ES2278411T3 - Factor de crecimiento nervioso como adyuvante de vacuna. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de vacunación utiliza una combinación farmacéutica para potenciar la eficacia de las vacunas. El procedimiento utiliza una vacuna que desencadena una respuesta inmune capaz de estimular la producción en un animal inmunodeficiente de anticuerpos ante un agente causante de enfermedad extraño al animal. Como coadyuvante, se administra una cantidad potenciadora de la eficacia de la vacuna de factor del crecimiento nervioso (NGF), que potencia la producción y la afinidad de los anticuerpos en el animal en respuesta a la vacuna.
Description
Factor de crecimiento nervioso como adyuvante de
vacuna.
La presente invención se refiere al campo de las
vacunas.
A menudo seres humanos, ganado y animales
domésticos son vacunados para prevenir enfermedades o disminuir la
gravedad de las mismas. La vacunación tiene como resultado la
producción de anticuerpos, que son proteínas séricas capaces de
unirse específicamente a sustancias antígenas utilizadas en la
vacuna. Esta respuesta humoral implica la selección de líneas
específicas de linfocitos B, así como la proliferación y
diferenciación de las células seleccionadas para producir clones de
células plasmáticas productoras de anticuerpos.
La producción de anticuerpos alcanza su punto
máximo en un plazo de varias semanas tras la vacunación y luego
disminuye gradualmente. Debido a la renovación constante de
proteínas séricas, la disminución de producción de anticuerpos va
acompañada de la correspondiente disminución del nivel circulante de
anticuerpos. Sin embargo, si se somete al paciente de nuevo al
mismo antígeno, se inicia una curva nueva de respuesta más rápida e
intensa que la primera. Ésta es conocida como respuesta secundaria,
de refuerzo o anamnésica y que en pacientes sanos da lugar a
niveles más altos de anticuerpos con mayor afinidad con el antígeno
que en la primera exposición o vacunación primaria. El aumento en
la velocidad de la síntesis de anticuerpos es el resultado del
aumento del número de células plasmáticas productoras de
anticuerpos. Dichas células son escasas en los nódulos linfáticos
del paciente que no ha sido vacunado y contienen en su mayor parte
linfocitos pequeños. Sin embargo, en pacientes sanos, las células
plasmáticas constituyen hasta un 3% del total de células del nódulo
linfático tras una vacunación primaria y hasta un 30% de células
del nódulo linfático tras una vacunación secundaria.
Se dice que la respuesta secundaria se debe a la
memoria inmunitaria. Es decir, el organismo sano es capaz de
"recordar" su exposición anterior al antígeno y reaccionar más
rápida y eficazmente la segunda vez que es expuesto, incluso si la
cantidad de anticuerpos específicos del suero ha descendido, entre
tanto, a un nivel muy bajo.
Algunas condiciones tales como el
envejecimiento, malnutrición, adicción a las drogas, alcoholismo y
ciertas enfermedades como la diabetes y el SIDA, conducen a la
inmunodeficiencia, en la que muchas respuestas inmunitarias son
reprimidas y la vacunación tiene una eficacia reducida. De modo que,
en ese caso, aún es necesario, encontrar técnicas de vacunación
mejoradas, particularmente para ancianos u otros
inmudeficientes.
El documento WO 95/05845 describe una
formulación farmacéutica acuosa que comprende el factor de
crecimiento nervioso, una sal aceptable biológicamente en una
cantidad suficiente para mantener la isotonicidad, una solución
tampón en una cantidad suficiente para mantener el pH de la
formulación desde aproximadamente 4,5 a 6,0 y agua.
El documento WO 95/30436 describe una
composición adyuvante que comprende al menos dos actividades
citoquínicas (IL-1\beta y
TNF-\alpha o IL-1\beta y
GM-CSF) que actúan en sinergia para aumentar la
respuesta inmunitaria al antígeno.
En Vacinne (1992) (Vacunas), vol.10, nº
7, páginas 427-434 de Heath A. W. et al., se
analiza el uso de citoquinas como IFN-\gamma,
IL1\beta y IL2 como adyuvantes inmunológicos en la
inmunodeficiencia.
El factor de crecimiento nervioso (NGF),
descrito y tipificado hace casi treinta años
(Levi-Montalcini, 1987; Cohen, 1960) como la
primera señal soluble que media las comunicaciones intracelulares,
pertenece a la familia de proteínas conocidas como neurotrofinas,
que son cruciales para el desarrollo regulado y supervivencia de
las células neuronales (Barde, 1990). Durante décadas se ha
demostrado su función en el mantenimiento de la supervivencia de
las neuronas de los ganglios simpáticos y sensoriales
(Levi-Montalcini y Angeletti, 1966, 1968).
Recientemente dichos estudios iniciales se han extendido a otras
poblaciones de neuronas del sistema nervioso central, incluyendo
las células colinérgicas del cerebro basal anterior (Johnson et
al. 1986; Shelton y Reichardt, 1986) Se cree que el NGF, como
otras neurotrofinas, es producido en el sistema nervioso por células
accesorias, tales como las células y gliales y oligodendrocitas
(Ernfors et al., 1990, Hofer et al., 1990) que, por
consiguiente, regulan el proceso de diferenciación de las neuronas,
en su mayor parte, a través de la formación de circuitos de
paracrina.
Las neurotrofinas, incluyendo el NGF, el factor
neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), la
neurotrofina-3 (NT-3) y NT4/5,
ejercen su efecto sobre blancos celulares a través de receptores de
superficie específicos, que tras la unión e internalización del
ligando, desencadenan una cascada de eventos bioquímicos, que
representan la respuesta adaptiva (revisado por Barde, 1990). Se
pueden identificar dos clases de sitios de unión a la neurotrofina
en las células diana, basándose en la baja afinidad (K_{d} 1 nM) y
la alta afinidad (K_{d} 20 pM) del ligando o ligandos.
Recientemente se ha tipificado la naturaleza molecular de estos
receptores (Meakin y Scooter, 1992). Una glicoproteína 75 kDa, la
denominada p75^{NGFR}, media la unión de baja afinidad de
cualquier neurorofina con similar afinidad (Chao, 1994). Las
proteínas pertenecientes a la familia de los receptores tirosina
quinasa (trk), que interactúan con las neurotrofinas de manera muy
específica, son responsables de la unión de alta afinidad.
P140^{trk-A} se combina con NGF,
p140^{trk-B} con BDNF y
p140^{trk-C} con NT-3 y
NT-4/5 (Barbacid, 1994). Probablemente cada clase de
receptores transmite señales distintas a la célula diana, ya que
parece que p75^{NGFR} y p140^{trk-A} no forman
heterodímeros de unión a NGF (Jing et al., 1992).
Curiosamente, p75^{NGFR} guarda homología estructural con los
receptores de factor de necrosis tumoral I y II, los antígenos de
superficie de los linfocitos CD30, CD40, OX40 y el antígeno de
superficie Fas/Apo-1, que son las moléculas
implicadas en la prevención o mediación de la apoptosis (revisado
por Raffioni et al., 1993).
Desde la primera descripción de la purificación
de NGF a partir de células glandulares de ratones, se ha hecho
patente que este factor es también producido por varios tipos de
células no nerviosas (Levi-Montalcini, 1987), entre
las que se incluyen los queratinocitos (Di Marco et al.,
1993) y células del músculo liso (Ueyama et al., 1993).
Asimismo, se tiene constancia de que el protooncógeno es expresado
por inmunocitos tales como los monocitos (Ehrard et al.,
1993a) o los linfocitos T (Ehrard et al., 1993b). Por lo
tanto, se cree que las neurotrofinas, particularmente el NGF,
pueden estar al servicio de funciones importantes fuera el sistema
nervioso.
Estas dos líneas de investigación, junto a la
homología estructural de p75^{NGFR} con una serie de receptores
de superficie, incluyendo los receptores de las citoquinas, y los
altos niveles de NGF observados en pacientes con enfermedades
inmunitarias (Dicou et al., 1993;
Bracci-Laudiero et al., 1993; L.B.-L, L.A.,
E.G y G. Rasi, estudio no publicado) dieron lugar a una
investigación acerca de si NGF y/o sus receptores eran expresados
por células del sistema inmunitario. En este punto, se manifiesta
que NGF es sintetizado y liberado, en condiciones basales, por
linfocitos B humanos normales, que también expresan
constitutivamente tanto cadenas de receptores p75^{NGFR} como de
p140^{trk-A}. Además, NGF funciona de manera
autocrina para mantener la viabilidad de las células con el fenotipo
de superficie de las células de memoria B, y su neutralización in
vivo anula una respuesta inmunitaria humoral secundaria.
La presente invención se refiere a un combinado
farmacéutico para mejorar la eficacia de una vacuna en animales
inmunodeficientes. El combinado farmacéutico comprende una vacuna
capaz de estimular la producción, en animales inmunodeficientes, de
anticuerpos frente al agente extraño causante de la enfermedad. El
combinado farmacéutico contiene además una cantidad que mejora la
eficacia de la vacuna de Factor de Crecimiento Nervioso (NGF), que
aumenta la producción y afinidad de dichos anticuerpos en dicho
animal, en respuesta a dicha vacuna. La invención se refiere
también al uso de una vacuna capaz de estimular la producción de
dichos anticuerpos de anticuerpos frente al agente extraño causante
de la enfermedad, en animales inmunodeficientes, y a una cantidad
que mejora la eficacia de la vacuna de Factor de Crecimiento
Nervioso (NGF), que aumenta la producción de dichos anticuerpos en
dicho animal, en respuesta a dicha vacuna, para la preparación de un
combinado farmacéutico para la vacuna, en el que dicha vacuna y
dicho NGF pueden ser administrados por separado o juntos, y en el
que la eficacia de dicha vacuna en dichos animales es mejorada por
dicho NGF. La invención se refiere además al uso de dicho combinado
farmacéutico para la vacunación, en el que dicha vacunación
comprende la administración a un animal inmunodeficiente de una
primera dosis de la vacuna capaz de estimular la producción de
anticuerpos frente al agente extraño causante de la enfermedad en
dichos animales inmunodeficientes; luego, en un plazo comprendido
entre 1 semana y 2 meses tras la administración de dicha primera
dosis, la administración a dicho animal de o 1) una cantidad que
mejora la eficacia de la vacuna de Factor de Crecimiento Nervioso
(NGF) que aumenta la producción de dichos anticuerpos en dicho
animal, en respuesta a dicha vacuna o 2) una dosis de refuerzo de
dicha vacuna junto a una cantidad que mejora la eficacia de la
vacuna de dicho Factor de Crecimiento Nervioso (NGF), a fin de
mejorar la eficacia de dicha vacuna en dicho animal.
