CZ2003180A3 - Papilomavirové sekvence s optimalizovanými kodony - Google Patents

Description

PAPILOMAVIROVÉ SEKVENCE S OPTIMALIZOVANÝMI KODONY

Předkládaný vynález souvisí se způsoby a směsmi užitečnými při léčbě a prevenci infekcí lidským papilomavirem a s nimi spojených symptomů a onemocnění.

Papilomavirové infekce byly pozorovány u řady druhů, včetně ovcí, psů, králíků, opic, dobytka a lidi. Lidské papilomaviry (HPV) byly klasifikovány do více než 80 typů (Epidemiology a Biology of Cervical Cancer. Seminars in Surgical Oncology 1999 16:203-211). Jako nové (původní) typy jsou definovány ty, u nichž LI gen vykazuje menší než 90% sekvenční identitu k LI sekvencím dříve identifikovaných typů, zatímco subtyp vykazuje sekvenční identitu LI mezi 90% a 98%, a varianta vykazuje více než 98% sekvenční identity (k prototypickému (rodičovskému) typu). Papilomaviry obecně infikují epitel, ale různé typy HPV způsobují různá onemocnění. Například, typy 1-4, 7, 10 a 26-29 způsobují benigní kožní bradavice, typy 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, a 68 jsou spojeny s rakovinami děložního hrdla a typy 6 a 11 jsou spojeny s bradavicemi na pohlavních orgánech (nezhoubný kondylom rodidel).

Většina bradavic na pohlavních orgánech (>90%) obsahuje HPV genotypu 6 a 11. Zatímco HPV-β je nejrozšířenější genotyp identifikovaný v jednotlivých infekcích, mohou se oba, jak HPV-6, tak HPV-11 příležitostně vyskytovat ve stejném poškození. Bradavice se obecně vyskytují na několika místech infikovaných jedinců a u více než 60% pacientů s partnery, kteří mají kondylom (bradavicemi na pohlavních orgánech), se vyvine poranění, s průměrnou inkubační dobou 3 měsíce. V současné době je dostupná rada léčebných možností. Ty však spoléhají na odstranění nebo ablaci anebo na lokálním použití • · · · • · • · · ·

gelů a krémů. Tyto možnosti nejsou bezbolestné, mohou vyžadovat časté návštěvy kliniky a účinnost je vysoce proměnlivá. Značný problém pro účinné zvládnuti tohoto onemocněni je recidiva.

Bradavice na pohlavních orgánech mohou spontánně ustoupit a zdá se, že za regresi bradavic jsou zodpovědné buňky zprostředkovávající imunitu. Vysoké spontánní rychlosti regrese naznačují, že hostitelská buněčná imunita může vyřešit klinické možnost orgánech, terapii, kliniky, onemocnenr, a pro léčbu nebo činí z imunoterapeutického zásahu prevenci bradavic na pohlavních Cíle pro léčbu nemoci jsou pro virově specifickou která je bezbolestná, vyžaduje minimum návštěv má vysokou míru vyřešení nemoci a snižuje/minimalizuje recidivu onemocnění.

Je prokázán obtížný růst HPV v tkáňové kultuře, takže neexistuje žádná živá nebo oslabená virová vakcína. Vývoj HPV vakcíny je také zpomalen nedostatkem vhodného zvířecího modelu, ve kterém může být lidský virus studován. Je to z důvodů, že viry jsou vysoce specifické druhy, takže není možné infikovat lidským papilomavirem imunokompetentní zvíře, což by bylo vyžadováno pro bezpečné testování před tím, než by byla vakcína poprvé vyzkoušena na lidech.

Papilomaviry mají DNA genom, který kóduje časné a pozdní geny, označené El až E7, LI a L2. Bylo ukázáno, že sekvence časného genu mají funkční spojitost s replikací a transkripcí virové DNA, únikem hostitelské imunitě, pozměněním normálního buněčného cyklu hostitele a dalšími procesy. Například protein El je ATP-dependentní DNA helikasa a účastní se procesu iniciace replikace virové DNA, zatímco E2 je regulační protein, kontrolující jak virovou, expresi genu, tak replikaci DNA. Díky této schopnosti vázat se jak k El, tak k virovému •9 9999

9 99 9

99999 9 počátku replikace, způsobuje E2 lokální koncentraci El v počátku, a tak stimuluje iniciaci replikace virové DNA. Zdá se, že protein E4 má řadu málo prozkoumaných funkcí, ale mezi nimi může být vazba k cytoskeletu hostitelské buňky, zatímco E5 zřejmě zpožďuje acidifikaci endosomů, vedoucí ke zvýšení exprese receptoru EGF na buněčném povrchu, a oba, jak E6 tak E7 jsou známy, že váží buněčné proteiny, E6 protein p53 a E7 protein pRB. Proteiny E6 a E7 z HPV typů, které jsou spojeny s rakovinou děložního hrdla, jsou známé onkogeny. LI a L2 kódují dva virové strukturální (kapsidové) proteiny.

Historicky, bylo na vakcíny pohlíženo, jako na způsob prevence infekce patogenem, připravující imunitní systém na rozpoznání patogenu a jeho neutralizaci tam, kde by mělo dojít k infekci. Vakcína obsahuje jeden nebo více patogenních antigenů, často celý organismus, buď mrtvý nebo v oslabené (atenuované) formě nebo obsahuje vybrané antigenní peptidy organismu. Když je imunitní systém vystaven antigenů(ům), vytvoří se buňky, které si ponechají imunologickou „paměť pro tento antigen po celý život jednotlivce. Následné vystavení stejnému antigenů (např. při infekci patogenem), stimuluje specifickou imunitní odpověď, která vede k odstranění nebo inaktivaci infekčního činidla.

Existují dva mechanismy imunitní odpovědi: humorální odpověď (založená na protilátkách) a buněčně zprostředkovaná odpověď. Proteinové antigeny odvozené od patogenů, které jsou replikovány intracelulárně (viry a některé bakterie), jsou procesovány uvnitř infikované hostitelské buňky za uvolnění krátkých peptidů, které jsou následně vystaveny na povrchu infikované buňky ve spojení s MHC molekulami (major histocompatability complex) I třídy. Spojí-li se tento spojený komplex.MHC 1 a peptidu s antigen-specifickými CD8+ T-buňkami, • 4

99 9

4 9 99 9

4 ···· 4 · 4 • 444 4444444 · 4

44 44 4 4444

444444 44 4 «4 44 jsou aktivovány T-buňky, vyžadující cytotoxickou aktivitu. Tyto cytotoxické T-buňky (CTL) mohou lyžovat infikované hostitelské buňky, a tak omezit replikaci a rozšíření infekčního patogenu. Dalším důležitým mechanismem imunitní odpovědi je kontrola pomocí CD4 + T-buněk. Je-li antigen odvozený od patogenů uvolněn do vnějšího buněčného prostředí, může být přijat pomocí specializovaných antigen-prezentujících buněk (APC) a vystaven na povrchu těchto buněk ve spojení s molekulami MHC II. Rozpoznání antigenů v tomto komplexu stimuluje CD4 + T-buňky, aby sekretovaly rozpustné faktory (cytokiny), které regulují efektorové mechanismy jiných Tbuněk. Protilátka je produkována B-buňkami. Vazba antigenů k sekretované protilátce může neutralizovat infektivitu patogenu a vazba antigenů k membránově-vázané protilátce na povrchu B-buněk stimuluje dělení B-buněk, čímž se zesiluje odezva B-buňkami. Obecně, jak protilátkové, tak buněčně zprostředkované imunitní odpovědi (CD8+ a CD4+) jsou nutné pro potlačení infekcí patogeny.

Má se za to, že by mohlo být možné ovládnout imunitní systém, dokonce po infekci patogenem, pro potlačení nebo vyřešení infekce, inaktivací nebo odstraněním patogenu. Takové imunitní terapie (také známy jako „terapeutické vakcíny nebo imunoterapeutika) by ideálně vyžadovaly, aby buněčně zprostředkovaná odezva byla účinná, ačkoliv mohou být vyvolány obě, jak humorální, tak buněčně zprostředkovaná imunitní odpověď.

Bylo ukázáno (Benvenisty, N a Reshaf, L. PNAS 83 9551-9555) , že naočkováním precipitátu fosforečnanu vápenatého a DNA vede k expresi peptidů kódovaných DNA. Následně, bylo ukázáno, že byla-li do myši vpravena nitrosvalová injekce obsahující plasmidovou DNA, která nebyla precipitována, vedlo to k příjmu • 9 9 9 9 9 • 9 9

9 9 9

DNA svalovými buňkami a expresi kódovaného proteinu. Protože exprese DNA vede k tvorbě patogenem kódovaných proteinů v hostitelských buňkách, podobně jako během přirozené infekce, může tento mechanismus stimulovat buněčně zprostředkovanou imunitní odpověď nutnou pro imunitní terapie nebo terapeutickou vakcinaci, takže může být aplikován lék na bázi DNA jako ochranná vakcína nebo jako imunitní terapie. DNA vakcíny jsou popsány v W090/11092 (Vical, lne.).

DNA vakcína může být přenesena jiným mechanismem než nitrosvalovou injekcí. Například, přenos do kůže má tu výhodu, že imunitní mechanismy jsou vysoce aktivní v tkáních jako kůže a mukózní membrány, které jsou bariéry pro infekci. Přenos do kůže může být pomocí injektování tryskovým injektorem, (který pod tlakem tlačí kapalínu do kůže nebo do spodní tkáně včetně svalu), nebo pomocí bombardování částicí, ve které může DNA obalovat částice o dostatečné hustotě, aby prošly epitelem (US Patent No. 5371015). Například, nukleotidové sekvence mohou být vloženy do plasmidu, který je obaluje zlaté kuličky, které jsou poté pod tlakem vedeny do pokožky tak, jak je například popsáno v Haynes a kol. J. Biotechnology 44 : 37-42 (1996). Výběžky těchto částic do kůže vedou k přímé transfekci jak epidermálních buněk, tak i epidermálních Langerhansových buněk, Langerhansovy buňky jsou antigen prezentující buňky (APC), které přijímají DNA, exprimují kódované peptidy a procesují je pro vystavení s buněčnými povrchovými proteiny MHC. Transfekované Langerhansovy buňky migrují do lymfatických uzlin, kde prezentují vystavené fragmenty antigenů lymfocytům, vyvolávajících imunitní odpověď. Pro indukování imunitní odpovědi pomocí částice zprostředkovávající přenos do kůže je potřeba velmi malého množství DNA (méně než 1 pg, často méně než 0,5 pg) , což je v kontrastu s miligramovými množstvími DNA, • ·· · • · 9··· ·« · ······ • · · · · · · 9 • · · · ······· · · ······ ···· g ···· ·· 99 9 99 9₉ které, jak je známo, jsou potřebné k navození imunitních odpovědí následně po přímé nitrosvalové injekci.

Bylo často prokázáno, že exprese a detekce proteinů HPV v transfekovaných živočišných buňkách, takových jako HeLa, 293 nebo CHO buňky, je nesnadná a proto jsou pro biochemické a imunologické studie, vyžadující detekovatelnou expresi proteinů, nebo množství čistých proteinů, často používány proteinové expresní systémy E.coli, bakuloviru nebo kvasinek. V těchto systémech jsou výtěžky proteinu postačující pro funkční analýzy a purífíkaci a následné možné biochemické a imunologické studie. Přímé způsoby detekce proteinu (např. Western blot), většinou neuspějí při detekci exprese El proteinu v transfekovaných živočišných buňkách, dokonce i když jsou použity vektory se silnými promotory jako CMV nebo SV40. Způsoby navržené pro zvýšení exprese proteinu El v živočišných buňkách zahrnují klonování 5přesahující sekvence podél genu El (Remm a kol. J.Virol 1999 73, 3062-3070) a amplifikaci transfekovaného El plasmidového vektoru, po transfekci (Zou a kol. J.Virol 1998 72, 3436-3441). Amplifikace vloženého vektorového plasmidu replikací po transfekci způsobuje zvýšení počtu kopií genu El v buňce, čímž se zvyšují hladiny proteinů, a tak usnadňují detekci proteinu (pomocí Western blotu). Protože exprese a detekce proteinu El je v živočišných buňkách problematická, několik autorů se uchýlilo k detekování exprese proteinu pomocí in vitro transkripce-translace s ³⁵S-značeným methioninem, používající králičí retikulocytový systém (Promega), (Gopalakrishnan a kol. Virology 1999 256, 330-339., Safari a kol. Virology 1995 211, 385-396). Toto je však bezbuněčný systém a vyžaduje použití modifikovaného promotoru, který obsahuje vazebnou sekvenci pro RNA polymerasu z fága T7.

