosphate buffer, pH 8.2, in which 0.85 mg of anti-cord factor (trehalose-6,6'-dimycolate) IgG and 2 mg of cyanoborohydride are dissolved, over a period of 3 hours with gentle shaking reacted. It is washed several times with redistilled water and PBS buffer, pH 7.2. Incubation of the recovered fraction with a TBC infected sputum sample leads within 30 min. To bacteria-magnetic particle clusters, which can be detected by means of a hand magnet within 250 sec. As a brown-black particle agglomerate on the tube wall.
  • anti-cord factor trehalose-6,6'-dimycolate
  • aqueous dextran solution (average molecular weight 40,000) are added 1.2 ml of 5 M NaOH and 3 ml of MnZn ferrite suspension (BASF, Ludwigshafen, mean particle size 12 nm).
  • the mixture is sonicated for 10 minutes under ice-cooling and then injected by syringe into 80 ml of conventional cottonseed oil containing 0.3 g of polyoxyethylene sorbitan monooleate. It is followed by repeated sonication for 3 min. At 0 0 C. While stirring (2000 rpm, KPG stirrer) 0.5 g of cyanogen bromide, dissolved in 20 ml of ether was added.
  • the magnetic particles are isolated by magnetic separation (neodymium-boron-iron magnet) and washed several times with ether and ethanol alternately.
  • the recovered particles have a mean size of 4.8 microns and a magnetic content of 28%.
  • the magnetic particle fraction is then lyophilized and then activated with a solution consisting of 3 ml of absolute dimethylformamide (DMF) and 0.4 ml of hexamethylene diisocyanate over a period of 30 min. This is followed by repeated washing with absolute ethanol and DMF.
  • the washed fraction is then reacted with 2 ml of DMF in which 1 mM 6-aminocaproic acid is dissolved over a period of 60 min. At room temperature.
  • the suspension is then added under nitrogen to 150 ml of olive oil (viscosity 95 cp) containing 0.6% (w / w) Tween 80, 0.1% (w / w) Prisorine 3800 and 1.2% (v / v ) Span 85 are dissolved using a dispersing tool (Ultra-Turrax; 12,000 rpm).
  • the dispersion is continued for 10 min under nitrogen (5 ml / min). Thereafter, the reaction mixture is allowed to react for a further 30 min. With gentle stirring at 4 ° C.
  • the magnetic phase is separated by placing the magnetic fraction on a glass column densely packed with steel wool (filling volume: about 5 ml, inner diameter: 1.2 cm), which is surrounded by an annular neodymium-boron-iron magnet.
  • the retentate is then washed three times with 20 ml PBS buffer, pH 7.2. It is followed by removal of the magnet and elution with 5 ml of PBS buffer. There are magnetic particles with a mean particle size of 0.82 microns.
  • the product is lyophilized over a period of 5 days.
  • the magnetic particles After washing the magnetic particles repeatedly with bidistilled water, the magnetic particles are dispersed in 2 ml of sterile physiological saline. 30 to 60 minutes incubation of the magnetic particle fraction obtained with a sample infected with mycobacteria results in a magnetic particle-pathogen cluster which can be detected analogously to Example 2.
  • the magnetic phase is separated by placing the magnetic fraction on a glass column densely packed with steel wool (filling volume: about 5 ml, inner diameter: 1.2 cm), which is surrounded by an annular neodymium-boron-iron magnet.
  • the retained fraction is then washed with a total of 50 ml of PBS buffer, pH 7.2, (flow rate: 1 ml / min).
  • the magnetic particles are washed twice with 10 ml of 0.005 M HCl and, after removal of the magnet, by charging 5 ml of 0.1 M morpholinoethanesulfonic acid buffer (MES), pH 4.7, (flow rate: 0.5 ml / min) from the separation column eluted.
  • MES morpholinoethanesulfonic acid buffer
  • Magnetic particles with a mean particle size of 645 nm are produced.
  • To the eluate is added 0.5 mM N-cyclohexyl-N '- (2-morpholinoethyl) carbodiimide-methyl-p-toluenesulfonate and 1 mM N-hydroxysuccinimide; Reaction time: 30 min.
  • the support is applied to the magnetic separation column and washed with a total of 10 ml of ice water.
  • the washed magnetic fraction is eluted after removal of the magnet with 4 ml of MES buffer, pH 5.5, and divided into two equal particle fractions.
  • the two fractions are washed with 1 ml of bidistilled water in which 450 ⁇ g of anti-INF- ⁇ -IgG (MAI-23837, ABR-Affinity BioReagent Inc., USA) and 450 ⁇ g of anti-INF- ⁇ -IgG (MA 1- 37933) were incubated for 4 hours at room temperature 4 ° C. It is then washed with 20 ml of PBS buffer / 0.5% Tween 20, pH 7.2, and the magnetic fraction with 5 ml of 0.05 M Tris / HCl buffer / 1% ethanolamine, pH 8.5, eluted. The eluate is left in this elution solution for 2 hours.
  • Petroleum ether, methanol and ice water washed. There are particles with a mean particle size of 8.6 microns.
  • a second particle fraction is prepared which contains 2.5 mg methylene blue instead of the magnetic colloid.
  • the purification of the non-magnetic fraction is analogous to the magnetic fraction with the difference that each one centrifugation step is applied.
  • the fractions obtained are then each with 2.5 ml of epichlorohydrin and 5 ml 3 M NaOH solution for two hours at 60 0 C reacted. This is followed by intensive vigilance with ethanol and redistilled water using a magnetic separation step or by centrifugation.
  • Both fractions are immobilized separately with an antibody directed against Mycobacterium tuberculosis 38 kDa (HTM83) protein (Santa Cruz Biotechnology Inc, CA, USA) as follows: 2 ml of 0.5 M K phosphate buffer / 2.5 M ammonium sulfate, pH 8.5, in which 70 ⁇ g of IgG are dissolved, is reacted with the particle fractions over a period of 24 hours at room temperature. Followinged by a ⁇ -hour incubation with 4 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer / 1% ethanolamine, pH 8.5. This is followed by repeated washing with sterilized PBS buffer, pH 7.2. 30 to 10 minutes incubation of the recovered magnetic particle and color particle fraction with a mycobacteria-infected sample gives a colored magnetic particle-bacteria cluster, which can be detected analogously to Example 2.
  • HTM83 Mycobacterium tuberculosis 38 kDa

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine einfache Schnelldiagnose für Tuberkulose ohne aufwendige Laborhilfsmittel mit Hilfe neuartiger magnetischer und/oder gefärbter Polymerpartikel, die in der Lage sind, sich über immobilisierte Bakterien-spezifische Liganden, sich an die Bakterien oder infektionsauslösende komplementär anzulagern und dadurch einen visuell detektierbaren magnetischen und/oder gefärbten Cluster zu bilden.

Description

Verfahren und Mittel für die Tuberkulose Diagnostik
Beschreibung
Tuberkulose (TBC) ist weltweit eine der drei häufigsten Infektionskrankheiten, die durch Mykobakterien, hier insbesondere das Mycobacterium tuberculosis (M.L), per Tröpfchenübertragung verursacht werden. Ein Drittel der Weltbevölkerung gilt als infiziert, d.h., weltweit tragen etwa 2 Milliarden Menschen das Bakterium in sich. Der Infektionsweg verläuft über eingeatmete Bakterien, die durch Husten, Niesen oder Sprechen übertragen werden. Nach Angaben der WHO beläuft sich die Anzahl der Neuinfektionen pro Jahr auf 8-9 Mio. Fälle mit 2- 3 Mio. Todesfallen. Selbst in den hochentwickelten Ländern liegt der Heilungserfolg bei adäquater Therapie unter 80%. Diese Angaben treffen jedoch nicht für die nicht-industrialisierten Länder zu, die mangels hygienischer Maßnahmen und Zutritt zu entsprechenden medizinischer Versorgung wesentlich niedriger liegen. Bedingt durch die zunehmende
Reisetätigkeiten und Globalisierung stellt TBC auch in den westlichen Ländern zunehmend ein großes Problem dar. Darüber hinaus hat sich die TBC-Problematik im Zuge der AIDS Infektion, bei der TBC eines der opportunistischen Krankheitsbilder ist, zu einer brisanten Herausforderung für die medizinische Gemeinschaft entwickelt. Um TBC adäquat behandeln zu können, spielt die
Diagnostik vor allem in bezug auf eine Früherkennung eine mitentscheidende Rolle.