La Fig. 1 es un gráfico que muestra la
producción de anticuerpos en ratones adultos tratados conforme a la
invención, en comparación con los de control.
La Fig. 2 es un gráfico que muestra el aumento
de producción de anticuerpos en ratones viejos utilizando la
presente invención, en comparación con los de control.
La Fig. 3 es un gráfico que muestra la
producción de anticuerpos en ratones jóvenes y viejos.
La Fig. 4 es un gráfico que muestra el aumento
de producción de anticuerpos en ratones viejos conforme a la
presente invención, después de tres meses de la vacunación, en
comparación con los de control.
De forma imprevista se ha descubierto que el
Factor de Crecimiento Nervioso no sólo actúa sobre el desarrollo
del sistema nervioso, sino que además tiene un papel importante en
la fisiología del sistema inmunitario. Las células B de memoria,
linfocitos que guardan memoria del encuentro de un organismo con una
estructura química determinada (antígeno), producen y segregan NGF,
se unen a él mediante receptores de superficie celulares y
responden a su mensaje biológico (circuito autocrino de producción y
respuesta de la misma célula), permaneciendo vivas durante muchos
años o incluso a lo largo de toda la vida del organismo, a
diferencia del resto de los linfocitos, que tienen una vida mucho
más corta.
Sin estar ligada a ninguna teoría en particular,
se cree que además de la actividad de NGF para mantener la
supervivencia de las células B de memoria, éste también podría
influir en su generación, actuando positivamente sobre sus
precursores. La célula de memoria podría originarse por la capacidad
de producir NGF, estocásticamente adquirido por un progenitor, que
de otro modo estaría destinado a la muerte por apoptosis (suicidio),
lo que daría lugar al bucle autocrino que mantiene la
diferenciación en la fase de célula de memoria madura y a la
supervivencia de está última. Por lo tanto, la administración de NGF
exógeno a animales da lugar a una mayor cantidad de células de
memoria. Y esta mayor reserva de células de memoria proporciona al
individuo mayor protección y más duradera frente al antígeno. Este
aumento resulta más patente en condiciones de inmunodeficiencia,
por ejemplo con el envejecimiento, en el que muchas respuestas
inmunitarias son reprimidas. Al aumentar la cantidad de células de
memoria, NGF mejora la capacidad del sistema inmunitario para
reconocer el antígeno en concentraciones muy bajas, debido a una
mayor afinidad de los anticuerpos de superficie con las células de
memoria.
La presente invención es aplicable a animales
capaces de desarrollar anticuerpos en una reacción inmunitaria,
tales como mamíferos, entre los que se incluyen seres humanos,
ganado y animales domésticos; así como aves, por ejemplo, aves de
corral.
Al igual que con la edad de las personas, su
respuesta inmunitaria se reduce y la eficacia de la vacunación
disminuye debido a la prevalencia de una respuesta inmunitaria de
los anticuerpos de baja afinidad. Por consiguiente, la invención es
particularmente aplicable para su uso en seres humanos por encima de
45 años, en particular para personas que tienen de 50 años en
adelante.
La invención es también aplicable a pacientes
trasplantados que son inmunodeficientes como consecuencia de la
administración de medicamentos anti-rechazo, tales
como la ciclosporina.
Se piensa que la invención es aplicable a
cualquier vacuna conocida, entre las que se incluyen: la vacuna
contra la gripe, la vacuna contra la Hemophilus influenzae,
la vacuna contra la hepatitis A, la vacuna contra la hepatitis B,
la vacuna contra la hepatitis C, la vacuna contra la tuberculosis,
la vacuna contra el Herpes Zóster, la vacuna contra el
citomegalovirus, la vacuna contra la neumonía neumocócica, la vacuna
contra la meningitis meningocócica, la vacuna contra la difteria, la
vacuna antitetánica, la vacuna antirrábica, la vacuna contra el
Helicobacter Pylori, la vacuna contra la polio y la vacuna
antivariólica.
También se piensa que la invención es aplicable
a cualquier vacuna futura, como por ejemplo la vacuna que puede
desarrollarse contra el virus del SIDA.
Por lo general, las vacunas se administran en
cantidades comprendidas entre 1 x 10^{-9} g. a 1 x 10^{-3} g. y
más habitualmente entre 1 x 10^{-8} g. a 1 x 10^{-8} g.
Las cantidades que mejoran la eficacia de la
vacuna de NGF se administran, por lo general, en una escala que va
de 0,001-100 mg/kg del peso corporal del receptor,
preferiblemente en una cantidad comprendida entre
0,1-10 mg/kg y más preferiblemente entre
0,3-3 mg/kg.
De acuerdo con uno de los aspectos de la
presente invención, el NGF se puede administrar antes y/o
simultáneamente a la administración de la vacuna.
La presente vacuna es particularmente eficaz
cuando se administra junto a una dosis secundaria (de refuerzo) de
la vacuna. Las dosis secundarias o de refuerzo se administran
habitualmente en un plazo comprendido entre 1 semana y 2 meses
después de la primera (primaria) dosis de la vacuna, preferiblemente
entre 10-45 días desde la primera dosis de la
vacuna, más preferiblemente entre 10-30 días desde
la administración de la primera dosis de la vacuna y, según algunas
realizaciones, en un plazo comprendido entre 10-20
días desde la administración de la primera dosis de la vacuna.
De acuerdo con una realización, se administra
una dosis de NGF al receptor varios días antes de la administración
de una dosis secundaria (de refuerzo) de la vacuna, más
preferiblemente 3-4 días antes de la administración
de una dosis secundaria (de refuerzo) de la vacuna. En realizaciones
particularmente preferidas, NGF se administra también
simultáneamente a la dosis secundaria (de refuerzo) de la
vacuna.
La administración de NGF y de la vacuna puede
llevarse a cabo por cualquier vía apropiada, como por ejemplo: por
inyección, infusión u oralmente. En realizaciones particularmente
preferidas, la administración se efectúa por inyección. De acuerdo
con una realización, se puede administrar NGF introduciendo en un
recipiente mioblastos, incluyendo un vector portador de un gen que
codifica NGF. Conforme a dicha realización, NGF es producido por los
mioblastos en el recipiente para mejorar la eficacia de sistema
inmunitario. Cuando la vacuna y NGF son administradas
simultáneamente, se pueden suministrar en forma de una sola
composición que contiene la vacuna y NGF.
Las composiciones que comprenden una vacuna y/o
NGF también pueden contener uno o más portadores farmacéuticamente
aceptables y, opcionalmente, otros componentes terapéuticos. Entre
las formulaciones adecuadas para inyección o infusión están: las
soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas, que
opcionalmente pueden contener antioxidantes, soluciones tampón,
bacteriostatos y solutos que hacen isotónicas las formulaciones con
la sangre del receptor deseado, y suspensiones estériles acuosas y
no acuosas que pueden contener agentes de suspensión y agentes
espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en envases unidosis
y multidosis, por ejemplo, ampollas y viales precintados y se pueden
almacenar congeladas y deshidratadas (liofilizadas), requiriendo
solamente la adición del portador líquido estéril, por ejemplo, agua
para inyección, inmediatamente antes de su uso. El NGF utilizado es
preferiblemente emparejado con el receptor, por ejemplo, el NGF
humano es utilizado preferiblemente con un receptor humano. La
presente invención es aplicable a NGF nativo (es decir, el que se
produce naturalmente); así como a NGF sintético y NGF recombinante
correspondientes a NGF nativo, que tienen la secuencia de
aminoácidos de NGF nativo, secuencias de aminoácidos biológicamente
activas y sustancialmente similares a ellas, o una secuencia
abreviada de las mismas y sus análogas biológicamente activas, con
secuencias sustituidas, eliminadas, alargadas, reemplazadas o de lo
contrario, modificadas, que poseen bioactividad sustancialmente
similar a la de NGF. La invención es ilustrada más a fondo por el
ejemplo 1.
Se inmunizó a dos grupos de diez ratones hembra
C57/BL6 (> 5 meses), en particular con 0,1 mg por ratón de
seroalbúmina
(4-hidroxi-5-yodo-3-nitro-fenil)-acetil-bovina
(NIP-BSA) (Reth et al, 1978) en 0,1 ml de una
solución salina tamponada de fosfatos (PBS) resuspendida en 0,1 ml
de adyuvante de Freund. Después de 21 días, se inyectó a uno de los
grupos de animales 50 \mug por animal de Factor de Crecimiento
Nervioso de ratones (NGF), purificado de las glándulas salivares
submaxilares, como se describe, mientras los animales del otro
grupo fueron tratados con la misma cantidad de NGF purificado,
previamente inactivado por calor (72ºC durante 20 minutos). Después
de otros cuatro días, se les proporcionó a los animales de los dos
grupos el mismo tratamiento con NGF anterior y se les dio una dosis
de refuerzo de 0,1 mg de NIP-BSA en adyuvante de
Freund incompleto. Después de cuatro días, se obtuvieron \approx
0,4 ml de sangre de cada animal por punción del plexo retroorbital y
se neutralizaron los anticuerpos añadiendo BSA a las muestras de
suero. Luego se determinó el título de IgG
NIP-específica mediante ELISA (prueba de
inmunoabsorción enzimática). Se recubrieron las placas con
NIP-BSA (35 \mug/ml en PBS) y después de la
saturación con PBS, que contenía un 1% de PBS y el aclarado con PBS
con 0,05% (v/v) de Tween-20, se incubaron los
pocillos recubiertos durante 1 hora a 37ºC con una dilución en serie
de suero de ratones; como control negativo se utilizó una reserva de
suero de ratones preinmunizados. Se detectó Ig reactiva por la
adición de IgG anti-ratón de cabra de un conjugado
de fosfatasa alcalina. La reacción final fue visualizada al
incubarse con una solución substrato NPP (Sigma) y se anotó la
absorbancia a 405 nm. En la Tabla A de abajo se muestran los
resultados y las figuras 1 y 2.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Las figuras 1 y 2 muestran que el tratamiento
con NGF incrementa de manera espectacular el título de IgG
NIP-específica en ratones viejos, mientras que no
afecta la respuesta en ratones jóvenes.
