HU224706B1 - Novel uses of male sterility in plants - Google Patents
Novel uses of male sterility in plants Download PDFInfo
- Publication number
- HU224706B1 HU224706B1 HU0001856A HUP0001856A HU224706B1 HU 224706 B1 HU224706 B1 HU 224706B1 HU 0001856 A HU0001856 A HU 0001856A HU P0001856 A HUP0001856 A HU P0001856A HU 224706 B1 HU224706 B1 HU 224706B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- gene
- transgene
- plant
- expression
- plants
- Prior art date
Links
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 title claims description 43
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 title claims description 43
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 168
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 122
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 43
- 101150039403 ams gene Proteins 0.000 claims description 41
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 34
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 26
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 13
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 11
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 11
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 9
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 4
- 102100031416 Gastric triacylglycerol lipase Human genes 0.000 claims description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 4
- 108010091264 gastric triacylglycerol lipase Proteins 0.000 claims description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 claims 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 80
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 59
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 50
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 45
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 32
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 25
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 24
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 22
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 22
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 22
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 22
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 16
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 13
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 12
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 10
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 10
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 9
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 9
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N Clavulanic acid Natural products OC(=O)C1C(=CCO)OC2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 6
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101150005851 NOS gene Proteins 0.000 description 6
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 6
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 6
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940098164 augmentin Drugs 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 5
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 4
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 4
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 4
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 4
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 3
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 3
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 101710108868 Sporamin A Proteins 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000010165 autogamy Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 3
- 238000004853 microextraction Methods 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100109110 Danio rerio aph1b gene Proteins 0.000 description 2
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 2
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 2
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 2
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 2
- 229910002056 binary alloy Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 2
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 2
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 2
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 2
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid Chemical compound CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 101100489780 Arabidopsis thaliana A9 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 1
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 101000941274 Canis lupus familiaris Gastric triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 1
- 206010010144 Completed suicide Diseases 0.000 description 1
- LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N D-nopaline Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)N[C@@H](C(O)=O)CCC(O)=O LMKYZBGVKHTLTN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 108700003861 Dominant Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100039371 ER lumen protein-retaining receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010014458 Gin recombinase Proteins 0.000 description 1
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 1
- 101000812437 Homo sapiens ER lumen protein-retaining receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000910825 Homo sapiens Protein chibby homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100288095 Klebsiella pneumoniae neo gene Proteins 0.000 description 1
- 235000003228 Lactuca sativa Nutrition 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 240000001140 Mimosa pudica Species 0.000 description 1
- 235000016462 Mimosa pudica Nutrition 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 101150101654 PSR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 1
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 1
- 101710096342 Pathogenesis-related protein Proteins 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- 102100026774 Protein chibby homolog 1 Human genes 0.000 description 1
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 1
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 101100121642 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GEA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 229920002494 Zein Polymers 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010021384 barley lectin Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- DGQLVPJVXFOQEV-NGOCYOHBSA-N carminic acid Chemical compound OC1=C2C(=O)C=3C(C)=C(C(O)=O)C(O)=CC=3C(=O)C2=C(O)C(O)=C1[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O DGQLVPJVXFOQEV-NGOCYOHBSA-N 0.000 description 1
- 229940114118 carminic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000012730 carminic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004106 carminic acid Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 229960003324 clavulanic acid Drugs 0.000 description 1
- HZZVJAQRINQKSD-PBFISZAISA-N clavulanic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1C(=C/CO)/O[C@@H]2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-PBFISZAISA-N 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000012869 germination medium Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 1
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003415 peat Substances 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 230000008119 pollen development Effects 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004999 sex organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N trans-Zeatin Natural products OCC(/C)=C\CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-UQCOIBPSSA-N 0.000 description 1
- UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N trans-zeatin Chemical compound OCC(/C)=C/CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 UZKQTCBAMSWPJD-FARCUNLSSA-N 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 229940023877 zeatin Drugs 0.000 description 1
- 239000005019 zein Substances 0.000 description 1
- 229940093612 zein Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
A leírás terjedelme 16 oldal (ezen belül 1 lap ábra)
HU 224 706 Β1
A találmány tárgyát képezi hímsteril növény alkalmazása a növény genomjába beépült transzgén szétszóródásának megakadályozására, ahol a növény mesterséges hímsterilitást biztosító gént (AMS-gént) tartalmaz, és a transzgén expresszióját az AMS-gén jelenléte nem akadályozza. A találmány tárgyát képezik transzgenikus növények és eljárások adott transzgén expressziós termékének előállítására.
A transzgenikus növények alkalmazása nagyon ígéretes előnyökkel jár. Az emlősgének mesterséges átvitele növényi sejtekbe előnyösen új, rekombináns fehérjék nagy mennyiségben történő előállításának útját kínálja kisebb előállítási költséggel, és vírus- vagy szubvirális (prion) eredetű fertőzés veszélye nélkül.
Ezen előnyös hatások mellett azonban, a transzgenikus növények előállításával kapcsolatosan, nem szabad elfeledkezni a természet ökológiai szemléletéről sem, amely iránt a köz igen érzékeny.
Egy olyan technológiát dolgoztunk ki, amely az ökológiai és humán szempontokat figyelembe vevő „zöld biotechnológia szolgálatába állítja a hímsterilitást.
A fejlesztéssel elért egyik lehetséges eredmény a transzgén környezetben való elterjedésének ellenőrzése.
A termesztési területek térbeli izolációja csökkentheti a transzgén „kimenekülésének” veszélyét, de ez az eljárás korlátozott, és a termékek számának növekedésével problémákat okozhat.
A transzgén izolálására és a „kimenekülés” veszélyének csökkentésére szolgáló genetikai eljárások jelentőségét 1990-ben Ellstrand egy cikkben vetette fel. A transzgén „kimenekülési” problémájának megoldására javasolt nagyszámú javaslat között Ellstrand megjegyzi, hogy hímsteril genotípust lehetne bevinni, vagy egy, a pollenre letális gént közvetlenül a génmérnöki úton előállított génhez kellene kapcsolni. Technikai fejlesztés azonban ebben a tekintetben nem történt. Valójában gyakorlatilag lehetetlen volt előre látni egy ilyen, sikeres fejlesztés folyamatát, különösen a növényekben alkalmazott génsebészeti technikák során fellépő nagyszámú paraméter miatt.
Egy olyan technológiát fejlesztettünk ki, amely megakadályozza a transzgén pollen útján történő szétszóródását, és ezáltal megakadályozza a transzgén „kimenekülését” a természetbe, amely technológia szerint egy hímsteril növényt alkalmazunk a növény genomjába integrálódott, az érdeklődés tárgyát képező transzgén (adott transzgén) szétszóródásának megakadályozására.
Ismeretes, hogy a hím termékenyítőképesség ellenőrzése fontos két különböző vonal keresztezésével létrehozott hibrid növények előállításában.
Az önmegtermékenyítés megakadályozásának egyik eljárása a beporzás ellenőrzése a növény hím ivarszerveinek manuális „kasztrálásával”.
Kutatásokat végeztek a pollenfejlődés genetikai ellenőrzésének lehetőségei irányában is.
A hímsterilitás lehet „szerzett”, amely független minden genetikai manipulációtól, bármilyen rekombináns DNS út révén. A citoplazmatikus hímsterilitás megkülönböztethető a sejtmageredetű hímsterilitástól (Williams, 1995). A citoplazmatikus hímsterilitás a mitokondriális genom szerveződésében és expressziójában lévő változásokkal kapcsolatos, míg a sejtmageredetű hímsterilitás a sejtmag genomjában történt mutációkból származik.
A hímsterilitás lehet „mesterséges” is, amelyet egy hímsterilitást közvetítő gén („artificial male sterility”, AMS-gén) expressziójával váltunk ki, és amelyet vagy a mitokondriális genomba (citoplazmatikus hímsterilitás), vagy a sejtmaggenomba (sejtmageredetű hímsterilitás) inszertálunk.
A találmány szerinti megoldásban a hímsteril növény, amelyet az érdeklődés tárgyát képező, a növény genomjába integrálódott transzgén szétszóródásának megakadályozására alkalmazunk:
- vagy citoplazmatikus hímsterilitást hordoz, előnyösen a növény mitokondriális genomjába integrálódott transzgénnel kiváltott mesterséges hímsterilitást;
- vagy sejtmageredetű hímsterilitást hordoz, előnyösen a növény sejtmaggenomjának nem létfontosságú helyére inszertálódott transzgénnel kiváltott hímsterilitást.
A találmány szerinti növény előnyösen a sejtmag egy nem létfontosságú helyére történő inszercióval alakítható hímsterillé, egy olyan szekvenciával, amely tartalmaz egy AMS-gént és egy adott (az érdeklődés tárgyát képező) transzgént, és ezek a szekvenciák genetikailag kapcsolva vannak.
Az adott, érdeklődés tárgyát képező gén és az AMS-gén összekapcsolása eredményeképpen a gén pollen útján történő szétszóródása megakadályozódik, így lehetővé teszi nagyszámú, különböző termék előállítását egy és ugyanazon kísérletben.
Ezenkívül az AMS-gén átvitele magába a vad típusú növényekbe nem veszélyes, mivel az nem lesz képes megmaradni a vad típusú populációban olyan mértékben, ami már inkább „genetikai terhet” jelentene, mint bármiféle szelektív előnyt.
Az érdeklődés tárgyát képező gén és az AMS-gén közötti kapcsolat nyilvánvalóan olyan genetikai távolságot jelent, amely elegendően kicsi ahhoz, hogy a meiózis alatt bekövetkező rekombinációs gyakoriság elhanyagolható legyen.
Genetikai transzformáció útján egy növénybe bevihető két vagy akár három gén is, amelyeknek fizikai kapcsolata abszolút.
A találmány tárgya továbbá egy transzgenikus növény vagy egy transzgenikus növény egy része vagy kivonata, amelyben az adott, érdeklődés tárgyát képező transzgén genetikailag egy AMS-génhez van kapcsolva, amely olyan elemekkel van társítva, amelyek lehetővé teszik növényi sejtben való expresszióját, előnyösen egy promoterrel és egy transzkripciós terminátorral.
A találmányi gondolat alapján nyilvánvaló, hogy az AMS-gén jelenléte nem akadályozza meg az érdeklődés tárgyát képező transzgén kifejeződését.
Egy transzgenikus növény egy „része” kifejezés alatt előnyösen genetikailag transzformált növények levelei, termései és sejtjei értendők.
HU 224 706 Β1
A találmány tárgya egy vektor is, előnyösen egy plazmid, amely tartalmazza az érdeklődés tárgyát képező transzgént olyan elemekkel társítva, amelyek lehetővé teszik növényi sejtekben történő kifejeződését, előnyösen egy promoterrel és egy transzkripciós terminátorral, és amelyik genetikailag kapcsolva van egy AMS-génnel, amely növényi sejtekben való kifejeződését lehetővé tevő elemekkel van kombinálva (társítva), előnyösen egy promoterrel és egy transzkripciós terminátorral.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint mesterséges hímsterilitás elérhető egy specifikus portokpromoter ellenőrzése alatt álló, a sejtes RNS-molekulákat bontani képes fehérjéket (RNáz) kódoló szekvenciából álló génnel, mint ezt Paul W. és munkatársai (1992) közölték.
Az RNáz lehet Bacillus amyloliquefaciens barnáz. A promoter előnyösen lehet Arabidopsis thaliana A9-promoter, amely a portoktapétumra specifikus.
Az ezt a kiméra gént expresszáló növények nem képesek életképes pollent termelni a portokburkolat sejtjeinek specifikus pusztulása miatt. Ezek a növények máskülönben normálisak.
Mivel a találmány szerinti növények nem képesek életképes pollent termelni, ezért a hímsterilitás génje és az érdeklődés tárgyát képező gén pollen útján történő szétszóródásának veszélye nem áll fent.
Ezek a növények olyan növényekből származó pollen alkalmazásával szaporíthatok, amelyek nem tartalmazzák a találmány szerinti, az érdeklődés tárgyát képező gént.
Kukorica esetében a termelési szándékkal történő transzgenikus növények termesztését biztosítani lehet a mag-előállítási típus sémájának megfelelően (4 vagy 6 nőivarú vonalat 2 beporzóvonal követ). A nőivarúként alkalmazott növényeket (azokat a növényeket, amelyek tartalmazzák az érdeklődés tárgyát képező gént) kétszeres sűrűséggel vetjük. Ebben az eljárásban az érdeklődés tárgyát képező gén egy szelekciós génhez kapcsolt (például egy növényirtó szerre rezisztenciát hordozó génhez), amely következésképpen lehetővé teszi, hogy a szelektálóanyaggal (például növényirtó szerrel) történő kezeléssel a hímsteril növényeken kívül a többi növényt kiirtsuk. így azután csak a nőivarú vonalakat gyűjtjük be.