TBC Diagnostik ist seit langem Standard in der Medizin, wobei, je nach Situation und Standort, verschiedene Testverfahren Eingang in die Praxis gefunden haben. Zur Diagnose der latenten TBC wurde bis vor kurzem der Tuberkulin-Hauttest mit gereinigtem Tuberkulin durchgeführt. Da sich dieser Test jedoch als nicht immer aussagefähig erwies, wurde er im Jahre 2004 durch den Mendel-Mantoux-Hauttest ersetzt, der sich jedoch seinerseits als nicht immer sicher herausgestellt hat. Neben diesen eher einfachen Tests wurden in den letzten Jahren eine Reihe molekularbiologischer und immunlogischer Tests entwickelt, deren Ziel in einer verbesserten und sicheren Diagnostik bestand. In den US-Patenten 7,122,196 und 7,087,713 werden Antikörper beschrieben, die in der Lage sind, TBC Polypeptide und DNA Sequenzen zu detektieren. US-Patent 7,1 15,361 offenbart eine Methode zur Detektion einer mykobakteriellen CD8 T-ZeII-Antwort mit Hilfe antigener TBC Peptide. Der Nachweis einer M. tuberculosis spezifischen rpoB Sequenz wird mittels Amplifizierungstechnik im US-Patent 7,094,542 beschrieben. Oligonukleotide zur Amplifizierung M. twόercw/os/s-spezifischer Nukleinsäuresequenzen und deren Anwendung zum Nachweis von M tuberculosis wird im US-Patent 7,009,041 beschrieben. Ebenfalls auf einer Amplifizierungsmethode zum Nachweis M. tuberculosis-spez'iüscher Nukleinsäuresequenzen beruht das im US-Patent 5,908,744 beschriebene Verfahren.
Der Nachweis der Pathogen DNA über die Amplifizierung der Nukleinsäuren mit Hilfe der PCR-Technik {polymerase chain reactiori) wird häufig durch PCR Inhibitoren, die sich in den klinischen Proben befinden, stark eingeschränkt.
Um die Nachteile der bisherigen Nukleinsäure-Nachweise zu umgehen, ist von der Fa. Genpoint AS, Oslo, Norwegen, ein Verfahren offenbart (DE 698 02 191 T3, entsprechend WO 1998/051693, als Referenz hier beigefügt), das die Bindung und Lyse von Zellen, Bindung derselben und Nachweis der Zell-Nukleinsäure auf partikulären magnetischen Trägern beschreibt.
Eine weitere Nachweistechnik zur Detektion von Pathogenen geht von Goldkolloiden aus, wie sie in WO 1998/004740 sowie im US-Patent 7,323,309 offenbart sind. Hierbei wird die auf der Plasmonenresonanz beruhende Eigenfärbung der Kolloide genutzt, die sich Teilchengrößen bedingt verändert. Durch Bindung solcher Antikörper oder Nukleinsäuresequenzen an die Kolloide, die entsprechende Ziel Strukturen (Nukleinsäuren, Epitope) des Pathogens spezifisch erkennen, kommt es zu einer Teilchen-Agglomerisierung, die sich in einer Farbänderung manifestiert. Der Nachteil der auf diesem Prinzip basierenden Verfahren besteht in der geringen Farbtiefe der Kolloide, die durch die Eigenfärbung der klinischen Proben (Blut, Sputum, Faeces, Urin) meist überdeckt wird, sowie in dem komplizierten Nachweisprozedere (s. J.-M. Nam et al., J. Amer. Chem. Soc, Vol. 126, 5932, 2004).
Neben diesen molekularbiologischen Testverfahren, die ausnahmslos einer modern ausgestatteten Laborausrüstung bedürfen, hat sich in letzter Zeit vor allem der QuantiFERON TB Gold Test der Fa. Cellestis (Australien) sowie dem T-Spot-TB- Test (Oxford-Immunotec, GB) in der Praxis bewährt. Dieser Test beruht auf dem Nachweis der Interferon-gamma (IFN-γ)-Sekretion, die durch Stimulation sensibilisierter T-Effektorzellen mit Hilfe spezifischer Mykobakterien-Antigenen (z.B. ESAT-6: early secretory antigen target, CFP-10: culture filtrate protein) zustande kommt. Obwohl der Nachweis eine Reihe von Vorteilen wie Sensitivität, schneller Nachweis (24-48 Stunden), Unbeeinflussung durch BCG-Impfung (Bacille- Calmette-Guerin) sowie Erkennung falsch negativer Testresultate aufweist, ist das Testverfahren in jedem Fall auf eine entsprechend hochtechnisierte Laborinfrastruktur angewiesen.
Eine Alternative zu den oben beschriebenen Verfahren stellt ein membranbasierter Schnelltest zum Nachweis aktiver TBC aus Serum oder Vollblut der Fa. Bio-Vita dar (EP 0966544), der auf einer Komplexbildung eines Gold-markierten antikörperbindenden Proteins mit einem TBC Antigen beruht. Im Falle einer Infektion wird dieser Komplex anhand einer gefärbten Bande detektiert. Das Verfahren wird jedoch wegen fehlender Empfindlichkeit und mangelnder Spezifität nicht als Alternative zum Tuberkulin-Hauttest empfohlen (Pneumologie, Vol. 59, 681, 2005). Allen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren ist gemeinsam, dass sie entweder auf eine hochtechnische Laborinfrastruktur oder aber auf Reagenzien angewiesen sind, die eine einfache Applikation ohne ausreichende Laborausrüstung nicht ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung hat sich zur Aufgabegestellt, durch Bereitstellung einfach zu handhabender Verfahren die Möglichkeit zu eröffnen, eine rasche und empfindliche Diagnostik auch in nicht hochtechnischen Labors oder Pflegestationen, so wie sie in den Drittweltländern weit verbreitet sind, durchzuführen.
Ausgangspunkt der Erfindung sind magnetische und unmagnetische Nano- und Mikropartikel, die aufgrund spezieller Beschichtungen eine spezifische Bindung (Komplexierung) mit den Mykobakterien (Pathogen) eingehen. Die Komplexierung der Bakterien führt zu einer Veränderung der optischen und magnetischen Eigenschaften, die zu einem empfindlichen Nachweis mittels einfacher Methoden genutzt wird.
Als magnetische Nanopartikel werden vorzugsweise Magnetit (Fe3O4), Eisenoxid (Fe2O3) oder Eisenoxyhydroxid (FeOOH) verwendet. Die Darstellung solcher Substanzen sind allgemein bekannt und können entweder über Fällungsverfahren - in der Regel werden hierfür Eisen(III) und Eisen(II)-Salzlösungen mit variierenden molaren Verhältnissen (2:1, 0,5:1 bis 4:1) durch Zugabe von Basen oder durch Hitzezufuhr in entsprechend kolloidale Magnetdispersionen (im folgenden auch mit „Magnetkolloid" bezeichnet) überführt -, Zersetzung entsprechender Metallcarbonyle oder Sinterverfahren vollzogen werden. Die Partikelgrößen liegen durchweg im Bereich von 10-300 nm. Wie dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt, hängen die Teilchengrößen der mit Hilfe der vorgenannten Präparationsweise hergestellten Magnetkolloide erfahrungsgemäß von der Konzentration der Base, der Art der Base, der Temperatur, der Rührweise sowie dem Salzverhältnis und der Ionenkonzentration ab. Um ein besonders durch die van-der-Waals'sche Kräfte bedingtes Agglomerieren der Magnetkolloide zu verhindern, werden den magnetischen Nanopartikeln oberflächenaktive Stoffe wie Tenside oder Emulgatoren zugesetzt, die ein Absetzen des Kolloids in der wäßrigen Phase verhindert. Solche stabilisierten kolloidalen Dispersionen bzw. Magnetkolloide sind auch unter der Bezeichnung „Ferrofluide" bekannt. Sie werden heute auch kommerziell angeboten (Ferrofluidics Corp., USA, Advanced Magnetics, USA, Taibo Co, Japan, Liquids Research Ltd, Wales, Schering AG, Deutschland).
