ES2283071T3 - Modulacion de la carga de medicamenteos en liposomas multivesiculares. - Google Patents
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Abstract
Un proceso para controlar la carga de un agente biológicamente activo a un liposoma que incluye: (a) Modulación de la carga de un agente biológicamente activo en un liposoma por ajuste de la osmolaridad de una solución acuosa en la cual se disuelve el agente, donde la osmolaridad de la solución acuosa es aumentada para disminuir la carga de agente, o disminuida para aumentarla; y luego (b) Encapsulamiento de la solución acuosa en el liposoma.
Description
Modulación de la carga de medicamentos en
liposomas multivesiculares.
La presente invención se relaciona con un método
para controlar la carga de agentes activos en los liposomas. Más
particularmente, la presente invención se relaciona con métodos para
modular la carga de agentes activos en liposomas
multivesiculares.
El tratamiento óptimo con muchos medicamentos
requiere que el nivel del medicamento se mantenga a un valor
especificado durante un periodo de tiempo prolongado. Por ejemplo,
un tratamiento anticáncer óptimo con antimetabolitos de células de
ciclo específico requiere el mantenimiento de un nivel citotóxico
del medicamento durante un periodo de tiempo prolongado. La
citarabina es una droga anticáncer altamente dependiente del esquema
de suministro. Debido a que esta droga mata las células solo cuando
éstas se encuentran sintetizando ADN, se requiere una prolongada
exposición a concentraciones terapéuticas de la droga para lograr un
efecto terapéutico óptimo. La efectividad terapéutica de tales
agentes a veces se complica por el hecho de que su vida media, luego
de una dosis intravenosa o subcutánea, puede ser tan corta como
solo unas pocas horas. Para lograr efectos terapéuticos óptimos
contra las células cancerosas con un medicamento de fase específica
de ciclo celular como la citarabina existen dos requerimientos
principales: primero, las células cancerígenas tienen que estar
expuestas a una alta concentración de la droga sin que se haga un
daño significativo irreversible a las células huésped; y segundo,
el tumor tiene que estar expuesto a la droga durante un periodo de
tiempo prolongado con el fin de maximizar el número de células
cancerígenas contactadas durante la síntesis del ADN, la porción
susceptible del ciclo de proliferación celular. Esta clase de
tratamiento requiere una alta carga de medicamento en una
formulación de liberación lenta.
Otros ciertos tipos de drogas son tan tóxicas
que es importante mantener un nivel bajo de las mismas durante un
periodo de tiempo extendido. Por ejemplo, la amikacina es un
antibiótico aminoglicósido con una actividad clínicamente
significativa contra cepas de ambas bacterias, gram negativas y gram
positivas. Bajo procedimientos terapéuticos existentes la droga es
administrada normalmente mediante ruta intravenosa o intramuscular
en un esquema de una o dos veces por día. La dosis clínica más
comúnmente usada es 15 mg/kg/día, que es equivalente a una dosis
diaria máxima recomendada de 1g por día. Sin embargo, la
administración del medicamento mediante inyecciones espaciadas
resulta en una exposición sistémica a los pacientes y, dependiendo
de la droga, en un riesgo potenciado de efectos tóxicos
colaterales. En consecuencia, una preparación de punto local y lento
suministro para el tratamiento de infecciones tales como las
confinadas a una región local de tejido suave o hueso sería
ventajosa para aumentar los niveles de la droga en tejidos locales,
en comparación con dosis sistémicas terapéuticas, a la vez que para
reducir o evitar la toxicidad sistémica de la droga libre. Si la
droga es altamente tóxica o el régimen de tratamiento requiere una
dosis terapéutica, es beneficiosa una formulación de liberación
lenta.
Una estrategia que ha sido empleada para proveer
composiciones de liberación controlada de la droga es la
encapsulación liposómica. Entre los principales tipos de liposomas,
los liposomas multivesiculares (Kim, et al., Biochim. Biophys.
Acta; 728: 339-348, 1983) son diferentes de los
liposomas unilamelares (Huang, Biochemistry; 8:
334-352, 1969; Kim, et al., Biochim. Biophys.
Acta; 646: 1-10, 1981), de los liposomas
multilamelares (Bangham, et al., J. Mol. Bio., 13:
238-252, 1965) y de los liposomas plurilamelares
(Patente U.S Nº 4'522.803). En contraste a los liposomas
unilamelares, los multivesiculares contienen múltiples cámaras
acuosas. En contraste a los liposomas multilamelares, las múltiples
cámaras acuosas de los liposomas multivesiculares no son
concéntricas.
El arte anterior también describe métodos para
la producción de liposomas multivesiculares (Kim, et al.,
Biochim. Biophys. Acta, 728: 339-348, 1983).
Sin embargo se comprobó que la eficiencia de encapsulación de
algunas moléculas pequeñas tales como la citosina arabinosa,
también conocida como citarabina o Ara-C, es
relativamente baja y la rata de liberación de moléculas
encapsuladas en fluidos biológicos es más rápida que lo que se desea
desde el punto de vista terapéutico. EP 0 280 503 B1 revela un
método desarrollado para controlar la tasa de liberación de
moléculas encapsuladas de los liposomas multivesiculares donde un
clorhidrato es introducido durante el proceso de encapsulación con
el fin de controlar la tasa de liberación en los fluidos biológicos
(del agente activo). Investigación adicional, revelada en WO
95/13796, ha mostrado que la tasa de liberación de agentes desde
los liposomas multivesiculares en plasma humano puede ser controlada
introduciendo un ácido no clorhídico a la solución acuosa en la
cual el agente se disuelve antes de formar el liposoma
multivesicular.
La patente US Nº 5'077.056 revela estudios que
muestran que la tasa de liberación del agente biológico encapsulado
desde el liposoma al ambiente acuoso, puede ser modulado
introduciendo protonóforos o ionóforos a los liposomas para crear
un potencial de membrana. Adicionalmente se conoce un método
(Patente U.S Nº 5'186.941) para controlar la rata de liberación de
los medicamentos a partir de composiciones vesiculares donde los
liposomas que contienen un agente terapéutico encapsulado son
suspendidos en una solución que contiene suficiente soluto para
suministrar una osmolaridad substancialmente isotónica con respecto
a la de la solución en el interior de las vesículas, e hipertónica
con respecto al suero fisiológico. En los liposomas
multivesiculares también se sabe (WO 96/08253) que controla la tasa
de liberación de agentes activos introduciendo un espaciador
osmótico en la solución acuosa en la cual el agente activo se
disuelve antes de la formación de los liposomas
multivesiculares.
Adicionalmente a los agentes biológicamente
activos y a los ácidos o espaciadores osmóticos cuya intención es
la de controlar la rata de liberación del agente biológicamente
activo de los liposomas, es práctica común el coencapsular
compuestos adicionados para cumplir cualquiera de un número de
funciones de soporte. Por ejemplo, ciertos compuestos
biológicamente activos retienen su actividad solamente cuando se les
mantiene a un determinado pH. Así, los ácidos o soluciones
amortiguadoras a menudo son necesariamente encapsuladas,
adicionalmente al agente activo, con el fin de controlar el pH del
ambiente del medicamento. En otros casos se incorpora un contraión
para aumentar la solubilidad de un agente biológicamente activo que
presenta una baja solubilidad.
Estos métodos para la producción de
formulaciones liposómicas con características de lenta liberación
algunas veces han resultado ser incompatibles con el propósito de
producir liposomas que contengan una alta carga de agente activo
con buena eficiencia de encapsulación de tal manera que sea poca la
pérdida del costoso agente activo al no lograrse su captura dentro
de los liposomas.
De esta manera existe la necesidad de nuevos
métodos para la producción de liposomas, por ejemplo liposomas
multivesiculares (LMVs) que permitan el control de la carga del
medicamento, ya sea alta o baja, mientras que se mantenga la
liberación lenta deseable del agente activo hacia los fluidos
biológicos y de almacenamiento. De interés particular es el
desarrollo de formulaciones de alta carga y liberación controlada
para péptidos y proteínas. También existe la necesidad de nuevos
métodos para alcanzar estos objetivos sin sacrificar la alta
eficiencia de encapsulación con el fin de evitar la pérdida de
costosos agentes activos tales como drogas y proteínas
terapéuticas.
La presente invención provee un método para
modular el cargado de agente biológicamente activo en formulaciones
liposómicas. La concentración del agente biológicamente activo en
el producto final es modulada ajustando la osmolaridad del
componente acuoso en el que se disuelve el agente activo para su
encapsulación. Una relación inversa entre la osmolaridad y la carga
del fármaco ha sido descubierta donde la carga del agente activo
aumenta al disminuir la osmolaridad del componente acuoso. Así, se
pueden lograr liposomas, ya sea con alta carga de fármaco o con
baja carga de fármaco, mediante manipulación de la osmolaridad de la
solución que contiene el medicamento antes de la encapsulación del
mismo. Más aún, se ha descubierto que la modulación de la carga del
fármaco, particularmente para alcanzar una alta carga de
medicamento, puede lograrse sin sacrificar ni la alta eficiencia de
encapsulación en el método de fabricación, ni la liberación
controlada deseable del fármaco a partir del producto final en
uso.
Los liposomas obtenidos por el método de esta
invención logran resultados enormemente mejorados suministrando una
cantidad deseable del agente activo dentro de un volumen dado de la
formulación inyectable o implantable de liposoma y suministra la
liberación sostenida del fármaco a un nivel terapéutico deseable
cuando es introducido a un lugar in vivo. El principio
general seguido para modular la carga de agentes activos en
formulaciones liposómicas es ilustrado aquí por referencia a la
fabricación de liposomas multivesiculares (LMVs).