Kevert vetés is számításba jöhet a végső termelés céljából. Ebben az esetben a beporzóvonal nem tartalmazza az érdeklődés tárgyát képező gént, és 10%-os keverékben alkalmazzuk a nőivarú vonalként alkalmazott vonallal. A vetést kétszeres sűrűséggel végezzük. Ebben az esetben az egész vetésterületet begyűjtjük.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint citoplazmatikus hímsterilitást alkalmazunk a növény genomjába integrálódott transzgén szétszóródásának megakadályozására.
A citoplazmatikus hímsterilitást hordozó növények a mitokondriális genomjukban sérültek, amely képtelenné teszi azokat pollen termelésére, amennyiben az ezt a tulajdonságot helyreállítani képes sejtmagi gén hiányzik. Ez a hímsterilitás lehet „szerzett” vagy mesterségesen indukált egy citoplazmatikus hímsterilitást biztosító gén (CMS-gén), például az Ogura-gén mitokondriális genomba történő inszertálásával.
Ilyen növényeket általában a magelőállítással foglalkozó cégek alkalmaznak a magok előállításának elősegítésére. Például Európában a kukoricamag előállításának egy jelentős része az úgynevezett C típusú citoplazmatikus hímsterilitás alkalmazásán alapul.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a transzgént visszakeresztezéssel visszük be egy növényvonalba, előnyösen egy citoplazmatikus hímsterilitást hordozó kukorica-növényvonalba. Ebben az esetben a hímsteril növényeket alkalmazzuk nőivarú szülőként. Két egymás után következő visszakeresztezés, az azt követő kiértékelés és az utódok kiválogatása lehetővé teszi a transzgén homozigóta állapotának elérését.
Egy sejtmagbeli helyreállító gén (Rf4-gén a C típusú citoplazma esetén) hiányában a transzgént hordozó növény hlmsteril lesz. így egyetlen, transzgént hordozó pollenszem sem fog kiszabadulni a környezetbe. Amennyiben a növény a transzgénre homozigóta, minden begyűjtött mag hordozza a gént, és így expresszálja a fenotípust.
Az ilyen növények termelési céllal való termesztése transzgenikus hímsteril növények szomszédságába telepített beporzónövényekkel hajtható végre. Ez kivitelezhető vagy a magok keverésével (10% elegendő a beporzó növénymagokból), vagy nőivarú (hímsteril) és beporzóvonalak váltakozásával. Ez utóbbi esetben csak a nőivarúakat gyűjtjük be.
A találmány tárgya továbbá egy eljárás az érdeklődésre számot tartó transzgén expressziós termékének előállítására, amely eljárás során
a) - vagy növényi sejteket transzformálunk, előnyösen egy, a fentiekben meghatározott gazdasejt alkalmazásával, amely gazda maga is transzformálva van egy olyan vektorral, amely az érdeklődés tárgyát képező transzgént tartalmazza annak növényi sejtekben való kifejeződését lehetővé tevő elemekkel kombinálva, és amely transzgén genetikailag egy olyan AMSgénnel van összekötve, amely növényi sejtekben való kifejeződését lehetővé tevő elemekkel van kombinálva, és így egy, az érdeklődés tárgyát képező transzgénnel genetikailag kapcsolt AMS-gént integrálunk ezeknek a sejteknek a genomjába;
- vagy citoplazmatikus vagy sejtmageredetű hímsterilitást hordozó növényi sejtek transzformálása, úgy, hogy integráljuk az érdeklődés tárgyát képező transzgént ezeknek a sejteknek a genomjába;
b) transzformált növények regenerálása a fent említett transzformált sejtekből;
c) az érdeklődés tárgyát képező transzgén expressziós termékének kinyerése a fent említett transzformáit sejtekből vagy növényekből, előnyösen extrakcióval szükség esetén tisztítással követve.
A transzgenikus növények előállításával kapcsolatos másik szempont az emberre és/vagy a környezetre nézve, különösen a nagyközönség szemében, nemkívánatosnak vagy éppen károsnak ítélhető gének jelenléte.
HU 224 706 Β1
Egy transzgenikus növény előállítása érdekében sejtek milliói közül ki kell választanunk azt, amelyik a bejuttatandó változást tartalmazza. Ennek érdekében úgynevezett markergéneket alkalmaznak, amelyek általában antibiotikumokra vagy növényirtó szerekre való rezisztenciát közvetítenek. Ezeket a géneket néha nemkívánatosnak tekintik, és különböző stratégiákkal (kotranszformáció, rekombinázok alkalmazása stb.) kívánják eltávolításukat elérni.
A WO 92 01370 számú szabadalmi leírás kitanítást közöl egy, az érdeklődés tárgyát képező gént tartalmazó transzgenikus növény markergénektől mentes előállítási eljárására, amely eljárás egy transzpozíciós rendszert alkalmaz.
A WO 91 09957 számú szabadalmi leírás továbbá kitanítást közöl növényi sejtek egy helyspecifikus rekombinációs eljárására, ahol egy Cre/lox rendszert alkalmaznak DNS-részek deléciójára, inszerciójára vagy reciprok kicserélésére. A leírt eljárás alkalmazható a markergén eltávolítására. A benyújtó megemlíti ennek az eljárásnak a termékenyítőképesség génmérnöki eszközökkel történő helyreállításával kapcsolatos alkalmazását is hibrid magok előállításának összefüggésében.
A technikában ezt megelőzően azonban hímsterilitást nem alkalmaztak markerként, mint olyanként szűrővizsgálati eljárásokban.
A találmány egy megvalósítási módja szerint az AMS-gén pozitív markerként szolgál az érdeklődés tárgyát képező transzgént integráltan tartalmazó növények szűrővizsgálatára olyan egyedek szelektálásával, amelyek az AMS-gént tartalmazzák.
Az AMS-gén jelenléte kimutatható előnyösen polimeráz-láncreakció (PCR) és/vagy Southern-blot-analízises molekuláris vizsgálati eljárásokkal, a szokásos technikákkal összhangban (Sambrook és munkatársai, 1989). A hímsterilitással rendelkező növények nagyon egyszerűen kiválaszthatók a pollenszemek kifejlődésének megléte vagy hiánya alapján is. A pozitív markerként használt AMS-gén azután nemkívánatosnak tekinthető és kivágható.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint az AMS-gén lehetővé teszi egy nemkívánatos exogén DNS-fragmens megszüntetésére szolgáló eljárás javítását a genetikailag transzformált növényekre való szűrővizsgálat eljárásaival kapcsolatosan.
A megfelelő hatékonyság elérése érdekében a markergén alkalmazásán alapuló létező szűrővizsgálati eljárásoknak, amelyeket például a fent említett szabadalmi leírásokban közöltek, nagyon nagy frekvenciával kell működniük. Azok a sejtek vagy növények, amelyek a markergént elvesztették, többé nem választhatók el azoktól, amiből származnak. A szűrővizsgálat így azután olyan molekuláris eljárásokon alapul, amelyek nehezek és vesződségesek.
Felismertük a mesterséges hímsterilitást közvetítő gén (AMS-gén) alkalmazásának értékét egy kivágódási esemény „öngyilkos markereként vagy „negatív markereként”, nevezetesen, hogy csak azok az egyedek fognak szaporodni, amelyek elvesztették a markergént. Ez lehetővé teszi olyan stratégiáknak az alkalmazását egy nemkívánatos exogén DNS-fragmens megszüntetésére, amelynek alacsony a hozama, és így lehetővé teszi ebben a tárgykörben a vizsgálatok területének kiszélesítését.
A találmány szerinti AMS-gén genetikailag kapcsolva van egy nemkívánatos DNS-fragmenshez, úgyhogy az AMS-gén és a nemkívánatos DNS-fragmens együtt kivágható.
A nemkívánatos exogén DNS-fragmens előnyösen lehet egy markergén, előnyösen egy antibiotikumrezisztenciát biztosító gén.
Általánosságban a nemkívánatos gének megszüntetésére szolgáló rendszerek két komponensből állnak: egy kivágható DNS-fragmensből, amely a nemkívánatos gént tartalmazza, és a kivágás egy indukálójából.
A találmány egy megvalósítási módja szerint a mesterséges hímsterilitást biztosító gént bevisszük a kivágható fragmensbe. Az ezzel az első komponenssel transzformált növények hímsterilek lesznek, és visszakeresztezéssel tarthatók fent. A keresztezéssel bevitt indukáló az AMS-gént tartalmazó DNS-fragmens megszűnéséhez vezet, ezáltal kiváltja az önmegtermékenyítésből származó termések fejlődését. Ezek a termések olyan egyedeket tartalmaznak, amelyekből az AMS-gén és a nemkívánatos gén hiányzik.
Gyakorlatilag elegendő csak a két komponenst tartalmazó F1 növények önmegtermékenyítéséből származó magokat begyűjteni.
A találmány egy másik megvalósítási módja szerint az AMS-gént tartalmazó, kivágható DNS-fragmenst a genomjába beépített növényt egy olyan DNS-fragmenssel transzformálunk, amely indukálja a kivágást.
A találmány szerinti kivágási rendszer a nemkívánatos DNS-fragmens megszüntetésére lehet egy transzpozíciós rendszer, mint például előnyösen a kukorica Ac/Ds rendszere, vagy egy rekombinációs rendszer, mint például előnyösen a P1-bakteriofág Cre/lox rendszere, az élesztő FLP/FRT rendszere, a Mu-fág Gin-rekombináza, az E. coli Pin-rekombináza vagy a pSR1-plazmid R/RS rendszere.
A találmány kidolgozásával célunk volt egy olyan vektor létrehozása is, előnyösen egy plazmidé, amely egy nemkívánatos génből és az AMS-génből álló kivágható DNS-fragmenst tartalmaz, a nemkívánatos DNS-fragmens előnyösen egy markergén, előnyösen egy antibiotikumrezisztenciát hordozó gén, az AMSgén és a nemkívánatos DNS-fragmens mindegyike társítva van olyan elemekkel, amelyek lehetővé teszik a növényi sejtben való kifejeződésüket, előnyösen egy promoterrel és egy transzkripciós terminátorral.
A találmány szerinti vektort alkalmazzuk a növénysejtek transzformálására.
A találmány tárgya végül egy reagenskészlet kivágható fragmensek megszüntetésére szolgáló eljárások végrehajtására, amely tartalmazza egyrészről a fentiekben meghatározott vektort, amely vektor az érdeklődés tárgyát képező transzgénből, és vele társított olyan elemekből áll, amelyek lehetővé teszik a növényi sejtekben történő expresszálódását, és genetikailag
HU 224 706 Β1 kapcsolva van egy olyan elemekkel egyesített AMSgénnel, amelyek lehetővé teszik a kivágható AMS-gént tartalmazó növényi sejtekben történő expresszióját, vagy egy növény vagy növényi rész, amelyet a vektorral transzformálunk, és másrészről egy vektort, amely transzpozáz- vagy rekombinázforrást hordoz, vagy egy növény vagy növényi rész, amelyet a vektorral transzformálunk.
A növényi sejtek transzformálhatok a fent említett vektorok protoplasztokba történő bevitelével, előnyösen a protoplasztoknak polietilénglikol (PG)-oldatban kétértékű kationok (Ca2+) jelenlétében való inkubálása után Krens és munkatársai (1982) cikkében közölt eljárás szerint.
A növényi sejtek elektroporációval is transzformálhatok, előnyösen Fromm és munkatársai (1986) cikkében közölt eljárás szerint. A növényi sejtek transzformálhatok úgynevezett génpuskával (gene gun) is, amely az érdeklődés tárgyát képező DNS-szekvenciákkal borított fémrészecskéket nagyon nagy sebességgel képes kirepíteni, ily módon a gént a sejtmag belsejébe viszi, előnyösen Sanford (1988) cikkében leírt technika szerint.
Egy másik módszer növényi sejtek transzformálására a citoplazmatikus vagy sejtmagi mikroinjekció.
A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint a növényi sejteket a találmány szerinti vektorral transzformáljuk a növényi sejteket fertőzni képes sejtgazdával, így lehetővé téve, hogy az eredetileg a fent említett vektor genomjában lévő, az érdeklődés tárgyát képező DNS-szekvencia ezeknek a növényi sejteknek a genomjába integrálódjon.
Előnyösen a fent említett, alkalmazott sejtgazda Agrobacterium tumefaciens, előnyösen Bevan (1984) és An és munkatársai (1986) cikkében leírt eljárások szerint, vagy még Agrobacterium rhizogenes, előnyösen Jouanin és munkatársai (1987) cikkében leírt eljárás szerint.
