ES2272482T3 - Preparacion y xenotransplante de islotes porcinos. - Google Patents
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Abstract
Un método para preparar una preparación de islotes porcinos xenotransplantables capaces después del xenotransplante de producir insulina porcina en un mamífero receptor apropiado, en el que el método incluye o comprende las etapas de: (i) preparar un cultivo de páncreas recogido, páncreas que se ha recogido de lechones en o cerca del periodo de gestación completo; (ii) simultáneamente con la etapa (i) y/o después de la etapa (i) extraer células Beta de los islotes pancreáticos del cultivo del páncreas recogido; y (iii) someter al páncreas o las células de los islotes a un anestésico; en el que los islotes (al menos en alguna etapa en la realización del método) se exponen a nicotinamida y en el que la extracción se realiza usando una colagenasa adecuada.
Description
Preparación y xenotransplante de islotes
porcinos.
La presente invención se refiere a mejoras en/o
relacionadas con el tratamiento de diabetes usando xenotransplante.
Más particular, pero no exclusivamente la presente invención se
refiere a la preparación de islotes porcinos xenotransplantables
viables y/o el tratamiento de un paciente mamífero (incluyendo seres
humanos) que padece diabetes, que implica el transplante en el
mamífero de islotes porcinos viables capaces de producir insulina
en el hospedador.
La diabetes mellitus de tipo 1 (dependiente de
insulina) es un trastorno endocrino común que da como resultado
morbosidad y mortalidad sustanciales, y conduce a un coste económico
considerable para los pacientes individuales y los sistemas
sanitarios.
El tratamiento con insulina, aunque salva vidas,
a menudo no proporciona control suficiente de la glucosa en sangre
para prevenir las temidas complicaciones de la enfermedad, lo que ha
proporcionado el impulso para la investigación intensiva de mejores
métodos para mantener la normoglucemia.
Entre las estrategias de tratamiento más
recientes que se han propuesto, el transplante de células \beta
de los islotes pancreáticos, obtenidas de otros seres humanos o
animales, ha recibido la mayor atención en todo el mundo. Esto es
porque el transplante puede restaurar no solamente la unidad
secretora de insulina, sino también el preciso ajuste de la
liberación de insulina en respuesta a múltiples señales neurales y
humorales que aparecen dentro de y más allá de los islotes de
Langerhans.
El transplante de islotes de células humanas
está limitado por la escasez de tejido de islotes humanos. El uso de
células de los islotes de cerdo se ve actualmente como la
alternativa más prometedora, puesto que:
- (a)
- la reserva de células de cerdo puede ampliarse fácilmente optimizando la reserva de animales donantes;
- (b)
- la insulina de cerdo y la humana tienen estrechas similitudes estructurales; y
- (c)
- los niveles fisiológicos de glucosa en cerdos son similares a los de los seres humanos.
El fundamento para este enfoque de tratamiento
(denominado "xenotransplante") es que los islotes de cerdo
implantados tienen el potencial de imitar la respuesta de insulina
fisiológica normal en diabetes de tipo 1 de modo que pueden
alcanzarse niveles de glucosa en sangre casi normales sin
administración de insulina o con un requerimiento reducido de la
misma. Como consecuencia, pueden prevenirse complicaciones de
diabetes a largo plazo y los pacientes deberían experimentar menos
hipoglucemia de la que experimentan con los regímenes
"intensivos" de insulina recomendados actualmente.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar un método para preparar islotes porcinos, que produzca
islotes viables para xenotransplante en un paciente mamífero siendo
capaces los islotes de producir insulina en un mamífero hospedador,
así como la preparación de islotes así producidos, o sin tener en
consideración como se produjeron, o una forma similar.
Como alternativa o además, es un objeto
adicional proporcionar un método para tratar un paciente mamífero
que padece diabetes que implica el xenotransplante de islotes
porcinos en el paciente mamífero.
Como alternativa o además, es un objeto
adicional proporcional al menos al público o la comunidad médica un
enfoque alternativo útil al tratamiento de la diabetes.
