PT1049712E - Proteínas híbridas da toxina do tétano que migram retrogradamente e trans - sinapticamente para o snc - Google Patents

Description

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Descrição "Proteínas híbridas da toxina do tétano que migram retrogradamente e trans-sinapticamente para o SNC"

Antecedentes da Invenção

Esta invenção diz respeito ao uso de uma parte da toxina do tétano para administrar uma composição ao sistema nervoso central de um ser humano, ou de um animal. Esta invenção diz também respeito a um fragmento híbrido de uma toxina do tétano, a um polinucleótido que híbridiza com a toxina natural do tétano, e a uma composição contende o fragmento da toxina do tétano como molécula activa. Além disso, esta invenção diz respeito a um vector compreendendo um promotor e uma sequência de ácido nucleico que codifica para o fragmento da toxina do tétano. A toxina do tétano é produzida pelo Clostridium tetani como uma cadeia polipéptidica simples inactiva de 150 kD constituída por três domínios de 50kD ligados por loops sensíveis à protease. A toxina é aetivada por cisão proteolitica selectiva, que gera duas cadeias ligadas por ligações dissulfídícas : L(leve 50 kD) e H (pesada, 100 kD) [Montecucco C. e Schiavo G. Q. Rev. Biophys., (1995), 28: 423-472].

Evidência do transporte retrógrado axónico da toxina do tétano para o sistema nervoso central (SNC) foi descrita por Erdmann et al. [Naunyn Scmiedebergs Arch Phamacol., (1975), 290:357-373], Price et al. [Sience, (1975), 188:945-94], e Stoeckel et al. [Brain Res., (1975), 99:1-16]. Em cada um destes estudos foi encontrada toxina marcada com radioactividade no interior de vesículas ligadas è membrana. Outra propriedade foi o movimento 2 trans-sináptíco da toxina do tétano que foi primeiro demonstrado por localização autoradiográfica de toxina do tétano marcada com 1/5I nos interneurónios da medula espinal, após injecção num músculo [Schwab e Thoenen, Brain Res., (1976), 105:218-227]. A estrutura desta toxina do tétano foi elucidada por Helting et al. [J. Biol. Chem., (1977), 252:187-193]. Ά papaína quebra a toxina do tétano em dois fragmentos: - a parte terminal C da cadeia pesada, 451 aminoácidos, também designado como fragmento C; e - a outra parte contida na porção complementar designada fragmento B ligado à cadeia leve (fragmento A), através de uma ligação dissulfidica. A patente europeia N° EP 0030 496 Bl mostrou o transporte retrógrado de um fragmento B-IIb para o SNC e foi detectado após a injecção no músculo médio do olho em neurónios primários e de segunda ordem. Este fragmento pode consistir em "isofragmentos" obtidos por proteólise clostridial. Mais tarde, demonstrou-se que este fragmento 8-IIb era idêntico ao fragmento C obtido por digestão com papaína por Eisel et al. [EMBO J., 1986, 5:2495-2502].

Esta patente EP também demonstrou o transporte retrogrado de um conjugado que consiste num fragmento Ibc da toxina do tétano acoplado por uma ligação dissulfidica a B-Ili, a partir de extremidades axónicas no músculo aos pericaria motoneuronais e espaços pericelulares. (O fragmento I be corresponde à outra parte obtida através de digestão com papaína como descrito acima por Helting et al.). Não existe evidência que este conjugado tenha sido encontrado em neurónios de segunda ordem. Os autores indicaram que um conjugado que consiste num fragmento B-IIb acoplado através de uma ligação dissulfidica a um agente 3 terapêutico é capaz de se fixar de forma específica a ganglíósidos e membranas sínápticas. Nenhum resultado mostrou qualquer transporte retrogrado axcníco ou transporte trans-sináptico para um tal conjugado.

Outra patente de invenção europeia, N° EP 0057 140B1 mostrou igualmente o transporte retrogrado de um fragmento IIC para o SNC. Tal como na patente europeia N° EP 0030496B1 os autores indicam que um conjugado que consiste no fragmento IIC e um agente terapêutico era capaz de se fixar especificamente, mas nenhum resultado ilustrou, tal alegação. Este fragmento IIC corresponde ao fragmento agora chamado C obtido por digestão de papaína.

Francis et al. [J. Bíol. Chem., (1995), 270(25):15434-15442] apenas conduziu a um estudo in vítro que mostra a internalização pelos neurónios de um híbrido entre SOD-1 (Cu Zn superoxido dismutase) e um fragmento recombinante da toxina do tétano C, através de recombinação genética. Este fragmento recombinante da toxina do tétano C foi obtido do grupo Halpern. (ver ref. 11).

Além disso, Kuypers H. G. J. M e Ugolini G. [TINS, (1990), 13(2): 71-75] indicaram na sua publicação sobre vírus como sondas transneuronais que apesar do facto de que o fragmento da toxina do tétano se ligar a receptores específicos em membranas neuronais, a marcação transneuronal é relativamente fraca e pode ser detectada apenas em alguns dos neurónios ligados sínapticamente.

Apesar destes avanços, no estado da técnica existe ainda a necessidade de métodos para administrar composições ao sistema nervoso central de seres humanos ou animais. Também existe a necessidade no estado da técnica de agentes biológicos que possam obter este resultado. 4

Sumário da Invenção

Esta invenção ajuda a satisfazer estas necessidades do estado da técnica, Mais particularmente, esta invenção disponibilíza um método para a administração in vivo da composiçãc desejada para o sistema nervoso central (SNC) do mamífero, em que a composição compreende um fragmento não tóxico proteolítico da toxina do tétano (TT) em associação com pelo menos uma molécula possuindo uma função biológica. A composição é capaz de efectuar o transporte retrogrado in vivo e transporte trans-sináptico para o SNC e de ser administrado a diferentes áreas do SNC.

Esta invenção também disponibiliza um fragmento híbrido da toxina do tétano compreendendo um fragmento C mais 11 aminoácidos da cadeia pesada que precede imediatamente o terminal amino do Fragmento C capaz de transferir uma proteína in vivo, um péptido, ou um polinucleótido, através de uma junção neuromuscular e pelo menos uma sinapse.

Além disso, esta invenção disponibiliza uma composição compreendendo uma molécula activa em associação com o fragmento híbrido da toxina do tétano (TT) ou de uma sua variante. A composição é útil para o tratamento de um doente ou de um animal afectado com a doença do SNC que compreende a administração da composição da invenção ao doente, ou animal. Adicionalmente, a composição desta invenção pode ser útil para provocar uma resposta imunitária no doente, ou animal afectado com SNC, que compreende a administração de uma composição da invenção ao doente, ou animal.

Além disso, esta invenção disponibiliza fragmentos de variantes de polinucleótidos capazes de hibrídizarem em condições severas com a sequência da toxina natural do tétano. As condições severas são por exemplo as seguintes: a 42°C durante 4 a 6 horas na presença de 6x tampão SSC, Ix 5 solução de Denhardt's, 1% de SDS, e 250 pg/ml de tARN. (1 x SSC corresponde a NaCl 0,15 M e citrato de sedio 0,05 M; lx solução de Denhardt's corresponde a 0,02% de Fieoll, 0,02% de polivinilpirrolidona e 0,02% de albumina do soro de bovino; . Os dois passos de lavagem são efectuados à temperatura ambiente na presença de 0,1 x SCC e 0,1% de SDS.

Uma variante do fragmento do polinucleótido significa um polinucleótido que codifica para uma sequência da toxina do tétano derivada da sequência nativa da toxina do tétano e possuindo as mesmas propriedades de transporte.

Adicionalmente, a invenção disponibíliza um vector compreendendo um promotor capaz de expressão nas células dos músculos e opcionaimente um amplificador, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para o fragmento da toxina do tétano da invenção, ou uma variante do fragmento dos aminoácidos da invenção associada com um polinucleótido que codifica para uma proteína ou um polipéptido de interesse. Numa concretização preferida da invenção, o promotor pode ser o promotor CMV e preferencialmente o promotor CMV contido no pcADN 3.1 (In Vítrogen, refa. V790-20), ou o promotor actina descrito em Bronson S.V. et al. (PNAS, 1996), 93:9067-9072).

