ES2281937T3 - Nuevas ariloxi-alquil-dialquilaminas. - Google Patents
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Abstract
Sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula: en el que: R1 y R2 se seleccionan independientemente de entre H; alquilo C1-C12 o alquilo C1-C6 perfluorado; X se selecciona de entre halógeno, -O-SO2-CH3, -O-SO2-CF3, o una fracción de la estructura: Z es -NO2, halógeno, -CH3 o -CF3; A se selecciona de entre -O- o -S-, -SO- o -SO2-; m es un número entero de 0 a 3; R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente de entre H, halógeno, -NO2, alquilo, alcoxi, alquilo C1-C6 perfluorado, OH o los ésteres C1-C4 o éteres alquílicos de los mismos, -CN, -O-R1, -O-Ar, -S-R1, -S-Ar, SO-R1, -SO-Ar, -SO2-R1, -SO2-Ar, -CO-R1, -CO-Ar, -CO2-R1, o -CO2-Ar; e Y se selecciona de entre: a) la fracción: en la que R7 y R8 se combinan con -(CH2)p-, en el que p es 6, de manera que forman un anillo, estando el anillo así formado opcionalmente sustituido con uno a tres sustituyentes seleccionados de entre el grupo constituido por alquilo C1-C3, trifluorometilo, halógeno, hidrógeno, fenilo, -NO2 y CN, o
Description
Nuevas
ariloxi-alquil-dialquilaminas.
La presente invención proporciona nuevos
compuestos útiles en la producción de compuestos con actividad
biológica, así como procedimientos para su producción. Más en
particular, la presente invención proporciona nuevas
ariloxialquil-dialquilaminas que pueden utilizarse
en la producción de productos farmacéuticos.
Las metaloproteinasas de la matriz (MMP) son un
grupo de enzimas que han sido implicadas en la destrucción del
tejido conjuntivo y de las membranas basales [Woessner, J.F., Jr.
FASEB J. 1991, 5, 2145;
Birkedal-Hansen, H.; Moore, W.G.I.; Bodden, M.K.;
Windsor, L.J.; Birkedal-Hansen, B.; DeCarlo, A.;
Engler, J.A. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 1993,
4, 197; Cawston, T.E. Pharmacol. Ther. 1996,
70, 163; Powell, W.C.; Matrisian, L.M. Cur. Top.
Microbiol. and Immunol. 1996, 213, 1]. Estas
endopeptidasas que contienen cinc se dividen en varias subclases de
enzimas, entre ellas las colagenasas, estromelisinas y gelatinasas.
De entre estas clases, se ha demostrado que las gelatinasas son las
MMP más estrechamente involucradas en el crecimiento y en el
desarrollo de tumores, mientras que las colagenasas se han asociado
a la patogénesis de la artrosis [Howell, D.S.; Pelletier, J.-P. En
Arthritis and Allied Conditions; McCarthy, D.J.; Koopman,
W.J., Eds.; Lea y Febiger: Philadelphia, 1993; 12^{a}
Edición Vol. 2, pág. 1723; Dean, D.D. Sem. Arthritis
Rheum. 1991, 20, 2; Crawford, H.C; Matrisian,
L.M. Invasion Metast. 1994-95,
14, 234; Ray, J.M.; Stetler-Stevenson, W.G.
Exp. Opin. Invest. Drugs, 1996, 5, 323].
La utilización de la hormonoterapia sustitutiva
para la prevención de la osteopenia en mujeres posmenopáusicas está
bien establecida. El protocolo normal implica el aporte
complementario de estrógenos utilizando formulaciones que contienen
estrona, estriol, etinilestradiol o estrógenos conjugados de origen
natural (por ejemplo, Premarin® estrógenos conjugados, de
Wyeth-Ayerst). En algunas pacientes, el tratamiento
puede estar contraindicado debido a los efectos proliferativos que
tienen los estrógenos sin antagonistas (estrógenos no administrados
de forma combinada con progestágenos) en el tejido uterino. Esta
proliferación está asociada a un aumento del riesgo de
endometriosis y/o cáncer de endometrio. Los efectos de los
estrógenos sin antagonistas en el tejido mamario están menos
claros, pero son motivo de preocupación. Resulta evidente la
necesidad de encontrar estrógenos que mantengan el efecto de
protección ósea y que al mismo tiempo reduzcan al mínimo los efectos
proliferativos en el útero y en la mama. Se ha demostrado que
algunos antiestrógenos no esteroideos mantienen la masa ósea en el
modelo de rata ovariectomizada, así como en ensayos clínicos en
seres humanos. El tamoxifeno (comercializado con la marca Novadex®,
citrato de tamoxifeno, por Zeneca Pharmaceuticals, Wilmington,
Delaware), por ejemplo, es útil como paliativo en el tratamiento
del cáncer de mama, y se ha demostrado que ejerce un efecto de tipo
agonista estrogénico en el hueso, en seres humanos. Sin embargo,
también es un agonista parcial en el útero, por lo que es motivo de
preocupación. Se ha demostrado que el raloxifeno, un antiestrógeno
benzotiofénico, estimula el crecimiento uterino en la rata
ovariectomizada en menor medida que el tamoxifeno, manteniendo al
mismo tiempo la capacidad para proteger el hueso. Una revisión
adecuada de los estrógenos histoselectivos puede consultarse en el
artículo "Tissue-Selective Actions Of Estrogen
Analogs", Bone Vol. 17, n.º 4, octubre 1995,
181S-190S.
La presente invención proporciona nuevos
intermediarios que pueden utilizarse en la producción de compuestos
farmacéuticos para su utilización como agentes estrogénicos e
inhibidores de las MMP. La utilización de compuestos de cloruro de
4-carbamoilmetoxi-metoxi-bencilo
con las estructuras:
se describe en los documentos NL
6402393; 1964; y Chem. Abstr. 1965, 62,
7698.
La utilización de compuestos de cloruro de
4-(2-dialquilamino-etoxi)benzoílo
con las estructuras:
se describe en Sharpe, C. J. et
al. J. Med. Chem. 1972, 15, 523 y Jones, C. D. et al. J.
Med. Chem. 1984, 27, 1057. De forma similar, la utilización de
cloruro de
4-(2-quinolinilmetoxi)bencilo
se describe en Huang,
F-C. et al. J. Med. Chem. 1990, 33,
1194.
Ciertos derivados de haluro de alcoxibencilo se
conocen a partir de los documentos Collect. Czech. Chem. Commun.,
55, 1602-1612 (1990); J. Chem. Soc. 1965,
954-973; Arzneim. Forsch., 29, 591-4
(1979); Chem. Abst. 54, 648d y 568h; y EP 00428312.
La presente invención proporciona nuevos
compuestos, así como procedimientos para la producción de los
mismos, que pueden utilizarse en la producción de compuestos con
actividad farmacéutica. Los compuestos de la presente invención
pueden utilizarse en especial como intermediarios en la producción
de compuestos farmacéuticos, tales como inhibidores de bajo peso
molecular, no peptídicos, de las metaloproteinasas de la matriz (por
ejemplo, gelatinasas, estromelisinas y colagenasas) y de la enzima
conversora del TNF-_ (TACE, enzima conversora del
factor de necrosis tumoral-_) que son útiles en el
tratamiento de enfermedades en las que estas enzimas están
involucradas, tales como artritis, metástasis de tumores, ulceración
tisular, cicatrización anómala de heridas, enfermedad periodontal,
enfermedad ósea, proteinuria, aneurisma de la aorta, pérdida
degenerativa del cartílago tras lesión articular traumática,
enfermedades desmielinizantes del sistema nervioso e infección por
VIH. Además, los compuestos de la presente invención pueden
utilizarse para producir compuestos que se comportan como agonistas
estrogénicos, reduciendo el nivel de colesterol y previniendo la
osteopenia. Por consiguiente, dichos compuestos son útiles en el
tratamiento de muchos trastornos, entre ellos osteoporosis,
hipertrofia prostática, esterilidad, cáncer de mama, hiperplasia y
cáncer de endometrio, enfermedades cardiovasculares,
anticoncepción, enfermedad de Alzheimer y melanoma.
La presente invención incluye nuevas sales
farmacéuticamente aceptables, de compuestos de fórmula (I):
en los
que:
R^{1} y R^{2} se seleccionan
independientemente de entre H; alquilo
C_{1}-C_{12}, preferentemente alquilo
C_{1}-C_{6}; o alquilo
C_{1}-C_{6} perfluorado, preferentemente
-CF_{3};
X es un grupo saliente, seleccionado de entre
halógeno, -O-SO_{2}-CH_{3},
-O-SO_{2}-CF_{3}, o una
fracción que tiene la estructura:
Z se selecciona de entre -NO_{2}, halógeno,
-CH_{3} o -CF_{3};
A se selecciona de entre -O- o -S-, -SO- o
-SO_{2}-;
m es un número entero de 0 a 3, preferentemente
1;
R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se
seleccionan independientemente de entre H, halógeno, -NO_{2},
alquilo (preferentemente alquilo C_{1}-C_{12},
más preferentemente alquilo C_{1}-C_{6}), alcoxi
(preferentemente alcoxi C_{1}-C_{12}, más
preferentemente alcoxi C_{1}-C_{6}), alquilo
C_{1}-C_{6} perfluorado (preferentemente
-CF_{3}), OH o los ésteres C_{1}-C_{4} o
éteres alquílicos de los mismos, -CN, -O-R^{1},
-O-Ar, -S-R^{1},
-S-Ar, SO-R^{1},
-SO-Ar, -SO_{2}-R^{1},
-SO_{2}-Ar, -CO-R^{1},
-CO-Ar, -CO_{2}-R^{1}, o
-CO_{2}-Ar;
Y se selecciona de entre:
a) la fracción:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{7} y R^{8} se
combinan con -(CH_{2})_{p}-, en el que p es 6, de manera
que forman un anillo, que puede estar opcionalmente sustituido con
uno a tres sustituyentes seleccionados de entre el grupo
constituido por alquilo C_{1}-C_{3},
trifluorometilo, halógeno, hidrógeno, fenilo, NO_{2} y
CN;
o
b) un heterociclo saturado, insaturado o
parcialmente insaturado de siete miembros, que contiene hasta dos
heteroátomos seleccionados de entre el grupo constituido por -O-,
-NH-, -N(alquilo C_{1}-C_{4})-, -N=, y
-S(O)_{n}-, en el que n es un número entero de
0-2, opcionalmente sustituido con
1-3 sustituyentes seleccionados independientemente
de entre el grupo constituido por hidrógeno, hidroxilo, halo,
alquilo C_{1}-C_{4}, trihalometilo, alcoxi
C_{1}-C_{4}, trihalometoxi, aciloxi
C_{1}-C_{4}, alquiltio
C_{1}-C_{4}, alquilsulfinilo
C_{1}-C_{4}, alquilsulfonilo
C_{1}-C_{4}, hidroxialquilo
(C_{1}-C_{4}), fenilo opcionalmente sustituido
con 1-3 alquilo (C_{1}-C_{4}),
-CO_{2}H, -CN, -CONHR^{1}, -NH_{2}, alquilamino
C_{1}-C_{4}, dialquilamino
C_{1}-C_{4}, -NHSO_{2}R^{1},
-NHCOR^{1}, -NO_{2}.
Se entiende en la descripción genérica anterior
y en el resto de los grupos de la presente memoria que, en todo los
casos en los que aparecen, R^{1} y R^{2} se seleccionan
independientemente de entrel grupo de sustituyentes mencionados en
la lista. Cualquier grupo R^{1} mencionado en cualquier estructura
de la presente memoria no representa necesariamente el mismo
sustituyente que otro grupo R^{1}, ni tampoco tiene que ser
cualquier grupo R^{2} el mismo sustituyente que cualquier otro
grupo R^{2}, incluso si más de un R^{1} o R^{2} están
presentes en la misma estructura.
En la descripción anterior, el símbolo "Ar"
indica grupos arilo o heteroarilo monocíclicos o policíclicos que
pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más sustituyentes
seleccionados a partir de halógeno, alquilo
C_{1}-C_{6} o -CF_{3}. Los ejemplos de grupos
arilo preferidos incluyen grupos antracenilo y fenantrenilo, así
como los grupos más preferidos de fenilo, cumenilo, mesitilo,
tolilo, xililo y naftalenilo. Los ejemplos de grupos heteroarilo
preferidos incluyen grupos indolizinilo, indazolilo, indazolilo,
purinilo, quinozinilo, isoquinolinilo, quinolinilo, ftalozinilo,
naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinnolinilo y
pteridinilo, y similares, así como los grupos más preferidos de
piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridizinilo e indolilo.
La invención incluye formas de sales aceptables
preparadas por reacción de adición con ácidos inorgánicos u
orgánicos. Son útiles ácidos inorgánicos tales como ácido
clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico,
ácido fosfórico, ácido nítrico; así como ácidos orgánicos tales como
ácido acético, ácido propiónico, ácido cítrico, ácido maleico,
ácido málico, ácido tartárico, ácido ftálico, ácido succínico, ácido
metanosulfónico, ácido toluenosulfónico, ácido naftalenosulfónico,
ácido camforsulfónico, ácido bencenosulfónico. Se sabe que los
compuestos que poseen un nitrógeno básico pueden formar complejos
con muchos ácidos distintos (tanto próticos como no próticos), y es
generalmente preferida la administración de un compuesto de la
presente invención en forma de sal por adición de ácido. Además, la
presente invención incluye sales de amonio cuaternario de los
compuestos de la presente memoria, que pueden prepararse haciendo
reaccionar las aminas nucleófilas de la cadena lateral con un
agente alquilante reactivo adecuado, tal como un haluro de alquilo o
haluro de bencilo
Entre los compuestos preferidos de la presente
invención se encuentran los de fórmula (I):
en la
que:
R^{1} y R^{2} se seleccionan
independientemente de entre H; alquilo
C_{1}-C_{12}, preferentemente alquilo
C_{1}-C_{6}; o alquilo
C_{1}-C_{6} perfluorado, preferentemente
-CF_{3};
X es halógeno,
-O-SO_{2}-CH_{3},
-O-SO_{2}-CF_{3} o una fracción
que tiene la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Z se selecciona de entre -NO_{2}, halógeno,
-CH_{3} o -CF_{3};
A se selecciona de entre -O- o -S-, -SO- o
-SO_{2}-;
m es un número entero de 0 a 3, preferentemente
1;
Y se selecciona de entre:
un grupo seleccionado de entre acepina,
diacepina, oxacepina, tiacepina, oxapina y tiepina, en el que el
grupo está opcionalmente sustituido con 1-3
sustituyentes seleccionados independientemente de entre el grupo
constituido por hidrógeno, hidroxilo, halo, alquilo
C_{1}-C_{4}, trihalometilo, alcoxi
C_{1}-C_{4}, trihalometoxi, aciloxi
C_{1}-C_{4}, alquiltio
C_{1}-C_{4}, alquilsulfinilo
C_{1}-C_{4}, alquilsulfonilo
C_{1}-C_{4}, hidroxialquilo
(C_{1}-C_{4}), fenilo opcionalmente sustituido
con 1-3 alquilo (C_{1}-C_{4}),
-CO_{2}H, -CN, -CONHR^{1}, -NH_{2}, alquilamino
C_{1}-C_{4}, dialquilamino
C_{1}-C_{4}, -NHSO_{2}R^{1}, -NHCOR^{1},
-NO_{2}.