Előnyösen a növényi sejteket Agrobacterium tumefaciens Ti-tumorkeltő extrakromoszomális cirkuláris plazmidja T-régiójának átvitelével transzformáljuk egy bináris rendszer alkalmazásával (Watson és munkatársai).
Erre a célra két vektort hozunk létre. Az egyik vektorban a T-DNS-régiót delécióval eltávolítottuk a bal és jobb oldali szélső részek kivételével, és egy markergént inszertáltunk közéjük, hogy lehetővé tegye a növényi sejtekben történő szelekciót. A bináris rendszer másik partnere egy segítő Ti-plazmid, azaz egy módosított plazmid, amelyben már nincsen T-DNS, de tartalmazza a növényi sejt transzformálásához szükséges v/r-virulenciagéneket. Ezt a plazmidot Agrobacteriumban tartjuk fent.
Az AMS-gén és az érdeklődés tárgyát képező gén egyesíthető egymással, vagy mindegyik külön-külön egy transzkripciós ellenőrző rendszerrel, előnyösen egy promoterrel és egy transzkripciós terminátorral.
Az AMS-gén előnyösen egyesíthető egy transzkripcionális ellenőrző rendszerrel, amely egy, a portokban történő specifikus expressziót lehetővé tevő promoterből, például az A3- vagy A9-promoterekből (WO
11379) vagy a TA29-, TA26- vagy TA13-promoterekből (WO 89 10396) áll.
Az alkalmazható és megemlíthető transzkripciós terminátorok: karfiol mozaíkvírusának (CaMV) polyA 35Stermínátora, amelyet Franck és munkatársai (1980) írtak le a cikkükben, vagy a polyA NOS-terminátor, amely Agrobacterium tumefaciens nopalin törzs Ti-plazmidja nopalin-szintetáz-génje 3’-nemkódoló régiójának felel meg (Depicker és munkatársai, 1982).
A különösképpen említésre méltó, az érdeklődés tárgyát képező génnel egyesítve alkalmazható transzkripciós promoterek például a következők:
- a 35S-promoter, vagy előnyösen a CaMV 35S kettős konstitutív promoter (35Sdp), amelyet Kay és munkatársai írtak le a cikkükben (1987);
- a retek kruciferingénjének PCRU-promotere, amely lehetővé teszi a találmány szerinti rekombináns polipeptidek expresszálását kizárólag a találmány szerinti eljárással transzformált sejtekből kapott növény magjaiban (vagy a szemeiben), amit Depigny-This és munkatársai írtak le (1992);
- a PGEA1- és PGEA6-promoterek, amelyek megfelelnek Arabidopsis thaliana GEA1, illetve GEA6 magi raktározó fehérjegének 5’-nemkódoló régiójának (Gaubier és munkatársai, 1993), és amelyek a magokban történő specifikus expressziót teszik lehetővé;
- az SPP-szuperpromoter kiméra promoter (Ni M. és munkatársai, 1995), amely Agrobacterium tumefaciens octopin-szintáz-gén promotere transzkripciós aktivátor eleme háromszoros ismétlésének fúziójából, mannopin-szintáz-gén promoterének transzkripciós aktivátor eleméből és Agrobacterium tumefaciens mannopin-szintáz promoteréből áll;
- rizs aktinpromoterét követő rizs aktinintron (RAP-RAI) a McElroy és munkatársai által leírt (1991) pAct1-F4-plazmidban;
- árpa HMWG- (high molecular weight glutenine, nagy molekulasúlyú glutenin) promoter (Anderson O. D. és munkatársai, 1989);
- kukorica γ-zein génjének promotere (Pyzein), amelyet a PY63-plazmid (Reina és munkatársai, 1990) tartalmaz, és amely lehetővé teszi a kukoricamagok fehérjéjében való expressziót.
Előnyösen a hímsterilitásért felelős gént és az érdeklődés tárgyát képező gént kombináljuk egy vagy több, olyan peptidet kódoló szekvenciával, amely peptid a rekombináns polipeptideknek a növényi sejt egy előre meghatározott kompartmentjébe, előnyösen az endoplazmás retikulumba vagy a vakuólumokba vagy a sejt külső részébe, a pektocellulózfalba vagy az apoplazmának is nevezett extracelluláris térbe történő irányításáért felelős.
Ezek az irányítópeptidet kódoló szekvenciák lehetnek növényi, humán vagy állati eredetűek.
A növényi eredetű irányítófehérjét kódoló szekvenciák, amelyek itt megemlíthetők, a következők:
HU 224 706 Β1
- a 69 nukleotidból álló nukleotidszekvencia (az alábbi példákban feltüntetve), amely az édesburgonyában a sporamin-A 23 aminosavból álló prepeptidjét (szignálpeptid) kódolja, amely szignálpeptiddel lehetővé válik, hogy a találmány szerinti rekombináns polipeptidek belépjenek a találmány szerint transzformált növényi sejtek kiválasztórendszerébe (nevezetesen jórészt az endoplazmás retikulumba);
- a 42 nukleotidból álló nukleotidszekvencia (az alábbi példákban feltüntetve), amely az édesburgonyában a sporamin-A vakuolairányító N-terminális propeptidjének 14 aminosavát kódolja, és amely lehetővé teszi a találmány szerinti rekombináns polipeptidek felhalmozását a találmány szerint transzformált növényi sejtekben;
- a 111 nukleotidból álló nukleotidszekvencia (az alábbi példákban feltüntetve), amely a sporamin-A 37 aminosavból álló prepropeptidjét kódolja, amely a fent említett szignálpeptid 23 aminosavát tartalmazza az N-terminális résztől a C-terminális felé, amelyet a 14 aminosavból álló fent említett propeptid követ, és ezzel a prepropeptiddel a találmány szerinti rekombináns polipeptidek képesek belépni a találmány szerint transzformált növényi sejtek kiválasztórendszerébe és felhalmozódni vakuólumokban. Az előbb említett három szekvenciát Murakami és munkatársai (1986) és Matsuoka és munkatársai (1991) közölték;
- az árpa lektinjének karboxiterminális propeptidje, amelyet elsősorban Schroeder és munkatársai (1993) és Bednarek és munkatársai (1991) közöltek;
- és a PRS (pathogenesis-related protein, patogenezissel társult fehérje, Cornelissen és munkatársai, 1986), amely a szekréciót teszi lehetővé.
Az itt szintén megemlíthető, irányítópeptidet kódoló egyik szekvencia a KDEL-, SEKDEL- és HDEL-peptidek C-terminális végét kódolja, és az endoplazmatikus retikulumba irányít.
A találmány szerint transzformálható növényi sejtek közül példaképpen kiemelhetők a repce, dohánynövény, kukorica, borsó, paradicsom, sárgarépa, búza, árpa, burgonya, szójabab, napraforgó, saláta, rizs és lucerna.
A növényi sejt genomjába integrálandó szóban forgó gének lehetnek előnyösen humán vagy állati eredetű fehérjéket kódoló gének gyógyászati vagy kórmegelőző jelentőséggel, mint például kollagén, gyomoreredetű lipáz stb.
Az alkalmazott markergének lehetnek előnyösen antibiotikumrezisztenciát hordozó gének, például higromicin, kanamicin, bleomicin vagy sztreptomicin, vagy növényirtószer-rezisztenciát hordozó gének, például glufozinát, glifozát vagy bromoxinil.
Példák
Több plazmidot hoztunk létre és ligáltunk, és előzőleg kompetenssé tett Escherichia coli DH5a baktériumokat transzformáltunk a szokásos rekombináns DNStechnikák alkalmazásával (Sambrook és munkatársai,
1989).
1. példa
Repce transzgenezisében alkalmazható bináris plazmid készítése, amely egyesíti a PR-glukanázt kódoló gén közvetítette hímsterilitást, kutya gyomoreredetű lipázának termelését, kanamicinen és bastán történő szelekciót
A pGA492 „bináris” plazmidszármazéka (An, 1986), amely a következő szekvenciákat tartalmazza az Agrobacterium tumefaciens pTiT37-plazmidból származó jobb és bal oldali határolórészek közötti szállító DNSszakaszban: a nopalin-szintázt kódoló nos-gén konstitutív promoterét (Depicker és munkatársai, 1982), a kanamicinrezisztenciát biztosító neomicin-foszfotranszferázt kódoló NPTII-gént kódoló szekvenciát (Berg és Berg, 1983), amely szekvencia első nyolc kodonja deletálva van, beleértve a metionin ATG startkodont, és fuzionáltatva van a nos-gént kódoló szekvencia első 14 kodonjának szekvenciájához (Depicker és munkatársai, 1982), a nos-gént kódoló szekvenciát, amelyben azonban hiányzik az első 14 kodon, a nos-terminátort (Depicker és munkatársai, 1982), a többszörös klónozóhelyet tartalmazó régiót (amelyet polilinkernek is hívnak) (Hindlll-Xbal-Sacl-Hpal-Kpnl-Clal-Bglll), és amelyik megelőzi a CAT-gént, amely kloramfenikol-acetiltranszferázt kódol (Close és Rodriguez, 1982) és az Agrobacterium tumefaciens pTiA6-plazmid hatos génjének terminátorszekvenciáit (Liu és munkatársai, 1993).
a) Hímsterilitást biztosító gént tartalmazó pBIOCőOO-plazmid készítése A pDW80PR-ben lévő „A9-PR-glukanáz-T35S-promoternek” megfelelő kiméra gént alkalmaztuk (Worall és munkatársai, 1992). Az ezt a kiméra gént hordozó Kpnl/EcoRV fragmenst Kpnl és EcoRV enzimekkel történt kettős enzimes emésztéssel izoláltuk, elektroelúcióval tisztítottuk az elektroforetikus migrációt követve 0,8%-os agarózgélen, alkohollal kicsapva és azután szárítva. A Stratagene pBluescript KS+ jelű plazmidjának Kphl és Smal helyeire inszertáltuk. A ligálást 14 °C-on 16 órán keresztül végeztük 100 ng defoszforilált plazmid és 50 ng Kpnl/EcoRV fragmensek alkalmazásával 10 μΙ-es reakcióelegyben 1 μΙ 10*T4-DNS-ligáz pufferben (Amersham) és 2,5 U T4-DNS-ligáz enzim (Amersham) jelenlétében. Kompetens Escherichia coli DH5a baktériumokat transzformáltunk. A képződő, milliliterenként 50 pg ampicillint tartalmazó táptalajon szelektált kiónok plazmid DNS-ét alkalikus lízissel extraháltuk és restrikciós enzimes emésztéssel vizsgáltuk. A képződő plazmid Kpnl/Sstl fragmensét, amely a fent említett kiméra gént hordozza, bevittük pGA492 Kpnl és Ssíl helyei közé. A kiméra fragmenst a hagyományos eljárásokkal izoláltuk. A ligálást 14 °C-on 16 órán keresztül végeztük 100 ng defoszforilált vektor és 50 ng Kpnl/Sstl fragmenst tartalmazó fragmens alkalmazásával 10 ml reakcióelegyben 1 μΙ 10*T4-DNS-ligáz pufferben (Amersham) és 2,5 U T4-DNS-ligáz en6
HU 224 706 Β1 zim (Amersham) jelenlétében. Kompetens Escherichia coli DH5a baktériumokat transzformáltunk. A képződő, milliliterenként 12 pg tetraciklint tartalmazó táptalajon szelektált kiónok plazmid DNS-ét alkalikus lízissel extraháltuk és restrikciós enzimes emésztéssel vizsgáltuk. A képződő vektort pBIOC500-nak neveztük el.
b) Bastával szemben rezisztenciát biztosító gént hordozó pBIOC501 -plazmid készítése
A plB16.1-plazmidból (Broerés munkatársai, 1988) izolált, kiméra „P35S-pat-TNOS”-gént hordozó EcoRl/Hindlll fragmenst egy, a polilinkerszekvenciában a Smal helybe bevitt Kpnl hely bevitelével módosított pBSIISK+ (eredeti formájában a Stratagene árusításában) EcoRI és Hindlll helyei közé inszertáltuk. A képződő plazmidot pBIOC501-nek neveztük. A képződő, milliliterenként 50 pg ampicillint tartalmazó táptalajon szelektált kiónok plazmid DNS-ét alkalikus lízissel extraháltuk és restrikciós enzimes emésztéssel vizsgáltuk.
c) Kutya gyomoreredetű lipázát kódoló gént hordozó PBIOC502-plazmid készítése
A WO 9633277 számú szabadalmi leírásban közzétett pBIOC93-ból izolált „PCRU-PSLGL-LGCT35S”-nek megfelelő kiméra gén egy, Saci és Xhol enzimekkel történő kettős emésztéssel kapott fragmensen található, a Saci helyet T4-DNS-polimeráz enzim (New England Biolabs) működésével helyreállítva a gyártó útmutatása alapján. Ezt a fragmenst a pBIOC501-plazmid T4-DNS-polimeráz enzimmel kezelt Apai helye és Xhol helye közé inszertáltuk. A képződő plazmidot pBIOC502-nek neveztük. A képződő, milliliterenként 50 pg ampicillint tartalmazó táptalajon szelektált kiónok plazmid DNS-ét alkalikus lízissel extraháltuk és restrikciós enzimes emésztéssel vizsgáltuk.
d) A pBIOC503 bináris vektor elkészítése
A „PCRU-PSLGL-LGC-T35S” és „P35S-pat-TNOS” expressziós kazettákat hordozó Kpnl-fragmenst pBIOC502-ből izoláltuk és pBIOC500 Kpnl helyére ligáltuk. A képződő plazmidot pBIOC503-nak neveztük. A képződő, milliliterenként 12 pg ampicillint tartalmazó táptalajon szelektált kiónok plazmid DNS-ét alkalikus lízissel extraháltuk és restrikciós enzimes emésztéssel vizsgáltuk.