Além disso, a invenção disponibíliza um vector que compreende um promotor capaz de expressão em células neuronaís ou em precursores (tais como células precursoras NT2 (hNT) da stratagen referência # 204101) e opcionalmente um amplificador, uma sequência de ácido nucleico que codifica para o fragmento da toxina do tétano da invenção, ou uma variante de aminoácidos de um fragmento da invenção associado a um polinucleótido que codifica para uma proteína ou um polipéptido de interesse. Numa concretização preferida da invenção o promotor pode ser actina (ver a referência acima). Estes vectores são úteis para o 6 tratamento de um doente, ou de um animal infectado com uma doença do SNC compreendendo a administração do vector da invenção ao doente ou animal. Além disso, estes vectores são úteis para provocar respostas imunitárias no doente, ou no animal.

Uma vantagem da presente invenção compreendendo o fragmento da toxina do tétano é para obter um melhor transporte do fragmento dentro do organismo comparado com o fragmento C. Uma outra vantagem da composição da invenção é obter uma sequência de aminoácidos bem definida e não uma composição multimérica. Assim, pode-se manipular facilmente esta composição na terapia génica.

Breve Descrição das Figuras A invenção será melhor descrita referindo as figuras em que: A Figura 1 apresenta a sequência de ADN e a sequência de aminoácidos do fragmento de TTC clonado em pBS:TTC. A Figura 2 apresenta os detalhes da construção pBS:TTC. Isolamento de TTC cADN: 0 TTC cADN foi isolado a partir de uma estirpe de Clostridium Tetani utilizando a reacção em cadeia da polimerase. Foi utilizado um PCR triplo para gerar três fragmentos sobrepostos respectivamente de 465 pb (PCR1; iniciador 1: 5'CCC CCC GGG CCA CCA TGG TTT TTT CAA CAC CAA TTC CAT TTT CTT ATT C-3' & iniciador 2: 5' CTA AAC CAG TM TTT CTG-3' ) , de 468 pb (PCR2; iniciador 3:5' -MT TAT GGA CTT TM AAG ATT CCG C-3' & iniciador 4:5' GGC ATT ATA ACC TAC TCT TAG AAT-3') e 338 pb (PCR3; iniciador 5: 5'-AAT GCC TTT MT AAT CTT GAT AGA MT-3' & iniciador 6: 5'-CCC CCC GGG CAT ATG TC A TGA -ACA TAT CAA TCT GTT TAA TC-3') , e cada fragmento foi clonado sequencialmente em pBluescript KS+ 7 para produzir plasmídeo pBS-TTC. O iniciador 1 a montante continha o local de ligação do ribossoma (RBS) e sinais de iniciação da tradução. A Figura 3 representa a construção pGEX:iacZ-TTC. A Figura 4 representa a construção pGEX:TTC-IacZ. A Figura 5 representa os detalhes da construção pCMV: lacZ-TTC.

Descrição Detalhada A toxina do tétano é uma neurotoxina potente de 1315 aminoácidos que é produzida por Clostridium tetani (1,2). Evita a libertação do neutransmissor inibidor a partir dos interneurónios da medula espinal, através de um mecanismo especifico de intoxicação celular (para uma revisão ver refa 3). Demonstrou-se que este mecanismo patológico envolve o transporte retrogrado axónico e trans-sináptico da toxina do tétano. A toxina é absorvida pelas extremidades do nervo na junção neuromuscular, mas não actua neste local; pelo contrário, a toxina é transportada para um compartimento vesicular e viaja ao longo dos axóníos motores durante uma distância considerável até atingir os seus alvos. 0 movimento trans-sináptico da toxina do tétano foi demonstrado pela primeira vez por localização autoradiográfica nos interneurónios da medula espinal após injecção num músculo (4). Contudo, os estudos prévios da passagem trans-sínáptíca da toxina do tétano dos motoneurónios encontravam-se limitados pelo desenvolvimento rápido do tétano clínico e morte do animai experimental (4,5, 6) .

Foi mostrado que um fragmento de toxina do tétano obtido por digestão por protease, o fragmento C, é transportado pelos neurónios de uma forma semelhante à da 8 toxina nativa sem provocar sintomas clínicos (7,8,9,10). Foi reportado que um fragmento C recombínante possui as mesmas propriedades que o fragmento obtido pela digestão da protease (11) . O facto de um fragmento não tóxico da molécula de toxina ser capaz de migrar retrogradamente nos axónios e acumular-se no SNC conduziu à especulação de que tal fragmento poderia ser utilizado como um veiculo neurotrófico (12) . Um fragmento C quimicamente conjugado com várias proteínas grandes foi absorvido por neurónios numa cultura de tecido (13) e por neurónios motores em modelos animais (refa 12, 14 e 15) . De acordo com a invenção o fragmento da toxina do tétano consiste num fragmento proteolítico não tóxico da toxina do tétano (TT) compreendendo um fragmento C mais 11 aminoácidos da cadeia pesada que precede imediatamente o terminal amíno do fragmento C. A molécula que possui uma função biológica é seleccionada a partir do grupo que consiste numa proteína de interesse, por exemplo para a compensação ou modulação das funções sob o controlo do SNC ou da medula espinal ou da modulação das funções no SNS, ou na medula espinal ou proteínas de interesse para serem administradas por um sistema de expressão de terapia génica ao SNC, ou medula espinal. As proteínas de interesse são, por exemplo, a proteína SMN implicada na atrofia muscular da medula (Lefebvre et al., Cell, (1995), 880:155-165 e Roy et al., Cell, (1955), 80:167-178); factores neurotróficos, tais como BDNF (factor neurotrófico derivado do cérebro); NT-3 (Neurotrofin-3); NT-4/5; GDNF (factor neurotrófico derivado da linha celular Glial), IGF (factor de crescimento semelhante a insulina), (Oppenheim, Neuron, {1996}, 17:195-197; Thoenen et al., Exp. Neurol., (1993), 124:47-55 e Henderson et al., Adv. Neurol., (1995), 68:235-240); ou PNI (protease nexin I) promotor do crescimento de neurite (este 9 factor pode ser utilizado para o tratamento da doença de Alzheimer (Houenou et al., PNAS, (1995), 92:895-899)); ou SPI3 uma proteína inibídora da protease de serina (Safaei, Dev. Brain Res., 1997), 100:5-12); ou ICE (enzima de conversão da interleucina-1) um factor implicado na apóptose, para evitar a apóptose (Nagata, Cell, (1997), 88:355-365); ou BcI-2, um regulador intracelular chave da morte celular programada (Jacobson, M.D. (1997), Current Biology, 7:R277-R281); ou proteína fluorescente verde (Lang et al., Neuron (1997), 18:857-863) como marcador; enzima (ex: -Gal) ; endonuclease como I-Scel (Choulika A., et al. (1995), Molecular and Cellular biology, 15(4): 1968-1973 ou CRE (Gu H., et al. (1994), Science 265:103—106) ; anticorpos específicos; fármacos dirigidos especificamente contra doenças neurodegenerativas, tal como esclerose amiotrófica lateral. Várias moléculas podem ser associadas a um fragmento TT.

Associado significa uma associação obtida por recombinação genética. Esta associação pode ser efectuada a jusante, assim como a montante do fragmento TT. O modo preferido de realização da invenção é a jusante e é descrito em detalhe; uma concretização a jusante é também contemplada. (Apesar de Halpern et al., J. Biol. Chem., (1993), 268(15):11188-11192 terem indicado que os aminoácidos de terminal carbóxilo possuem o domínio necessário para a ligação a gangliósidos purificados e células neuronais). A área do SNC desejada significa, por exemplo, a língua que é escolhida para díreccíonar o transporte para o motoneurónio do hipoglosso; o músculo do braço que é escolhido para dirigir o transporte para os motoneurónios da medula espinal.

Para a realização do transplante de um neurónio para o SNC, ou da medula espinal ver Gage, F.H. et al. (1987), 10

Neuroscience, 23:725-807, "Grafting genetically modified cells to the brain: possíbilities for the future."