Als magnetische Teilchen im Rahmen der vorliegenden Erfindung kommen grundsätzlich solche Werkstoffe in Frage, die über eine spontane Magnetisierung in einem statischen Magnetfeld verfügen. Unter diese Kategorie fallen ferro- ferri- und superparamagnetische Stoffe. Zu dieser Substanzklasse gehören z.B. alle Eisen(II) und Eisen(III)oxide der Formel FeO, Fe2Ch sowie Eisenmischoxide der Formel Fe3θ4 sowie Ferrite der allgemeinen Formel Mei-xZnxFe2θ4, worin Me Kobalt oder Nickel sein kann. Weitere Verbindungen, die ebenfalls ferromagnetischer Natur sind und grundsätzlich die erfindungsgemäßen Bedingungen erfüllen, sind Nickel, Cobalt, Gadolinium sowie die Seltenerdenmetalle Dysprosium, Holmium und Terbium sowie ferromagnetische Legierungen aus nicht-ferromagnetischen Elementen. Verbindungen dieser Art, die auch unter der Bezeichnung „Heuslersche Legierungen" allgemein bekannt sind, weisen beispielsweise die Zusammensetzung Cu2AlMn oder Cu2SnMn auf. Auch Legierungen aus Eisen, Nickel, Kobalt, Aluminium, Kupfer, Neodym und Bor, die wegen ihrer teilweise sehr hohen Koerzitivkraft als hartmagnetische Werkstoffe zum Einsatz kommen, erfüllen grundsätzlich auch die oben geforderten Voraussetzungen. Um die oben bezeichneten Werkstoffe in den erfindungsgemäßen Mitteln und Verfahren einsetzen zu können, weisen diese eine Teilchengröße von 10 bis 300 nm, vorzugsweise eine solche von 50 bis 200, auf. Dadurch ist gewährleistet, dass die Magnetkolloide bei der anschließenden Einkapselung durch ein funktionelles Polymeres in fein disperser Form in der Polymermatrix vorliegen.
Neben den magnetischen Eigenschaften besteht ein weiterer, wesentlicher Aspekt der erfindungsgemäßen Mittel darin, die Nanopartikel in eine funktionelle Polymerhülle (Matrix) einzukapseln. Die Polymermatrix muß dafür folgende Bedingungen erfüllen: (i) chemische Funktionalität und (ii) Biokompatibilität. Die chemische Funktionalität ermöglicht die chemische Kopplung solcher Bioliganden in Form von Antikörpern z.B., die in der Lage sind, mit den Oberflächenstrukturen des Bakteriums eine komplementäre Bindung einzugehen. Die Biokompatibilität erfüllt die Voraussetzung für den Einsatz der Magnetpartikel im diagnostischen Bereich. Als Maßgabe für die Biokompatibilität bei der Auswahl der betreffenden Polymermatrizes wurde eine mindestens 90%ige Erhaltung der Zellintegrität und Zellmorphologie von HeLa-Zellen nach fünfstündiger Inkubation zugrunde gelegt. Polymere, die diesen Anforderungen genügen, gehören in der Regel der Klasse der Hydrogele an, deren Biokompatibilität sich in erster Linie aus dem hohen
Wassergehalt (>80%) ableitet. Polymere, die die obigen Kriterien erfüllen, sind PoIy- und Oligosaccharide, Polysaccharid-Abkömmlinge wie Hyaluronate, Alginate, Dextran, Agarose, Dextrin, Stärke, Heparin, Hydroxyäthylzellulose, weiterhin synthetische Polymere wie Polyvinylalkohol, Polyacrylsäure, Polyurethane, Silicagele, Polyoxyäthylene, Polylactide, Polyglycolide, Polycyanoacrylate,
Polyhydroxyethylmethacrylate sowie Copolymere dieser Substanzen. Ferner haben sich auch Proteine wie z.B. Gelatine, Casein, Collagen, Albumin, Fibrinogen oder Polyaminosäuren hierfür bewährt. Zur Einkapselung der magnetischen Kolloide mit den Polymeren sind grundsätzlich solche Verfahren anwendbar, die die Magnetkolloide vollständig einzukapseln vermögen und entsprechend isolierte nano- oder mikropartikuläre Magnetpartikel ergeben. Vorteilhafterweise kommen hierfür die allgemein bekannten Verfahren wie Suspensionsvernetzung („suspension-crosslinking"), Suspensionspolymerisation oder Präzipitationsverfahren („Solvent-Evaporation-Prozeß") aus organischer Phase zur Anwendung. Diese Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt und können von einem Fachmann auf diesem Gebiet jeder Zeit genutzt werden.
Beim Suspensionsvernetzungsverfahren wird eine wäßrige Polymerlösung, in der das magnetische Kolloid dispergiert ist, in einer mit Wasser nicht mischbaren Phase (organische Phase) suspendiert und anschließend mit einem geeigneten bi- oder trifunktionellen Vernetzer vernetzt ( US-Patente 6,204,033 und 4,345,588). Als organische Phase eignen sich Öle mit einer Viskosität von 50 bis 200 cp (200C) oder organische Lösungsmittel, in die das Polymere in der Regel als 1- 20%, vorzugsweise als 2 bis 10%ige Lösung zusammen mit dem Magnetkolloid dispergiert wird. Während des Suspensionsvorganges wird die Polymerphase dann durch Zugabe von Vernetzern zu sphärischen Partikeln kovalent verfestigt, wobei das Magnetkolloid physikalisch in die Polymermatrix eingekapselt wird. Als organische Phase haben sich besonders Paraffinöle, Pflanzenöle, Siliconöle oder organische Lösungsmittel wie Xylol, Chloroform, Butanol, Heptanol, Toluol, Benzol, Essigester, Hexan, Heptan, Octan sowie Mischungen derselben als geeignet erwiesen. Um die für die verschiedenen Anwendungen bzw. Verfahrensweisen optimalen Teilchengrößen zu realisieren, können verschiedene verfahrens-technische Maßnahmen angewendet werden, die die Synthese sowohl nano- als auch mikropartikulärer Teilchen ermöglichen. Für die Synthese sehr kleiner Partikel im Bereich von 300 nm bis 5 μm kommen vor allem zwei Maßnahmen zum Tragen: (i) Zusatz von 0,3-15% (w/w)/(v/v) Emulsionsstabilisatoren und (ii) mechanische Zerkleinerung unter Zuhilfenahme eines Dispergierwerkzeuges, das nach dem Rotor- Stator-Prinzip funktioniert (z.B. Ultra-Turrax, IKA Werke, BRD). Die Rotorgeschwindigkeiten liegen dabei im Bereich von 5000 U/Min bis 24.000 U/Min., wobei generell mit steigender Geschwindigkeit die Teilchengrößen nach unten verschoben werden (<1 μm). Geeignete Emulgatoren sind z.B.: Polyoxyäthylenaddukte, Polyoxyäthylensorbitolester, Polyäthylenpropylenoxid- Blockcopolymere, Alkylphenoxypolyäthoxyäthanole, Fettalkoholglycoläther- Phosphorsäureester, Sorbitan-Fettsäureester, Polyoxyäthylenalkohole, Polyoxyäthylensorbitan-fettsäurester oder Polyoxyäthylensäuren. Die
Volumenverhältnisse von organischer Phase zur Polymer/Magnetkolloid-Phase variieren dabei zwischen 10:1 und 60: 1, die der Polymer-Phase zur Kolloid-Phase in der Regel zwischen 1 :0,5 und 1 :4, vorzugsweise zwischen 1 : 1 und 1 :3, wobei das Polymer-Magnetkolloid-Verhältnis durch die jeweilige Menge des Festkörperanteiles im Kolloid bestimmt wird. Der Festkörperanteil im Polymeren beträgt durchweg 20 bis 60% (w/w). Dieser variable Magnetkolloidanteil ist wichtig für die Einstellung des magnetischen Ansprech- bzw. des magnetischen Attraktionsverhaltens der Partikel in einem Magnetfeld, die für den differentiellen Nachweis der Komplexe entscheidend ist und eines der erfindungs-gemäßen Alleinstellungsmerkmale darstellt.
Geeignete Vernetzer zur Verfestigung der Polymertröpfchen zu sphärischen Partikeln sind di- und trifunktionelle Substanzen, die mit den funktionellen Gruppen (Hydroxyl-, Carboxyl-, Aminogruppen z.B.) der verschiedenen Polymermatrizes reagieren können. Beispiele hierfür sind: Alkyldihalogenide, Glutaraldehyd, Di- und Triisocyanate, Divinylsulfon, Bromcyan, Triallylisocyanurat, Divinyläthylenharnstoff, Epichlorhydrin, 2-Chlor-l-methylpyridiniumiodid, 1.4- Butandioldivinyläther, Divinylsuccinat, Divinylglutarat, Divinyladipat. Die Konzentration des Vernetzers liegt in der Regel zwischen 0,1-5 Mol%, bezogen auf den Polymeranteil.