En un primer aspecto la invención consiste en
un método para preparar una preparación de islotes porcinos
xenotransplantables capaz, después del xenotransplante de producir
insulina porcina en un mamífero receptor apropiado, incluyendo o
comprendiendo el método las etapas de:
- (i)
- preparar un cultivo de páncreas recogido, páncreas que se ha recogido de lechones en o cerca del periodo de gestación completo;
- (ii)
- simultáneamente a la etapa (i) y/o después de la etapa (i) extraer células \beta de los islotes pancreáticos del cultivo del páncreas recogido; y
- (iii)
- someter el páncreas o las células de los islotes a un anestésico;
en el que los islotes (al menos en
alguna etapa en la realización del método) están expuestos a
nicotinamida y en el que la extracción se realiza usando una
colagenasa
adecuada.
Preferiblemente dichos lechones de los que se
extraen las células \beta de los islotes pancreáticos están en -20
a +10 días del periodo de gestación completo.
Preferiblemente dichos lechones están en -7 a
+10 días del periodo de gestación completo.
Preferiblemente la colagenasa se selecciona
entre Liberase® humana o Liberase® porcina.
Preferiblemente dicha colagenasa es Liberase®
humana.
Preferiblemente el cultivo incluye páncreas
recogido en una albúmina de mamífero de soporte sustancialmente
libre de agentes microbiológicos no humanos.
Preferiblemente la albúmina de mamífero es
albúmina de suero humano (HSA).
Preferiblemente los islotes se tratan con
nicotinamida después de su extracción del páncreas.
Preferiblemente el método incluye la etapa
adicional de tratar los islotes con IgF-1 o el
tripéptido N-terminal de IgF-1
(GPE).
Preferiblemente la exposición a IgF_{1} o a
GPE es mayor para las células de lechones más allá del periodo de
gestación completo, más preferiblemente hay exposición a IgF_{1}
para todas las células extraídas sin tener en consideración su
relación con el periodo de gestación completo.
Preferiblemente el páncreas y/o islotes se
someten a un agente anestésico adecuado que es lignocaína.
Preferiblemente la etapa (ii) del método incluye
reducir mecánicamente el páncreas recogido en presencia del agente
anestésico de islotes.
Preferiblemente se asocia un antibiótico con las
células de los islotes.
Preferiblemente dicho antibiótico es
ciproxin.
El método de la invención puede incluir o
comprender la etapa de:
(iii) encapsular las células de los islotes con
un material xenotransplantable biocompatible, siendo dicho material
in vivo poroso a glucosa e inulina,
en el que la nicotinamida se introduce en los
islotes o células de los islotes antes de la encapsulación en una
cualquiera o más etapas del procedimiento.
Preferiblemente dichos lechones en o cerca del
periodo de gestación completo de los que se extraen las células
\beta de islotes pancreáticos están en de -20 a +10 días del
periodo de gestación completo.
Preferiblemente dicho material biocompatible es
un alginato adecuado.
Preferiblemente el alginato está en forma
ultrapura.
Preferiblemente cada islote o agrupación de
islotes está atrapada en un entorno de alginato o similar a alginato
biocompatible poroso a insulina y glucosa in vivo.
Preferiblemente la encapsulación proporciona un
entorno que previene, una vez implantado, contacto directo del
tejido con los islotes.
Preferiblemente cada encapsulación implica
presentar los islotes y una solución de alginato adecuada en una
fuente de cationes compatibles para atrapar de este modo los islotes
en un gel de cationes - alginato.
Preferiblemente dicho gel de cationes alginato
es gel de calcio - alginato.
Preferiblemente dicho alginato usado en la
solución es alginato de sodio, y la solución de islotes y alginato
de sodio se presenta en forma de una gota en un baño de cationes
adecuados.
Preferiblemente la solución de islotes y
alginato de sodio es del 1,6% p/p.
Preferiblemente la solución de islotes y
alginato de sodio se presenta como una gota a través de una aguja
generadora de gotas.
Preferiblemente los cationes adecuados son
cloruro de calcio.
Preferiblemente los islotes revestidos de gel se
recubren con un material cargado positivamente y a partir de
entonces se les proporciona un recubrimiento externo de un alginato
adecuado.