Otros compuestos preferidos de la presente
invención son aquellos de fórmula (I):
Entre los compuestos más preferidos de la
presente invención se encuentran los que tienen la fórmula
general
en los
que:
R^{1} y R^{2} se seleccionan
independientemente de entre H; alquilo
C_{1}-C_{6} o alquilo
C_{1}-C_{6} perfluorado; preferentemente, entre
los grupos alquilo perfluorados, -CF_{3};
R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se
seleccionan independientemente de entre H, OH, o los ésteres
C_{1}-C_{4} o éteres alquílicos de los mismos,
halógeno, -CN, alquilo C_{1}-C_{6}, o
trifluorometilo,
m es un número entero de 0 a 3, preferentemente
1;
R^{7} y R^{8} se combinan con
-(CH_{2})_{p}-, en el que p es 6, de modo que forman un
anillo, que puede estar opcionalmente sustituido con hasta tres
sustituyentes seleccionados de entre el grupo constituido por
hidrógeno, halo, alquilo C_{1}-C_{3},
trifluorometilo, alquiltio, alquilsulfinilo
C_{1}-C_{4}, alquilsulfonilo
C_{1}-C_{4}, hidroxi-alquilo
(C_{1}-C_{4}), -CO_{2}H, -CN y -NO_{2};
y
X es como se ha definido anteriormente.
Entre los compuestos más preferidos de la
presente invención también se encuentran los que tienen la fórmula
general
en los
que:
R^{1} y R^{2} se seleccionan
independientemente de entre H; alquilo
C_{1}-C_{6} o alquilo
C_{1}-C_{6} perfluorado, preferentemente, entre
los grupos alquilo perfluorados, -CF_{3};
R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se
seleccionan independientemente de entre H, OH, o los ésteres
C_{1}-C_{4} o éteres alquílicos de los mismos,
halógeno, -CN, alquilo C_{1}-C_{6}, o
trifluorometilo,
m es un número entero de 0 a 3, preferentemente
1;
A se selecciona de entre -S-, -SO- o
-SO_{2}-;
R^{7} y R^{8} se combinan con
-(CH_{2})_{p}-, en el que p es 6, de modo que forman un
anillo, que puede estar opcionalmente sustituido con hasta tres
sustituyentes seleccionados de entre el grupo constituido por
hidrógeno, halo, alquilo C_{1}-C_{3},
trihalometilo, alquiltio, alquilsulfinilo
C_{1}-C_{4}, alquilsulfonilo
C_{1}-C_{4}, hidroxi-alquilo
(C_{1}-C_{4}), -CO_{2}H, -CN y -NO_{2};
y
X es como se ha definido anteriormente.
La presente invención también incluye un
procedimiento para la preparación de los compuestos anteriores.
Las sales farmacéuticamente aceptables de la
invención pueden prepararse mediante un procedimiento que comprende
una de las siguientes etapas:
a) convertir un alcohol de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en un compuesto correspondiente de
fórmula I, en el que X es un grupo saliente, empleando medios
apropiados, por ejemplo, utilizando un agente halogenante,
sulfonilante o acilante que contiene el grupo saliente X; si es
necesario convirtiendo el compuesto de fórmula (I) formado en una
sal del mismo farmacéuticamente
aceptable;
o
b) oxidar un compuesto de fórmula I en
el que A es S, para obtener el correspondiente compuesto de fórmula
I en el que A es SO o -SO_{2}-; si es necesario convirtiendo el
compuesto de fórmula (I) formado en una sal del mismo
farmacéuticamente aceptable;
o
c) convertir un compuesto de fórmula (I)
en una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.
Los compuestos de fórmula A pueden prepararse
haciendo reaccionar un fenol de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en el que P es un grupo protector
de radicales hidroxi, y A y R^{1-6} soncomo se ha
definido anteriormente (por ejemplo, R^{1} y R^{2} son cada uno
H o alquilo C_{1}-C_{12}), con un compuesto de
fórmula
en el que Y, R^{1}, R^{2} y m
son como se ha definido anteriormente, y halo es F, Cl, Br o I,
seguido por la eliminación del grupo
protector.
Los compuestos de la presente invención en los
que "A" es oxígeno pueden sintetizarse empleando un
procedimiento con las etapas de:
a) alquilar un hidroxibenzaldehído
correspondiente de fórmula:
en el que
R^{3}-R^{6} son como se ha definido
anteriormente, con un haluro de alquilo correspondiente de
fórmula:
en el que Y, R^{1}, R^{2} y m
son como se ha definido anteriormente en los grupos genéricos y
subgenéricos, y halo puede ser Cl, F, Br o I, para producir un
aldehído de
fórmula:
b) reducir el producto de
aldehído de la etapa a), para dar lugar al alcohol correspondiente
de
fórmula:
c) convertir el alcohol de la
etapa b) en su sal de clorhidrato, por ejemplo, con HCl/THF;
y
d) convertir el alcohol en un grupo saliente
preferido, por ejemplo, por tratamiento con cloruro de
metanosulfonilo, cloruro de toluenosulfonilo, o anhídrido
trifluoroacético en presencia de una base tal como piridina o
trietilamina.
De modo similar, la presente invención
proporciona un procedimiento para producir compuestos de la presente
invención en los que "A" es azufre, por medio de las etapas
siguientes:
a) alquilar un compuesto de fórmula
con un agente alquilante de
fórmula:
en el que Y y m son como se ha
definido anteriormente y halo se selecciona de entre Cl, F, Br o I,
para producir un aldehído de
fórmula:
b) reducir el producto de
aldehído de la etapa a), por ejemplo, con borohidruro de sodio,
hasta obtener un alcohol de
fórmula;
c) tratar el alcohol de la etapa
b) con HCl gaseoso, para generar su clorhidrato;
y
d) convertir el producto de clorhidrato del
alcohol de la etapa c) en un grupo saliente preferido, por ejemplo,
mediante tratamiento con cloruro de metanosulfonilo, cloruro de
toluenosulfonilo, o anhídrido trifluoroacético en presencia de una
base tal como piridina o trietilamina, o mediante tratamiento
continuo con HCl para formar el correspondiente cloruro de bencilo;
y,
e) opcionalmente, completar la oxidación
controlada del azufre a sulfóxido o a sulfona, por ejemplo, con
ácido m-cloroperbenzoico.
El material de partida de
tiofenóxido-aldehído de la etapa a), descrito
anteriormente, puede generarse a partir de su correspondiente
tiofenol-aldehído, por ejemplo con hidruro de sodio,
que puede considerarse, o no, una etapa del procedimiento
anterior.
Los siguientes Esquemas de reacción I a IV
demuestran la síntesis de compuestos de la presente invención, o de
análogos de los mismos, utilizando diferentes variables para
"Y". Los reactivos y disolventes de las etapas individuales se
presentan exclusivamente a título ilustrativo, y pueden sustituirse
por otros reactivos y disolventes conocidos por los expertos en la
materia.
Esquema
I
\newpage
Esquema
II
Esquema
IIa
El Esquema IIa ofrece una síntesis alternativa
de los alcoholes bencílicos de la presente invención, ilustrando la
síntesis del alcohol
4-(2-piperidiniletoxi)bencílico. En esta
síntesis, el alcohol 4-hidroxibencílico se trata
con un cloruro de aril-amino-alquilo
deseado, para dar lugar al correspondiente alcohol
alcoxi-bencílico. En el ejemplo específico del
Esquema IIa, el alcohol 4-hidroxibencílico puede
tratarse con clorhidrato de
1-(2-cloroetil)-piperidina en
presencia de K_{2}CO_{3}/Me_{2}CO, para dar lugar al alcohol
4-(2-piperidiniletoxi)bencílico.
El Esquema IIa también ilustra de forma más
específica otra forma de realización preferida de la presente
invención. La presente invención comprende asimismo un procedimiento
para producir compuestos alcohólicos útiles de fórmula:
en los que Y
representa
un anillo heterocíclico insaturado
o parcialmente insaturado de cinco, seis o siete miembros, que
contiene uno o dos átomos de nitrógeno, en el que el anillo
heterocíclico está unido al puente etoxi en un átomo de nitrógeno
del anillo, y está opcionalmente sustituido por 1 a 3 grupos
seleccionados a partir de halógeno, alquilo
C_{1}-C_{6}, alcoxi
C_{1}-C_{6}, tioalquilo
C_{1}-C_{6}, -CF_{3}, o
-NO_{2}.
Entre los grupos Y preferidos de dicho
procedimiento se encuentran acepina o hexametilenoimina.
El procedimiento comprende hacer reaccionar, en
un medio alcalino, el alcohol
4-hidroxibencílico con una sal, tal como una sal de
acetato, clorhidrato, bromhidrato o yodhidrato, de un compuesto de
fórmula:
en el que Y es como se ha definido
anteriormente.
Esta reacción se lleva cabo en un disolvente o
sistema de disolventes orgánico, por ejemplo, en acetona,
dimetilformamida o tetrahidrofurano. Preferentemente, el pH del
medio se mantiene por encima de pH 8, más preferentemente por
encima de pH 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
III
\newpage
Esquema
IV
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando etapas similares pueden producirse
los compuestos de la presente invención en los que "A" es
azufre, como se muestra a continuación en el Esquema V. En una
primera etapa, puede producirse tiofenóxido con hidruro de sodio,
seguido por la alquilación y reducción del aldehído correspondiente,
por ejemplo, con borohidruro de sodio, o de forma catalítica con
hidrógeno y catalizadores como níquel Raney o platino o paladio en
carbono. El alcohol resultante puede tratarse a continuación con
HCl gaseoso, para generar su clorhidrato, con tratamiento continuo
con HCl para formar un cloruro de bencilo. El producto final puede
formarse después mediante oxidación controlada del azufre hasta
sulfóxido, y después hasta sulfona, por ejemplo con ácido
m-cloroperbenzoico.
Esquema
V
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos se presentan para
ilustrar, y no para limitar, el alcance de de la invención.
En los procedimientos anteriores, los compuestos
de fórmula (I) en los que R^{1} y R^{2} adyacentes a la
fracción X representan hidrógeno se preparan a partir de alcoholes
primarios (por ejemplo, en el Esquema I, los compuestos
3a-c) que, a su vez, se preparan reduciendo los
precursores de aldehído (por ejemplo, en el Esquema I, los
compuestos 2a-c).
Los compuestos análogos de fórmula (I) en los
que uno de R^{1} y R^{2} adyacentes a la fracción X es alquilo
o perfluoroalquilo, y el otro es hidrógeno, pueden prepararse a
partir de los alcoholes secundarios adecuados, que, a su vez,
pueden prepararse a partir de las cetonas correspondientes, por
ejemplo, los compuestos que tienen una fracción COR^{1} en el que
R^{1} es alquilo o perfluoroalquilo.
Los compuestos análogos de fórmula (I) en los
que tanto R^{1} como R^{2} adyacentes a la fracción X se
seleccionan cada uno a partir de alquilo o perfluoroalquilo, pueden
prepararse a partir de los alcoholes terciarios adecuados.
Los siguientes Ejemplos y Esquemas ilustran la
preparación y la utilización de los compuestos de fórmula I. Los
Ejemplos 1, 3-5, 7, 8, 10, 11, 13, 15,
18-20 y 24-26 son comparativos.
A una suspensión espesa, bien agitada, de
p-hidroxibenzaldehído (83,5 g, 0,68 mol, 1,05 eq.) y
K_{2}CO_{3} (224 g, 1,6 mol, 2,5 eq.) en DMF (1 l) se le añade
clorhidrato de 1-(2-cloroetil)piperidina (120
g, 0,65 mol, 1,0 eq.). La mezcla de reacción se somete a reflujo
durante 2 h con agitación mecánica intensa. En ese momento la TLC
no muestra material de partida, siendo la mayor parte producto
(EtOAc/hexano 1:1). La mezcla de reacción se filtra a través de
Celite, se diluye con EtOAc (2 l), y se lava con agua (3 x 500 ml).
La capa orgánica se concentra en un evaporador rotatorio, para dar
lugar a 147 g (97%) del aldehído (2a) en forma de aceite de color
amarillo.
^{1}H RMN (CDCl_{3}/TMS): 9,87 (s, 1H), 7,81
(d, 2H, J = 8,7 Hz), 7,01 (d, 2H, J = 8,7 Hz), 4,18 (t, 2H, J =
6,03 Hz), 2,79 (t, 2H, J = 6,03 Hz), 2,51 (m, 4H),
1,6-1,4 (m, 6H)
A una suspensión espesa, bien agitada, de NaH
(65 g, dispersión al 60% en aceite, 1,6 mol, 2,2 eq.) en DMF (500
ml) se le añade una solución de clorhidrato de
p-hidroxibenzaldehído (90 g, 0,74 mol, 1,0 eq.) gota
a gota a 0ºC. La mezcla de reacción se agita durante 30 min,
después se añade cloruro de 4-[2-(hexametilenoimino)]etilo (153 g,
0,77 mol, 1,0 eq.) en porciones. La mezcla de reacción se agita
durante 1 h. En ese momento la TLC muestra poco material de
partida, siendo la mayor parte producto (EtOAc/hexano 1:1). La
mezcla de reacción se diluye con agua (1 l), y se extrae con éter
(5 l). La capa orgánica se seca con MgSO_{4}, y se concentra en
un evaporador rotatorio, para dar lugar a 176,8 g (97%) de aldehído
(2b) en forma de aceite de color amarillo.