In einer weiteren Ausfuhrungsform kann alternativ zu dem Suspensions- Vernetzungsverfahren auch die Suspensionspolymerisation angewendet werden, um die Magnetkolloide in definierter Weise einzukapseln. Dazu werden wasserlösliche Vinylmonomer einzeln oder in Mischung in einer mit den Monomeren nicht mischbaren organischen Phase suspendiert und anschließend unter Zugabe geeigneter Stabilisatoren radikalisch polymerisiert. Verfahren dieser Art sind aus der Literatur bekannt (vgl. Paine et al., Macromolecules, 23j 3104, 1990). Als Monomere kommen wasserlösliche Monomere wie z.B. Vinylpyrrolidon, Acrylamid, 2- Hydroxyethyl-methacrylat, Hydroxyethylacrylat, Acrylsäure, Methacrylsäure, N- Isopropylacrylamid, Acrolein sowie Mischungen derselben in Frage. Die Suspensionsphasen entsprechen durchweg den bei der Suspensionsvernetzung benutzten mit Wasser nicht-mischbaren organischen Phasen. Auch kommen hierbei die gleichen Suspensionsstabilisatoren zur Anwendung wie beim vorgenannten Vernetzungs verfahren. Die Mengenverhältnisse von Polymer zu Magnetkolloid sowie organischer Phase zur wäßrigen Phase sind analog denen im vorgenannten Vernetzungsverfahren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft gefärbte oder fluoreszierende Partikel. Diese bestehen grundsätzlich aus denselben Polymerhüllen wie die der vorgenannten magnetischen Partikel, der Unterschied ist der, dass in die Polymerhülle statt der Magnetkolloide Farbstoffe oder Fluoreszenzfarbstoffe („Marker") eingekapselt werden. Grundsätzlich ist auch eine simultane Einkapselung der gefärbten - bzw. der fluoreszierenden Substanzen mit den Magnetkolloiden möglich. Unter der Bezeichnung "gefärbt" werden im folgenden auch fluoreszierende und auch Quantum Dots-enthaltende Teilchen zusammengefaßt. Als Farbstoffe können praktisch sämtliche wasserlöslichen Substanzen verwendet werden, die eine intensive Färbung der Partikel herbeiführen. Da die Diagnostik z.T. im Vollblut durchgeführt wird, kommen vorzugsweise solche Farbstoffe bzw. Fluoreszenzfarbstoffe zum Einsatz, die eine gute Kontrastierung zum Blut aufweisen wie beispielsweise Methylenblau, Oregon Green, Malachitgrün, Eriochromschwarz T, Indischgelb, Safranin, Kristallviolett, Fuchsin, Erioglaucin A., Acridinorange, RiboGreen.
Eine weitere Substanzklasse, die sich zur Markierung der Partikel eignen und eine extrem starke Fluoreszenz aufweisen, sind die sogenannten Quantum Dots. Hierbei handelt es sich um Halbleiter Nanokristalle, vorwiegend mit einer Größe im Bereich von 2 bis 10 nm, die aus Elementen der Gruppen II- VI, HI-V oder IV-VI gebildet werden. Die Erfindung nicht einschränkende Beispiele hierfür sind: CdS, CdSe, ZnS, ZnSe, CdTe, MgS, ZnTe. Die Besonderheit dieser Materialien besteht in ihrer sehr hohen Fluoreszenzintensität und der genauen Einstellung der Emissionen aufgrund der veränderbaren Bandlücken zwischen Valenz- und Leiterband, wobei letztere durch die Größe der Teilchen bestimmt wird. So werden die Emissionen bei abnehmender Kristallitgröße zum kürzerwelligen sichtbaren Spektrum hin verschoben (Blauverschiebung) und umgekehrt. Diese exakt einstellbaren Emissionsfrequenzen in Verbindung mit hoher Fluoreszenzintensität hat in den letzten Jahren zu einer interessanten Anwendungspalette in der Physik und Biotechnologie geführt. Die Synthesen dieser Substanzklasse sind mannigfach in der Literatur beschrieben (X. Gao, S. Nie, J. Phys. Chem. B Vol. 107, 1 1575, 2003) und daher allgemeiner Stand der Technik. Für die Einkapselung dieser Partikel kommen grundsätzlich dieselben Verfahrensweisen zur Anwendung wie bei der Herstellung der magnetischen Partikel. Die Nanokristalle liegen in der Regel in einer Konzentration von 0,1 bis und 3% (w/w), bezogen auf das Polymere, vor. Basis für den Einsatz der erfindungsgemäßen Mittel ist die spezifische Komplexierung der Mykobakterien durch die Magnet- und/oder gefärbten Partikel, wobei die Magnetpartikel als Fänger- und die gefärbten Partikel als Markersonden fungieren. Unter "Komplexierung" wird im Folgenden die spezifische bzw. komplementäre, nicht-kovalente Bindung der Magnet- und/oder der gefärbten Partikel an die Zellwandstrukturen der Bakterien oder Bakterienantigene definiert. Um die Pathogene spezifisch komplexieren zu können, werden an die Polymermatrix der Partikel in erster Linie Antikörper oder Antikörperfragmente, im folgenden auch als „Fängerstrukturen", „Fänger" oder „Bio-Liganden" bezeichnet, kovalent gekoppelt, die in der Lage sind, mit den Zellwandstrukturen (Epitopen) oder
Antigenen, die im Zuge der Infektion durch das Pathogen sezerniert werden, eine komplementäre Bindung einzugehen. Die Erfindung in keiner Weise einschränkende Beispiele hierfür sind Antikörper gegen Lipoarabinomannan, mannosyliertes Lipoarabinomannan, Mycolsäure, Arabinogalactan, Peptidoglycolipid, Trehalose-6- Phosphat Phosphatase, Cord Faktor, Glykolipid, 19 kDa- Antigen, 38 kDa- Antigen, 14 kDa (TB68 epitope)-Antigen, heat shock protein HSP 65, 14 kDa-Antigen, 27- kDa-Antigen und 25-kDa-Antigen oder das 40 kDa-Antigen.
Die Gewinnung solcher Antikörper als monoklonale, polyclonale oder rekombinante Spezies sind aus dem Stand der Technik hinlänglich bekannt und können jeder Zeit von einem Fachmann auf diesem Gebiet genutzt werden (s. PJ. Cummings et al., Hybridoma, Vol. 17, 151,1998). Neben den Antikörpern sind auch Antikörper- Fragmente wie Fab oder F(ab')2, Einzelkettenmoleküle (scFv), künstliche Konstrukte wie „Diabodies", „Triabodies" oder "Minibodies" einsetzbar.
Neben den gegen die Oberflächenepitope des Pathogens gerichteten Antikörpern konnte überraschenderweise gezeigt werden, dass eine zielgerichtete Bindung zwischen Zielpathogen (M.t.) und Partikeln erreicht wird, indem rezeptoranaloge Strukturen an die Marker- und Magnetsonden gebunden (immobilisiert) werden. Rezeptoranaloge Strukturen sind hierbei im Sinne der Erfindung Rezeptoren auf den Oberflächen solcher Zellen, an die das Mt. bindet und die Phagocytose und damit die Primärinfektion in der Zielzelle auslöst. Hierzu zählen die Komplementrezeptoren CRl, CR3 und CR4 der Makrophagen, der Makrophagen Mannose Rezeptor (MR) und der Oberflächen Protein A Rezeptor (SPA-R). Die Rezeptoren lassen sich sowohl einzeln als auch in Kombination mit den anderen Fängerstrukturen an die Sonden binden. Durch die kombinatorische Immobilisierung der Rezeptoren und/oder Antikörper wird die Anzahl der möglichen komplementären Interaktionen zwischen Fänger-/ Markersonden und Pathogen verbessert und damit die Wahrscheinlichkeit der detektionsrelevanten Bindungen erhöht. Die
Bereitstellung der entsprechenden rezeptoranalogen Strukturen geschieht in der Regel gentechnisch und geht aus dem Stand der Technik hervor.