As técnicas para introduzir os polinucleótidos nas células são descritas nas patentes US N°s 5,580,859 e 5,589,466 na qual se baseia. Por exemplo, os nucleótidos podem ser introduzidos por transfecção in vitro antes da reimplantação na área do SNC ou na medula espinal. É considerada uma ligação química numa concretização particular da invenção e compreende a associação entre o fragmento TT e um polinucleótido que codifica para a molécula de interesse com os seus elementos reguladores, tal como promotor e amplificador capazes de expressar o dito polinucleótido. Depois, o fragmento TT permite o transporte axónico retrogrado e/ ou o transporte trans-sináptico, e o produto do polinucleótido é expresso directamente nos neurónios. A ligação pode ser covalente, ou não, mas preferencialmente covalente efectuada por uma reacção de tiolação, ou por qualquer outra reacção de ligação como descrito em "Bioconjugate Techniques" de Gret T. Hermanson (Academic press, 1996) . 0 transporte axonal retrogrado inicia-se ao nível do músculo, em que a composição de interesse é tomada na junção neuromuscular, e migra para o corpo neuronal dos motoneurónios (que também são chamados neurónios de primeira ordem) no SNC, ou na medula espinal. Neurónios de primeira ordem significam neurónios que internalizaram a composição de interesse, e assim neste caso, correspondem a motoneurónios. O transporte trans-sináptico retrogrado corresponde a comunicações de interneurónios, através das sinapses dos motoneurónios, e compreende neurónios de segunda ordem e neurónios de ordem mais elevada (a quarta ordem correspondendo a neurónios no córtex cerebral). 11

As diferentes fases do transporte neuronal são efectuadas através da junção neuromuscular, o motoneurónio, também designado como neurónio de primeira ordem, as sinapses em qualquer fase entre os neurónios de ordens diferentes, neurónios de segunda ordem a quarta ordem que correspondem ac córtex cerebral.

Numa concretização desta invenção verifica-se que uma proteína híbrida β-gal-TTC (TT-fragmento C) retém as actividades biológicas de ambas as proteínas in vivo. For isso, a proteína híbrida pode sofrer transporte retrogrado e transneuronal, através de uma cadeia de neurónios interligados, como pesquisado através da sua actividade enzimática. Estes resultados são consistentes com os obtidos por outros que utilizaram TTC, quimicamente conjugado, ou TTC fundido com outras proteínas (12, 13, 14, 15). Nestes, a análise in vitro, a actividade das proteínas conjugadas, ou híbridas foi igualmente retida, ou apenas fracamente diminuída. Dependendo da natureza do parceiro de fusão do TTC, podem ser concebidas diferentes tipos de aplicações potenciais. Por exemplo, esta aplicação pode ser utilizada para administrar uma proteína biologicamente actíva para o SNC para fins terapêuticos. Tais genes híbridos podem ser também utilizados para analisar e mapear neurónios ligados sinapticamente, se repórteres, tais como lacZ ou o gene da proteína fluorescente verde (GFP; 29) , forem fundidos com TTC. 0 transporte retrogrado da proteína híbrida pode ser demonstrado como se segue. Quando injectado num músculo, a actividade β-gal localiza-se rapidamente nos corpos celulares dos mctoneurónios que i.nnervate o músculo. A arborização dc nervo completo, axónio, corpo celular e dendrites pode ser facilmente visualizada. Contudo, em comparação com os vírus neurotrópicos, a extensão do transporte transneural retrogrado da proteína híbrida dos 12 neurónios do hipoglosso indica que apenas um subconjunto de neurónios interligados são detectados, apesar de a maior parte das áreas contendo os interneurónios de segunda ordem foram identificados com o marcador β-gal TTC, A absorção transneuronal encontra-se na maior parte das vezes restringida a neurónios de segunda ordem. Em tais experiências, quando uma quantidade limitada de uma sonda neuronal é injectada num músculo ou célula, apenas uma fracção pode ser transportada através de uma sinapse, impondo deste modo uma limitação experimental à sua detecção. Actualmente, o método mais eficiente, em termos da extensão do transporte, baseia-se em vírus neurotrópicos. Exemplos incluem: vírus do herpes alfa, tais como herpes símplex tipo 1 (HSV-i), vírus da pseudo raiva (PrV), e vírus rhabdo (24, 25). Os métodos virais são muito sensíveis, porque de cada vez que um vírus infecta uma nova célula, replica-se amplificando deste modo o sinal e permitindo a visualização de neurónios de ordem mais elevada numa cadeia. Ultimamente, contudo deseja-se mapear uma rede neuronal numa situação in vivo, tal como de um animal transgénico. Aqui a desvantagem da marcação virai é a sua toxicidade potencial. A maior parte dos vírus não são inócuos para a célula neural, e a sua replicação induz uma resposta celular e algumas vezes degeneração celular (24). Além disso, dependendo das condições experimentais, pode ocorrer gemulação do vírus conduzindo ao seu alastramento pelas células adjacentes e tecidos.

Diferenças nos mecanismos de migração transneuronal poderia também justificar o número restrito de neurónios marcados por β-gal-TTC. Matteoli et al. disponibilizaram uma forte evidência que a toxina do tétano intacta atravessa as sínapses parasitando o processo fisiológico de reciclagem da vesícula sináptica no terminai do nervo (22). A toxina líga-se provavelmente à superfície interna de uma 13 vesícula sináptica durante o tempo que o lumen é exposto ao meio externo. A endocitose da vesícula iria presumivelmente fornecer o mecanismo para a internalização da toxina. Uma vez que se sabe que o fragmento TTC mirnetiza a migração da toxina ín vive, poderia por isso dirigir a proteína de fusão ao longo de uma via trans-sináptíca semelhante. Se esta hipótese for confirmada seria fortemente sugerido que é necessária actividade sináptica para o transporte transneuronal de β-gal-TTC. Por isso, apenas os circuitos neuronaís activos seriam detectados pela proteína híbrida. A dependência possível de β-gal-TTC da exoeitose e endocitose da vesícula sináptica poderia continuar a ser investigada, uma vez que se encontram agora disponíveis técnicas para registar a actividade sináptica em redes neuronais in vítro (30) . Em contraste, o metabolismo transneuronal dos vírus neurotrópícos não foi ainda esclarecido e poderia ser fundamentalmente diferente, envolvendo gemulação de vírus na vizinhança de uma sinapse. Finalmente, o transporte transneuronal da proteína híbrida poderá depender de uma especificidade sináptica, apesar da toxina do tétano não ser conhecida como apresentando alguma (7,23). É por isso provável que um vírus atravesse diferentes sinapses ou sinapses inactivas. Em resumo, o espectro restrito do transporte interneuronal, adicionalmente à sua não toxicidade, torna a proteína híbrida β-gal-TTC um novo e poderoso instrumento para a análise de metabolismos neurais.

Uma vantagem do gene de fusão da invenção para o mapeamento neuronal é que deriva de uma única entidade genética passível de ser submetida a manipulação e engenharia genética. Há alguns anos foi desenvolvida uma técnica baseada em recombinação homóloga em células estaminaís para substituir de forma específica genes no ratinho (31, 32). Este método gera uma mutação nula no gene 14 substituído, apesar de numa estratégia ligeiramente modificada poder ser também produzido um ARN mensageiro dicistrónico (33, 34). Quando é utilizado um gene repórter como gene substituto, tal como E. colí lacZ esta técnica disponibiliza um meio de marcar as células mutadas de modo que elas podem ser seguidas durante a embriogénese. Assim, esta técnica simplifica grandemente a análise tanto da expressão heterozigótica do gene alvc como do fenótipo de animais mutantes nulos (homozigóticos).

Uma outra vantagem desta invenção é que a composição que compreende o gene de fusão pode codificar para um antigénic, ou antigénios. Assim, a composição pode ser utilizada para provocar uma resposta imunitária no seu hospedeiro e subsequentemente conferir protecção ao hospedeiro contra o antigénio ou antigénios expressos. Estes métodos de imunização são descritos em Robinson et al. Patente de invenção US N° 5,43,578. Em particular, o método de imunizar um doente ou animal hospedeiro compreende a introdução de uma unidade de transcrição do ADN compreendendo o gene de fusão desta invenção, que codifica para o antigénio desejado ou antigénios. A tomada da unidade de transcrição de ADN pelo hospedeiro resulta na expressão do antigénio desejado ou antigénios e a provocação subsequente de respostas humorais e/ ou respostas imunitárias mediadas pela célula. Células neuronais estabelecem redes específicas e complexas de células interligadas. Se um gene for mutado numa determinada célula neural, esperaríamos que esta mutação tivesse um impacto no funcionamento das outras células neurais interligadas. Tendo em mente estas considerações, um marcador genético que se pede difundir através de sinapses activas seria muito útil para analisar o efeito da mutação em animais mutantes heterozigóticos, as células em que o gene alvo é normalmente transcrito poderia 15 ser identificado, assim como as células da rede neuronal ligadas sinapticamente. Num animal homozigótico, o impacto da mutação no estabelecimento, ou actividade da rede neural poderia ser determinado. A possibilidade de realização de uma tal estratégia in vivo depende criticamente da eficiência da transferência sináptica da proteína de fusão, assim como da sua estabilidade e localização celular.