A pBIOC503-plazmid DNS-ét direkt transzformációval bevittük Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzsébe Holster és munkatársai (1978) eljárása szerint.
2. példa
Repce transzgenezisében alkalmazható barnázt kódoló gén közvetítette hímsterilitást kutya gyomoreredetű lipáztermelésével, kanamicinen és bastán való szelekcióval egyesítő bináris plazmid készítése
a) Hímsterilitást biztosító gént hordozó pBIOC504-plazmid készítése A pWP173-ban (Paul és munkatársai, 1992) lévő „A9-barnáz-T35S-promoternek” megfelelő kiméra gént alkalmaztuk. Az ezt a kiméra gént hordozó Kpnl/EcoRV fragmenst inszertáltuk a pBluescript KS+ jelű plazmid (Stratagene) Kpnl és Smal helyeibe. A fent említett kiméra gént hordozó Kpnl/Sstl fragmenst a képződő plazmidból nyertük, és pGA492 Kpnl és Ssíl helyeibe vittük be. A képződő vektort pBIOC504-nek neveztük. A képződő, milliliterenként 50 pg ampicillint tartalmazó táptalajon szelektált kiónok plazmid DNS-ét alkalikus lízissel extraháltuk és restrikciós enzimes emésztéssel vizsgáltuk.
b) Bastára rezisztenciát biztosító gént hordozó
PBIOC501-plazmid elkészítése
A vektort az 1. példa b) részében leírtak alapján készítettük el.
c) Kutya gyomoreredetű lipázát kódoló gént hordozó pBIOC502-plazmid elkészítése
A pBIOC502-vektort az 1. példa c) részében leírtak alapján készítettük el.
d) A pBIOC505-vektor elkészítése
A „PCRU-PSLGL-LGC-T35S” és „P35S-pat-TNOS” expressziós kazettákat tartalmazó Kpnl-fragmenst a pBIOC502-ből izoláltuk és a pBIOC504 Kpnl helyére ligáltuk. A képződő plazmidot pBIOC505-nek neveztük. A képződő, milliliterenként 50 pg ampicillint tartalmazó táptalajon szelektált kiónok plazmid DNS-ét alkalikus lízissel extraháltuk és restrikciós enzimes emésztéssel vizsgáltuk.
A pBIOC505-plazmid DNS-ét direkt transzformációval bevittük Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzsébe Holsters és munkatársai (1978) eljárását követve.
3. példa
Transzgenikus repcenövények előállítása
Tavaszi repce (Brassica napus cv WESTAR vagy Limagrain vonalak) magját 40 percen keresztül 15%-os Domestos oldatban fertőtlenítettük. Négyszeri, steril vízzel történő öblítést követően a magokat elültettük, egy-egy 7 cm átmérőjű és 10 cm magasságú virágcserépbe 20 magot ültettünk Murashige és Skoog (Sigma M 5519) ásványi tápközegbe, amely 30 g/l szacharózt tartalmaz, és amelyet 5 g/l agargéllel szilárdítunk. A virágcserepeket azután 26 °C-os tenyésztőkamrába helyezzük 16h/8h fotoperiódussal 80 pE.m_2.S_1 fényerősséggel.
Ötnapi csíráztatás után a szikleveleket sterilen összegyűjtöttük a levélnyélnek körülbelül 1 mm-rel a sziklevélcsomó feletti elvágásával.
Ezzel párhuzamosan a bináris plazmidokat tartalmazó Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzset előtenyésztjük 28 °C-on 36 órán keresztül 50 ml-es Erlenmeyer-lombikban az alkalmazott törzs szelektálására alkalmazható antibiotikummal kiegészített 10 ml 2YT-baktérium táptalajban (Sambrook és munkatársai, 1989).
Ezt az előtenyésztést alkalmazzuk ugyanilyen körülmények között 1%-os koncentrációnál egy új baktériumkultúra kialakítására. Tizennégy óra múltán a kultúrát lecentrifugáljuk 3000 g-vel 15 percen keresztül, és a baktériumokat azonos mennyiségű folyékony csíráztató tápközegben vesszük fel. A szuszpenziót szétosztjuk 5 cm-es Petri-csészékbe 5 ml/csésze rátával.
A nyél levágott végét néhány másodpercre az ily módon készített agrobaktériumokat tartalmazó oldatba
HU 224 706 Β1 merítjük, majd ezután a levélnyelet néhány milliméternyíre a regenerációs tápközegbe szúrjuk. Ez a tápközeg ugyanolyan alap-összetételű, mint a csíráztató tápközeg, azzal a kivétellel, hogy még 4 mg/l benzil-amino-purint (BAP) tartalmaz, amely egy, az új rügyek képzését elősegítő fitohormon. Tíz explantátumot (sziklevelet nyéllel) termesztünk egy 9 cm átmérőjű Petri-csészében (Greiner, kát. sz. 664102).
Kétnapos, a csíráztatáshoz hasonló környezeti körülmények között végzett együtt termesztés után az explantátumokat átültetjük növényültetéshez használt tálcákra (Sigma, kát. sz. P1552), amelyek az előző tápközeget tartalmazzák kiegészítve egy szelekciós anyaggal: 45 mg/l kanamicin-szulfát (Sigma, kát. sz. K4000) és egy bakteriosztatikus anyaggal: egyhatod súlyarányban clavulánsav káliumsója és öthatod súlyarányban amoxicillin nátriumsója (injekciózható Augmeritin®) 600 mg/l rátával.
Kétszer egymás után háromhetes szünettel az explantátumokat steril körülmények között új tápközegre ültetjük át ugyanolyan körülmények közé.
A második vagy harmadik átültetés végén megjelenő zöld rügyeket leválasztjuk az explantátumokról, és egyenként termesztjük 5 cm átmérőjű és 10 cm magas átlátszó virágcserepekben, az előzővel azonos, de BAP nélküli tápközegben. Háromheti tenyésztés után a transzformált rügy szárát levágjuk, és a rügyet áthelyezzük egy új virágcserépbe, friss tápközeggel. Három-négy hét elteltével a gyökerek eléggé kifejlődnek ahhoz, hogy a csíranövény fitotronban akklimatizálódni tudjon. A nem zöld vagy gyökeres rügyeket eltávolítjuk, Ezeket a csíranövényeket azután vízzel telített komposzttal (NF U44551 standard: 40% barna tőzeg, 30% szitált hangás talaj és 30% homok) töltött 7 cm oldalú virágcserépbe ültetjük át. Kéthetes fitotronban történő akklimatizálódás után (hőmérséklet: 21 °C, fotoperiódus: 16h/8h és 84% relatív páratartalom), a csíranövényeket átültetjük lassú felszabadulású trágyával (4 g Osmocote/I komposzt) kiegészített, ugyanolyan komposzttal töltött 12 cm átmérőjű virágcserepekbe, és üvegházba (S2 osztályú) vittük, a hőmérsékletet 18 °C-ra állítottuk, és a csíranövényeket naponta kétszer, minden egyes alkalommal két-két percig öntöztük.
Amint a virágok megjelentek, a keresztmegtermékenyítés megakadályozása érdekében zacskóba csomagoltuk azokat (Crispac, kát. sz. SM 570γ 300 mm-700 mm).
A becőterméseket beérésükkor begyűjtjük, szárítjuk, majd kicsépeljük. A kapott magokat használjuk a kérdéses gén biokémiai aktivitásának vizsgálatára.
A transzgenikus utódot 100-150 mg/l (a genotípustól függően) koncentrációjú kanamicin-szulfát-tartalmú táptalajon történő csíráztatással szelektáljuk. A kivitelezési körülmények azonosak a fentiekben leírtakkal azzal a kivétellel, hogy a csíráztatást üvegcsőben végezzük, csövenként egyetlen magot alkalmazva. Csak azokat a csíranövényeket akklimatizáljuk fitotronban az üvegházba történő kiültetés előtt, amelyek másodlagos gyökereket fejlesztettek az első három hét alatt.
4. példa
Transzgenikus dohánynövények előállítása
A transzformációs kísérletekhez használt dohánynövényeket (Nicotiana tabacum var. Xanthi NC és PBD6) in vitro termesztjük Murashige és Skoog (1962) alaptápközegen, amely ezenkívül még Gamborg és munkatársai (1968) vitaminokat (Sigma, kát. sz. M0404), 20 g/l szacharózt és 8 g/l agart (Merck) tartalmaz. A tápközeg pH-ját 5,8-re állítjuk kálium-hidroxidoldattal 120 °C-on 20 percig történő autoklávozás előtt. A dohánycsíranövényeket 30 naponként átültetjük szártagok közti vágásokkal erre az MS20 tenyésztő tápközegre.
Minden in vitro kultúrát légkondicionált, zárt területen tartunk a következőkben meghatározott feltételek mellett:
- 30 pE.m_2.S“1 fényerősség, 16 órás fotoperiódus;
- a hőmérsékleti periódus: nappal 26 °C, éjjel 24 °C.
Az alkalmazott transzformációs technika Horsch és munkatársaitól (1985) származik.
A bináris plazmidokat tartalmazó Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzset 28 °C-on 48 órán keresztül előtenyésztjük rázatással a megfelelő antibiotikumokkal (kanamicin) kiegészített LB-tápközegben (Sambrook és munkatársai, 1989). Az előtenyésztett kultúrát azután 1/50 arányban kihígítjuk ugyanavval a tápközeggel, és ugyanolyan feltételek mellett tenyésztjük. Egy éjszakán keresztül történő inkubációt követően a kultúrát lecentrifugáljuk (3000 g, 10 perc), és a baktériumokat azonos mennyiségű folyékony MS30-tápközegben (30 g/l szacharóz) vesszük fel, majd ezt a szuszpenziót 1/10 arányban hígítjuk.
Körülbelül egy cm2 nagyságú explantátumokat vágunk a fent leírt csíranövények leveleiből. Ezeket azután érintkezésbe hozzuk a baktériumos szuszpenzióval egy órán keresztül, majd ezután szűrőpapíron gyorsan leszárítjuk és a termesztő tápközegre helyezzük (szilárd MS30).
Két nap múlva az explantátumokat Petri-csészékre, MS30 regenerációs tápközegre visszük, a tápközeget egy szelekciós anyaggal kiegészítve, azaz kanamicinnel (2000 mg/l), egy bakteriosztatikus anyaggal, azaz Augmentin®-nel (400 mg/l), és a rügyek indukálásához szükséges hormonokkal (1 mg/l BAP és 0,1 mg/l ANA). Kéthetes tenyésztés után az explantátumokat ugyanerre a tápközegre ültetjük át. Újabb két hét múlva a rügyeket kanamicinnel és Augmentinnel kiegészített MS20-tápközegből álló kifejlesztő tápközegre ültetjük át Petri-csészékbe. Tizenöt nap múlva a rügyek felét átültetjük. A gyökeresedés körülbelül 20 napot vesz igénybe, amely végén a csíranövények szártag közötti vágásokkal klónozhatok, és üvegházba vihetők.
5. példa
A transzpozázforrás készítése
Egy bináris plazmidot hoztunk létre, amely hordozta rögzített transzpozáz egy forrását a 35S-promoter alatt, mivel ez utóbbiról bebizonyosodott, hogy ennek a
HU 224 706 Β1 transzpozáznak erős és korai expresszióját okozza (Finnegan és munkatársai, 1993).
Ennek érdekében a pBI35S-Ac (Finnegan készítette) BamHI/EcoRI fragmensét a pBI121 (Jefferson és munkatársai, 1987) BamHI és SnaBI helyeibe klónoztuk. A képződő, pBIOS144-nek nevezett plazmid a bal és a jobb határolószakaszai között tartalmazza a kanamicin-rezisztenciagént, azaz az NPTII-t a nos-promoter és terminátor irányítása alatt, az Ac-elemet, amelynek 5’-része deletálva lett, és amelyik a 35S-promoter ellenőrzése alatt áll, és amely így alkotja a rögzített transzpozáz forrását, és E. coli β-glükuronidázát kódoló gén (GUS-gén, a 3. ábrában dél GUS jellel jelölve) ö’-részének 1400 bázispárját, és végül a nos-terminátort.