Se analizó la afinidad del determinante
antigénico (NIP-BSA) de la IgG específica producida
en ratones tratados con NGF y en ratones de control, en una maquina
BIAcore, utilizando NIP-BSA unido a dextrano como
microcircuito sensor. Los resultados de dichos experimentos
muestran que la afinidad IgG con el determinante antigénico es
mucho menor en ratones viejos que en ratones jóvenes, lo que indica
que hay un defecto en la maduración de las células de memoria. Sin
embargo, el tratamiento con NGF en ratones viejos es capaz de
restablecer la producción de IgG de alta afinidad, modificando con
ello no sólo la cantidad sino la calidad de la repuesta inmunitaria
humoral (datos no mostrados).
A fin de determinar si este sencillo programa de
administración de NGF podía mantener un alto título de IgG
específica durante un periodo largo después de la vacunación,
obtuvimos muestras de sangre del mismo grupo de ratones viejos
vacunados, tres meses después de la vacuna de refuerzo con
NIP-BSA. El título sérico de IgG
NIP-específica fue determinado por ELISA. La Fig. 4
muestra que el grupo de animales tratados con NGF mantenía un título
significativo de IgG NIP-específica incluso después
de un largo periodo tras la vacunación de refuerzo.
En términos generales, estos resultados indican
que se puede corregir la cantidad y calidad de respuesta inmunitaria
humoral en ratones viejos mediante una sola administración de NGF
al final de la respuesta primaria, cuando, se sabe, se produce la
maduración de las células B de memoria. El tratamiento con NGF, en
este momento, aumenta la supervivencia de las células B de memoria
que, en ratones viejos, no son capaces de producir por si mismas
citoquina. En contraposición a esto, el tratamiento con NGF es
ineficaz en animales jóvenes normales, cuyos linfocitos de memoria
son capaces de producir cantidades suficientes de NGF, y por tanto,
sobrevivir. Además, los datos hacen pensar que la administración de
NGF podría ser útil en casi todas las condiciones de
inmunodeficiencia primaria y secundaria caracterizadas por una
respuesta inmunitaria humoral disminuida (cáncer, SIDA, inflamación
crónica, etc.).
La invención es sustentada más a fondo por el
ejemplo 2.
Se evaluó la producción de Factor de Crecimiento
Nervioso (NGF) en cultivos de linfocitos T y B y macrófagos
humanos. NGF era sólo constitutivamente producido por células B, que
también expresaban moléculas p140^{trk-A} y
p75^{NGFR} de superficie, de ahí que unieran e internalizaran
eficazmente la citoquina. La neutralización del NGF endógeno causó
la desaparición de la proteína blc-2 y la muerte
apoptótica de los linfocitos en reposo que portan IgG o IgA de
superficie; población que comprende células de memoria, mientras los
linfocitos B virgen del tipo IgM/IgD de superficie no resultaron
afectados. La administración in vivo de anticuerpos
anti-NGF neutralizantes causó una fuerte
disminución del título de IgG NIP-específica en
ratones inmunizados con toxoide tetánico,
nitro-fenol o arseniato y redujo el número de
linfocitos IgG o IgA. Por consiguiente, NGF es un factor de
supervivencia autocrina de los linfocitos B de memoria.
En el curso de una investigación, en varios
estadíos patológicos para evaluar los niveles plasmáticos de NGF,
nos dimos cuenta de que, en pacientes con enfermedades del hígado
crónicas y otras enfermedades autioinmunitarias, había presentes
cantidades particularmente altas de citoquina. Para determinar qué
tipo de célula, en el caso de que la hubiere, entre las células
inmunocompetentes, era responsable de la producción de NGF, se
fraccionaron células de la sangre periférica normales o células
mononucleares de las amígdalas (MNC) en células T, células B y
monocitos. A continuación dichas células fueron cultivadas en
presencia o ausencia de los estímulos pertinentes y posteriormente
se examinaron para ver si existían pruebas bioquímicas de síntesis y
secreción de NGF. Se vio que únicamente los linfocitos B producían
constitutivamente NGF y que la generación por éstos de NGF aumentaba
por estimulación con Staphylococcus Aureus de la cepa Cowan I
(SAC) (a). La inmunotransferencia evidenció una banda más grande en
medio condicionado de linfocitos B con anticuerpos
anti-NGF, pero no con IgG no-inmune
(datos no mostrados). La inmunoprecipitación de los sobrenadantes de
células metabólicamente marcadas B, también mostró una sola banda
grande con M_{r} 13kDa en condiciones de reducción o con M_{r}
26 kDa en condiciones de no-reducción, cuya
presencia fue bloqueada por la inclusión de un exceso de NGF sin
marcar. Los estudios cinéticos de lisatos de células B y
sobrenadantes mostraron que no había una reserva de almacenamiento
de NGF (datos no mostrados). En contraposición a estos resultados
con células B, no se observó producción de NGF con linfocitos T o
monocitos, incluso después de la estimulación. Aunque recientemente
se tiene constancia de que algunos clones celulares T pueden
producir NGF (Ehrard et al., 1993b), parece que dichas
células apenas están representadas en muestras de sangre periférica
normal o de amígdalas (basándose en análisis de poblaciones de
células de al menos veinte donantes diferentes), y por tanto la
atención se centró en la producción de células B.
Se fraccionaron linfocitos B en gradientes de
densidad y se estudiaron las fracciones de alta y baja densidad
como representativos de células en reposo y de células activadas
in vivo, respectivamente. Ambas poblaciones de células B
produjeron una liberación eficaz de NGF (la última \approx 60% más
que la primera, datos no mostrados). A continuación, células B en
reposo fueron estimuladas con anticuerpos frente a la región
constante de la cadena de inmunoglobulina humana más
Interleucina-4 (anti-_{\mu} +
IL-4) o con SAC, dos estímulos activos sobre células
B, el primero activó sólo las células IgM^{+} (s) de superficie, y
el último activó prácticamente todos los linfocitos B (Romagnani
et al., 1982). Quedó patente que la estimulación con
anti-_{\mu} + IL-4 fue ineficaz,
en tanto que la estimulación con SAC mejoró enormemente la síntesis
y secreción de NGF. Los análisis obtenidos por ELISA de
sobrenadantes de cultivos similares, confirmaron que las células
estimuladas con anti-_{\mu} +
IL-4 y las células no estimuladas reducían
gradualmente la producción de NGF, mientras que las células
estimuladas con SAC aumentaban su producción enormemente. En
contraposición a esto, ambos estímulos fueron ineficaces, por lo
que respecta a la inducción de índices de estimulación proliferativa
> 10 y > 20, respectivamente. Estos hallazgos indican que SAC,
y no anti-_{\mu} + IL-4,
desencadena una vía metabólica que conduce a la producción de NGF.
Otra explicación era que los linfocitos que normalmente responden a
anti-_{\mu} + IL-4, es decir, la
mayoría de las células s_{\mu}^{+}\delta^{+}, no alteraban
la producción de NGF (o posiblemente no lo producían) tras una
entrecruzamiento sIg, mientras que los linfocitos que responden a
SAC, población que comprende también células con fenotipo
s\gamma^{+} o s\alpha^{+} (s\gamma^{+}/\alpha^{+}),
sí lo hacían, lo que indica que la citoquina estaba involucrada en
los programas funcionales específicos para este último tipo de
célula.
Al observarse que NGF era producido por
linfocitos B, se quiso determinar si los receptores de NGF estaban
también presentes, haciendo posible un bucle de retroalimentación
autocrina. Con este fin, se estudiaron las células T de las
amígdalas y de la sangre periférica, células B y monocitos para ver
su expresión de las dos moléculas de unión a NGF que están
representadas visualmente por las células del sistema nervioso, la
p140^{trk-A} (trk) y p75^{NGFR}. El análisis de
Western Blot de los lisatos celulares utilizando anticuerpos mostró
que cada uno de los tipos de células estudiadas expresaba la
molécula trk; curiosamente, p75^{NGFR} era producida por células B
solamente.
Además, se analizaron las mismas células por
FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter - separador de células
activado por fluorescencia) tras la coloración con anticuerpos
frente a la cadena p75^{NGFR} y con Tmg 13.1, un anticuerpo
monoclonal recientemente descrito frente a la región de unión a la
citoquina extracelular de la molécula trk (Eager, 1991). De acuerdo
con el enfoque inmunoquímico, solamente se observó doble tinción en
las células B, mientras que las células T y los monocitos eran
solamente teñidos por Tmg 13.1 (datos no mostrados).
La expresión simultánea de ambas cadenas de
receptores por linfocitos B, típica de células nerviosas, indicaba
que dichas células estaban preparadas para responder a toda clase de
señales transmitidas por la citoquina. Por lo tanto se observó a
las células B, con objeto de obtener datos relevantes de la función
de NGF en los linfocitos.
Con el fin de demostrar la unión de la citoquina
y de analizar sus efectos funcionales, linfocitos B de las
amígdalas fueron divididos en células pequeñas y grandes, y se
analizaron para ver su capacidad de unir e internalizar NGF,
utilizado ensayos de unión de equilibrio. Tanto las células B en
reposo como las células B activadas in vivo internalizaron
eficazmente ^{125}I-NGF (datos no mostrados). Se
observaron curvas de saturación de ^{125}I-NGF y
sus transformaciones Scatchard obtenidas con células grandes y en
reposo. Las células grandes expresaron, como cabía esperar, dos
clases de sitios de unión, que evidenciaban K_{d} 30 pM (30.000.
sitios/células) y K_{d} 1 nM (10^{6} sitios de unión/célula),
respectivamente, de acuerdo con datos que se tienen sobre células
nerviosas. Sorprendentemente, cuando se efectuó el mismo análisis en
células pequeñas, células B en reposo, no se observó unión
saturable, ni siquiera al incubarse con concentraciones muy altas
de ^{125}I-NGF (datos no mostrados), a pesar de la
expresión evidente de ambas cadenas de receptores y de la eficaz
internalización de la citoquina. Ésta notable diferencia indicaba la
posibilidad de que el ligando endógeno estuviera realmente ocupando
los sitios de receptores, situación frecuente cuando los circuitos
autocrinos están actuando (Cozzolino et al., 1989; Cozzolino
et al., 1990). Por lo tato, se trataron brevemente (60
segundos a 4ºC) los linfocitos B pequeños en un medio de cultivo
regulado a un pH de 3,0 y luego se lavaron en medio normal antes del
ensayo de unión. En estas condiciones, se detectaron receptores
tanto de alta como de baja afinidad (K_{d} 170 pM y 1 nM,
respectivamente), con 90.000 y 10^{6} sitios/célula de unión,
respectivamente. A fin de reforzar más la hipótesis de que dichos
sitios estaban en realidad ocupados por NGF debido a la existencia
de un bucle autocrino, los eluatos con pH ácido (y los eluatos con
pH neutro, como los de control) fueron desteñidos en
SDS-PAGE (Electroforesis en gel de
poliacril-amida con SDS), emborronados y teñidos
con anticuerpos anti-NGF. Únicamente se detectó
citoquina en los eluatos ácidos. En general, estos resultados
confirmaban dos clases de receptores de NGF completamente
funcionales expresados por linfocitos B.