Die Ankopplung der Liganden erfolgt nach den bekannten Verfahren zur Immobilisierung von Bioliganden an polymere Träger (vgl. „Methods in
Enzymology", Mosbach Hrsg, VoI 135 Part B, Academic Press, 1987, S. 3-169). Geeignete Kopplungsagenzien hierfür sind z.B.: Bromcyan, Carbodiimide, Hexamethylendiisocyanat, Tosylchlorid, Tresylchlorid, 2-Fluor-l-methyl- pyridinium-toluol-4-sulfonat, Epichlorhydrin, N-Hydroxysuccinimid, Chlorcarbonat, Isonitril, Hydrazid, Glutaraldehyd, l,r,-Carbonyl-diimidazol, 1,4-Butandiol- diglycidyläther. Besonders günstig sind darüber hinaus die Kopplungen der Bioliganden über sogenannte Spacer-Moleküle, heterobifunktionelle, reaktive Verbindungen, die sowohl mit den funktionellen Gruppen der Matrix (Carboxyl-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Aminogruppen) als auch mit dem Bioliganden eine chemische Bindung eingehen können. Beispiele hierfür sind: Succinimidyl-4-(N- maleiimido-methyl)-cyclohexan- 1 -carboxy lat, 4-Succinimidyloxycarbonyl-α-(2- pyridyldithio)toluol, Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat, N-γ- Maleimidobutyryloxysuccinimidester, 3-(2-Pyridyldithio)propionylhydrazid, Sulfosuccinimidyl-2-(p-azidosalicylamido)äthyl-l ,3'-dithiopropionat.
Durch den kombinatorischen Einsatz der Magnet- und der Markerpartikel eröffnen sich überraschenderweise ein Reihe neuartiger diagnostischer Anwendungen, deren Alleinstellungsmerkmal in der einfachen visuellen Detektion eines gebildeten Komplexes ohne Zuhilfenahme besonderer Analysengeräte besteht. Die extrem hohe Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren ergibt sich dadurch, dass pro Test ein über zehntausenfacher Überschuß an Partikeln mit einer Vielzahl immobilisierter Bioliganden eingesetzt werden kann, die mit den entsprechenden Antigenen des Pathogens reagieren können. Dadurch wird das Reaktionsgleichgewicht gänzlich auf die Seite des Pathogen-Magnetpartikel- Komplexes verschoben, woraus die enorme Nachweisempfindlichkeit des Verfahrens resultiert. D.h., es sind nur wenige Pathogene bzw Antigene vonnöten, um einen Nachweis führen zu können. So hat sich gezeigt, dass weniger als 1000 Pathogene in der betreffenden infizierten Proben ausreichen, um eine eindeutige Diagnoseaussage zu treffen. Über die eine empfindliche Diagnostik ermöglichende Reaktionskinetik hinaus, ergibt sich eine weitere Steigerung der Nachweisempfindlichkeit dadurch, dass die Pathogene nicht nur "zweidimensional" komplexiert werden, sondern aufgrund der statistischen Verteilung der immobilisierten Fänger auf der Partikeloberfläche einen dreidimensionalen Pathogen-Partikel-Cluster, bestehend aus einer Vielzahl von Partikeln und Bakterien, bilden, der sich aufgrund der Größe und der Farbe in einfacher Weise visuell detektieren läßt.
Durch die Auswahl verschiedener Teilchengrößen eröffnen sich grundsätzlich drei Detektionsmöglichkeiten: (i) Durch Verwendung von vorzugsweise 350 bis 700 nm großen Nanoteilchen, wird ein Pathogen-Magnetpartikel-Cluster gebildet, der sich aufgrund des deutlich verstärkten magnetischen Momentes im Vergleich zu den Basisteilchen mit Hilfe eines konventionellen Handmagneten innerhalb weniger Sekunden in Form eines deutlich sichtbaren Teilchenfleckes (patch) an der Teströhrchenwandung manifestiert. Diese als differentielle magnetische Attraktion bezeichnete Verhaltensweise der Magnetteilchen bedeutet, dass der gebildete Magnetpart ikel- Pathogen-Cluster aufgrund der Präsenz mehrerer Magnetpartikel ein deutlich erhöhtes magnetisches Moment gegenüber den Basisteilchen aufweist und dadurch mit Hilfe eines an das Probenröhrchen plazierten Magneten innerhalb weniger Sekunden an die Röhrchenwandung unter Ausbildung eines deutlich sichtbaren Teilchenfleckens wandert. Demgegenüber werden die Ausgangspartikel nicht von dem Magneten innerhalb dieses Zeitraumes attrahiert. Die Attraktionszeiten variieren dabei analog zur Viskosität der Probe und liegen im Bereich von 30 (Magensaft, niedrige Viskosität) bis zu 240 Sek. (Sputum, Blut, Gewebeprobe). Dieser rein visuelle Nachweis bedarf keinerlei optischer oder sonstiger technisch-analytischer Hilfsmittel.
(ii) Magnetische Mikropartikel (Teilchengröße 5 bis 30 μm) bilden in der Probe (z.B. Blut, Urin, Serum oder Sputum) einen Pathogen-Magnetpartikel-Cluster, der nach entsprechender Abtrennung durch einen konventionellen Handmagneten entweder visuell oder mit Hilfe eines konventionellen Mikroskops nachweisbar ist.
(iii) Kombinatorische Anwendung magnetischer und gefärbter Mikropartikel (Sonden), die beide mit den gleichen Pathogen-spezifischen Fängern beschichtet sind. Der gebildete Cluster kann magnetisch abgetrennt und aufgrund seiner Farbe ohne besondere optische Hilfsmittel nachgewiesen werden. Mit Hilfe dieses sowie der unter (i) und (ii) dargelegten Verfahren lassen sich Bakterienzahlen von unter 1000 nachweisen.
Die hervorstechenden Merkmale dieser Verfahrensweisen bestehen in: (a) einer einfachen Handhabung - es werden nur wenige Pipettierschritte benötigt, (b) einem Nachweis ohne optische Hilfsmittel und (c) in einer extremem Nachweisempfindlichkeit.
Neben der Komplexierung der Pathogene mit Hilfe spezifische Liganden-tragender Partikel besteht eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform des diagnostischen Verfahrens darin, magnetische und gefärbte/fluoreszierende Polymerpartikel einzusetzen, an deren Oberfläche je ein gegen ein unterschiedliches Epitop des Interferon-γ (IFN-γ) gerichtete Antikörper statistisch gekoppelt sind. Basis des Testverfahrens besteht im Nachweis von IFN-γ, das durch Stimulation von T- Effektorzellen aufgrund der Inkubation mit Mykobakterien- Antigenen wie z.B. ESAT-6 und/oder CFP-10 ausgeschüttet wird. Dieses Verfahren ist Grundlage des T SPOT-TB Verfahrens (Oxford Immunotec, Oxford, GB), das seit geraumer Zeit auf dem Markt ist. Nachteil des Verfahrens ist jedoch seine zeitaufwendige und komplizierte Handhabung, die nur in einem entsprechend hochmodernen Labor ausgeführt werden kann. Die Anwendung der erfindungsgemäßen Mittel ermöglicht es überraschenderweise, dieses Nachweisprinzip innerhalb eines deutlich vereinfachten Testverfahrens anzuwenden und dadurch auch dieses Diagnoseprinzip für einfach ausgestattete Labors oder Medizineinrichtungen zugänglich zu machen.
Nach Zugabe der Antikörper-tragenden Polymerpartikel kann das gebildete IFN-γ durch Ausbildung eines Partikel-Clusters, der sich aus mehreren vernetzten Partikeln zusammensetzt und sich entweder durch Absetzen im Probenröhrchen oder durch differentielle magnetische Attraktion nachweisen läßt. Für dieses Testverfahren eignen sich verschiedene Kombinationen, je nachdem, ob der Nachweis im Sputum, Urin, Vollblut oder Serum durchgeführt wird. Mögliche Kombinationen sind : (i) magnetische Partikel und gefärbte Partikel - vor allem geeignet für Vollblut, (ii) Nano- und Mikropartikel, (iii) zwei Magnetpartikel, geeignet für Sputum mit hoher Viskosität. Die für diese Ausführungsformen besonders geeigneten Partikelgrößen liegen im Bereich von 0,8 bis 10 μm, wobei die Partikelgrößen entsprechend den Viskositäten der jeweiligen Proben eingesetzt werden. Teilchengrößen von 3-10 μm und größer werden vorzugsweise in höher viskosen Medien eingesetzt, da die magnetische Attraktion dieser Teilchen aufgrund des höheren magnetischen Momentes gegenüber Nanopartikeln zu rascheren Nachweisen führt.