A una suspensión espesa, bien agitada, de
p-hidroxibenzaldehído (9,54 g, 0,078 mol, 1,00 eq.)
y K_{2}CO_{3} (27 g, 0,195 mol, 2,5 eq.) en DMF (100 ml), se le
añade clorhidrato de
1-(2-cloroetil)dimetilamina (11,26 g, 0,078
mol, 1,0 eq.). La mezcla de reacción se agita durante 2 h a 60
-70ºC. En ese momento la TLC no muestra material de partida, siendo
la mayor parte producto (EtOAc/hexano/Et_{3}N 3:7:1). La mezcla de
reacción se vierte en una mezcla de agua/hielo (200 ml), y se
extrae con Et_{2}O (3 x 200 ml). La capa orgánica se seca con
MgSO_{4}, y se concentra en un evaporador rotatorio, para dar
lugar a 5,9 g (39%) de aldehído (2c) en forma de líquido de color
rosado.
^{1}H RMN (CDCl_{3}/TMS): 9,88 (s, 1H), 7,8
(d, 2H, J = 8,7 Hz), 7,02 (d, 2H, J = 8,7 Hz), 4,15 (t, 2H, J =
5,64 Hz), 2,77 (t, 2H, J = 5,64 Hz), 2,35 (s, 6H).
A una solución agitada del aldehído 2a (115 g,
0,494 mol, 1,0 eq.) en metanol (360 ml) a 0 / +5ºC se le añade
borohidruro de sodio (9,44 g, 0,249 mol, 0,5 eq.) en porciones. La
reacción se agita durante 30 min. En ese momento la TLC no muestra
material de partida, siendo la mayor parte producto
(EtOAc/hexano/trietilamina 3:7:1). La mezcla de reacción se vierte
en agua (1,1 l), se extrae con cloruro de metileno (3 x 550 ml), y
se seca con MgSO_{4}. La solución se concentra en un evaporador
rotatorio, para dar lugar a 91,6 g (80%) del alcohol 3a en forma de
aceite espeso, que cristaliza de forma instantánea al reposar que
cristaliza de forma instantánea durante la nucleación.
^{1}H RMN (CDCl_{3}/TMS): 7,23 (d, 2H, J =
8,5 Hz), 6,80 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 4,56 (s, 2H) 3,99 (t, 2H, J =
6,12 Hz), 2,69 (t, 2H, J = 6,14 Hz), 2,47 (m, 4H),
1,6-1,25 (m, 6H)
^{13}C RMN (DMSO-d_{6}):
158,23, 135,34, 128,70, 114,84, 66,42, 63,44, 58,27, 55,29, 26,45,
24,80.
Se disolvió alcohol
4-hidroxibencílico (6,2 g, 0,05 mol) en hidróxido de
sodio acuoso (5 N, 30 ml). Se añadió tolueno (30 ml), seguido por
clorhidrato de 1-(2-cloroetil)piperidina
(9,29 g, 0,05 mol) y bromuro de benciltrietilamonio (0,3 g). La
mezcla de reacción se calentó con agitación intensa durante 1,5 h.
Las capas se separaron, la capa acuosa se extrajo con tolueno (2 x
15 ml). Los extractos orgánicos se combinaron, y la capa orgánica
se lavó con agua (50 ml) y salmuera (50 ml), se secó con sulfato de
sodio, y se concentró en un evaporador rotatorio, para dar lugar a
8,725 g (75%) del alcohol (3a) en forma de aceite de color marrón
amarillento.
A una solución agitada del aldehído 2b (200 g,
0,72 mol, 1,0 eq.) en metanol (400 ml) a 0 /+5ºC se le añade
borohidruro de sodio (15,6 g, 0,41 mol, 0,57 eq.) en porciones. La
reacción se agita durante 30 min. En ese momento la TLC no muestra
material de partida, siendo la mayor parte producto
(EtOAc/hexano/trietilamina 3:7:1). La mezcla de reacción se diluye
con agua (400 ml), se extrae con cloruro de metileno
(3 x 400 ml), y se seca con MgSO_{4}. La solución se concentra en
un evaporador rotatorio, para dar lugar a 201 g (100%) del alcohol
3b en forma de aceite espeso.
^{1}H RMN (CDCl_{3}/TMS): 7,27 (d, 2H, J =
8,5 Hz), 6,87 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 4,60 (s, 2H), 4,05 (t, 2H, J =
6,21 Hz), 2,93 (t, 2H, J = 6,15 Hz), 2,77 (m, 4H),
1,7-1,5 (m, 8H)
A una solución agitada del aldehído 2c (5,9 g,
0,031 mol, 1,0 eq.) en metanol (20 ml) a 22ºC se le añade
borohidruro de sodio (0,58 g, 0,015 mol, 0,5 eq.) en porciones. La
reacción se agita durante 30 min. En ese momento la TLC no muestra
material de partida, siendo de la mayor parte producto
(EtOAc/hexano/trietilamina 5:5:1). La mezcla de reacción se diluye
con agua (50 ml), se extrae con cloruro de metileno (3 x 40 ml), y
se seca con MgSO_{4}. La solución se concentra en un evaporador
rotatorio, para dar lugar a 5,25 g (88%) del alcohol 3c en forma de
aceite espeso.
^{1}H RMN (CDCl_{3}/TMS): 7,25 (d, 2H, J =
8,64 Hz), 6,85 (d, 2H, J = 8,64 Hz), 4,52 (s, 2H), 3,99 (t, 2H, J =
5,88 Hz), 2,67 (t, 2H, J = 5,79 Hz), 2,29 (s, 6H)
Una solución del alcohol 3a (61,3 g, 0,26 mol, 1
eq.) en THF (500 ml) se enfría hasta 0 / -5ºC (baño de agua con
hielo) y se somete a burbujeo con HCl gaseoso. El burbujeo se
continúa hasta que la mezcla de reacción deja de espesarse. Se
retira el baño de refrigeración. Se añade cloruro de tionilo (29 ml,
0,39 mol, 1,5 eq.) a la suspensión espesa del clorhidrato 4a, y la
mezcla se calienta hasta 50ºC hasta que se hace transparente. La
mezcla de reacción se enfría hasta -3ºC y se agita durante 30 min.
El sólido blanco obtenido se filtra y se seca, para dar lugar a 72
g (96%) del cloruro 1a.
4a: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}):
10,9 (s, HCl), 7,25 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 6,94 (d, 2H, J = 8,5
Hz), 4,42 (m, 4H), 3,41 (m, 4H)
1a: ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}):
11 (s amplio, HCl), 7,39 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 6,99 (d, 2H, J
= 8,5 Hz), 4,74 (s, 2H), 4,46 (m, 2H), 3,45 (m, 4H), 2,69 (m, 2H) y
1,9-1,2 (m, 6H)
A una solución del alcohol 3b (179 g, 0,72 mol,
1 eq.) en THF (300 ml) se le añade una solución de HCl (26,3 g de
HCl en 263 ml de THF, 0,72 mol, 1,0 eq.) gota a gota a 0/ + 10ºC. Se
forma un precipitado blanco. Se añade cloruro de tionilo (80 ml,
1,1 mol, 1,5 eq.) a la suspensión espesa del clorhidrato 4b, y la
mezcla se calienta hasta 50ºC hasta que se hace transparente. La
mezcla de reacción se concentra hasta 350 ml, y se mantiene en el
refrigerador durante toda la noche. El sólido blanco obtenido se
filtra, se lava con THF frío (100 ml), y se seca, para dar lugar a
147 g (67%) del cloruro 1b.
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 11
(s amplio, HCl), 7,40 (d, 2H, J = 8,6 Hz), 7,00 (d, 2H, J = 8,6 Hz),
4,74 (s, 2H), 4,44 (t, 2H, J = 5,25), 3,64 -3,39 (m, 4H), 3,25
-3,17 (m, 2H), 1,84-1,54 (m, 8H)
Una solución del alcohol 3c (5,25 g, 0,027 mol,
1 eq.) en THF (100 ml) se sometió a burbujeo con HCl gaseoso a 0 /
+ 25ºC durante 15 min. Se forma un precipitado blanco. Se añade
cloruro de tionilo (6 ml, 9,6 g, 0,081 mol, 3,0 eq.) a la
suspensión espesa del clorhidrato 4c, y la mezcla se calienta a 30ºC
hasta que se hace transparente. La mezcla de reacción se concentra
a 350 ml, y se mantiene en el refrigerador durante toda la noche.
El sólido blanco obtenido se filtra, se lava con THF frío (100 ml),
y se seca, para dar lugar a 4,57 g (68%) del cloruro 1c.
Entre los compuestos farmacológicamente activos
que pueden producirse utilizando los compuestos de la presente
invención se encuentran compuestos de
2-fenil-1-[4-(2-aminoetoxi)-bencil]-indol
que son útiles como agentes estrogénicos. Dichos compuestos
comprenden los de fórmulas IV y V, presentados a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en los
que:
R^{11} se selecciona de entre H, OH o los
ésteres C_{1}-C_{12} (de cadena lineal o
ramificada) o éteres alquílicos C_{1}-C_{12}
(de cadena lineal o ramificada o cíclica) de los mismos, o
halógenos, o éteres halogenados, incluidos éter trifluorometílico y
éter triclorometílico.
R^{12}, R^{9} y R^{10} se seleccionan
independientemente de entre H, OH, o los ésteres
C_{1}-C_{12} (de cadena lineal o ramificada) o
éteres alquílicos C_{1}-C_{12} (de cadena lineal
o ramificada o cíclica) de los mismos, halógenos, o éteres
halogenados C_{1}-C_{3}, incluidos éter
trifluorometílico y éter triclorometílico, ciano, alquilo
C_{1}-C_{6} (de cadena lineal o ramificada), o
trifluorometilo, con la salvedad de que, cuando R^{1} es H,
R^{2} no es OH.
R^{13} se selecciona de entre H, alquilo
C_{1}-C_{6}, ciano, nitro, trifluorometilo,
halógeno; y
Y, A, m, R^{3} y R^{4} son como se ha
definido en la presente memoria.
Los compuestos de
2-fenil-1-[4-(2-aminoetoxi)-bencil]-indol
de este tipo son agonistas estrogénicos parciales y presentan
elevada afinidad por el receptor de estrógenos. Sin embargo, a
diferencia de lo que sucede con muchos estrógenos, estos compuestos
no provocan aumentos en el peso húmedo uterino. Dichos compuestos
son antiestrogénicos en el útero y pueden antagonizar completamente
los efectos tróficos de los agonistas estrogénicos en el tejido
uterino. Dichos compuestos son útiles para el tratamiento o la
prevención en un mamífero de enfermedades o síndromes causados por,
o asociados a, una insuficiencia de estrógenos.
Dichos compuestos tienen la capacidad de actuar
como agonistas estrogénicos, reduciendo el nivel de colesterol y
previniendo la osteopenia. Por consiguiente, dichos compuestos son
útiles en el tratamiento de muchos trastornos, incluidos
osteoporosis, hipertrofia prostática, esterilidad, cáncer de mama,
cáncer de endometrio, enfermedades cardiovasculares,
anticoncepción, enfermedad de Alzheimer, y melanoma. Además, estos
compuestos pueden usarse para la hormonoterapia sustitutiva en
mujeres posmenopáusicas, o en otros estados carenciales de
estrógenos en los que pueda resultar beneficioso el aporte
complementario de estrógenos.
Los compuestos de
2-fenil-1-[4-(2-aminoetoxi)-bencil]-indol
producidos con los compuestos de la presente invención también
pueden utilizarse en métodos para el tratamiento de la osteopenia,
que puede provenir de un desequilibro entre la formación de nuevos
tejidos óseos y la reabsorción de tejidos viejos en un individuo,
que se traduce en una osteopenia neta. Dichas reducciones del
tejido óseo tienen lugar en diversos individuos, particularmente en
mujeres posmenopáusicas, mujeres histerectomizadas, personas que
reciben, o han recibido, tratamientos prolongados con
corticosteroides, personas con disgenesia gonadal, y personas que
sufren el síndrome de Cushing. También pueden tratarse necesidades
especiales de sustitución ósea utilizando dichos compuestos en
individuos con fracturas óseas, estructuras óseas defectuosas y
personas sometidas a cirugía ósea y/o implante de prótesis. Además
de los problemas descritos anteriormente, dichos compuestos pueden
utilizarse en tratamientos para la artrosis, enfermedad de Paget,
osteomalacia, osteohalistéresis, cáncer de endometrio, mieloma
múltiple y otras formas de cáncer que tienen efectos perjudiciales
en los tejidos óseos. Se entiende que los métodos de tratamiento de
los trastornos mencionados en la presente memoria comprenden la
administración, a un individuo que necesite dicho tratamiento, de
una cantidad farmacéuticamente eficaz de uno o más de los compuestos
de la presente invención, o de una sal de los mismos
farmacéuticamente aceptable. La presente invención comprende
asimismo composiciones farmacéuticas que utilizan uno o más de los
dichos compuestos y/o las sales farmacéuticamente aceptables de los
mismos farmacéuticamente, junto con uno o más vehículos,
excipientes, etc. farmacéuticamente aceptables.
Se entiende que las dosis, pauta y forma de
administración de estos compuestos de
fenil-1-[4-(2-aminoetoxi)-bencil]-indol
variarán en función del trastorno y del individuo que se va a
tratar, y estarán sujetas al juicio del personal médico encargado.
Se prefiere que la administración de uno o más de los compuestos de
la presente memoria comience a una dosis baja y se incremente hasta
que se alcancen los efectos deseados.
La administración eficaz de dichos compuestos
puede realizarse a una dosis de aproximadamente 0,1 mg/día a
aproximadamente 1.000 mg/día. Preferentemente, la administración se
realizará desde aproximadamente 50 mg/día a aproximadamente 600
mg/día en una dosis única o en dos o más dosis divididas. Dichas
dosis pueden administrarse de cualquier forma que sea útil para
dirigir los compuestos activos de la presente memoria al torrente
sanguíneo del paciente, incluidas las formas orales, parenterales
(entre ellas las inyecciones intravenosas, intraperitoneales y
subcutáneas) y transdérmicas. Para los efectos de la presente
descripción, se entiende que las administraciones transdérmicas
incluyen todas las administraciones a través de la superficie
corporal y los revestimientos interiores de los conductos
corporales, incluidos los tejidos epiteliales y las mucosas. Dichas
administraciones pueden llevarse a cabo utilizando los compuestos
de la presente memoria, o las sales farmacéuticamente aceptables de
los mismos, en lociones, cremas, espumas, parches, suspensiones,
soluciones y supositorios (por vía rectal y vaginal).