Los datos anteriores, que señalan que las
células B producían NGF y expresaban receptores de alta y baja
afinidad, respaldaban la hipótesis del circuito autocrino. A fin de
comprender la función que ejerce dicho circuito, se neutralizó NGF
endógeno y se evaluó su impacto sobre las propiedades de los
linfocitos B. Con este fin se emplearon anticuerpos neutralizantes
frente a NGF o, en experimentos seleccionados, oligonucleótidos
antisentido NGF. Primero se analizaron los anticuerpos
anti-NGF en ensayos de incorporación convencionales
^{3}H-timidina utilizando linfocitos B de la
sangre periférica en reposo o de las amígdalas, estimulados con
anti-_{\mu} + IL-4 o con SAC.
Ambos estímulos produjeron una respuesta enérgica en presencia de
anticuerpos pre-inmunes de control; en presencia de
anticuerpos anti-NGF, la respuesta a
anti-_{\mu} + IL-4 no quedó
afectada, mientras que la respuesta a SAC disminuyó en un
20-30% (Tabla 1), lo que en un principio indica que
NGF estaba implicado en la respuesta proliferativa a SAC. Sin
embargo, la adición de NGF recombinante exógeno no incrementó la
incorporación de ^{3}H-timidina (Tabla 1), incluso
en presencia de dosis subóptimas de estimulantes (datos no
mostrados), lo que más bien indicaba que la citoquina no estaba
actuando como factor de crecimiento. En consecuencia, la
proliferación espontánea de células B de baja densidad
pre-activadas in vivo no era modulada por
anticuerpos anti-NGF (datos no mostrados). Estos
experimentos de estimulación con
anti-_{\mu} + IL-4 o con SAC de nuevo indicaban que diferentes poblaciones de células estaban respondiendo a mitógenos, y que podrían estar funcionalmente divididas basándose en la utilización de NGF, además de la producción de NGF. A fin de poder respaldar más este concepto, linfocitos B de las amígdalas en reposo fueron separadas por lavado, células s_{\mu}^{+}\delta^{+} y células s\gamma^{+} y s\alpha^{+} (s\gamma^{+}/\alpha^{+}), que luego fueron estimuladas con SAC o anti-_{\mu} + IL-4. La Tabla 1 muestra que la proliferación de células s_{\mu}^{+}\delta^{+} en respuesta a SAC no resultó afectada por los anticuerpos anti-NGF neutralizantes. Como cabía esperar, la proliferación de células s\gamma^{+}/\alpha^{+} en respuesta a anti-_{\mu} + IL-4 fue muy escasa (datos no mostrados), en tanto que estas células fueron muy sensibles a SAC; cuando se efectuó la estimulación en presencia de anticuerpos anti-NGF, la incorporación de ^{3}H-timidina se redujo en > 80% (p < 0,0001). Este hallazgo, junto a los resultados de los experimentos sobre la producción de NGF, daban a entender que la citoquina era crucial para las células s\gamma^{+}/\alpha^{+} y, al parecer, prescindible para las células s_{\mu}^{+}\delta^{+}.
anti-_{\mu} + IL-4 o con SAC de nuevo indicaban que diferentes poblaciones de células estaban respondiendo a mitógenos, y que podrían estar funcionalmente divididas basándose en la utilización de NGF, además de la producción de NGF. A fin de poder respaldar más este concepto, linfocitos B de las amígdalas en reposo fueron separadas por lavado, células s_{\mu}^{+}\delta^{+} y células s\gamma^{+} y s\alpha^{+} (s\gamma^{+}/\alpha^{+}), que luego fueron estimuladas con SAC o anti-_{\mu} + IL-4. La Tabla 1 muestra que la proliferación de células s_{\mu}^{+}\delta^{+} en respuesta a SAC no resultó afectada por los anticuerpos anti-NGF neutralizantes. Como cabía esperar, la proliferación de células s\gamma^{+}/\alpha^{+} en respuesta a anti-_{\mu} + IL-4 fue muy escasa (datos no mostrados), en tanto que estas células fueron muy sensibles a SAC; cuando se efectuó la estimulación en presencia de anticuerpos anti-NGF, la incorporación de ^{3}H-timidina se redujo en > 80% (p < 0,0001). Este hallazgo, junto a los resultados de los experimentos sobre la producción de NGF, daban a entender que la citoquina era crucial para las células s\gamma^{+}/\alpha^{+} y, al parecer, prescindible para las células s_{\mu}^{+}\delta^{+}.
Dichos datos llevaron a una exploración ulterior
de los efectos de NGF sobre las células
s_{\mu}^{+}\delta^{+} y células
s\gamma^{+}/\alpha^{+}. Teniendo en cuenta que NGF no
incrementó el crecimiento in vitro de células B (Tabla 1) y
en vista de las propiedades que NGF tiene para mantener la
supervivencia de las células neuronales (en su ausencia dichas
células sufren apoptosis), se examinó si NGF podría aumentar la
supervivencia de las células s_{\mu}^{+}\delta^{+} o de las
células s\gamma^{+}/\alpha^{+}. Por lo tanto, las
poblaciones anteriores, purificadas de las amígdalas, fueron
cultivadas en presencia de anticuerpos anti-NGF o
de oligonucleótidos antisentido NGF durante varios intervalos de
tiempo, y se registró el ratio de ADN fragmentado/intacto, como
medida del porcentaje de células que sufrían apoptosis. Cuando se
analizaron las células s_{\mu}^{+}\delta^{+}, se vio que la
proporción de células apoptóticas era igual, tanto las que habían
sido tratadas con reactivos anti-NGF como las que
habían sido tratadas con IgG preinmnune de control (u
oligonucleótido sentido). En contraposición a esto, los cultivos de
células s\gamma^{+}/\alpha^{+} tratadas con anticuerpos
anti-NGF u oligonucleótidos contenían > 60% de
células apoptóticas en 60 horas, mientras que los cultivos de
control tenían < 20% de células apoptóticas (p < 0,0001);
curiosamente, la cinética de la apoptosis era mucho más lenta que la
de las células s_{\mu}^{+}\delta^{+}, lo que hace pensar que
hay una diferencia importante entre el potencial de vida de estas
últimas células y el de las células s\gamma^{+}/\alpha^{+}
in vitro.
En general estos experimentos demostraron que
NGF endógeno era un factor de supervivencia autocrina para células
s\gamma^{+}/\alpha^{+}, ya que su neutralización
desencadenaba su muerte apoptótica, pero no para células
s_{\mu}^{+}\delta^{+}; lo que indica que sólo las células
anteriores podrían elaborar citoquina. Para comprobar este
experimento, se analizó la producción de NGF por poblaciones
purificadas mediante ELISA. Quedó patente que las células
s\gamma^{+}/\alpha^{+} producían al menos ocho veces más NGF
que las células s_{\mu}^{+}\delta^{+} (células 409 19
pg/10^{7} frente acélulas 51 4 pg/10^{7}; n=9).
Por consiguiente, para determinar si la
diferencia funcional entre los subconjuntos era debida a la
utilización, más que a la producción de NGF, se investigó una causa
determinante de la vía que lleva a la apoptosis: la renovación de la
proteína blc-2 (Korsmeyer, 1992). Para ello, se
cultivaron poblaciones de células s\gamma^{+}/\alpha^{+} y
s_{\mu}^{+}\delta^{+} en reposo purificadas, con anticuerpos
anti-NGF y anticuerpos de control durante 18 horas
y luego se disolvieron por medio de lisinas a fin de analizar el
contendido intracelular de la proteína bcl-2. La
neutralización del NGF endógeno provocó la desaparición completa de
la proteína bcl-2 de las células
s\gamma^{+}/\alpha^{+}, pero no afectó al contenido de
proteína bcl-2 en las células
s_{\mu}^{+}\delta^{+}, lo que revela una gran diferencia
entre las subpoblaciones en lo que respecta a la utilización de
NGF.
Dado que el fenotipo
s_{\mu}^{+}\delta^{+} identifica células B vírgenes, en
tanto que las células con fenotipo s\gamma^{+}/\alpha^{+}
comprenden los linfocitos que han sufrido el proceso de conmutación
de clase en la región constante Ig, incluyendo linfocitos B de
memoria (Kishimoto e Hirano, 1989; Sprent, 1994), se planteó la
hipótesis de que el NGF autocrino serviría de factor de
supervivencia de las células B de memoria y se decidió comprobar
este concepto utilizando un enfoque in vivo que analizara los
sistemas hapteno-específicos bien definidos:
nitro-fenol-BSA (NP) o
arsonato-KLH (Ars), o el toxoide tetánico del
sistema antigénico (en mosaico) complejo (TT). En primer lugar se
demostró una identidad sustancial entre células B humanas y murinas,
en lo que respecta a la síntesis de NGF (las células murinas
s\gamma^{+}/\alpha^{+} y s_{\mu}^{+}\delta^{+}
producían constitutivamente 234 t 21 y 28 \pm 3 pg/10^{7}
células, respectivamente), la expresión del receptor NGF [las
células sIg^{+} murinas no fraccionadas expresaban sitios de unión
por célula de alta afinidad de \approx 4.800 (Kd \approx
135 pM) y de baja afinidad de \approx 10^{6} (Kd
\approx 1,1 nM] y la importancia funcional de la citoquina en la
supervivencia celular in vitro (las células
s\gamma^{+}/\alpha^{+} presentaban una fragmentación del ADN
= 70% al exponerse a los anticuerpos anti-NGF
neutralizantes). Así pues, se inmunizó a grupos de veinte ratones
BALB/c o C57BL/6 con el pertinente antígeno, y después de 40 días,
se dio una sola dosis de IgG anti-NGF neutralizante
a un grupo de diez animales, mientras se inyectó IgG
no-inmune a diez ratones de control. Tras otras 48
horas, se dio a todos los animales una dosis de recuerdo del
antígeno respectivo y cuatro días más tarde se sacrificó a todos
los animales y se determinaron las concentraciones de IgM
antígeno-específica e IgG por ELISA. Los animales
que habían recibido anticuerpos anti-NGF mostraron
niveles de IgG específica frente al inmunógeno notablemente
inferiores que los de control (p < 0,001).