Outra extensão da invenção é para a terapia génica aplicada ao SNC. Esta invenção providencia para uma absorção de um conjugado enzima-vector não tóxico por terminais axónicos e transmissão retrógrada para os motoneurónios do tronco cerebral. Um mecanismo trans-sináptico retrogrado selectivo transporta subsequentemente a proteína hibrida para neurónios ligados de segunda ordem. Uma tal via que contorna a barreira sangue- cérebro pode administrar moléculas ao SNC. De facto, agentes patogénicos, tais como a toxina do tétano e vírus neurotrópico são absorvidas de forma semelhante pelos terminais dos nervos, internalizadas, e transportadas retrogradamente para corpo celular da célula nervosa. Num tal cenário, o repórter lacZ seria substituído por um gene que codifica para uma proteína que disponibiliza uma actividade necessária ou interessante e/ ou função. Por exemplo, superoxido dismutase humana CuZn, SOD-1, e a enzima humana β-Ν-acetilhexosaminidase A, HexA, foram fundidas, ou quimicamente acopladas ao fragmento TTC (13,16), e a sua absorção pelos neurónios in vitro foi consideravelmente aumentada e as suas funções enzimáticas parcialmente conservadas. Combinadas com as experiências in vivo aqui descritas utilizando β-gal-TTC, uma estratégia de terapia génica baseada em proteínas híbridas TTC parece ser um método possível para administrar uma função biológica ao SNC. Contudo têm que ser encontradas vias atingir proteínas híbridas TTC que são provavelmente sequestradas em 16 vesículas para o compartimento subcelular apropriado. Uma tal estratégia terapêutica poderá ser particularmente útil para o tratamento de doenças neurodegenerativas e de motoneurónios, tal como a esclerose amiotrófica lateral (ALS, 35), atrofias musculares da medula espinal (SMA, 36,37), ou doenças de armazenagem lisosscmal neurodegenerativas (38, 39). Injecção em músculos seleccionados, mesmo no útero poderiam ajudar a atingir-se especificamente os neurónios apropriados. Além disso, uma tal estratégia iria evitar os efeitos secundários e potencialmente tóxicos associados ao uso de vírus defectivos para administrar um gene (40,41).

Exemplos

Exemplo 1: Construções plasmxdicas (A) Clonagem TTC:

Foi gerado ADN TTC de cadeia completa a partir da estirpe de ADN genómico de uma estirpe de Clostridium tetani (uma oferta do Dr. M Popoff, Instituto Pasteur) utilizando PCR. Foram sintetizados três fragmentos sobreponíveis: PCR1 de 465 pb (iniciador 1: 5'-CCC CCC GGG CCA CCA TGG TTT TTT CAA CAC CAA TTC CAT TTT CTT ATT C-3' e iniciador 2: 5'-CTA AAC CAG TAA TTT CTG-3'), PCR2 de 648 pb (iniciador 3: 5' -MT TAT GGA CTT TAA AAG ATT CCG C-3' e iniciador 4: 5'-GGC ATT ATA ACC TAC TCT TAG AAT-3') e PCR3 de 338 pb (iniciador 5: 5'-AAT GCC TTT AAT AAT CTT GAT AGA AAT-3' e iniciador 6: 5'-CCC CCC GGG CAT ATG TCA TGA ACA TAT CM TCT GTT TAA TC-3') . Os três fragmentos foram introduzidos sequencialmente em pBluescript KS+ (Stratagene) para dar plasmidec pBS: TTC. O iniciador a jusante 1 também contém um local de ligação ribossomal eucaríótíeo optímizado (RBS) e sinais de iniciação de tradução. O nosso fragmento TTC (462 aminoácidos) 17 representa os aminoácidos 854-1315 da holotoxina do tétano, i.e. o terminal carbóxilo de 451 aminoácidos da cadeia pesada, que constitui o fragmento C mais 11 aminoácidos da cadeia pesada que precede imediatamente o terminal amino do fragmento C. A sequência de ADN e sequência de aminoácidos do fragmento TTC clonado em pBS:TTC é apresentado na Figura 1. A construção pBS:xTC é apresentada na Figura 2. (B) pGEX: lacZ-TTC: 0 pGEX: lacZ foi obtido através de clonagem de um fragmento Smal/Xhol lacZ a partir do vector pGNA (uma oferta de Dr. H. Le Mouellic) em pGEX 4T-2 (Pharmacia). Foi utilizado o PCR para converter o codão de paragem lacZ num local de restrição Ncol. Foram utilizados dois iniciadores (a montante: 5'-CTG AAT ATC GAC GGT TTC CAT ATG-3' e a jusante: 5'-GGC AGT CTC GAG TCT AGA CCA TGG CTT TTT GAC ACC AGA C-3') para amplificar as sequências entre Ndel e Xhol, gerando pGEX:lacZ(Ncol) a partir de pGEX:lacZ. PGEX;lacZ-TTC foi obtido por inserção do fragmento TTC Ncol/Xhol em pGEX:lacZ (Ncol) , fundindo o TTC imediatamente a jusante da região que codifica para lacZ na mesma estrutura de leitura. A Figura 3 apresenta os detalhes da construção pGEX:lacZ-TTC. (C ) pGEX:TTC-lacZ:

pBS:TTC foi modificado para transformar Ncol num local de restrição BamRI (agente ligante 5'-CAT GAC TGG GGA TCC CCA GT-3') no inicio de TTC ADN, para dar o plasmídeo pBS:TTC (BamHI) . Foi obtido pGEX.-TTC clonando o fragmente TTC BamHI/Smal de pBS:TTC (BamHI) em pGEX 4T-2 (Pharmacia). Foi utilizado PCR para converter o codão de paragem do TTC num local de restrição Nhel. Foram utilizados dois iniciadores (a montante: 5'-TAT GAT AAA AAT GCA TCT TTA 18 GGA-3' e a jusante 5'-TGG AGT CGA CGC TAG CAG GAT CAT TTG TCC ATC CTT C-3') para amplificar a sequência entre Nsil e Smal, gerando pGEX:TTC(Nhel) a partir de pGEX:TTC. 0 lacZ cADN do plasmídeo pGNA foi modificado na sua extremidade 5' para transformar Sacll num local de restrição Nhel (ligante 5'-GCI AGC GC-3'). pGEX:TTC-lacZ foi obtido por inserção do fragmento de lacZ Nhel/Xhol no pGEX:TTC(Nhel), fundindo o lacZ imediatamente a jusante da região de codificação do TTC e na mesma estrutura de leitura. Os detalhes da construção de pGEX:TTC-lacZ são apresentados na Figura 4. (D) pCMV:lacZ-TTC: 0 vector pCMV foi obtido a partir de pGFP-Cl (Clontech laboratories) após algumas modificações: a sequência GFP foi apagada por uma digestão por BglII/Nhel e relegação, X100, 4 mM DTT, 1 mg/ml de lisosima, e uma mistura de anti-proteases (100 pg/ml Pefablok, 1 pg/ml de leupeptina, 1 μg/ml de pepestatina, 1 mM de benzamidina). Após quebra das células numa prensa francesa, o lisado bacteriano total foi centrifugado durante 10 min a 30000 rpm. O sobrenadante resultante foi incubado de um dia para o outro a 4°C com a matriz de afinidade Glutationa Sepharose 4B (Stratagene) com baixa agitação. Após centrifugação durante 5 min a 3000 rpm, a matriz foi lavada três vezes com o mesmo tampão de lise, mas sem lisosima e glicerol, e depois três vezes com PBS. A resina foi incubada de um dia para o outro a 4°C com trombina (lOU/ml; Sigma] em PBS de modo a cindir a proteína de fusão β-gal-TTC a partir da sequência da Glutationa-S-transferase (GST) fazendo deste modo a sua eluição na coluna de afinidade. A concentração da proteína de fusão eluída foi conseguida por centrifugação em tubos de centrícon X-1Q0 (Amicon; membrana de peso molecular de corte 100,000). 19 A proteína híbrida modificada foi analisada por transferência de Western após separação electroforética 8% acrilamida SDS/PAGE em condições de redução seguidas por transferência electroforética em membranas de nitrocelulose (0,2 mm de porosidade, EioRad). A imunodetecção das proteínas transferidas foi efectuada com um kit Vectastaln ABC- fosfatase alcalina da ÍVector Laboratories) e desenvolvimento de cor DAB. Os anticorpos foram utilizados como se segue: antisoro de coelho anti-p-gal (Capei), diluição de 1:1000; antisoro de coelho (Calbiochem), diluição 1:20000. Uma banda principal com uma massa molecular relativa de 180 kDa correspondente ao híbrido β-Gal-TCC e SacII no poliligando foi convertida no local de restrição Asei (ligantes 5'-GAT ATC GGC GCG CCA GC-3' e 5'-TGG CGC GCC GAT ATC GC-3'). pBluescript KS+ (Stratagene) foi modificado para transformar Xhol num local de restrição Ascl (ligante 5'-TCG ATG GCG CGC CA-3'), dando pBS (Ascl) plasmídeo. Foi obtido pBS:lacZ-TTC clonando um fragmento Xmal lacZ-TTC de pGEX: lacZ-TTC em pBS (Ascl) . PCMV: lacZ-TTC foi obtido por inserção do fragmento de lacZ-TTC Xm.nl/Ascl num vector pCMV nos locais Xhol e Ascl (Xhol e Xmnl foram eliminados com clonagem), colocando a fusão a jusante do promotor CMV. A figura 5 apresenta os detalhes da construção pCMV:JacZ-TTC. O plasmídeo pCMV:lacZ-TTC foi depositado em 12 de Agosto de 1997, na Collectíon Nationale de Cultures de Microorganisms (CNCM), Institut Pasteur, 25, Rue de Docteur Roux, F— 75724, Paris Cedex 15, France, sob o número de acesso 1-1912.