La carga de fármacos en los liposomas se modula
controlando la osmolaridad de la solución acuosa que es encapsulada
durante la fabricación de los liposomas. La osmolaridad es la suma
de las concentraciones molares de los solutos presentes en la
solución acuosa, incluyendo las sustancias biológicamente activas y
cualquier molécula de soporte, tal como excipientes osmóticos
utilizados para frenar la tasa de agente activo. Si el soluto está
presente en una forma disociada, ionizada o agregada, la osmolaridad
se define como la suma de las concentraciones molares de las formas
disociada, ionizada o agregada. La contribución hecha por cualquier
soluto en solución a la osmolaridad de la solución es
aproximadamente equivalente a la concentración del soluto en
solución dividida por su peso molecular. Así, como principio
general, entre mayor sea el peso molecular de un soluto, menor es
su osmolaridad y menor su contribución a la osmolaridad total de la
solución.
Es bien sabido que el nivel de carga de fármaco
en los liposomas es directamente proporcional a la concentración
del agente biológicamente activo. De acuerdo a esto, un alto nivel
del agente activo tiene que ser disuelto en una solución acuosa que
va a ser encapsulada con el fin de obtener liposomas con un alto
nivel de carga de fármaco. Sin embargo, la carga no siempre puede
ser aumentada por adición de una concentración adicional del agente
activo. Solutos diferentes al agente activo, presentes en la
solución acuosa, utilizados durante la obtención de los liposomas,
tienden a reducir la cantidad del agente biológicamente activo que
puede ser cargada en los liposomas. Por lo tanto si la solución
también contiene excipientes osmóticos, necesarios para regular la
solubilidad o bioactividad del agente activo, los efectos benéficos
de los excipientes osmóticos de soporte en la solución tienen que
ser balanceados con relación a sus efectos adversos sobre la carga
del fármaco.
Para potenciar la carga del fármaco, la
osmolaridad de la solución acuosa puede ser disminuida sin disminuir
la concentración del agente activo disuelto en ella, ya sea
reduciendo la concentración de los excipientes osmóticos o
reemplazando un excipiente osmótico de bajo peso molecular por un
excipiente osmótico de mayor peso molecular y de función comparable
o haciendo ambas cosas. Por ejemplo, si el excipiente osmótico es
una solución amortiguadora utilizada para lograr la solubilidad de
una concentración particular de un agente biológicamente activo, se
selecciona una solución amortiguadora de alto peso molecular con el
fin de obtener una alta carga del agente activo. Por el contrario,
para disminuir la carga en tal situación se emplearía un tampón de
menor peso molecular.
Aunque estos principios son operativos en la
obtención de todo tipo de liposomas, se ilustran aquí en
formulaciones de LMV que contienen varios agentes activos tales
como citarabina, leuprolida, encefalina, morfina y factor de
crecimiento I (IGF-I) tipo insulina. En estos
estudios se encontró que, para cualquier concentración seleccionada
de agente biológicamente activo, la carga de fármaco durante la
fabricación puede ser modulada efectivamente en LMVs variando las
contribuciones hechas por los excipientes osmóticos en la solución a
la osmolaridad total de un primer componente acuoso. Este principio
es ilustrado en los presentes ejemplos ajustando la concentración
de un excipiente osmótico modelo comúnmente usado en las
formulaciones liposómicas, ya sea sacarosa o glicilglicina. Por
este método las formulaciones LMV pueden ser producidas con un rango
más amplio de niveles de carga para cualquier agente biológicamente
activo.
En el método de fabricación de liposomas
multivesiculares (LMVs) que tienen carga controlada de fármaco, un
componente lipídico que contiene al menos un lípido amfipático y un
lípido neutro disueltos en uno o más solventes orgánicos se mezcla
con un primer componente acuoso inmiscible que contiene uno o más
agentes biológicamente activos para ser encapsulados y,
opcionalmente, uno o más excipientes osmóticos tales como una
molécula de soporte. El cargado del agente activo a la formulación
final dependerá de la osmolaridad total del primer componente
acuoso, la cual es la suma de las osmolaridades aportadas por cada
uno de los solutos disueltos en el primer componente acuoso,
incluyendo al agente activo y cualquier excipiente osmótico.
Una vez que la osmolaridad del primer componente
acuoso ha sido ajustada para alcanzar la carga deseada del agente
activo en el producto final, se forma una emulsión agua en aceite
mediante el mezclado de los dos componentes inmiscibles. La
emulsión agua en aceite se mezcla entonces con un segundo componente
acuoso inmiscible para formar esférulas de solvente. El solvente
orgánico es finalmente removido de las esférulas solventes, por
ejemplo, por evaporación para hacer que formen agregados en los
LMVs. En la etapa final del proceso se suspenden los LMVs en un
medio acuoso, tal como una solución salina normal. Una composición
que contenga una dosis terapéuticamente efectiva de agente activo,
en una base peso a volumen de la formulación, se puede obtener
incrementando o disminuyendo el volumen del medio en el cual los
LMVs que contienen el agente activo son suspendidos.
Para mantener una alta eficiencia de
encapsulamiento (o porcentaje de producido) durante la formulación
de los LMVs y para asegurar que la liberación del agente activo en
uso se hace a una tasa terapéutica efectiva baja, el componente
lipídico contiene uno o más lípidos amfipáticos con, desde
aproximadamente 13 a unos 28, por ejemplo entre unos 18 y 22,
átomos de carbono en la cadena carbonada.
La Figura 1 es una gráfica que muestra el
porcentaje de IGF-I retenido en los LMVs durante
incubación in vitro (tasa de liberación) durante 7 días, en
plasma, a 37ºC. Durante la fabricación el concentrado utilizado,
sacarosa o glicilglicina, como excipiente osmótico fue variado en
el componente acuoso para controlar la carga del fármaco. \nabla
= 80 mg/mL IGF-I y 2,5% p/v sacarosa (113,5 mOsm); =
80 mg/mL IGF-I y 1% p/v glicilglicina (113,5 mOsm);
+ = 50 mg/mL IGF-I y 1% p/v sacarosa (63,5 mOsm).
Las barras de error representan la desviación estándar.
La Figura 2 es una gráfica que representa la
concentración de IGF-I durante 8 días, en suero,
(ng/mL) de ratas macho luego de una inyección subcutánea de 10 mg
de LMVs que contenían 80 mg/mL IGF-I y 2,5% p/v de
sacarosa (113,5 mOsm) en el componente acuoso. Los datos
representan el promedio de datos para tres ratas.
En esta invención, se provee un método donde la
cantidad de agente biológicamente activo encapsulado por unidad de
volumen de formulación liposómica se modula ajustando la osmolaridad
del componente acuoso encapsulado que contiene la droga. En éste
método una reducción en la osmolaridad del componente acuoso en el
que se disuelve el agente activo antes de la encapsulación produce
una concentración aumentada del agente activo en la suspensión
final LMV en base peso a volumen y viceversa.
Hay por lo menos tres tipos de liposomas. El
término "liposomas multivesiculares (LMV)", tal como se usa en
las especificaciones y reivindicaciones, significa vesículas
lipídicas microscópicas artificiales que incluyen membranas
lipídicas con múltiples cámaras acuosas no concéntricas. En
contraste, los "liposomas o vesículas multilamelares (VML)"
tienen múltiples membranas concéntricas estilo "cebolla", entre
las cuales hay compartimientos acuosos concéntricos en forma de
cascarón. Los liposomas multilamelares y los liposomas
multivesiculares característicamente tienen diámetros medios que se
sitúan en el rango de los micrómetros, usualmente entre 0,5 y 25
\mum. El término "Liposomas o vesículas unilamelares (VUL)"
tal como se usa aquí se refiere a estructuras liposómicas que
poseen una sola cámara acuosa, usualmente con un diámetro medio en
un rango entre 20 y 500 nm.
Los liposomas multilamelares y unilamelares
pueden ser obtenidos por varios métodos relativamente simples. El
arte anterior describe un número de técnicas para producir VUL y VML
(por ejemplo la Patente U.S Nº 4'522.803 a Lenk; 4'310.506 a
Baldeschweiler; 4'235.871 a Papahadjopoulos; 4'224.179 a Schneider;
4'078.052 a Papahadjopoulos; 4'394.372 a Taylor; 4'308.166 a
Marchetti; 4'485.054 a Mezei y 4'508.704 a Redziniak).
En contraste, la producción de liposomas
multivesiculares requiere varias etapas del proceso. Brevemente, el
método preferido para hacer LMV es el siguiente: En el primer paso
se genera una emulsión de "agua en aceite" disolviendo por lo
menos un lípido amfipático y por lo menos un lípido neutro en uno o
más solventes orgánicos volátiles para el componente lipídico. Al
componente lipídico se agrega un primer componente acuoso inmiscible
que contenga un agente biológicamente activo que vaya a ser
encapsulado y una o más moléculas de soporte. i.e. excipientes
osmóticos que suministren propiedades útiles y benéficas a los LMVs.
La mezcla es emulsificada y luego mezclada con un segundo
componente acuoso inmiscible para formar una segunda emulsión. La
segunda emulsión se mezcla, ya sea mecánicamente, mediante energía
ultrasónica, por atomización y afines o por combinación de los
métodos anteriores, con el fin de obtener esférulas solventes
suspendidas en el segundo componente acuoso. Las esférulas
solventes contienen múltiples gotas acuosas con el agente
biológicamente activo, que va a ser encapsulado, disuelto en ellas
(ver Kim et al., Biochem. Biophys. Acta, 728:
339-348, 1983). Para una amplia revisión de varios
métodos de preparación de VUL y VML ver Szoka, et al. Ann. Rev.
Biophys. Bioeng. 9: 465-508, 1980.