Por contraste, no se observó una diferencia en
la concentración de IgM antígeno-específica, lo que
indicaba que la respuesta a los anticuerpos generada por los recién
formados, los linfocitos B vírgenes que se encuentran con el
inmunógeno (la segunda respuesta "primaria"), no quedaba
afectada. Para reforzar más aún esta última conclusión, se trató a
dos grupos más de ratones, primero con IgG anti-NGF
o con IgG de control, luego (tras 48 horas) se les inmunizó con TT y
después de una semana, se les sacrificó para determinar su nivel
plasmático de IgM TT-específica, que resultó no ser
estadísticamente diferente en las dos poblaciones (0,275 \pm
0,032 Abs 405 Unidades Arbitrarias en animales tratados frente a
0,284 \pm 0,041 en animales de control) (datos no mostrados).
Los hallazgos anteriores indicaban, de acuerdo
con los datos in vitro, que los anticuerpos
anti-NGF eran capaces de inducir la muerte celular
de la mayoría de las células B de memoria isotópicamente conmutadas,
reprimiendo con ello una respuesta humoral secundaria. Para poder
obtener pruebas directas de este experimento, se trató a dos grupos
de ratones adultos normales con IgG anti-NGF o con
IgG de control, después de tres días células del bazo fueron
aisladas y se determinaron las proporciones de subpoblaciones de
células B por citofluorimetría. El porcentaje de células
s\gamma^{+}/\alpha^{+} era notablemente inferior en bazos de
ratones tratados que en ratones de control, en tanto que no se
observó una diferencia significativa entre los dos grupos en el
porcentaje de células s_{\mu}^{+}\delta^{+}. En general,
estos experimentos indicaban que el NGF también desempeña un papel
fundamental en el mantenimiento de las células B de
memoria.
memoria.
El resultado de los experimentos anteriores de
neutralización NGF in vivo era compatible con la hipótesis
de que la citoquina es un factor de supervivencia autocrino de los
linfocitos B de memoria. Sin embargo, se habrían observado los
mismos resultados si NGF estuviera implicado en la maquinaria que
gobierna la conmutación de clase IgMIgG, con el ligando CD40
(Aruffo et al., 1993). No obstante, si así fuera, se
observaría una proporción mayor de células productoras de IgM,
junto a una cantidad inferior de células productoras de IgG o IgA,
siempre que la población policlonal de linfocitos es inducida para
diferenciarse in vitro en presencia de anticuerpos
anti-NGF. Así pues, se cultivaron células
monoclonales de sangre periférica durante diez días con mitógeno de
fitolaca, para estimular la diferenciación policlonal (Kishimoto e
Hirano, 1989) con IgG anti-NGF o IgG
no-inmune, como control negativo, o con pentámero CD
40 soluble, molécula de ingeniería genética que previene la
interacción CD40-gp39 (Fanslow et al., 1992),
como control positivo. La medición por ELISA de Ig reveló que los
anticuerpos anti-NGF produjeron una clara reducción
del nivel de IgG y IgA en los cultivos estimulados por mitógenos de
fitolaca, pero también niveles de IgM un 20% inferiores a los de los
cultivos de control (Tabla 2). Por contraste, el pentámero CD40
provocó una caída brusca de la secreción de IgG e IgA en comparación
con la de control, y un incremento en el índice de secreción de IgM
(tabla 2).
Estos experimentos indicaban una clara
diferencia en los mecanismos con más probabilidad de ser
responsables de los cambios observados. En realidad, el pentámero
CD40 soluble provocó un bloqueo en el fenómeno de conmutación de
clase Ig, que indujo a una "acumulación de células" en el
compartimiento pre-conmutación (es decir, s^{+});
por contraste, los anticuerpos anti-NGF provocaron
únicamente una brusca reducción de células productoras de IgG y
IgA, prueba de la desaparición (muerte) de los respectivos
precursores, inducidos por anticuerpos anti-NGF.
Estos datos son compatibles con los resultados
de los anteriores experimentos in vivo, según los cuales la
reducción de s^{+} o decélulas s^{+} no fue acompañada de un
aumento de células s^{+}. En general, estos hallazgos indicaban
firmemente que NGF no estaba actuando como un "factor de
conmutación" en los linfocitos B humanos o murinos.
La capacidad de discriminar con precisión entre
múltiples estructuras químicas y de tener memoria de estos
encuentros, especificidad y memoria, son distintivos del sistema
inmune. Mientras las bases moleculares de la especificad han sido,
en su mayor parte, definidas a través de la caracterización
extensiva de la bioquímica y genética de los receptores de
antígenos definidos por los linfocitos T y B, el conocimiento de la
memoria inmunitaria es todavía, en buena parte, fenomenológico. En
particular, queda por definir si una única célula de memoria, como
la mayoría de los linfocitos, tiene una duración de vida definida y
limitada en condiciones quiescentes, o de lo contrario es, una
célula de larga vida que dura años, posiblemente toda la vida. Se
han propuesto varias hipótesis, y la que prevalece es que la larga
persistencia del antígeno dentro de los órganos linfoides tiene
como resultado una proliferación continua y lenta de células
inmunitarias que mantienen la memoria inmunológica (Gray, 1993).
Sin embargo, no es fácil imaginar cómo los antígenos pueden
permanecer no modificados durante años, especialmente si son
proteináceos (Sprent, 1994). En realidad, existen pruebas de que
las células no cíclicas pueden mantener la memoria inmunológica
durante largos periodos de tiempo. (Schittek y Rajewsky, 1990)
aunque todavía se desconocen los mecanismos moleculares que permiten
la supervivencia.
Las pruebas presentes indican que los linfocitos
B de memoria, cuando se generan, pueden sufrir el mismo destino que
las células "perennes" Bizzozzero, cuyo prototipo son las
neuronas, debido a su capacidad de producir un factor de
supervivencia autocrina, NGF.
El principal razonamiento que indica que la
citoquina actúa más como un factor de supervivencia que como un
factor de crecimiento, se basa en la observación de que la
activación del receptor NGF de prevención de células B en reposo
purificadas s\gamma^{+}/\alpha^{+} por anticuerpos
anti-NGF neutralizantes provocó la muerte celular
masiva por apoptosis. Además, cuando células B no fraccionadas en
reposo fueron estimuladas con
anti-_{\mu}anticuerpos + IL-4, que
provocaron una fuerte respuesta proliferativa, no incrementaron el
índice de producción NGF y su proliferación no fue aumentada por el
NGF recombinante exógeno, ni tampoco quedó afectada por anticuerpos
anti-NGF. Además, cuando se utilizó SAC para
estimular las mismas células, se segregaron mayores cantidades de
NGF, pero la adición de más citoquina exógena no potenció la
incorporación de ^{3}H-timidina, aunque se
aplicaran dosis de estimulante subóptimas. En consecuencia, las
células pre-activadas in vivo de baja
densidad expresaron más NGF, pero las dosis de saturación de
anticuerpos anti-NGF no anularon la proliferación
de células B, como cabía esperar si la citoquina era un factor de
crecimiento. Puestas juntas, estas consideraciones más bien
apuntaban a NGF como factor de supervivencia.
Podría parecer que esta conclusión contraviene
los informes que en años anteriores apuntaban a una actividad de
estimulación del crecimiento intrínseca de NGF sobre los linfocitos
(Otten et al., 1989; Brodie y Gelfand, 1992). No obstante,
dichos informes pueden ser reinterpretados si se tiene en cuenta
que, de acuerdo con estos hallazgos, la adición de NGF exógeno puede
reducir el número de algunas células que espontáneamente mueren
in vitro [en particular las que originan células de secreción
de IgA y IgG4 (Kimata et al., 1991)] debido a las condiciones
de baja densidad, que al final conducen a una mayor proliferación
basal en cultivo. Además, la distinción entre factor de crecimiento
y de supervivencia puede ser puramente nominativa, como indicaba la
observación de que el Factor
IL-3 y de las Células Madre sostiene la supervivencia de los progenitores linfo-hematopoyéticos no cíclicos inactivos en cultivos líquidos (Katayama et al., 1993).
IL-3 y de las Células Madre sostiene la supervivencia de los progenitores linfo-hematopoyéticos no cíclicos inactivos en cultivos líquidos (Katayama et al., 1993).
El descubrimiento de la producción espontánea de
NGF por células B da mayor apoyo a los indicios del papel
"flogístico" de NGF (Aloe et al., 1994), que
probablemente contribuye de manera paracrina a la función de células
inflamatorias, tales como los macrófagos, que están equipados con la
maquinaria receptora necesaria para responder a la citoquina (Ehrhad
et al., 1993ª), pero que no son capaces de producirla
(Santambrogio et al., 1994). Consideraciones similares pueden
aplicarse a los linfocitos B. En este trabajo, no se ha tratado de
caracterizar, de manera más precisa, desde el punto de vista
fenotípico o funcional, a las (sub)poblaciones de células T
que expresan receptores de NGF; de ahí que respondan a él. Sin
embargo, el NGF derivado de células B podría estar al servicio de
funciones importantes, en el complicado caso de presentación de
antígeno de células B en linfocitos T, particularmente cuando tenga
que darse una respuesta inmunitaria secundaria.
De hecho, las células B de memoria sIgG^{+}
expresan receptores de máxima afinidad para el antígeno (Siekevitz
et al., 1987; MacLennan y Gray, 1986) y lo por tanto están en
una situación privilegiada en la competición para la unión, que
sucede cuando hay cantidades limitadas de antígeno. Su capacidad de
liberar NGF podría ser esencial para la activación adecuada de
células T de memoria o de células T naive.