Exemplo 2: Purificação da proteína híbrida A estirpe E. coli SR3315 (uma oferta de Dr. A Pugsley, Institut Pasteur) transfectada com pGEX:lacZ-TTC foi utilizada para a produção de proteína. 20

Uma cultura bacteriana de um dia para o outro foi diluída 1:100 em meio LB contendo 100 pg/ml de ampícilina, e feita crescer durante várias horas a 32°C até se atingir uma DO de 0,5. Foi conseguida a indução do promotor Ptac adicionando 1 mM de IPTG e 1 mH de MgCl2 e mais 2 horas de incubação. As bactérias induzidas foram peletízadas por centrifugação durante 20 mín a 3000 rpm, lavadas com PBS e novamente suspensas em tampão de lise contendo 0,1 M de Tris pH 7,8, 0,1 M de NaCl, 20% de glicerol, 10 mM de EDTA, 0,1% de proteína tríton foi detectada com anticorpos anti-Gal e anti-TTC.

Exemplo 3: Ligação e internalização de proteína recoxnbinante em células 1009 diferenciadas. A linha celular 1009 foi derivada de um teratocarcinoma testicular espontâneo que surge numa estirpe consanguínea recombinante de ratinho (129xB6) (17). As células 1009 foram cultivadas em meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) contendo soro fetal de vitela a 10% e subcultivado na subconfluência. Diferenciação in vítro com ácido retinoico e cAMP foi efectuado como descrito (18). Oito dias após tratamento com ácido retinoico, as células foram utilizadas para as experiências de internalização com a proteína híbrida ou com β-gal.

Ligação e internalização da fusão β-gal-TTC foram avaliadas utilizando um protocolo modificado (16). Células 1009 diferenciadas foram incubadas durante 2 horas a 37°C com 5 μ9/πύ de β-gal-TTC ou proteína β-gal diluída em tampão de ligação (0,25% de sacarose, 20 mM de Tris acetato ImM CaC12, ImM MgCla, 0,25% de albumina de soro de bovino, em PBS). As células foram então incubadas com 1 μg/ml de Pronase E (Sigma) em PBS durante 10 min a 37°C, seguida de 21 lavagem com inibidores de proteases diluídos em PBS (100 μς/τΐά de pefabiok, 1 mM de benzamidina) .

As células foram fixadas com 4% de formalina em PBS durante 10 mín à temperatura ambiente (Ta) e depois lavadas exaustivamente com PBS. Foi detectada actividade β-gal em células fixadas através de uma coloração de um dia para o outro a 37°C numa solução de X-Gal (0,8 mg/ml X-Gal, 4 mM de ferrocianeto de potássio, 4 mM de MgCl2 em PBS) . Para a microscopia electrónica, as células foram ainda fixadas em 2,5% de glutaraldeído durante 18 horas, e depois processadas como descrito em (19).

Para a marcação imunihistoquímica as células foram fixadas com 4% de paraformaldeido em PBS durante 10 min à Ta depois lavadas exaustivamente com PBS, seguindo-se uma hora de incubação à Ta com 2% de BSA/0,02% triton X-100 em PBS. As células foram co-incubadas em anticorpos primários diluídas em 2% BSA/0,02% Triton X-100 em PBS durante 2 horas à Ta. Os anticorpos utilizados foram um anticorpo anti-neurofilamento de ratinho (NF 200 Kd, diluição 1:50; Sigma), ou o anticorpo anti-TTC de coelho (diluição 1:1000). A marcação foi visualizada utilizando anticorpos secundários fluorescentes: Cy3, cabra anti- IgG de coelho (diluição 1:500; Amersham) ou IgG anti-ratinho com extravidina-FITC (diluição 1:200; Sigma). As células foram montadas em moviol e visualizadas com epifluorescência.

Exemplo 4: Injecção de proteína recombinante in vivo.

Ratinhos B6D2F1 de 14 semanas foram obtidos a partir de IFFA-CREDO. O músculo da língua do animal foi injectado utilizando uma seringa de Hamilton (20 μΐ por animal) sob anestesia gerai com 3% de Avertina (15 μΐ/g de animal) . A concentração de proteína f oi de 0,5 Λ 5 μρ/μΐ em PBS; por 22 isso os ratinhos receberam aproximadamente 10 a 100 pg por injecção. Os animais foram mantidos vivos durante 12 horas a 48 horas após a injecção para permitir a migração da proteína injectada e não foram detectados sintomas de tétano em nenhum caso. Os ratinhos foram sacrificados com perfusão intracardíaca com 4% de paraformaldeído em PBS sob anestesia profunda. Os cérebros foram recolhidos, lavados em PBS e incubados em 15% de sacarose de um dia para o outro a 4°C, depois montados em Tissue-Tek antes de seccionamento em secções de 15 pm utilizando um crióstato.

Exemplo 5: Histologia, Imunohistologia, e coloração de X-Gal.

Para a coloração in toto X-Gal do cérebro dissecado e língua, ratinhos (10 animais) foram sacrificados e fixados como descrito acima. O cérebro foi ainda cortado com um escalpelo ao longo de um plano mediano e incubado directamente durante 12 horas numa solução de X-Gal.

Para a imunohistologia, foram incubadas secções numa diluição de 1:5000 de anti-corpo anti-TTC em 2% de BSA/0,02% Triton X-100 em PBS de um dia para o outro a 4°C após locais de ligação do anticorpo não específicos serem bloqueados por uma incubação de 1 h no mesmo tampão. Foi efectuada a detecção do anticorpo utilizando o kit de ABC-fosfatase alcalina da Vectastain com o desenvolvimento de cor DAB. Para a coloração de X-Gal secções foram incubadas numa solução de X-Gal e contrastadas durante 30 s com hematoxilina 115 (v/v) em PBS. Foi realizada a histologia em secções adjacentes após coloração com X-Gai, utilizando uma incubação de 30 s numa solução de hematoxilina/ tionina. Todas as secções foram montadas em moviol antes de oito análises microscópicas. 23

Exemplo 6A: Internalização da proteína de fusão β-Gal-TTC por neurónios in vitro.