Exprese El proteinu byla navíc detekována nepřímo, pomocí detekce in vitro DNA replikace plasmidu obsahujícího HPV ·· ·♦·· • · · · • · · · · · · · · ·· · · · · ··· • · · · · ···· · · · · 7 ······ ·· Z *..**..* počátek replikace DNA. Detekce tohoto replikovaného plastidu, obsahujícího počátek replikace, působí jako náhrada za expresi proteinu El (a E2) (Gopalakrishnan a kol, Virology 1999 256, 330-339., Lu a kol J.Virol 1993 67, 7131-7139 a Del Vecchio a kol J. Virol 1992 66, 5949-5958) . Jak El, tak i E2 jsou vyžadovány pro replikaci HPV počátku replikace, takže transfekce živočišných buněk plasmidy kódujícími oba geny El a E2 a třetím plasmidem nesoucím HPV počátek replikace DNA povede pouze k replikaci plasmidu nesoucí počátek replikace, jestliže exprese El proteinu (a E2 proteinu) byla úspěšná, i když nebyla detekovatelná standardním způsobem detekce proteinu (Western blotem).

DNA kód je 4 písmenkový (A, T, C a G) a používá je pro vytvoření tří písmenkových „kodonů, které reprezentují aminokyseliny proteinů, kódovaných geny organismu. Lineární sekvence kodonů v molekule DNA je translatována do lineární sekvence aminokyselin proteinů, kódovaných těmito geny. Kód je vysoce degenerovaný, s 61 kodony kódujícími 20 přirozených aminokyselin a 3 kodony reprezentujícími „stop signály. Většina aminokyselin je tedy kódována více než jedním kodonem - ve skutečností několik aminokyselin je kódováno čtyřmi nebo více různými kodony.

Bylo pozorováno, že tam, kde je k dispozici více než jeden kodon pro kódování dané aminokyseliny, jsou způsoby využívání kodonů daného organismu vysoce nenáhodné. Různé druhy vykazují různé tendence při jejich výběru kodonů a navíc, využití kodonů může být značně odlišné v jednom druhu mezi geny, které jsou exprimovány ve vysoké nebo nízké míře. Tato tendence je různá u virů, rostlinných, bakteriálních a živočišných buněk, a některé druhy ukazují silnější tendenci vzdálenější od náhodné selekce kodonů než jiné. Například, lidé a jiní savci ·· ·♦·· ·

···· ··

jsou ovlivněny méně než určité bakterie nebo viry. Z těchto důvodů, existuje značná pravděpodobnost, že savčí gen exprimovaný v E,coli nebo virový gen exprimovaný v savčích buňkách, bude mít nevhodné rozdělení profilu využití kodonů pro účinnou expresi. Avšak, gen s profilem využití kodonů vhodným pro expresi v E.coli, může být také účinně exprimován v lidech. Má se za to, že pokud jsou v heterologní DNA sekvence klastrů kodonů, které jsou zřídka pozorovány v hostiteli, ve kterém k expresi dochází, dá se z toho usuzovat na nízkou hladinu heterologní exprese v tomto hostiteli.

Existuje několik příkladů, kde změna kodonů z těch, které se v hostiteli zřídka vyskytují na ty, které hostitel preferuje („optimalizace kodonů) zvyšuje hladiny heterologní exprese. Například, pokud byl u pozdních genů LI a L2 BPV (bovine papilloma virus) optimalizován profil využití kodonů pro využití v savcích, bylo ukázáno, že to vede k zvýšeným hladinám exprese ve srovnání s HPV sekvencemi divokého typu v kultuře savčích (Cos-1) buněk (Zhou et. al. J. Virol 1999. 73, 4972-4982). V této práci byly všechny kodony BPV, které se vyskytují více než dvakrát častěji v BPV než u savců (poměr použití >2), a většina kodonů s použitým poměrem >1,5, konzervativně nahrazeny přednostně využívaným savčím kodonem. V WO97/31115, WO97/48370 a WO98/34640 (Merck & Co., Inc.) bylo ukázáno, že optimalizace kodonů HIV genů nebo jeho segmentů vedla ke zvýšení exprese proteinu a zlepšení imunogenity, byly-li kodonově optimalizované sekvence použity jako DNA vakcíny v savčích hostitelích, pro které byla optimalizace navržená. V této práci sekvence sestávají zcela z optimalizovaných kodonů (s výjimkou těch, kde byle zavedeno nežádoucí restrikční místo, místo sestřihu intronu, atd.), protože každý virový kodon je konzervativně nahrazen optimálním kodonem pro zamýšleného hostitele.

·· ····

9999

9

9 9 9 9 9 • · · · · 9 9 9 9 • 9999 9999 999 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 g 9999 99 99 φ φφ φφ

Podle prvního aspektu, poskytuje předkládaný vynález polynukleotidovou sekvenci, která kóduje aminokyselinovou sekvenci HPV, kde je profil využití kodonů polynukleotidové sekvence podobný tomu, který je obsažen v silně exprimovaných savčích genech. Je vhodnější, aby polynukleotidové sekvence byla sekvence DNA. Je vhodné, aby se profil využití kodonů podobal tomu, který je v silně exprimovaných lidských genech.

V ideálním případě se profil využití kodonů také podobá tomu, který je v silně exprimovaných genech E.coli. Polynukleotidové sekvence může být DNA sekvence, například dvoj řetězcová DNA sekvence. Je vhodnější, když polynukleotidové sekvence kóduje polypeptid HPV typu nebo subtypu HPV spojeného s rakovinou děložního hrdla, benigními kožními bradavicemi nebo bradavicemi na pohlavních orgánech, například typů 1-4, 6, 7, 10, 11, 16, 18, 26-29, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, a 68, vhodněji typů 6, 11, 16, 18, 33 nebo 45, které jsou spojeny zejména s rakovinou děložního hrdla a s bradavicemi na pohlavních orgánech, nejvhodněji HPV 11, 6a nebo 6b.

Podle toho, je poskytnut umělý gen, zahrnující rozmanitost kodonů kódujících aminokyselinovou sekvenci HPV, kde výběr možných kodonů použitých pro kódování aminokyselinové sekvence byl změněn, aby se podobal optimálnímu savčímu využívání kodonů tak, aby se frekvence využívání kodonů v umělém genu více podobala frekvenci v silně exprimovaných savčích genech než frekvenci v genech papilomaviru. Je vhodnější, když profil využití kodonů je v podstatě stejný jako pro vysoce exprimované lidské geny.

V určitých formách, je kódovaná aminokyselinová sekvence aminokyselinovou sekvencí divokého typu HPV, V alternativních formách, je kódovaná aminokyselinová sekvence mutovaná • 9 9999

9 9 « 9 T «9 9 ·· · » · 9 · · « • * · 9 9 9 «·»

9*9 9999999 » ·

9 9 9 9 9 9 9 · · ίο .............

aminokyselinová sekvence HPV, zahrnující sekvenci divokého typu se změnami v aminokyselinách, například aminokyselinové bodové mutace, dostatečné ke snížení nebo inaktivaci jedné nebo více přirozených biologických funkcí polypeptidu. Je vhodné, aby si mutovaná aminokyselinová sekvence ponechala imunogenitu polypeptidu divokého typu.

Kódovaný polypeptid HPV může zahrnovat produkt časného genu, takového jako El, E2 nebo E7, nebo jeho fragment, analog nebo fúzi, nebo může být produkt pozdního genu, takového jako LI nebo L2, nebo jeho fragment, analog nebo fúze. Polynukleotid vynálezu může například kódovat fúzi mezi dvěma nebo více produkty časných genů HPV, mezi produktem časného genu HPV a produktem pozdního genu HPV, nebo mezi dvěma nebo více produkty pozdních genů HPV, mezi jedním nebo více fragmenty produktů genu HPV nebo mezi produktem genu HPV (nebo jeho fragmentem) a polypeptidem, odvozeným z jiného zdroje než HPV, například adjuvans nebo cílovým peptidem nebo polypeptidem, jako je peptid core HBV. Fúze mohou být mezi produktem genu HPV odvozeným od stejných nebo rozdílných virových typů nebo subtypů. Je vhodné, aby si takové fúze ponechaly imunogenitu fúzních polypeptidových složek. Je vhodnější, když kódovaný polypeptid HPV zahrnuje celý nebo část produktu časného genu, nejvhodněji El nebo E2. V jedné konkrétní formě kóduje polynukleotidová sekvence HPV 6b polypeptid El divokého typu, jak je ukázáno na Obr.l, nebo jeho fragment nebo analog. V jiných formách může polynukleotidová sekvence kódovat jednu nebo více z: mutovaných aminokyselinových sekvencí El HPV6b, ukázaných na Obr. 2; aminokyselinové sekvence divokého typu E2 (Obr. 3) HPV 11 nebo 6a nebo 6b; mutované aminokyselinové sekvence E2 HPV6b z Obr. 4b; a mutované sekvence E2 HPV11 z Obr. 4a, nebo jejich fragmenty, analoga nebo fúze, ve kterých si kódované polypeptidy ponechávají svou imunogenitu.

·· ··#· ·

♦ * *

9 * · · • ···· « • · ·· 9 • · 9

9 • » · ·· 99

Podle předkládaného vynálezu, bude profil využití kodonů polynukleotidu vhodněji vylučovat kodony s hodnotou RSCU menší než 0,2 v silně exprimovaných genech cílového organismu. Hodnota relativně synonymního využití kodonů (RSCU) je počet sledovaných kodonů dělený počtem očekávaných kodonů, když všechny kodony pro takovou aminokyselinu byly využity stejně často. Polynukleotid předkládaného vynálezu bude mít obecně koeficient využívání kodonů (jak je definováno níže) pro silně exprimované lidské geny vyšší než 0,3, vhodněji vyšší než 0,4, nejvhodněji vyšší než 0,5 ale menší než 1. Je vhodné, aby polynukleotid měl -také koeficient využívání kodonů pro silně exprimované geny E.coli vyšší než 0,5, vhodněji vyšší než 0,6, nejvhodněji vyšší než 0,7.

V jedné formě poskytuje předkládaný vynález polynukleotidovou sekvenci, jak je ukázáno na Obr. 5 nebo na Obr. 6, nebo její fragment nebo analog, která zachovává svůj profil využití kodonů. V další formě poskytuje předkládaný vynález polynukleotidovou sekvenci komplementární k sekvenci ukázané na Obr. 5 nebo na Obr. 6.

Podle druhého aspektu vynálezu, je poskytnut expresní vektor, který zahrnuje a je schopen řídit expresi polynukleotidové sekvence podle prvního aspektu vynálezu, kódující aminokyselinovou sekvenci HPV, kde se profil využití kodonů polynukleotidové sekvence podobá profilu v silně exprimovaných savčích genech, vhodněji v silně exprimovaných lidských genech. Vektor může být vhodný pro řízení exprese heterologních DNA v bakteriálních, hmyzích nebo savčích buňkách, zejména lidských buňkách. V jedné formě je expresní vektor p7313PLc (Obr.7).