6. példa
A Ds:KanaR-AMS-elem elkészítése
Ennek a vektornak az elkészítéséhez vezető egymás utáni lépések a következők:
a) A kanamicin-rezisztenciagént hordozó pBIOC203-plazmid elkészítése
A pCamVNEO (Fromm és munkatársai, 1986) 1 kb nagyságú BamHI-fragmensét (az NPTII-génnek felel meg) a pBIOSI (Perez és munkatársai, 1989) BamHI helyére inszertáltuk. A képződő pBIOS-1K-vektort EcoRl-gyel emésztettük. A BIOS-1K-ból származó EcoRIfragmenst Klenow-polimerázzal tompa végűvé alakítottuk, és az AF-3Ac-plazmid (Cocherel és munkatársai, 1996) EcoRI helyére klónoztuk, így alakítva ki a pBIOS203-at.
b) Az AMS-gént hordozó pBIOS208-plazmid elkészítése
A pBGS-phleo-vektor EcoRI-fragmensét, amely az Ac-elem 5'-végéből 399 bázispárt tartalmaz (Cocherel és munkatársai, 1996), pBSsk (Stratagene) EcoRI helyére klónoztuk, így alakítva ki a pBIOS204-et.
A pBIOS203-ból származó EcoRI/HindlII fragmenst (amely az AC 3’-végéből és az NPTII-kazettából áll) klónoztuk pBSsk EcoRI-H/ndlII helyeire, így alakítva ki a pBIOS205-öt.
A pBIOS204-ből származó Smal-fragmenst (az Ac 5'-vége) a pBIOS205 Smal helyére klónoztuk, így alakítva ki a pBIOS206-ot.
Az A9-promoter és a CaMV-terminátor ellenőrzése alatt álló PR-glükanázgént (PR-Glu) tartalmazó DW80bin-PRglukanázból (Worall és munkatársai, 1992) származó Sphl-fragmenst pBIOS206 EcoRI helyére klónoztuk. A képződő plazmidban, azaz a pBIOS208-ban, az A9-PR-glükanázgént ellentétes orientációban inszertáltuk az NPTII-génhez.
c) A Ds:KanaR-AMS-elem inszertálása a bináris vektorba
A pGA492DL-vektort a pGA492-n (G. An.) végrehajtott következő módosítások után kaptuk:
- a kiméra NPTII-gént expresszáló kazettának megfelelő Sacll/Clal fragmens deléciója. Ezt az új vektort neveztük pGA492D-nek;
- a pGA492D Bglll/Scal fragmensének helyettesítése (a CAT-gén egy részének elvesztése) a pBSIIsk Sacl/Kpnl polilinkerével. Ezt az új vektort jelöltük pGA492DL-nek.
A pBIOS208-ból származó HindiIl/Spel fragmenst a pGA492DL HindUUSpel helyeire klónoztuk, hogy létrehozzuk a bináris pBIOS232-plazmidot. Ennek a T-DNS-nek a szerkezetét az 1. és a 2. ábrák diagramjain mutatjuk be.
7. példa
Paradicsom transzformációja és szelekciója a) Paradicsom (UC82B változat) transzformációja az elkészített bináris vektorral
A pBIOS232 bináris vektort bevittük Agrobacterium LBA4404 törzsébe háromszülős konjugációval, Ditta és munkatársai által leírt technika szerint.
A paradicsomot J. Fillatti technikájának módosított változata szerint transzformáltuk:
Az UC82B kultúrnövény magjait 15 percig 10%-os Domestosban fertőtlenítjük, majd háromszor steril vízzel öblítjük.
Ezután a magokat MSSV/2 jelű termesztő tápközeget tartalmazó virágcserepekbe ültetjük hét vagy nyolc napra.
A szikleveleket eltávolítjuk és átlósan három részre vágjuk. Csak a központi részt tartjuk meg, ezzel a résszel kultúrát készítünk 26 °C-on, fényben, Acetosyringone-nal kiegészített KCMS-tápközegen, az alsó felülettel a tápközeg felé.
Agrobacterium LBA4404 törzset egy éjszakán keresztül tenyésztünk a megfelelő szelekciós anyaggal (tetraciklin) kiegészített LB-tápközegben. A következő napon a tenyészetet lecentrifugáljuk, és a képződő üledéket folyékony KCMS-tápközegben vesszük fel.
Az explantátumokat körülbelül 30 percig Acetosyringone-nal kiegészített KCMS-tápközeggel 1/20 arányban hígított Agrobacterium-tartalmú oldatba áztatjuk, majd szűrőpapíron gyorsan megszárítjuk.
Az explantátumokat azután:
- áthelyezzük ugyanarra a KCMS-tápközegre két napig, sötétben és 26 °C-on;
- Augmentinnel (400 mg/l) kiegészített folyékony 2Z-tápközegben mossuk és szűrőpapíron szárítjuk;
- áthelyezzük 400 mg/l Augmentint és 100 mg/l kanamicint tartalmazó szilárd 2Z-tápközegre, fényben 26 °C-on tenyésztjük; és
- átültetjük friss 2Z-tápközegre két héttel később. Az első rügyek három héttel a kiültetés után jelennek meg. Amikor elérik a körülbelül 1 cm-es nagyságot, leválasztjuk az explantátumról és átültetjük Dev-tápközegre, ahol a gyökerek egy vagy két héten belül megjelennek, amennyiben megfelelően lettek transzformálva.
Amikor megfelelően kigyökeresedtek, átültetjük Jiffy-7 földbe (AS Jiffy Products) fitotronba, ahol gyorsan akklimatizálódnak.
Amint a gyökérrendszer a „Jiffy”-ben jól kifejlődött, a növényeket 12 cm átmérőjű virágcserepekbe, majd pedig 30 cm átmérőjű tartókba ültetjük és üvegházban termesztjük egy tápoldattal (hígított 5 kg/50 I oldat, 1,6%-ban adagolva) automatikusan öntözve.
HU 224 706 Β1
b) A pBIOS144 vagy pBIOS232 T-DNS-ét tartalmazó elsődleges transzformánsok molekuláris analízise
Amikor a transzformált növények elegendően kifejlődtek az üvegházban, körülbelül 5 g levelet eltávolítunk, hogy a DNS-üket kivonjuk, amelyet azután Southern-blot-eljárással analizálunk a jelenleg alkalmazott eljárások szerint (Sambrook és munkatársai).
Minden növényből származó DNS-t H/nólll enzimmel emésztettünk. Futtatás és nitro-cellulóz-membránra való átvitel után a DNS-mintákat számos próbával hibridizáltuk, amelyek lehetővé teszik a vizsgálatát:
- az inszertálódott T-DNS-kópiák számának,
- hogy az egész T-DNS inszertálódott-e,
- a határolórészeken kívüli szekvenciák jelenlétének vagy hiányának.
Miután ezeket a molekuláris vizsgálatokat elvégeztük, csak azokat a növényeket választjuk ki, amelyek egyetlen, ép T-DNS-t tartalmaznak a határolórészeken kívüli egyéb szekvenciák nélkül.
Ugyanezt az eljárást hajtottuk végre paradicsomsejtek pBIOS144-plazmiddal való transzformálásakor és a transzformált növények kiválogatásakor.
8. példa
A rögzített transzpozáz forrásának megállapítása
Amint a rögzített transzpozáz forrását integráltuk a növényekbe, vizsgálatokat végeztünk annak ellenőrzésére, hogy képes-e aktiválni egy „Ds”-elemet. Ennek érdekében a pBIOS144-plazmidot tartalmazó kiválasztott növényeket keresztezzük olyan növénnyel, amely egy próba Ds-elemet tartalmaz, amelynek kivágódása helyreállítja a Gus-gén (β-glükuronidáz) aktivitását. Ezt a Ds-elemet két lépésben készítettük el:
- a pBIOS206-ból származó Bglll/Spel fragmenst, amely megfelel Ds::KanaR-nek, inszertáltuk pBI221 (Clontech) BamHI/Xőal helyeire, így előállítva a pBIOS226-ot.
Az egész pBIOS226-plazmidot inszertáltuk azután pGA492DL Hindlll helyére. A képződő bináris plazmid, azaz a pBIOS228 tartalmazza a bal és a jobb határolórészek között a Ds::KanaR-t a 35S-promoter és a Gus-gén kódolórésze között.
Ennek a Ds::KanaR-nek bármilyen kivágódása a Gus-reportergén expressziójában nyilvánul meg. A Gus-vizsgálati eljárást (Jefferson és munkatársai) egy ilyen típusú keresztezés F1 nemzedékén végeztük el a transzpozázt tartalmazó különböző vonalak hatékonyságának megállapítására. Kék foltokat figyeltünk meg a „transzpozáz vonal és a „Ds-próba vonal keresztezéséből származó növények sziklevelein és levelük egyes területein. A foltok és a területek száma a növényen bizonyítja a transzpozázforrás hatékonyságát ezekben a növényekben.
9. példa
Rögzített transzpozázzal rendelkező vonalak előállítása
Az egyetlen kópiával rendelkező, a határolórészeken túl más szekvenciákat nem tartalmazó transzformánsokat, amelyeket az előző példában leírt módon választottunk ki és pozitívként értékeltünk ki, két egymást követő önmegtermékenyítésnek vetettük alá. A T2 magok csoportjait egymástól függetlenül gyűjtöttük be.
A kanamicinrezisztenciára való szegregációt minden egyes T2 esetében kiértékeltük, hogy a homozigóta magok csoportjait kimutassuk. Mindegyik csoportból néhányszor harminc magot üvegházban talajba ültettünk. Tizennyolc nappal az ültetés után 400 mg/l kanamicinoldatot permetezünk a csíranövényekre három napig (Weide és munkatársai). Öt nappal később könnyen azonosíthatók a kanamicinre szenzitív növények. A transzgénre homozigóta növények csoportjai a rezisztens és szenzitív növények szegregációja alapján és egy domináns gén mendeli szegregációjával való egyezés alapján azonosíthatók. Ezek azok a csoportok, amelyeket előnyösen fenntartunk és a Ds::KanaR-AMS-elemet tartalmazó növényekkel történő keresztezésekhez alkalmazunk.
10. példa
A homozigóta „transzpozáz” vonalak keresztezése
Ds::KanaR-AMS-vonalakkal
A kiválasztott elsődleges transzformánsok (egyetlen kópia, a határolórészeken túl más szekvencia nélkül) termékenyítőképességét kiértékeljük, amint virágozni kezdenek az üvegházban, növényenként egy vagy két virág portokcsövének kármin-ecetsavval festett harántirányú metszeteinek mikroszkópos vizsgálatával. A kiértékelés eredményeképpen csak azokat a hímsteril növényeket tartottuk meg, amelyekben egyáltalán nem volt pollen.
A Ds::KanaR-AMS-t hordozó steril növényeket Ac-transzpozázt expresszáló vonalakból származó pollennel termékenyítjük meg. A termést begyűjtjük, és a magokat eltávolítjuk.
11. példa
A-A kivágódási esemény azonosítása az F1 növényekben
A transzpozázforrást hordozó növények és a DS::KanaR-AMS-t hordozó növények keresztezéséből származó magokat üvegházban komposztba ültetjük. Szikleveles állapotban csíranövényenként egy sziklevelet eltávolítunk a DNS-ük gyors kivonása érdekében (Lassnerés munkatársai, 1989), majd a DNS-sel PCRvizsgálatot végzünk A9a- és A9b-oligonukletidok alkalmazásával (1. ábra). Az alkalmazott PCR-körülmények a következők:
DNS: 40 ng (vagy 10 μΙ-es mikroextrakció) oligo A9a (10 pmol/μΙ): 3 μΙ oligo A9b (10 pmol/μΙ): 3 μΙ
10*puffer: 10 μΙ dNTP keverék (5 mM): 4 μΙ
Promega Taq: 0,4 μΙ mM MgCI2: 8 μΙ
H2O: 100 μΙ-re kiegészítve
A reakciókat Perkin 9600 készülékben végeztük.