Un punto importante surgido de esta
investigación es la expresión simultánea de ambas cadenas conocidas
por unirse a NGF -la molécula trk y la molécula p75^{NGRF}-, por
linfocitos B, característica típicamente presentada por las células
neuronales. Aunque NGF fue la primera citoquina tipificada, todavía
se conoce relativamente poco sobre las vías metabólicas
desencadenadas por su interacción con cada una de las cadenas de
receptores, y tampoco está claro si ambas cadenas colaboran en la
unión de una sola molécula de ligando, ya que se tiene constancia de
resultados contradictorios sobre esta cuestión (Jing et al.,
1992; Benedetti et al., 1993; Huber y Chao, 1995) No
obstante, se ha demostrado que la expresión de p75^{NGRF} inducía
la muerte celular neuronal constitutivamente cuando la proteína no
se había unido, en tanto que su unión por NGF o por anticuerpos
monoclonales inhibía la muerte celular (Rabizadeh et al.,
1993), lo que indica, per se, que es capaz de transmitir una
señal biológica, lo que concuerda con la homología estructural entre
p75^{NGFR} y una serie de cadenas de receptores, entre las que se
incluyen TNFRI, TNFRII, Fas/Apo y CD40, todas involucradas en la
inducción o prevención de la apoptosis en las células diana
(revisado por Raffioni et al., 1993). Estos últimos datos
están totalmente de acuerdo con el hallazgo de que la neutralización
del NGF autocrino, pero no el tratamiento con
anti-p75^{NGFR}, determina la muerte de la célula
B (manuscrito en preparación), lo que apunta a esta cadena de
receptores como mediadora de señales que actúan sobre la línea
divisoria supervivencia/muerte. Curiosamente, a pesar de la
homología estructural entre p75^{NGFR} y CD40, es evidente que NGF
no participa en el proceso de conmutación de clase Ig.
En algunos tipos de células, como queratinocitos
o melanocitos (Yaar et al., 1994; Di Marco et al.,
1993) trk media señales que potencialmente estimulan la
proliferación celular, a diferencia de lo que ocurre en células
neuronales, por medio de las cuales NGF previene la apoposis tras el
enlace de trk, posiblemente por medio de la activación
fosfatidil-inositol-3-quinasa
(Yao y Cooper, 1995). Esta discrepancia podría solucionarse por
medio de la existencia de otra(s) cadena(s), que
pueden participar en la formación de un complejo receptor
multi-cadena con trk y/o p75^{NGFR}, como
normalmente ocurre en la mayoría de los receptores de la citoquina.
Esta última hipótesis explicaría también, la pequeña pero
significativa diferencia observada en las afinidades de unión NGF
mostradas por poblaciones de células B grandes y en reposo
(\approx 30 pM vs \approx 170 pM, respectivamente).
La separación de linfocitos B en reposo normales
basándose en la expresión isotipo Ig de superficie identifica dos
sub-poblaciones funcionalmente diferentes, o sea,
las células de memoria s_{\mu}^{+}\delta^{+} vírgenes y las
células de memoria s\gamma^{+}/\alpha^{+} (Kishimoto e
Hirino, 1989). Utilizamos este enfoque para comprender la
naturaleza del papel del circuito autocrino NGF y, para ello,
observamos varias características, que nos llevaron a la idea de que
la citoquina es un factor de supervivencia endógeno para células de
memoria, tanto en humanos como en ratones. En primer lugar, mientras
ambas células, vírgenes y de memoria, expresaban básicamente los
mismos niveles de receptores de NGF, las últimas producían al menos
ocho veces más proteína NGF que las primeras. En segundo lugar, el
tratamiento con anticuerpos anti-NGF neutralizantes
inducía la desaparición de la proteína bcl-2 y la
sistemática fragmentación masiva de ADN en células
s\gamma^{+}/\alpha^{+}, mientras era inapreciable para
células s_{\mu}^{+}\delta^{+}. En tercer lugar, la
administración in vivo de anticuerpos
anti-NGF anulaba las respuestas inmunitarias al
antígeno-específico secundarias, pero no afectaba a
la respuesta IgG primaria. Por último, una única inyección de
anticuerpos anti-NGF provocó una notable reducción
en el porcentaje de linfocitos B isotópicamente conmutados, entre
los que se encuentran las células de memoria. Por otro lado, estos
hallazgos plantean al menos dos cuestiones importantes, a saber, la
fase de maduración en la que tiene lugar la expresión genética de
NGF y las relaciones entre NGF y blc-2.
La baja pero apreciable producción de NGF por
células s_{\mu}^{+}\delta^{+} indicaría un comienzo
relativamente prematuro durante la ontogenia de células B, cuya
importancia funcional será más tarde dilucidada. Sin embargo,
basándose en consideraciones cuantitativas sobre la magnitud de las
diferentes subpoblaciones de células B, se tienen indicios de que
las células s_{\mu}^{+} también comprenden linfocitos de
memoria, capaces de originar células que segregan Ig distinta a IgM
(Gray, 1993).
\newpage
De ser así, el NGF derivado de células
s_{\mu}^{+} observado, podría ser producido por estas últimas
células y, en este caso, la expresión genética de NGF podría estar
vinculada y posiblemente también regulada por los mismos mecanismos
moleculares que operan en la conmutación de clase Ig.
Actualmente se conoce poco sobre las vías
moleculares que relacionan las cadenas de receptores de NGF con
blc-2, proteína que fundamentalmente regula la
supervivencia de las neuronas y de las células linfoides,
especialmente de las células B de memoria (Batistatou et al.,
1993; Hawkins y Vaux, 1994; Núñez et al., 1991), que de hecho
desparece de las células sIgG^{+} o sIgA^{+} en reposo tratadas
con anticuerpos anti-NGF neutralizantes. Existen
pruebas recientes de que las especies reactivas de oxígeno y, más
comúnmente, las alteraciones en el potencial de
reducción-oxidación celular pueden estar implicados
(Greenlund et al., 1995). Con relación a esto, se ha
demostrado que la baja producción de óxido nítrico en linfocitos B
infectados con EBV, que expresan constitutivamente óxido nítrico
sinteasa, previene la apoptosis (Mannick et al. 1994),
probablemente actuando a múltiples niveles sobre las vías sensibles
al tiol que también regulan el metabolismo de blc-2,
proclive al potencial de reducción-oxidación
intracelular y que participa en su mantenimiento. (Hockenbery et
al., 1993). Curiosamente, Mosialos et al., (1995)
demostró hace poco que existen relaciones funcionales entre las
proteínas que transducen señales desde la familia de receptores
TNF/Fas/NGF; ya que TNF induce alteraciones en el equilibrio
reducción-oxidación celular (Ishii et al.,
1992); dichas moléculas podrían también participar en la respuesta
adaptiva provocada por NGF.
Actualmente estamos investigando acerca de esta
última hipótesis en células de memoria B después de su
neutralización NGF.
Una prueba sorprendente que merece ser tenida en
cuenta es que, al menos, en células linfoides, tanto la apoptosis
como la supervivencia celular son reguladas por circuitos
autocrinos, la primera implica Fas/Apo-1 y su
ligando (Brunner et al., 1995; Dhein et al., 1995; Ju
et al., 1995), la última implica NGF, según nuestros datos.
Dicha configuración asegura que todos los requisitos moleculares
necesarios para enviar la célula a cada vía están inmediatamente
disponibles y ayuda a entender cómo los órganos linfáticos son
sitios en los que se producen cambios funcionales complejos de
manera ordenada. La prueba de que el circuito autocrino es público-
es decir, que implica la secreción de ligandos y la unión a
receptores extracelulares, en lugar de ser privado o intracrino-
indica firmemente que la función de ambos sistemas puede estar
modulada por antagonistas del receptor o receptores solubles, que
originan una compleja red de controles "sociales" sobre el
destino de un solo linfocito. Curiosamente, esta complejidad puede
producir varias oportunidades de interferir en dicha dinámica, si se
utilizan enfoques farmacológicos.
Se separaron linfocitos T humanos de células
mononucleares de la sangre periférica o de células de las amígdalas
por formación de roseta E. Se aislaron monocitos por adherencia en
placas de plástico de Petri. Luego se purificaron los linfocitos B
de la población no-T, utilizando perlas magnéticas
recubiertas de CD-19. Se aislaron linfocitos B
murinos, extraídos de monocitos, como se describe arriba, de los
bazos en dos series de selección negativa utilizando un anticuerpo
monoclonal anti-CD3\varepsilon (Boheringer
Mannheim, Milán, Italia). La pureza de la población fue de más del
95%, según el cálculo por citometría de flujo. Luego se fraccionaron
células B humanas o murinas en células de reposo (de alta densidad)
y en células activadas (de baja densidad) por gradientes de densidad
Percoll. La proporción de células sIgM^{+}, sIgG^{+} y
sIgA^{+} en células B en reposo de las amígdalas fue, cómo de
costumbre, del 65%, 25% y 10% respectivamente, según el cálculo por
citometría de flujo.
Para los ensayos de proliferación, se cultivaron
células B en placas de 96 pocillos a una concentración de
10^{6}/ml en medio RPMI 1640 (GIBCO, Milán), se complementaron con
10% v/v de suero fetal bovino (FCS, Hyclone, Logan, UT) durante 75
horas en aire humedecido con 5% de CO_{2}. Se utilizó
Staphylococcus Aureus inactivado por calor de la cepa Cowan I
(SAC, Boheringer Mannheim) en la dilución final en una proporción
1:10.000. Se utilizó rIL-4 humano (R&D,
Minneapolis, MN) en una proporción de 100 U/ml, y cadena anti humana
de conejo en una proporción de 1 g/ml, NGF (Boheringer Mannheim) en
una proporción de 100 ng/ml, anticuerpos anti-NGF de
cabra neutralizantes [R&D, ND_{50} = 10 \mug/ml en el ensayo
de proliferación celular de neuroblastomas IMR-32
(Janet et al., 1995) en respuesta a 100 ng/ml de NGF] o IgG
de cabra pre-inmune en una proporción de 10
\mug/ml. Las células fueron pulsadas con 0,5 Ci de
^{3}H-timidina en las últimas 12 horas del cultivo
y se contaron en un contador de escintilación.