Podle třetího aspektu vynálezu, jsou poskytnuty hostitelské buňky, obsahující polynukleotidovou sekvenci podle prvního • · • · · · • · · · • · · · ······· · · aspektu vynálezu, nebo expresní vektor podle druhého aspektu. Hostitelské buňky mohou být bakteriální, např. E.coli, savčí, např. lidské, nebo mohou být hmyzí buňky. Savčí buňky obsahující vektor podle předkládaného vynálezu mohou být kultivované buňky transfekované in vitro nebo mohou být transfekovány in vivo podáním vektoru savci.

Ve čtvrtém farmaceutickou podle prvního obsahovala DNA aspektu poskytuje předkládaný směs obsahující polynukleotidovou vhodněj ší, vynález sekvenci aby aspektu vynálezu. Je vektor podle druhého aspektu předkládaného vynálezu. V přednostních formách směs zahrnuje rozmanitost částic, vhodněji zlatých částic, potažených DNA obsahující směs vektor, kódující polynukleotidovou sekvenci, která aminokyselinovou polynukleotidové kóduj e kodonů silně genů.

sekvenci HPV, sekvence se exprimovaných savčích genů,

V alternativních formách obsahuje přijatelnou excipientní látku a DNA aspektu předkládaného vynálezu. Směs adjuvans.

kde profil využití podobá profilu u zejména lidských směs farmaceuticky vektor podle druhého může také obsahovat

V dalším aspektu poskytuje předkládaný vynález způsob vytvoření farmaceutické směsi, včetně kroku změny profilu využití kodonu nukleotidové sekvence HPV divokého typu nebo vytvoření syntetické polynukleotidové sekvence, pro tvorbu sekvence, která má profil využití kodonů podobný profilu vysoce exprimovaných savčích genů a kódující aminokyselinovou sekvenci HPV divokého typu nebo mutovanou aminokyselinovou sekvenci HPV, obsahující sekvenci divokého typu s aminokyselinovými změnami, dostatečnými pro inaktivaci jedné nebo více přirozených funkcí polypeptidu.

• · ·· · ·. · ··

Je také poskytnuto použití polynukleotidu podle prvního aspektu nebo vektoru podle druhého aspektu vynálezu, při léčbě nebo prevenci infekce HPV, vhodněji infekce typem nebo subtypem HPV spojeným s rakovinou děložního hrdla, benigními kožními bradavicemi nebo bradavicemi na pohlavních orgánech například typy, 1-4, 6,7, 10, 11, 16, 18,26-29,31,33,35,39,45, 51, 52, 56, 58, 59 a 68. V určitých formách poskytuje vynález použití polynukleotidu podle prvního aspektu nebo vektoru podle druhého aspektu vynálezu při léčbě nebo prevenci infekce HPV typu 6, 11, 16, 18, 33 nebo 45, které jsou spojeny zejména s rakovinou děložního hrdla a s bradavicemi na pohlavních orgánech, nejvhodněji HPV 11, 6a nebo 6b. Vynález také poskytuje použití polynukleotidu podle prvního aspektu, vektoru podle druhého aspektu vynálezu nebo farmaceutické směsi podle čtvrtého aspektu vynálezu, při léčbě nebo prevenci benigních kožních bradavic, bradavic na pohlavních orgánech, atypické ploché buňky nezjištěného významu (ASCUS), dysplazie děložního hrdla, intraepiteliální neoplazie děložního hrdla (CIN) nebo rakoviny děložního hrdla. Podle toho, předkládaný vynález také poskytuje použití polynukleotidu podle prvního aspektu nebo vektoru podle druhého aspektu vynálezu pro přípravu léku pro léčbu nebo prevenci infekce HPV, jakéhokoliv jednoho nebo více typů 1-4, 6, 7, 10, 11, 16, 18, 26-29, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 a 68, nebo s ní spojených jakýchkoliv symptomů nebo onemocnění.

Předkládaný vynález také poskytuje způsoby pro léčbu nebo prevenci infekcí HPV, zejména infekcí jakéhokoliv jednoho nebo více typů HPV 1-4, 6, 7, 10, 11, 16, 18, 26-29, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 a 68, nebo s nimi spojených jakýchkoliv symptomů nebo onemocnění, včetně podávání účinného množství polynukleotidu podle prvního aspektu, vektoru podle druhého aspektu nebo farmaceutické směsi podle čtvrtého aspektu vynálezu. Podávání farmaceutické směsi může být ve • · · • · • · · · • · · · · • · · • · · · • · · · · · · • · · • · · · · formě jedné nebo více jednotlivých dávek, například v první spouštěcí dávce „prime-boost terapeutického vakcinačního režimu. V některých případech může být „první vakcina.ce provedena pomocí částice zprostředkující DNA přenos polynukleotidu podle předkládaného vynálezu, vhodněji inkorporovaného do plasmidového vektoru a spouštěcí dávka „boost podáním rekombinantního virového vektoru obsahujícího stejnou polynukleotidovou sekvenci.

V předkládané specifikaci a v doprovodných nárocích jsou slova „zahrnovat a „obsahovat a takové obměny jako „zahrnuje, „zahrnující, „obsahuje a „obsahující vykládána jako plně zahrnující. To znamená, že tato slova mají vyjadřovat možné zahrnutí dalších prvků nebo čísel, které nejsou specificky uvedeny tam, kde to kontext umožňuje.

Výraz „analog označuje polynukleotid, který kóduje stejnou aminokyselinovou sekvenci jako jiný polynukleotid předkládaného vynálezu, ale který má díky nadbytečnosti genetického kódu odlišnou nukleotidovou sekvenci ale zachovává si stejný profil využití kodonů, například má stejný koeficient využití kodonů nebo má koeficient využití kodonů do 0,1, vhodněji do 0,05 koeficientu jiného polynukleotidu.

Výraz „profil využití kodonů označuje průměrné frekvence všech kodonů v nukleotidové sekvenci, genu nebo třídě genů, o nichž se diskutuje (např. silně exprimované savčí geny). Profil využití kodonů pro savce, včetně lidí, je možné nalézt v literatuře (viz např. Nakamura a kol., Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215).

V polynukleotidech předkládaného vynálezu se profil využití kodonů mění z toho, který je typický pro lidské, papilomaviry na takový, který je blíže kodonům cílového organismu, např.

• · · · · · • · · · • · · · · · · · · • · · · ······· · · • · · · · · ···· ······ ·· · ·· ··

E.coli nebo savci, zejména člověku. „Koeficient využití kodonů je míra toho, jak moc se profil využití kodonů dané polynukleotidové cílového druhu.

profilu využití kodonů sekvence podobá

Frekvence kodonů mohou být odvozeny z literárních zdrojů pro mnoho druhů silně exprimovaných genů (viz např. Nakamura a kol. Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215). Frekvence kodonů pro každý z 61 kodonů (vyjádřené jako číslo vyskytovaného výskytu na 1000 kodonů z 10 vybraných tříd genů) jsou normalizovány pro každou z dvaceti přirozených aminokyselin, takže hodnota pro nejfrekventovaněji využívaný kodon pro každou aminokyselinu se rovná 1 a frekvence méně běžných kodonů leží mezi nulou a 1. Každý z 61 kodonů je tedy označen hodnotou 1 nebo nižší pro silně exprimované geny cílových druhů. Za účelem spočítat koeficient využití kodonů pro specifický nukleotid, vzhledem k silně exprimovaným genům tohoto druhu, jsou velikosti hodnoty specifického polynukleotidu zaznamenány geometrický průměr všech těchto zaznamenaných hodnot (pomocí dělení sumy přirozených logaritmů těchto hodnot celkovým počtem kodonů a převedením na jejich záporný logaritmus). Koeficient bude mít hodnotu mezi nulou ala čím vyšší koeficient tím více je kodonů, které jsou v polynukleotidu často využívané. Jestliže má koeficient využívání kodonů pro a

každý kodon je vypočten polynukleotidové sekvence 1, všechny kodony jsou nej frekventovanej ší cílových druhů.

kodony pro silně exprimované geny

Kratší polynukleotidové sekvence jsou v rámci tohoto vynálezu. Polynukleotid vynálezu může například kódovat fragment proteinu HPV. Polynukleotid, který kóduje fragment dlouhý alespoň 8, například 8-10 aminokyselin nebo do 20, 50, 60, 70, 80, 100, 150 nebo 200 aminokyselin je považován, že náleží do rámce vynálezu, pokud má polynukleotid profil využití kodonů, který se podobá profilu silně exprimovaného savčího genu a ·♦···· A · A A· • · A · · · ·

A · AAAA A

A A · A AAAAAAA

AAAA AA AA A AA kódovaný oligo nebo polypeptid vykazuje antigenní vlastnosti HPV. Zejména, ale ne výhradně, zahrnuje tento aspekt vynálezu situaci, kde polynukleotid kóduje fragment kompletní proteinové sekvence HPV a může představovat jeden nebo více samostatných epitopů tohoto proteinu.

Polynukleotidy předkládaného vynálezu vykazují vyšší expresi v E.coli a savčích buňkách než odpovídající sekvence divokého typu, kódující stejné aminokyselinové sekvence. I když není žádoucí vázat se na jakoukoliv teorii, má se za to, že je to způsobeno alespoň dvěma důvody. Za prvé tím, že má profil využití kodonů bližší profilu hostitelské buňky, jsou sekvence snadněji procesovány buněčnou translační mašinérií. Za druhé, protože až 30% nukleotidové sekvence (nebo více) je odlišných od sekvence divokého typu, jsou odstraněna nebo změněna místa, která interferují s transkripcí nebo translací (taková jako vazebná místa pro proteiny).

V některých formách vykazují polynukleotidy podle předkládaného vynálezu profily využití kodonů, které se podobají profilům E.coli a savčím (např. lidským) genům. To je zejména výhodné tam, kde je sekvence použita při vakcinaci savců a při přípravě značných množství antigenového proteinu in vitro použitím buněk E.coli (např. pro použití v testech, takových jako jsou imunotesty pro odhadnutí hladin exprese v savčích nebo lidských tkáních).

Jak je diskutováno výše, zahrnuje předkládaný vynález expresní vektory, které obsahují nukleotidové sekvence vynálezu. Takové expresní vektory jsou rutinně konstruovány v oblasti molekulární biologie a mohou například zahrnovat použití plasmidové DNA a vhodných iniciátorů, promotorů, enhancerů a dalších prvků, takových jsou například polyadenylační signály, které mohou být nezbytné a které jsou umístěny ve

AAAA ♦ · · · • · • · · · • · · · · ♦ « · · • · · · · · · · · • ··· ······· · · ···· *· · *··* ’··* správné orientaci, aby umožnily expresi proteinu. Osobám, které jsou orientovány v oboru budou zřejmé další vhodné vektory. S ohledem na další příklad odkazujeme na Sambrook a kol. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2 vydání. CSH Laboratory Press. (1989).

Výhodněji, je polynukleotid vynálezu nebo pro použití ve vynálezu ve vektoru, funkčně spojen s kontrolní sekvencí, která umožňuje poskytnutí exprese kódující sekvence hostitelskou buňkou, tj. vektor je expresní vektor. Výraz funkčně spojen označuje vzájemnou polohu, kde popsané složky jsou v takovém vztahu, který jim dovoluje správně fungovat žádoucím způsobem. Regulační sekvence, taková jako promotor, funkčně spojená s kódující sekvencí je umístěna tak, že exprese kódující sekvence je dosaženo za podmínek, které jsou slučitelné s regulační sekvencí.