HU 224 706 Β1
Kétperces, 95 °C-on végzett denaturációt követően a következő felállításéi ciklusból negyvenet hajtunk végre:
denaturáció 94 °C-on
30” hibridizáció 55 °C-on
T30 lánchosszabbítás 72 °C-on
A vizsgálattal az volt a célunk, hogy gyorsan azonosítsuk az AMS-gént hordozó növényeket (800 bázispár nagyságú sáv a PCR-termékben), összehasonlítva azokkal, amelyek ezt nem tartalmazzák (nincs sáv a PCR-termékben). Az AMS-gént tartalmazó növényeket újraültetjük, és virágzásuk ideje alatt a termések megjelenését, amely szomatikus kivágódás egy vagy több területét jelezheti, figyelemmel kísérjük. Az F1 növények terméseinek vizsgálata vagy a Ds reinszertálódása nélküli kivágódást mutat, vagy kivágódást követő reinszertálódást, amely az aktivitás elvesztésével jár.
Ennek kimutatása érdekében az ezekből a termésekből származó magokat eltávolítottuk és elvetettük. Ezen növények PCR-rel történt molekuláris vizsgálatát elvégeztük annak kimutatására, hogy ezek többé nem tartalmazzák a Ds::KanaR-AMS-t, de tartalmazzák a T-DNS és/vagy az érdeklődés tárgyát képező gén hegét („forradásának nyomát”; „scar”). Ennek vizsgálata érdekében minden csíranövényről egy sziklevelet eltávolítunk és gyorsan kivonjuk a DNS-t.
Ennek a DNS-nek egy részét kivesszük, hogy két PCR reakciót végezzünk vele:
- Egy reakciót EM1- és EM5-oligonukleotidok alkalmazásával (2. ábra).
Az alkalmazott PCR-körülmények a következők:
DNS: 40 ng (vagy 10 μΙ mikroextrakció) oligo EM1 (10 pmol/μΙ): 3 μΙ oligo EM5 (10 pmol/μΙ): 3 μΙ
10xpuffer: 10 μΙ dNTP keverék (5 mM): 4 μΙ
Promega Taq: 0,4 μΙ mM MgCI2: 18 μΙ
BSA: 8 μΙ
Glicerin: 2,5 μΙ
H2O 100 μΙ-re kiegészítve
A reakciókat Perkin 9600 készülékben hajtottuk végre.
Kétperces 95 °C-on történő denaturációt követően a következő felállítású ciklusból negyvenet hajtunk végre:
30” denaturáció 94 °C-on
30” hibridizáció 62 °C-on
45” lánchosszabbítás 72 °C-on
Ez a vizsgálat lehetővé teszi annak kimutatását, hogy a csíranövény tartalmazza-e a T-DNS és/vagy az érdeklődés tárgyát képező gén hegét. Amikor a Ds-elem kivágódott, amennyiben önmagában a heg van jelen, egy körülbelül 300 bázispár nagyságú fragmens várható, amelyhez hozzá kell adni az érdeklődés tárgyát képező gén méretét.
- A másik reakciót 5Ή- és Ac12-oligonukleotidok alkalmazásával (3. ábra).
Az alkalmazott PCR-körülmények a következők:
DNS: 40 ng (vagy 10 μΙ mikroextrakció) oligo 5Ή (10 pmol/μΙ): 3 μΙ oligo Ac12 (10 pmol/μΙ): 3 μΙ 10xpuffer: 10 μΙ dNTP keverék (5 mM): 4 μ|
Promega Taq: 0,4 μΙ 25 mM MgCI2: 18 μΙ 100xBSA: 8 μΙ Glicerin: 2,5 μΙ H2O 100 μΙ-re kiegészítve
A reakciókat Perkin 9600 készülékben hajtottuk végre.
Kétperces 95 °C-on történő denaturációt követően a következő felállítású ciklusból negyvenet hajtunk végre:
30” denaturáció 94 °C-on
30” hibridizáció 62 °C-on
T30” lánchosszabbítás 72 °C-on
Ez a vizsgálat lehetővé teszi a transzpozázt kódoló gén hiányának kimutatását. Ha nincsen megsokszorozódott fragmens, a transzpozáz hiányzik. A transzpozáz jelenléte esetén egy 1,6 kb nagyságú sáv mutatható ki.
Azok a kivágódási eseményekből származó növények, amelyek most már csak a kérdéses gént tartalmazzák, a kanamicin-rezisztenciagén vagy a transzpozázt kódoló gént hordozó T-DNS nélkül pozitívak lesznek az első oligonukleotidkészlettel (EM1-EM5) és negatívak a másodikkal (5’H-Ac12).
Ezeken a növényeken végzett Southern-vizsgálat lehetővé teszi az érdeklődés tárgyát képező gén jelenlétének és a kanamicin-rezisztenciagén hiányának bizonyítását.
B - A szelekciós marker nélküli transzformánsok azonosítása
1. Anyagok
NPTII-próba
A pBIOS232-vektor NPTII-génje 1 kb fragmensének megsokszorozása a következő szekvenciájú Kana7- és Kana8-oligonukleotidokkal:
Kana7: GCTCGACGTTGTCACTGAAG
Kana8: CCCGGAAAACGATTCCGAAG
Az alkalmazott NPTII-gén Escherichia coli Tn5transzpozonjából lett izolálva (Berg és Berg, 1983).
Cat-intra-LB+intra-RB próbák
A két próba keveréke:
Cat-int-LB: a pGA492DL T-DNS-e Sall-fragmense, amely a bal határolórészt és a Cat-gén részét tartalmazza.
Int-RB: a pGA492 T-DNS-e Sall-fragmense, amely a jobb határolórészt tartalmazza.
A két próba együttesen megfelel a pGA492DL teljes T-DNS-ének, amely alapvektor a pBIOS232 elkészítéséhez, amelyet viszont a Ds::KanaR-AMS-növények létrehozásához használtunk.
2. Két aktív komponenst tartalmazó növények azonosítása és termesztése
A Ds::KanaR-AMS-t hordozó növény és a rögzített transzpozázforrást tartalmazó növény keresztezéséből származó F1 magokat előállítottuk és elvetettük. PCR-vizsgálatot hajtottunk végre 173 növény szikleveléből származó DNS-sel EM1- és EM5-oligonukleotidok
HU 224 706 Β1 alkalmazásával a fentiekben leírtak szerint. A vizsgálat azonosított 18 növényt, amelyekben EM1-EM5 alkalmazásával egy 350 bp nagyságú sáv sokszorozódott, így kimutatva a szomatikus kivágódási eseményeket, amelyek bebizonyítják a rendszer két elemének jelenlétét és működési képességét.
A rendszert egy, a Ds::KanaR-AMS-t hordozó, de az érdeklődés tárgyát képező gént nem tartalmazó T-DNS alkalmazásával fejlesztettük ki. Ezért az EM1és EM5-oligonukleotidokkal végzett sokszorozás eredményeként kimutatott kivágódási sáv körülbelül 350 bp nagyságú. Amikor az érdeklődés tárgyát képező gént inszertáltuk, ennek a sávnak a hosszúsága megnőtt ennek a génnek a nagyságával. Egy másik megvalósítási mód szerint alkalmazhatók az érdeklődés tárgyát képező génre specifikus oligonukleotidok is.
Ezt a 18 növényt 4 hónapon keresztül szántóföldön termesztettük. A virágokat rendszeresen megvizsgáltuk, hogy ellenőrizzük a portokok termékenyítőképességét, valamint a termések megjelenését szintén ellenőriztük. A 18 növényen kívül háromban termések csak néhány gócban jelentek meg. Ezek a növények ezek szerint kimérák voltak a hímsteril/hímsteril fenotípusra nézve. Ezen növények terméseit begyűjtöttük gócról gócra, feljegyezve a gócok elhelyezkedését a növény egészéhez képest.
Az újra részlegesen termékennyé vált három növényből származó három gócon megjelent termésekből származó magokat elvetettük. A képződő csíranövényekből (4 csíranövény/góc) származó leveleket eltávolítottuk, hogy Southern típusú vizsgálathoz kivonjuk a DNS-üket. A DNS-t Hind\l\ enzimmel emésztettük (egyetlen hasítóhely a T-DNS-ben), mielőtt elektroforézist végeztünk volna és membránra vittük volna át. Ugyanakkor az F2 utódoknak megfelelő 36 mintát kezeltük a hibrid szülőinek DNS-eként (a Ds::KanaR-AMS-t hordozó növények és a rögzített transzpozázforrást hordozó növények), hogy legyen vonatkoztatási minta. Az NPTII- és Cat-int-LB-próbákkal végzett Southern-blot-hibridizáció során a szülői mintázattal való összehasonlítás kimutatott olyan növényeket, amelyek sem a transzpozázforrást tartalmazó T-DNS-t, sem pedig a Ds::KanaR-AMS-t már nem hordozzák, de amelyek még valóban tartalmazzák a T-DNS hegét.
Összesen 36 növényt elemeztünk, minden előzetes kanamicinre való szelekció nélkül, ezek a növények három olyan növény három gócából származtak, amelyekben termést figyeltünk meg.
3. A vizsgálat eredményei
Húsz, a „behegedt” T-DNS-t hordozó növény csak egy sávot mutat, amely hibridizál a Cat-int-LB-RB-próbával, és amelynek mérete kisebb, mint amekkora a Ds-t tartalmazó szülőben. Ez a sáv NPTII-próbával nem hibridizál.
Harmincegy, transzpozázforrást hordozó növény egy sávot mutat, amely hibridizál az NPTII-próbával, és amely azonos méretű az ugyanevvel a próbával a rögzített transzpozázforrást hordozó szülőben kimutatható sávval.
Öt növény az üres T-DNS-t tartalmazta, de a transzpozázforrást nem.
A vizsgált 36 növényen kívül ötöt találtunk alkalmas transzformánsoknak, amelyek már csak az érdeklődés tárgyát képező gént hordozó T-DNS-t tartalmazzák, de a szelekciós markergén már kivágódott.
Ily módon ezek szerint lehetséges megfelelő transzformált növényeket kiválogatni 2 generációval az elsődleges transzformánsok után.
Ennek a technikának nagyszámú előnye van. Lehetővé teszi szelekciós marker nélküli transzformánsok azonosítását korai állapotban.
Az elsődleges transzformánsok keresztezését a transzpozázforrással elősegíti, és még inkább megbízhatóvá teszi, hogy ez utóbbi hímsteril.
Végül, ez a technika lehetővé teszi kisszámú csíranövény átvizsgálását a megfelelő transzformánsok azonosítása érdekében: bármilyen előzetes előválogatás nélkül 3 növényből származó 36 utód levizsgálása után 5 növényt találtunk, amelyek tartalmazták a Ds::KanaR-AMS nélküli T-DNS-t.
Továbbá javítható a markerek nélküli transzformánsok azonosítása:
ha a Ds::KanaR-AMS-t és a transzpozázforrást hordozó növényen keletkezett termések utódját kanamicin előtt kezeljük, a növények egynegyede lesz Kanas a 15/16 helyett (amelyet általában kapunk, ha nincsen Ds-kivágódás). Ezek közül a 3/4 a „megfelelő” T-DNS hordozója, a maradék egynegyed megfelel a transzgént nem hordozó klasszikus szegregánsoknak.
Három negyedrész rezisztens növény és egy negyedrész szenzitív növény szegregációjának a megfigyelése gyorsan lehetővé teszi a kivágási rendszer hatékony működésének kimutatását.
Megfelelő utódok azonosíthatók tehát az F2 csíranövényeken kívül nagyon kevés kanamicinre szenzitív növény vizsgálatával.
4. Végkövetkeztetés
Ez a vizsgálat kimutatja, hogy egy mesterséges hímsterilitást biztosító gén hozzáadása egy markergén megszüntetésére szolgáló rendszerhez az Ac/Ds segítségével lehetővé teszi az érdeklődés tárgyát képező gén gyors azonosítását szelekciós marker nélkül, ugyanakkor elősegíti a folyamatot, és megakadályozza a nem megfelelően jellemzett transzgenikus események pollen útján történő szétszóródását.