Las formulaciones orales que contienen los
compuestos activos de la presente invención pueden comprender
cualquiera de las formas orales utilizadas habitualmente, incluidos
comprimidos, cápsulas, formas para administración bucofaríngea,
tabletas, pastillas para chupar y líquidos, suspensiones o
soluciones orales. Las cápsulas pueden contener mezclas del
compuesto o compuestos activos con rellenos inertes y/o diluyentes
tales como almidones farmacéuticamente aceptables (por ejemplo,
almidón de maíz, de patata o de tapioca), azúcares, edulcorantes
artificiales, celulosas en polvo, tales como celulosas cristalinas y
microcristalinas, harinas, gelatinas, gomas, etc. Pueden prepararse
formulaciones útiles para comprimidos por métodos convencionales de
compresión, granulación por vía húmeda y granulación por vía seca,
utilizando diluyentes, aglutinantes, lubricantes, disgregantes,
dispersantes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables, que
incluyen, sin limitarse a los mismos, estearato de magnesio, ácido
esteárico, talco, lauril sulfato de sodio, celulosa microcristalina,
carboximetilcelulosa de calcio, polivinilpirrolidona, gelatina,
ácido algínico, goma arábiga, goma xantana, citrato de sodio,
silicatos complejos, carbonato de calcio, glicina, dextrina,
sacarosa, sorbitol, fosfato dicálcico, sulfato de calcio, lactosa,
caolín, manitol, cloruro de sodio, talco, almidones secos y azúcar
en polvo. Las formulaciones orales descritas en la presente memoria
pueden utilizar formulaciones estándar de retardo o de liberación
controlada para alterar la absorción del compuesto o compuestos
activos. Las formulaciones de supositorios pueden prepararse con
materiales tradicionales, incluidos manteca de cacao, con o sin
adición de ceras para alterar el punto de fusión del supositorio, y
glicerina. También pueden utilizarse las bases hidrosolubles de
supositorios, tales como polietilenglicoles de varios pesos
moleculares.
Como se muestra en el Esquema VI, los compuestos
de este grupo pueden sintetizarse por alquilación del nitrógeno del
indol con compuestos de la presente invención, como se ilustra a
continuación en los Ejemplos 11-13, utilizando el
clorhidrato de
(4-clorometil-fenoxi)-etil-piperidin-1-ilo
del Ejemplo 8, el clorhidrato de
(4-clorometil-fenoxi)-etil-hexametilenoimina-1-ilo
del Ejemplo 9 y el clorhidrato de
(4-clorometil-fenoxi)-etil-dimetilamino
del Ejemplo 10, respectivamente. Además de NaH, pueden utilizarse
otras bases, incluido t-butóxido de potasio o
t-butóxido de sodio.
\newpage
Esquema
VI
\vskip1.000000\baselineskip
Los Esquemas VII y VIII ilustran la síntesis del
clorhidrato de
1-[4-(2-acepan-1-il-etoxi)-bencil]2-(4-hidroxi-fenil)-3-metil-1H-indol-5-ol
utilizando intermediarios de la presente invención.
Esquema
VII
El Esquema VII ilustra la alquilación del
4-hidroxibenzaldehído con clorhidrato de cloruro de
2-(hexametilamino)etilo, que puede llevarse a cabo en
presencia de carbonato de potasio, para dar lugar al correspondiente
aldehído I (Etapa 1). Cuando la reacción se completa, puede
aclararse la mezcla, mezclarse con tolueno y lavarse con agua. La
solución de tolueno puede concentrarse después, y el residuo
resultante puede tratarse con isopropanol, para dar lugar a una
solución del aldehído I. La solución isopropanólica de I puede
someterse a reducción catalítica, por ejemplo con níquel Raney,
para proporcionar al alcohol II (Etapa 2). Tras la reducción, la
mezcla de reacción puede aclararse y concentrarse, y el residuo
resultante se disuelve en dicloruro de etileno, para dar lugar a
una solución que contiene el alcohol II. Esta solución puede
tratarse con cloruro de tionilo, seguido por la concentración. El
residuo resultante puede tratarse después con
1,2-dimetoxietano, para dar lugar al producto
cristalino III (Etapa 3).
Esquema
VIII
En el Esquema VIII, Etapa 4, la
4-benciloxipropiofenona se somete a bromación en
ácido acético con bromo. Cuando se completa la reacción, la mezcla
puede desactivarse con agua, y el precipitado resultante se lava
con ácido acético diluido, agua y heptano. El sólido resultante se
seca, para dar lugar a IV, clorhidrato de
4-benciloxianilina. En la Etapa 5, una mezcla de IV,
N,N-diisopropiletilamina y tolueno se calienta en
condiciones de reflujo, con eliminación de agua. Cuando se completa
la reacción, la mezcla puede enfriarse y diluirse con metanol. Los
sólidos producidos pueden recogerse, lavarse con metanol y secarse,
para dar lugar al compuesto de indol V. Una mezcla de los
compuestos V y III puede mezclarse en la Etapa 6 con
ter-butóxido de sodio en
N,N-dimetilformamida y agitarse hasta completar la
reacción. A continuación, la mezcla puede desactivarse con
salmuera, y extraerse con tolueno. Los extractos se concentran y el
residuo se diluye con metanol. Los sólidos resultantes pueden
recogerse, disolverse en acetato de etilo, aclararse, y diluirse con
metanol. Los sólidos pueden recogerse a partir de esta dilución y
secarse, para dar lugar al compuesto VI.
En una Etapa 7 (no mostrada), el compuesto VI en
una solución de etanol puede hidrogenarse con un catalizador de
Pd-carbón. Tras el aclaramiento, el material
hidrogenado puede mezclarse con una pequeña cantidad de ácido
ascórbico y tratarse con ácido acético. El precipitado cristalino
resultante puede después recogerse, lavarse con etanol y secarse,
para dar lugar al producto final, clorhidrato de
1-[4-(2-acepan-1-il-etoxi)-bencil]2-(4-hidroxi-fenil)-3-metil-1H-indol-5-ol.
A continuación, el producto puede recristalizarse en etanol, que
contiene opcionalmente una pequeña cantidad de ácido ascórbico,
preferentemente, por ejemplo, de aproximadamente 0,5% en peso a
aproximadamente 3,0% en peso.
En las descripciones anteriores, los
intermediarios III a VI pueden aislarse fácilmente en forma de
sólidos. Todos los demás intermediarios pueden utilizarse más
preferentemente en forma de soluciones en disolventes
orgánicos.
Los Esquemas IX a XII ilustran la síntesis de
2-(4-hidroxi-fenil)-metil-1-[4-(2-piperidin-1-il-etoxi)-bencil]-1H-indol-5-ol
utilizando intermediarios de la presente invención. El Esquema IIa,
descrito anteriormente, puede considerarse una primera etapa del
Esquema IX, o una etapa anterior del mismo. En esta etapa, el
alcohol 4-hidroxibencílico se trata con un cloruro
de aril-alquil-amino deseado, para
dar lugar al correspondiente alcohol
alcoxi-bencílico. En el ejemplo específico del
Esquema IIa, el alcohol 4-hidroxibencílico se trata
con clorhidrato de
1-(2-cloroetil)-piperidina en
presencia de K_{2}CO_{3}/Me_{2}CO, para dar lugar al alcohol
4-(2-piperidiniletoxi)bencílico. Pueden
añadirse tolueno y salmuera a la mezcla del alcohol resultante para
separar sus fases. La fase de tolueno puede lavarse después
sucesivamente con álcali acuoso y salmuera. El lote resultante puede
después concentrarse, y puede añadírsele dicloruro de etileno para
formar una solución del intermediario, alcohol
4-(2-piperidiniletoxi)bencílico.
La solución del alcohol
4-(2-piperidiniletoxi)bencílico en dicloruro
de etileno puede combinarse con cloruro de tionilo y calentarse
hasta que se complete la reacción. Tras enfriar, la mezcla puede
concentrarse, seguido por la adición de
1,2-dimetoxietano y la concentración adicional. El
precipitado puede recogerse y secarse, para proporcionar el
intermediario de clorhidrato de cloruro de
4-(2-piperidiniletoxi)bencilo, como se
muestra en el Esquema IX.
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Esquema
IX
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Como se muestra en el Esquema IX, una solución
de alcohol 4-(2-piperidiniletoxi)bencílico
puede combinarse con cloruro de etileno y cloruro de tionilo, y
calentarse hasta crear una mezcla de reacción. Tras enfriar, la
mezcla de reacción puede tratarse con
1,2-dimetoxietano y concentrarse de nuevo. El
precipitado resultante, clorhidrato de cloruro de
4-(2-piperidiniletoxi)bencilo, puede después
recogerse y secarse.
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Esquema
X
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El Esquema X ilustra la bromación de
4-benciloxipropiofenona en ácido acético con bromo,
para dar lugar a
4'-(benciloxi)-2-bromopropiofenona.
Cuando se completa esta reacción, la mezcla puede desactivarse con
agua. El precipitado resultante puede recogerse, lavarse con ácido
acético diluido, agua y heptano, y secarse.
\newpage
Esquema
XI
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El producto de
4'-(benciloxi)-2-bromopropiofenona
del Esquema X puede calentarse con clorhidrato de
4-benciloxianilina en presencia de
N,N-diisopropiletilamina y tolueno en condiciones de
reflujo, con eliminación azeotrópica de agua, como se muestra en el
Esquema XI. Cuando se completa la reacción, la mezcla puede
enfriarse y diluirse con metanol. Los sólidos resultantes de
3-metil-2-(4-benciloxi)fenil-5-benciloxiindol
pueden recogerse, lavarse con metanol, y secarse.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
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Esquema
XII
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El producto de
3-metil-2-(4-benciloxi)fenil-5-benciloxiindol
del Esquema XI puede hacerse reaccionar después con clorhidrato de
cloruro de 4-(2-piperidiniletoxi)bencilo en
presencia de ter-butóxido de sodio en
N,N-dimetilformamida. La mezcla resultante puede
desactivarse con salmuera, y extraerse con tolueno. Después del
aclarado, los extractos pueden concentrarse y diluirse con metanol.
Los sólidos resultantes de
5-benciloxi-2-(4-benciloxifenil)-1-[4-(2-piperidin-1-il-etoxi)bencil]-1H-indol
pueden recogerse, disolverse en acetato de etilo y diluirse con
metanol, y secarse. Estos sólidos pueden disolverse en
etanol-tetrahidrofurano y someterse a hidrogenación
utilizando catalizador de Pd-carbón. La solución
puede después aclararse, opcionalmente mezclarse con una pequeña
cantidad de ácido ascórbico, y después tratarse con HCl acuoso. A
continuación puede recogerse el precipitado, lavarse con
etanol-tetrahidrofurano y agua, y secarse, para dar
lugar al producto final de
2-(4-hidroxi-fenil)-3-metil-1-[4-(2-piperidin-1-il-etoxi)-bencil]-1H-indol-5-ol.
A una solución de
5-benciloxi-2-(4-benciloxi-fenil)-3-metil-1H-indol
(117,5 g, 0,28 mol, 1,0 eq.) en DMF (1,3 l) se le añadió NaH (28,0
g, dispersión al 60% en aceite, 0,7 mol, 2,5 eq.) en porciones a -5
/ -8ºC durante 1 h. La mezcla de reacción se agitó durante 2 h. Se
añadió una solución del cloruro del Ejemplo 8 en THF (1,0 l), gota
a gota, a -10 /
0ºC durante 2 h. La mezcla de reacción se agitó a 25ºC durante toda la noche. En ese momento la TLC no mostró material de partida, siendo de la mayor parte producto (EtOAc/hexano 1:5). La mezcla de reacción se diluyó con agua (6 l), se extrajo con EtOAc (2 x 3 l), y se secó con Na_{2}SO_{4}. La solución se concentró hasta 1 l, se vertió en MeOH (2,5 l), y se agitó durante 1 h. El precipitado se filtró y se secó, para dar lugar al compuesto del título (129 g, 73%).
0ºC durante 2 h. La mezcla de reacción se agitó a 25ºC durante toda la noche. En ese momento la TLC no mostró material de partida, siendo de la mayor parte producto (EtOAc/hexano 1:5). La mezcla de reacción se diluyó con agua (6 l), se extrajo con EtOAc (2 x 3 l), y se secó con Na_{2}SO_{4}. La solución se concentró hasta 1 l, se vertió en MeOH (2,5 l), y se agitó durante 1 h. El precipitado se filtró y se secó, para dar lugar al compuesto del título (129 g, 73%).
^{1}H RMN (CDCl_{3}/TMS): 7,64 - 6,63 (m,
21H), 5,12 (s, 2H), 5,09 (s, 2H), 5,07 (s, 2H), 4,07 (t, 2H, J =
6,06 Hz), 2,72 (t, 2H, J = 6,06 Hz), 2,48 (m, 4H), 2,24 (s, 3H),
1,62 - 1,24 (m, 6H).
A una suspensión espesa de NaH (20,0 g,
dispersión al 60% en aceite, 0,5 mol, 2,5 eq.) se le añadió solución
de
5-benciloxi-2-(4-benciloxi-fenil)-3-metil-1H-indol
(84 g, 0,2 mol, 1,0 eq.) en DMF (100 ml) a 0 / + 10°C durante 1 h.
La mezcla de reacción se agitó durante 30 min. Se añadió una
solución del cloruro del Ejemplo 9 (67 g, 0,22 mol, 1,1 eq.) en DMF
(200 ml), gota a gota, a 0 / + 10ºC durante 2 h. La mezcla de
reacción se agitó a 25ºC durante 2 h. En ese momento la TLC no
mostró material de partida, siendo la mayor parte producto
(EtOAc/hexano 1:5). La mezcla de reacción se diluyó con agua (1 l),
se extrajo con EtOAc (3 x 1 l), y se secó con MgSO_{4}. La
solución se concentró hasta 150 ml, se vertió en MeOH (750 ml), y se
agitó durante toda la noche. El precipitado se filtró y se secó,
para dar lugar al compuesto del título (99 g, 76%).