El término "esférula solvente" tal como se
usa en las especificaciones y reivindicaciones significa una gota
esferoide microscópica de un solvente orgánico, dentro de la cual
hay múltiples gotas más pequeñas de una solución acuosa. Las
esférulas solventes están suspendidas y completamente inmersas en
una segunda solución acuosa.
El término "lípido neutro" significa un
aceite o grasa que no tiene capacidad de formar membrana por sí
misma y a la que le falta un grupo "cabeza" hidrofílico.
El término "lípido amfipático" significa
una molécula que tiene una cabeza hidrofílica y una cola hidrofóbica
y que presenta la capacidad de formar membrana.
El término "lípido zwitteriónico" significa
un lípido amfipático con una carga neta cero a pH 7,4.
El término "lípido aniónico" significa un
lípido amfipático con una carga neta negativa a pH 7,4.
El término "lípido catiónico" significa un
lípido amfipático con una carga neta positiva a pH 7,4.
Para la obtención de liposomas multivesiculares
se requiere que al menos un lípido amfipático y un lípido neutro
sean incluidos en el componente lipídico. Los lípidos amfipáticos
pueden ser zwitteriónicos, aniónicos o catiónicos. Ejemplos de
lípidos amfipáticos zwitteriónicos son las fosfatidilcolinas,
fosfatidiletanolaminas, esfingomielinas, etc. Ejemplos de lípidos
amfipáticos aniónicos son los fofatidilgliceroles,
fosfatidilserinas, fosfatidilinositoles, ácidos fosfatídicos, etc.
Ejemplos de lípidos amfipáticos catiónicos son el
diaciltrimetil-amoniopropano y etil
fosfatidilcolina. Ejemplos de lípidos neutros incluyen diglicéridos
como por ejemplo dioleína, dipalmitoleína, y caprilincaprín
diglicéridos; triglicéridos tales como trioleína, tripalmitoleína,
trilinoleína, tricaprilina y trilaurina; aceites vegetales tales
como aceite de soya; escualeno; tocoferol; y combinaciones de éstos.
Adicionalmente, el colesterol o esteroles vegetales pueden ser
empleados para la fabricación de liposomas multivesiculares.
Tal como se utiliza aquí, el término "agente
biológicamente activo" o "agente activo", cuando se utiliza
para describir agentes presentes en las cámaras de los liposomas
multivesiculares o en la solución acuosa utilizada durante la
obtención de los liposomas, incluye agentes que poseen actividad
biológica orientada en el tratamiento a un estado de enfermedad
particular, ya sea en la forma liberada por la vesícula o en una
forma que la haga activa luego de ser liberada de la cámara
vesicular. Por ejemplo, agentes biológicamente activos incluyen
fármacos y pro-fármacos que son convertidos, luego
de la interacción con una enzima, en un grupo activo con actividad
terapéutica. Los insecticidas, pesticidas y agentes con aplicación
cosmética deseable también son cobijados por el término "Agente
biológicamente activo".
El término "excipiente osmótico" significa
cualquier molécula soluto biológicamente compatible en una solución
acuosa que no es el agente biológicamente activo. Tanto los
electrolitos como los no electrolitos actúan como excipientes
osmóticos. Para determinar si una molécula en particular funcionará
como un excipiente osmótico o para determinar la concentración del
excipiente osmótico en una solución, por ejemplo una encapsulada
dentro de un liposoma multivesicular, se tiene que considerar si
bajo las condiciones al interior de la solución (por ejemplo pH),
la molécula se encuentra ionizada parcial o completamente. También
se debe determinar si tales iones permearán la membrana lipídica
(Mahendra K. Jain, van Nostrand Reinhold Co., The Bimolecular
Lipid Bilayer Membrane, 1972, 470 pp.). Alguien experto en el
arte apreciará que para su uso en la presente invención, el
excipiente osmótico tiene que ser seleccionado de tal forma que se
evite aquellos probadamente tóxicos o perjudiciales a un sujeto
sometido a terapia con el liposoma. Aquellos con experiencia en el
arte pueden evaluar fácilmente la adecuabilidad de un excipiente
osmótico dado para uso en la presente invención sin tener que
recurrir a experimentación innecesaria.
Ciertos excipientes osmóticos presentan
actividad biológica inherente y muchos facilitan la actividad
biológica del agente biológicamente activo. Por ejemplo, los iones
calcio pueden ser co-encapsulados como contraiones
con el fin de aumentar la vida de almacenamiento o para facilitar la
biodisponibilidad de un fármaco, pero no son suficientes para
llevar a cabo la utilidad terapéutica u otra de la formulación LMV.
Adicionalmente pueden estar presentes varios estabilizantes,
ciertos agentes comúnmente clasificados como excipientes pueden en
realidad poseer actividad biológica desde muy modesta hasta muy
significativa. Por ejemplo, el excipiente común manitol puede
actuar también biológicamente como un diurético. Aún el agua puede
actuar biológicamente para curar la deshidratación, pero cuando
estos compuestos se usan como excipientes osmóticos en lugar de
como agentes activos, son relativamente intercambiables con otros
que realizan la misma función de soporte.
Los excipientes osmóticos, que pueden ser
utilizados para formar liposomas multivesiculares y para modular la
carga del agente encapsulado de los liposomas multivesiculares
incluyen, pero no están limitados a, glucosa, sacarosa, trehalosa,
succinato, glicilglicina, ácido glucónico, ciclodextrina, arginina,
galactosa, manosa, manitol, glicina, lisina, citrato, sorbitol,
dextrán y combinaciones adecuadas de éstos. La Tabla 1 abajo,
compara la osmolaridad de soluciones de sacarosa y de glicilglicina
a diferentes concentraciones.
| ^{1}Los datos para la sacarosa son tomados de Handbook of Physics and Chemistry, 67^{ava} edición | |
| ^{2}Los datos para la glicilclicina son calculados con base a la concentración molar. |
Aquellos con experiencia ordinaria en el arte
pueden corroborar y dilucidar varias combinaciones de excipientes
que pueden ser utilizados en las vesículas de la invención sin tener
que recurrir a experimentación innecesaria.
Tal como se emplea aquí, el término "cantidad
o nivel terapéuticamente efectivo" significa la cantidad de un
agente biológicamente activo necesaria para inducir un efecto
farmacológico deseado. La cantidad puede variar grandemente de
acuerdo a la efectividad del agente activo en particular, la edad,
el peso y la respuesta del huésped individual así como la
naturaleza y severidad de los síntomas del huésped. Es así como no
existe un límite crítico superior o inferior para la cantidad de
agente activo. La cantidad terapéuticamente efectiva a emplearse en
la presente invención puede ser determinada fácilmente por aquellos
con experiencia en el arte.
Tal como se usa aquí, "carga del fármaco"
significa, en un sentido cuantitativo general, la cantidad de agente
biológicamente activo cargado en el producto de suspensión
liposómica. Es por lo tanto una medida de la cantidad de agente
activo disponible en una unidad de volumen de la formulación
liposómica que va a ser suministrada al paciente durante el uso.
Más particularmente, "carga del fármaco" significa la tasa de
fármaco encapsulado por unidad de volumen de la suspensión
liposómica al porcentaje de volumen encapsulado en los mismos
liposomas. Este es aproximadamente igual a la concentración del
agente activo en la suspensión dividido entre el lipocrito de la
suspensión para fármaco libre en bajo porcentaje.
Carga de la
droga = (Fármaco encapsulado por unidad de volumen de la suspensión
liposómica)/(porcentaje volumen encapsulado en el liposoma)
\approx (Concentración del fármaco de la suspensión
liposómica)/Lipocrito
Tal como se usa aquí, "porcentaje de
encapsulación del fármaco, u otro compuesto" significa la tasa de
la cantidad de compuesto que va a ser encapsulado en la suspensión
final del proceso de fabricación del liposoma a la cantidad total
de compuesto que va a ser encapsulado usada en la primera solución
acuosa del proceso multiplicado por 100.
Porcentaje de
encapsulación = [(cantidad de compuesto encapsulado)/(Cantidad de
compuesto introducido antes de la encapsulación)] X
100
Tal como se utiliza aquí, "lipocrito", que
se define en analogía al hematocrito, significa la tasa del volumen
ocupado por los liposomas al volumen de suspensión total
multiplicado por 100.
Lipocrito =
[(Volumen ocupado por los liposomas)/(Volumen total de la suspensión
liposómica)] X
100
Tal como se usa aquí, "porcentaje de fármaco
libre" significa la tasa de la cantidad de fármaco externo a los
liposomas en la suspensión liposómica final a la cantidad total de
fármaco en la suspensión final (el producto final) multiplicado por
100.
Porcentaje de
fármaco libre = [(Cantidad de fármaco por fuera de los liposomas en
el producto final)/(Cantidad del fármaco en el producto final)] X
100 \approx (1-lipocrito) X [(Concentración del
fármaco por fuera de los liposomas)/(Concentración del fármaco en
la suspensión
liposómica)]
Los métodos para la determinación de estos
parámetros se ilustran en el ejemplo 7 de esta solicitud.
Siempre que sea posible, el uso de excipientes
osmóticos se reduce a un mínimo o se evita con el fin de lograr una
alta carga del agente biológicamente activo. En este caso, la carga
del fármaco es directamente dependiente de la concentración del
agente activo en la solución que va a ser encapsulada puesto que la
osmolaridad es atribuible en gran medida al agente activo. Cuando
no es posible el utilizar una primera solución acuosa libre de
excipientes osmóticos, la osmolaridad del primer componente acuoso
puede ser disminuida substituyendo excipientes osmóticos de alto
peso molecular por excipientes de bajo peso molecular como por
ejemplo soluciones tampón o estabilizantes de alto peso molecular
por otro de menor peso molecular. Igualmente, al escoger un
contraión negativo para un fármaco, se puede sustituir uno de alto
peso molecular por otro que tenga menor peso mecánico. Por ejemplo,
en el caso del clorhidrato de morfina el ión cloruro puede ser
substituido por sulfato o por un ión negativo con un peso molecular
aún mayor tal como fosfato.