Eine weitere Ausführungsform besteht in der Verwendung nur einer Partikelsorte, auf die die beiden anti-IFN-γ-Antikörper gleichzeitig in statistischer Weise immobilisiert sind. Entscheidend bei dieser Ausfuhrungsform ist, dass die Immobilisierungsdichte der Antikörper gering bleibt, um (a) die sterische Zugänglichkeit für das IFN-γ zu erhalten und (b) intrapartikuläre Vernetzungen durch das Cytokin zu unterdrücken. Besonders geeignet für diese Ausführungsform sind Mikropartikel mit einer Größe >3 μm, deren Konzentration so gewählt ist, dass die Reaktion weitestgehend in Richtung der Clusterbildung verschoben wird. Der Vorteil der vorgenannten Verfahrensweisen im Vergleich zu den aus dem Stand der Technik bekannten Methoden besteht darin, dass
(i) der Test in einem Röhrchen durchgeführt werden kann, (ii) nur wenige Pipettierschritte notwendig sind und
(iii) keine technischen Hilfsmittel wie Mikroskop, Nephelometer, Photometer etc. zur Pathogendetektion notwendig sind.
Die erfindungsgemäßen Mittel und Verfahren werden im folgenden anhand einiger Beispiel näher erläutert. Beispiel 1
Eine 10%ige (w/w) Gelatine-Lösung in 2 ml 0,05 M Na-Phosphat-Puffer, pH 8.2, wird durch Erwärmen der Mischung auf 800C hergestellt. Danach wird die Lösung auf 450C gebracht. Zu dieser Lösung werden zunächst 0,5 ml eines nach einer Vorschrift von Shinkai et al. (Biocatalysis, Vol. 5, 61, 1991) hergestellten Magnetkolloides zugegeben. Es folgt die Zugabe von 0,5% (v/v) 12%iger Glutaraldehyd-Lösung. Die Suspension wird danach 2 Minuten bei 45°C im Ultraschallbad beschallt. Danach wird die resultierende Mischung in 60 ml, auf 45°C vorgewärmtes Pflanzenöl (Viskosität 84 cp), in dem 0.8% (v/v) Pluronic L61 , 0.8% (v/v) Tetronic 1 101 und 2.5% (v/v) Dehymuls FCE gelöst sind, gegeben und bei 6.000 U/Min, mit Hilfe eines Dispergierwerkzeuges (T25 Ultra-Turrax, IKA Werke, BRD) unter Stickstoff-atmosphäre 2 Minuten homogenisiert. Danach wird die Dispersion mittels Eiskühlung auf <10°C heruntergekühlt. Die Suspension läßt man unter leichtem Rühren über 3 Stunden bei Raumtemperatur abreagieren. Nach
Zugabe von 50 ml Petrolether wird die magnetische Fraktion mittels eines Neodym- Bor-Eisen Handmagneten abgetrennt und zehnmal abwechselnd mit Petrolether und Ethanol nachgewaschen. Danach erfolgt fünfmaliges Waschen mit PBS-Puffer. Es werden Polymerteilchen mit einer mittleren Größe von 0,943 μm gewonnen. Die gewonnene Partikelfraktion wird sodann in 3 ml 0,1 M Na-Phosphat-Buffer, pH 8.2, suspendiert und unter Zugabe von 0,5 ml 12%iger Glutaraldehyd-Lösung über einen Zeitrum von 2 Stunden bei Raumtemperatur aktiviert. Die Fraktion wird mehrfach mit bidest Wasser unter Zuhilfenahme der Magnetabtrennung gewaschen. Die gewaschene Fraktion wird in einer Mischung, bestehend aus 2 ml 0.05 M Phosphat- Puffer, pH 8.2, in dem 0,85 mg anti-Cord Factor (Trehalose-6,6 '-dimycolat)-IgG und 2 mg Cyanborhydrid gelöst sind, über einen Zeitraum von 3 Stunden unter leichtem Schütteln zur Reaktion gebracht. Es wird mehrfach mit bidest Wasser und PBS- Puffer, pH 7.2, nachgewaschen. Inkubation der gewonnenen Fraktion mit einer TBC infizierten Sputum Probe führt innerhalb von 30 Min. zu Bakterien-Magnetpartikel- Clustern, die sich mittels eines Handmagneten innerhalb von 250 Sek. als braunschwarzes Partikel-Aggiomerat an der Röhrchenwandung nachweisen lassen.
Beispiel 2
Einer 4 ml 25% (w/w) wäßrigen Dextranlösung (mittlere Molmasse 40.000) werden 1,2 ml 5 M NaOH und 3 ml MnZn-Ferrit-Suspension (BASF, Ludwigshafen, mittlere Teilchengröße 12 nm) zugesetzt. Die Mischung wird für 10 Min. unter Eiskühlung mit Ultraschall behandelt und anschließend mittels einer Spritze in 80 ml herkömmliches Baumwollsaatöl, das 0,3 g Polyoxyäthylen-Sorbitan-Monooleat enthält, eingespritzt. Es folgt nochmalige Ultrabeschallung für 3 Min. bei 00C. Unter Rühren (2000 U/Min.; KPG Rührer) werden 0,5 g Bromcyan, gelöst in 20 ml Äther, zugegeben. Nach 15 Min. werden die Magnetpartikel per magnetischer Abtrennung (Neodym-Bor-Eisen-Magnet) isoliert und mehrfach mit Äther und Äthanol abwechselnd gewaschen. Die gewonnenen Partikel weisen eine mittlere Größe von 4.8 μm und einen Magnetanteil von 28% auf. Die Magnetpartikelfraktion wird anschließend lyophilisiert und sodann mit einer Lösung, bestehend aus 3 ml absolutiertem Dimethylformamid (DMF) und 0,4 ml Hexamethylendiisocyanat, über einen Zeitraum von 30 Min aktiviert. Es folgt mehrfaches Waschen mit absolutiertem Äthanol und DMF. Die gewaschene Fraktion wird sodann mit 2 ml DMF, in dem 1 mM 6-Aminocapronsäure gelöst sind, über eine Zeitraum von 60 Min. bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht. Dem schließt sich mehrfaches Waschen mit bidest Wasser an. Der mehrfach mit Wasser gewaschene, carboxylierte Träger wird zweimal mit 0,005 M HCl inkubiert, zweimal mit bidest Wasser nachgewaschen und sodann mit 2 ml 20 mg N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoäthyl)- carbodiimid-methyl-p-toluolsulfonat enthaltendem 0,1 MES Puffer, pH 4.5, für 30 Min. bei Raumtemperatur aktiviert. Es wird fünfmal mit Eiswasser gewaschen, gefolgt von einer όstündigen Inkubation mit 0,45 mg anti-Lipoarabinomannan-IgG (GeneTex Inc. San Antonio, USA), das in 3 ml 0,05 M MES-Puffer, pH 6.0, gelöst ist. Das umgesetzte Produkt wird bei Raumtemperatur über einen Zeitraum von 2 Stunden mit 5 ml 0,05 M Tris/HCl-Puffer/1% Ethanolamin, pH 8.5 inkubiert und anschließend mehrfach mit bidest Wasser und sterilisiertem PBS-Puffer gewaschen. Inkubation der gewonnenen Magnetpartikel-Fraktion mit einer M. tuberculosis- enthaltenden Probe führt innerhalb eines Zeitraumes von 30 bis 60 Min. zu einem Bakterien-Magnetpartikel-Cluster, der visuell analog Beispiel 2 nachweisbar ist.