Diferenciação de células 1009 com ácido retínoico e cAMP in vitro dá origem a células neuronais e gliais (18,20). Coloração com X-Gal ou imunomarcação foram efectuadas após incubação com proteína de fusão β-Gal-TTC, ou com β-gal ou proteínas TTC isoladas. Apenas quando a proteína híbrida foi incubada com células diferenciadas 1009 foi detectada uma coloração forte em células que possuem um fenótipo neuronal. Não foi detectado nenhum sinal quando apenas β-gal foi incubado sob as mesmas condições. Foi obtido um padrão de coloração com X-Gal semelhante, após tratamento das células com pronase para remover proteínas ligadas à superfície, indicando que a proteína híbrida tinha sido internalizada. A localização intracelular da proteína híbrida foi ainda confirmada por análise por microscopia electrónica de células coradas com X-Gal. Além disso, a actividade enzimática observada nos axónios parecia estar localizada em vesículas associadas com filamentos, o que está de acordo com trabalho anterior no fragmento TTC ou na toxina do tétano nativa (14, 21, 22). Co-marcação com anti-TTC e anticorpos anti-neurofilamento revelou que a actividade β-gal se encontrava co-localizada com o fragmento TTC em células neuronais. As células gliais não foram marcadas com nenhum dos anticorpos.

Exemplo 6B:Internalização da proteína de fusão TTC-β gal por neurónios in vitro. 0 método utilizado para a internalização foi idêntico ao descrito no Exemplo 6 acima. Os resultados apresentam 24 uma internalização eficiente do híbrido, tal como no Exemplo 6 acima.

Exemplo 7: Transporte retrogrado da proteína híbrida in vivo.

Para estudar o comportamento da proteína β-gal-TTC in vivo, a proteína híbrida foi testada numa rede neuronal bem caracterizada, o sistema do hipoglosso. Após injecção intramuscular da proteína β-gal-TTC na língua do ratinho foi analisada a distribuição da proteína híbrida no SNC por coloração com X-Gal. Foram injectadas várias diluições da proteína e pontos sequenciais no tempo foram analisados para permitir transporte de proteína para motoneurónios do hipoglosso (XII), e a sua migração transneuronal para os neurónios de segunda ordem ligados.

Um perfil bem definido de neurónios grandes marcados era claramente evidente na estrutura do hipoglosso, analisada in toto às 12 horas após a injecção. Uma marcação forte era também aparentemente retrogradamente era também aparente no nervo do hipoglosso (Xlln) da língua dos ratinhos injectados. Ao nível das fibras do músculo, foram observadas estruturas em botão que podem reflectir a marcação de junções neuromusculares, em que a proteína híbrida foi internalizada para os axónios do nervo. Estes dados demonstram que a proteína híbrida β-gal-TTC pode migrar rapidamente através de transporte axónico retrógrado e tão longe quanto os corpos celulares dos motoneurónios, após absorção prévia pelos terminais do nervo na língua. Esta absorção específica e o transporte intra-axonal são semelhantes às propriedades que foram descritas para a toxina nativa (6, 21, 23). 0 transporte da proteína híbrida foi examinado com maior detalhe analisando as secções do cérebro coradas com 25 X-Gal. Os motoneurónios do núcleo do hipoglosso ficarem rapidamente marcado, sendo 12 horas o menor tempo examinado. A maior parte da marcação encontrava-se confinada a corpos celulares neuronais, estando o núcleo da célula não marcado. A intensidade da marcação depende da concentração da proteína β-gal-TTC injectada: quando foi ínjectada 10 μς de proteína, apenas foram detectados os corpos celulares do hipoglosso, enquanto que com 25 a 50 μια foi visualizada uma rede difusa de dendrites; foi detectada transferência trans-sináptica com 100 μς de proteína híbrida. Foi observada uma distribuição idêntica da marcação, as secções do cérebro encontravam-se imunocoradas com um anticorpo anti-TTC, demonstrando que β-gal e o fragmento TTC se co-localizam dentro das células. Finalmente, a injecção de β-gal não resultou na marcação de núcleos do hipoglosso confirmando deste modo que o transporte da proteína híbrida é dependente de TTC. Marcação com um anti-corpo anti-TTC foi menos informativo que a detecção de actividade β-gal; por exemplo a via nervosa para o cérebro não podia ser visualizada por imunocoloração anti-TTC. Às 18 horas após a injecção, foi observada marcação nos núcleos do hipoglosso: todos os corpos celulares de motoneurónios e a parte mais proximal das suas dendrites encontravam-se densamente coradas. Em contraste, não foi detectada nenhuma marcação em células glíais juntas com motoneurónios Xll ou com os seus axóníos. Os nossos resultados estão de acordo com outros que reportaram um padrão idêntico de ímunomarcação após injecção do fragmento de TTC sozinho (9). h transferência transneuronal é detectável após 24 horas. Mais 24 horas e mais do que isso não produziu uma coloração diferente.

Exemplo 8: Transporte transneuronal da proteína híbrida. 26

Interneurónios de segunda ordem, assim como neurónios de ordem maís elevada que sínapsarrt com os motoneurónios do hipoglosso, tem sido extensivamente analisada utilizando marcadores convencionais, tais como o complexo de gérmen de trigo aglutinina- peroxidase do rábano silvestre (WGA-HRP), ou vírus neurotrópicos tais como o herpes- alfa (24) e vírus rhabdo (25) . Uma compilação exaustiva das regiões do cérebro que se ligam sinapticamente ao núcleo do hipoglosso também foi recentemente descrita (25).

Nesta invenção a distribuição da β-gal-TTC de fusão depende da concentração inicial da proteína injectada no músculo e do tempo permitido para o transporte após injecção. Até 24 horas após a injecção, a marcação foi restrita aos núcleos do hipoglosso. Após 24 horas, a distribuição de células transneuronais de segunda ordem marcadas em várias regiões do cérebro era consistente e reprodutível. Mesmo para tempos mais longos (por ex. 48 horas), a marcação dos núcleos do hipoglosso permaneceu constante. Para uma maior amplificação, foi observada uma coloração localizada e discreta dos neurónios de segunda ordem, sugerindo que a proteína híbrida tinha sido dirigida para vesículas dentro dos corpos celulares das células, sinapses e axónios. Uma distribuição semelhante em manchas foi anteriormente descrita para a toxina do tétano e para o fragmento TTC isolados (14, 21, 22).

Foi detectada uma marcação transneuronal intensa na formação reticular lateral (LRF), em que foi reportado que cs neurónios reticulares medulares formam numerosas proiecções para o núcleo do hipoglosso (26, 27). Foi detectada actividade gal bilateralmente nestas secções. Projecções da marcação led LRF formavam uma coluna contínua ao longo do eixo rostrocaudal, iniciando-se lateralmente ao núcleo do hipoglosso, estando alguns neurónios corados 27 preferencialmente nos núcleos da dorsal reticular medular (MdD) e da ventral reticular medular (MdV), Esta coluna extende-se rostralmente, através da medula, com neurónios mais intensamente marcados no núcleo reticular parvicelular (PCRt, caudal e rostral). Após 48 horas, as células em MdD e PCRt encontravam-se mais intensamente coradas. Foi detectada no núcleo solitário (Sol) uma segunda distribuição bilateral de neurónios medulares projectando-se para o núcleo do hipoglosso, mas a marcação foi menos intensa do que na formação reticular, presumivelmente porque relativamente poucas células do núcleo solitário se projecto para o núcleo do hipoglosso (26). Contudo, não foi encontrada marcação no núcleo trigeminal espinal (Sp5), que foi demonstrado projectar-se no núcleo do hipoglosso (26) . 0 transporte trans-sináptico da proteína β-gal-TTC foi também detectada na formação reticular pontina do núcleo caudal (PnC), no locus coeruleus (LC), no núcleo médio vestibular (MVe) e nalgumas células do núcleo vestibular inferior (IV). Estes grupos celulares são conhecidos por se projectarem sobre o núcleo do hipoglosso (25), mas a sua marcação foi fraca, provavelmente devido ao maior comprimento dos seus axónios. Foram observadas algumas células marcadas no núcleo paragigantocelular dorsal (DPGi), do caudal do núcleo magnocelular (RMc), e do núcleo da raphe caudal (R ); as suas ligações ao núcleo do hipoglosso foram também reportadas (25). Finalmente os neurónios marcados foram detectados bilateralmente nas projecções do cérebro médio, tais como os do núcleo mesencefálico trigeminal (Me5), e alguns neurónios foram corados na região mesencefáiica central cinzenta (CG). Estes últimos núcleos foram tipificados como grupos de células putativas de terceira ordem relacionadas com o núcleo do hipoglosso (25) . 28

Também fcram marcados os neurónios no núcleo motor trigeminal (Mo5) e no tracto trigeminal acessório (Acs5), conjuntamente com uma população de neurónios no núcleo facial (N7). Contudo, a interpretação desta marcação é mais ambígua, uma vez que é conhecido que os motoneurónios nesses núcleos também inervam outras partes dc tecido muscular, e difusão da proteína híbrida pode ter ocorrido no ponto de injecção. Reciprocamente, estes núcleos podem também projectar-se para a musculatura da língua através do nervo XII, uma vez que os neurónios em NI foram reportados receberem estímulos directos do nervo do hipoglosso (28). Esta última explicação é consistente com o facto de que foi detectada marcação nestes núcleos apenas após 24 horas; contudo, este ponto não foi mais investigado.