Contrario a lo anterior, cuando se desea
producir una formulación de baja carga de agente biológicamente
activo, como en el caso cuando este último es tóxico a altas
concentraciones, la osmolaridad de la primera solución acuosa puede
ser aumentada escogiendo excipientes osmóticos de bajo peso
molecular con el fin de incrementar su osmolaridad.
El límite inferior para la osmolaridad del
primer componente acuoso puede estar cercano a cero, como en el
caso en el que el agente biológicamente activo es una proteína de
alto peso molecular u otra macromolécula y no se emplean
excipientes osmóticos. Del otro lado, la osmolaridad del primer
componente acuoso algunas veces puede ser tan alta como unos 1000
mOsm o mayor sin que se tengan efectos contraproducentes o tóxicos
en el uso puesto que muchos de los excipientes pueden salir del
liposoma durante el proceso de su obtención. Generalmente, sin
embargo la osmolaridad del primer componente acuoso se encuentra en
el rango de entre aproximadamente 0,01 mOsm a cerca de 1100 mOsm,
por ejemplo en el rango entre cerca a 5 mOsm a cerca de 400
mOsm.
La osmolaridad del componente acuoso encapsulado
en el producto liposómico final es generalmente isotónico con
relación al ambiente acuoso en el cual son almacenados los LMVs
(tales como NaCl 0,9% en peso, o solución salina normal) o en el
cual se introducen los LMVs para su utilización, tal como suero u
otro ambiente acuoso fisiológicamente relevante. Sin embargo, la
osmolaridad del componente acuoso en el producto LMV final puede
ser hipertónica con el fin de proveer una disminución óptima en la
tasa de liberación del agente biológicamente activo desde los
liposomas. Por lo tanto, dentro del objetivo de la invención se
contempla que el componente acuoso en el producto LMV pueda ser
hipotónico con respecto al medio de almacenamiento o al ambiente
acuoso en el cual será liberado el agente biológicamente
activo.
La osmolaridad de una solución salina normal es
similar a la del plasma humano y otros ambientes in vivo
tales como fluido cerebroespinal, fluido sinovial y espacios
subcutáneos e intramusculares. Por lo tanto una solución salina
puede emplearse como modelo predictivo de la liberación de fármacos
LMV en tales ambientes. Debido a que el uso preferido de los LMVs
de la invención es para inyecciones in vivo o implantes en
tejidos o cavidades corporales (por ejemplo como puntos de
fármacos), usualmente se almacenan en un medio tal como una solución
salina normal, solución salina amortiguada con fosfato u otro medio
osmóticamente similar.
La rata de liberación del agente activo a partir
de las LMVs se incrementa generalmente bajando la osmolaridad del
primer componente acuoso utilizado durante la fabricación. Sin
embargo, el disminuir la osmolaridad del primer componente acuoso
puede tener un efecto negativo sobre la liberación sostenida y la
eficiencia de encapsulación. Este efecto negativo puede ser
superado utilizando en el componente lipídico uno o más lípidos
amfipáticos que tengan entre aproximadamente 13 y 28 átomos de
carbono, por ejemplo entre unos 18 y 22 carbonos. Esta regla
general se cumple sea o no saturada la cadena carbonada del lípido
amfipático o contenga o no uno o más enlaces dobles. Generalmente,
sin embargo, al seleccionar los lípidos que se van a emplear en la
formulación del lípido multivesicular se debe tener en mente que es
posible usarse un solvente orgánico con un punto de ebullición más
bajo cuando se utiliza un lípido con un número dado de carbonos en
la cadena carbonada si el lípido contiene al menos un doble enlace
en la cadena carbonada. Los lípidos amfipáticos preferidos para uso
en la formación de liposomas multivesiculares de esta invención son
lípidos de ocurrencia natural. Los efectos benéficos sobre la
eficiencia de encapsulamiento y liberación sostenida del agente
biológicamente activo que se pueden lograr utilizando dichos
lípidos amfipáticos de cadena larga de los LMVs se revelan en la
Aplicación para Patente U.S pendiente Serial Nº 08/723.583,
diligenciada el 1º de octubre de 1996, titulada "Método para la
producción de liposomas con porcentaje incrementado del compuesto
encapsulado" incorporado aquí íntegramente.
Una lista representativa de lípidos amfipáticos
de cadena larga utilizados en la práctica con esta invención se da
a continuación. Esta lista es ilustrativa y no pretende de ninguna
manera limitar el objetivo de la invención. También se incluyen
las abreviaturas utilizadas para hacer referencia a los fosfolípidos
en esta aplicación y en la literatura científica.
- DOPC o DC 18:1 PC = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina
- DLPC o DC 12:0PC = 1,2-dilauroil-sn-glicero-3-fosfocolina
- DMPC o DC 14:0PC = 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina
- DPPC o DC 16:0PC = 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fofocolina
- DSPC o DC 18:0PC = 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina
- DAPC o DC20:0PC = 1,2-diaraquidoil-sn-glicero-3-fosfocolina
- DBPC o DC22:0PC = 1,2-dibehenoil-sn-glicero-3-fosfocolina
- DC16:1PC = 1,2-dipalmitoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina
- DC20:1PC = 1,2-dieicosenoil-sn-glicero-3-fosfocolina
- DC22:1PC = 1,2-dierucoil-sn-glicero-3-fosfocolina
- DPPG = 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol
- DOPG = 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol.
Muchos tipos diferentes de solventes
hidrofóbicos tales como éteres, hidrocarburos, hidrocarburos
halogenados, fluidos supercríticos incluyendo pero no limitado al
CO_{2}, NH_{3} y freones, pueden ser utilizados como el
solvente de fase lípida. Por ejemplo, dietil éter, isopropil y otros
éteres, diclorometano, cloroformo, tetrahidrofurano, éteres
halogenados, ésteres y combinaciones de estos son
satisfactorias.
Los compuestos biológicamente activos
terapéuticos, o fármacos, para encapsulación en los métodos y
composiciones de esta invención pueden ser seleccionados del grupo
general consistente de agentes anti-neoplásticos,
agentes anti-infecciosos, hormonas, antidepresivos,
agentes anti-inflamatorios, agentes antivirales,
agentes anti-nociceptivos, ansiolíticos y
biológicos.
Ejemplos representativos de agentes
anti-neplásticos útiles en las composiciones y
métodos de la presente invención incluyen matotrexato, taxol,
factor tumor necrosis, clorambucil, interleucinas, etopósido,
citarabina, fluorouracilo y vinblastina.
Ejemplos representativos de agentes
anti-infecciosos útiles en las composiciones y
métodos de la presente invención incluyen amikacina, pentamidina,
metronidazol, penicilina, cefalexina, tetraciclina y
cloranfenicol.
Ejemplos representativos de agentes antivirales
útiles en la composición y métodos de la presente invención
incluyen dideoxicitidina, zidovudina, aciclovir, interferones,
dideoxinosina y ganciclovir.
Ejemplos representativos de ansiolíticos y
sedantes útiles en las composiciones y métodos de la presente
invención incluyen benzodiacepinas tales como diazepam,
barbitúricos tales como fenobarbital y otros compuestos tales como
buspirona y haloperidol.
Ejemplos representativos de hormonas útiles en
las composiciones y métodos de la presente invención incluyen
estradiol, prednisona, insulina, hormona del crecimiento,
eritropoitina y prostaglandinas.
Ejemplos representativos de antidepresivos
útiles en las composiciones y métodos de la presente invención
incluyen fluoxetina, trazodona, imipramina y doxepina.
Ejemplos representativos de antinociceptivos
útiles en las composiciones y métodos de la presente invención
incluyen bupivacaína, hidromorfina, oxicodona, fentanilo, morfina y
meperidina.
El término "biológicos" incluye ácidos
nucléicos (ADN y ARN), proteínas glucosaminoglicanos y péptidos e
incluye compuestos tales como citocinas, hormonas (hormonas
pituitaria, adrenal e hipofiseal), factores de crecimiento,
vacunas, etc. De interés particular son la
interleucina-2, factores-1 de
crecimiento tipo insulina (IGF-I), interferones,
insulina, heparina, leuprolida, factores que estimulan colonias de
granulositos, factores que estimulan colonias macrófagas de
granulosito (GM-CSF), factores de necrosis de
tumores, inhibina, factores alfa y beta del crecimiento de tumores,
sustancias inhibidoras de muleria, calcitonina, vacuna para la
hepatitis B, vacunas de ADN o ARN, ADN para transferencia de genes
y oligonucleótidos antisentido.
El agente biológicamente activo puede ser
empleado en la presente invención en varias formas tales como en
complejos moleculares o sales biológicamente aceptables. Ejemplos
representativos de tales sales son succinato, clorhidrato,
bromhidrato, sulfato, fosfato, nitrato, citrato, glucuronato,
borato, acetato, maleato, tartrato, salicilato, sales metálicas (p.
ej., álcalis o tierras alcalinas) sales de amonio o de aminas (ej.,
amonio cuaternario) y las similares. Adicionalmente se pueden
emplear como agentes biológicamente activos derivados de agentes
activos tales como ésteres, amidas y éteres de éstos que tengan
características deseables de retención y liberación pero que sean
fácilmente hidrolizables por pH fisiológico o enzimas in
vivo.