Para la producción de inmunoglobina, se
cultivaron células mononucleares de sangre periférica humana durante
12 horas, en presencia o ausencia de mitógeno de fitolaca (GIBCO),
(10 g/ml), anticuerpos anti-NGF (10 g/ml), IgG de
cabra pre-inmune (10 g/ml), sobrenadante
CD-40 o CD-4 (en una dilución final
1:10). Se recogieron los sobrenadantes y se analizaron para ver la
producción de IgG, IgA, IgM por ELISA.
Para el análisis de la producción de NGF, se
cultivaron células (2 x 10^{7}) a 10^{7}/ml en medio
RPMI-1640 sin suero, se complementaron con 10% (v/v)
de Nutridoma (Sigma), varias veces en presencia o ausencia de SAC
(dilución final 1:10.000), fitohemoaglutinina
(PHA-P, 1 g/ml, GIBCO), lipopolisacárido (LPS, 10
g/ml, Sigma) y sobrenadantes ensayados por ELISA.
Se aislaron subpoblaciones de células B por
lavado utilizando placas de plástico de Petri recubiertas con IgM
anti-humana de conejo y IgD
anti-humana de conejo (referidos como
s\mu^{+}\delta^{+}) o IgG anti-humana de
conejo más IgA anti-humana de conejo (referidos como
s^{+}/^{+}) o IgM anti-ratón de cabra y IgD o
IgD e IgA, preparados como describe (Wysocki et al., 1978).
La pureza de la población asilada fue siempre > 90%, según el
cálculo de citrometría de flujo utilizando mAbs específico. A fin de
descartar la interferencia en el proceso de activación tras la
activación del receptor sIg, se repitieron todos los experimentos
utilizando poblaciones no-adherentes recíprocas (por
ejemplo, células s^{-}, en su mayor parte células s^{+}/^{+}),
recuperadas después de efectuar tres series de adherencia de las
placas recubiertas de Ig.
Se diluyeron subpoblaciones de Células B humanas
y murinas, cultivadas a 5 x 10^{6}/ml con 10 \mug/ml de IgG
anti-NGF o IgG pre-inmune, o con 20
\muM de oligonucleótidos antisentido 18-mer u
oligonucleótidos sentido complementarios a los nucleótidos
54-72 de la región que codifica NGF (Primm, Milán,
Italia), con 5 mM Tris, 20 mM EDTA y 0,5% (v/v) Tritón
X-100, a un pH de 8,0 en una proporción de 1:1,5; y
se dejaron disolver por medio de lisinas durante 15 minutos en hielo
antes de centrifugarse durante 20 minutos a 27.000 x g, para separar
la cromatina intacta (gránulo) de los fragmentos de ADN. Se
volvieron a suspender los gránulos en 5 ml de una solución tampón
que contenía 10 mM de Tris y 1 mM de EDTA, a un pH de 8,0 y se
analizaron las muestras de gránulos y sobrenadantes para ver su
contenido de ADN, utilizando un reactivo de
difenil-amina (1,5% de difenil-amina
en ácido acético más 10% de acetaldehído) durante 16 horas a 30ºC
(Burton, 1956). Se midió la densidad óptica de cada muestra a 600
nm. Se calculó el porcentaje de fragmentación de ADN según McConkey
et al. (1989). Y se evaluó la viabilidad celular por
exclusión del azul de tripano.
Para el análisis de los receptores NGF de
superficie, se trataron con ácido linfocitos B de las amígdalas en
reposo humanas o linfocitos esplénicos murinos en medio
RPMI-1640 estabilizado a un pH de 3,0 durante 1
minuto en hielo y se lavaron con PBS. Luego se incubaron los
linfocitos B en reposo tratados con ácido y los linfocitos B grandes
activados in vivo a 10^{6}/ml con diferentes
concentraciones de ^{125}l-NGF (Amersham, Milán,
actividad específica 50 Ci/g), en presencia o ausencia de exceso de
rNGF humano no marcado durante 2 horas a 4ºC. Se lavaron las células
y se procedió a contar la radioactividad ligada en un
contador-a\gamma. Se calculó la unión específica
de cada punto experimental y se analizaron los datos mediante un
programa científico (Fig. P, Biosoft, Cambridge, UK). Para la
internalización de radioligandos, se cultivaron células, tal y como
se describe arriba, con 0,5 nM de ^{125}l-NGF en
presencia o ausencia de NGF no marcado, se lavaron y cultivaron a
37ºC durante 2 horas, luego se trataron con una solución tamponada
de glicina (pH 2,8) y se disolvieron por medio de lisinas. Se
determinó la radioactividad del (eluato ácido) ligado a la membrana
y de la célula asociada en un contador-a\gamma. El
baño con pH neutro y el eluato con pH ácido de las células B en
reposo 10^{8} fue concentrado con TCA, emborronado sobre
nitrocelulosa e inmunoteñido con IgG anti-NGF o con
IgG pre-inmune para detectar el ligando endógeno
ligado al receptor.
Para el análisis de Western Blot, se
precipitaron con TCA sobrenadantes o lisatos NP-40
(0,25% en PBS) de células 2 x 10^{7}, se lavaron con etanol y
diluyeron en una solución tamponada Laemmli
2-mercapto-etanol en una proporción
1:1. Se corrieron las muestras en SDS-PAGE, se
emborronaron en filtros de nitrocelulosa y se inmunotiñeron con
anticuerpos apropiados [anti-NGF de cabra,
anti-trk de conejo (Genzyme, Boston, MA),
anti-p75^{NGFR} de ratón (Boheringer Mannheim),
anti-bcl-2 de ratón (Santa Cruz
Technology, Milán)] o con Ig pre-inmune. Los
complejos antígeno-anticuerpo se visualizaron
utilizando anticuerpos secundarios y el sistema de detección ELC,
como recomienda el fabricante (Amersham). Para la marcación e
inmunoprecipitación endógenas, se lavaron las células tres veces con
RPMI-1640 sin cisteína (GIBCO) y se cultivaron a
10^{7}/ml en el mismo medio complementado con 5% de FCS dializado
y 200 Ci de ^{35}S-cisteína (Amersham, actividad
específica 800 Ci/nM) durante 4 horas a 37ºC en 5% de CO_{2}. Se
eliminaron los sobrenadantes, se lavaron las células en PBS frío y
se disolvieron por medio de lisinas en 0,25% de
NP-40 más 1 mM de PMSF. Los sobrenadantes y lisatos
celulares fueron inmunoprecipitados como describe (Cozzolino et
al., 1990), en presencia o ausencia de 100 \mug/ml de rNGF
humano. Se lavaron los inmunoprecipitados, eluyeron en una solución
tamponada Laemmli SDS con o sin
2-mercapto-etanol, y se corrieron
sobre placas con un 15% de SDS-PAGE, que fueron
tratadas con Amplify (Amersham), secadas y expuestas a Hyper film MP
(Amersham) a -70ºC.
Se preparó Ars-KLH diazotando
ácido
p-amino-fenil-arsónico
y uniéndolo a hemocianina de lapa Keyhole (KLH, Calbiochem)
en una proporción de 40 mg de hapteno por 1 g. de proteína
(Nisonoff, 1967). Se unió
(4-hidroxi-5-yodo-3-nitro-fenil)-acetilo
(NIP, generosa donación del Dr. Schilovich, HSR, Milán) a la
seroalbúmina bovina (NIP-BSA) según Reth et
al., 1978. Se inyectaron 0,1 ml de una solución TT [15\mug/ml
(Anatetal, Biocine-Sclavo, Siena, Italia)] a dos
grupos de veinte ratones hembra Balb/c, de 6 años en el cuello, o,
en particular, Ars-KLH (0,1mg), y se inmunizó a un
grupo de veinte ratones C57BL/6, en particular, con 0,1 mg. de
NIP/BSA. Después de 40 días de la pre-inyección, se
trató a un grupo de diez ratones con IgG anti-NGF de
cabra (500 g/ratón) a los otros con IgG de cabra
pre-inmune (500 g/ratón) y 48 horas más tarde se
inyectó una vacuna de refuerzo con la misma dosis del antígeno
pertinente. Cuatro días después de la segunda vacunación, se sacó
sangre del plexo retroorbital venoso. Se utilizó a otros grupos de
10 ratones inmunizados con TT, NIP-BSA o
Ars-KLH para la medición de la IgG
antígeno-específica inmediatamente antes de la
inyección de refuerzo.
Para el análisis FACS de esplenocitos, se
inyectaron (0,5 mg/ratón) de anticuerpos anti-NGF o
IgG de cabra a grupos de 10 ratones BALB-c adultos
en 72 horas. Después de otras 72 horas, se sacrificó a los ratones y
se obtuvieron esplenocitos, extraídos de monocitos. Se determinó el
porcentaje de esplenocitos IgG^{+}, IgA^{+,} IgM^{+} por
citofluorimetría utilizando anticuerpos específicos.
Se efectuó un análisis ELISA de NGF como
describe Söderström et al. (1990). Para la evaluación del
título IgG o IgM específica Toxoide Tetánico (TT), se recubrieron
placas con 50 l de TT (10 g/ml) en una solución tamponada de borato
(0,1 M), a un pH de 8,6 durante toda la noche a 4ºC. Para la
evaluación del título NIP o IgG Ars-específica o
IgM, se recubrieron placas con NIP-KLH o
Ars-BSA (35 \mug/ml en PBS). También se evaluaron
los títulos IgG e IgM específicas en los complejos inmunizantes
recubriendo las placas con NIP/BSA o Ars-KLH.
Después de saturarse con PBS que contenía un 1% de BSA y de
aclararlo con PBS con 0,05% (v/v) Tween 20, se incubaron los
pocillos recubiertos durante 1 hora a 37ºC con una dilución en serie
de suero de ratón; se utilizó una reserva de suero de ratón
pre-inmune como control negativo. Se detectó Ig
reactiva por adicción de IgG o IgM anti-ratón de
cabra de un conjugado de fosfatasa alcalina.
La reacción final se visualizó por incubación
con una solución sustrato (Sigma) NPP y se anotó la absorbancia a
405 nm.
Incorporación de
^{3}H-timidina
(cpm)
Se cultivaron durante 48 horas linfocitos B (UF)
no fraccionados o las poblaciones purificadas indicadas y se
pulsaron con ^{3}H-timidina las últimas 12 horas.