Vektory mohou být například plasmidy, umělé chromosomy (např. BAC, PAC, YAC), virové nebo fágové vektory, poskytnuté s počátkem replikace, volitelně promotor pro expresi polynukleotidu a volitelně regulátor promotoru. Vektory mohou obsahovat jeden nebo více selekčních markerových genů, například gen pro ampicilinovou nebo kanamycinovou rezistenci v případě bakteriálního plasmidu nebo rezistenční gen pro fungální vektor. Vektory mohou být použity in vitro, například pro tvorbu DNA nebo RNA nebo použity pro transfekci nebo transformaci hostitelských buněk, například savčí hostitelské buňky např. pro tvorbu proteinu, kódovaného vektorem. Vektory mohou být také upraveny pro použití in vivo, například při způsobech DNA vakcinace nebo genové terapie.

Promotory a další expresní regulační signály mohou být vybrány tak, aby byly slučitelné s hostitelskou buňkou, pro kterou je exprese navržena. Například, savčí promotory zahrnují • 4 • · · · • ··· ·· · «· <4 «444 · · 4 • · 444· 44 4

444 4444444 4 4 jg ...... ·· · *··* *·.* metalothioneinový promotor, který může být indukován jako odezva na těžké kovy, takové jako kadmium a β-aktinový promotor. Mohou být také použity virové promotory, takové jako promotor velkého T antigenů SV40, ranně časný (IE) promotor lidského cytomegaloviru, LTR promotor Rous sarcoma viru, adenovirový promotor nebo HPV promotor, zejména protisměrná regulační oblast (URR) HPV. Všechny tyto promotory jsou velmi dobře popsány a jsou v oboru dostupné.

Příklady vhodných virových vektorů zahrnují virové vektory herpes simplex, vektory vakcinia nebo alfa-viru a vektory retrovirů, včetně lentivirů, adenovirů a virů spojenými s adenoviry. Techniky přenosu genů použitím těchto virů jsou známy těm, jenž jsou orientováni v oboru, Retrovirové vektory mohou být například použity pro stabilní integraci polynukleotidu vynálezu do hostitelského genomu, i když taková rekombinace není přednostní. Na druhé straně replikačnědefektní adenovirové vektory zůstávají epizomální a proto dovolují tranzientní expresi. Za účelem tvorby velkého množství proteinu HPV, kódovaného polynukleotidy předkládaného vynálezu, například pro použití jako podjednotkové vakcíny nebo pro imunotesty, mohou být použity vektory schopné řídit expresi v hmyzích buňkách (například bakulovirové vektory), v lidských buňkách nebo v bakteriích.

Polynukleotidy podle tohoto vynálezu mají využití při tvorbě kódovaných proteinů pomocí exprese, kde exprese může být in vitro, in vivo nebo ex vivo. Nukleotidy mohou tedy být obsaženy v syntéze rekombinantního proteinu, například pro zvýšení výtěžků nebo mohou najít uplatnění jako uznávaná terapeutická činidla, používaná v technikách DNA vakcinace. Tam, kde jsou polynukleotidy předkládaného vynálezu použity při tvorbě kódovaných proteinů in vitro nebo ex vivo, budou buňky, například v buněčné kultuře modifikovány, aby φ φ φφφφ φφφφ φφ φφφφ ·· · φ φ φφφφ φφ · φ φφφ φ φφφ φ · φ φ φ φφφ φφφ φφφφ

......... *· ·· obsahovaly polynukleotid, jenž má být exprimován. Takové buňky zahrnují tranzientní nebo vhodněji stabilní savčí buněčné linie. Konkrétní příklady buněk, které mohou být modifikovány vložením vektorů, kódujících polypeptid podle vynálezu, zahrnují savčí HEK293T, CHO, HeLa, 293 a COS buňky. Výhodněji bude vybraná buněčná linie ta, která je nejen stabilní, ale také umožňuje kompletní glykosylaci a expresi polypeptidů na buněčném povrchu. Exprese může být dosaženo v transformovaných oocytech. Polypeptid může být exprimován z polynukleotidu předkládaného vynálezu v buňkách transgenního nelidského živočicha, vhodně myši. V rámci předkládaného vynálezu je zahrnut transgenní nelidský živočich exprimující polypeptid z polynukleotidu vynálezu.

podávány může být jakoukoliv například

Najdou-li polynukleotidy předkládaného vynálezu použití jako terapeutická činidla, např. v DNA vakcinaci, bude nukleová kyselina podávána živočichu, např. člověku, který má být vakcinován. Nukleová kyselina, taková jako RNA nebo DNA, výhodněji DNA, je poskytnuta ve' formě vektoru, takového jako ty popsané výše, který může být exprimován v buňkách živočicha. Polynukleotidy mohou být vhodnou technikou. Nukleová kyselina vnesena injekční jehlou, výhodněji intradermálně, subkutánně nebo intramuskulárně. Nukleová kyselina může být alternativně vnesena přímo do kůže použitím přenosového zařízení pro nukleové kyseliny, takového jako přenos DNA zprostředkovaný částicemi (PMDD). V tomto způsobu, jsou inertní částice (takové, jako zlaté kuličky) potaženy nukleovou kyselinou a jsou urychleny na dostatečnou rychlost, aby jim umožnila penetrovat povrchem recipienta (např. kůží), například vypuštěním za vysokého tlaku z projektilového zařízení. (Částice potažené molekulou nukleové kyseliny předkládaného vynálezu jsou v rámci předkládaného vynálezu, přenosová zařízení naplněná takovými částicemi) stejně jako Směs vhodně • · ·· 4444

• · 4 · 4 ·

444 44444

4 4 4 4 4

20..........

zahrnuje zlaté částice, které mají průměrný průměr 0,5-5 μιπ, výhodněji přibližně 2 μπι. V přednostních formách, jsou potažené zlaté kuličky naplněny do nádobek, sloužících jako náplně tak, že každá náplň obsahuje 0,1-1 mg, výhodněji 0,5 mg zlata potaženého 0,1-5 μς, výhodněji přibližně 0,5 μσ DNA/náplň.

Techniky vhodné pro vnesení holého polynukleotidu nebo vektoru do pacienta zahrnuje topikální aplikaci vhodným prostředkem. Nukleová kyselina může být podána topikálně na kůži, nebo na mukózní povrchy například pomocí intranasálního, orálního, intravaginálního nebo intrarektálního podávání. Holý polynukleotid nebo vektor mohou být přítomny společně s farmaceuticky přijatelnou excipientní látkou, takovou jako fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS). Příjem DNA může být dále usnadněn pomocí usnadňovacích činidel, takových jako bupivacain, buď odděleně nebo zahrnutých ve směsi DNA. Další způsoby podávání nukleové kyseliny přímo příjemci zahrnují ultrazvuk, elektrické stimulace a mikrovýsev, které jsou uvedeny v US-5,697,901.

Příjem konstruktů nukleových kyselin může být zvýšen několika známými transfekčními technikami, například takovými, které zahrnují použití transfekčních činidel. Příklady těchto činidel zahrnují kationtová činidla, například fosfát vápenatý a DEAE-Dextran a lipofektanty, například lipofektam nebo transfektam. Dávka nukleové kyseliny, která má být podána, může být změněna. Většinou je nukleová kyselina podávána v množství v rozmezí od lpg do lmg, výhodněji Ipg až 10μς nukleové kyseliny na částici zprostředkovávající přenos a 10μρ až lmg pro jiné cesty.

Sekvence nukleové kyseliny předkládaného vynálezu může být také podána prostřednictvím specializovaných přenosových vektorů, používaných při genové terapii. Přístupy genové ·« ··♦· ·· ···· • · ♦ · ······· « · ······ · · · · ···· ·· ·* .....

terapie jsou diskutovány například v Verme a kol, Nátuře 1997, 389:239-242. Mohou být použity jak virové, tak nevirové vektorové systémy. Virově založené systémy zahrnují systémy založené na retrovirech, lentivirech, adenovirech, virech spojených s adenoviry, herpes virech, canarypox a vakcinia virech. Nevirově založené systémy zahrnují přímé podávání nukleových kyselin, mikrosférickou enkapsulační technologií (póly(laktid-ko-glykolid) a systémy založené na liposomech. Virové a nevirové přenosové systémy mohou být kombinovány, jeli žádoucí poskytnou opakované injektování po první vakcinaci, například první „prime DNA vakcinace pomocí nevirových vektorů, takových jako plasmid, následované jednou nebo více „opakovacími dávkami vakcinace použitím virového vektoru nebo nevirově založeného systému.

Sekvence nukleové kyseliny předkládaného vynálezu může být také podávána prostřednictvím transformovaných buněk. Takové buňky zahrnují buňky odebrané ze subjektu. Čistý polynukleotid nebo vektor předkládaného vynálezu mohou být vloženy do takových buněk in vitro a transformované buňky mohou být později vráceny subjektu. Polynukleotid vynálezu může být integrován do nukleové kyseliny, která je již přítomna v buňkách pomocí homologní rekombinace. Je-li žádoucí, mohou být transformované buňky připraveny nárůstem in vitro a jedna nebo více výsledných buněk mohou být použity v předkládaném vynálezu. Buňky mohou být poskytnuty na vhodném místě pacienta pomocí známých chirurgických nebo mikrochirurgických technik (např. štěpy, mikroinjektování, atd.)

Vhodné buňky zahrnují antigen-prezentující buňky (APC), takové jako dendritické buňky, makrofágy, B buňky, monocyty a další buňky, které mohou být zkonstruovány tak, aby byly účinné APC. Takové buňky mohou být, ale nemusí, geneticky modifikovány pro zvýšení kapacity pro prezentování antigenu, aby se vylepšila ·· ···· * · odpovídáj ící jakékoliv aktivace a udržení odezvy T buněk, a aby měly protinádorové účinky, např. proti rakovině děložního hrdla per se anebo, aby byly imunologicky kompatibilní s příjemcem (tj

HLA haplotypu). APC mohou být obecně izolovány z celé řady biologických tekutin a orgánů, včetně nádoru a peritumorálních tkání a mohou být autologní, alogenní, syngenní nebo xenogenní buňky.

Určité přednostní formy předkládaného vynálezu používají dendritické buňky nebo jejich předky jako antigen-prezentující buňky, buď pro transformaci in vítro a navrácení pacientu nebo jako in vivo cíl nukleotidů přenesených ve vakcíně, například pomocí částice zprostředkovávající přenos DNA. Dendritické buňky jsou velmi účinné APC (Banchereau a Steinman, Nátuře 392:245-251, 1998) a byly ukázány, že jsou účinné jako fyziologické adjuvans pro vyvolání profylaktické nebo terapeutické protinádorové imunity (viz Timmerman a Levý, Ann. Rev. Med. 50:507-529,1999). Obecně, mohou být dendritické buňky identifikovány na základě jejich typického tvaru (hvězdicový in šitu, se zřetelnými cytoplasmatickými procesy (dendrity) viditelnými in vítro), jejich schopnosti přijmout, a prezentovat antigeny a odezvy naivních T buněk.

mohou být zkonstruovány tak, aby exprimovaly specifické buněčné povrchové receptory nebo ligandy, které nejsou běžně nalezeny na dendritických buňkách in vivo nebo ex vivo, například antigen(y), kódované v konstruktech vynálezu a takové modifikované dendritické buňky jsou zamýšleny v předkládaném vynálezu. Jako alternativní k dendritickým buňkám jejich schopnosti Dendritické buňky procesovat aktivovat samozřejmě sekretované vezikuly mohou být ve vakcíně použity dendritických buněk, naplněné antigeny (nazývané exosomy) (viz Zitvogel a kol., Nátuře Med. 4:594-600, 1998).