Beispiel 3
4 ml einer wäßrigen 10% (w/w) Hydroxypropyl-cellulose-Lösung werden mit 1,2 ml Magnetkolloid, das nach der Vorschrift von Shinkai et al. (Biocatalysis, Vol. 5, 61, 1991) hergestellt wurde, versetzt und 2 Min. in einem Ultraschallbad (60 W) unter Eiskühlung beschallt. Die Lösung wird mit 3 M NaOH auf pH 10.5 eingestellt. Sodann werden 120 μl Divinylsulfon zugegeben. Es folgt die Suspension unter Stickstoffzufuhr in 150 ml Olivenöl (Viskosität 95 cp), in dem 0,6% (w/w) Tween 80, 0,1% (w/w) Prisorine 3800 und 1 ,2% (v/v) Span 85 gelöst sind, mit Hilfe eines Dispergierwerkzeuges (Ultra-Turrax; 12.000 U/Min.). Der Dispergiervorgang wird für 10 Min. unter Stickstoffeinleitung (5 ml/Min.) fortgesetzt. Danach läßt man die Reaktionsmischung noch weitere 30 Min. unter leichtem Rühren bei 4°C abreagieren. Es erfolgt die Abtrennung der magnetischen Phase durch Aufgeben der Magnetfraktion auf eine mit Stahlwolle dichtgepackte Glassäule (Füllvolumen: ca. 5 ml; Innendurchmesser: 1 ,2 cm), die von einem ringförmigen Neodym-Bor-Eisen- Magneten umgeben ist. Das Retentat wird anschließend dreimal mit je 20 ml PBS- Puffer, pH 7.2, nachgewaschen. Es folgt Wegnahme des Magneten und Elution mit 5 ml PBS-Puffer. Es fallen Magnetpartikel mit einer mittleren Teilchengröße von 0,82 μm an. Das Produkt wird über einen Zeitraum von 5 Tagen lyophilisiert. Sodann werden 3 ml über Molekularsieb getrocknetes Dimethylsulfoxid, in dem 0,6 mM 4- Dimethylaminopyridin und 0,3 mM 2-Fluor-l-methyl-pyridinium-toluol-4-sulfonat gelöst sind, zugegeben. Reaktionszeit: 45 Min. bei Raumtemperatur. Das Produkt wird mehrfach abwechselnd mit absolutem Äthanol und Tetrahydrofuran und schließlich zweimal mit 0,05 M K-Phosphat-Puffer, pH 8.0, unter Zuhilfenahme der Magnet-Trennsäule gewaschen. Es wird anschließend mit 3 ml PBS-Puffer, pH 7.2, eluiert. Dem Eluat werden 0,5 ml desselben Puffers, in dem 35 μg anti-38 kDa IgG (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA) gelöst sind, zugesetzt. Reaktionszeit: 12 Stunden bei 4°C unter leichtem Schütteln. Zur Desaktivierung wird der Träger für 2 Stunden bei 40C mit 5 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer/1% Glycin, pH 8.5 gelöst ist, inkubiert. Nach Waschen mit bidest Wasser wird die Magnetfraktion anschließend 2 Stunden in 4 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer/5% Glycerin/ 0,1 % Serum Albumin, pH 7.5, aufbewahrt. Nach mehrfachem Waschen der Magnetpartikel mit bidest Wasser werden die Magnetpartikel in 2 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung dispergiert. 30 bis 60minütige Inkubation der gewonnenen Magnetpartikel-Fraktion mit einer Mykobakterien infizierten Probe ergibt einen Magnetpartikel-Pathogen- Cluster, der analog Beispiel 2 nachweisbar ist.
Beispiel 4
Eine Mischung, bestehend aus 7 ml 10 % (w/w) wäßrige Acrylamid-Lösung, 0,5 ml 30%ige N,N'-Methylenbisacrylamid und 2 ml vakuumdestillierte Acrylsäure, werden für 15 Min. mit Argon durchspült. Der Lösung werden anschließend 3,5 ml Magnetkolloid EMG 507, (Fa. FerroTec, USA) und 0,4 ml 5 N NaOH Lösung zugesetzt. Die Mischung wird 5 Min. unter Eiskühlung in einem Ultraschallbad (60 W) beschallt. Nach Zugabe von 1,2 ml 35%iger Ammoniumperoxodisulfat-Lösung zu der wäßrigen Phase wird diese in 300 ml Xylol, in dem 0,8% (v/v) Prisorine 3800 und 0,1% (v/v) Igepal 520 gelöst sind, unter Rühren (1200 U/Min.) und Eiskühlung sowie einem kontinuierlichen Argonstrom dispergiert. Nach 20 Sek. werden 0,4 ml N,N,N',N'-Tetrarnethyl-ethylendiamin zugefugt und die Mischung 8 Min. bei 100C weitergerührt. Danach läßt man die Mischung für weitere 20 Min. bei 15°C abreagieren. Es erfolgt die Abtrennung der magnetischen Phase durch Aufgeben der Magnetfraktion auf eine mit Stahlwolle dichtgepackte Glassäule (Füllvolumen: ca. 5 ml; Innendurchmesser: 1 ,2 cm), die von einem ringförmigen Neodym-Bor-Eisen- Magneten umgeben ist. Die retendierte Fraktion wird anschließend mit insgesamt 50 ml PBS-Puffer, pH 7.2, gewaschen (Fließgeschwindigkeit: 1 ml/Min). Die Magnetpartikel werden zweimal mit 10 ml 0,005 M HCl gewaschen und nach Entfernung des Magneten durch Aufgabe von 5 ml 0,1 M Morpholino- ethansulfonsäure-Puffer (MES), pH 4.7, (Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/Min) von der Trennsäule eluiert. Es fallen Magnetpartikel mit einer mittleren Teilchengrößen von 645 nm an. Dem Eluat werden 0,5 mM N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoäthyl)- carbodiimid-methyl-p-toluolsulfonat und 1 mM N-Hydroxysuccinimid zugegeben; Reaktionszeit: 30 Min. bei Raumtemperatur. Nach der Aktivierung wird der Träger auf die Magnet-Trennsäule aufgegeben und mit insgesamt 10 ml Eiswasser gewaschen. Die gewaschene Magnetfraktion wird nach Wegnahme des Magneten mit 4 ml MES-Puffer, pH 5.5, eluiert und in je zwei gleiche Partikel- Fraktionen aufgeteilt. Die beiden Fraktionen werden mit je 1 ml bidest Wasser, in dem 450 μg anti-INF-γ-IgG (MAI-23837; ABR-Affinity BioReagent Inc., USA) und 450 μg anti- INF-γ-IgG (MA 1-37933) gelöst sind, über einen Zeitraum von 6 Stunden bei Raumtemperatur 4°C inkubiert. Es wird danach mit 20 ml PBS-Puffer/0,5% Tween 20, pH 7.2, gewaschen und die Magnetfraktion mit 5 ml 0,05 M Tris/HCl-Puffer/1% Ethanolamin, pH 8.5, eluiert. Das Eluat wird für 2 Stunden in dieser Elutionslösung belassen. Nach Waschen des Trägers mit 40 ml PBS-Puffer, pH 7.2, unter Zuhilfenahme der Magnettrennsäule wird mit 4 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung eluiert. Beide Eluate können nun mit einer mit ESAT-6 oder CFP-10 stimulierten Zellprobe, die nach einer Vorschrift von T. Meier et al. (Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., Vol. 24, 529, 2005) präpariert wurde, zum Nachweis des IFN-γ eingesetzt werden. Dazu werden 10 x 106 Teilchen für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Präsenz von IFN-γ manifestiert sich in einem Magnetpartikel-Cluster, der durch Anlegen eines konventionellen Handmagneten (Neodym-Bor-Eisen ) an das Proberöhrchen nach 30 bis 45 Sek. an der Wandung sichtbar wird.
Beispiel 5
In 5 ml Ethylenglykol werden 0,8% Polyvinylalkohol (Molmasse 84 kDa) bei 16O0C gelöst. Nachdem die Lösung auf 800C heruntergekühlt ist, werden der Lösung 1,5 ml Ferrofluid 507 (Fa. Ferro Tee, USA) zugesetzt. Es folgt eine zweiminütige Behandlung im Ultraschallbad bei 8O0C. Danach läßt man die Dispersion auf 700C herunterkühlen. Die Lösung wird sodann in 60 ml auf 700C vorgeheiztem Rapsöl (Viskosität 140 cp), in dem 1,2% (w/w) Pluronic 6200 und 0,5% Prisorine 3800 gelöst sind, unter Rühren (1000 U/Min) für zwei Minuten suspendiert. Danach wird das Rührgefäß mit Eiswasser heruntergekühlt. Nach ca. 4 Minuten fallen periförmige Teilchen aus. Es wird 15 Minuten unter Eiskühlung weitergerührt. Danach werden 50 ml Petrolether zugefügt und die magnetische Teilchenfraktion unter Zuhilfenahme eines Neodym-Bor-Eisen Handmagneten abgetrennt. Es wird mehrfach mit
Petrolether, Methanol und Eiswasser nachgewaschen. Es fallen Partikel mit einer mittleren Teilchengröße von 8,6 μm an.