^{1}H RMN (CDCl_{3}/TMS): 7,48 - 6,74 (m,
21H), 5,13 (s, 2H), 5,11 (s, 2H), 5,09 (s, 2H), 4,00 (t, 2H, J =
6,24 Hz), 2,91 (t, 2H, J = 6,27 Hz), 2,75 (m, 4H), 2,24 (s, 3H),
1,71 - 1,52 (m, 8H)
A una suspensión espesa de NaH (1,1 g,
dispersión al 60% en aceite, 0,05 mol, 2,5 eq.) se le añadió una
solución del indol
5-benciloxi-2-(4-benciloxi-fenil)-3-metil-1H-indol
(6,97 g, 0,017 mol, 1,0 eq.) en DMF (100 ml) a 0/+ 10ºC durante 0,5
h. La mezcla de reacción se agitó durante 30 min. Se añadió una
solución del cloruro del Ejemplo 10 (4,57 g, 0,018 mol, 1,1 eq.),
en porciones, a 0/ + 10ºC durante 2 h. La mezcla de reacción se
agitó a 25ºC durante 0,5 h. En ese momento la TLC no mostró material
de partida, siendo de la mayor parte producto. (EtOAc/hexano 1:5).
La mezcla de reacción se diluyó con agua (200 ml), se extrajo con
EtOAc (3 x 200 ml), y se secó con MgSO_{4}, La solución se
concentró hasta 150 ml, se vertió en MeOH (300 ml), y se agitó
durante toda la noche. El precipitado se filtró y se secó, para dar
lugar al compuesto del título (5,6 g, 53%).
^{1}H RMN (CDCl_{3}/TMS):
7,50-6,66 (m, 21H), 5,13 (s, 2H), 5,11 (s, 2H), 5,09
(s, 2H), 3,99 (t, 2H, J = 5,76 Hz), 2,69 (t, 2H, J = 5,73 Hz), 2,31
(s, 6H), 2,42 (s, 3H)
Se cargó un matraz con
4-benciloxianilina (45 g, 0,23 mol),
4'-benciloxi-2-bromofenilpropiofenona
(66414-19-5) (21 g, 0,066 mol) y 50
ml DMF. La reacción se calentó en condiciones de reflujo durante 30
minutos, y después se enfrió hasta temperatura ambiente y se
repartió entre 250 ml EtOAc y 100 ml de HCl 1 N (acuoso). El EtOAc
se lavó con NaHCO_{3} (acuoso) y salmuera, se secó con MgSO_{4}.
La solución se concentró y el residuo se recogió en
CH_{2}Cl_{2}, y se añadieron hexanos, para precipitar 25 g de un
sólido crudo. El sólido se disolvió en CH_{2}Cl_{2}, y se
evaporó en gel de sílice y se cromatografió utilizando
CH_{2}Cl_{2}/hexano (1:5), para dar lugar a 9,2 g de un sólido
de color canela (33%): T.p.f. = 150-152ºC; ^{1}H
RMN (DMSO) 10,88 (s, 1 H), 7,56 (d, 2 H, J = 8,8
Hz), 7,48 (d, 4 H, J = 7,9 Hz), 7,42-7,29 (m, 6 H),
7,21 (d, 1 H, J = 7,0 Hz), 7,13 (d, 2 H, J = 8,8 Hz), 7,08 (d, 1 H,
J = 2,2 Hz), 6,94 (dd, 1 H, J = 8,8, 2,4 Hz), 5,16 (s, 2 H), 5,11
(s, 2 H), 2,33 (s, 3 H); IR (KBr) 3470, 2880, 2820, 1620 cm^{-1};
EM eI m/z 419.
Una suspensión de Pd al 10% /C (1,1 g) en EtOH
se trató con una solución del compuesto del título del Ejemplo 11
(2,2 g, 3,4 mmol) en THF/EtOH. Se añadió ciclohexadieno (6,0 ml, 63
mmol) y la reacción se agitó durante 48 horas. El catalizador se
filtró a través de Celite, y la mezcla de reacción se concentró y se
cromatografió en gel de sílice, utilizando una elución con
gradiente de MeOH/CH_{2}Cl_{2} (1:19 hasta 1:10), para dar
lugar a 0,8 g del producto en forma de sólido blanco. T.p.f. =
109-113ºC; CHN calculado para
C_{29}H_{32}N_{2}O_{3} + 0,5 H_{2}O; ^{1}H RMN 9,64 (s,
1 H), 8,67 (s, 1 H), 7,14 (d, 2 H, J = 8,6 Hz), 7,05 (d, 1 H, J =
8,6 Hz), 6,84 (d, 2 H, J = 8,8 Hz), 6,79 (d, 1 H, J = 2,2 Hz), 6,74
(s, 4 H), 6,56 (dd, 1 H, J = 8,8, 2,4 Hz), 5,09 (s, 2 H),
3,95-3,93 (m, 2 H), 2,60-2,51 (m, 2
H), 2,39-2,38 (m, 4 H), 2,09 (s, 3 H),
1,46-1,45 (m, 4 H), 1,35-1,34 (m, 2
H); IR (KBr) 3350 (br), 2920, 1620, 1510 cm^{-1}; EM (EI) m/z
456.
Se cultivaron células CHO que sobreexpresaban el
receptor de estrógenos en placas de 150 mm^{2}, en DMEM + 10% de
suero bovino fetal tratado con carbón recubierto con dextrano. Las
placas se lavaron dos veces con PBS y una vez con
Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM. Las células se
recogieron raspando la superficie, y después se colocó la
suspensión de células en hielo. Las células se rompieron con un
homogeneizador de tejidos manual, equipado con un motor, utilizando
dos pasadas de 10 segundos. La preparación cruda se centrifugó a
12.000 x g durante 20 minutos, seguido por una centrifugación de 60
minutos a 100.000 x g, para obtener un citosol exento de ribosomas.
A continuación se congeló el citosol y se almacenó a -80ºC. La
concentración de proteínas del citosol se estimó utilizando el
ensayo BCA con proteína patrón de referencia.
El ensayo de competición se realizó en una placa
de 96 pocillos (poliestireno*) que fija < 2,0% del
[^{3}H]-17_-estradiol total
añadido, y se registró cada punto de medida por triplicado. Se
repartieron partes alícuotas de 100 \mug/100 \mul de la
preparación de receptores por pocillo. Se añadió una dosis saturante
de [^{3}H]-17_-estradiol 2,5 nM +
competidor (o tampón) en un volumen de 50 \mul, en la competición
preliminar; cuando se evaluaron concentraciones de competidor de
100x y 500x, sólo se utilizó
[^{3}H]-17_-estradiol 0,8 nM. La
placa se incubó a temperatura ambiente durante 2,5 h. Al final de
este período de incubación se añadieron a cada pocillo 150 \mul de
carbón recubierto con dextrano y enfriado con hielo (5% de carbón
activado recubierto con 0,05% de dextrano de 69 K) y la placa se
centrifugó inmediatamente a 99 x g durante 5 minutos a 4ºC. A
continuación se extrajeron 200 \mul de la solución sobrenadante
para recuento por centelleo. Las muestras se contaron hasta 2% o 10
minutos, lo que tuviese lugar antes. Dado que el poliestireno
absorbe una pequeña cantidad de
[^{3}H]-17_-estradiol, se
incluyeron pocillos que contenían radiactividad y citosol, pero que
no habían sido tratados con carbón, para cuantificar las cantidades
de isótopo disponibles. Asimismo, se trataron con carbón pocillos
que contenían radiactividad pero no citosol, para estimar las DPM
no eliminables de
[^{3}H]-17_-estradiol. Se
emplearon placas de 96 pocillos Corning n.º
25880-96, ya que se ha demostrado que fijan la
cantidad mínima de estradiol.
Las cuentas por minuto (CPM) de radiactividad se
convirtieron automáticamente a desintegraciones por minuto (DPM)
por el contador de centelleo Beckman LS 7500 utilizando un conjunto
de patrones atenuados, para generar el valor de H# para cada
muestra. Para calcular el % de fijación de estradiol en presencia de
una cantidad 100 o 500 veces mayor de competidor, se aplicó la
siguiente fórmula:
((DPM de la
muestra-DPM no eliminadas por carbón)/(DPM del
estradiol-DPM no eliminadas
por carbón)) x 100 % = % de fijación de estradiol
por carbón)) x 100 % = % de fijación de estradiol
Para la generación de las curvas de CI_{50} se
representa el % de fijación frente al compuesto. Las CI_{50} se
generan para compuestos que muestran > 30% de competición a una
concentración de competidor de 500x. Para una descripción de estos
métodos, véase Hulme, E.C., ed. 1992,
Receptor-Ligand Interactions: A Practical Approach.
IRL Press, Nueva York. (Véase especialmente el capítulo 8). La
referencia en las tablas siguientes al compuesto del Ejemplo 1 se
refieren al producto final,
2-(4-hidroxi-fenil)-3-metil-1-[4-(2-piperidin-1-il-etoxi)-bencil]-1H-indol-5-ol.
Compuesto | RBA |
Raloxifeno | 200 |
Tamoxifeno | 1,8 |
Equilina | 5,3 |
Ejemplo 15 | 400 |
Se mantuvieron células de Ishikawa en DMEM/F12
(50%:50%) que contenía rojo fenol + suero bovino fetal al 10%, y se
añadió al medio un aporte complementario de Glutamax 2 mM,
penicilina/estreptomicina al 1%, y piruvato de sodio 1 mM. Cinco
días antes del comienzo de cada experimento (tratamiento de células)
se cambió el medio a DMEM exento de rojo fenol /F12 + suero al 10%
tratado con carbón recubierto de dextrano. El día anterior al
tratamiento se recogieron las células utilizando tripsina al
0,5%/EDTA y se sembraron a una densidad de 5 x 10 células/pocillo
en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Los compuestos de
prueba se añadieron a concentraciones de 10^{-6}, 10^{-7} y
10^{-8} M, además de 10^{-6} M (compuesto) +
17_-estradiol 10^{-9} M para evaluar la capacidad
de los compuestos para actuar como antiestrógenos. Las células se
trataron durante 48 h antes del ensayo. Cada placa de 96 pocillos
contenía un testigo de 17_-estradiol. La población
de la muestra para cada dosis fue
n=8.
n=8.
Al final del período de 48 h, se aspira el medio
y se lavan las células tres veces con solución salina tamponada con
fosfato (PBS). Se añaden 50 \mul de tampón de lisis
(Tris-HCl, 0,1 M, pH 9,8, Triton
X-100 al 0,2%) a cada pocillo. Las placas se
colocan a -80ºC durante un mínimo de 15 minutos. Las placas se
descongelan a 37ºC, y después se añaden a cada pocillo 150 \mul
de Tris-HCl 0,1 M, pH 9,8, que contiene
para-nitrofenilfosfato (pNPP) 4 mM (concentración
final, pNPP 3 mM). Los cálculos de la absorbancia y de la pendiente
se realizaron utilizando el programa KineticCalc Application
(Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT). Los
resultaron se expresaron como la media \pm D.T. de la velocidad
de reacción enzimática (pendiente) calculada como promedio de la
porción lineal de la curva de reacción cinética (lecturas de la
densidad óptica cada 5 minutos durante 30 minutos de lectura de la
absorbancia). Los resultados para los compuestos se resumen como
porcentaje de la respuesta relativa a 17_-estradiol
1 nM. Se ensayaron varios compuestos para determinar su actividad
estrógenica por el método de la fosfatasa alcalina, y se calcularon
los correspondientes valores de ED_{50} (I.C. del 95%). Los cuatro
compuestos mencionados a continuación fueron utilizados como
patrones de referencia:
17_-estradiol | 0,03 nM | 17_-estradiol | 1,42 nM |
estriol | 0,13 nM | estrona | 0,36 nM |
Una descripción de estos métodos puede
consultarse en Holinka, C.F., Hata, H., Kuramoto, H. y Gurpide, E.
(1986) Effects of steroid hormones and antisteroids on alkaline
phosphatase activity in human endometrial cancer cells (Ishikawa
Line). Cancer Research, 46: 2771-2774, y en
Littlefield, B.A., Gurpide, E., Markiewicz, L., McKinley, B. y
Hochberg, R.B. (1990) A simple and sensitive microtiter plate
estrogen bioassay based on stimulation alkaline phosphatase in
Ishikawa cells; Estrogen action of D5 adrenal steroids.
Endocrinology, 6: 2757-2762.
Compuesto | % de activación |
17_-estradiol | 100% de actividad |
Tamoxifeno | 0% de actividad (45% con 17_-estradiol 1 nM) |
Raloxifeno | 5% de actividad (5% con 17_-estradiol 1 nM) |
Ejemplo 15 | 1% de actividad (1% con 17_-estradiol 1 nM) |
Se mantuvieron células de ovario de hámster
chino (CHO), que habían sido transfectadas de forma estable con el
receptor de estrógenos humano, en DMEM + suero bovino fetal al 10%
(FBS). El medio de cultivo se sustituyó, 48 h antes del
tratamiento, por DMEM exento de rojo fenol + FBS al 10% tratado con
carbón recubierto de dextrano (medio de tratamiento). Las células
se sembraron a una densidad de 5000 células/pocillo en placas de 96
pocillos que contenían 200 \mul de medio/pocillo.
Se combinó ADN indicador (plásmido pGL2 de
Promega, que contenía dos copias en tándem del sector ERE de la
vitelogenina antes del promotor mínimo de la timidina quinasa que
controla la expresión del gen de la luciferasa) con el plásmido de
expresión pCH110 (Pharmacia) de la
\beta-galactosidasa y con ADN portador (pTZ18U) en
la siguiente relación:
- 10 \mug de ADN indicador
- 5 \mug de ADN de pCH110
- 5 \mug de pTZ18U
- 20 \mug de ADN/1 ml de solución de transfección
Se disolvió el ADN (20 \mug) en 500 \mul de
CaCl_{2} 250 mM estéril, y se añadió gota a gota a 500 \mul de 2
X HeBS (NaCl 0,28 M, HEPES 50 mM, Na_{2}HPO_{4} 1,5 mM, pH
7,05) y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se
añadieron 20 \mul de esta mezcla a cada pocillo de células, y se
mantuvieron en contacto con las células durante 16 h. Al final de
esta incubación se eliminó el precipitado, las células se lavaron
con medio, se introdujo un nuevo medio de tratamiento, y se
trataron las células con vehículo, 17_-estradiol 1
nM, compuesto 1 \muM o compuesto 1 \muM +
17_-estradiol 1 nM (pruebas para antagonismo
estrogénico). Cada tipo de tratamiento se llevó a cabo en 8
pocillos (n=8), que se incubaron durante 24 h antes del ensayo de la
luciferasa.