La concentración del agente biológicamente
activo encapsulado puede variar desde unos pocos picomoles a varios
milimoles. La concentración deseable de agente biológicamente activo
variará dependiendo de características tales como la enfermedad que
se va a tratar, edad y condición del paciente y propiedades
particulares del agente. En el caso en que el agente está
normalmente asociado con efectos laterales tales como toxicidad,
generalmente es deseable producir un LMV con una concentración más
baja del agente y utilizar una concentración más alta del
excipiente osmótico. La interrelación de estos diferentes parámetros
puede ser evaluada fácilmente por alguien con experiencia en el
arte seleccionando y produciendo un LMV dado sin tener que recurrir
a experimentos innecesarios.
Formulaciones con alta carga obtenidas por el
método de esta invención son particularmente útiles en la industria
farmacéutica para reducir la cantidad de formulación liposómica que
tiene que ser administrada a un individuo (ej., intramuscular o
subcutáneamente) para lograr una concentración terapéutica del
fármaco en el torrente sanguíneo. Sin embargo, el límite superior
útil de la cantidad de fármaco encapsulada en un volumen dado de
suspensión liposómica puede ser dictado por el lipocrito de la
suspensión. Como puede apreciar un experto en el arte, puede ser
difícil inyectar una suspensión que contenga liposomas si el
lipocrito de la suspensión es muy alto.
El rango apropiado para la dosificación del
agente biológicamente activo en liposomas multivesiculares de esta
invención para uso in vivo en humanos incluye el rango 0,001
- 6.000 mg/m^{2} de área superficial corporal. Mientras que dosis
por fuera de este rango pueden ser suministradas, este rango
representa el ancho de uso para prácticamente todos los agentes
biológicamente activos. Sin embargo, para un agente terapéutico en
particular, la concentración preferida puede ser fácilmente
calculada como se describió previamente.
Las formulaciones LMV pueden ser adicionalmente
diluidas con el fin de obtener una formulación inyectable de
liberación lenta de cualquier dosis total terapéuticamente efectiva
por adición de un medio de suspensión o de cualquier vehículo
fisiológicamente aceptable. Vehículos comunes aceptables incluyen
soluciones acuosas y no acuosas y emulsiones. Ejemplos de
soluciones no acuosas son propilenglicol, polietilenglicol, aceites
vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables
tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua,
soluciones alcohólicas en agua, emulsiones o suspensiones incluyendo
medios salinos y tamponados. Los vehículos parenterales incluyen
solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer y solución de
Ringer lactosada. Los vehículos intravenosos incluyen
reaprovisionamiento fluido y nutriente, reaprovisionamiento de
electrolitos (tales como los basados en dextrosa de Ringer) y
similares. También puede haber presencia de preservativos y otros
aditivos tales como antimicrobiales, antioxidantes, agentes
quelatantes y gases inertes (ver, Remington's Pharmaceutical
Science, 16 ed., Oslo, ed., Mack, Easton. PA. 1980)
Los liposomas multivesiculares pueden ser
administrados por cualquier ruta deseada; por ejemplo intratumoral,
intrarticular (en las articulaciones), intraocular, intramuscular,
intratecal, intraperitoneal, subcutánea, intravenosa,
intralinfática, oral y submucosal. Los liposomas multivesiculares
pueden ser modificados utilizando métodos ampliamente conocidos en
el arte adhiriendo, ya sea directa o indirectamente por ejemplo
mediante una molécula excipiente o péptido, ligantes de objetivo
específico, tales como anticuerpos y otros ligantes receptores de
proteína específica con el fin de impartir especificidad de objetivo
celular o de órgano (Malone, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci,
USA., 86:6077, 1989; Gregoriadis, Inmunology Today,
11(3):89, 1990; ambos incorporados por referencia).
Se efectuó una serie de experimentos para
mostrar que el efecto de la osmolaridad sobre la carga de fármaco
es inverso e independiente de otros parámetros usados durante el
proceso de fabricación, a excepción de la cantidad de agente
activo, la cual es directamente proporcional a la cantidad de agente
activo que puede ser cargado en la formulación liposómica. Estos
dos parámetros, por lo tanto, tienen que ser balanceados para
obtener cualquier nivel de carga deseado. Por ejemplo, en el Ejemplo
1 se mostró que la citarabina puede ser encapsulada en LMVs usando
un mezclador vortex y un primer componente acuoso que contenga 40
mg/mL de citarabina en ácido cítrico 20 mM y cantidades de sacarosa
en el rango de cero a 8,0 por ciento peso a volumen (% p/v). La
correspondiente osmolaridad estimada de la primera composición
acuosa en este rango de las formulaciones era de 185,9 a 446,9
mOsm. El correspondiente rango de carga de fármaco (Tabla 2) era de
61,7 a 21,0 mg/ml con un % de producido del proceso de
encapsulación que permanecía relativamente constante.
Al variar la concentración del agente activo y
la concentración del excipiente osmótico, la invención produce
formulaciones LMV con un amplio rango de carga de fármaco para
cualquier agente activo. Por ejemplo, en el Ejemplo 2 se encapsuló
met-encefalina en LMVs utilizando un primer
componente acuoso que contenía 40 ó 5 mg/mL de
met-encefalina en ácido cítrico 20 mM, y 0, 2,5 ó 5%
p/v de sacarosa, produciendo un rango de osmolaridad en el primer
componente acuoso entre 35,5 y 191,5 mOsm. Los resultados de estos
estudios (Tablas 2 y 3) muestran que el disminuir la osmolaridad en
el primer componente acuoso resulta en un incremento proporcional en
la carga del fármaco, ya sea que la cantidad del agente activo en
la primera solución acuosa sea 40 mg/mL ó 5 mg/mL. Adicionalmente,
formulaciones LMV que contienen tan poco como 6,4 mg/mL o tanto como
61,7 mg/mL del fármaco fueron obtenidas utilizando el método de la
invención. Estos resultados ilustran la amplia aplicabilidad del
principio que subyace en la invención reivindicada.
Se efectuaron estudios adicionales utilizando en
el primer componente acuoso concentraciones de IGF-I
entre 10 y 80 mg/mL, ya fuera con o sin HCl 100 mM o ácido cítrico
25 mM a un pH constante. Se encontró que la solubilidad y
biodisponibilidad del IGF-I encapsulado variaba de
acuerdo al pH del primer componente acuoso. Estudios han mostrado
hasta cerca a 300 mg/mL de IGF-I solubilizan a un pH
por debajo de 5. Para todas las concentraciones de
IGF-I probadas, en el rango de pH donde el fármaco
es soluble, la carga de fármaco varía de acuerdo a la osmolaridad.
Para concentraciones de IGF-I en el rango 40 a 300
mg/mL, la solubilidad fue mayor en el rango 2 a 4,8; mientras que
el rango de solubilidad útil para las concentraciones de
IGF-I en el rango aproximado entre 1 mg/mL y cerca
de 33 mg/mL estuvo entre aproximadamente 1 y 5.
Adicionalmente, las formulaciones
IGF-I hechas comparan los efectos sobre la carga de
fármaco al sustituir como excipiente un azúcar (sacarosa) por un
compuesto que no lo es (glicilglicina). En un número de
formulaciones el lípido amfipático de cadena larga, utilizado para
impartir propiedades de liberación lenta a las formulaciones,
también fue cambiado de DEPC a DOPC sin cambio significativo en la
tendencia de modulación de la carga de fármaco ajustando la
osmolaridad del primer componente acuoso. Para ilustrar que el
método de esta invención depende de variables tales como el tamaño
de cochada y el método de mezclado usado durante el proceso de
fabricación, las formulaciones LMV se obtuvieron en diferentes
tamaños de cochada y con diferentes tipos de mezcladores. La
comparación de los resultados de estas pruebas en las Tablas 6A a 6F
mostraron que la relación inversa entre osmolaridad y carga de
fármaco no depende del carácter químico de ninguno de los
excipientes osmóticos en el primer componente acuoso, y que, para
concentraciones de fármaco constantes, la tendencia de carga
incrementada de fármaco con osmolaridad reducida es consistente,
aunque diferentes tamaños de cochada y métodos de mezclado puedan
dar diferentes niveles de carga.
Los siguientes ejemplos ilustran la manera en la
cual la invención puede ser practicada. Se entiende, sin embargo,
que los ejemplos son para propósito de ilustración y que la
invención no debe tomarse como limitada a ninguno de los materiales
específicos o condiciones de estos ejemplos.
En todos los métodos de fabricación de LMVs
ilustrados aquí, en el primer paso se preparó una emulsión de agua
en aceite mezclando un componente lípido con un primer componente
acuoso. El componente lípido contenía 0,5-4 mL de
DOPC o DEPC 1320 mM, colesterol 19,88 mM, DPPG 2,79 mM y trioleína
2,44 mM (Avant Polar Lipids Inc., Alabaster, AL) en cloroformo
(Spectrum Chemical Manufacturing Corp., Gardena, CA) como solvente.
Un volumen igual (0,5-4 mL) de la primera solución
acuosa que contenía citarabina, leuprolida, morfina, encefalina o
IGF-I y diferentes concentraciones de un excipiente
osmótico se mezclaron con el componente lípido utilizando una
variedad de mezcladores con el fin de determinar el efecto de la
osmolaridad sobre la carga de fármaco y el porcentaje de producido
de las diferentes combinaciones probadas.