No seu conjunto, os dados resumidos na Tabela 1 estabelecem claramente o transporte transneuronal da proteína de fusão β-gal-TTC a partir dos neurónios do hipoglosso para vária regiões ligadas do tronco cerebral. 29

Tabela 1. Transporte transneuronal da proteína de fusão lacZ-TTC a partir do nervo XII: marcação de diferentes tipos de células no sistema nervoso centrai._

Grupos celulares 12-18 horas 24-28 horas Neurónios de primeira ordem Primeira categoria: XII, motoneurónios do hipoglosso ++ +++ Sequnda categoria: N7 nu faciais — ++ Mo5, nu trigeminal motores — ++ Acs5, nu trigeminal acessórios — + Grupos celulares de segunda ordem MdD, nu medular, reticular, dorsal _ ++ MdV, nu medular, reticular, ventral “ + PCRt, nu parvicelular, reticular, caudal ++ PCRt, nu parvicelular, reticular, rostral ++ Sol, nu tracto solitário — + DPGi, nu paragigantocelular dorsal + /- PnC, nu reticular pontina caudal “ + RMc, nu reticular magnacelular — + /- R, nu raphe caudal - + /- MVe, nu médio vestibular — + IV, nu vestibular inferior + /- LC, locus coeruleus - + Me5, nu trigeminal mesencefálico (1) — + CG, mesencefálico central cinzento (1) — + /- 1

Representa grupos celulares de segunda ordem que também contêm neurónios putativos de terceira ordem (ver texto). -, sem marcação; + a +++ densidade acrescida de marcação; + /- marcação fraca. Foram analisados 16 animais para os dados das 12-18 horas p.i; foram analisados 6 animais para os dados das 24-48 horas p.i. 30

Referência Bibliográficas

Esta invenção baseia-se nas seguintes publicações aqui citadas 1. Eisel, U„ Jarausch, W„ Goretzki, K.,Henschen, A., Engels, J., Weller, U., Hudel, M„ Habermann, E. &Niemann, H (1986) EMBO 0 5,2495-2502. 2. Fairwealher, N. F. & Lyness, V. A. (1936) Nucleic Acids Res. 14, 7809-7812. 3. Montecucco, O. & Schiavo, G. (1995) Quart. Rev. Biophys. 28, 423-472. 4. Schwab. Μ. E. & Thoenen, H. (1976) Brâin Res. 105, 213-227. 5. Schwab, Μ. E, & Thoenen, H. (1977) Brain fies. 122, 459-474. 6. Price, D. L„ Gfrfin, J. W. & Peck. K. (1977) Brain Res. 121,379-334, 7. Bizzini, B., Stoeckel, K, & Schwab, M. (1977) J. Neurochem. 28, 529-542. 8. Evinger, O, & Erichsen, J. T. (1986) Brain Res. 300. 383-386. 9. Físhman, P S. & Carrioan, D. P. (1987) Brain Res, 406,275-279. 10. Manning, K. A., Erichsen, j. 7, & Evinger, O. (1990) Neurosd. 34, 251-263. 11. Halpe-n, J. L, Habig, W. H., Meale, E. A. & Stibííz, S (1990) /nfecí/on andImmunitySB, 1004-1009. 12. Bizzini, B., Grob, P.p Glicksman, Μ, A. & Akert, K. (1980) Brain Res. 193, 221-227. 13. Dobrenís, K., Joseph, A. & Rattazzí, M. G. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 2297-2301. 14. Físhman, P. S. & Savitt, J, M. (1989) Exp. Neurol. 106,197-203. 15. Beaude, P., Delacour, A., Bizzini. B„ Domuado, D. & Remy Μ. H. (1990) Biochem. 271, 87-91. 16. Francis, J.W., Hosler, B. H., Brown, R. H., Jr. & Físhman, P, S. (1995) J. Bioi. Chem. 270,15434-15442. 17. Fellous, M.p Gunlher, E., Kemler, R„ Wells, J., Bergen R., Guenet, J. L„ Jakob, H. & Jacob, F, (1978)0. Exp. Ued. 148, 58-70. 18. Jakob, H. & Nicolas, J. F. (1987) Methods Enzymoi. 151,66-84. 19. Whitehouse, R. L S„ Benichou, J. O. & Ryter, A. (1977) Biol. Cell. 30, 155-158. 20. Wo|cik, B. E., Mothias, F., Lazar, M., Jouin, H., Nicolas, J. F, & Peschanski, M. (1993; Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 1305-1309. 21. Price, D. L, Griffin, J.. Young, A.. Peck, K. & Stocks, A, (1575) Science 188, 945-947, 22. MaHsoli, M„ Verderio, C., Rossetto, o,, lezzi, N., Ooco. S.. Schiavo, G. & Montecucco, G, (1996) Proc. Natl. Acad Sei. USA 93, 13310-13315. 23. Stockal, K., Schwab, M. & Thoenen, H. (1975) Brain Res. 99, 1-16. 24. Ugoliní, ú. (1995a) in Virai Vectors: Gene Therapy and Neurasc/ence Applications, eds. Loevvy, A. D & Kaplitt M. G. (New York: Academic Press), pp. 293-317, 25. Ugolini, G, (1 995b) The Journalol Compamtive Neurology 356, 457-480, 26. Borke, R. C„ Nau, Μ. E. & R-L Ringler, J. (1983) Brain Research 269, 47-55. 27. Horsl, G, T, T„ Copray, J. C, V. M,, liem, R. S. B. & Wíiiigen, J. D. V. (1991) Ncuroscience 4C, 735-758. 28. 0'Reilly, P. M. R. & Fitzgerald, M. J. T. (1990) J. Anai. 172, 227-243. 29. Chalfie, M„ Tu, Y„ Euskirchen, G„ VYard, W. W. & Prasher, D, C. (1994) Science 263, 602-805. 30. Miesenbõck, G. & Rothman, J. E. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94, 3402-3407 31. Le Mouellíc, H., Lailemand, Y. &. Brulet, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 4712-4716. 32 32. Le Mouellíc, H,, taflemand, Y. & BrOlet, P. (1992) Cell69, 251-264. 33. Mombaerls, P., Wang, F„ Dulac, C.. Chao, S, K., Nemes, A., Mendelsohn, M., Edmorsdson, J. & Axei, R. (1996) C$1187. 675-686. 34. Mountfoxd, P. S. & Srrsith, A. G. (1995) Trencls Ger.et. 11.179-164. 35. fiosen, D. R. & a! (1993) Nature 362, 59-62. 36. Lefebvra, S., Buglen, L, Reboulleí, S„ Clermonl, 0„ Burlei, P., Viollst, L, Benichou, B., Cruaud, O., Millasseau, P., Zeviani, M,, Paslier, D.L, Frézal, J., Cohen, D,, Weissenbach, J., Munnich, A. & Meiki, J. (1995) Ce//8Q, 155-165. 37. Roy, N. & al (1995) «,780, 167-178. 38. Wolfe, 3. H., Deshmane, S. L. & Fraser, N. W. (1992) Nature genetscs 1,379- 384. 39. Sartgo, K., Yamanaka, S„ Hoffmarm, A., Okuda, Y., Grínberg, A., Westphal, H., McDonald, M, P„ Crawley, J. N„ Sandhoff, K., Suzuki, K. & Prosa, R. L. (1995) Naturo Genetics 11,170-176. 40. Duarte, R. G, (1995) Neurologia 1, 56-61, 41. Ghadge, G, D., Roos, R, P,, Kang, U. J„ Wollmann, R„ Fishman; P. S., Kaiynych, A M., Barr, E. & Leiden, J. M. (1995) Gene TherapyZ, 132-137.

Lisboa, 12 de Abril de 2007

Claims (23)

1 Reivindicações 1. Fragmento da toxina do tétano não tóxico recombinante, caracterízado por ser um fragmento recombinante da toxina do tétano compreendendo o fragmento C, mais 11 aminoácidos da cadeia pesada que precede imediatamente o terminal amino do fragmento C.

2. Polinucleótido que codifica para um fragmento não tóxico recombinante da toxina do tétano de acordo com a reivindicação 1.

3. Uso de um fragmento não tóxico recombinante da toxina do tétano de acordo com a reivindicação 1, como um veículo trans-sináptico no fabrico de um medicamento para a administração de pelo menos uma proteína ou péptido a neurónios de segunda ordem ou de ordem superior, em que o dito fragmento não tóxico recombinante da dita toxina do tétano é destinado a ser fundido pelo menos com uma dita proteína ou péptido para ser administrado, ou para ser quimicamente ligado a um polinucleótido que codifica para uma tal proteína ou péptido.

4. Uso de um polinucleótido que codifica para um fragmento recombinante não tóxico da toxina do tétano de acordo com a reivindicação 1, como um polinucleótido que codifica para um veículo trans-sináptico para a produção de um medicamento para a administração de pelo menos uma proteína ou ura péptido a neurónios de segunda ordem ou de ordem superior, em que o dito polinucleótido que codifica para o veículo se destina a ser fundido com um polinucleótido que codifica para a dita proteína ou dito péptido a ser administrado. 2

5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o dito polinucleótido que codifica para pelo menos uma dita proteína ou dito péptido a ser administrado ao SNC compreende ainda um promotor capaz de expressão em células neuronais, ou em precursores de células neuronals, ou em células musculares.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-5, caracterizado por o dito medicamento se destinar à compensação ou modulação de funções sob o controlo do SNC, ou para a compensação, ou para a modulação das funções do SNC, ou para o tratamento de uma doença do SNC.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-6, caracterizado por pelo menos uma proteína a ser administrada ao SNC ser seleccionada a partir do grupo que consiste na proteína SMN, BDNF (factor neurotrófico derivado do cérebro), NT-3 (neurotrofina-3), NT-4/5, GDNF (factor neurotrófico derivado da linha celular glial), IGF (factor de crescimento semelhante à insulina), PNI (protease nexin I), SP13 (proteína inibidora das serina proteases), ICE (enzima de conversão da interleucina-1), Bd-2, GFP (proteína fluorescente verde), endonucleases como I-Scel ou CRE, anticorpos, fármacos especificamente direccionados contra doenças neurodegenerativas, fármacos direccionados especificamente contra a esclerose amiotrófica lateral (LSA).

8. Polipéptido híbrido compreendendo um fragmento de toxina do tétano fundido pelo mencs com uma proteína ou péptido, caracterizado por o dito fragmento da toxina do tétano ser um fragmento recombinante não tóxico de acordo com a reivindicação 1. 3

9. Polipéptido híbrido de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por pelo menos uma proteína fundida ou péptido ser seleccíonado a partir do grupo que consiste na proteína SMN, BDNF (factor neurctrófico derivado dc cérebro), NT-3 (neurotrofina-3), NT-4/5, GDNF (factor neurotrófico derivado da linha celular glial), IGF (factor de crescimento semelhante à insulina), PNI (protease nexin I), SP13 (proteína inibidora das serina proteases), ICE (enzima de conversão da interleucina-1), Bcl-2, GFP (proteína fluorescente verde), endonucleases como I-Scel ou CRE, anticorpos, fármacos especificamente direccionados contra doenças neurodegenerativas, fármacos direccionados especificamente contra a esclerose amiotrófica lateral (LSA).

10. Polipéptido híbrido de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado por pelo menos uma proteína fundida ou péptido ser fundido a montante do fragmento da toxina do tétano.

11. Polipéptido híbrido de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado por pelo menos uma proteína fundida ou péptido ser fundido a jusante do fragmento da toxina do tétano.

12. Polinuclectido que codifica para um polipéptido híbrido de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11.

13. Vector compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para um polipéptido híbrido de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, e um promotor capaz de expressão em células neuronais, ou precursoras de células neuronais e opcionalmente um amplificador. 4

14. Vector compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para um polipéptido híbrido de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, e um promotor capaz de expressão em células musculares, e opcionalmente um amplificador.

15. Vector de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o dito vector ser o plasmídeo pCMV-LacZ-TTC que foi depositado na C. N. C. M. em 12 de Agosto de 1997, sob o número de registo 1-1912.

16. Célula contendo um polinucleótido que codifica para uma proteína híbrida de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11.

17. Fragmento associado a um polinucleótido, compreendendo um fragmento não tóxico recombinante da toxina do tétano de acordo com a reivindicação 1, ligada quimicamente a pelo menos um polinucleótido compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma proteína, ou péptido, e elementos reguladores da expressão.

18. Fragmento associado a um polinucleótido de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por pelo menos um polinucleótido que codifica para uma proteína ou péptido seleccionado a partir do grupo que consiste na proteína SMN, BDNF (factor neurotrófico derivado do cérebro), NT-3 (neurotrofina-3), NT-4/5, GDNF (factor neurotrófico derivado da linha celular glial), IGF (factor de crescimento semelhante à insulina), PNI (protease nexin I), SP13 (proteína inibidora das serina prcteases), ICE (enzima de conversão da interleucina-1), Bci-2, GFP (proteína fluorescente verde), endonucleases como I-Scel ou CRE, anticorpos, fármacos especificamente direccionados contra 5 doenças neurodegenerativas, fármacos direccionados específicamente contra a esclerose amiotrófica lateral (LSA).

19. Célula contendo um fragmento associado a um polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 18.

20. Composição para uso como medicamento que compreende um polipéptido híbrido de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-11, ou um polinucleótido de acordo com a reivindicação 12, ou um vector de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-15, ou uma célula de acordo com a reivindicação 16, um fragmento associado a um polinucleótido de acordo com a reivindicação 17 ou 18, ou uma célula de acordo com a reivindicação 19.

21. Uso de: - um polipéptido híbrido compreendendo um fragmento não tóxico recombinante da toxina do tétano de acordo com a reivindicação 1, fundido pelo menos com uma proteína, ou um péptido, ou -um polinucleótido que codifica para um tal polipéptido híbrido, ou - um vector compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica para um tal polipéptido híbrido, e um promotor capaz de se expressar em células neuronais ou precursores de células neuronais, ou em células musculares, ou - uma célula contendo um tal polipéptido híbrido, ou - um fragmento associado a um polinucleótido compreendendo um fragmento não tóxico da toxina do tétano de acordo com a reivindicação 1, ligado quimicamente a pelo menos um 6 polinucleótido compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica para uma proteína ou um péptido, e elementos reguladores da expressão, ou - uma célula contendo um tal fragmento associado a um polinucleótido, para o fabrico de um medicamento para a administração da dita proteína, ou péptido fundido ou codificado a neurónios de segunda ordem ou de ordem superior.

22. Uso de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por a dita composição se destinar à compensação, ou modulação das funções sob o controlo do SNC, ou para a compensação, ou modulação das funções do SNC, ou para o tratamento de uma doença do SNC.

23. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21-22, caracterizado por pelo menos uma proteína a ser administrada ao SNC ser seleccionada a partir do grupo que consiste nas proteínas SMN, BDNF (factor neurotrófico derivado do cérebro), NT-3 (neurotrofina-3), NT-4/5, GDNF (factor neurotrófico derivado da linha celular glial), IGF (factor de crescimento semelhante à insulina), PNI (protease nexín I) , SP13 (proteína inibidora das serina proteases), ICE (enzima de conversão da ínterleucina-1), Bcl-2, GFP (proteína fluorescente verde), endonucleases como I-Scel ou CRE, anticorpos, fármacos especificamente direccionados contra doenças neurodegenerativas, fármacos direccionados especificamente contra a esclerose amiotrófica lateral (LSA). Lisboa, 12 de Abril de 2007