12. példa
Az FLP-rekombinázt hordozó pBIOC4-FLP bináris plazmid elkészítése
A Saccharomyces cerevisiae FLP-rekombinázát kódoló szekvencia a Stratagene által árult pOG44-en található. A pOG44-plazmidot H/ndlII és Kpn\ enzimekkel emésztettük, és a Hindlll-Kpnl fragmenst izoláltuk. Ligálást végeztünk 14 °C-on 16 órán keresztül 100 ng defoszforilált pBIOS512-vektor és 50 ng, a rekombinázt kódoló szekvenciát hordozó Hindlll-Kpnl fragmens alkalmazásával 10 μΙ reakcióelegyben 1 μΙ 10><T4-DNS-ligáz pufferben (Amersham) és 2,5 U
HU 224 706 Β1
T4-DNS-ligáz enzimmel (Amersham). Kompetens Escherichia coli DH5a baktériumokat transzformáltunk. A képződő plazmidot pBIOS512-FLP-nek jelöltük. A képződő, 50 pg/ml ampicillintartalmú tápközegen szelektált kiónok plazmid DNS-ét alkalikus lízises eljárással kivontuk és restrikciós enzimes emésztéssel analizáltuk. Az FLP-rekombinázt kódoló szekvenciát hordozó fragmenst Kpnl enzimes emésztéssel izoláltuk, majd T4-DNS-polimeráz enzimet alkalmaztunk (New England Biolabs) a gyártó utasításai szerint, és végül H/ndlll-mal emésztettük. A fragmenst 0,8% agarózgélen végzett elektroforézissel tisztítottuk, majd elektroelúciót végeztünk, alkohollal kicsaptuk és szárítottuk. Ezt a DNS-t vittük be a pBIOS512-plazmid Klenow-enzimmel (New England Biolabs) a gyártó utasításai szerint kezelt BamHI helyére és Hindlll helyére. Az FLP nukleotidszekvenciáját dideoxinukleotideljárás (Sanger és munkatársai, 1997) szerinti szekvenálással vizsgáltuk, T7™-szekvenáló kit (Pharmacia) alkalmazásával. A pBIOS512-plazmid a pUC származéka, és tartalmazza a „35S kettős promoter (35SDP)-NOS-terminátor (NŐST)” expressziós kazettát (EcoRI-fragmens). A 35S kettős promoter a pJIT163-ból származik (WO 96 33277).
A „35SDP-FLP-NOST” expressziós kazettát hordozó EcoRI-fragmenst a PBIOS512-FLP-ből EcoRI enzimmel történő emésztéssel izoláltuk, majd ezután 0,8%-os agarózgélen, azután elektroelúcióval tisztítottuk, végül alkohollal kicsaptuk és szárítottuk. Borjúbél alkalikus foszfatáz enzimével (Boehringer Mannheim) a gyártó utasításai szerint defoszforilált pBIOC4 (WO 96 33277) EcoRI helyére vittük be a DNS-t. Ligálást végeztünk 14 °C-on 16 órán keresztül 100 ng defoszforilált vektor és 50 ng „35SDP-FLP-NOST” kazettát hordozó fragmensek alkalmazásával 10 pl reakcióelegyben 1 pl 10*T4-DNS-ligáz pufferben (Amersham) és 2,5 U T4-DNS-ligáz enzimmel (Amersham). Kompetens Escherichia coli DH5a baktériumokat transzformáltunk. A képződő plazmidot pBIOC4-FLP-nek jelöltük. A képződő, 12 pg/ml tetraciklintartalmú tápközegen szelektált kiónok plazmid DNS-ét alkalikus lízises eljárással kivontuk és restrikciós enzimes emésztéssel vizsgáltuk. A bináris plazmid pBIOC4-FLP-plazmid DNS-ét direkt transzformációval bevittük Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzsébe Holsters és munkatársai (1978) eljárása szerint. A kiválasztott klón helyességét a bevitt plazmid DNS enzimatikus emésztésével bizonyítottuk.
13. példa
Dohánynövény transzgenezisében alkalmazható bináris plazmid, a pBIOC511 elkészítése, amely hímsterilitást, valamint kanamicinre való szelekciót hordoz az FRT-specifikus rekombinációs helyek között
A következő szekvenciákat kivágtuk a pGA492 bináris plazmidból (An, 1986): a nopalin-szintázt kódoló nos-gén konstitutív promoterét (Depicker és munkatársai, 1982), a II típusú neomicin-foszfotranszferázt kódoló nptll-gént kódoló szekvenciát (Berg és Berg,
1983), amely szekvenciát az első nyolc kodon szakaszában kivágtuk, beleértve a metionin ATG startkodont, és fuzionáltattuk a nos-gént kódoló szekvencia első 14 kodonjának szekvenciájához (Depicker és munkatársai, 1982), a nos-gént kódoló szekvenciát, amelyben azonban hiányzik az első 14 kodon, és a nos-terminátort (Depicker és munkatársai, 1982). Ezt a kivágást C/al-gyel történő teljes emésztést követően Sacll-vel való részleges emésztéssel hajtottuk végre. A fragmenst tisztítottuk, majd T4-DNS-polimerázzal (New England Biolabs) kezeltük a gyártó útmutatásai szerint. A plazmid ligálását és a kompetens Escherichia coli DH5a baktériumsejtek transzformációját a szokásos eljárások szerint végeztük (Sambrook és munkatársai, 1989). A képződő plazmidot pBIOC506nak neveztük.
Az FRT-specifikus integrációs helyet a pOG45plazmidból (Stratagene) PCR-rel megsokszoroztuk. A PCR-hez láncindítóként használt két oligodeoxinukleotid a következő:
5’ CCC CTG CAG TTT TCA AAA GCG CTC TGA AGT TC 3’ és
5’ CCA AAG CTT GAA TTC GCC AGG GGG ATC TTG AAG TTC 3’.
Az FRT-helynek megfelelő és a PCR-sokszorozásból származó fragmenseket Psfl-gyel emésztettük és T4-DNS-polimeráz enzimmel (New England Biolabs) kezeltük a gyártó útmutatásai szerint, majd EcoRI-gyel emésztettük. Kétszázalékos agarózgélen tisztítottuk, majd elektroelúciót végeztünk, alkohollal kicsaptuk, szárítottuk és vízben felvettük. A fragmenst azután a pUC18-plazmid (Pharmacia) Sacl helye, amelyet ezt megelőzően T4-DNS-polimerázzal kezeltünk, és EcoRI helye közé ligáltuk. A képződő plazmidot pBIOC507-nek neveztük.
A második FRT-helyet bevittük a pBIOC507-plazmidba.
Ez a második FRT-hely a következő két oligodeoxinukleotidokkal végrehajtott PCR-sokszorozásból származik:
5' CCC CTG CAG TTT TCA AAA GCG CTC TGA AGT TC 3’ és
5’ AAA GGT ACC GCC AGG GGG ATC TTG AAG TTC 3’.
A megsokszorozott fragmenseket Psfl-gyel és Kpnl-gyel emésztettük, T4-DNS-polimerázzal kezeltük és a pBIOC507-plazmid Sphl helyére ligáltuk, amelyet T4-DNS-polimerázzal kezeltünk. A képződő plazmidot pBIOC508-nak neveztük, és tartalmazza a két FRT-helyet ugyanabban az orientációban.
A két FRT-helyet hordozó HindiIΙ/EcoRI fragmenst a pBIOC508-plazmidból izoláltuk. Ezt a fragmenst inszertáltuk a pBIOC506-plazmid Hindlll és EcoRI helyeire. A képződő plazmidot pBIOC509-nek jelöltük.
A pWP173-ban lévő „A9-barnáz-T35S-promoternek” (Paul és munkatársai, 1992) megfelelő kiméra gént hordozó Sphl-fragmenst alkalmaztuk a hímsterilitás közvetítésére. Ezt az Sphl-fragmenst T4-DNS-polimerázzal kezeltük, és pBIOC509-plazmid korábban T4-DNS-poli13
HU 224 706 Β1 meráz enzimmel kezelt Pstl helyére ligáltuk. A képződő plazmidot pBIOC510-nek jelöltük.
Végül pedig, hogy a kanamicinen történő szelekciót lehetővé tegyük (Fromm és munkatársai, 1986), a korábban T4-DNS-polimerázzal kezelt EcoRI-fragmenst, amely megfelel a pBIOSI-plazmidból izolált „NOSPnptlI-NOST” expressziós kazettának, amelybe az nptllgént kódoló BamHI-fragmenst már beleklónoztuk a Bambii helyre, ligáltuk a pBIOC511-plazmid Kpnl helyére, amelyet ezt megelőzően T4-DNS-polimeráz enzimmel kezeltünk. A képződő plazmidot pBIOC511-nek jelöltük.
Tenyésztő táptalajok
LB g/l bactotryptone g/l élesztőkivonat g/l nátrium-klorid pH 7,5 nátrium-hidroxiddal beállítva
MSSV/2
2,2 g Murashige és Skoog makro- és mikroelemek (Sigma, kát. sz. M 6899) ml/l Nitsch-vitaminok 15 g/l szacharóz 8 g/l agaragar pH 5,9 sterilezés előtt
2Z
4,4 g Murashige és Skoog makro- és mikroelemek (Sigma, kát. sz. M 6899) ml/l Nitsch-vitaminok 30 g/l szacharóz 2 mg/l zeatin 400 mg/l Augmentin 100 mg/l kanamicin 8 g/l agaragar pH 5,9 sterilezés előtt
KCMS
4,4 g Murashige és Skoog makro- és mikroelemek (Sigma, kát. sz. M 6899)
0,9 mg/l tiamin
200 mg/l kálium-dihidrogén-foszfát g/l szacharóz g/l agaragar
200 μΜ Acetosyringone
0,2 mg/l 2-4D
0,1 mg/l kinetin pH 5,9 sterilezés előtt
DEV
2,2 g Murashige és Skoog makro- és mikroelemek (Sigma, kát. sz. M 6899) ml/l Nitsch-vitaminok 15 g/l szacharóz 50 mg/l kanamicin 400 mg/l Augmentin 8 g/l agaragar pH 5,8 sterilezés előtt
MS20
4,4 g/l MO404 (Sigma) g/l szacharóz g/l agaragar (szilárd tápközeg) pH 5,7 + szükség esetén BAP növényi hormon, 1 mg/l és ANA, 0,1 mg/l
MS30
4,4 g/l MO404 (Sigma) g/l szacharóz g/l agaragar (szilárd tápközeg) pH 5,7 + szükség esetén BAP növényi hormon, 1 mg/l és ANA, 0,1 mg/l
Hivatkozások
- An G. (1986), Plánt. Physiol. 81:86-91
- Bednarek S. Y. and Ralkhel N. V., The Plánt. Cell., 3, 1195-1206(1991)
- Broer et al., Braunschweig Symposium on Applied Plánt. Molecular biology, Braunschweig November 21-23, (1988); Proceedings, Ed. Galling G„ (1989), 240
- Berg D. E., Berg C. M., (1983) Biotechnology, 1, 417-435
- Close J. J., Rodriguez R. L., (1982) Gene, 20, 305-316
- Cocherel S., Perez P., Degroote F., Genestier S., Picard G., (1996), Plánt. Molecular Biology 30:539-551
- De la Penna (1987), Natúré, 325:274-278
- Depicker et al., (1982) J. Mól. Appl. Génét., 1, 561-573
- Ditta G., Stanfield S., Corbin D., Helinski D. R., (1980) Pnas 77:7347-7351
- Ellstrand Norman C., (1990), Bioscience, vol. 40 No. 6, pp. 438-442
- Fillatti J. J., Kiser J., Rose R. and Commai L., (1987) Bio/Technology 5:726-730
- Finnegan E. J., Lawrence G. J., Dennis E. S., Ellis J. G., (1993) Plánt. Molecular Biology 22:625-633
- Franck et al., (1980) Cell., 21,285-294
- Fromm Μ. E., Taylor L. P., Walbot V., (1986) Natúré, vol. 319, 791-793
- Gaubieret al., Mól. Gén., 238, 409-418 (1993)
- Holsters et al., (1978) Mól. Gén. Génét., 163, 181-187
- Horsch et al., (1985), Science, 227, 1229 (1985)
- Jefferson R. A., (1987) Plánt. Molecular Biology, Rep. 5:387-405
- Jouanin, Plánt. Sci. 53, 53-63 (1987)
- Kay, Science, (1987) 236, 1299-1302
- Lassner M. W., Peterson P., Yoder J. I., (1989), Plánt. Molecular Biology Rep. 7:116-128
- Liu, (1951) Mól. Plánt. Microb., Interactions, 6, 144-156
- Matsuoka K., Nakamura K., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 834-838
HU 224 706 Β1
- McElroy (1991) Mól. Gén. Génét. 231:150-160
- Murakami et al., Plánt. Mól. Bioi., (1986) 7, 343-355
- Ni et al., Plnt J„ (1995) 7, 661-676
- Paul W. etal. (1992) Plánt. Mól. Bioi. 19:611-622
- Perez P., Tiraby G., Kallerhoff J., Perret J., (1989), Plánt. Molecular Biology 13:365-373
- Rogers S., Bendich A. J., (1988), Plánt. Molecular Biology, Manual A65, 69-76
- Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., (1989) Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor laboratory press
- Sanford J. C., (1988) Trends in Biotechnology, 6, 299-302
- Schroeder M. R., Borksenious Ο. N., Matsuoka K„ Nakamura K. and Rakhel Ν. V., (1993) Plánt. Physiol., 101,451-458
- Watson et al., recombinant DNA, Ed. De Boeck University, pp. 273-292
- Weider R„ Koornnef M„ Zabéi P„ (1989) Theo. Appl. Gén., 78:169-172
- Worall D. Hird D. L., Hodge R., Paul W., Draper J„ and Scott R„ (1992), Plánt. Cell. 4, 759-771
- Yoder J. I. Goldsbrough A. P., (1994), Bio/Technology vol. 12, 263-267
Claims (15)
1. Mesterséges hímsteril növény alkalmazása egy adott transzgén szétszóródásának megakadályozására, ahol a növény mesterséges hímsterilitást biztosító gént (AMS-gént) tartalmazó kukorica, repce vagy paradicsom, amelynek genomjába az adott transzgén be van épülve, amelynek expresszióját az AMS-gén jelenléte nem akadályozza.