·· ···· • · · « · · • · • · ·

9 999

Dendritické buňky a jejich přeci mohou být získány z periferní krve, kostní dřeně, nádorem infiltrovaných buněk, buněk infiltrujících do peritumorálních tkání, lymfatických uzlin, sleziny, kůže, pupečníkové krve nebo jakýchkoliv jiných vhodných tkání nebo tekutin. Dendritické buňky mohou být například diferencovány ex vivo přidáním kombinace cytokinů, takových jako GM-CSF, IL-4, IL-13 anebo· TNF ke kulturám monocytů získaných z periferní krve. Alternativně, mohou být CD34 pozitivní buňky získané z periferní krve, pupečníkové krve nebo krevní dřeně diferencovány na dendritické buňky přídavkem směsí

GM-CSF,

IL-3,

TNF,

CD40 ligandu, lipopolysacharidu LPS, fit3 ligandu (cytokinů důležitého pro vytvoření profesionálních antigen prezentujících buněk, zejména dentritických buněk) anebo jiných sloučenin indukujících diferenciaci, maturaci a proliferace dendritických buněk, ke kultivačnímu médiu.

APC mohou být obecně transfekovány polynukleotidem kódujícím antigenní aminokyselinovou sekvenci HPV, takovým jako kodonově-optimalizovaný polynukleotid, jak je předpokládáno v předkládaném vynálezu. Taková transfekce může být provedena ex vivo a směs nebo vakcína zahrnující takové transfekované buňky může být poté použita pro terapeutické účely, jak je zde popsáno. Alternativně, prostředek pro přenos genu, který cílí do dendritických nebo jiných antigen prezentujících buněk, může být podán pacientu, což vede k transfekci, která se odehrává in vivo. In vivo a ex vivo transfekce dendritických buněk, mohou být obecně provedeny například použitím jakýkoliv způsobů známých v oboru, jako těch, popsaných v WO 97/24447, nebo přístupem zprostředkovaným částicí, popsaným v Mahvi a kol., Immunology and Cell Biology 75:456-460, 1997.

Vakcíny a farmaceutické směsi mohou být předkládány v jednodávkových nebo v mnohodávkových nádobkách, jako ·« ···· ·· · ·· ·*·*

doby použití. Obecně, suspenze, roztoky nebo uzavřené ampule nebo lahvičky. Takové nádobky jsou výhodněji hermeticky uzavřeny pro zachování sterility složení, až do mohou být směsi skladovány jako emulze v olejových nebo vodných prostředcích. Alternativně, může být vakcína nebo farmaceutická směs skladována za lyofilizovaných podmínek, které vyžadují pouze přídavek sterilního tekutého nosiče těsně před použitím. Vakcíny zahrnující nukleotidové sekvence, jež jsou zamýšleny pro podávání pomocí částic zprostředkovávajících náplně, vhodné pro mohou být předkládány jako s přístrojem pro přenos se z dutých přenos, použití stlačeným plynem, kde náplně mohou být složeny trubiček, jejichž vnitřní povrch je potažen nesoucími nukleotidovou sekvenci vakcíny, dle částicemi volby za přítomnosti dalších farmaceuticky přijatelných přísad.

Farmaceutické směsi předkládaného vynálezu mohou obsahovat adjuvans, nebo jiné látky, které mohou sloužit pro modulování nebo zvýšení imunitní odezvy, indukované proteinem, který je kódován DNA. Tyto mohou být kódovány DNA, buď odděleně od nebo ve fúzi s antigenem, nebo mohou zahrnovat prvky, jež nejsou tvořeny DNA. Příklady substancí typu adjuvans, které mohou být zahrnuty ve směsích předkládaného vynálezu, zahrnují ubikvitin, membránový protein asociován s lysosomem (LAMP), antigen core viru hepatitidy B, fit3-ligand a další cytokiny, takové, jako IFN-ya GMCSF.

Další vhodná adjuvans jsou komerčně dostupná, například Freundovo nekompletní adjuvans a kompletní adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MI); Imiquimod (3M, St. Paul, MN) ; Resimiquimod (3M, St. Paul, MN) ; Merck Adjuvans 65 (Merck and Company, lne., Rahway, NJ) ; AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); soli hliníku takové, jako gel hydroxidu hlinitého (alum) nebo fosforečnan hlinitý; soli vápníku, ♦ * 9999

9999

9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9999999 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 9 99 99 železa nebo zinku, nerozpustné suspenze acylovaného tyrosinu; acylované cukry; kationtově a aniontově derivatizované polysacharidy; polyfosfazeny; biodegradovatelné mikrosféry; monofosforylovaný lipid A a quil A. Jako adjuvans mohou být také použity cytokiny, jako GM-CSF nebo interleukin-2, -7, nebo -12.

Ve směsích vynálezu je přednostní, aby složení adjuvans indukovalo imunitní odezvu převážně Thl typu. Adjuvans může tedy sloužit pro modulaci imunitní odpovědi vytvořené v odezvě na antigen kódovaný DNA z převážně Th2 na převážně Thl typ odezvy. Vysoké hladiny cytokinů Thl typu (např., IFN-, TNF, IL-2 a IL-12) mají tendenci upřednostňovat indukci buněk, zprostředkovávajících imunitní odezvy na podávaný antigen. V přednostní formě, ve které je odezva převážně Thl typu, se bude hladina cytokinů Thl typu zvyšovat na vyšší hodnotu než hladina cytokinů Th2 typu. Hladiny těchto cytokinů mohou být snadno stanoveny použitím standardních stanovení. Pro přehled o rodinách cytokinů, viz Mosmann a Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989.

Podle toho, vhodná adjuvans pro použití pro vyvolání odezvy převážně Thl typu zahrnují například kombinaci monofosforyllipidu A, výhodněji 3-de-0-acylovaného monofosforylovaného lipidu A (3D-MPL), spolu se solí hliníku. Další známá adjuvans, která přednostně indukují imunitní odezvu typu Thl, zahrnují oligonukleotidy obsahující CpG. Tyto oligonukleotidy jsou charakteristické tím, že CpG dinukleotid je nemethylovaný. Takové oligonukleotidy jsou dobře známy a jsou popsány například v WO96/02555. Také jsou popsány imunostimulační sekvence DNA, například v Sáto a kol., Science 273:352, 1996. Oligonukleotidy obsahující CpG mohou být kódovány odděleně od antigen(ů) papilomaviru ve stejném nebo jiném polynukleotidovém konstruktu, nebo k němu mohou být připojeny, např, pomocí fúze. Alternativně, oligonukleotidy «9 9999

9999 9¼ » »9 9 » « 9 9 * · 9 * 9 · «

9 * 9 9999999

9999 ·« obsahující CpG mohou být podávány odděleně, tj. ne jako součást směsi, která zahrnuje kódovaný antigen. CpG oligonukleotidy mohou být použity samotné nebo v kombinaci například zahrnuje CpG a saponinového s jinými adjuvans. Zesílený systém kombinaci oligonukleotidu obsahujícího derivátu, zejména kombinaci CpG a QS21, jak je ukázáno v WO 00/09159 a WO 00/62800. Výhodněji, tato směs dále zahrnuje emulzi oleje ve vodě anebo tokoferol.

Další přednostní adjuvans je saponin, výhodněji QS21 (Aquila Biopharmaceuticals lne., Framingham, MA), který může být použit samotný nebo v kombinaci s jinými adjuvans. Zesílený systém zahrnuje například kombinaci monofosforyllipidu A a saponinového derivátu, takovou jako je kombinace QS21 a 3DMPL, jak je popsáno v WO 94/00153, nebo směs méně vyvolávající reakci, kde QS21 je zastaven cholesterolem, jak je popsáno v WO 96/33739. Další přednostní formy zahrnují emulzi olej ve vodě a tokoferol. Zvláště účinné složení adjuvans, obsahující QS21, 3D-MPL a tokoferol v emulzi olej ve vodě je popsáno v WO 95/17210.

Další přednostní adjuvans zahrnují Montanide ISA 720 (Seppic, France), SAF (Chiron, California, United States), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), Detox (Ribi, Hamilton, MT) , RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) a jiné aminoalkylglukosaminid 4-fosfáty (AGP) .

Další přednostní adjuvans zahrnují molekuly adjuvans obecného vzorce (I)

Vzorec (I): HO(CH2CH20)n-A-R kde n je 1-50, A je vazba nebo -C(O)-, R je Cl-50 alkyl nebo fenyl Cl-50 alkyl.

9 9 9 • · • · · ·

9999 99 • · · · 9

9999·· · «

Jedna forma předkládaného vynálezu sestává ze složení obsahujícího polyoxyethylenether obecného vzorce (I), kde n je mezi 1 a 50, výhodněji 4-24, nejvýhodněji 9; R složka je Cl50, výhodněji C4-C20 alkyl a nejvýhodněji C12 alkyl, a A je vazba. Koncentrace polyoxyethylenetherů by měla být v rozmezí 0,1-20%, výhodněji od 0,1-10%, a nejvýhodněji v rozmezí od 0,1-1%. Přednostní polyoxyethylenethery jsou vybrány z následující skupiny: polyoxyethylen-9-laurylether, polyoxyethylen-9-steorylether, polyoxyethylen-8-steorylether, polyoxyethylen-4-laurylether, polyoxyethylen-35-laurylether a polyoxyethylene-23-laurylether. Polyoxyethylenethery, takové jako polyoxyethylenlaurylether, jsou popsány v Merck indexu (12 vydání: entry 7717). Tyto molekuly adjuvans jsou popsány v WO 99/52549. Polyoxyethylenether podle obecného vzorce (I) uvedeného výše může, je-li to žádoucí, být kombinován s dalším adjuvans. Přednostní směs adjuvans je například výhodněji s CpG, jak je popsáno v podané UK patentové žádosti GB 9820956.2.

Tam, kde vakcína zahrnuje adjuvans, může být vakcína podávána ve dvou částech. Například, část složení vakcíny, obsahující nukleotidový konstrukt, který kóduje antigen, může být podán jako např. subkutánní nebo intramuskulární injekcí nebo pomocí intradermálního částicí zprostředkovaného přenosu, poté později může být podána část složení obsahující adjuvans, a to buď ihned nebo po vhodné době, která bude zřejmá lékaři, jenž je obeznámen s vakcinací. Za těchto podmínek, může být adjuvans podáváno stejnou cestou jako antigenní směs nebo pozměněnou cestou. V další formě bude část adjuvans směsi podávána před antigenní částí. V jedné formě je adjuvans podáván jako lokální směs, aplikovaná na kůži v místě, kde částice zprostředkovává přenos nukleotidové sekvence, která kóduje antigen(y) , buď před nebo zprostředkovaného částicí.

po jeho přenosu

Následuj ící	Příklady	slouží pro	další objasnění	vynálezu,
s odkazy k	doprovodným	obrázkům, na	kterých:
Obrázek 1	ukazuj e	prototyp	aminokyselinových	sekvencí
	divokého	typu El	HPV typů 11,	6a a 6b,

odvozených z GenBank;

Obrázek 2 ukazuje prototyp aminokyselinové sekvence divokého typu El HPV6b z Obr.l (6b-el), porovnanou s aminokyselinovou sekvencí El HPV6b, včetně bodových mutací odstraňujících biologickou aktivitu (6b-el mut);

Obrázek 3 ukazuje aminokyselinové sekvence divokého typu

E2 HPV typů 11, 6a a 6b, odvozených z genové

Obrázek 4a

Obrázek 4b

Obrázek 5

Obrázek 6 banky;

ukazuje prototyp aminokyselinové sekvence divokého typu E2 HPV11 z Obr.3 (Hpv-lle2-wt) porovnanou s aminokyselinovou sekvencí E2 HPV11, včetně bodové mutace odstraňující biologickou aktivitu (Hpv-lle2-mut) a s aminokyselinovou sekvencí kódovanou nukleotidovou sekvencí z Obr. 6 (Hpv-lle2-comut);

ukazuje prototyp aminokyselinové sekvence divokého typu E2 HPV6b z Obr.3 (Hpv-6be2-wt), porovnanou s aminokyselinovou sekvencí E2 HPV6b, včetně bodové mutace odstraňující biologickou aktivitu (Hpv-6be2-mut);

ukazuje nukleotidovou sekvence, která má profil využívání kodonů podobající se profilu silně exprimujícího lidského genu, kódující mutovanou aminokyselinovou sekvenci El HPV6b z Obr. 2; ukazuje nukleotidovou sekvence, která má profil využívání kodonů, podobající se profilu silně • · · · ···« • · • · · · 99999·· ·

Obrázek 7 Obrázek 8

Obrázek 9

Obrázek 10 exprimujícího lidského genu, kódující mutovanou aminokyselinovou sekvenci E2 HPV11 z Obr. 4; ukazuje DNA vektor p7313-PLc;

ukazuje vzorky buněčného lyzátu z Příkladu 4, rozdělené na akrylamidovém gelu a barvené tak, aby se ukázala vazba protilátky k exprimovanému El proteinu;

ukazuje buněčné odezvy na antigen po imunizaci myši polynukleotidem podle vynálezu (Příklad 6);

a ukazuje vzorky buněčného lyzátu z Příkladu 7, rozdělené na akrylamidovém gelu a barvené tak, aby se ukázala vazba protilátky k exprimovanému proteinu E2.

Příklad 1 - Optimalizace kodonů El HPV6b

Aminokyselinová sekvence prototypu divokého typu El HPV6b získaná z GenBank je předložena na Obr.l (spodní sekvence). Tento obrázek ukazuje vysoký stupeň homologie pro tento protein mezi sekvencemi virových prototypů HPV typů 11, 6a a 6b. Podobně jsou na Obr. 3 ukázány prototypové aminokyselinové sekvence divokého kmene proteinu E2 HPV 11, 6a a 6b. Očekává se, že imunitní terapie (terapeutická vakcína) použitím sekvencí HPV6b bude křížově reagovat za poskytnutí profylaktické nebo terapeutické imunitní odezvy proti všem třem typům viru.

Využití kodonů sekvence El HVP6b bylo porovnáno s využitím vysoce exprimovaných lidských a E.coli genů a bylo zjištěno, že má nízký koeficient využití kodonů pro oba druhy. Jednoduché použití nejčastějšího kodonů pro každý aminokyselinový zbytek by také vedlo ke zkreslenému profilu využití kodonů, protože žádný organismus nevyužívá pouze svůj nejpřednostnější kodon pro danou aminokyselinu. Následně byly • · • · · · • · · · · · • · · · · · · · • · · · ······· · kodony přiřazeny použitím statistického způsobu za vytvoření syntetického genu, který má frekvenci kodonů blíže té, která byla nalezena v silně exprimovaných E.coli a lidských genech.

Kodony v syntetickém genu byly přiřazeny použitím Vizuálního základního programu (Visual Basic program) nazvaného Calcgen, který napsal R. S. Hale a G. Thompson (Protein Expression and Purification Sv. 12 str. 185-188 (1998)). Pro každý aminokyselinový zbytek v původní sekvenci byl přiřazen kodon na základě pravděpodobnosti jeho výskytu v silně exprimovaných E.coli genech. Podrobnosti o tomto programu, který pracuje pod Microsoft Windows 3.1, mohou být získány od autorů. Protože program pro přiřazení kodonů v syntetickém genu aplikuje statistický způsob, ne všechny výsledné kodony jsou nejfrekventovaněji využívané v cílovém organismu. Spíše je podíl často a méně často využívaných kodonů cílového organismu zobrazen v syntetické sekvenci přiřazením kodonů ve správném poměru. Jelikož zde však neexistuje žádné přísné pravidlo pro přiřazení konkrétního kodonů na konkrétní místo v sekvenci, je pokaždé, když je spuštěn tento program, vytvořen jiný syntetický gen - ačkoliv každý bude mít stejný profil využití kodonů a každý bude kódovat stejnou aminokyselinovou sekvenci. Je-li tento program spuštěn několikrát pro danou aminokyselinovou sekvenci a daný cílový organismus bude vytvořeno několik odlišných nukleotidových sekvencí, které se mohou lišit v počtu, typu a poloze restrikčních míst, signálů pro sestřih intronu atd., z nichž některé mohou být nežádoucí. Ten, kdo je orientovaný v oboru bude na základě těchto vlastností, schopen vybrat vhodnou sekvenci pro použití pro expresí polypeptidů.

Kromě toho, jelikož jsou kodony přiřazeny náhodně na základě statistiky, je možné (ačkoli nepravděpodobné), že dva nebo více kodonů, které jsou relativně zřídka využívány v cílovém

A A · • · · · • · A · I

A A A A AA« organismu, mohou být seskupeny v těsné blízkosti. Má se za to, že taková seskupení mohou narušit translační aparát a mít za následek zejména nízké rychlosti exprese, takže algoritmus pro výběr kodonů v optimalizovaném genu vylučuje jakékoliv kodony s RSCU hodnotou, nižší než 0,2 pro silně exprimované geny, aby se zabránilo náhodnému vybrání jakémukoliv seskupení zřídka využívaných kodonů. Rozdělení zbylých kodonů bylo poté přiděleno podle frekvencí u silně exprimovaných genů E.coli, za vytvoření celkového rozdělení v syntetickém genu, které se podobá rozdělení genů v E.coli (koeficient = 0,85) a také rozdělení silně exprimovaných lidských genů (koeficient ’= 0,50). Podobný postup byl použit pro získání nukleotidové sekvence s optimalizovanými kodony pro E2 HPVll, kromě toho, že byl použit Syngen (Peter Ertl, nepublikováno), novější verze programu Calcgen, dovolující volitelné vyloučení zřídka využívaných kodonů, pro přiřazení kodonů podle profilu frekvence kodonů silně exprimovaných lidských genů. Na rozdíl od přiřazení kodonů pro El, zřídka využívané kodony nebyly vyloučeny. Současně byla také provedena změna v jednom z oligonukleotidů, taková, aby kódoval aminokyselinovou změnu K111A, jak je popsáno níže.

Mutace byly vloženy do El a E2 genů s optimalizovanými kodony, za vzniku bodových mutací v aminokyselinových sekvencích El (K83G, R84G a G483D) a E2 (K111A). Aminokyselinové sekvence mutovaných genů jsou ukázány (porovnány s prototypem sekvence divokého typu) na Obr. 2 (HPV6bEl) a 4 (HPV6bE2 a HPV11E2) .

Nukleotidová sekvence s optimalizovanými kodony mutovaná nukleotidová sekvence pro El HPV6b je ukázána na Obr. 5. Nukleotidová sekvence s optimalizovanými kodony a mutovaná nukleotidová sekvence pro E2 HPVll je ukázána na Obr. 6. Obr. 4 také ukazuje aminokyselinovou sekvenci polypeptidů, získaného expresí genu s optimalizovanými kodony a mutovaného genu E2 HPVll, v porovnání s prototypem sekvence divokého typu • *·· • « · · · · · • · · · · · · • · · · ······· a mutovaných sekvencí divokého typu, aby bylo zřejmé, že nukleotidová sekvence s optimalizovanými kodony nemění kódovanou aminokyselinovou sekvenci (která je , identická s mutovanou sekvencí divokého typu).

Příklad 2 - Příprava polynukleotidové sekvence El HPV6b s optimalizovanými kodony

Návrh genu:

Použitím softwaru pro optimalizaci, diskutovaného výše, byly z optimalizovaných sekvencí vypočteny 40merní překrývající se oligonukleotidy. Terminální restrikční místa, byly 60méry.

oligonukleotidy, obsahující Oligonukleotidy byly objednány od Life Technologies Ltd v 50 nmol koncentraci, nechráněné a nefosforylované.

Příprava oligonukleotidů:

Každý oligonukleotid byl rozpuštěn v dvakrát destilované vodě na finální koncentraci 100 mikromolární(μΜ) a byla připravena ekvimolární směs všech 96 oligonukleotidů o 100 μΜ koncentraci. Syntéza byla připravena následovně použitím Pwo polymerasy od Roche Boehringer (Kat č. 1 644 955).

Dvakrát destilovaná voda Pwo 10X pufr

Směs dNTP směs oligonukleotidů Pwo polymerasa

6μ1

10μ1

Ιμΐ (ekvimolární směs lOOmM dNTP) Ιμΐ(ekvimolární směs 100μΜ oligo) 2μ1

Polymerasová řetězová reakce (PCR) byla provedena s výše uvedenou reakční směsí v Trio Thermoblock (Biometra), použitím následujících podmínek:

1. 40°C 2 minuty • · · ·

2.	72°C	10	sekund
3.	94°C	15	sekund
4 .	40°C	30	sekund
5.	72°C	20	sekund + 2 sekundy na c\
6.	4°C	OO
Cyklus	se opakoval	25 krát mezi kroky 3 a 5

Po dokončení 25 cyklů byl z každé nádobky odebrán 10μ1 alikvot a byl analyzován na 0,8% Tris acetátovém (TAE) agarosovém gelu a vyhodnocen pod UV světlem při dlouhé vlnové délce. Očekávaná velikost syntetizované El DNA by měla být přibližně 2kb.

Získání genu:

Syntetický gen byl získán PCR použitím polymerasv použitím dvou terminálních oligonukleotidů, které obsahovaly restrikční místo pro Not 1 na N-konci syntetického oligonukleotidu a Bam HI místo na C-konci syntetického oligonukleotidu.

Dvakrát destilovaná voda

Pwo 10X pufr

Směs dNTP

Sestavená směs

N-koncový oligonukleotid C-koncový oligonukleotid

Pwo	polymerasa
1.	94°C	45 sekund
2.	72°C	2 minuty +
3.	72°C	10 minut
4 .	4°C	co

minuta na 500bp

Cyklus se opakuje 25krát mezi kroky 2 a 1.

65μ1

10μ1

Ιμΐ (ekvimolární směs lOOmM dNTP) 20μ1 (z předchozího PCR)

Ιμΐ (ΙΟΟμΜ)

Ιμΐ (ΙΟΟμΜ)

2μ1.

·· ··· ·

PCR produkt byl poté purifikován použitím QIAquick PCR purifikačního kitu (Qiagen kat. č. 28104), a DNA byla resuspendována v celkovém objemu 50 μΐ elučního pufru použitého kitu. 10 μΐ alikvot byl štěpen restrikčními enzymy Not 1 a BamHl (od Life Technologies Ltd, 3 Fountain Drive, Inchinnan Business Park, Paisley, Scotland) 2 hodiny při 37°C. Toto štěpení bylo purifikováno na 0.8% TAE agarosovém gelu a 2kb DNA produkt byl vyřezán a extrahován použitím QIAquick Gel extraction Kit (Qiagen kat.č.287 04) . Finální naštěpený čistý DNA fragment byl eluován celkovým objemem 50μ1 elučního pufru použitého kitu.

Tento PCR fragment byl klonován do vektoru p7313PLc (Obr. 7), (Powderject Vaccines Inc., viz další podrobnosti níže) a transformován do kompetentních buněk JM109 (Promega kat.č.: P9751). DNA plasmid z vybraných klonů byl zkontrolován štěpením restrikčními enzymy Ncol-BamHl a Ncol-EcoRl. Bylo vybráno pět správných klonů s 2kb fragmentem inzertu a inzert DNA byl sekvenován. Pro další použití byl vybrán jeden klon s inzertem obsahujícím tří bodové mutace. Tři bodové mutace byly opraveny výměnnou ligací s homologními malými fragmenty z jiných klonů.

Opravené klony byly znovu zkontrolovány štěpením restrikčním enzymem a DNA inzert byl celý sekvenován. Tento klon byl označen p6bElc/o. Současně, pro porovnání exprese a pro imunizační studie byly PCR amplifikovány El gen HPV-6b divokého typu a El gen HPV-11 divokého typu, použitím genomových klonů HPV-6b, (EMBO J. 2 (12) 2314-2318 1983) a

HPV-11 (Virology 151, 124-130 1986), a příslušné fragmenty byly klonovány do vektoru p7313PLc štěpeného Not 1 -BamHl. První z těchto klonů byl označen jako p6bElw/t a druhý pllElw/t.

• ·♦ · • 4 ··· ·

El geny v klonech p6bElc/o a p6bElw/t byly dále mutovány tak, aby vytvořily aminokyselinové záměny K83G, R84G a G438D. V PCR reakcích byly spolu s dalšími reagenciemi popsanými v QuickChange Site-Directed Mutagensis Kitu (Stratagene kat.č. 200518) použity 3' a 5' oligonukleotidové primery odpovídajících sekvencí s nukleotidovými substitucemi navrženými pro zavedení žádaných mutací. Mutovaný klon p6bElc/o byl označen p6bElc/o mut a mutovaný klon p6bElw/t byl označen p6bElw/t mut.

Příklad 3 - Příprava polynukleotidové sekvence E2 HPV11 s optimalizovanými kodony

Návrh, příprava a získání genu E2 s optimalizovanými kodony byly popsány výše pro El, ale překrývající se oligonukleotidy byly 60 nukleotidů dlouhé místo 40, s 18 nt překryvem. Na rozdíl od postupu El byl vytvořen klon obsahující aminokyselinovou mutací K111A současně s klonem genu E2 s optimalizovanými kodony, nahrazením dvou vhodných oligonukleotídů o sekvenci divokého typu dvěma 60 merními oligonukleotidy, které společně obsahují nukleotidovou substituci nutnou pro vytvoření změny K111A.

Složení plasmidu p7313-PLc

Plasmid byl vytvořen nahrazením genu beta-laktamasy, obsahujícího Eamll051 - Pstl fragment pUC19 (dostupný od Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd., Amersham Plače, Little Chalfont, Bucks, HP7 9NA) EcoRI fragmentem pUC4K (AmershamPharmacia), obsahujícím gen pro rezistenci ke kanamycinu, následovaném použitím T4 DNA polymerasy pro vytvoření tupých konců na obou fragmentech. Lidský cytomegalovirový IE1 promotor/enhancer, Intron A, byl odvozen z plasmidu JW4303, získaného od Dr. Harriet Robinsona, University of Massachusetts, a vložen do Sall místa v pUC19 jako Xhol -Sall fragment, ínkorporujícího polyadenylační signál hovězího ·· 4 444 »4 4

4444 4 4 • · · růstového hormonu. Delece 5' Sall-BanI fragmentu z promotoru vytvořila minimální promotor použitý ve vektoru (WOOO/23592 Powderject Vaccines lne.). 3'UTR povrchového antigenu HBV byl odvozen z Hepatitis B viru, serotyp adw, ve vektoru ρΑΜβ (Moriarty a kol., Proč.Nati.Acad.Sci. USA, 78, 2606-2610, 1981). pAM6 (vektor založený na pBR322) byl získán od American Type Culture Collection, katalogové číslo ATCC 45020. 3'UTR byl vložen na 5' konec polyadenylačního signálu jako l,4kb BamHI fragment, pro vložení byl zatupen, aby se odstranila BamHI místa. V řadě kroků (včetně štěpení Bgl II, úpravy Klenowovou polymerasou, štěpení BstX I, štěpení Nco I, úpravy Mung beán nukleasou pro odstranění přečnívajícího konce a dalšího štěpení BstX I) byly vytvořeny modifikace v oblasti mezi 3'netranslatované enhancerové oblasti HBV S genu a bGHpA signálu pro odstranění všech otevřených čtecích rámců, větších než 5 kodonů mezi promotorem X genu a bGHpA signálem. Toto má za výsledek deleci sekvence kódující translatovatelnou část proteinu X (9 aminokyselin) a iniciačního kodonu genu X. Byla však ponechána oblast slabého enhanceru/promotoru, protože bylo zjištěno, že tato oblast zvyšuje expresi HBsAg z CMV promotoru. Polyadenylační signál hovězího růstového hormonu byl nahrazen polyadenylačním signálem králičího beta globínu. 5'nekódující a kódující sekvence S antigenu byly odstraněny a nahrazeny oligonukleotidovým linkerem za poskytnutí vícenásobných klonovacích míst, jak je ukázáno, za vytvoření plasmidu p7313-PL.

Hind —Notl— -EcoRV -Ndel- -BamHIAGCTTGCGGCCGCTAGCGATATCGGTACCATATGTCGACGGATCC .... ....ACGCCGGCGATCGCTATAGCCATGGTCTACAGCTGCCTAGGCCGG

-Nhel- -KpnI- -Sáli- ANotl

·· ♦ ·· ···· • · « « · · ♦ · · · · · · • · ·····«· · · • · · · · · · ·* · ·· ··

Sekvence ColEl cer byla získána ze subklonu z plasmidu pDAH212 od David Hodgeson (Warwick University) a amplifikovaná pomocí PCR použitím primerů pro vytvoření restrikčních míst EcoRI na koncích sekvence. Sekvence cer byla poté vložena do EcoRI místa p7313-PL za vytvoření plasmidu p7313-^PLc (Obr. 7). Sekvence amplifikovaného ceru byla ověřena s genovou bankou entry M11411.

Příklad 4 - Exprese El v savčích 293T buňkách

Savčí 293T buňky rostly do logaritmické fáze do finální koncentrace 2X10⁵ buněk na 6 jamkové misce Corning Costar™ (Corning Science Products, 10 The ValleyCentre, Gordon Road,

High Wycombe, Bucks, UK) pro tkáňové kultury přes noc při 37°C v 5%CO₂. Byla připravena následující transfekční směs a pro vytvoření byla ponechána 25 minut:

2μς plasmidové DNA (vektor, p6bElc/o, p6bElw/t) v 16μ1 sterilní dvakrát destilované vodě plus:

OPTI-mem™ (Gibco BRL, Paisley, Scotland) 8μ1

Lipofectamine™ (GibcoBRL) 6μ1.

Každá buněčná monovrstva byla pečlivě promyta dvakrát OPTImem™. Ke každé jamce bylo přidáno 800μ1 OPTI-mem™. Ke každé transfekční směsi bylo přidáno 200 μΐ OPTI-mem™, směs byla promíchána a opatrně přidána k buněčné monovrstvě. Miska byla inkubována 5 hodin při 37 °C v 5% CO₂ a po této inkubaci byly transfekční směs a OPTI-mem™ odstraněny. Buněčné monovrstvy byly dvakrát opatrně promyty buněčným růstovým médiem a nakonec byly transfekované buňky inkubovány 24 hodin v Dulbecco Modified Eagle Mediu, obsahujícím 10% fetální telecí sérum a 29,2mg/ml L-glutaminu, pří 37 °C v 5% CO₂. Buňky byly seškrábnuty do mikrozkumavek, dvakrát promyty PBS, odstředěny a buněčná peleta byla resuspendována v Laemmliho barvičce pro •9 *999 • 9 · ·· 9999

SDS Page. Buněčné pelety byly povařeny a naneseny na 10% SDS Page gel a elektrof oréza probíhala v IX Tris Glycinovém SDS pufru. Po elektroforéze byl gel přenesen na nitrocelulosovou membránu (Amersham) a byl proveden Western blot. Nitrocelulosová membrána byla blokována 5% Marvel™ (Premier Beverages, Knighton, Adbaston, Stafford, UK) v PBS po 30 min při laboratorní teplotě a dvakrát promyta PBS a. 0,1% Tweenem 20. K nitrocelulosové membráně byla přidána polyklonální protilátka, připravená proti C terminální sekvence proteinu El HPV6b (proteinová sekvence: CSSSLDIQDSEDEEDGSNSQAFR) v králících, která byla naředěna v 5% Marvel™ v PBS. Membrána byla inkubována při laboratorní teplotě 1 hodinu za mírného třepání. Zředěná protilátka byla odstraněna a membrána byla třikrát promyta PBS a 0,1% Tweenem 20. Sekundární konjugát, prasečí proti králičí s křenovou peroxidasou (HRP) (DAKO), byl naředěn 1:20000 v PBS a 0,1% Tweenu 20, Toto bylo přidáno k promyté membráně a inkubace byla prováděna 1 hodinu při laboratorní teplotě za mírného třepání. Poté byla membrána pečlivě promyta PBS a 0,1% Tweenem 20. Pro detekci přenesených proteinů na membráně byl použit chemiluminiscenční HRP kit (Amersham).

Výsledky:

Předpovídaná velikost pro translatovaný El protein je 68kDa 72kDa. Výsledky (Obr. 8) ukazují správnou velikost proteinu, exprimovaného pomocí p7313-PLc, obsahujícího HPV6bEl s optimalizovanými kodony (dráha 4). Vektor obsahující El divokého typu je v dráze 3, která ukazuje, že zde nebyla žádná detekovatelná exprese El v lidských buňkách z nukleotidové sekvence divokého typu. Podobně nebyl El detekován v dráze 2 (prázdný vektor ) a dráze 1 (netransfekované buňky). Přibližně 60kDa zóna v drahách 1-4 je neindentifikovaný buněčný protein, který křížově reaguje s protilátkou proti El. Tato zóna je ve ·99·

9 • · · 9 9 9 * · 9 9 9 9 • 9999 999 • · 9 9 · 9

9 9 9 ·9 99 9 všech drahách v téměř konstantní intenzitě, což ukazuje, že nanáška vzorků byla stejná.

99 9

Příklad 5 - Příprava rekombinantního vakcinia viru, exprimujícího HPV El a HPV E2 proteiny.

Vakcinia virus exprimující HPV-6b El protein byl vytvořen v Glaxo Wellcome, Stevenage, UK. Vakcinia viry exprimující HPV11 El a HPV-11 E2 byly darovány Jeffem Englerem, University of Alabama at Birmingham, US.

kontrolována antiséra po

Krátce, El gen z p6bElw/t byl klonován do vektoru pTM3 vakcinia viru, který byl poté zkontrolován restrikčním enzymem a po sekvenování DNA byl rekombinantni vektor použit pro transfekci HTk~ buněk, Rekombinantni vakcinia virus byl izolován a purifikován pomocí plaků. Exprese El byla pomocí Western blotu použitím peptidového infekci permisivních buněk pomocí obou, jak rekombinantního viru exprimujícího HPV-6b El, tak i vakcinia viru (vTF7-3) exprimujícího RNA polymerasu bakteriofága T7. Pro přímou expresi El a E2 proteinu z HPV-11 El a E2 rekombinantních vakcinia virů je také nezbytná koinfekce buněk s vakcinia virem vFT7-3. Jako negativní kontrola byl v pokusech použit vakcinia virus kmene WR. Vektor pTM3 a virus VTF7-3 byly z National Institute of Health, Maryland,

US.

Příklad 6 - Imunologie - detekce buněčných odezev na HPV antigeny

Všechna činidla byla získána od Gibco BRL, Paisley, Scotland nebo Sigma, Poole, Dorset, pokud není uvedeno jinak.

A. Imunizační protokol.

Samičky myší C57BL/6 byly imunizovány 1,0-2,0 pg DNA (buď p6bElc/o, p6bElw/t, p6bElc/o mut, p6bElw/t mut nebo prázdným ·· ···· ·· ···· plasmidem p7313PLc) pomocí PMDD a boosted stejnou dávkou o 14 dní později. Zvířata byla usmrcena narušením děložního hrdla a odstraněním sleziny pro zjištění buněčných odezev na HPV antigeny.

B. Příprava buněčné suspenze splenocytů.

Sleziny byly rozmačkány mezi podložními sklíčky (BDH), červené krvinky byly lyžovány (155 mM NH4CI, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA) a buňky byly resuspendovány v kompletním RPMI. (RPMI-1640 medium doplněno o 10% fetální telecí sérum (FCS), 2mM glutamin, 100 jednotek/ml penicilín, 100 μρ/ml streptomycin a 5 x 10”⁵ M 2-merkaptoethanol) .

C. Infekce MC57 cílových buněk.

Imunodominantní epitopy odvozené z HPV antigenů nebyly definovány a proto detekce antigen specifických odezev in vitro závisela na přirozeném štěpení celého antigenů, dosaženého v cílových buňkách, které byly transfekovány cDNA kódující celý protein(y). MC57 buňky (K^b pozitivní) byly infikovány rekombinantním vakcinia virem exprimujícím HPV-6b El, HPV-11 E2 nebo HPV-11 El použitím četnosti infekce 5 po 1 hodinu při 37°C. Přebytek viru byl odmyt a buňky byly resuspendovány v kompletním RPMI obsahujícím 50ng/ml rekombinantního lidského IL-2 (Glaxo Wellcome, Geneva).

L·. ELISPOT.

ELISPOT misky (96 jamkové, Millipore MAIP S 45 1 0) byly potaženy krysí proti myší IFN gama (Pharmingen 18181D) 15 μς/πΐ v PBS přes noc (4°C) před přidáním 4 x 1CT⁵ splenocytů, získaných od experimentálních skupin. Antigen byl prezentován přídavkem 1 x 10^-4 MC57 buněk infikovaných rekombinantním vakcinia virem. Jako negativní kontrola byl použit vakcinia • ·*«· « · • · · • · ···· ··

virus divokého typu kmen WR. Stanovení bylo inkubováno přes noc při 37°C(5% CO₂) .

Druhý den stanovení byly detekovány buňky tvořící skvrny použitím biotinylované krysí proti myší IFN gama (Pharmingen 18112D) lpg/ml následovaným přídavkem konjugátu streptavidinu s alkalickou fosfatasou (TCS Biologicals SA 1008) v ředění 1/1000 v PBS. Tato reakce byla vizualizována pomocí soupravy substrátu pro alkalickou fosfatasu (Biorad 170-6432) a kvantifikována pomocí analýzy obrazu. Výsledky jsou ukázány na Obr. 9.

Jak je zřejmé z Obr. 9, byla silná buněčná odezva pozorována u všech tří myší, vakcinovaných plasmidem kódujícím sekvenci El HPV-6b s optimalizovanými kodony, když byly vystaveny El, obsaženému ve vakcinia vektoru (vacc.El(11) nebo vacc.El(6b)). Žádná odezva nebyla pozorována, když byly tyto myši vystaveny vakcinia viru divokého typu (vacc.WT), nebo s vakcinia virem exprimujícím E2 HPV-11 (vacc.E2(11)). Naproti tomu, vakcinace myší plasmidem, kódujícím sekvenci El divokého typu nevedla k odezvě T-buněk. Splenocyty z těchto myší nereagují na vystavení vakcinia virem, nesoucím gen El, ani na jakékoliv další jiné vystavení (data nejsou ukázána). Mutace genu El buněčnou odezvu v myších nezmění. Jelikož se u myší imunizovaných p6bEl c/o a p6bElc/o mut také zvýšily silné buněčné imunitní odezvy proti cílovým buňkám infikovaným vakcinia virem exprimujícím protein El z HPV-11, můžeme předpokládat, že zde existuje vysoký stupeň imunologické křížové reaktivity mezi HPV-6b El a HPV-11 El. Myši vakcinované prázdným vektorem p7313-PLc nevykázaly žádnou odezvu na jakékoliv vystavení.

Příklad 7 - Exprese E2 HPV 6b v savčích 293T buňkách »· ···· * * · · « » * · ··*· vé • ··· ·«·«»·· M

·.·· ·· t · »

	42	9·99 99	·♦ ♦ ·»
293T buňky v jedné vrstvě	(80%	konfluentní) ve	24	j amkových
miskách byly transfekovány	ΐμς	každého z plasmidu	(p6bw/t,
p6bc/o, p6bw/t mut, p6bc/o	mut)	použitím 2,5μ1	Lipofectaminu

2000 (Life Technologies) na transfekci, prováděnou podle standardního protokolu (viz Příklad 4, výše). 24hodin po transfekci byly buňky sklizeny, promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a analyzovány SDS-PAGE a Western blotem použitím antiséra proti peptidů E2 (#1100), připraveného proti N terminální aminokyselinové sekvenci MEAIAKRLDACQEQLLELYEEC HPV-6b (Obr. 10) .

Výsledky

Výsledky ukazují hlavní proteinovou zónu s očekávanou velikostí (40kDa - 45 kDa) v dráze 3 (E2 s optimalizovanými kodony) a dráze 5 (E2 mutovaná a s optimalizovanými kodony). Slabá zóna stejné velikosti je také v dráze 4, což naznačuje velmi slabou hladinu exprese z plasmidu kódujícího mutovaný E2 divokého typu, ale není v dráze 1 (negativní kontrola) nebo v dráze 2 (protein E2 divokého typu). Ve všech drahách je patrný křížově reagující protein o ~25kDa, což ukazuje rovnoměrné nanesení vzorků proteinových lyzátů. Mutace E2 zjevně neovlivnila expresi proteinu E2, která byla značně zlepšena optimalizací kodonů.

Claims (28)

1. Polynukleotidová sekvence kódující aminokyselinovou sekvenci časného antigenu HPV nebo jeho fragmentu lidského papilomaviru, mající koeficient využití kodonů vyšší než 0,3 ale nižší než 1,0 pro lidský gen a schopné vyvolat imunitní odezvu k řečenému časnému antigenu in vivo.

2. Polynukleotidová sekvence podle jakéhokoliv z nároku 1, kde sekvence je DNA.

3. Polynukleotidová sekvence podle nároku 1 nebo 2, která kóduje polypeptid HPV typu nebo subtypu HPV, spojeného s rakovinou děložního hrdla, benigními kožními bradavicemi nebo bradavicemi na pohlavních orgánech.

4. Polynukleotidová sekvence podle nároku 3, která kóduje polypeptid HPV jednoho z typů 1-4, 6, 7, 10, 11, 16, 18, 26-29, 31, 33, 35, 39, 49, 51, 52, 56, 58, 59, a 68.

5. Polynukleotidová sekvence podle nároku 4, která kóduje polypeptid HPV typu nebo subtypu HPV, spojeného s rakovinou děložního hrdla nebo bradavicemi na pohlavních orgánech.

6. Polynukleotidová sekvence podle nároku 5, která kóduje polypeptid HPV jednoho z typů 6, 11, 16, 18, 33 nebo 45, nebo fúzi dvou nebo více typů virů HPV 6, 11, 16, 18, 33 nebo 45.

• · · · • · • ·

7. Polynukleotidová sekvence podle nároku 5, která kóduje

polypeptid HPV typu nebo subtypu HPV vybraného z HPV 11, 6a nebo 6b. 8. Polynukleotidová z předcházejícího sekvence nároku, která podle jakéhokoliv kóduje mutovaný

polypeptid HPV mající sníženou biologickou funkci.

9. Polynukleotidová sekvence podle nároku 7, která kóduje mutovaný polypeptid HPV, obsahující jednu nebo několik

bodových mutací, pomocí nichž je jedna nebo více přirozených biologických funkcí polypeptidu inaktivována. 10. Polynukleotidová sekvence podle jakéhokoliv

z předcházejícího nároku, ve kterých kódovaný polypeptid HPV obsahuje celý produkt nebo část produktu časného genu HPV.

11. Polynukleotidová sekvence podle nároku 9, ve které kódovaný polypeptid HPV obsahuje celý nebo část El nebo E2, nebo fúzi celého nebo části El nebo E2 s jiným polypeptidem HPV.

12. Polynukleotidová sekvence podle jakéhokoliv z předcházejícího nároku, mající koeficient použití kodonů pro lidské geny vyšší než 0,4, ale menší než 1.

13. Polynukleotidová sekvence podle nároku „ 15, mající koeficient použití kodonů pro lidské geny vyšší, než 0,5 ale menší než 1.

• · • · · · • · · ·

Polynukleotidová z předcházejícího kodonů pro geny E sekvence nároku, mající coli vyšší než 0,6 podle jakéhokoliv koeficient použití

15. Polynukleotidové sekvence fragment nebo její analog, využití kodonů. ukázaná který na Obr. zachovává 5 nebo její její profil 16. Polynukleotidová sekvence ukázaná na Obr. 6 nebo její fragment nebo její analog, který zachovává její profil využití kodonů.

17. Expresní vektor obsahující polynukleotidovou sekvenci podle jakéhokoliv z předcházejícího nároku, funkčně spojeného s kontrolní sekvencí, která je schopna poskytnou expresi polynukleotidové sekvence hostitelskými buňkami.

18. Expresní vektor podle nároku 17, který je schopen řídit expresi polynukleotidové sekvence v bakteriálních, hmyzích nebo savčích buňkách.

19. Expresní vektor podle nároku 17 nebo nároku 18, který je p7313PLc.

20. Hostitelské buňky obsahující polynukleotidovou sekvencí podle jakéhokoliv z nároků 1-16.

21. Hostitelské buňky obsahující expresní vektor podle jakéhokoliv z nároků 17-19.

22. Hostitelské buňky, podle nároku 20 nebo nároku 21, které jsou bakteriální, savčí nebo hmyzí buňky.

• · · ·

23. Farmaceutická směs obsahující polynukleotidovou sekvenci podle jakéhokoliv z nároků 1-16.

24. Farmaceutická směs obsahující vektor podle jakéhokoliv z nároků 17-19.

25. Farmaceutická směs podle nároku 23 nebo nároku 24, obsahující rozmanitost částic, výhodněji zlaté částice, potažené DNA.

Farmaceutická farmaceuticky vektor.

směs podle nároku 24, obsahující přijatelnou excipientní látku a DNA

Farmaceutická směs podle jakéhokoliv dále obsahující adjuvans.

z nároků 23-26,

28. Farmaceutická směs podle nároku 27, ve které je adjuvans kódováno ve fúzi s polypeptidem HPV, kódovaným polynukleotidem.

29. Použití polynukleotidu podle jakéhokoliv z nároků 1-16 při léčbě nebo prevenci infekce HPV.

30. Použití vektoru podle jakéhokoliv z nároků 17-19 při léčbě nebo prevenci infekce HPV.

31. Použití složení vakcíny podle jakéhokoliv z nároků 23-28 při léčbě nebo prevenci infekce HPV.

32. Použití podle jakéhokoliv z nároků 29-31, ve kterých je infekce HPV infekcí HPV typů 6, 11, 16 nebo 18.

• · · · • · · · · ·· · • · ···· · · · • · · · ······· · φ ··· ··· · · · φ

47 .............

33. Použití polynukleotidu podle jakéhokoliv z nároků 1-16, vektoru podle jakéhokoliv z nároků 17-19 nebo farmaceutické směsi podle jakéhokoliv z nároků 24-28 při léčbě nebo prevenci kožních bradavic, bradavic na pohlavních orgánech, atypických plochých buněk nedefinovaného významu (ASCUS), dysplasií děložního hrdla, intraepiteliální neoplasie děložního hrdla (CIN) nebo rakoviny děložního hrdla.

34. Způsob léčby nebo prevence infekcí HPV nebo jakýchkoliv symptomů nebo onemocnění s nimi spojených, zahrnující podávání účinného množství polynukleotidu podle jakéhokoliv z nároků 1-16, vektoru podle jakéhokoliv z nároků 17-19 nebo farmaceutické směsi podle jakéhokoliv z nároků 23-28.

35. Způsob léčby nebo prevence infekcí HPV nebo symptomů nebo onemocnění s nimi spojených, zahrnující podávání farmaceutické směsi podle jakéhokoliv z nároků 23-27 v dávkovačům režimu s první spouštěcí dávkou rekombinantním virovým vektorem nebo s nevirově-založeným systémem, obsahujícím polynukleotid podle jakéhokoliv z nároků 1-16.