Para la citarabina, el componente lípido
contenía DEPC en lugar de DOPC, y se prepararon cuatro diferentes
soluciones acuosas primarias cada una de las cuales contenía 40
mg/mL de citarabina (Upjohn Co., Kalamazoo, MI) en ácido cítrico 20
mM (Sigma Chemical) y 0, 2, 5 u 8% p/v de sacarosa como agente
excipiente osmótico. Una emulsión del lípido y de los primeros
componentes acuosos se formó mezclando 0,5 mL del primer componente
acuoso con 0,5 mL del componente lipídico utilizando un vortex
Baxter® a la máxima velocidad (ajuste 10) durante 6 minutos. A la
resultante primera emulsión se le adicionó 2,5 mL de una solución
que contenía 4% p/v de glucosa y lisina 40 mM (Spectrum Chemicals)
respectivamente. La mezcla resultante fue emulsificada para formar
una segunda emulsión con el vortex Baxter a la velocidad máxima
(ajuste 10) durante 4 segundos. La segunda emulsión resultante, una
emulsión doble agua en aceite en agua, fue transferida para
agitación suave a un erlenmeyer de 250 mL que contenía 10 mL de una
solución al 4% en peso de glucosa y lisina 40 mM.
Para evaporar el solvente orgánico (cloroformo)
de las partículas, se pasó nitrógeno gaseoso sobre la segunda
emulsión a 37ºC durante 20 minutos con agitación suave. Los
liposomas multivesiculares resultantes se lavaron dos veces con 50
mL de solución salina normal por centrifugación a 600 x g en una
centrífuga de mesa y luego se resuspendieron en
0,5-4 mL de solución salina normal. La osmolaridad
estimada (mOsm), el porcentaje de producido y la carga de fármaco
de estas formulaciones se muestran a continuación en la Tabla 2
Estos resultados muestran que la carga de
fármaco puede ser modulada variando la osmolaridad de la primera
solución acuosa, obteniéndose un aumento en la carga de fármaco al
disminuir la osmolaridad. El incremento en la carga del fármaco
obtenido por disminución de la osmolaridad no representa una
variación significativa en el porcentaje de producido en la
formulación LMV.
Se preparó, como en el Ejemplo 1, un componente
lípido que contiene DEPC en lugar de DOPC. El primer componente
acuoso contenía 5 mg/mL de met-encefalina (un
pentapéptido) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en ácido cítrico
25 mM y 0; 2,5 ó 5,0% p/v de sacarosa como excipiente osmótico. Los
pasos restantes descritos en el Ejemplo 1 fueron efectuados para
obtener LMVs que contenían met-encefalina
suspendidos en solución salina normal. La osmolaridad estimada
(mOsm), el porcentaje de producido y la carga de fármaco de estas
formulaciones se reporta a continuación en la tabla 3:
Los datos en la Tabla 3 nuevamente muestran que
la carga de met-encefalina se modula variando la
osmolaridad de la primera solución acuosa, obteniéndose un
incremento en la carga de fármaco al disminuir la osmolaridad. De
esta manera el efecto es independiente de la carga de fármaco. El
porcentaje de producido no varía significativamente por disminución
de la osmolaridad. El efecto obtenido sobre la carga de fármaco al
variar la osmolaridad del primer componente acuoso se obtiene
también cuando se reemplaza DEPC por DOPC en el componente lípido
durante la fabricación.
Como en el Ejemplo 1 se preparó un componente
lípido que contenía DOPC en lugar de DEPC, excepto que contenía
leuprolida en una concentración molar 3 veces superior a todos los
cuatro lípidos en el componente lípido. El primer componente acuoso
contenía 15 mg/mL de acetato de leuprolida (Bachem Bioscience Inc.,
King of Prussia, PA) en ácido fosfórico 100 mM y 4,0 ó 6,0% p/v de
sacarosa como excipiente osmótico. Se siguieron los procedimientos
del Ejemplo 1 para la obtención de LMVs que contuvieran leuprolida,
excepto que se mezclaron 4 mL del primer componente acuoso con 4 mL
del componente lípido utilizando un autohomogenizador TK K a una
velocidad de 9.000 rpm durante 8 minutos con el fin de obtener la
primera emulsión. A la primera emulsión se le adicionó 16 mL de una
solución que contenía 4% p/v de glucosa y lisina 40 mM (Spectrum
Chemicals), respectivamente. La mezcla resultante fue emulsificada
para formar una segunda emulsión en un autohomogenizador TK K a una
velocidad de 4.000 rpm durante 1 minuto. La osmolaridad estimada
(mOsm), el porcentaje de producido y la carga de fármaco de estas
formulaciones se reporta a continuación en la tabla 4:
Al igual que en los ejemplos 1 y 2 anteriores,
la carga de la leuprolida, un péptido aminoácido-9,
se modula variando la osmolaridad de la primera solución acuosa
obteniéndose un incremento en la carga de fármaco al reducir la
osmolaridad. Un porcentaje de producido similar fue mantenido a lo
largo del rango de osmolaridades ensayadas. Este resultado también
se muestra independiente del tipo de mezclador utilizado para
generar la primera y segunda emulsión en la fabricación de
LMVs.
Se preparó, como en el Ejemplo 1, un componente
lípido que contenía DEPC en lugar de DOPC. El primer componente
acuoso contenía 17 mg/mL de sulfato de morfina (Mallinckrodt
Chemical Inc., St. Louis, MO) en ácido clorhídrico 10 mM y 0,2; 2,5
ó 5,0% p/v de sacarosa como excipiente osmótico. El resto de los
pasos descritos en el Ejemplo 1 fueron efectuados hasta obtener
LMVs que contenían sulfato de morfina, suspendidos en solución
salina normal. La osmolaridad estimada (mOsm), el porcentaje de
producido y la carga de fármaco de estas formulaciones se reporta a
continuación en la tabla 5:
Nuevamente, la carga de la morfina, un fármaco
liposoluble, se moduló variando la osmolaridad de la primera
solución acuosa obteniéndose un incremento en la carga del fármaco
al reducirse la osmolaridad. El porcentaje de producido de la
formulación LMV se mantuvo substancialmente equivalente a lo largo
del rango de osmolaridades ensayadas.
Se preparó, como en el Ejemplo 1, un componente
lípido que contenía DEPC en lugar de DOPC. El primer componente
acuoso contenía 50 mg/mL de IGF-I y 0,25; 0,5; 1,0;
2,5 ó 5,0% p/v de sacarosa como excipiente osmótico. El resto de
los pasos descritos en el Ejemplo 1 fueron efectuados hasta obtener
LMVs que contenían IGF-I, suspendidos en solución
salina normal. La osmolaridad estimada (mOsm), el porcentaje de
producido y la carga de fármaco de estas formulaciones se reporta a
continuación en la tabla 6A:
Aunque la carga de IGF-I fue
consistente con los resultados obtenidos cuando se utilizó ácido
cítrico como amortiguador, el IGF-I mostró cierto
nivel de degradación en los estudios realizados para caracterizar la
proteína encapsulada.
Se preparó, como en el Ejemplo 1, un componente
lípido que contenía DOPC en lugar de DEPC. Un primer conjunto de
formulaciones empleadas utilizó un primer componente acuoso que
contenía 20 mg/mL de IGF-I (Chiron Corp.,
Emeryville, CA) en ácido clorhídrico 100 mM y 2,5 ó 5,0% p/v de
sacarosa como excipiente osmótico. Un segundo conjunto utilizó 50
mg/mL de IGF-I en ácido clorhídrico 100 mM y 0 ó
2,5% p/v de sacarosa como excipiente osmótico. Se siguieron los
procedimientos del Ejemplo 1 para la obtención de LMVs que
contuvieran IGF-I, excepto que se mezclaron 4 mL
del primer componente acuoso con 4 mL del componente lípido
utilizando un autohomogenizador TK K a una velocidad de 9.000 rpm
durante 8 minutos con el fin de obtener la primera emulsión. A la
primera emulsión se le adicionó 16 mL de una solución que contenía
4% p/v de glucosa y lisina 40 mM (Spectrum Chemicals),
respectivamente. La mezcla resultante fue emulsificada para formar
una segunda emulsión en un autohomogenizador TK K a una velocidad
de 4.000 rpm durante 1 minuto. La osmolaridad estimada (mOsm), el
porcentaje de producido y la carga de fármaco de estas
formulaciones utilizando un mezclador vortex y DEPC, un lípido que
tiene una cadena de 22 carbonos, se reporta a continuación en la
tabla 6B:
La Tabla 6B muestra que las cargas obtenidas con
el procedimiento que usa el mezclador TK son similares a aquellas
obtenidas cuando se utiliza un mezclador vortex para fabricar las
emulsiones. Sin embargo, los estudios conducidos para caracterizar
la proteína encapsulada muestran presencia incrementada de
oligómeros IGF-I cuando no hay un tampón ácido.
Se preparó, como en el Ejemplo 1, un componente
lípido que contenía DEPC en lugar de DOPC. El primer componente
acuoso contenía una de tres formulaciones: (1) 30 mg/mL de
IGF-I en ácido cítrico 25 mM y 0 ó 2,5% p/v de
sacarosa como excipiente osmótico. (2) o 50 mg/mL de
IGF-I en ácido cítrico 25 mM y 2,5; 0,5 ó 0% p/v de
sacarosa, (3) o 50 mg/mL de IGF-I sin ácido cítrico
y 0 ó 0,5% p/v de sacarosa. Se siguieron los procedimientos del
Ejemplo 1 para la obtención de LMVs que contuvieran
IGF-I, excepto que se mezclaron 3 mL del primer
componente acuoso con 3 mL del componente lípido utilizando un
mezclador Omni ES a una velocidad de 10.000 rpm durante 12 minutos
con el fin de obtener la primera emulsión. A la primera emulsión se
le adicionó 20 mL de una solución que contenía 4% p/v de glucosa y
lisina 40 mM (Spectrum Chemicals), respectivamente. La mezcla
resultante fue emulsificada para formar una segunda emulsión en un
mezclador Omni ES a una velocidad de 4.500 rpm durante 2 minutos.
La osmolaridad estimada (mOsm), el porcentaje de producido y la
carga de fármaco de estas formulaciones se reportan a continuación
en la tabla 6C:
Los resultados en la Tabla 6C muestran una
modulación de carga de fármaco por osmolaridad similar para
cualquier concentración de fármaco ensayada.
Se preparó un componente lípido que contenía
DEPC en lugar de DOPC igual que para otras formulaciones de
fármacos. El primer componente acuoso contenía 15 mg/mL de
IGF-I disuelto en solución de 5% sacarosa / citrato
de amonio 20 mM o en de 8% sacarosa / citrato de amonio 20 mM. Se
mezclaron 125 mL de la primera solución acuosa con 125 mL de un
componente lípido utilizando un sistema con recipiente de doble
mezclado y alta cizalla con el fin de obtener la primera emulsión.
Este sistema de mezclado modela el proceso de producción en escala y
se utiliza para escalar las formulaciones de droga encapsulada.
Los componentes acuoso y orgánico se mezclaron a una velocidad de
8.000 rpm durante 30 minutos en el primer recipiente de emulsión. La
primera emulsión fue entonces bombeada a una rata de 167 mL/min a
una corriente fluida consistente de hidróxido de amonio 0,04 N en
solución de glicina 1,5% fluyendo a 2.400 mL/min y se mezcló
utilizando un mezclador estático en línea con el fin de obtener la
segunda emulsión. La rata de flujo total a través del mezclador
estático fue de 2567 mL/min. A esta rata la primera emulsión se
agotó en 90 segundos. La segunda emulsión, una vez entró en un
recipiente de recepción, fue mezclada con solución de lisina y luego
fue inmediatamente aspersados con nitrógeno para retirar el
solvente orgánico. La osmolaridad estimada (mOsm), el porcentaje de
producido y el porcentaje de fármaco libre para estas formulaciones
se reporta a continuación en la Tabla 7.
Los resultados en la Tabla 7 muestran un
incremento similar en la carga de fármaco ocasionado por una
disminución en la concentración de sacarosa al igual que para las
otras formulaciones de fármacos ensayadas.
Se preparó, como en el Ejemplo 1, un componente
lípido que contenía DEPC en lugar de DOPC. El primer componente
acuoso contenía 10 mg/mL de IGF-I en ácido cítrico
25 mM y 0; 1,0 ó 2,0% p/v de glicilglicina como excipiente
osmótico. Se siguieron los restantes procedimientos del Ejemplo 1
para la obtención de LMVs que contuvieran IGF-I
suspendido en solución salina normal. La osmolaridad estimada
(mOsm), el porcentaje de producido y la carga de fármaco de estas
formulaciones se reportan a continuación en la tabla 6D:
Una modulación osmótica similar de la carga de
fármaco se muestra para formulaciones que utilizan un espaciador
osmótico no azucarado, glicilglicina, en lugar de sacarosa. Así el
efecto de la osmolaridad sobre la carga se muestra en los datos de
la Tabla 6D que es independiente de la estructura química del
excipiente osmótico usado.
Se fabricaron LMVs en el método del Ejemplo 1
que contenían IGF-I encapsulado con sacarosa 2,5%
p/v o glicilglicina 1,0% p/v como excipientes osmóticos a
aproximadamente la misma fuerza osmótica. Para la comparación, se
introdujo sacarosa 2,5% p/v o glicilglicina 1,0% p/v como
excipiente osmótico en el primer componente acuoso que contenía 80
mg/mL de IGF-I y ácido cítrico 25 mM.
Los procedimientos del Ejemplo 1 fueron seguidos
hasta obtener los lMVs que contenían IGF-I, excepto
que 3 mL del primer componente acuoso fueron mezclados con 3 mL del
componente lipídico utilizando un mezclador Omni ES a una velocidad
de 10.000 rpm durante 12 minutos con el fin de obtener la primera
emulsión. Se adicionó a la primera emulsión 20 mL de una solución
que contenía glucosa 4% p/v y lisina 40 mM (Spectrum Chemicals)
respectivamente. La mezcla resultante fue emulsionada en el
mezclador Omini ES para formar una segunda emulsión a una velocidad
de 4.500 rpm durante 2 minutos.
Con el fin de determinar si el efecto sobre la
carga de fármaco es atribuible solamente a la osmolaridad del
primer componente acuoso, se preparó una tercera formulación tal
como se describió anteriormente, excepto que las concentraciones
del excipiente osmótico y del IGF-I se disminuyeron
proporcionalmente (de 80 mg/mL IGF-I y 2,5% p/v
sacarosa a 50 mg/mL IGF-I y 1,0% p/v sacarosa). En
esta formulación el segundo componente acuoso substituyó 1,5% de
glicina y lisina 40 mM en lugar de 4% de glucosa y lisina 40 mM
utilizadas en el Ejemplo 1. La Tabla 6E a continuación compara la
osmolaridad estimada, el % de producido y la carga de fármaco en la
suspensión liposómica final para estas formulaciones.
Los datos en la Tabla 6E muestran que la
osmolaridad del excipiente osmótico es el resultado variable
efectivo porque dos diferentes espaciadores osmóticos, a
aproximadamente igual fuerza osmótica pero a concentraciones
molares no iguales, produce un efecto comparable sobre la carga de
fármaco.
La Tablas 2 a 6A-E muestran la
osmolaridad estimada (mOsm), % de producido y carga de fármaco
(mg/mL) para las formulaciones liposómicas descritas anteriormente
en los Ejemplos 1 a 6. Estos parámetros se obtuvieron como se
explica a continuación:
El porcentaje de encapsulación (o porcentaje de
producido) del fármaco se calculó como la relación de porcentaje de
la cantidad del fármaco en la suspensión liposómica final a la
cantidad total de fármaco utilizado en la primera solución acuosa.
De esta manera, el porcentaje de producido del fármaco fue calculado
como la relación de la concentración del fármaco en la suspensión
final multiplicado por el volumen de suspensión final a la
concentración del fármaco en la primera solución acuosa multiplicada
por el volumen de la primera solución acuosa. El lipocrito fue
calculado, en analogía al hematocrito, como la relación de
porcentaje del volumen de píldora al volumen de suspensión (ver
condiciones más adelante para obtención del volumen de píldora).
El porcentaje de fármaco libre fue calculado
como la relación de porcentaje de la cantidad de fármaco en el
sobrenadante a la cantidad de fármaco en la suspensión final. El
porcentaje de fármaco libre también puede ser calculado como la
relación porcentual de la concentración del fármaco en el
sobrenadante a la de la suspensión, multiplicado por
(1-lipocrito) la carga de fármaco, lo cual es una
medida de la cantidad de fármaco encapsulado en cada unidad del
volumen encapsulado. Este es aproximadamente igual a, y puede ser
estimado como (asumiendo un bajo porcentaje de fármaco libre), la
relación de la concentración del fármaco de la suspensión liposómica
final al lipocrito. Estas variables fueron determinadas como se
describe en más detalle más adelante.
Con el fin de calcular el lipocrito, cerca de 50
\muL de suspensión de liposomas multivesiculares fueron tomados
en un capilar y un extremo de éste fue sellado a la par que se
aseguraba que la suspensión no contuviera burbujas. La suspensión
fue centrifugada a 600 xg durante 10 minutos para obtener una capa
de píldoras y una capa sobrenadante. La relación porcentual de la
longitud del tubo ocupado por las píldoras al ocupado por la
suspensión da el valor del lipocrito.
Para su uso en la determinación de la cantidad
de fármaco libre en una formulación, se obtuvo sobrenadante
centrifugando cerca de 0,2 mL de suspensión durante 3 minutos a 600
xg en un tubo para centrífuga Eppendorf®. Para las formulaciones de
citarabina y morfina, se retiraron 25-50 \muL del
sobrenadante y fueron pipeteados a un tubo de vidrio que contenía 1
ml de alcohol isopropílico: ácido clorhídrico 1N 3:1 v/v (Fisher
Chemical, Fair Lawn, NJ), y se mezclaron rigurosamente hasta
obtener una solución clara. La absorbancia a 280 nm para la
citarabina o a 285 nm para la morfina fue medida en un espectrómetro
(Hitachi® U-2000). Para las formulaciones de
leuprolida, se tomaron 50 \muL del sobrenadante y se pipetearon a
un tubo de vidrio que contenía 2ml de alcohol isopropílico:agua 1:1
titulado a pH 10 usando hidróxido de amonio 0,1 N, seguido de
mezclada rigurosa hasta la obtención de una solución clara. La
absorbancia a 280 nm fue entonces medida en un espectrofotómetro
(Hitachi® U-2000). Para la encefalina y la
IGF-I se tomaron 25-50 \muL de
sobrenadante y se pipetearon a un tubo de virio que contenía
alcohol isopropílico:ácido cítrico 3:1 v/v (Sigma Chemical), seguido
de un mezclado riguroso hasta obtener una solución clara. La
absorbancia a 275 nm para la encefalina y la IGF-I
fue medida en un espectrofotómetro (Hitachi®
U-2000). Se calcularon las concentraciones de
fármaco en la suspensión utilizando un estándar de referencia
basado en soluciones de fármacos de concentraciones conocidas en las
mismas soluciones disolventes.
La distribución de tamaño de partícula y el
diámetro medio de partícula fueron determinados por el método de
difracción de luz láser utilizando un analizador de tamaño de
partícula LA-500 de Horiba Inc (Irvine, CA). Los
diámetros medios de partícula para volumen ponderado para todas las
formulaciones estudiadas estuvo generalmente en el rango aproximado
de 6 a 18 \mum.
La integridad fisicoquímica del
IGI-F encapsulado fue confirmada mediante ensayo
SDS-PAGE utilizando gel Novex® Nu Page y mediante
análisis RP-HPLC utilizando una columna simétrica
C18. La proteína encapsulada fue extraída utilizando IPA:Acido
cítrico 2N 75:25. La bioactividad del IGP-I
encapsulado fue confirmada mediante un bioensayo mitogénico usando
línea celular de osteosarcoma humano MG-63 y tinción
de bromuro de
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
(MTT) de acuerdo al método de W. Lopaczynski et al., Regulatory
Peptides, 48:207-216, 1993. Las células
MG-63 se obtuvieron de la American Type Culture
Collection (ATCC#CRL 1427) y se determinó la respuesta mitogénica
dependiente de la dosis de las células MG-63 en
reposo. La bioactividad del IGF-I extraído se
confirmó como aproximadamente equivalente al de un estándar no
encapsulado.
Experimento In Vitro : Brevemente,
un experimento de liberación in vitro fue diseñado y
realizado de la siguiente manera: Una suspensión de LMV que
contenía cerca de 50 mg/mL de IGF-I fue diluida 20
veces en plasma humano que contenía NaN_{3} 0,01%; una muestra de
0,5 mL en un tubo eppendorf tapa rosca fue empleado para cada punto
temporal y se incubaron muestras bajo condiciones de rotación
dinámica a 37ºC. Muestras de punto temporal e tomaron a diferentes
tiempos y fueron lavadas con 0,9 mL de solución salina normal. Se
obtuvieron entonces cápsulas particuladas centrifugando en una
microfuge a 16000 g durante 4 minutos y se almacenaron a -20ºC
hasta su análisis por RP-HPLC usando una columna
simétrica C18. La Figura 1 muestra algunos datos de liberación
in vitro en plasma obtenidos para las tres formulaciones
IGF-I representativas listadas en la Tabla 6E. Estos
datos indican que se logra una liberación de IGF-I
sostenida luego de un periodo de varios días con formulaciones
IGF-I con una alta carga de fármaco y alto
producido.
Experimentos in vivo : Ratas macho
fueron inyectadas subcutáneamente con las tres formulaciones LMV
mostradas en la Tabla 6E con el fin de obtenerse información acerca
de las características de liberación in vivo. Cada rata
recibió una dosis de 10 mg de IGF-I y cada una de
las formulaciones fue inyectada en 3 ratas. Se recolectaron
muestras de sangre (0,2 mL) de la vena de la cola de las ratas en
los tiempos cero y a 1, 3, 5, y 7 días luego de la inyección y se
dejó que coagularan. Luego se obtuvo suero por centrifugación y se
almacenó a -70ºC antes de analizar la concentración de
IGF-I utilizando un juego IGF-I
ELISA DSL-10-5600 (Diagnostic
Systems Laboratories Inc., Webster, TX de acuerdo a las
instrucciones del fabricante.
La Figura 2 muestra el decurso temporal de la
concentración media de IGF-I en suero en las ratas
que recibieron los 10 mg de formulación A de IGF-I
en la Tabla 6E. Estos datos indican que un nivel sostenido de
IGF-I en suero se puede lograr a lo largo de un
período de muchos días utilizando las formulaciones
IGF-I de alta carga de fármaco y alto producido de
esta invención.
Claims (25)
1. Un proceso para controlar la carga de un
agente biológicamente activo a un liposoma que incluye:
(a) Modulación de la carga de un agente
biológicamente activo en un liposoma por ajuste de la osmolaridad
de una solución acuosa en la cual se disuelve el agente, donde la
osmolaridad de la solución acuosa es aumentada para disminuir la
carga de agente, o disminuida para aumentarla; y luego
(b) Encapsulamiento de la solución acuosa en el
liposoma.
2. Un proceso para producir un liposoma
multivesicular que tenga múltiples cámaras no concéntricas, con
membranas distribuidas como un sistema continuo y con carga
controlada en su interior de un agente biológicamente activo. El
proceso consistente de los siguientes pasos:
(a) Formación de una emulsión agua en aceite a
partir de dos componentes inmiscibles, siendo los dos componentes
inmiscibles (i) un componente lípido que tenga al menos un solvente
orgánico, al menos un lípido amfipático y un lípido neutro sin
cabeza hidrofóbica, y (ii) un componente acuoso que contenga al
menos un agente biológicamente activo y que presente una
osmolaridad escogida para modular la carga del agente biológicamente
activo en los liposomas multivesiculares:
(b) Dispersión, en un segundo componente acuoso,
de la emulsión agua en aceite que contiene el agente biológicamente
activo con el fin de formar esférulas solventes; y luego
(c) Remoción del solvente orgánico de las
esférulas solventes para formar los liposomas multivesiculares
suspendidos en el segundo componente acuoso;
donde la osmolaridad disminuida del primer
componente acuoso da como resultado una carga aumentada de
fármaco.
3. El proceso de la reivindicación 1 ó 2 donde
la solución acuosa incluye aún más un excipiente osmótico en una
concentración seleccionada para modular la osmolaridad.
4. El proceso de la reivindicación 3, donde el
excipiente osmótico es sacarosa o es seleccionado de un grupo
consistente de glucosa, glicina y glicilglicina.
5. El proceso de la reivindicación 1 ó 2 donde
la osmolaridad está en el rango entre unos 0,01 mOsm y cerca de
1100 mOsm.
6. El proceso de la reivindicación 1 ó 2 donde
la osmolaridad esta en el rango entre aproximadamente 5 mOsm hasta
aproximadamente 400 mOsm.
7. El proceso acorde a la reivindicación 1 ó 2
donde el agente biológicamente activo es la citarabina.
8. El proceso acorde a la reivindicación 7 donde
la osmolaridad de la solución acuosa está en el rango de
aproximadamente 185 mOsm y aproximadamente 450 mOsm.
9. El proceso acorde a la reivindicación 1 ó 2
donde el agente activo es morfina.
10. El proceso acorde a la reivindicación 9
donde la osmolaridad de la solución acuosa está en el rango de
aproximadamente 114 mOsm y aproximadamente 260 mOsm.
11. El proceso acorde a la reivindicación 1 ó 2
donde el agente activo es encefalina.
12. El proceso acorde a la reivindicación 11
donde la osmolaridad de la solución acuosa está en el rango de
aproximadamente 35,4 mOsm y aproximadamente 191,5 mOsm.
13. El proceso acorde a la reivindicación 1 ó 2
donde el agente activo es leuprolida.
14. El proceso acorde a la reivindicación 13
donde la osmolaridad de la solución acuosa está en el rango de
aproximadamente 261,6 mOsm y aproximadamente 328,6 mOsm.
15. El proceso de acuerdo a la reivindicación 1ó
2 donde el agente biológicamente activo se selecciona de un grupo
consistente de un anestésico, un agente antiasmático, un glicósido
cardíaco, un antihipertensivo, un ácido nucleico, un antibiótico,
una vacuna, un antinflamatorio, un antiarrítmico, una antiangina,
una hormona, un antidiabético, un antineoplástico, un
inmunomodulador, un antifungicida, un tranquilizador, un esteroide,
un sedante, un analgésico, un vasopresor, un antiviral, un
herbicida, un pesticida, una proteína, un péptido, un
neurotransmisor, un radionúclido y combinaciones adecuadas de los
anteriores.
16. El proceso de la reivindicación 3 donde el
excipiente osmótico se selecciona:
(a) Para disminuir la osmolaridad del primer
componente acuoso donde la carga del agente biológicamente activo
es incrementada; o
(b) Para aumentar la osmolaridad del primer
componente acuoso donde la carga del agente biológicamente activo
es disminuida.
17. El proceso de la reivindicación 2 donde el
componente lípido incluye al menos un lípido amfipático que tenga
entre aproximadamente 13 y aproximadamente 28 átomos de carbono en
la cadena carbonada.
18. El proceso de la reivindicación 2 donde el
componente lípido incluye al menos un lípido amfipático que tenga
entre aproximadamente 18 y aproximadamente 22 átomos de carbono en
la cadena carbonada.
19. El proceso de la reivindicación 2 donde el
componente lípido incluye al menos un lípido amfipático
zwitteriónico o un lípido amfipático aniónico.
20. El proceso acorde a la reivindicación 2
donde el agente biológicamente activo es encefalina.
21. El proceso acorde a la reivindicación 20
donde la osmolaridad del primer componente acuoso está en el rango
de aproximadamente 35,4 mOsm y aproximadamente 191,5 mOsm y la carga
correspondiente de encefalina esta en el rango de aproximadamente
6,4 mg/mL a aproximadamente 50,8 mg/mL de la formulación.
22. El proceso acorde a la reivindicación 2
donde el primer componente acuoso incluye un excipiente osmótico
seleccionado del grupo consistente de glicilglicina, glucosa,
sacarosa, trehalosa, succinato, ciclodextrina, arginina, galactosa,
manosa, maltosa, manitol, glicina, ácido glucurónico, citrato,
sorbitol, dextrán, cloruro de sodio y combinaciones de estos.
23. El proceso acorde a la reivindicación 2
donde la osmolaridad del primer componente acuoso es escogida para
modular la tasa de liberación del liposoma multivesicular a un
ambiente acuoso fisiológicamente relevante.
24. El proceso acorde a la reivindicación 2
donde el lípido neutro es seleccionado del grupo consistente de
trioleína, tripalmitoleína, tricaprin, trilinoleína, trilourina,
tricaprilina, escualeno y combinaciones de estos.
25. El proceso acorde a la reivindicación 2
donde el solvente orgánico es seleccionado del grupo consistente de
éteres, hidrocarburos, hidrocarburos halogenados, éteres
halogenados, ésteres, CO_{2}, NH_{3}, freones y combinaciones
de estos.
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