2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a növény citoplazmatikus hímsterilitást hordoz.
3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amelyben a növény sejtmageredetű hímsterilitást hordoz.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az adott transzgén terápiás vagy profilaktikus fehérjét kódol.
5. A 4. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az adott transzgén fehérjeként kollagént vagy gyomoreredetű lipázt kódol.
6. Transzgenikus növény, amely kukorica, repce vagy paradicsom vagy a transzgenikus növény része, azzal jellemezve, hogy a növény vagy része genetikailag egy AMS-génhez kapcsolt, adott transzgént tartalmaz, amely AMS-gén olyan elemekkel van kombinálva, amelyek lehetővé teszik növényi sejtekben való expresszióját, ahol a transzgén expresszióját az AMS-gén jelenléte nem akadályozza.
7. A 6. igénypont szerinti transzgenikus növény vagy annak része, azzal jellemezve, hogy a növényi sejtben való expressziót lehetővé tévő elemek egy promoter és egy transzkripciós terminátor.
8. A 6. vagy 7. igénypont szerinti transzgenikus növény vagy annak része, azzal jellemezve, hogy a mesterséges hímsterilitási gén (AMS-gén) portokban történő specifikus expressziót lehetővé tevő promoterrel kombinált.
9. A 6-8. igénypontok bármelyike szerinti transzgenikus növény vagy annak része, azzal jellemezve, hogy az adott transzgén terápiás vagy profilaktikus fehérjét kódol.
10. A 9. igénypont szerinti transzgenikus növény vagy annak része, azzal jellemezve, hogy az adott transzgén fehérjeként kollagént vagy gyomoreredetű lipázt kódol.
11. Eljárás egy adott transzgén expressziós termékének előállítására, azzal jellemezve, hogy:
a) - vagy kukorica-, repce- vagy paradicsomeredetű növényi sejteket transzformálunk olyan vektorral transzformált gazdasejt alkalmazásával, amely vektor egyidejűleg tartalmaz egy adott transzgént az expresszióját növényi sejtekben lehetővé tévő elemekkel kombináltan, valamint egy, az adott transzgénhez genetikailag kapcsolt mesterséges hímsterilitási gént (AMS-gént), ahol az AMS-gén az expresszióját növényi sejtekben lehetővé tévő elemekkel van kombinálva, és az AMS-gén jelenléte a transzgén expresszióját nem akadályozza, oly módon, hogy az adott transzgénhez genetikailag kapcsolódó AMS-gén beépül a sejtek genomjába;
- vagy citoplazmatikus vagy sejtmageredetű hímsterilitást hordozó, kukorica-, repce- vagy paradicsomeredetű növényi sejteket transzformálunk oly módon, hogy az adott transzgén beépül a sejtek genomjába,
b) a transzformált növényi sejtekből az adott transzgént expresszáló, hímsteril fenotípusú, transzformált növényeket regenerálunk;
c) az adott transzgén transzformált növényekben történő expressziójának termékét kinyerjük.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás adott transzgén expressziós termékének előállítására, azzal jellemezve, hogy a transzgén expressziós termékének c) lépés szerinti kinyerését extrakció útján valósítjuk meg.
13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás adott transzgén expressziós termékének előállítására, azzal jellemezve, hogy a transzgén expressziós termékének c) lépés szerinti kinyerését követően a terméket tisztítjuk.
14. A 11-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás adott transzgén expressziós termékének előállítására, azzal jellemezve, hogy az adott transzgén terápiás vagy profilaktikus fehérjét kódol.
15. A 14. igénypont szerinti eljárás adott transzgén expressziós termékének előállítására, azzal jellemezve, hogy az adott transzgén fehérjeként kollagént vagy gyomoreredetű lipázt kódol.
pBios232
HU 224 706 Β1 Int. Cl.: C12N 15/82
A9a A9b RB fnos NPTII pnos pAö] PR-glu t-CamV
6a-6b }lb
5'Ac cd
Az érdeklődés tárgyát képező gén klónozóhelye
A9a = TAGACATTGTAGGTTGGTTTTG A9b = TCTAGTTACTTCATAAGTTTTG Az A9a- és A9b- oligonukleotídok elhelyezkedése
1. ábra
EM1 toos NPTII
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9702369A FR2759857B1 (fr) | 1997-02-27 | 1997-02-27 | Nouvelles utilisations de la sterilite male chez les plantes |
| PCT/FR1998/000381 WO1998038323A2 (fr) | 1997-02-27 | 1998-02-26 | Nouvelles utilisations de la sterilite male chez les plantes |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0001856A2 HUP0001856A2 (hu) | 2000-09-28 |
| HUP0001856A3 HUP0001856A3 (en) | 2002-04-29 |
| HU224706B1 true HU224706B1 (en) | 2006-01-30 |
Family
ID=9504258
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0001856A HU224706B1 (en) | 1997-02-27 | 1998-02-26 | Novel uses of male sterility in plants |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7112719B2 (hu) |
| EP (1) | EP0972061B1 (hu) |
| AT (1) | ATE338824T1 (hu) |
| AU (1) | AU6734998A (hu) |
| CA (1) | CA2282726C (hu) |
| CZ (1) | CZ296781B6 (hu) |
| DE (1) | DE69835812T2 (hu) |
| ES (1) | ES2273411T3 (hu) |
| FR (1) | FR2759857B1 (hu) |
| HU (1) | HU224706B1 (hu) |
| PL (1) | PL336300A1 (hu) |
| WO (1) | WO1998038323A2 (hu) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6632980B1 (en) | 1997-10-24 | 2003-10-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Binary viral expression system in plants |
| JP2004512007A (ja) * | 2000-02-28 | 2004-04-22 | エール ユニヴァーシティ | トランス遺伝子の伝達を削減または排除する方法および組成物 |
| EP1174512A1 (en) * | 2000-07-17 | 2002-01-23 | Peter Stamp | Seed composition and method for reducing or preventing the release of genetically manipulated pollen |
| GB0108048D0 (en) * | 2001-03-30 | 2001-05-23 | Isis Innovation | Specification of meiocyte and tapetal cell layers in plants |
| FR2825579B1 (fr) * | 2001-06-11 | 2004-07-23 | Rhobio | Methode d'obtention de plante monocotyledone contenant un gene d'interet sans sequence auxiliaire etrangere |
| AU2002315526A1 (en) * | 2001-07-06 | 2003-01-21 | Monsanto Technology Llc | Methods for enhancing segregation of transgenes in plants and compositions thereof |
| WO2005001101A1 (en) | 2003-06-03 | 2005-01-06 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Conditional sterility in plants |
| US7491811B2 (en) * | 2004-01-15 | 2009-02-17 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Repressor-mediated tissue-specific gene expression in plants |
| CN111676229B (zh) * | 2020-06-30 | 2021-07-13 | 四川农业大学 | 一种玉米雄性核不育基因ms40及其分子标记和应用 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5180873A (en) * | 1985-04-16 | 1993-01-19 | Dna Plant Technology Corporation | Transformation of plants to introduce closely linked markers |
| US6198023B1 (en) * | 1988-02-03 | 2001-03-06 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Molecular methods of hybrid seed production |
| GB8810120D0 (en) * | 1988-04-28 | 1988-06-02 | Plant Genetic Systems Nv | Transgenic nuclear male sterile plants |
| US5689041A (en) * | 1989-08-10 | 1997-11-18 | Plant Gentic Systems N.V. | Plants modified with barstar for fertility restoration |
| CA2071943C (en) * | 1989-12-22 | 2007-04-24 | Joan Tellefsen Odell | Site-specific recombination of dna in plant cells |
| US5451513A (en) * | 1990-05-01 | 1995-09-19 | The State University of New Jersey Rutgers | Method for stably transforming plastids of multicellular plants |
| EP0558676B1 (en) * | 1990-11-23 | 2000-04-19 | Plant Genetic Systems, N.V. | Process for transforming monocotyledonous plants |
| GB9028060D0 (en) * | 1990-12-24 | 1991-02-13 | Nickerson Int Seed | Recombinant dna |
| WO1993001283A1 (en) * | 1991-07-08 | 1993-01-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Selection-gene-free transgenic plants |
| GB9115909D0 (en) * | 1991-07-23 | 1991-09-04 | Nickerson Int Seed | Recombinant dna |
| EG23907A (en) * | 1994-08-01 | 2007-12-30 | Delta & Pine Land Co | Control of plant gene expression |
| JP3256952B2 (ja) * | 1994-11-09 | 2002-02-18 | 日本製紙株式会社 | 植物への遺伝子導入用ベクター、並びにこれを用いた遺伝子導入植物の作成方法及び植物への遣伝子多重導入方法 |
| ATE304600T1 (de) * | 1995-02-21 | 2005-09-15 | Bayer Bioscience Nv | Verfahren zur herstellung von männlich sterilen pflanzen |
| FR2733249B1 (fr) * | 1995-04-20 | 1997-06-06 | Biocem | Lipase gastrique de chien recombinante et polypeptides derives produits par les plantes, leurs procedes d'obtention et leurs utilisations |
| EP0939826A2 (en) * | 1996-08-15 | 1999-09-08 | Agrivax Incorporated | Delivery of tolerogenic antigens via edible plants or plant-derived products |
-
1997
- 1997-02-27 FR FR9702369A patent/FR2759857B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-02-26 WO PCT/FR1998/000381 patent/WO1998038323A2/fr active IP Right Grant
- 1998-02-26 US US09/380,086 patent/US7112719B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-26 CZ CZ0301799A patent/CZ296781B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-02-26 PL PL98336300A patent/PL336300A1/xx unknown
- 1998-02-26 HU HU0001856A patent/HU224706B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-02-26 AU AU67349/98A patent/AU6734998A/en not_active Abandoned
- 1998-02-26 DE DE69835812T patent/DE69835812T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-26 ES ES98912557T patent/ES2273411T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-26 CA CA002282726A patent/CA2282726C/fr not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-26 EP EP98912557A patent/EP0972061B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-26 AT AT98912557T patent/ATE338824T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL336300A1 (en) | 2000-06-19 |
| HUP0001856A2 (hu) | 2000-09-28 |
| ATE338824T1 (de) | 2006-09-15 |
| DE69835812D1 (de) | 2006-10-19 |
| US7112719B2 (en) | 2006-09-26 |
| AU6734998A (en) | 1998-09-18 |
| CA2282726A1 (fr) | 1998-09-03 |
| WO1998038323A2 (fr) | 1998-09-03 |
| DE69835812T2 (de) | 2007-09-13 |
| EP0972061A2 (fr) | 2000-01-19 |
| CZ296781B6 (cs) | 2006-06-14 |
| US20020157129A1 (en) | 2002-10-24 |
| FR2759857A1 (fr) | 1998-08-28 |
| WO1998038323A3 (fr) | 1998-12-17 |
| ES2273411T3 (es) | 2007-05-01 |
| CA2282726C (fr) | 2008-08-19 |
| FR2759857B1 (fr) | 1999-04-30 |
| EP0972061B1 (fr) | 2006-09-06 |
| HUP0001856A3 (en) | 2002-04-29 |
| CZ301799A3 (cs) | 2000-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0775212B1 (en) | Control of plant gene expression | |
| US5723765A (en) | Control of plant gene expression | |
| AU639059B2 (en) | Site-specific recombination of dna in plant cells | |
| CA2106718C (en) | Methods for the production of hybrid seed | |
| US5658772A (en) | Site-specific recombination of DNA in plant cells | |
| AU718262B2 (en) | Methods and constructs for producing male sterile plants | |
| US7115798B1 (en) | Methods for regulated expression of triats in plants using multiple site-specific recombination systems | |
| US6737560B1 (en) | Molecular methods of hybrid seed production | |
| WO1990008828A2 (en) | Molecular methods of hybrid seed production | |
| US6191343B1 (en) | Molecular methods of hybrid seed production | |
| AU739946B2 (en) | Nuclear male sterile plants, method of producing same and methods to restore fertility | |
| HU224706B1 (en) | Novel uses of male sterility in plants | |
| US20050120416A1 (en) | Novel method for the production of hybrid maize seeds | |
| AU655574C (en) | Molecular methods of hybrid seed production | |
| Abid et al. | Transgenic chicory (Cichorium intybus L.) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20051122 |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |