ES2273411T3 - Uso de la esterilidad masculina en las plantas. - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a nuevos usos de la esterilidad del macho para mejorar las condiciones de cultivo de plantas transgénicas para el hombre y el medio ambiente.
Description
Uso de la esterilidad masculina en las
plantas.
La invención se refiere a nuevos usos de la
esterilidad masculina para limitar los riesgos vinculados a la
producción de plantas transgénicas para el hombre y el medio
ambiente.
Los beneficios del uso de plantas transgénicas
son muy prometedores. La transgénesis de genes de mamíferos a una
célula vegetal ofrece en particular una vía de producción en grandes
cantidades de nuevas proteínas recombinantes, a un costo de
producción reducido y sin riesgo de contaminaciones virales o
subvirales (priones).
Sin embargo, esos beneficios no deben hacer
olvidar los aspectos de índole ecológico vinculados a la producción
de plantas transgénicas, a los cuales el público es muy
sensible.
La Solicitante ha puesto a punto actualmente una
tecnología colocando la esterilidad masculina al servicio de una
"biotecnología verde", respetuosa de los aspectos ecológicos y
humanos.
Una posible mejora reside en el control de la
diseminación del transgén en el medioambiente.
El aislamiento espacial de las parcelas
cultivadas ya permite reducir el riesgo de "fugas" del transgén
pero este método está limitado y deviene problemático en relación
con la multiplicación de los productos.
El interés de métodos genéticos para aislar el
transgén y reducir el riesgo de "fuga" ha sido sugerido en un
artículo de Ellstrand en 1990. Entre numerosas propuestas de
soluciones ante el problema de "fuga" del transgén, Ellstrand
señala que podrían ser introducidos genotipos masculinos estériles,
o que un gen letal para el polen podría estar vinculado directamente
a un gen construido por ingeniería genética. Sin embargo, ningún
desarrollo técnico había sido puesto en práctica en este sentido.
Ahora bien, era imposible prever el éxito de la puesta en práctica
de tal desarrollo, en particular debido al número de parámetros
puestos en juego en las técnicas de ingeniería genética en las
plantas.
La Solicitante ha puesto a punto una tecnología
que permite impedir la diseminación del transgén por vía polínica y
por consiguiente su "fuga" hacia el medio ambiente, tecnología
según la cual una planta masculina estéril (artificial escogida
entre el maíz, la colza o el tomate, comprendiendo un gen de
esterilidad masculina artificial (gen AMS), en cuyo genoma es
integrado un transgén de interés cuya expresión no es impedida por
la presencia del gen AMS, es utilizada para evitar la diseminación
de dicho transgén.
El interés del control de la fertilidad
masculina es conocido para la producción de plantas híbridas que
implica el cruzamiento de dos descendencias diferentes.
Uno de los métodos para impedir la
auto-fecundación controlando la polinización es la
"castración" manual de los órganos masculinos de la planta.
Ciertas investigaciones son igualmente
realizadas para un control genético del desarrollo del polen.
La esterilidad masculina puede ser
"adquirida", es decir que es independiente de una manipulación
genética cualquiera por la vía del ADN recombinante. Se puede
distinguir la esterilidad masculina citoplásmica de la esterilidad
masculina nuclear (Williams, 1995). La esterilidad masculina
citoplásmica está vinculada a cambios en la organización y la
expresión del genoma mitocondrial, la esterilidad masculina nuclear
resulta de mutaciones en el genoma del núcleo de la célula.
La esterilidad masculina también puede ser
"artificial", es decir que es inducida por la expresión de un
gen que confiere la esterilidad masculina (gen AMS) que es insertado
ya sea en el genoma mitocondrial (esterilidad masculina
citoplásmica), ya sea en el genoma nuclear (esterilidad masculina
nuclear).
La solicitud internacional WO 96/04 393 describe
particularmente el uso de un gen de esterilidad masculino AMS como
secuencia que bloquea la expresión de un gen de interés al cual el
gen AMS está genéticamente vinculado, permitiendo evitar la
autopolinización de las plantas transformadas por estas
secuencias.
De acuerdo con la invención, dicha planta
masculina estéril artificial escogida entre el maíz, la colza o el
tomate utilizada para evitar la diseminación de un transgén de
interés integrado al genoma de dicha planta es portadora:
- -
- ya sea de una esterilidad masculina citoplásmica, de preferencia una esterilidad masculina artificial inducida por un transgén integrado en el genoma mitocondrial de dicha planta;
- -
- ya sea de una esterilidad masculina nuclear, de preferencia una esterilidad masculina inducida por un transgén insertado en un sitio no esencial del genoma nuclear de dicha planta.
\newpage
De manera preferencial, de acuerdo con la
invención, dicha planta puede haber sido convertida en masculina
estéril por la inserción, en un sitio no esencial del genoma
nuclear, de una secuencia que comprende un gen AMS y dicho transgén
de interés genéticamente vinculado.
El vínculo entre el gen de interés y el gen del
AMS tendrá como efecto prohibir su diseminación por vía polínica,
permitiendo así una multitud de producciones diferentes en un mismo
medio ambiente.
Además, no se debe temer la transferencia del
propio gen del AMS hacia las plantas de tipo silvestre porque no
será susceptible de ser retenido en el seno de una población
silvestre en la medida en que representa más una "carga
genética" que una ventaja selectiva cualquiera.
Por vínculo entre gen de interés y gen del AMS,
se entiende una distancia genética suficientemente débil como para
que las frecuencias de recombinación en el curso de la meiosis sean
despreciables.
Por transformación genética, se pueden
introducir en una planta dos e incluso tres genes cuyo vínculo
físico es absoluto.
La invención tiene igualmente por objeto una
planta transgénica, o parte de planta transgénica seleccionada entre
el maíz, la colza o el tomate, caracterizada porque; el transgén de
interés vinculado genéticamente a un gen de esterilidad masculina
artificial de dicha planta transgénica o de dicha parte de la planta
transgénica comprende un (gen AMS) asociado a elementos que permiten
su expresión en las células vegetales, en particular un promotor y
un terminador de transcripción, no siendo impedida la expresión de
dicho transgén por la presencia del gen AMS.
De acuerdo con la presente invención, se
entiende que la presencia de dicho gen AMS no impide la expresión de
dicho transgén de interés.
Por "parte" de planta transgénica, se
entiende en particular hojas, frutos, o células de plantas
transformadas genéticamente.
Según un modo de realización preferido de la
invención, la esterilidad masculina artificial puede ser conferida
por un gen constituido por una secuencia que codifica una proteína
susceptible de degradar los ARN celulares (RNAsa) bajo control de un
promotor antera específico tales como son descritos por PAUL W. y
otros (1992).
Esa RNAsa puede ser la Barnasa de Bacillus
amyloliquefaciens. El promotor ventajosamente puede ser el
promotor A9 de Arabidopsis thaliana específico del tapiz de
la antera.
Las plantas que expresan este gen quimérico
devienen incapaces de producir un polen viable debido a la
destrucción específica de las células del tapiz de la antera. Por lo
demás tales plantas son normales.
Ya que las plantas de acuerdo con la invención
son incapaces de producir polen viable, no existe ningún riesgo de
diseminación de los genes de esterilidad masculina y de interés por
el polen.
La multiplicación de esas plantas se hace
aportando polen proveniente de plantas no portadoras del gen de
interés de acuerdo con la invención.
En el caso del maíz, el cultivo de las plantas
transgénicas con vistas a la producción puede ser asegurado según un
esquema del tipo producción de semillas (4 ó 6 líneas femeninas
seguidas de 2 líneas polinizadoras). Las plantas utilizadas como
femeninas (plantas portadoras del gen de interés) son sembradas con
doble densidad. En tal esquema, el gen de interés está vinculado a
un gen de selección (por ejemplo, gen que confire una resistencia a
un herbicida), lo que permite luego, por un tratamiento con el
agente de selección (herbicida por ejemplo), eliminar otras plantas
menos las masculinas estériles. Entonces la recogida solamente se
hace en las líneas femeninas.
Para la producción final, puede igualmente ser
considerada una siembra de mezcla. En ese caso, la línea
polinizadora no es portadora del gen de interés y es utilizada como
mezcla (10%) con la línea utilizada como femenina. La siembra es
realizada con doble densidad. En este caso, el campo es recogido en
su totalidad.
Según otro modo de realización de la invención,
se utiliza la esterilidad masculina citoplásmica para limitar la
diseminación de un transgén integrado en el genoma de una
planta.
Las plantas portadoras de una esterilidad
masculina citoplásmica son afectadas en su genoma mitocondrial, lo
que las vuelve no aptas para la producción de polen en ausencia de
los genes nucleares de restablecimiento. Esa esterilidad masculina
puede ser "adquirida", o provocada artificialmente por la
inserción en el genoma mitocondrial de un gen que confiere la
esterilidad masculina citoplásmica (gen CMS), por ejemplo el gen
Ogura.
Tales plantas son habitualmente utilizadas por
los establecimientos de semilleros para facilitar su producción de
semillas. Una parte importante de la producción de semillas de maíz
se basa, por ejemplo, en Europa, en el uso de una esterilidad
masculina citoplásmica llamada de tipo C.
Según un modo de realización preferido de la
invención, se introduce un transgén por retrocruzamiento en una
descendencia de planta, en especial de maíz, portadora de una
esterilidad masculina citoplásmica. En este caso la planta masculina
estéril es utilizada como ascendente femenino. Dos retrocruzamientos
sucesivos seguidos de evaluaciones y selecciones en la descendencia
permiten alcanzar el estado homocigoto para ese transgén.
En ausencia del gen nuclear de restablecimiento
(gen Rf4 para el citoplasma C), la planta portadora del transgén
será por consiguiente convertida en masculina estéril. Por
consiguiente, ningún grano de polen portador de un transgén será
emitido al medio ambiente. Si la planta es homocigoto para el
transgén, todos los granos recogidos son portadores del gen y por
consiguiente expresan el fenotipo.
El cultivo de esas plantas con vistas a la
producción es realizado cultivando plantas polinizadoras próximas a
plantas transgénicas masculinas estériles. Esto puede ser logrado ya
sea por mezcla de semillas (10% de polinizador es suficiente), ya
sea por una alternancia de líneas femeninas (masculinas estériles) y
de líneas polinizadoras. En este último caso, solo son recogidas las
femeninas.
La invención tiene igualmente por objeto un
procedimiento de producción de un producto de expresión de un
transgén de interés caracterizado porque comprende:
- a)
- -
- ya sea la transformación de células vegetales de maíz, de colza o de tomate, con la ayuda de un hospedero celular tal como es definido anteriormente, el mismo transformado por un vector que contiene un transgén de interés asociado a elementos permitiendo su expresión en las células vegetales, vinculado genéticamente a un gen AMS asociado a elementos permitiendo su expresión en las células vegetales, no impidiendo la presencia de dicho gen AMS la expresión de dicho transgén de interés de manera que integre en el genoma de esas células un gen AMS vinculado genéticamente a un transgén de interés;
- -
- ya sea la transformación de células vegetales de maíz, de colza o de tomate, portadoras de una esterilidad masculina citoplásmica o nuclear de manera que integre un transgén de interés en el genoma de esas células;
- b)
- la regeneración de plantas transformadas presentando un fenotipo masculino estéril que expresa dicho transgén de interés a partir de las células vegetales transformadas antes mencionadas;
- c)
- la recuperación del producto de expresión de dicho transgén de interés en dichas células o plantas transformadas antes mencionadas, en particular por extracción, seguida, dado el caso, por una purificación.
Otro aspecto vinculado a la producción de
plantas transgénicas reside en la presencia de genes eventualmente
considerados indeseados, incluso nefastos, para el hombre y/o el
medio ambiente, en particular a los ojos del
público.
público.
En efecto, para obtener plantas transgénicas,
hay que seleccionar entre millones de células, aquellas que
comprenden la modificación a introducir. Para hacerlo, se utilizan
genes llamados marcadores que confieren habitualmente resistencias a
antibióticos o a herbicidas. Estos genes son en ocasiones
considerados indeseados y han sido previstas diferentes estrategias
(co-transformación, uso de recombinasas...) para
intentar eliminarlos.
Así, la solicitud de patente WO 9201370 difunde
un procedimiento para producir una planta transgénica que contiene
un gen de interés, liberado de genes marcadores utilizando un
sistema de transposición.
Por otra parte, la solicitud WO 91 09957 difunde
un procedimiento de recombinación específico del sitio en células de
plantas que utiliza un sistema Cre/lox para producir una supresión,
una inserción o un intercambio recíproco de segmentos de ADN. El
procedimiento descrito es aplicable a la eliminación de un gen
marcador. El solicitante cita también el uso de ese procedimiento
para restablecer la fertilidad en el marco de la producción por
ingeniería genética de semillas híbridas.
Sin embargo, en el arte anterior, la esterilidad
masculina no había sido utilizada como marcador como tal dentro de
las operaciones de cribado.
Según un modo de realización, el gen AMS puede
servir de marcador positivo para el cribado de plantas habiendo
integrado un transgén de interés, siendo seleccionados los
individuos que poseen dicho gen AMS.
La presencia de ese gen AMS puede ser detectada
en particular por análisis moleculares utilizando reacciones de
polimerización en cadena (PCR), y/o por análisis de Southern Blot
según técnicas usuales (Sambrook y otros, 1989). Las plantas que
poseen una esterilidad masculina pueden también ser simplemente
seleccionadas observando la presencia o la ausencia de desarrollo de
los granos de polen. El gen AMS habiendo servido de marcador
positivo puede luego ser considerado como indeseado y puede ser
extirpado.
\newpage
Según otro modo de realización de la invención,
el gen AMS permite el mejoramiento del procedimiento de eliminación
de un fragmento de ADN exógeno indeseado en el marco de operaciones
de cribado de plantas transformadas genéticamente.
En efecto, para ser eficaces, las estrategias de
cribado existentes, basándose en el uso de un gen marcador, tales
como son descritas en las solicitudes de patente antes mencionadas
por ejemplo, deben funcionar a una frecuencia muy elevada. Las
células o plantas que han perdido el gen marcador ya no son
elegibles en relación con aquellas de las que han salido. La
selección se basa entonces en métodos moleculares pesados y
onerosos.
La Solicitante ha descubierto ahora el interés
del uso de un gen que confiere la esterilidad masculina artificial
(gen AMS) como "marcador suicida" o "negativo" de un
evento de escisión, a saber que solo los individuos que lo hayan
perdido se multiplican. Esto permite el uso de estrategias de
eliminación de un fragmento de ADN exógeno indeseado teniendo
rendimientos débiles y por consiguiente la ampliación de los campos
de investigación en esta
esfera.
esfera.
El gen AMS está vinculado genéticamente a un
fragmento de ADN indeseado de manera que dicho gen AMS y dicho
fragmento de ADN indeseado puedan ser extirpados
simultáneamente.
Dicho fragmento de ADN exógeno indeseado puede
ser en particular un gen marcador, de preferencia un gen que
confiere una resistencia a un antibiótico.
Los sistemas de eliminación de genes indeseados
se basan generalmente en dos componentes: un fragmento de ADN
extirpable que contiene el gen indeseado y un inductor de esta
escisión.
Según un modo de realización se introduce en el
fragmento extirpable un gen que confirere la esterilidad masculina
artificial. Por consiguiente las plantas transformadas con ese
primer componente serán masculinas estériles, y conservadas por
retrocruzamiento ("back-cross"). El inductor
aportado por un cruzamiento, conllevará a la eliminación del
fragmento de ADN que contiene el gen AMS, provocando así el
desarrollo de frutos resultado de la autofecundación. Estos frutos
contienen individuos sin el gen AMS ni el gen indeseado.
En realidad, basta con recoger solo los granos
producidos en autofecundación por plantas F1 conteniendo los dos
componentes.
Según otro modo de realización la planta que ha
integrado el fragmento de ADN extirpable que contiene el gen AMS
puede ser transformada por un fragmento de ADN inductor de la
escisión.
El sistema de escisión utilizado de acuerdo con
la invención para eliminar el fragmento de ADN indeseado puede ser
un sistema de transposición, en particular tal como el sistema Ac/Ds
del maíz, o un sistema de recombinación, en particular tal como el
sistema Cre/lox del bacteriófago P1, el sistema FLP/FRT de la
levadura, la recombinasa Gin del fago Mu, la recombinasa Pin de
E. coli o el sistema R/RS del plásmido pSR1.
Para la transformación de células vegetales es
utilizado un vector, en particular plásmido, caracterizado porque
comprende un fragmento de ADN extirpable que comprende un fragmento
de ADN indeseado y dicho gen AMS, siendo dicho fragmento de ADN
indeseado preferentemente un gen marcador, preferentemente un gen
que confiere una resistencia a un antibiótico, siendo asociados
dicho gen AMS y dicho fragmento de ADN indeseado cada uno
respectivamente a elementos que permiten su expresión en las células
vegetales, en particular un promotor y un terminador de
transcripción.
La transformación de células vegetales puede ser
realizada por transferencia de los vectores antes mencionados a los
protoplastos, en particular después de la incubación de estos
últimos en una solución de polietilenglicol (PG) en presencia de
cationes divalentes (Ca^{2+}) según el método descrito en el
artículo de Krens y otros, 1982.
La transformación de las células vegetales puede
igualmente ser realizada por electroporación en particular según el
método descrito en el artículo de Fromm y otros, 1986.
La transformación de las células vegetales puede
igualmente ser realizada mediante el uso de un dispositivo emisor de
genes permitiendo la proyección, a muy alta velocidad, de partículas
metálicas recubiertas de secuencias de ADN de interés, llevando así
genes al interior del núcleo celular, en particular según la técnica
descrita en el artículo de Sanford, (1988).
Otro método de transformación de las células
vegetales, es el de la micro-inyección citoplásmica
o nuclear.
Según un modo de realización particularmente
preferido por el procedimiento de la invención, las células
vegetales son transformadas por el vector antes mencionado siendo
susceptible dicho hospedero celular de infectar dichas células
vegetales permitiendo la integración en el genoma de estas últimas,
de las secuencias de ADN de interés inicialmente contenidas en el
genoma del vector antes mencionado.
\newpage
Ventajosamente, el hospedero celular antes
mencionado utilizado es Agrobacterium tumefaciens, en
particular según los métodos descritos en los artículos de Bevan,
1984 y de An y otros, 1986, o también Agrobacterium
rhizogenes, en particular según el método descrito en el
artículo de Jouanin y otros, 1987.
De forma preferencial, la transformación de las
células vegetales es realizada por la transferencia de la región T
del plásmido circular extra-cromosómico inductor de
tumores Ti de Agrobacterium tumefaciens, utilizando un
sistema binario (Watson y otros).
Para hacerlo, son construidos dos vectores. En
uno de esos vectores, la región de ADN-T ha sido
eliminada por supresión, a excepción de los bordes derecho e
izquierdo, donde un gen marcador es insertado entre ellos para
permitir la selección en las células de plantas. El otro elemento
del sistema binario es un plásmido Ti auxiliar, plásmido modificado
que no tiene ya ADN-T pero contiene aún los genes de
virulencia vir, necesarios para la transformación de la
célula vegetal. Ese plásmido es conservado en
Agrobacterium.
El gen AMS y el gen de interés pueden ser
asociados de conjunto o cada uno respectivamente a un sistema de
control de trascripción, en particular un promotor o un terminador
de trascripción.
El gen AMS puede ser asociado en particular a un
sistema de control de trascripción que comprende un promotor
permitiendo una expresión específica en la antera tal como el
promotor A3 ó A9 (WO 92 11379) o los promotores TA29, TA26 ó TA13
(WO 89 10396).
Entre los terminadores de trascripción que
pueden ser utilizados, se puede citar el terminador polyA 35S del
virus del mosaico de la coliflor (CaMV), descrito en el artículo de
Franck y otros, (1980), o el terminador polyA NOS, que corresponde a
la región en 3' no codificadora del gen de la nopalina sintasa del
plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens cepa de nopalina
(Depicker y otros, 1982).
Entre los promotores de transcripción que pueden
ser utilizados, por ejemplo en asociación con el gen de interés,
pueden citarse en particular:
- -
- el promotor 35S, o ventajosamente el promotor constitutivo doble 35S (pd35S) de CaMV, descritos en el artículo de Kay y otros, 1987;
- -
- el promotor PCRU del gen de la cruciferina de rábano que permite la expresión de los polipéptidos recombinantes de la invención únicamente en las semillas (o granos) de la planta obtenida a partir de células transformadas de acuerdo con la invención, y descrito en el artículo de Depigny-This y otros, 1992;
- -
- los promotores PGEA1 y PGEA6 que corresponden a la región 5' no codificadores de los genes de la proteína de reserva de granos, GEA1 y GEA6, respectivamente, de Arabidopsis thaliana (Gaubier y otros, 1993) y que permiten una expresión específica en los granos;
- -
- el promotor quimérico super-promotor PSP (Ni M y otros, 1995) constituido por la fusión de una triple repetición de un elemento activador de transcripción del promotor del gen de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens, de un elemento activador de transcripción del promotor del gen de manopina sintasa y del promotor manopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens;
- -
- el promotor actina de arroz seguido del intrón actina de arroz (PAR-IAR) contenido en el plásmido pAct1-F4 descrito por Mc Elroy y otros, 1991;
- -
- el promotor HMGW (High Molecular Weight Glutenine) de cebada (Anderson O.D. y otros, 1989);
- -
- el promotor del gen de \gammazeina de maíz (P\gammazeina) contenido en el plásmido p\gamma63 descrito en Reina y otros, 1990 y permitiendo la expresión en el albumen de las semillas de maíz.
Ventajosamente, el gen de la esterilidad
masculina y el gen de interés son asociados a una o varias
secuencias codificadoras para un péptido responsable de la remisión
de polipéptidos recombinantes en un compartimiento determinado de la
célula vegetal, en particular en el retículo endoplásmico o las
vacuolas, o bien incluso en el exterior de la célula, en la pared
pectocelulósica o en el espacio extracelular también llamado
apoplasma.
Estas secuencias codificadoras para un péptido
de remisión pueden ser de origen vegetal, humano o animal.
Entre las secuencias codificadoras para un
péptido de remisión de origen vegetal, pueden citarse:
- -
- la secuencia nucleotídica de 69 nucleótidos (indicados en los ejemplos que aparecen más adelante) codificadora para el prepéptido (péptido señal) de 23 aminoácidos de la esporamina A en el boniato, permitiendo ese péptido señal la entrada de los polipéptidos recombinantes de la invención en el sistema de secreción de las células vegetales transformadas de acuerdo con la invención (a saber principalmente en el retículo endoplásmico);
- -
- la secuencia nucleotídica de 42 nucleótidos (indicada en los ejemplos que aparecen más adelante) codificadora para el propéptido N-terminal de remisión vacuolar de 14 aminoácidos de la esporamina A en el boniato, permitiendo la acumulación de los polipéptidos recombinantes de la invención en las vacuolas de las células vegetales transformadas de acuerdo con la invención;
- -
- la secuencia nucleotídica de 111 nucleótidos (indicada en los ejemplos que aparecen más adelante) codificadora para el prepropéptido de 37 aminoácidos de la esporamina A constituida de la parte N-terminal hacia la parte C-terminal de los 23 aminoácidos del péptido señal antes mencionado seguidos por los 14 aminoácidos del propéptido antes mencionado, permitiendo ese prepropéptido la entrada de los polipéptidos recombinantes de la invención en el sistema de secreción y su acumulación en las vacuolas de las células vegetales transformadas según la invención;
las tres secuencias antes
mencionadas son descritas en los artículos de Murakami y otros, 1986
y Matsuoka y otros,
1991;
- -
- el propéptido carboxiterminal de la lecitina de cebada descrito en particular en los artículos de Schroeder y otros, 1993 y de Bednarek y otros, 1991;
- -
- y la PRS (Pathogenesis Related Protein, Cornelissen y otros, 1986) permitiendo la secreción.
Se puede igualmente citar entre las secuencias
codificadoras para un péptido de remisión, la que codificada para
los péptidos KDEL, SEKDEL y HDEL en el extremo
C-terminal y que permite una remisión en el retículo
endoplásmico.
Los genes de interés a integrar en el genoma de
la célula vegetal pueden ser en particular genes codificadores para
proteínas de origen humano o animal pudiendo presentar un interés
terapéutico o profiláctico, tales como el colágeno, la lipasa
gástrica, etc.
Los genes marcadores utilizados pueden ser en
particular genes que confieren una resistencia a antibióticos tales
como la higromicina, la kanamicina, la bleomicina y o la
estreptomicina o a herbicidas tales como el glufosinato, el
glifosato o el bromoxinilo.
La construcción de los diferentes plásmidos así
como su unión y la transformación de las bacterias Escherichia
coli DH5\alpha convertidas previamente en competentes, es
realizada gracias a las técnicas usuales de ADN recombinante
(Sambrook y otros, 1989).
El plásmido "binario" derivado de pGA492
(An., 1986) que contiene entre los bordes derecho e izquierdo;
resultados del plásmido pTiT37 de Agrobacterium tumefaciens,
en su ADN de transferencia, las secuencias siguientes: el promotor
constitutivo del gen no codificador para la nopalina sintasa
(Depicker y otros, 1982), la secuencia codificadora del gen NPTII
codificador para la neomicina fosfotransferasa confiriendo la
resistencia a la kanamicina (Berg y Berg, 1983) suprimida de la
región de los 8 primeros codones cuyo codón iniciador metionina ATG
y fusionada con la secuencia de los 14 primeros codones de la
secuencia codificadora del gen nos (Depicker y otros, 1982), la
secuencia codificadora del gen nos desprovista de la región de los
14 primeros codones, el terminal nos (Depicker y otros, 1982), una
región conteniendo sitios múltiples de clonación (también denominada
poliligador)
(HindIII-XbacI-HpaI-KpnI-ClaI-BglII)
precediendo al gen CAT codificador para el cloranfenicol
acetiltransferasa (Close y Rodríguez, 1982) y las secuencias
terminales del gen 6 del plásmido pTiA6 de Agrobacterium
tumefaciens (Liu y otros, 1993).
Ha sido utilizado el gen quimérico
correspondiente al "promotor
A9-PR-glucanasa-T35S"
contenido en pDW80PR (Worall y otros, 1992). El fragmento
KpnI-EcoRV portando ese gen quimérico ha sido
aislado por doble asimilación enzimática por KpnI y EcoRV,
purificado por electroelución después de la migración
electroforética en gel de agarosa al 0,8%, precipitado en alcohol,
secado. Ha sido insertado en los sitios KpnI y SmaI del plásmido
pBluescript KS+ comercializado por Stratagene. La unión ha sido
realizada con 100 ng del plásmido desfoforilado y 50 ng de
fragmentos KpnI-EcoRV en un medio de reacción de 10
\mul en presencia de 1 \mul de una solución tampón T4 ADN ligasa
x 10 (Amersham) y de 2,5 U de enzima T4 ADN ligasa (Amersham) a 14ºC
durante 16 horas. Las bacterias Escherichia coli DH5\alpha
convertidas previamente en competentes, han sido transformadas. El
ADN plasmídico de los clones obtenidos, seleccionados en un medio
con 50 \mug/ml de ampicillina, ha sido extraído según el método de
la disolución alcalina y analizado por asimilación enzimática por
enzimas de restricción. A partir del plásmido obtenido, el fragmento
KpnI-SstI portando el gen quimérico descrito
anteriormente ha sido introducido en los sitios KpnI y SstI de
pGA492. El aislamiento del fragmento quimérico es realizado con los
procedimientos usuales. La unión ha sido realizada con 100 ng del
vector desfoforilado y 50 ng de fragmentos portando el fragmento
KpnI-SstI en un medio de reacción de 10 ml en
presencia de 1 \mul de una solución tampón T4 ADN ligasa x 10
(Amersham) y de 2,5 U de enzima T4 ADN ligasa (Amersham) a 14ºC
durante 16 horas. Las bacterias Escherichia coli DH5\alpha
convertidas previamente en competentes, han sido transformadas. El
ADN plasmídico de los clones obtenidos, seleccionados en un medio
conteniendo 12 pg/ml de tetraciclina, ha sido extraído según el
método de la disolución alcalina y analizado por asimilación
enzimática por enzimas de restricción. El vector obtenido es llamado
pBIOC500.
El fragmento EcoRI-HindIII que
porta el gen quimérico "P35S - pat- TNOS", aislado a partir del
plásmido pIB16,1 (Broer y otros, 1988), ha sido insertado en los
sitios EcoRI y HindIII de pBSIISK+ comercializado por Strategene y
modificado por la adición de un sitio KpnI en el sitio SmaI de la
secuencia poliligador de pBSIISK+. El plásmido resultante es llamado
pBIOC501. El ADN plasmídico de los clones obtenidos, seleccionados
en un medio conteniendo 50 \mug/ml de ampicillina, ha sido
extraído según el método de la disolución alcalina y analizado por
asimilación enzimática por enzimas de restricción.
El gen quimérico correspondiente a
"PCRU-PSLGL-LGC-T35S"
aislado a partir de pBIOC93 descrito en la solicitud WO 9633277, es
portado por el fragmento obtenido por doble digestión SacI y XhoI,
siendo el sitio SacI reparado por la acción de la enzima T4 ADN
Polimerasa (New England Biolabs) según las recomendaciones del
fabricante. Este fragmento ha sido insertado entre el sitio ApaI
tratado por la acción de la enzima T4 ADN Polimerasa y el sitio XhoI
del plásmido pBIOC501. El plásmido resultante es llamado pBIOC502.
El ADN plasmídico de los clones obtenidos, seleccionados en un medio
conteniendo 50 \mug/ml de ampicillina, ha sido extraído según el
método de disolución alcalina y analizado por asimilación enzimática
por enzimas de restricción.
A partir de pBIOC502, un fragmento KpnI que
porta los datos de expresión,
"PCRU-PSLGL-LGC-T35S"
y "P35S-pat-TNOS", ha sido
aislado y ligado al sitio KpnI de pBIOC500. El plásmido resultante
es llamado pBIOC503. El ADN plasmídico de los clones obtenidos,
seleccionados en un medio conteniendo 12 \mug/ml de ampicillina,
ha sido extraído según el método de la disolución alcalina y
analizado por asimilación enzimática por enzimas de restricción.
El ADN plasmídico del plásmido pBIOC503 ha sido
introducido por transformación directa en la cepa LBA4404 de
Agrobacterium tumefaciens según el procedimiento de Holsters
y otros (1978).
Ha sido utilizado el gen quimérico
correspondiente al "promotor A9 barnasa-T35S"
contenido en pWP173 (Paul y otros, 1992). El fragmento
KpnI-EcoRV que porta ese gen quimérico ha sido
insertado en los sitios KpnI y SmaI del plásmido pBluescript KS+
comercializado por Strategene. A partir del plásmido obtenido, el
fragmento KpnI-SstI que porta el gen quimérico
descrito anteriormente ha sido introducido en los sitios KpnI y SstI
de pGA492. El vector obtenido es llamado pBIOC504. El ADN plasmídico
de los clones obtenidos, seleccionados en el medio conteniendo 50
\mug/ml de ampicillina, ha sido extraído según el método de la
disolución alcalina por asimilación enzimática por enzimas de
restricción.
El vector ha sido construido como es descrito en
el ejemplo 1 b).
El vector pBIOC502 ha sido construido como es
descrito en el ejemplo 1 c).
A partir de pBIOC502, un fragmento KpnI que
porta los datos de expresión,
"PCRU-PSLGL-LGC-T35S"
y "P35S-pat-TNOS", ha sido
aislado y ligado al sitio KpnI de pBIOC504. El plásmido resultante
es llamado pBIOC505. El ADN plasmídico de los clones obtenidos,
seleccionados en el medio conteniendo 50 \mug/ml de ampicillina,
ha sido extraído según el método de disolución alcalina y analizado
por asimilación enzimática por enzimas de restricción.
\newpage
El ADN plasmídico del plásmido pBIOC505 ha sido
introducido por transformación directa en la cepa LBA4404 de
Agrobacterium tumefaciens según el procedimiento de Holsters
y otros (1978).
Los granos de colza de primavera (Brassica
napus cv WESTAR o descendencias Limagrain) son desinfectados
durante 40 minutos en una solución de Domestos al 15%. Después de
cuatro enjuagues en agua estéril, los granos son puestos a germinar,
a razón de 20 granos por pote de 7 cm de diámetro y 10 cm de alto,
en un medio mineral de Murashige y Skoog (Sigma M 5519) con 30 g/l
de sacarosa y solidificado con gel Agar a 5 g/l. Esos potes son
situados en un cuarto de cultivo a 26ºC con fotoperíodo de 16H/8H y
bajo una intensidad luminosa del orden de 80
\muE.m^{-2}.S^{-1}.
Después de cinco días de germinación, los
cotiledones son extraídos estérilmente cortando cada petiolo
aproximadamente 1 mm por encima del nudo cotiledóneo.
Paralelamente, un precultivo de Agrobacterium
tumefaciens cepa LBA4404, conteniendo los plásmidos binarios, es
realizado en Erienmeyer de 50 ml, durante 36 horas a 28ºC en 10 ml
de medio bacteriano 2YT (Sambrook y otros, 1989) complementado con
los antibióticos útiles para la selección de la cepa utilizada.
Este precultivo sirve para sembrar al 1% un
nuevo cultivo bacteriano efectuado en las mismas condiciones. Al
cabo de 14 horas, el cultivo es centrifugado 15 minutos a 3000 g y
las bacterias son recolocadas en un volumen equivalente a un medio
de germinación líquido. Esa suspensión es distribuida en placas de
Petri de 5 cm de diámetro a razón de 5 ml/casete.
El extremo seccionado del petiolo es sumergido
durante algunos segundos en la solución de agrobacterias así
preparada, luego el petiolo es hundido unos milímetros en el medio
de regeneración. Este medio tiene la misma composición de base que
el medio de germinación y además 4 mg/l de
bencil-amino-purina (BAP),
fitohormona que favorece la neo-formación de yemas.
Diez explantes (cotiledón con petiolo) son puestos en cultivo por
placa de Petri de 9 cm de diámetro (Greiner referencia 664102).
Después de dos días de cocultivo en las mismas
condiciones medioambientales que las germinaciones, los explantes
cultivados artificialmente son replantados en placas phytatray
(Sigma, referencia P1552) conteniendo el medio precedente
complementado con un agente selectivo: 45 mg/l de sulfato de
kanamicina (Sigma, referencia K 4000) y un bacteriostático: mezcla
de 1/6 en peso de sal de potasio de ácido clavulánico y de 5/6 sal
de sodio de amoxicillina (Augmentin® inyectable) a razón de 600
mg/l.
Dos veces consecutivamente, con tres semanas de
intervalo, los explantes son transplantados estérilmente en un medio
nuevo con las mismas condiciones.
Las yemas verdes aparecidas al final del segundo
o tercer transplante son separadas de los explantes y puestas en
cultivo individualmente en potes transparentes de 5 cm de diámetro y
10 cm de alto conteniendo un medio idéntico al precedente pero
desprovisto de BAP. Después de tres semanas de cultivo, el tallo de
la yema transformada es seccionado y la yema es transplantada a un
pote con un medio fresco. Al cabo de tres o cuatro semanas, las
raíces están suficientemente desarrolladas como para permitir la
aclimatación de la plántula en un fitotrón. Las yemas que no están
verdes o arraigadas son eliminadas. Estas plántulas son entonces
transplantadas a pequeños recipientes de 7 cm de lado llenos de
mantillo (norma NF U44551: 40% de turba oscura, 30% de brezo
tamizado y 30% de arena) saturado en agua. Después de dos semanas de
aclimatación en fitotrón (temperatura: 21ºC; fotoperíodo: 16H/8H y
84% de humedad relativa), las plántulas son reenvasadas en potes de
12 cm de diámetro rellenos con el mismo mantillo enriquecido con
abono retardado (Osmocote, a razón de 4 g/l de mantillo) luego
transportadas a invernadero (clase S2) regulado a 18ºC con dos
riegos diarios de dos minutos con agua.
Desde la aparición de flores, éstas son
ensacadas (Crispac, referencia SM 570y 300 mm*700 mm) de manera que
se impida la fecundación cruzada.
Cuando las silicuas llegan a la madurez, son
recolectadas, secadas y luego apisonadas. Los granos obtenidos
sirven para la dosificación de la actividad bioquímica del gen de
interés.
La selección de la descendencia transgénica se
hace por germinación en un medio conteniendo sulfato de kanamicina a
razón de 100 a 150 mg/l (según los genotipos). Las condiciones
operativas son idénticas a las descritas anteriormente, excepto que
las germinaciones son efectuadas en tubos de vidrio con un solo
grano por tubo. Solo las plántulas desarrollando raíces secundarias
en las tres primeras semanas, son aclimatadas en fitotrón antes de
ser pasadas a invernadero.
Los plantones de tabaco utilizados para las
experiencias de transformación (Nicotiana tabacum var.
Xanthi NC y PBD6) son cultivados in vitro en el medio
de base Murashige y Skoog (1962) con adición de vitaminas de Gamborg
y otros (1968), Sigma referencia M0404), de sacarosa a 20 g/l y de
agar (Merck) a 8 g/l. El pH del medio es ajustado a 5,8 con una
solución de potasa antes de pasar por autoclave a 120ºC durante 20
minutos. Las plántulas de tabaco son transplantadas por esqueje
entre nudos cada 30 días en ese medio de multiplicación MS20.
Todos los cultivos in vitro son
realizados en recinto climatizado, en las condiciones definidas a
continuación:
- -
- intensidad luminosa de 30 \muE.m^{-2}.S^{-1}, fotoperíodo de 16 horas;
- -
- termoperíodo de 26ºC por el día, 24ºC por la noche.
La técnica de transformación utilizada es
derivada de aquella de Horsch y otros (1985).
Un precultivo de Agrobacterium
tumefaciens cepa LBA4404 conteniendo plásmidos binarios es
realizado durante 48 horas a 28ºC bajo agitación, en un medio LB
(Sambrook y otros, 1989) con adición de antibióticos adecuados
(kanamicina). Luego el precultivo es diluido en 1/50 en el mismo
medio y cultivado en las mismas condiciones. Después de una noche,
el cultivo es centrifugado (10 minutos, 3 000 g), las bacterias son
recolocadas en un volumen equivalente al medio MS30 (30 g/l
sacarosa) líquido y esta suspensión es diluida en 1/10.
Explantes de aproximadamente 1 cm^{2} son
cortados a partir de hojas de plántulas descritas anteriormente.
Luego son puestos en contacto con la suspensión bacteriana durante
una hora, más tarde secados rápidamente sobre papel filtro y
colocados en un medio de cocultivo (MS30 sólido).
Después de dos días, los explantes son
transferidos en placas de Petri al medio de regeneración MS30,
conteniendo un agente selectivo, la kanamicina (2 000 mg/l), un
bacteriostático, la Augmentin® (400 mg/l) y las hormonas necesarias
para la inducción de yemas (BAP, 1 mg/l y ANA, 0,1 mg/l). Un
transplante de los explantes es efectuado en el mismo medio después
de dos semanas de cultivo. Después de dos semanas complementarias,
las yemas son transplantadas en placas de Petri a un medio de
desarrollo compuesto por el medio MS20 con adición de kanamicina y
Augmentin. Después de quince días, las yemas son transplantadas a la
mitad. El arraigamiento demora aproximadamente 20 días, al término
del cual las plántulas pueden ser clonadas en invernadero por
esqueje de entre nudos o salidas.
Se ha construido un plásmido binario portando
una fuente de transposasa fijada bajo el promotor 35S, puesto que
demostró conducir una expresión fuerte y precoz de esa transposasa
(Finnegan y otros, 1993).
Para hacerlo, el fragmento
BamHI-EcoRI de pBI35S Ac (construido por Finnegan)
ha sido clonado en los sitios BamHI y SnaBI de pB1121 (Jefferson y
otros, 1987). El plásmido resultante llamado pBIOS144 contiene,
entre los bordes derecho e izquierdo, el gen de resistencia a la
kanamicina NPTII bajo el promotor y terminador nos. El elemento Ac
suprimido de su parte 5' bajo el promotor 35S, constituyendo así la
fuente de transposasa fijada, y 1400 pares de base de la parte 5'
del gen codificador para la \beta-glucoronidasa de
E. Coli (gen GUS señalado del GUS en la figura 3) seguido del
terminador nos.
Las etapas sucesivas que han conducido a la
fabricación de ese vector son las siguientes:
Se ha insertado el fragmento BamHI de 1 Kb
(correspondiente al gen NPTII) de pCamVNEO (Fromm y otros, 1986) en
el sitio BamHI de pBIOS1 (Pérez y otros, 1989). El vector pBIOS 1 K
resultante ha sido asimilado por EcoRI. El fragmento EcoRI de BIOS 1
K ha sido convertido en libre por la polimarasa Klenow, luego
clonado en el plásmido AF 3'Ac (Cocherel y otros, 1996) en el sitio
EcoRI constituyendo así pBIOS203.
El fragmento EcoRI del vector pBGS fleo
conteniendo 399 pares de bases del extremo 5' del elemento Ac
(Cocherel y otros, 1996) ha sido clonado en pBSsk (Stratagene) en el
sitio EcoRI, constituyendo así pBIOS204.
El fragmento EcoRI-HindIII
(comprendiendo el extremo 3' de Ac y el casete NPTII) de pBIOS203 ha
sido clonado en pBSsk en los sitios EcoRI-HindIII
constituyendo así pBIOS205.
El fragmento SmaI de pBIOS204 (comprendiendo el
extremo 5' de Ac) ha sido clonado en pBIOS205 en el sitio SmaI
constituyendo así pBIOS206.
El fragmento SphI de DW 80 bin
PR-glucanasa conteniendo el gen
PR-glucanasa (PR-Glu) bajo promotor
A9 y terminador CaMV (Worall y otros, 1992) ha sido clonado en el
sitio EcoRI de pBIOS206. En el plásmido resultante pBIOS208, el gen
A9-PR-glucanasa es insertado en el
sentido inverso al gen NPTII.
El vector pGA 492DL ha sido obtenido después de
las modificaciones siguientes de pGA 492(G.An):
- -
- supresión del fragmento SacII-CIaI correspondiente al casete de expresión del gen quimérico NPTII. Este nuevo vector es llamado pGa 492D;
- -
- reemplazo del fragmento BgIII-SCaI (pérdida de una parte del gen CAT) de pGA 492D por el poliligador SacI-KpnI de pBSIIsk. Este nuevo vector es llamado pGA 492 DL.
El fragmento Hindi-Spel de
pBIOS208 ha sido clonado en los sitios HindIII-SpeI
de pGA 492 DL para constituir el plásmido binario pBIOS232. La
estructura de ese ADN-T es esquematizada en las
figuras 1 y 2.
El vector binario pBIOS232 ha sido transferido
en la cepa de Agrobacterium LBA 4404, por conjugación
triparental según la técnica descrita por Ditta y otros.
La transformación del tomate ha sido efectuada
según la técnica modificada de J. Fillatti:
Granos del cultivo UC82B son esterilizados
durante 15 minutos en 10% de Domestos, y enjuagados tres veces en
agua estéril.
Luego son sembrados en potes conteniendo el
medio de cultivo MSSV/2 durante siete u ocho días.
Los cotiledones son extraídos y cortados
transversalmente en tres partes. Sólo la parte central es conservada
y puesta en cultivo a 26ºC y a la luz, en medio KCMS con adición de
Acetosiringona cara inferior contra el medio.
Bacterias de la cepa Agrobacterium LBA
4404 son puestas en cultivo una noche en el medio LB complementado
con el agente selectivo apropiado (tetraciclina). Al día siguiente,
el cultivo es centrifugado y el residuo obtenido es recolocado en el
medio KCMS líquido.
Los explantes cultivados artificialmente son
remojados aproximadamente 30 minutos en una solución de
Agrobacterium diluida en 1/20 en el medio KCMS con adición de
Acetosiringona. Luego son secados rápidamente con papel filtro.
Los explantes son seguidamente:
- -
- recolocados en el mismo medio KCMS durante dos días en la oscuridad a 26ºC;
- -
- lavados en el medio líquido 2Z con adición de Augmentin (400 mg/l) y secados con papel filtro;
- -
- transferidos al medio sólido 2Z conteniendo 400 mg/l de Augmentin y 100 mg/l de Kanamicina;
cultivados a la luz a 26ºC;
y
- -
- transplantados en un medio 2Z fresco, quince días después.
Tres semanas después del cocultivo, aparecen las
primeras yemas. Cuando alcanzan aproximadamente 1 cm, son separadas
del explante y transplantadas al medio Dev donde se arraigan en una
o dos semanas si están bien transformadas.
Cuando están bien arraigadas, son transplantadas
en terrón Jiffy-7 (por AS Jiffy Products) en el
fitotrón, donde se aclimatan rápidamente.
Desde que el sistema radicular está bien
desarrollado en "Jiffy", las plantas son transplantadas en pote
de 12 cm de diámetro luego en contenedor de 30 cm de diámetro, y
cultivadas en invernadero, bajo riego automático y solución
nutritiva (solución diluida a 5 kg/50 l entregado a 1,6%).
Cuando las plantas transformadas están
suficientemente desarrolladas en invernadero, algunas hojas son
extraídas (aproximadamente 5 g) para sacar de ellas el ADN analizado
luego por Southern Blot según los métodos comúnmente utilizados
(Sambrook y otros).
El ADN de cada planta es asimilado con la enzima
HindIII. Después de la migración y transferencia en la membrana de
nitrocelulosa, estos son sometidos a hibridaciones con diferentes
sondas permitiendo verificar:
- -
- el número de copias del ADN-T insertadas,
- -
- si el ADN-T ha sido insertado completamente,
- -
- la presencia o ausencia de extra-bordes.
Al término de esos análisis moleculares, se
seleccionan únicamente las plantas que comprenden un
ADN-T completo único sin
extra-borde.
El mismo protocolo ha sido puesto en práctica
para transformar células de tomate con plásmido pBIOS144 y
seleccionar las plantas transformadas.
Una vez fijada e integrada la fuente de
transposasa en las plantas, se verificó que fuera capaz de activar
un elemento "Ds". Para ello, las plantas que tienen el plásmido
pBIOS144 seleccionadas son cruzadas con una planta que contiene un
elemento Ds probador cuya escisión restablece la actividad del gen
Gus(\beta-glucuronidasa). Este Ds ha sido
construido en dos etapas:
- -
- el fragmento BgIII-SpeI de pBIOS206 correspondiente al Ds::Kana^{R} ha sido insertado en los sitios BamHI-XbaI de pBI221 (Clontech) para obtener pBIOS226.
Luego se ha insertado el plásmido pBIOS226
completo en el sitio HindIII dentro de pGA 492 DL. El plásmido
binario resultante pBIOS228 comprende entre los bordes derecho e
izquierdo el Ds::Kana^{R} entre el promotor 35S y la parte
codificadora del gen Gus.
Toda escisión de ese Ds::Kana^{R} se traducirá
en una expresión del gen transportador Gus. Una prueba Gus
(Jefferson y otros) es realizada a los descendientes F1 de este tipo
de cruzamiento para evaluar la eficacia de los diferentes
descendientes que contienen la transposasa. Han sido detectadas
manchas azules en cotiledones y sectores en las hojas de plantas
salidas del cruzamiento entre un descendiente "transposasa" y
un descendiente "probador Ds". El número de manchas y sectores
en una planta atestigua la eficacia de la fuente de transposasa en
esa planta.
Los transformadores de copia única y sin
extra-borde seleccionados y evaluados positivamente
según el ejemplo anterior han sido sometidos a dos ciclos sucesivos
de autofecundación. Los lotes de granos T2 han sido cosechados por
separado.
Para cada T2, se ha evaluado la segregación para
la resistencia a la kanamicina a fin de detectar los lotes de granos
homocigotos. Por cada lote, una treintena de granos son sembrados en
tierra en un invernadero. Dieciocho días después de la siembra, una
solución con 400 mg/l de kanamicina es pulverizada sobre las
plántulas durante tres días (Weide y otros). Cinco días después,
resulta fácil identificar las plantas sensibles a la kanamicina.
Según la segregación de las plantas resistentes y sensibles, y
conforme a la segregación Mendeliana de un gen dominante, se
identifican los lotes de plantas homocigotos para el transgén. Estos
son los que se conservan preferentemente y que servirán para cruzar
las plantas conteniendo el elemento
Ds::Kana^{R}-AMS.
\newpage
Los transformadores primarios seleccionados
(copia única sin extra-borde) son evaluados desde su
floración en invernadero, para la fertilidad por observación
microscópica de la sección transversal del tubo de antera de una o
dos flores por planta, dentro del carmín acético. Como resultado de
esta evolución, sólo son conservadas las plantas masculinas
estériles que no presentan polen.
Las plantas estériles portando el
Ds::Kana^{R}-AMS son fecundadas con polen de
descendientes expresando la transposasa de Ac. Los frutos son
recogidos y los granos extraídos.
Los granos salidos del cruzamiento entre las
plantas que portan la fuente de transposasa y aquellas que portan el
Ds::Kana^{R}-AMS son sembradas en mantillo en
invernadero. En la etapa de cotiledón, un cotiledón por plántula es
extraído con vistas a una extracción rápida de ADN (Lassner y otros,
1989) para una prueba PCR con oligo-nucléotidos A9a
y A9b (fig. 1). Las condiciones de PCR utilizadas son las
siguientes:
- ADN: 40 ng (o 10 \mul de la micro-extracción)
- Oligo A9a (10 pM/\mul): 3 \mul
- Oligo A9b (10 pM/\mul): 3 \mul
- Tampon x 10: 10 \mul
- Mix dNTP (5 mM): 4 \mul
- Taq Promega 0,4 \mul
- MgCl_{2} 25 mM: 8 \mul
- H_{2}O up qsp 100 \mul
Las reacciones son efectuadas en la máquina
Perkin 9600.
Después de 2 minutos de desnaturalización a
95ºC, se realizan 40 ciclos de las siguientes operaciones:
- 30'' de desnaturalización a 94ºC
- 30'' de hibridación a 55ºC
- 1'30'' de elongación a 72ºC
La finalidad de esta prueba es identificar
rápidamente las plantas portadoras del gen AMS (banda de 800 pares
de bases en PCR) de las que no lo portan (sin banda en PCR). Las
plantas portadoras del gen AMS son vueltas a envasar y durante su
floración, se vigila la aparición de frutos que revelarían uno o
varios sectores de escisión somática. La observación de frutos en
plantas F1 revela ya sea una escisión sin reinserción del Ds ya sea
una escisión seguida de una reinserción con pérdida de
actividad.
Para verificar esto, los granos salidos de esos
frutos son extraídos y sembrados. Un análisis molecular por PCR de
esas plantas es realizado para verificar que no portan ya el
Ds::Kana^{R}-AMS, pero que poseen la
"cicatriz" del ADN-T y/o el gen de interés.
Para ello, un cotiledón de cada plántula es sacado por extracción
rápida de ADN.
Una parte de ese ADN es extraído para ser
sometido a dos reacciones PCR:
- -
- una con oligo-nucleótidos EM1 y EM5 (fig. 2).
Las condiciones de PCR utilizadas son las
siguientes:
- ADN: 40 ng (o 10 \mul de la micro-extracción)
- Oligo EM1 (10 pM/\mul): 3 \mul
- Oligo EM5 (10 pM/\mul): 3 \mul
- Tampon x 10: 10 \mul
- Mix dNTP (5 mM): 4 \mul
- Taq Promega 0,4 \mul
- MgCl_{2} 25 mM: 18 \mul
- BSA: 8 \mul
- Glicerol: 2,5 \mul
- H_{2}O up qsp 100 \mul
Las reacciones son efectuadas en la máquina
Perkin 9600.
Después de dos minutos de desnaturalización a
95ºC, se realizan 40 ciclos de las siguientes operaciones:
- 30'' de desnaturalización a 94ºC
- 30'' de hibridación a 62ºC
- 45'' de elongación a 72ºC
Esta prueba permite ver si la plántula es
portadora de la cicatriz del ADN-T y/o del gen de
interés. En el caso en que el elemento Ds sea extirpado, se espera
un fragmento de 300 pares de bases aproximadamente, para la cicatriz
sola, al cual hay que añadir el tamaño del gen de interés;
- el otro con los
oligo-nucleótidos 5'H y Ac12 (fig. 3).
Las condiciones de PCR utilizadas son las
siguientes:
- ADN: 40 ng (o 10 \mul de la micro-extracción)
- Oligo 5'H (10 pM/\mul): 3 \mul
- Oligo Ac12 (10 pM/\mul): 3 \mul
- Tampon x 10: 10 \mul
- Mix dNTP (5 mM): 4 \mul
- Taq Promega 0,4 \mul
- MgCl_{2} 25 mM: 18 \mul
- BSA x 100: 8 \mul
- Glicerol: 2,5 \mul
- H_{2}O up qsp 100 \mul
Las reacciones son efectuadas en la máquina
Perkin 9600.
Después de dos minutos de desnaturalización a
95ºC, se realizan 40 ciclos de las siguientes operaciones:
- 30'' de desnaturalización a 94ºC
- 30'' de hibridación a 62ºC
- 1'30'' de elongación a 72ºC
Esta prueba permite verificar la ausencia del
gen codificando para la transposasa. Si no hay fragmento
amplificado, no hay transposasa. Si está presente, se detecta una
banda de 1,6 Kb.
Las plantas salidas del evento de escisión que
portan solamente el gen de interés sin resistencia a la kanamicina
ni al ADN-T portando el gen codificando para la
transposasa serán positivas con el primer juego de
oligo-nucleótidos (EM1-EM5) y
negativas con el segundo (5'H-Ac12).
Un análisis Southern realizado en esas plantas
permite confirmar la presencia del gen de interés y la ausencia del
gen de resistencia a la kanamicina.
Amplificación de un fragmento de 1 KB del gen
NPTII del vector pBios232 con los oligo-nucleótidos
Kana7 y Kana8, de secuencias.
- Kana 7: gtcgacgttgtcactgaag
- Kana 8: cccggaaaacgattccgaag
El gen NPTII utilizado fue aislado a partir del
transposón Tn5 de Escherichia coli (Berg y Berg, 1983).
Mezcla de 2 sondas:
- Cat int LB: fragmento Sall del ADN-T de pGA 492 DL conteniendo el borde izquierdo y una parte del gen Cat int RB; fragmento SalI del ADN-T de pGA 492 conteniendo el borde derecho.
El conjunto de las dos sondas corresponde al
conjunto del ADN-T de pGA 492 DL que es el vector de
base que ha servido para la construcción de pBios232 que ha servido
para crear las plantas DS::Kana^{R}-AMS.
Granos F1 salidos del cruzamiento entre una
planta portando el DS:Kana^{R}-AMS y una planta
que porta la fuente de transposasa fijada fueron obtenidos y
sembrados. Una prueba PCR en el ADN de cotiledones de 173 plantas ha
sido realizada con los oligo-nucleótidos EM1 y EM5
como fue descrito anteriormente. Esta prueba permitió identificar 18
plantas en las que una banda de 350 pb fue amplificada por
EM1-EM5, revelando así eventos de escisión
somáticos, atestiguando la presencia y la funcionalidad de los 2
elementos del sistema.
El sistema ha sido concluido con un
ADN-T portando un DS::Kana^{R}-AMS
pero ningún gen de interés. Por esto la banda de escisión revelada
por una amplificación hecha con EM1 t EM5 es de aproximadamente 350
pb. En el caso en que un gen de interés sea insertado, esa banda
será alargada según el tamaño de ese gen. Según otro modo de
realización, se pueden igualmente utilizar
oligo-nucleótidos específicos del gen de
interés.
Esas 18 plantas fueron cultivadas en el campo
durante 4 meses. La observación de las flores es hecha regularmente
para verificar la fertilidad de las anteras, así como la aparición
de frutos. Para 3 de esas 18 plantas solo aparecieron algunos frutos
en ciertas ramas. Por consiguiente esas plantas eran quiméricas por
fenotipos masculinos estériles/masculinos fértiles. Los frutos de
esas plantas fueron recogidos rama por rama indicando la jerarquía
de la rama con respecto a toda la planta.
Granos de frutos aparecidos en 3 ramas de las 3
plantas convertidas parcialmente en fértiles fueron sembrados.
Hojas-plántulas obtenidas (4 plántulas/rama), han
sido sacadas con vistas a una extracción de ADN para un análisis de
tipo Southern. El ADN es sometido a una asimilación con la enzima
Hind III (sitio único en el ADN-T), antes de ser
sometido a una electroforesis y a una transferencia sobre la
membrana. Las 36 muestras correspondientes a los descendientes F2
fueron tratadas al mismo tiempo que el ADN de los padres del híbrido
(la planta que porta el DS::Kana^{R}-AMS y la
planta que porta la fuente de transposasa fijada), de manera de
tener los perfiles de referencia. La hibridación del Southern blot
con las sondas NPTII y Cat-int LB permitió
identificar plantas que no portaban ya el ADN-T
conteniendo la fuente de transposasa ni el
DS::Kana^{R}-AMS pero que contenían la cicatriz
del ADN-T, gracias a la comparación con el perfil de
los padres.
Se analizaron en total 36 plantas, sin selección
previa a la kanamicina, proviniendo de 3 ramas de las 3 plantas
donde fueron observados los frutos.
20 plantas portando el ADN-T
"cicatrizado" es decir revelando 1 banda hibridante con la
sonda Cat int LB-RB, de tamaño inferior a la
presente en el padre portando el Ds. Esa misma banda no es hibridada
por la sonda NPTII.
31 plantas portando la fuente de transposasa, es
decir revelando una banda hibridante con la sonda NPTII de tamaño
idéntico al revelado por la misma sonda en el padre portando la
fuente de transposasa fijada.
5 plantas portando el ADN-T
vacío pero que no portan la fuente de transposasa.
De 36 plantas analizadas, 5 resultaron ser
transformadoras limpias no portando más que el ADN-T
portador del gen de interés, y habiendo extirpado el gen marcador de
selección.
Por consiguiente es posible seleccionar plantas
transformadas limpias 2 generaciones después del transformador
primario.
Las ventajas de esta técnica son múltiples.
Permite identificar de manera precoz los transformadores
desprovistos del marcador selectivo.
El cruzamiento del transformador primario con la
fuente de transposasa es facilitado y más fiable puesto que éste es
masculino estéril.
Esta técnica permite en fin el cribado de un
pequeño número de plántulas para identificar transformadores
limpios: sin preselección previa, después de análisis de 36
descendientes de 3 plantas, fueron identificadas 5 plantas
conteniendo el ADN-T desprovisto de
Ds::Kana^{R}-AMS.
Por otra parte, es posible mejorar la
identificación de los transformadores desprovistos de
marcadores:
- si se trata previamente con la Kanamicina a los descendientes de los frutos producidos en una planta que porta el Ds::Kana^{R}-AMS y la fuente de transposasa, se debe tener un cuarto de plantas Kana^{S} en lugar de 15/16 (normalmente obtenidos si no hubiera escisión del Ds). De estas, ¾ son portadores del ADN-T "limpio", el otro cuarto correspondiente a los segregadores clásicos que no portan ningún organismo transgénico. La observación de una segregación ¾ de plantas resistentes por ¼ de sensibles permite además confirmar rápidamente que el sistema de eliminación fue eficaz.
Por consiguiente es posible identificar
descendientes limpios analizando pocas plantas entre las plántulas
F2 sensibles a la Kanamicina.
Este estudio muestra que la agregación de un gen
que confiere la esterilidad masculina artificial al sistema de
eliminación de gen marcador por Ac/Ds, permite identificar
rápidamente los descendientes que portan el gen de interés sin el
marcador selectivo, facilitando el proceso y previniendo la
diseminación por el polen de eventos transgénicos insuficientemente
caracterizados.
La secuencia que codifica la recombinasa FLP de
Saccharomyces cerevisiae está contenida en pOG44
comercializado por Strategene. El plásmido pOG44 fue asimilado por
las enzimas HindIII y KpnI y el fragmento
HindIII-KpnI fue aislado. La unión fue realizada con
100 ng del vector pBIOS512 desfosforilado y 50 ng de fragmento
HindIII-KpnI portando la secuencia codificando la
recombinasa en un medio de reacción de 10 \mul en presencia de 1
\mul de solución tampón T4 ADN ligasa x 10 (Amersham) y de 2,5 U
de enzima T4 ADN ligasa (Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Las
bacterias Escherichia coli DHS\alpha, convertidas
previamente en competentes, han sido transformadas. El plásmido
resultante es llamado pBIOS512-FLP. El ADN
plasmídico de los clones obtenidos, seleccionados en un medio
conteniendo 50 \mug/ml de ampicillina, ha sido extraído según el
método de la disolución alcalina y analizado por asimilación
enzimática por enzimas de restricción. El fragmento que porta la
secuencia que codifica la recombinasa FLP ha sido aislado por
asimilación enzimática por KpnI seguido de la acción de la enzima T4
ADN Polimerasa (New England Biolabs) según las recomendaciones del
fabricante después de la asimilación por HindIII. El fragmento fue
purificado por electroforesis en gel de agarosa 0,8%,
electroseleccionado, precipitado en alcohol y secado. Ha sido
introducido en el sitio BamHI, tratado por la enzima Klenow (New
England Biolabs) según las recomendaciones del fabricante, y en el
sitio HindIII del plásmido pBIOS512. La secuencia nucleotídica de
FLP fue verificada por operación secuencial con la ayuda del kit de
operación secuencial T7^{TM} comercializado por Pharmacia según el
método de didesoxinucleótidos (Sanger y otros, 1977). El plásmido
pBIOS512 deriva de pUC y porta el casete de expresión "promotor
doble 35S(PD35S), terminador NOS (TNOS)" (fragmento
EcoRI). El promotor doble 35S proviene de pJIT163 (WO 96 33277).
A partir de pBIOS512-FLP, el
fragmento EcoRI que porta el casete de expresión
"PD35S-FLP-TNOS" fue aislado
por asimilación enzimática por EcoRI, purificado en gel de agarosa a
0,8% electroseleccionado, precipitado en alcohol y secado. Ha sido
introducido en el sitio EcoRI de pBIOC4 (WO 96 33277) desfosforilado
por la enzima fosfatasa alcalina de intestino de ternero (Boehringer
Mannheim) según las recomendaciones del fabricante. La unión fue
realizada con 100 ng del vector desfosforilado y 50 ng de fragmentos
portando el casete
"PD35S-FLP-TNOS" en un medio de
reacción de 10 \mul en presencia de 1 \mul de solución tampón T4
DNA ligasa x 10 (Amersham) y de 2,5 U de enzima T4 DNA ligasa
(Amersham) a 14ºC durante 16 horas. Las bacterias Escherichia
coli DH5\alpha convertidas previamente en competentes, fueron
transformadas. El plásmido resultante es llamado
pBIOC4-FLP. El ADN del plásmido de los clones
obtenidos, seleccionados en un medio que contiene 12 \mug/ml de
tetraciclina, ha sido extraído según el método de la disolución
alcalina y analizado por asimilación enzimática por enzimas de
restricción. El ADN plasmídico del plásmido binario
pBIOC4-FLP ha sido introducido por transformación
directa en la cepa LBA44O4 de Agrobacterium tumefaciens según
el procedimiento de Holsters y otros (1978). La validez del clon
retenido fue verificada por asimilación enzimática del ADN
plasmídico introducido.
\vskip1.000000\baselineskip
El plásmido binario pGA492 (An, 1986) ha sido
suprimido de las secuencias siguientes: el promotor constitutivo del
gen nos codificador para la nopalina sintasa (Depicker y otros,
1982), la secuencia codificadora del gen nptII codificador para la
neomicina fosfotransferasa II (Berg y Berg, 1983) suprimido de la
región de los 8 primeros codones, el agente cuyo codón iniciador
metionina ATG y fusionada a la secuencia de los 14 primeros
(codones) de la secuencia codificadora del gen nos (Depicker y
otros, 1982), la secuencia codificadora del gen nos desprovista de
la región de los 14 primeros codones, el terminador nos (Depicker y
otros, 1982). Esta supresión fue realizada por asimilación total
ClaI, seguida de una asimilación parcial SacII. El fragmento es
purificado, luego sometido a la acción de la enzima T4 DNA
polimerasa (New England Biolabs) según las recomendaciones del
fabricante. La unión del plásmido y la transformación de bacterias
Escherichia coli DH5\alpha convertidas previamente en
competentes, son realizadas siguiendo los procedimientos usuales
(Sambrook y otros, 1989). El plásmido resultante es llamado
pBIOC506.
El sitio de integración específico FRT ha sido
amplificado por PCR a partir del plásmido pOG45 comercializado por
Strategene. Los dos oligodesoxinucleótidos utilizados como cebadores
para la PCR son: 5' CCC CTG CAG TTT TCA AAA GCG CTC TGA AGT TC 3' y
5' CCA AAG CTT GAA TTC GCC AGG GGG ATC TTG AAG
TTC 3'.
TTC 3'.
Los fragmentos correspondientes al sitio FRT,
salidos de la amplificación PCR han sido asimilados por PstI,
sometidos a la acción de la enzima T4 DNA Polimerasa (New England
Biolabs) según las recomendaciones del fabricante, luego asimilados
por EcoRI. Los mismos fueron purificados en gel de agarosa al 2%,
electroeluidos, precipitados en alcohol, secados y recolocados en el
agua. Luego fueron ligados entre el sitio SacI previamente sometidos
a la acción de la enzima T4 DNA Polimerasa y el sitio EcoRI del
plásmido pUC18 comercializado por Pharmacia. El plásmido resultante
es llamado pBIOC507.
Un segundo sitio FRT ha sido introducido en el
plásmido pBIOC507. Este segundo sitio FRT resulta de la
amplificación PCR con la ayuda de los dos
oligodesoxinucleótidos:
- 5' CCC CTG CAG TTT TCA AAA GCG CTC TGA AGT TC 3' y
- 5' AAA GGT ACC GCC AGG GGG ATC TTG AAG TTC 3'.
Los fragmentos amplificados son digeridos por
PstI y KpnI, sometidos a la acción de la enzima T4 DNA Polimerasa, y
ligados al sitio SphI previamente tratado por la acción de la enzima
T4 DNA Polimerasa, del plásmido pBIOC507. El plásmido resultante es
llamado pBIOC508 y contiene los dos sitios FRT orientados en el
mismo sentido.
A partir del plásmido pBIOC508, ha sido aislado
el fragmento HindIII-EcoRI portando los dos sitios
FRT. Este fragmento ha sido insertado en los sitios HindIII y EcoRI
del plásmido pBIOC506. El plásmido resultante es llamado
pBIOC509.
Para conferir la esterilidad masculina, fue
utilizado el fragmento SphI que porta el gen quimérico
correspondiente al "promotor
A9-barnasa-T35S" contenido en
pWP173 (Paul y otros, 1992). Este fragmento SphI ha sido tratado por
la acción de la enzima T4 DNA polimerasa y unido al sitio PstI
tratado por la acción de la enzima T4 DNA Polimerasa del plásmido
pBIOC509. El plásmido resultante es llamado pBIOC510.
Finalmente para permitir la selección sobre la
kanamicina (Fromm y otros, 1986), el fragmento EcoRI tratado por la
acción de la enzima T4 DNA Polimerasa, correspondiente al casete de
expresión "PNOS-nptII-TNOS"
aislado a partir de un plásmido de pBIOS1 dentro del cual ha sido
clonado en el sitio BamH1 el fragmento BamH1 codificando para el gen
nptII ha sido unido al sitio KpnI tratado por la acción de la enzima
T4 DNA Polimerasa del plásmido pBIOC510. El plásmido resultante es
llamado pBIOC511.
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
LB
- 10 g/l Bactotriptona
- 5 g/l extracto de levadura
- 10 g/l NaCl
- pH 7,5 ajustado con NaOH
\vskip1.000000\baselineskip
MSSV/2
- 2,2 g macro y micro-elementos de Murashige y Skoog (ref. M 6899 Sigma)
- 2 ml/l vitaminas de Nitsch
- 15 g/l sacarosa
- 8 g/l Agar-Agar
- pH 5,9 antes de autoclave
\vskip1.000000\baselineskip
2Z
- 4,4 g macro y microelementos de Murashige y Skoog (ref. M 6899 Sigma)
- 2 ml/l vitaminas Nitsch
- 30 g/l sacarosa
- 2 mg/l Zeatina
- 400 mg/l Augmentin
- 100 mg/l Kanamicina
- 8 g/l Agar-Agar
- pH 5,9 antes de autoclave
\vskip1.000000\baselineskip
KCMS
- 4,4 g macro y microelementos de Murashige y Skoog (ref. M 6899 Sigma)
- 0,9 mg/l Tiamina
- 200 mg/l potasio dihidrogenofosfato
- 30 g/l sacarosa
- 8 g/l Agar-Agar
- 200 \muM Acetosiringona
- 0,2 mg/l 2-4D
- 0,1 mg/l Quinetina
- pH 5,9 antes de autoclave
\newpage
DEV
- 2,2 g macro y microelementos de Murashige y Skoog (ref. M 6899 Sigma)
- 2 ml/l vitaminas de Nitsch
- 15 g/l sacarosa
- 50 mg/l Kanamicina
- 400 mg/l Augmentin
- 8 g/l Agar-Agar
- pH 5,9 antes de autoclave
\vskip1.000000\baselineskip
MS20
- 4,4 g/l M0404 (SIGMA)
- 20 g/l Sacarosa
- 8 g/l Agar-Agar (medio sólido)
- pH 5,7
- + eventualmente hormonas vegetales BAP 1 mg/l y ANA 0,1 mg/l
\vskip1.000000\baselineskip
MS30
- 4,4 g/l M0404 (SIGMA)
- 30 g/l Sacarosa
- 8 g/l Agar-Agar (medio sólido)
- pH 5,7
- + eventualmente hormonas vegetales BAP 1 mg/l y ANA 0,1 mg/l.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (15)
1. Uso de una planta masculina estéril
artificial seleccionada entre el maíz, la colza o el tomate,
comprendiendo un gen de esterilidad masculina artificial (gen AMS),
en cuyo genoma está integrado un transgén de interés cuya expresión
no es impedida por la presencia del gen AMS, para evitar la
diseminación de dicho transgén.
2. Uso según la reivindicación 1 en el cual
dicha planta es portadora de una esterilidad masculina
citoplás-
mica.
mica.
3. Uso según la reivindicación 1 en el cual
dicha planta es portadora de una esterilidad masculina nuclear.
4. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 3,
caracterizado porque el transgén de interés codifica para una
proteína de interés terapéutico o profiláctico.
5. Uso según la reivindicación 4,
caracterizado porque el transgén de interés es escogido entre
una proteína codificadora para el colágeno o la lipasa gástrica.
6. Planta transgénica, o parte de planta
transgénica, selecinada entre el maíz, la colza o el tomate
caracterizada porque dicha planta transgénica o dicha parte
de planta transgénica comprende un transgén de interés vinculado
generalmente a un gen de esterilidad masculina artificial (gen AMS)
asociado a elementos que permiten su expresión en las células
vegetales, no siendo impedida la expresión de dicho transgén por la
presencia del gen AMS.
7. Planta transgénica o parte de planta
transgénica según la reivindicación 6, caracterizada porque
los elementos que permiten la expresión en las células vegetales son
un promotor y un terminador de transcripción.
8. Planta transgénica o parte de planta
transgénica de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 ó 7,
caracterizado porque el gen de esterilidad masculina
artificial (gen AMS) está asociado a un promotor que permite una
expresión específica en la antera.
9. Planta transgénica o parte de planta
transgénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6
a la 8, caracterizada porque el transgén de interés codifica
para una proteína de interés terapéutico o profiláctico.
10. Planta transgénica o parte de planta
transgénica según la reivindicación 9, caracterizada porque
el transgén de interés es seleccionado entre una proteína que
codifica para el colágeno o la lipasa gástrica.
11. Procedimiento de producción de un producto
de expresión de un transgén de interés caracterizado porque
incluye:
- a)
- -
- ya sea la transformación de células vegetales de maíz, de colza o de tomate, con la ayuda de un hospedero celular transformado por un vector que contiene a la vez un transgén de interés asociado a elementos que permiten su expresión en las células vegetales, y un gen de esterilidad masculina artifical (gen AMS) vinculado genéticamente a dicho transgén de interés, estando asociado dicho en AMS a elementos que permiten su expresión en las células vegetales, no impidiendo la presencia de dicho gen AMS la expresión de dicho transgén de interés, de manera tal que integre en el genoma de esas células un gen AMS vinculado genéticamente a un transgén de interés;
- -
- ya sea la transformación de células vegetales de maíz, de colza o de tomate que porta una esterilidad masculina citoplásmica o del núcleo celular de manera que integre un transgén de interés en el genoma de dichas células;
- b)
- la regeneración a partir de las células vegetales transformadas antes mencionadas, de plantas transformadas que tienen un fenotipo masculino estéril y que expresan dicho transgén de interés,
- c)
- la recuperación del producto de expresión de dicho transgén de interés en dichas plantas transformadas antes mencionadas.
12. Procedimiento de producción de un producto
de expresión de un transgén de interés de acuerdo con la
reivindicación 11, caracterizado porque la recuperación del
producto de expresión de dicho transgén en la etapa c) es realizada
por extracción.
13. Procedimiento de producción de un producto
de expresión de un transgén de interés de acuerdo con una de las
reivindicaciones 11 ó 12, caracterizado porque la
recuperación del producto de expresión de dicho transgén en la etapa
c) es seguida por una purificación.
\newpage
14. Procedimiento de producción de un producto
de expresión de un transgén de interés de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque dicho
transgén de interés codifica para una proteína de interés
terapéutico o profiláctico.
15. Procedimiento de producción de un producto
de expresión de un transgén de interés de acuerdo con la
reivindicación 14, caracterizado porque el transgén de
interés es seleccionado entre una proteína que codifica para el
colágeno o la lipasa gástrica.
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