Tras 24 h de exposición a los compuestos, el
medio se eliminó y cada pocillo se lavó 2 veces con 125 \mul de
PBS exenta de Mg^{++} y Ca^{++}. Tras eliminar la PBS, se
añadieron 25 \mul de tampón de lisis de Promega a cada pocillo, y
se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 min, seguido por
15 min a -80ºC y 15 min a 37ºC. Se transfirieron 20 \mul del
lisado a una placa de 96 pocillos opaca, para la evaluación de la
actividad de la luciferasa, y el resto del lisado (5 \mul) se
utilizó para la evaluación de la actividad de la
\beta-galactosidasa (normalización de la
transfección). Se añadió a cada pocillo de modo automático, por
medio del luminómetro, el sustrato de luciferina (Promega) en partes
alícuotas de 100 \mul, y se registró la luz producida (unidades
lumínicas relativas) 10 segundos después de la adición.
Compuesto | % de activación |
17_-estradiol | 100% de actividad |
Estriol | 38% de actividad |
Tamoxifeno | 0% de actividad (10% con 17_-estradiol 1 nM) |
Raloxifeno | 0% de actividad (0% con 17_-estradiol 1 nM) |
Ejemplo 15 | 0% de actividad (0% con 17_-estradiol 1 nM) |
A los 5 \mul restantes del lisado se les
añadieron 45 \mul de PBS. Después se añadieron 50 \mul del
tampón 2X de ensayo de la \beta-galactosidasa de
Promega, se mezcló bien y se incubó a 37ºC durante 1 hora. Para cada
tanda experimental se preparó una placa que contenía una curva
patrón (de 0,1 a 1,5 miliunidades, por triplicado). Las placas se
analizaron en un lector de placas espectrofotométrico de Molecular
Devices, a 410 nm. Se convirtieron las densidades ópticas de las
incógnitas en miliunidades de actividad por extrapolación matemática
a partir de la curva patrón.
Los datos de la luciferasa se obtuvieron en
forma de unidades lumínicas relativas (ULR) acumuladas durante un
período de medición de 10 segundos, y se transfirieron
automáticamente a un archivo JMP (SAS Inc), en el que se
sustrajeron las ULR de fondo. Los valores de la
\beta-galactosidasa se importaron automáticamente
al archivo, y estos valores se dividieron por las ULR para
normalizar los datos. La media y las desviaciones típicas se
determinaron a partir de n=8 en cada tratamiento. La actividad de
los compuestos se comparó con la del 17_-estradiol
en cada placa. El porcentaje de actividad, comparada con la del
17_-estradiol, se calculó utilizando la fórmula %=
((Estradiol-testigo)/(valor del compuesto)) X 100.
Estas técnicas se describen en Tzukerman, M.T., Esty, A.,
Santiso-Mere, D., Danielian, P., Parker, M.G.,
Stein, R.B., Pike, J.W. y McDonnel, D.P. (1994). Human estrogen
receptor transactivational capacity was determined by both cellular
and promoter context and mediated by two functionally distinct
intramolecular regions (véase Molecular Endocrinology,
8:21-30).
Las propiedades estrogénicas y antiestrogénicas
de los compuestos se determinaron en un ensayo uterotrófico en
ratas inmaduras (4 días) descrito previamente por L.J. Black y R.L.
Goode, Life Sciences, 26, 1453 (1980). Se analizaron ratas
Sprague-Dawley inmaduras (hembras, 18 días de edad)
en grupos de seis. Se trataron los animales con inyecciones i.p.
diarias de 10 \mug del compuesto, 100 \mug del compuesto, (100
\mug del compuesto + 1 \mug de 17_-estradiol)
para verificar la capacidad antiestrogénica, y 1 \mug de
17_-estradiol, con DMSO al 50% /solución salina al
50% como vehículo de inyección. En el día 4 se sacrificaron los
animales por asfixia con CO_{2}, se extrajeron los úteros y se
eliminó el exceso de lípidos, así como todos los líquidos, y se
determinó el peso húmedo. Una pequeña sección de una de las trompas
se remitió para análisis histológico y el resto se utilizó para
aislar el ARN total con el fin de evaluar la expresión del gen del
componente 3 del complemento.
Compuesto | 10 \mug | 100 \mug |
Tamoxifeno | 69,6 mg | 71,4 mg |
Raloxifeno | 47,5 mg | 43,2 mg |
Testigo = 42,7 mg | 1 \mug de 17_-estradiol = 98,2 |
Compuesto | 10 \mug | 100 \mug | 100 \mug + 1 \mug de 17_-estradiol |
Ejemplo 15 | 39,9 mg | 27,4 mg | 24,3 mg |
Testigo = 30,7 mg | 1 \mug de 17_-estradiol = 63,2 mg |
El compuesto raloxifeno, clorhidrato de
[2-(4-hidroxifenil)-6-hidroxibenzo[b]tien-3-il][4-(1-piperidinil)etoxi]fenil-metanona,
es representativo de una clase de compuestos que se sabe que son
moduladores selectivos del receptor de estrógenos, que ejercen
acciones de tipo agonista en los tejido óseos y los lípidos séricos,
mientras presentan antagonismo estrogénico en los tejidos uterino y
mamario. Palkowitz et al. describen en J. Med. Chem. 1997,
40, 1407, análogos activos de raloxifeno, que pueden también
producirse utilizando los compuestos de la presente invención. Por
ejemplo, el compuesto 4a descrito por dichos autores, clorhidrato de
[2-(4-hidroxifenil)-6-hidroxibenzo[b]tien-3-il][4-(1-piperidinil)etoxi]-fenil-metano,
puede prepararse siguiendo el siguiente esquema general de
reacción.
A una solución de 2,00 g (0,013 mol) de
antranilato de metilo disuelto en 20 ml de cloroformo se le
añadieron 3,2 ml (0,039 mol) de piridina, seguido por 2,733 g
(0,013 mol) de cloruro de p-metoxibencenosulfonilo.
La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 h,
y se lavó a continuación con HCl 3 N y agua. Los productos
orgánicos se secaron después con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se
concentraron en vacío. El sólido blanco resultante se lavó con éter
y se secó en vacío, para dar lugar a 3,7 g (87%) de la sulfonamida
deseada. Espectrometría de masas con CI: 322 (M+H).
De la misma manera descrita en el Ejemplo 16,
6,24 g (0,038 mol) de
metil-3-metil-antranilato
proporcionaron 6,21 g (49%) de la sulfonamida deseada en forma de
sólido blanco. Espectrometría de masas con electronebulización:
336,2 (M+H).
A una solución agitada de
4-hidroxi-benzaldehído (12,2 g, 0,1
mol) y K_{2}CO_{3} (25 g, exceso) en
N,N-dimetilformamida (250 ml) se le añadió
monoclorhidrato de 1-(2-cloroetil)piperidina
(20,0 g, 1,08 mol). La mezcla de reacción se calentó hasta 80ºC
durante 24 h y se enfrió hasta la temperatura ambiente. La mezcla de
reacción se desactivó con agua enfriada con hielo, y se extrajo con
cloroformo. Los productos orgánicos se lavaron con agua, se secaron
con MgSO_{4} anhidro, se filtraron y se concentraron en vacío. El
residuo se disolvió en metanol, y se le añadió lentamente
borohidruro de sodio (10 g, exceso) a 0ºC. La mezcla de reacción se
agitó a temperatura ambiente durante 2 h, y después se desactivó
con agua. El alcohol se extrajo con cloroformo, los productos
orgánicos se lavaron bien con agua, se secaron con Na_{2}SO_{4},
se filtraron y se concentraron al vacío.
El alcohol crudo así obtenido se disolvió en THF
(200 ml), y se sometió a burbujeo con HCl gaseoso durante 30
minutos a 0ºC. A la suspensión de clorhidrato así obtenida se le
añadió lentamente cloruro de tionilo (30 ml, exceso). La mezcla de
reacción se sometió a reflujo durante treinta minutos, y se enfrió
hasta la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró
después hasta sequedad, y se trituró con éter anhidro. El sólido
precipitado se filtró y se secó en vacío a temperatura ambiente,
para proporcionar 25 g (86%) del producto en forma de sólido
blanco. P.f. 145 -148ºC. Espectrometría de masas con
electronebulización: 256 (M+H).
A una solución agitada de
4-hidroxi-benzaldehído (12,2 g, 0,1
mol) y K_{2}CO_{3} (25 g, exceso) en
N,N-dimetilformamida (250 ml) se le añadió
monoclorhidrato de cloruro de 2-dietilaminoetilo
(20,0 g, 1,2 mol). La mezcla de reacción se calentó hasta 80ºC
durante 24 h y se enfrió hasta la temperatura ambiente. La mezcla de
reacción se desactivó con agua enfriada con hielo, y se extrajo con
cloroformo. Los compuestos orgánicos se lavaron con agua, se
secaron con MgSO_{4} anhidro, se filtraron y se concentraron en
vacío. El residuo se disolvió en metanol, y se le añadió lentamente
borohidruro de sodio (10 g, exceso) a 0ºC. La mezcla de reacción se
agitó a temperatura ambiente durante 2 h y después se desactivó con
agua. El alcohol se extrajo con cloroformo, se lavó bien con agua,
se secó, se filtró y se concentró al vacío.
El alcohol crudo así obtenido se disolvió en THF
(200 ml) y se sometió a burbujeo con HCl gaseoso durante 30 minutos
a 0ºC. A la suspensión de clorhidrato así obtenida se le añadió
lentamente cloruro de tionilo (30 ml, exceso). La mezcla de
reacción se sometió a reflujo durante treinta minutos, y se enfrió
hasta la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentró
después hasta sequedad y se trituró con éter anhidro. El sólido
precipitado se filtró y se secó en vacío a temperatura ambiente,
para proporcionar 18 g (65%) del producto en forma de sólido
blanco, p.f. 76-79ºC. Espectrometría de masas con
electronebulización: 244 (M+H).
A una solución de 1,00 g (2,985 mmol) del éster
metílico del ácido
2-(4-metoxi-bencenosulfonilamino)-3-metil-benzoico
en 5 ml de DMF se le añadieron 0,952 g (3,284 mmol) de cloruro de
4-(2-piperidin-1-il-etoxi)bencilo
y 1,65 g (11,9 mmol) de carbonato de potasio. La mezcla de reacción
se agitó después a temperatura ambiente durante 18 h, se diluyó con
agua y se extrajo con éter. Los productos orgánicos se extrajeron
después con solución de HCl 6 N, y la capa ácida acuosa se
alcalinizó después con solución de NaOH 6 N y se extrajo con éter.
La capa de éter resultante se secó con sulfato de sodio, se filtró
y se concentró en vacío, para dar lugar a 0,965 g del éster de
piperidina en forma de aceite incoloro. Espectrometría de masas con
electronebulización: 553,5 (M+H)^{+}.
A una solución de 0,889 g (1,611 mmol) del éster
de piperidina en 7 ml de THF se le añadieron 0,203 g de hidróxido
de litio monohidrato. La mezcla resultante se calentó hasta reflujo
durante 15 h, y después se concentró en vacío hasta obtener un
residuo. El residuo se diluyó con agua, se neutralizó con solución
de HCl al 5% y se extrajo con diclorometano. La capa orgánica se
secó con Na_{2}SO_{4}, se filtró y se concentró en vacío, para
dar lugar a 0,872 g del ácido carboxílico en forma de espuma blanca.
Espectrometría de masas con electronebulización: 539,2
(M+H)^{+}.
A una solución de 0,814 g (1,513 mmol) del ácido
carboxílico en 10 ml de DMF se le añadieron 0,245 g (1,82 mmol) de
HOBT y 0,386 g (2,01 mmol) de EDC. La reacción se agitó después
durante 1 h a temperatura ambiente, y se le añadieron 0,46 ml (7,57
mmol) de una solución de hidroxilamina al 50% en agua. La reacción
se agitó durante toda la noche y después se concentró en vacío
hasta obtener un residuo. El residuo se diluyó con EtOAc, se lavó
con agua y solución de bicarbonato de sodio, se secó con
Na_{2}SO_{4}, se filtró y se concentró en vacío hasta obtener
un residuo. El residuo se disolvió en 5 ml de diclorometano, y se le
añadieron 0,69 ml de solución de HCl 1 N en éter. Después de 1 h,
la reacción se diluyó con éter y el sólido resultante se filtró y
se secó en vacío, para dar lugar a 0,179 g de la sal de
hidroxamato-amina en forma de sólido blanco.
Espectrometría de masas con electronebulización: 554,5
(M+H)^{+}.
A una solución de 1,0 g (2,653 mmol) del éster
metílico del ácido
2-(4-metoxibenceno-sulfonilamino)-3-metilbenzoico
en 10 ml de DMF se le añadieron 0,811 g (2,918 mmol) de cloruro de
4-(2-N,N-dietil-etoxi)-bencilo
y 1,5 g (10,9 mmol) de carbonato de potasio. La mezcla de reacción
se agitó después a temperatura ambiente durante 18 h, se diluyó con
agua y se extrajo con éter. Los productos orgánicos se extrajeron
después con solución de HCl 6 N, y la capa ácida acuosa se
alcalinizó después con solución de NaOH 6 N y se extrajo con éter.
La capa de éter resultante se secó con sulfato de sodio, se filtró
y se concentró en vacío, para dar lugar a 0,575 g (37%) del
N,N-dietilamino-éster en forma de espuma de color
canela. Espectrometría de masas con electronebulización: 583,1
(M+H)^{+}.
A una solución de 0,539 g (0,926 mmol) del
N,N-dietilamino-éster en diclorometano se le
añadieron 2 ml de ácido trifluoroacético. La reacción se agitó a
temperatura ambiente durante 2 h y después se concentró en vacío
hasta obtener un residuo. El residuo se trituró con éter y el sólido
resultante se recogió por filtración y se secó en vacío, para dar
lugar a 0,369 g del ácido carboxílico en forma de sólido blanco.
Espectrometría de masas con electronebulización: 525,2
(M-H)^{-}.
A una solución de 0,328 g (0,513 mmol) del ácido
carboxílico en 6,5 ml de diclorometano se le añadieron 0,12 ml de
DMF, seguido por 0,77 ml de cloruro de oxalilo 2,0 M en
CH_{2}Cl_{2}, y la mezcla de reacción se agitó a temperatura
ambiente durante 1 h.