In analoge Weise wie oben beschrieben, wird eine zweite Partikelfraktion hergestellt, die anstelle des Magnetkolloides 2,5 mg Methylenblau enthält. Die Aufreinigung der nicht-magnetischen Fraktion geschieht in Analogie zur magnetischen Fraktion mit dem Unterschied, dass jeweils ein Zentrifugationsschritt angewandt wird. Die gewonnenen Fraktionen werden sodann mit je 2,5 ml Epichlorhydrin und 5 ml 3 M NaOH Lösung zwei Stunden bei 600C umgesetzt. Danach erfolgt intensives Wachen mit Äthanol und bidest Wasser unter Anwendung eines magnetischen Abtrennschrittes bzw mittels Zentrifugation.
Beide Fraktionen werden separat wie folgt mit einem gegen das Mycobacterium tuberculosis 38 kDa (HTM83) Protein gerichteten Antikörpers (Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA) immobilisiert: 2 ml einer 0,5 M K-Phosphat- Puffer/2.5 M Ammoniumsulfat, pH 8.5, in dem 70 μg IgG gelöst sind, wird über eine Zeitraum von 24 Stunden bei Raumtemperatur mit den Partikelfraktionen zur Reaktion gebracht. Es folgt βstündige Inkubation mit 4 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer/1% Ethanolamin, pH 8.5, gefolgt . Es folgt mehrfaches Waschen mit sterilisiertem PBS- Puffer, pH 7.2. 30 bis όOminütige Inkubation der gewonnen Magnetpartikel- und Farbpartikel-Fraktion mit einer Mykobakterien-infizierten Probe ergibt einen gefärbten Magnetpartikel-Bakterien-Cluster, der analog Beispiel 2 nachweisbar ist.

Claims

Patentansprüche
1. Polymere, Magnetkolloide- und/oder visuelle Marker-enthaltende Nano- und M ikro partikel für die Tuberkulosediagnostik, dadurch gekennzeichnet, dass die polymeren Partikel mit einem oder mehreren Bioliganden beschichtet sind, die an
Zellwand Strukturen, Antigene von Mycobacterium tuberculosis oder an infektionsbedingt ausgeschüttete Antigene komplementär binden.
2. Polymere Nano- und Mikropartikel, gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die visuellen Marker wasserlösliche Farbstoffe, wasserlösliche fluoreszierende Substanzen oder Quantum Dots sind.
3. Polymere Nano- und Mikropartikel, gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerpartikel mit Bioliganden koppelnde, reaktive Gruppen aufweisen.
4. Polymere Nano- und Mikropartikel, gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die koppelnden Gruppen mit Antikörpern, Antikörperfragmenten (Fab, F(ab')2), künstlich hergestellten Antikörpern („Diabodies", „Triabodies" oder "Minibodies"), Einzelkettenmoleküle (scFv), abgewandelten Antikörpern,
Antikörperkonjugaten, Antigenen, Proteinen, Glycoproteinen oder Oligosacchariden umgesetzt sind.
5. Polymere Nano- und Mikropartikel, gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper, Antikörperfragmente, Antigene, künstlich hergestellten
Antikörper, abgewandelten Antikörper, Antikörperkonjugate, Proteine, Glycoproteine oder Oligosaccharide spezifisch an Lipoarabinomannane, Mykolsäuren, Arabinogalactane, Peptidoglycolipide, Trehalose-6-Phosphat Phosphatase, Cord Faktor, Glykolipide, das 19 kDa-Antigen, das 38 kDa- Antigen, das 14 kDa-Antigen (TB68 epitope), das heal shock protein HSP 65, das 14 kDa-Antigen, das 27-kDa- Antigen, das 25-kDa- Antigen oder das 40 kDa- Antigen binden.
6. Polymere Nano- und Mikropartikel, gemäß Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die koppelnden Gruppen mit zwei Antikörpern, Antikörperfragmenten oder künstlichen Antikörpern, die gegen zwei unterschiedliche Epitope des IFN-γ gerichtet sind, umgesetzt sind.
7. Polymere Nano- und Mikropartikel, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymere aus der Gruppe der Polysaccharide, Polycyanacrylate, Polyacrylate, Dextran-gepfropften Polyaminosäuren (Polyaminosäure-g-Dextran), Stärke, Heparin, Dextransulfat, Agarose, Alginate, Hyaluronsäuren, Chitosane, Cellulosederivate, Pullulane, Hydroxypropyl- cellulosen, Dextran-g-PolyethylenglykoI-Alkyläther, Pektine, Dextrane, Polylactide, Polyglycolide, Polyurethane, Polyethylenimine, Gelatine, Caseine, Collagene, Albumine, Fibrinogene oder Polyaminosäuren, Silicagele, Polyvinylalkohole, Polyetherester, Polyacroleine, Polyester, Polyacrylsäuren, Poly-N-Isopropylacrylamide, Poly-N-substituierte Acrylamide, PoIy-N- substituierte Methacrylamide, Poly(ε-caprolactone), Polyoxyethylen- oxypropylene, linearen Copolymeren derselben, Pfropfcopolymeren oder Blockcopolymeren derselben ausgewählt ist.
8. Polymere Nano- und Mikropartikel, gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymere oder Copolymere oder Pfropfcopolymere kationische Gruppen in Form sekundärer, tertiärer oder quaternärer Aminofunktionen aufweist.
9. Polymere Nano- und Mikropartikel, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel eine Größe von 100 nm bis 600 nm aufweisen.
10. Polymere Nano- und Mikropartikel, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel eine Größe von 0,8 bis 2000 μm aufweisen.
1 1. Polymere Nano- und Mikropartikel, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerteilchen mit einer bi- oder trifunktionellen Substanz vernetzt sind.
12. Polymere Nano- und Mikropartikel, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 1 1, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Kolloide ferro-, ferri- oder superparamagnetische oder Ferrite oder magnetische Substanzen mit einer Curie- Temperatur im Bereich von 40°C bis 500°C sind.
13. Polymere Nano- und Mikropartikel, gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der magnetische Anteil in den Polymerpartikeln 10 bis 60% (w/w) beträgt.
14. Polymere Nano- und Mikropartikel, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die visuellen Marker in einer Konzentration von 0,1 bis 5% (w/w) in dem Polymerpartikel vorliegen.
15. Polymere Nano- und Mikropartikel, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Partikel mittels Emulsionspolymerisation,
Suspensionspolymersiation, Suspensions- Vernetzung oder der Präzipitation hergestellt sind.
16. Verfahren zur Diagnose von Tuberkulose mit Hilfe magnetischer und/ oder visuelle Marker-enthaltende Nano- und/oder Mikropartikel, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die polymeren Nano- und/oder Mikropartikel mit einer Sputum-, Magensaft-, Urin-, Ejakulat-, Punktat- oder Gewebeprobe inkubiert werden und durch spezifische Bindung an die
Mykobakterien (M tuberculosis) oder an durch die Mykobakterien-Infektion freigesetzten Antigene einen visuell detektierbaren magnetischen und/oder gefärbten Partikel-Cluster bilden.
17. Verfahren zur Diagnose von Tuberkulose, gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die polymeren Nano- oder Mikropartikel alleine oder in Kombination mit den Markerpartikeln eingesetzt werden.
18. Verfahren zur Diagnose von Tuberkulose, gemäß Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass zwei polymere Nano- oder Mikropartikelfraktionen mit je einem gegen ein unterschiedliches Epitop des IFN-γ gerichteten Antikörper beschichtet und mit einer infizierten und mit M. tuberculosis Antigenen sensibilisierten Probe inkubiert werden.
19. Verfahren zur Diagnose von Tuberkulose, gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die IFN-γ Freisetzung durch Inkubation einer mit M. tuberculosis infizierten Probe mit den M. tuberculosis Antigenen ESAT-6 und/oder CFP-10 ausgelöst wird.
20. Verwendung von magnetischen und/oder gefärbten nano- und/oder mikropartikulären Teilchen alleine oder in Kombination gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 als Mittel für die Tuberkulose Diagnostik.
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