Los datos se expresan como incorporación media de
^{3}H-timidina de cultivos triplicados. SD fue
siempre inferior al 10%. Se utilizó SAC en la dilución final de
1:10.000. Se utilizaron anticuerpos anti-NGF de
cabra o IgG pre-inmune de cabra en una concentración
de 10 g/ml. Se utilizó NGF humano recombinante en una concentración
de 100 ng/ml. Se utilizó IL/4 en una concentración de 100 U/ml. Se
utilizó
anti- de conejo policlonal en una concentración de 1 g/ml.
anti- de conejo policlonal en una concentración de 1 g/ml.
Se cultivaron PBMNC humanos en 3 x 10^{6}
células/ml durante 12 días en presencia o ausencia de PWM (10 g/ml),
anticuerpos anti-NGF de cabra o IgG de cabra
pre-inmune (10 g/nl), sobrenadante CD40 o CD4
(dilución final 1:10). Al final de la incubación, se recogieron los
sobrenadantes y se midieron IgA, IgG, IgM por ELISA utilizando
anticuerpos específicos. Los datos se expresan en concentración
media de Ig de los pocillos triplicados; SD fue <15%.
En inmunidad humoral los cambios asociados a la
edad afectan a la calidad más que a la cantidad de respuesta a los
anticuerpos. Entre los cambios en la calidad a la respuesta de los
anticuerpos con la edad se incluyen: los cambios de isotipos de los
anticuerpos de IgG a IgM y los cambios de las afinidades de los
anticuerpos de alta a baja. Las respuestas disminuidas de los
ancianos a la mayoría de las vacunas y la mayor susceptibilidad de
los ancianos a las infecciones han fomentado la idea de que la
senectud inmunológica conduce a un estado de inmunodeficiencia.
Aunque estos cambios se pueden ver, mayoritariamente en la capacidad
disminuida de las células T a facilitar la maduración de las células
B en lo que respecta a la maduración isotípica y de afinidad en la
periferia, este ejemplo muestra una capacidad disminuida de las
células B de memoria de los animales viejos a sobrevivir, debido a
una producción disminuida de NGF. La administración de NGF durante
la fase de maduración de las células B de memoria restablece la
producción de IgG de alta afinidad específica en ratones viejos
inmunizados con un hapteno utilizado comúnmente, NIP/BSA.
Se inmunizó a un grupo de 10 ratones hembra
viejos C57/BL6 (> de 5 meses) y a un grupo de 10 ratones hembra
jóvenes C57/BL6 (\leq 8 semanas) con 0,1 mg por ratón de
seroalbúmina bovina
(4-hidroxi-5-yodo-3-nitro-fenil)-acetilo
(NIP-BSA) (Reth et al, 1978) en 0,1 ml de una
solución salina en tampón fosfato (PBS), que se volvió a suspender
en 0,1 ml de adyuvante de Freund completo. Después de 21 días, de
obtuvieron 0,4 ml de sangre de cada animal por punción del plexo
retro-orbital y se neutralizaron los anticuerpos
anti/BSA por adición de BSA en las muestras séricas. Luego se
determinó el título IgG e IgM específica-NIP por
ELISA. La figura 3 muestra que la respuesta IgG específica frente a
NIP quedaba significativamente afectada en ratones viejos en
comparación con ratones jóvenes, mientras la respuesta de IgM
específica frente al hapteno era similar en los dos grupos de
ratones. Estos resultados indican que los mecanismos que subyacen a
la producción de inmunoglobulina de alta afinidad específica NIP
(hipermutación somática, conmutación isotípica) son defectuosos en
ratones viejos.
Se tiene constancia de que NGF es un factor de
supervivencia autocrino para linfocitos B de memoria (Torcia et
al., 1996). A fin de analizar si la respuesta inmunitaria
defectuosa de los ratones viejos podría atribuirse a la muerte
masiva de células B de memoria, inducida por la ausencia de
producción o disponibilidad de NGF, aislamos células B de memoria
(como linfocitos sIgD^{-}) mediante técnicas de lavado del bazo de
10 ratones viejos y de 10 ratones jóvenes de control. Se cultivaron
células durante 16 horas a 37ºC, se recogieron los sobrenadantes y
se midió el NGF por técnicas ELISA.
La tabla 3 muestra que las células B de memoria
aisladas de ratones viejos son incapaces de producir NGF, mientras
la misma población, aislada de ratones jóvenes producía niveles
altos de citoquina, tal como consta en (Torcia et al.,
1996).
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
Ratones viejos \+ \hskip3cm \+ < 9\cr Ratones jóvenes \+ \+
535,3 \pm
43,1\cr}
Como resultado de la producción disminuida de
NGF, la curva de supervivencia de las células B de memoria fue
sistemáticamente inferior, en comparación con la de la misma
población aislada de ratones jóvenes.
Claims (20)
1. Una combinación farmacéutica para mejorar la
eficacia de las vacunas en animales inmunodeficientes, que
comprende
- -
- Una vacuna capaz de estimular la producción de anticuerpos, en un animal, frente a un agente extraño causante de la enfermedad para dicho animal; y
- -
- Una cantidad que mejora la eficacia de la vacuna de Factor de Crecimiento (NGF), que aumenta la producción de dichos anticuerpos, en dicho animal, en respuesta a dicha vacuna.
2. Una combinación farmacéutica de la
reivindicación 1, en la que dicho animal es un humano y dicha vacuna
es seleccionada del grupo compuesto por: vacuna contra la gripe,
vacuna contra la Hemophilus influenzae, vacuna contra la
hepatitis A, vacuna contra la hepatitis B, vacuna contra la
hepatitis C, vacuna contra la tuberculosis, la vacuna contra el
Herpes Zóster, vacuna contra el citomegalovirus, vacuna
contra la neumonía neumocócica, vacuna contra la meningitis
meningocócica, vacuna contra la difteria, vacuna antitetánica,
vacuna antirrábica, vacuna contra el Helicobacter Pylori,
vacuna contra la polio y vacuna antivariólica.
3. La combinación farmacéutica de la
reivindicación 1, en la que dicha vacuna se da en una cantidad de 1
x 10^{-9} g a 1 x 10^{-3}, y dicho NGF se da en una cantidad de
0,001-100 mg/kg.
4. La combinación farmacéutica de la
reivindicación 1, en la que dicha vacuna se da en una cantidad de 1
x 10^{-8} g a 1 x 10^{-4}, y dicho NGF se da en una cantidad de
0,1-10 mg/kg.
5. La combinación farmacéutica de la
reivindicación 1, en la que dicho NGF se da en una cantidad de
0,3-3 mg/kg.
6. La combinación farmacéutica de la
reivindicación 1, que comprende una composición que contiene dicha
vacuna y dicho NGF.
7. La combinación farmacéutica de la
reivindicación 6, en la que dicha composición contiene un portador
farmacéuticamente aceptable.
8. El uso de:
- -
- Una vacuna capaz de estimular la producción, en un animal inmunodeficiente, de anticuerpos frente a un agente extraño causante de la enfermedad para dicho animal; y
- -
- Una cantidad que mejora la eficacia de la vacuna de Factor de Crecimiento (NGF), que aumenta la producción de dichos anticuerpos, en dicho animal, en respuesta a dicha vacuna.
9. El uso de la reivindicación 8, en el que
dicho animal es humano, y dicha vacuna es seleccionada del grupo
compuesto por: vacuna contra la gripe, vacuna contra la
Hemophilus influenzae, vacuna contra la hepatitis A, vacuna
contra la hepatitis B, vacuna contra la hepatitis C, vacuna contra
la tuberculosis, la vacuna contra el Herpes Zóster, vacuna
contra el citomegalovirus, vacuna contra la neumonía neumocócica,
vacuna contra la meningitis meningocócica, vacuna contra la
difteria, vacuna antitetánica, vacuna antirrábica, vacuna contra el
Helicobacter Pylori, vacuna contra la polio y vacuna
antivariólica.
10. El uso de la reivindicación 8, en el que
dicha vacuna se da en una cantidad de 1 x 10^{-9} g a 1 x
10^{-3}, y dicho NGF se da en una cantidad de
0,001-100 mg/kg.
11. El uso de la reivindicación 8, en el que
dicha vacuna se da en una cantidad de 1 x 10^{-8} g a 1 x
10^{-4}, y dicho NGF se da en una cantidad de
0,1-10 mg/kg.
12. El uso de la reivindicación 8, en el que
dicho NGF se da en una cantidad de 0,3-3 mg/kg.
13. El uso de la reivindicación 8, en el que
dicha vacuna es administrada como dosis de refuerzo de la
vacuna.
14. El uso de la reivindicación 13, en el que
dicho NGF es administrado 3-4 días antes de dicha
dosis de refuerzo de la vacuna.
15. El uso de la reivindicación 13, en el que
dicho NGF es también administrado de manera sustancial
simultáneamente a la administración de dicha vacuna.
16. El uso de la reivindicación 8, en el que
dicha vacuna y dicho NGF son administrados por inyección.
\newpage
17. El uso de la reivindicación 8, en el que
dicha vacunación comprende:
- -
- la administración a dicho animal de una primera dosis de dicha vacuna
- -
- luego, en un plazo comprendido entre 1 semana y 2 meses tras la administración de dicha primera dosis, la administración a dicho animal de o 1) una cantidad que mejora la eficacia de la vacuna de Factor de Crecimiento Nervioso (NGF) que aumenta la producción de dichos anticuerpos en dicho animal, en respuesta a dicha vacuna o 2) una dosis de refuerzo de dicha vacuna junto a una cantidad que mejora la eficacia de la vacuna de dicho Factor de Crecimiento Nervioso (NGF), a fin de mejorar la eficacia de dicha vacuna en dicho animal.
18. El uso de la reivindicación 17, en el que
dicho periodo de tiempo es de 10-45 días.
19. El uso de la reivindicación 17, en el que
dicho periodo de tiempo es de 10-30 días.
20. El uso de la reivindicación 17, en el que
dicho periodo de tiempo es de 10-20 días.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US84722897A | 1997-05-01 | 1997-05-01 | |
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| Publication Number | Publication Date |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98919999T Expired - Lifetime ES2278411T3 (es) | 1997-05-01 | 1998-04-30 | Factor de crecimiento nervioso como adyuvante de vacuna. |
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