En un matraz separado se añadieron 8 ml de THF y
1,7 ml de agua, a 0ºC, a una mezcla de 0,47 ml (7,7 mmol) de una
solución de hidroxilamina al 50% en agua. Una vez agitada esta
mezcla durante 15 minutos a 0ºC, se le añadió la solución del
cloruro de ácido en una porción, y la solución resultante se dejó
calentar hasta la temperatura ambiente con agitación durante toda
la noche. La mezcla de reacción se acidificó después hasta pH 3 con
HCl al 10% y se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se
secaron con Na_{2}SO_{4}, se filtraron y se concentraron en
vacío hasta obtener un residuo. El residuo se trituró con éter, para
dar lugar a 0,194 g de la sal de hidroxamato-amina
en forma de sólido blanco. Espectrometría de masas con
electronebulización: 542,3 (M+H)^{+}.
A una solución agitada de
4-metoxibencenotiol (2,5 g, 14 mmol) y
K_{2}CO_{3} anhidro (4,0 g, exceso) en acetona seca (100 ml),
se le añadió 2-bromo-propionato de
etilo (3,0 g, 16 mmol) en un matraz de fondo redondo, y la mezcla
de reacción se calentó en condiciones de reflujo durante 8 horas con
agitación intensa. Al final, se dejó enfriar la reacción, se
filtró, y la mezcla de reacción se concentró hasta obtener un
residuo. El residuo se extrajo con cloroformo y se lavó con
H_{2}O, y la capa orgánica se secó con MgSO_{4}, se filtró y se
concentró, para dar lugar al éster etílico del ácido
2-(4-metoxi-fenilsulfanil)-propiónico
en forma de aceite de color amarillo claro. Rendimiento: 3,6 g
(94%).
A una solución agitada de 12,0 g (50 mmol) del
éster etílico del ácido
2-(4-metoxi-fenilsulfanil)-propiónico
en 300 ml de cloruro de metileno a 0ºC se le añadió lentamente a
una velocidad suficiente para controlar la reacción exotérmica. La
mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas,
y se diluyó con 600 ml de hexanos. La mezcla de reacción se filtró,
y el filtrado se agitó con 500 ml de una solución saturada de
Na_{2}SO_{3} durante 3 horas. La capa orgánica se separó, se
lavó bien con agua, se secó y se evaporó en vacío, para dar lugar a
12 g de un semisólido.
Una mezcla agitada de 2,7 g (10 mmol) del éster
etílico del ácido
2-(4-metoxi-bencenosulfonil)propiónico,
3,03 g (10 mmol) de cloruro de
4-(2-piperidin-1-il-etoxi)bencilo,
10 g de K_{2}CO_{3} y 500 mg de
18-corona-6 en 250 ml de acetona se
sometió a reflujo durante 16 horas. Al final, la mezcla de reacción
se filtró, y la capa de acetona se concentró hasta obtener un
residuo. El residuo se extrajo con cloroformo, se lavó bien con
agua, se secó con MgSO_{4} anhidro, se filtró y se concentró hasta
obtener un residuo. El residuo obtenido se purificó por
cromatografía en columna de gel de sílice, eluyendo con acetato de
etilo al 50%-hexanos, para dar lugar a 4,8 g (92%) del producto
deseado en forma de aceite. EM: 490 (M+H)^{+}.
A una solución agitada del éster etílico del
ácido
2-(4-metoxibencenosulfonil)-2-metil-3-[4-(2-piperidin-1-il-etoxi)fenil]propiónico
(4,9 g, 10 mmol) en alcohol metílico se le añadió NaOH 10 N (20 ml,
exceso). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente
durante 48 horas. Al final, la mezcla de reacción se concentró y se
neutralizó con cuidado empleando HCl diluido. El residuo obtenido
se extrajo con cloroformo, se lavó bien con agua, se secó y se
concentró. El producto obtenido se purificó por cromatografía en
columna de gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo:metanol
(95:5), para dar lugar al producto del ejemplo en forma de cristales
incoloros, p.f. 106ºC; EM: 462,5 (M+H)^{+}. Rendimiento:
4,1 g, 88-1.
A una solución agitada del ácido
2-(4-metoxi-fenilsulfonil)-2-metil-3-fenil-[4-(2-piperidin-1-il-etoxi)]propiónico
(2,3 g, 5 mmol), de DMF (2 gotas) en CH_{2}Cl_{2} (100 ml) a
0ºC, se le añadió cloruro de oxalilo (1,2 g, 10 mmol) gota a gota.
Tras la adición, la mezcla de reacción se agitó a temperatura
ambiente durante 1 hora. De forma simultánea, se agitó en un matraz
separado una mezcla de clorhidrato de hidroxilamina (3,4 g, 50
mmol) de trietilamina (10,1 g, 100 mmol) en THF:agua (5:1, 50 ml) a
0ºC durante 1 hora. Al final del período de 1 hora, la mezcla de
reacción de cloruro de oxalilo se concentró, y el residuo de color
amarillo pálido se disolvió en 10 ml de CH_{2}Cl_{2}, y se
añadió lentamente a la hidroxilamina a 0ºC. La mezcla de reacción
se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas y se concentró. El
residuo obtenido se extrajo con cloroformo y se lavó bien con agua.
El producto obtenido se purificó por cromatografía en columna de gel
de sílice, y se eluyó con acetato de etilo. El producto del ejemplo
se aisló en forma de sólido incoloro. P.f. 98ºC; rendimiento: 48%;
EM: 477 (M+H)^{+}; ^{1}H RMN (300 MHz, CDCl_{3}): _ 1,2
(s, 3H), 3,5-1,5 (m, 16H), 3,9 (s, 3H), 4,4 (m,1H);
6,5-7,8 (m, 8H); 10,8 (bs, 1H).
Se analizó la actividad biológica de los
compuestos objeto de la presente invención de acuerdo con los
siguientes procedimientos.
El ensayo se basa en la escisión del sustrato
tiopeptídico
((Ac-Pro-Leu-Gly(2-mercapto-4-metilpentanoil)-Leu-Gly-OEt,
Bachem Bioscience) por la enzima gelatinasa, que da lugar a la
liberación de un sustrato que reacciona colorimétricamente con DTNB
(ácido
5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico)).
La actividad enzimática se mide siguiendo la velocidad de aumento
del color. El sustrato tiopeptídico se prepara en forma de solución
madre 20 mM en DMSO al 100% y el DTNB se disuelve en DMSO al 100%
en forma de solución madre 100 mM, y se conserva en la oscuridad a
temperatura ambiente. Tanto el sustrato como el DTNB se diluyen
conjuntamente hasta 1 mM con el tampón del sustrato (HEPES 50 mM pH
7,5, CaCl_{2} 5 mM) antes de su utilización. La solución madre de
gelatinasa B de neutrófilos humanos se diluye con el tampón de
ensayo (HEPES 50 mM, pH 7,5, CaCl_{2} 5 mM, Brij al 0,02%) hasta
una concentración final de 0,15 nM. El tampón de ensayo, la enzima,
y el DTNB/sustrato (concentración final de 500 \muM) y el
vehículo o el inhibidor se añaden a una placa de 96 pocillos
(volumen total de reacción de 200 \mul) y el aumento del color se
mide espectrofotométricamente durante 5 minutos a 405 nm en un
lector de placas. El aumento en la DO_{405} se representa
gráficamente y se calcula la pendiente de la línea, que representa
la velocidad de reacción. Se confirma la linealidad de la velocidad
de reacción (r^{2} > 0,85). Se calcula la media (x \pm ETM)
de la velocidad del testigo y se compara, en busca de significación
estadística (p < 0,05), con las velocidades de los casos
tratados con fármaco, utilizando la prueba de comparación múltiple
de Dunnett. Pueden generarse relaciones
dosis-respuesta utilizando dosis múltiples del
fármaco y los valores de CI_{50} con IC del 95% se calculan
utilizando regresión lineal (IPREB, HTB).
Referencias: Weingarten, H y
Feder, J., Spectrophotometric assay for vertebrate
collagenase, Anal. Biochem. 147, 437-440
(1985).
El ensayo se basa en la escisión del sustrato
peptídico
((Dnp-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(NMa)-NH_{2},
Peptide International, Inc.) por la colagenasa, que da lugar a la
liberación del grupo fluorescente NMa, que se cuantifica con un
fluorímetro. El Dnp desactiva la fluorescencia del NMa en el
sustrato intacto. El ensayo se lleva a cabo en tampón de ensayo
HCBC (HEPES 50 mM pH 7,0, Ca^{+2} 5 mM, Brij al 0,02%, cisteína al
0,5%) con colagenasa recombinante de fibroblastos humanos
(truncada, p.m. = 18.828, WAR, Radnor). El sustrato se disuelve en
metanol y se almacena congelado en partes alícuotas de 1 mM. La
colagenasa se almacena congelada en tampón, en partes alícuotas de
25 \muM. Para realizar el ensayo, el sustrato se disuelve en
tampón HCBC hasta una concentración final de 10 \muM y la
colagenasa hasta una concentración final de 5 nM. Los compuestos se
disuelven en metanol, DMSO o HCBC. El metanol y el DMSO se diluyen
en HCBC hasta <1,0%. Los compuestos se añaden a la placa de 96
pocillos que contiene la enzima y la reacción se pone en marcha
añadiendo el sustrato. La reacción se lee (excitación: 340 nm,
emisión: 444 nm) durante 10 min y se representa gráficamente el
aumento en la fluorescencia frente al tiempo en forma de trazado
lineal. Se calcula la pendiente de la línea, que representa la
velocidad de reacción. Se confirma la linealidad de la velocidad de
reacción (r^{2} > 0,85). Se calcula la media (x \pm ETM) de
la velocidad del testigo y se compara su significación estadística
(p <0,05) con las velocidades de los casos tratados con fármaco,
utilizando la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Pueden
generarse relaciones dosis-respuesta utilizando
dosis múltiples del fármaco y se calculan los valores de CI_{50}
con IC del 95% utilizando regresión lineal (IPRED, HTB).
Referencias: Bickett, D. M. et
al., A high throughput fluorogenic substrate for interstitial
collagenase (MMP-1) and gelatinase
(MMP-9), Anal. Biochem. 212,
58-64 (1993).
Se utilizan placas de microvaloración de 96
pocillos, negras, y cada pocillo recibe una solución compuesta de
10 \mul de TACE (Immunex, concentración final: 1 \mug/ml), 70
\mul de tampón Tris, pH 7,4, que contiene glicerol al 10%
(concentración final: 10 mM), y 10 \mul de solución del compuesto
de prueba en DMSO (concentración final: 1 \muM, concentración de
DMSO < 1%) y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente.
La reacción se inicia añadiendo el sustrato de peptidilo
fluorescente (concentración final: 100 \muM) a cada pocillo y
agitando a continuación en un agitador 5 durante segundos. La
reacción se lee (excitación: 340 nm, emisión: 420 nm) durante 10
min y se representa gráficamente el aumento en la fluorescencia
frente al tiempo en forma de trazado lineal. Se calcula la
pendiente de la línea, que representa la velocidad de reacción. Se
confirma la linealidad de la velocidad de reacción
(r^{2} > 0,85). Se calcula la media (x \pm ETM) de la velocidad del testigo y se compara su significación estadística (p <0,05) con las velocidades de los casos tratados con fármaco, utilizando la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Pueden generarse relaciones dosis-respuesta utilizando dosis múltiples del fármaco, y se calculan los valores de CI_{50} con IC del 95% utilizando regresión lineal.
(r^{2} > 0,85). Se calcula la media (x \pm ETM) de la velocidad del testigo y se compara su significación estadística (p <0,05) con las velocidades de los casos tratados con fármaco, utilizando la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Pueden generarse relaciones dosis-respuesta utilizando dosis múltiples del fármaco, y se calculan los valores de CI_{50} con IC del 95% utilizando regresión lineal.
Los resultados obtenidos siguiendo dichos
procedimientos estándar de análisis experimental se presentan en la
siguiente tabla.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos procedimientos estándar de análisis
farmacológico se basan en la escisión de sustratos tiopeptídicos
tales como
Ac-Pro-Leu-Gly
(2-mercapto-4-metilpentanoil)-Leu-Gly-OEt
por las metaloproteinasas de la matriz MMP-1,
MMP-13 (colagenasas) o MMP-9
(gelatinasa), que da lugar a la liberación de un sustrato que
reacciona colorimétricamente con DTNB (ácido
5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico)).
La actividad enzimática se mide siguiendo la velocidad de aumento
del color. El sustrato tiopeptídico se prepara en forma de solución
madre 20 mM en DMSO al 100% y el DTNB se disuelve en DMSO al 100%
en forma de solución madre 100 mM y se almacena en la oscuridad a
temperatura ambiente. Tanto el sustrato como el DTNB se diluyen
conjuntamente hasta 1 mM con el tampón del sustrato (HEPES 50 mM pH
7,5, CaCl_{2} 5 mM) antes de su utilización. La solución madre de
enzima se diluye con tampón de ensayo (HEPES 50 mM, pH 7,5,
CaCl_{2} 5 mM, Brij al 0,02%) hasta la concentración final
deseada. El tampón de ensayo, la enzima, vehículo o inhibidor y el
DTNB/sustrato se añaden, por este orden, a una placa de 96 pocillos
(volumen total de reacción de 200 \mul) y el aumento del color se
mide por espectrofotometría durante 5 minutos a 405 nm en un lector
de placas, y el aumento del color con el tiempo se representa
gráficamente en forma de trazado
lineal.
lineal.
Como alternativa, se utiliza un sustrato
peptídico fluorescente. En este ensayo, el sustrato peptídico
contiene un grupo fluorescente y un grupo desactivador. Cuando se
produce la escisión del sustrato por una MMP, se cuantifica la
fluorescencia que se genera con el lector de placas de
fluorescencia. El ensayo se lleva a cabo en un tampón de ensayo
HCBC (HEPES 50 mM, pH 7,0, Ca+^{2} 5 mM, Brij al 0,02%, cisteína
al 0,5%), con MMP-1, MMP-9 o
MMP-13 recombinantes humanas. El sustrato se
disuelve en metanol y se conserva congelado en partes alícuotas de
1 mM. Para el ensayo, se diluyen el sustrato y las enzimas con
tampón HCBC hasta alcanzar las concentraciones deseadas. Se añaden
los compuestos a la placa de 96 pocillos que contiene la enzima y
se inicia la reacción mediante la adición sustrato. La reacción se
lee (excitación: 340 nm, emisión: 444 nm) durante 10 min y se
representa gráficamente el aumento en la fluorescencia frente al
tiempo en forma de trazado lineal.
Tanto para el ensayo con el sustrato
tiopeptídico como con el péptido fluorescente, se calcula la
pendiente de la línea, que representa la velocidad de reacción. Se
confirma la linealidad de la velocidad de reacción (r^{2} >
0,85). Se calcula la media (x \pm ETM) de la velocidad del testigo
y se compara su significación estadística (p <0,05) con las
velocidades de los casos tratados con fármaco, utilizando la prueba
de comparación múltiple de Dunnett. Pueden generarse relaciones
dosis-respuesta utilizando dosis múltiples del
fármaco, y los valores de CI_{50} con IC del 95% se calculan
utilizando regresión lineal.
Un trozo de un tubo de diálisis de 2 cm (umbral
discriminatorio de peso molecular: 12-14.000, 10 mm
de anchura plana) que contenía enzima de metaloproteinasa de la
matriz (estromelisina, colagenasa o gelatinasa en 0,5 ml de tampón)
se implanta por vía intraperitoneal o subcutánea (en la espalda) de
una rata (Sprague-Dawley, 150-200
g) o ratón (CD-1, 25-50 g) con
anestesia. Los fármacos se administran PO, IP, SC o IV a través de
una cánula en la vena yugular. Los fármacos se administran en un
volumen de dosis de 0,1 a 0,25 ml/animal. El contenido de los tubos
de diálisis se recoge, y se mide la actividad enzimática.
Se calculan las velocidades de reacción
enzimática para cada tubo de diálisis. Se utilizan tubos de por lo
menos 3 animales diferentes para calcular la media + ETM. La
significación estadística (p < 0,05) de los animales tratados
con vehículo frente a los animales tratados con fármaco se determina
por análisis de la varianza. (Agents and Actions 21: 331,
1987).
Se utilizan placas de microvaloración de 96
pocillos, negras, y cada pocillo recibe una solución compuesta de
10 \mul de TACE (concentración final: 1 \mug/ml), 70 \mul de
tampón Tris, pH 7,4, que contiene glicerol al 10% (concentración
final: 10 mM), y 10 \mul de solución del compuesto de prueba en
DMSO (concentración final: 1 \muM, concentración de DMSO <1%)
y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente. La reacción
se inicia añadiendo el sustrato de peptidilo fluorescente
(concentración final: 100 \muM) a cada pocillo y agitando a
continuación en un agitador 5 durante segundos.
La reacción se lee (excitación: 340 nm, emisión:
420 nm) durante 10 min, y se representa gráficamente el aumento en
la fluorescencia frente al tiempo en forma de trazado lineal. Se
calcula la pendiente de la línea, que representa la velocidad de
reacción.
Se confirma la linealidad de la velocidad de
reacción (r^{2} >0,85). Se calcula la media (x \pm ETM) de
la velocidad del testigo y se compara su significación estadística
(p <0,05) con las velocidades de los casos tratados con fármaco,
utilizando la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Pueden
generarse relaciones dosis-respuesta utilizando
dosis múltiples del fármaco, y los valores de CI_{50} con IC del
95% se calculan utilizando regresión lineal.
Los resultados de los anteriores procedimientos
estándar de análisis farmacológico de la inhibición in vitro
e in vivo de las metaloproteinasas de la matriz y de la
inhibición de la TACE se presentan a continuación en la Tabla
I.
Claims (14)
1. Sal farmacéuticamente aceptable de un
compuesto de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
en el
que:
R^{1} y R^{2} se seleccionan
independientemente de entre H; alquilo
C_{1}-C_{12} o alquilo
C_{1}-C_{6} perfluorado;
X se selecciona de entre halógeno,
-O-SO_{2}-CH_{3},
-O-SO_{2}-CF_{3}, o una fracción
de la estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
Z es -NO_{2}, halógeno, -CH_{3} o
-CF_{3};
A se selecciona de entre -O- o -S-, -SO- o
-SO_{2}-;
m es un número entero de 0 a 3;
R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se
seleccionan independientemente de entre H, halógeno, -NO_{2},
alquilo, alcoxi, alquilo C_{1}-C_{6}
perfluorado, OH o los ésteres C_{1}-C_{4} o
éteres alquílicos de los mismos, -CN, -O-R^{1},
-O-Ar, -S-R^{1},
-S-Ar, SO-R^{1},
-SO-Ar, -SO_{2}-R^{1},
-SO_{2}-Ar, -CO-R^{1},
-CO-Ar, -CO_{2}-R^{1}, o
-CO_{2}-Ar; e
Y se selecciona de entre:
a) la fracción:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{7} y R^{8} se
combinan con -(CH_{2})_{p}-, en el que p es 6, de manera
que forman un anillo, estando el anillo así formado opcionalmente
sustituido con uno a tres sustituyentes seleccionados de entre el
grupo constituido por alquilo C_{1}-C_{3},
trifluorometilo, halógeno, hidrógeno, fenilo, -NO_{2} y
CN,
o
b) un heterociclo saturado, insaturado o
parcialmente insaturado de siete miembros, que contiene hasta dos
heteroátomos seleccionados de entre el grupo constituido por -O-,
-NH-, -N(alquilo C_{1}-C_{4})-, -N=, y
-S(O)_{n}-, en el que n es un número entero de 0 a
2, opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes seleccionados
independientemente de entre el grupo constituido por hidrógeno,
hidroxilo, halo, alquilo C_{1}-C_{4},
trihalometilo, alcoxi C_{1}-C_{4},
trihalometoxi, aciloxi C_{1}-C_{4}, alquiltio
C_{1}-C_{4}, alquilsulfinilo
C_{1}-C_{4}, alquilsulfonilo
C_{1}-C_{4}, hidroxi-alquilo
(C_{1}-C_{4}), fenilo opcionalmente sustituido
con 1 a 3 alquilo (C_{1}-C_{4}), -CO_{2}H,
-CN, -CONHR^{1}, -NH_{2}, alquilamino
C_{1}-C_{4}, dialquilamino
C_{1}-C_{4}, -NHSO_{2}R^{1}, -NHCOR^{1},
-NO_{2}.
\newpage
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el
que:
en el
que:
R^{1} y R^{2} se seleccionan
independientemente de entre H; alquilo
C_{1}-C_{12} o alquilo
C_{1}-C_{6} perfluorado;
X es halógeno,
-O-SO_{2}-CH_{3},
-O-SO_{2}-CF_{3} o una fracción
de estructura:
Z es -NO_{2}, halógeno, -CH_{3} o
-CF_{3};
A se selecciona de entre -O- o -S-, -SO- o
-SO_{2}-;
m es un número entero de 0 a 3; e
Y se selecciona de entre:
un grupo seleccionado a partir de
acepina, diacepina, oxacepina, tiacepina, oxapina y tiepina, estando
el grupo opcionalmente sustituido con 1 a 3 sustituyentes
seleccionados independientemente de entre el grupo constituido por
hidrógeno, hidroxilo, halo, alquilo C_{1}-C_{4},
trihalometilo, alcoxi C_{1}-C_{4},
trihalometoxi, aciloxi C_{1}-C_{4}, alquiltio
C_{1}-C_{4}, alquilsulfinilo
C_{1}-C_{4}, alquilsulfonilo
C_{1}-C_{4}, hidroxi-alquilo
(C_{1}-C_{4}), fenilo opcionalmente sustituido
con 1 a 3 alquilo (C_{1}-C_{4}), -CO_{2}H,
-CN, -CONHR^{1}, -NH_{2}, alquilamino
C_{1}-C_{4}, dialquilamino
C_{1}-C_{4}, -NHSO_{2}R^{1}, -NHCOR^{1},
-NO_{2}.
3. Compuesto según la reivindicación 1, de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que:
R^{1} y R^{2} se seleccionan
independientemente de entre H; alquilo
C_{1}-C_{6} o alquilo
C_{1}-C_{6} perfluorado;
R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se
seleccionan independientemente de entre H, OH, o los ésteres
C_{1}-C_{4} o éteres alquílicos de los mismos,
halógeno, -CN, alquilo C_{1}-C_{6}, o
trifluorometilo,
m es un número entero de 0 a 3;
R^{7} y R^{8} se combinan con
-(CH_{2})_{p}-, en el que p es 6, de manera que forman un
anillo, estando el anillo opcionalmente sustituido con hasta tres
sustituyentes seleccionados de entre el grupo constituido por
hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alquilo
C_{1}-C_{3}, trifluorometilo, -CN y -NO_{2};
y
X es halógeno,
-O-SO_{2}-CH_{3},
-O-SO_{2}-CF_{3}, o una fracción
de estructura:
Z se selecciona de entre -NO_{2}, halógeno,
-CH_{3} o -CF_{3};
4. Compuesto según la reivindicación 1, de
fórmula:
en la
que:
A se selecciona de entre -S-, -SO- o
-SO_{2}-;
R^{1} y R^{2} se seleccionan
independientemente de entre H; alquilo
C_{1}-C_{6} o alquilo
C_{1}-C_{6} perfluorado;
R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} se
seleccionan independientemente de entre H, OH, o los ésteres
C_{1}-C_{4} o éteres alquílicos de los mismos,
halógeno, -CN, alquilo C_{1}-C_{6}, o
trifluorometilo,
m es un número entero de 0 a 3;
Y es -NR^{7}R^{8}, en el que R^{7} y
R^{8} se combinan con -(CH_{2})_{p}-, en el que p es 6,
de manera que forman un anillo, estando el anillo opcionalmente
sustituido con hasta tres sustituyentes seleccionados de entre el
grupo constituido por hidrógeno, halógeno, alquilo
C_{1}-C_{3}, trifluorometilo, -CN y
-NO_{2};
X es halógeno,
-O-SO_{2}-CH_{3},
-O-SO_{2}-CF_{3} o una fracción
de estructura:
Z se selecciona de entre -NO_{2}, halógeno,
-CH_{3} o -CF_{3}.
5. Compuesto según la reivindicación 1, que
es el clorhidrato de
(4-clorometil-fenoxi)-etil-hexametilenoimina-1-ilo.
6. Procedimiento para la preparación de una
sal farmacéuticamente aceptable de un compuesto de fórmula (I)
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende una de
las etapas siguientes:
a) convertir un alcohol de fórmula
en la que m, A, Y e
R^{1-6} son como se ha definido en la
reivindicación 1, para proporcionar un compuesto correspondiente de
fórmula (I) en la que X es un grupo saliente mediante unos medios
adecuados, por ejemplo, utilizando un agente halogenante,
sulfonilante o acilante que contiene el grupo saliente X; si es
necesario convertir el compuesto de fórmula (I) formado en una sal
farmacéuticamente aceptable del
mismo;
o
b) oxidar un compuesto de fórmula (I) en la
que A es S, para proporcionar un compuesto correspondiente de
fórmula (I) en la que A es SO o -SO_{2}-; si es necesario
convertir el compuesto de fórmula (I) formado en una sal
farmacéuticamente aceptable del mismo;
o
c) convertir un compuesto de fórmula (I) en
una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
7. Procedimiento para la preparación de un
compuesto de fórmula (I) en la que A es O, que comprende las etapas
siguientes:
a) alquilar un hidroxibenzaldehído de
fórmula:
en la que
R^{3}-R^{6} son como se ha definido en la
reivindicación 1, con un haluro de alquilo de
fórmula:
en la que Y, R^{1}, R^{2} son
como se ha definido en la reivindicación 1, m es un número entero de
0 a 3, y halo se selecciona de entre Cl, F, Br o I, para producir
un aldehído de
fórmula:
b) reducir el producto de
aldehído de la etapa a), para proporcionar un alcohol de
fórmula:
c) convertir el alcohol de la
etapa b) en su sal de clorhidrato;
y
d) convertir el alcohol en el compuesto de la
etapa c) en un grupo saliente.
8. Procedimiento para la producción de
compuestos según la reivindicación 1, en los que A es S,
comprendiendo procedimiento las etapas siguientes:
a) alquilar un compuesto de la fórmula
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R^{3-6}
son como se ha definido en la reivindicación 1, con un agente
alquilante de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que Y, R^{1}, R^{2} y m
son como se ha definido en la reivindicación 1, halo puede ser Cl,
F, Br o I, para producir un aldehído de
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
b) reducir el aldehído, por
ejemplo, con borohidruro de sodio, para obtener un alcohol de
fórmula;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
c) tratar el alcohol de la etapa
b) con HCl gaseoso, para generar su clorhidrato;
y
d) convertir el producto de clorhidrato del
alcohol de la etapa c) en un grupo saliente.
9. Procedimiento según la reivindicación 8,
que comprende además la etapa de oxidación controlada del azufre en
el clorhidrato del alcohol de la etapa d) a sulfóxido o a
sulfona.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 9, en el que el alcohol se convierte en un
grupo saliente mediante tratamiento con cloruro de metanosulfonilo,
cloruro de toluenosulfonilo, o anhídrido trifluoroacético en
presencia de piridina o trietilamina.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 6 a 10, en el que halo es Cl, m es 1.
12. Procedimiento para la producción de
compuestos de fórmula:
en la que Y representa un anillo
heterocíclico insaturado o parcialmente insaturado de siete
miembros, que contiene uno o dos átomos de nitrógeno, estando el
anillo heterocíclico unido al puente etoxi en un átomo de nitrógeno
en el anillo, y estando opcionalmente sustituido por 1 a 3 grupos
seleccionados de entre alquilo C_{1}-C_{6},
alcoxi C_{1}-C_{6}, tioalquilo
C_{1}-C_{6}, -CF_{3}, o
-NO_{2};
comprendiendo el procedimiento hacer reaccionar,
en un medio alcalino, el alcohol 4-hidroxibencílico
con una sal de un compuesto de fórmula:
en la que Y es como se ha definido
anteriormente.
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
en el que el medio alcalino se mantiene a un pH de 9 o superior.
14. Utilización de un compuesto según la
reivindicación 5 en un procedimiento para preparar clorhidrato de
1-[4-(2-acepan-1-il-etoxi)-bencil]-2-(4-hidroxi-fenil)-3-metil-1H-indol-5-ol,
que comprende hacer reaccionar un compuesto según la reivindicación
5 con
3-metil-2-(4-benciloxi)fenil-5-benciloxiindol
en presencia de una base, seguido por la desprotección, para
proporcionar el producto deseado.
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