Preferiblemente el material cargado
positivamente es
poli-L-ornitina.
Preferiblemente el gel que atrapa los islotes
dentro del recubrimiento externo se licua después.
Preferiblemente el licuado implica o sucede
mediante la adición de citrato de sodio.
Preferiblemente la encapsulación produce
cápsulas.
Preferiblemente las cápsulas contienen una
pluralidad de células de los islotes.
Preferiblemente las cápsulas contienen
sustancialmente tres células de los islotes.
Preferiblemente las cápsulas tienen un diámetro
de sustancialmente de aproximadamente 300 a 400 micrómetros.
Preferiblemente después del licuado del alginato
que atrapa los islotes hay las etapas adicionales de:
- lavar las cápsulas
- recubrir adicionalmente las cápsulas con
alginato para neutralizar cualquier cambio residual en el
recubrimiento de poli-L-ornitina y
prevenir el contacto directo de la
poli-L-ornitina con los tejidos
cuando se transplanta toda la cápsula.
Preferiblemente el alginato se ha producido
mediante un proceso que implica las etapas de:
Recogida del alga \rightarrow Lavado
\rightarrow Extracción del alginato \rightarrow Filtrado
\rightarrow Precipitado \rightarrow Secado.
Puede prepararse una cápsula
xenotransplantable de acuerdo con el método anterior.
Puede prepararse una preparación
xenotransplantable que sea o incluya islotes porcinos viables de
acuerdo con el método de la presente invención.
Preferiblemente la cápsula
xenotransplantable de al menos una célula \beta de islotes
pancreáticos porcinos comprende al menos una célula \beta de
islotes pancreáticos porcinos viable encerrada en un material
biocompatible poroso a glucosa y poroso a insulina in
vivo.
La invención puede usarse en un método para
el tratamiento de un paciente mamífero que padece diabetes, que
comprende:
(a) extraer células \beta de islotes
pancreáticos de lechones en o cerca del periodo de gestación
completo;
(b) simultáneamente con, y/o después de a),
tratar dichos islotes con nicotinamida,
(c) encapsular dichos islotes en un material
biocompatible que permitirá la circulación de glucosa hacia, y una
circulación de insulina desde, los islotes in vivo, y
(d) inyectar o implantar de otra manera las
células de los islotes encapsulados de la etapa (c) para
transplantar en dicho paciente mamífero una cantidad eficaz de
células de los islotes de lechones viables capaces de producir
insulina en el paciente,
Preferiblemente el método incluye además la
etapa de administrar nicotinamida al paciente mamífero al menos
posteriormente al transplante.
Preferiblemente el método incluye además la
etapa de prescribir al paciente, antes o después de la etapa de
implante, una dieta sin caseína (como se describe en este
documento).
Preferiblemente el método incluye además la
etapa de exposición de las células \beta de los islotes
pancreáticos a IgF_{1} o a GPE en alguna etapa después de la
extracción de los lechones y antes de la encapsulación.
Preferiblemente la recogida de los islotes al
menos durante cualquier confrontación sustancial (por ejemplo,
picado o exposición enzimática) es en presencia de un agente
protector contra traumas.
Preferiblemente se usa un agente protector
contra traumas durante el aislamiento y/o preparación de los mismos
para encapsulación.
Preferiblemente el agente es un agente protector
contra traumas seleccionado entre agentes anestésicos adecuados.
Preferiblemente el agente protector contra
traumas es lignocaína.
Preferiblemente el paciente antes de, durante o
después de la etapa (d) se ha sometido a un régimen de fármaco
reductor del colesterol.
Preferiblemente el fármaco es de la familia de
la "estatina".
Preferiblemente el fármaco es pravastatina.
Preferiblemente el rendimiento de islotes
porcinos viables obtenidos de la extracción de la etapa a) se
potencia mediante el uso de una colagenasa adecuada.
Preferiblemente la colagenasa se selecciona
entre Liberase® humana o Liberase® porcina.
Preferiblemente dicha colagenasa es Liberase®
humana.
Preferiblemente la extracción de la etapa a)
incluye tratamiento mecánico de los islotes.
Preferiblemente el tratamiento mecánico sigue a
la aplicación de un anestésico adecuado al tejido pancreático.
Preferiblemente el anestésico es lignocaína.
La invención también puede usarse en un
método para el tratamiento de un paciente mamífero que padece o
predispuesto a diabetes, incluyendo o comprendiendo dicho método las
etapas de:
- (A)
- (i) {}\hskip3mm recoger el páncreas de lechones en o cerca del periodo de gestación completo,
- (ii)
- cultivar el páncreas recogido en Albúmina de Mamífero sustancialmente libre de agentes microbiológicos no humanos,
- (iii)
- simultáneamente con la etapa (ii) y/o después de la etapa (ii), extraer los islotes del páncreas recogido usando una Liberase® adecuada,
- \quad
- en el que los islotes (al menos en alguna etapa en la realización de (A)) se exponen a nicotinamida;
- (B)
- (i) {}\hskip3mm encapsular los islotes preparados mediante (A) con un material de encapsulación adecuado que {}\hskip0.8cm permita la circulación de glucosa e insulina a su través, e
- (ii)
- implantar los islotes porcinos encapsulados en el mamífero receptor.
Preferiblemente la Liberase® se selecciona entre
Liberase® humana o Liberase® porcina.
Preferiblemente la Liberase es Liberase®
humana.
Preferiblemente la extracción de la etapa a)
incluye tratamiento mecánico de los islotes.
Preferiblemente el tratamiento mecánico sigue a
la aplicación de un agente anestésico adecuado al tejido
pancreático.
Preferiblemente el anestésico es lignocaína.
Preferiblemente el método incluye además la
etapa de administrar nicotinamida al mamífero receptor antes o
después de la etapa de implante.
Preferiblemente el método incluye además la
etapa de prescribir para el paciente, antes o después de la etapa
de implante, una dieta sin caseína (como se describe en este
documento).
Preferiblemente el método incluye además la
etapa de someter al paciente antes o después de la etapa de implante
a un régimen de fármaco reductor del colesterol.
Preferiblemente el fármaco reductor del
colesterol es de la familia de la "estatina".
Preferiblemente dicho fármaco reductor del
colesterol es pravastatina o simvistatina.
La presente invención reconoce la capacidad de
extraer islotes apropiados de lechones que tienen insulina de
similitudes estructurales similares a seres humanos, y niveles
fisiológicos de glucosa similares a seres humanos. Los lechones
usados están en o cerca del periodo de gestación completo. Los
islotes se convierten en una fuente adecuada de islotes
xenotransplantables con viabilidad en un ser humano siguiendo
ciertos procedimientos con respecto a la recogida y extracción de
los islotes, tratamiento de los islotes antes del xenotransplante
así como regímenes de uso de dichos islotes.
La principal ventaja del transplante de células
de los islotes porcinos sobre el transplante de células de los
islotes humanos es que la fuente de células de los islotes puede
ampliarse fácilmente, y la bioseguridad de las células puede
explorarse minuciosamente antes de un transplante. Desde un punto de
vista práctico, la retirada del páncreas y el aislamiento de las
células de los islotes pueden realizarse con prontitud en un entorno
ideal.
Consideraciones importantes pertinentes al uso
de células de los islotes porcinos en enfoques de transplante para
diabetes de tipo 1 incluyen las siguientes:
- Las similitudes estructurales y biológicas de
la insulina porcina y humana
- El hecho de que la insulina porcina se ha
usado para tratar diabetes durante varias décadas (y sólo se ha
reemplazado por insulina de secuencia humana de forma relativamente
reciente); y
- La similitud de los niveles fisiológicos de
glucosa en cerdos y seres humanos. (Weir y
Bonner-Weir 1997). Esto significa de hecho que
puede esperarse que las células de los islotes de cerdo reaccionen
de forma similar a sus homólogas humanas a la hora de mantener
concentraciones equivalentes de glucosa en sangre.
El alotransplante con éxito a largo plazo de
islotes humanos puede conseguirse en más del 80% de los pacientes
cuando la enfermedad está causada por procesos no inmunes. Por el
contrario, ni siquiera los islotes obtenidos de un gemelo no
diabético pueden invertir la diabetes autoinmune a largo plazo en el
gemelo diabético. Esto enfatiza el papel crítico de la autoinmunidad
en el fracaso del transplante de islotes. Esta observación se ha
validado en alotransplantes de roedores con diabetes causada por
autoinmunidad en comparación con diabetes debida a pancreatectomía
o destrucción química de células\beta. No existe un modelo de
diabetes autoinmune en animales más grandes. Es posible que el uso
de islotes de diferentes especies (xenotransplante) pudiera evitar
la destrucción autoinmune de los islotes transplantados, puesto que
el proceso inmune de rechazo del xenotransplante es diferente al de
rechazo del alotransplante, pero es totalmente hipotético en seres
humanos.
Todos los animales pretendidos como fuente de
tejido pancreático para xenotransplante se obtienen de una
instalación de cría de cerdos libre de patógenos específicos (SPF)
que se mantiene de acuerdo con la American Association for
Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). La instalación
mantiene una colonia de alto estado de salud con excelentes
patrones de administración, y maneja un sistema de registro que es
de fácil acceso y se archiva indefinidamente. Las puercas y los
puercos donantes se seleccionan con el objetivo subyacente de
producir fuerte heterosis en las camadas donantes.
Después de la retirada quirúrgica, los páncreas
de los donantes se transfieren a una instalación de limpieza para
continuar el proceso en un recipiente de plástico frío en tubos de
50 ml que contienen Solución Salina Equilibrada de Hank (HBBS) fría
con albúmina de suero humano (HSA) al 0,2% añadida. Se envían
muestras de sangre de cada donante para ensayos de virología y
serología de toxoplasma. Las muestras de cada órgano se mantienen en
un congelador a -80ºC para ensayos adicionales si fuera
necesario.
Las células de los islotes se aislan mediante
digestión convencional con colagenasa del páncreas picado mediante
el procedimiento documentado por Ricordi et al. (1990),
aunque con algunas modificaciones. Usando técnica aséptica, las
glándulas se dilatan con Liberase® (1,5 mg/ml), se les retira el
exceso de grasa, vasos sanguíneos y tejido conectivo, se pican, y se
digieren a 37ºC en un baño de agua en agitación durante 15 minutos a
120 rpm. La digestión se consigue usando lignocaína mezclada con la
solución de Liberase® para evitar daño celular durante la digestión.
Después del proceso de digestión, las células se pasan a través de
una malla estéril de 400 mm a un vaso de precipitados estéril. Se
usa un segundo proceso de digestión para cualquier tejido no
digerido.
Se ha determinado que pueden obtenerse
rendimientos mucho mayores por páncreas de cerdo neonato usando
Liberase^{TM} de cerdo o humana (por ejemplo, obtenida en Nueva
Zelanda de Roche) en lugar de colagenasa. Aunque hay descripción en
"Improved Pig Islet Yield and Post-Culture
Recovery Using Liberase P1 Purified Enzyme Blend", T J
Cavanagh et al. Transplantation Proceedings 30, 367 (1998) y
en "Significant Progress In Porcine Islets Mass Isolation
Utilizing Liberase® HI For Enzymatic Low-Temperature
pancreas Digestion", H. Brandhorst et al.
Transplantation Vol 68, 355 - 361 Nº 3 15 de agosto de 1999, los
rendimientos en esos documentos son bajos en comparación con los
que se han descubierto. Si, por ejemplo, siguiendo el procedimiento
de Brandhorst et al. hay un incremento del rendimiento de
islotes sobre colagenasa de 400 a digamos 800 con el procedimiento
que usa Liberase® humana (es decir, Liberase® HI) como en el
procedimiento de Brandhorst et al. pero limitado a islotes de
porcinos de neonatos tales como los de 7 días después del parto son
posibles rendimientos extraordinariamente grandes, concretamente,
el equivalente a 400 que sería el caso con colagenasa en bruto a
30000 que puede observarse como mucho mayor que el esperado
siguiendo el procedimiento de Brandhorst et al. con
cerdos.
El tejido digerido se lava tres veces, y se
siembra en medios de cultivo RPMI 1640 a los que se añade albúmina
de suero humano (HSA) al 2%, 10 mmol/l de nicotinimida, y
antibiótico (Ciproxin).
Para excluir cualquier contaminación del tejido,
se realizan procedimientos de control de calidad sobre las muestras
de cultivos celulares después del aislamiento y antes de la
encapsulación. Tres días después del aislamiento, se ensaya la
contaminación microbiológica en el cultivo celular por laboratorios
acreditados. El ensayo de retrovirus endógenos porcinos (PERV) se
realiza en el Laboratorio de Virología del Hospital de Auckland.
El rendimiento de islotes se determina
mediante tinción con ditizona (DTZ) de las células. La Ditizona es
un agente quelante del zinc y un tinte supravital que tiñe de forma
selectiva zinc en los islotes de Langherhans, produciendo la
aparición de un rojo distintivo.
La viabilidad de las células de los
islotes se determina usando naranja de acridina y yoduro de
propidio. El naranja de acridina es un tinte fluorescente que pasa
fácilmente a través de todas las membranas celulares para teñir el
citoplasma y el núcleo. Una fluorescencia verde brillante en el
núcleo y el citoplasma en exposición a luz ultravioleta (UV) denota
células vivas intactas. Por contra, el yoduro de propidio es un
tinte fluorescente que no puede pasar a través de una membrana
intacta. Emite una fluorescencia roja brillante cuando se expone a
luz UV, y la presencia de yoduro de propidio en un núcleo celular
indica daños graves o una célula muerta.
Se usa estímulo estático de la glucosa (SGS)
para evaluar la función in vitro de los islotes porcinos
exponiéndolos a concentraciones bajas y altas de glucosa y
teofilina. La determinación de la capacidad secretora de insulina
in vitro se realiza en islotes libres (después de 3 días en
cultivo) y después de su encapsulación posterior.
Los procesos mediante los que se purifican los
islotes antes del transplante son traumáticos para estos tejidos
altamente especializados. Dicho trauma puede inducir necrosis o
apoptosis - esta última puede retrasarse bastante.
Otros traumas pueden resultar de la
encapsulación. Los procesos usados en la preparación de islotes y su
encapsulación se han optimizado para asegurar el mínimo daño a los
islotes. Dichos procedimientos han asegurado isquemia caliente cero
(en comparación con horas en la mayoría de las preparaciones de
islotes humanos), han implicado el uso de nicotinamida para
potenciar el explante in vitro con éxito, han implicado un
tiempo de incubación mínimo con colagenasa o Liberase, han
implicado tecnología de encapsulación rápida no traumática, han
implicado el uso de IgF-1 (o el tripéptido del mismo
GPE), el uso de un anestésico tal como lignocaína, y el uso de un
antibiótico tal como ciproproxin etc.
La preparación preferida usa preferiblemente
islotes de neonatos (7 días de edad) lo que es crucial a la hora de
limitar el trauma de los islotes durante la purificación, y de
asegurar la maduración suficiente de los islotes para la producción
de insulina estimulada.
El IgF-1 (Factor de Crecimiento
Humano Similar a Insulina I) se usa para inducir que los islotes
porcinos inmaduros maduren a su forma productora de insulina. El
IgF-1 es un potente factor de crecimiento mitogénico
que media después del nacimiento las actividades promotoras del
crecimiento de la hormona del crecimiento. Tanto
IgF-1 como IgF-2 se expresan en
muchos tipos celulares y pueden tener funciones endocrinas,
autocrinas y paracrinas. Se ha descubierto que la forma preferida de
IgF-1 es el tripéptido
amino-terminal de IgF-1 glicina -
prolina - glutamato (GPE).
El alginato de sodio usado para este
procedimiento se extrae de fuentes de materia prima (algas) y se
prepara en una forma ultrapura en polvo. La solución de alginato de
sodio estéril (1,6%) se utiliza después en el Centro de Transplantes
de Islotes Diatranz para fabricar islotes encapsulados.
Generalmente cada encapsulación implica
presentar islotes y una solución de alginato adecuada (normalmente
alginato de sodio) en una fuente de cationes compatibles para
atrapar de este modo los islotes un gel de alginato - cationes
(normalmente gel de calcio - alginato).
El procedimiento de encapsulación implica
extrudir una mezcla de islotes y solución de alginato de sodio (1,6%
p/p) a través de una aguja generadora de gotas hasta un baño de
cationes gelificantes (cloruro de calcio). Los islotes atrapados en
el gel de calcio - alginato se recubren después con
poli-L-ornitina cargada
positivamente seguida de un recubrimiento externo de alginato
(0,05%). El núcleo central de alginato se licua después mediante la
adición de citrato de sodio. La mayoría de las cápsulas contienen 3
islotes y tienen un diámetro de 300 a 400 \mum.
Después del licuado del alginato que atrapa a
los islotes, las "cápsulas" se lavan, y se recubren de nuevo
con alginato que neutraliza cualquier cambio residual en el
recubrimiento de poli-L-ornitina y
previene el contacto directo de la
poli-L-ornitina con tejidos cuando
se transplanta toda la cápsula.
Los islotes encapsulados se mantienen en cultivo
celular, y después se comprueba la contaminación, liberación de
insulina y viabilidad antes del transplante. Solamente se liberan
para transplante si todos los ensayos de control de calidad son
negativos.
Idealmente el proceso de producción de alginato
ha implicado las siguientes etapas:
Recogida del alga \rightarrow Lavado
\rightarrow Extracción del alginato \rightarrow Filtrado
(preferiblemente un filtro de 0,2 \mum) \rightarrow Precipitado
\rightarrow Secado.
El alginato ultrapuro usado es idealmente Kelco
LV producido por Monsanto - Kelco, US y tiene las siguientes
especificaciones:
- 1.
- Viscosidad: 2% - 100 - 300 cps (Brookfield 25ºC, velocidad 3,60 rpm)
- 2.
- pH: 6,4 - 8,0
- 3.
- Contenido de proteínas < 0,5%
- 4.
- Filtración: a través de 0,2 \mum
- 5.
- Análisis químico:
| Ca: < 100 ppm | Mg: < 40 ppm | Mn: < 10 ppm | |
| Cu: < 40 ppm | Zn: < 40 ppm | Sr: < 40 ppm | |
| Fe: < 60 ppm | Pb: < 50 ppm | As: < 100 ppb | |
| Hg: < 40 ppb | Si: < 10 ppm |
- 6.
- Nivel de endotoxinas - medido mediante ensayo LAL (en la Universidad de Perugia): 39 EU/g
[NB. Cualquier nivel por debajo de 100 EU/g en
este ensayo se considera sin endotoxinas].
- 7.
- Peso molecular: 120.000 - 190.000 kD
- 8.
- Contenido de ácido manurónico (M): fracción de M (F_{m}) 61%
- 9.
- Contenido de ácido gulurónico (G): fracción de G (F_{G}) 39%
Idealmente la filtración ha sido con un proceso
de filtración múltiple que emplea filtros cargados positivamente que
retiran cualquier contenido de lipopolisacáridos.
El transplante no requiere y evita la necesidad
de agentes citotóxicos para suprimir el sistema inmune. Dichos
agentes son capaces de entrar en la microcápsula de alginato y
causar toxicidad de islotes, así como causar toxicidad sistémica.
En cambio, se usan nicotinamida y una dieta especial (para el
fundamento, véase sección 1.4 a continuación).
Los procedimientos de transplante de la primera
memoria descriptiva de la patente tienen la capacidad durante un
periodo anterior al rechazo de proporcionar insulina porcina. A este
respecto, se realizaron ensayos clínicos.
Cuatros adolescentes diabéticos de tipo 1
recibieron 10.000 islotes libres/kg de peso corporal mediante
inyección intraperitoneal. Los islotes se tomaron de lechones usando
las técnicas convencionales de digestión con colagenasa,
purificación y cultivo descritas en la sección 3.2. Los cuatro
receptores recibieron nicotinamida oral (1,5 g/día) y una dieta sin
caseína como se define en este documento tanto antes como después
del transplante. Se apreció una rápida reducción en los
requerimientos de insulina, que no estaba relacionada claramente con
la dosis, en la primera semana después del transplante. La
reducción en la dosis de insulina variaba del 21 al 32%, y la
respuesta duró hasta 14 semanas. Sin embargo, la insulina volvió
posteriormente a sus niveles previos.
La razón más probable para el fracaso del
transplante en estos pacientes fue el rechazo crónico.
Sin embargo no se apreciaron efectos
adversos.
Se han mostrado ahora transplantes de células de
los islotes porcinos encapsuladas en alginato en dos pacientes
humanos diabéticos, con el funcionamiento de los transplantes
prolongado. Los islotes se transplantaron mediante inyección
intraperitoneal, recibiendo un paciente 15.000 IEQ/kg (1.300.000
islotes en total) y el otro 10.000 IEQ/kg (930.000 islotes en
total). Los dos pacientes se trataron antes y después del
transplante con nicotinamida oral y una dieta basada en soja/sin
caseína como se define en este documento.
Se uso el procedimiento preferido como se
muestra en la Figura 1 para la preparación, siendo la encapsulación
como se ha dicho anteriormente. Se usaron células de los islotes de
-7 días a +10 de gestación completa.
Ahora se describirán formas preferidas de la
presente invención o ejemplos de trabajo en referencia a las figuras
adjuntas en las que:
La Figura 1 muestra un procedimiento preferido
para recoger, aislar y preparar células de los islotes (con
confinamiento o encapsulación) y el régimen de tratamiento asociado
para un paciente humano diabético para recibir el beneficio en curso
del xenotransplante,
La Figura 2 muestra el efecto de colagenasa de
diversas fuentes en el rendimiento y función de los islotes,
La Figura 3 muestra el índice de estimulación de
Liberase® frente a Colagenasa mostrando claramente que las
preparaciones de Liberase® (tanto humana como porcina a
concentraciones adecuadas) dieron rendimientos y función in
vitro mayores que una concentración optimizada de Colagenasa
P,
La Figura 4 muestra el índice de estimulación de
islotes libres cuando se compara el uso de ciproxin frente a una
mezcla de penicilina/estreptomicina y frente a un control sin
antibióticos,
La Figura 5 muestra los resultados de exposición
de islotes porcinos de neonatos en cultivo con GPE en comparación
con células de control.
*Nota: en lo sucesivo, los diferentes
experimentos usaron preparaciones de islotes diferentes así que los
valores de control varían.
\bullet Los islotes porcinos en
cultivo que se expusieron a IgF-1, aumentaron su
respuesta de insulina a glucosa, en un aumento de hasta 3 veces.
\bullet Una concentración de 0,1
\mug/ml de IgF-1 es suficiente para producir
secreción óptima de insulina durante la exposición a glucosa. No se
consiguió ningún beneficio adicional aumentando la concentración de
IgF-1.
\bullet Se probaron variaciones de la
duración de la exposición a IgF-1 sobre las células
de los islotes porcinos. Sin embargo no se descubrió un aumento en
el beneficio al cultivar los islotes con IgF-1 más
allá de un periodo de 24 horas, después del aislamiento.
\bullet Esta producción aumentada de
insulina persistió durante 14 después de la exposición a
IgF-1. Aún se están investigando duraciones más
largas.
\bullet La retirada de Nicotinamida
del medio de cultivo eliminó el beneficio de IgF-1
sobre la producción de insulina de los islotes.
\bullet Una concentración de 0,1
\mug/ml de IgF-2 durante el cultivo parecía
aumentar la producción de insulina de las células de los islotes
porcinos, después de una exposición de 24 horas. Sin embargo, este
aumento era transitorio hasta 3 días después de exposición.
\bullet La exposición prolongada a
IgF-2 más allá de 24 horas, no consiguió aumentar la
producción de insulina de las células de los islotes en respuesta a
glucosa.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El GPE es un tripéptido (gly - pro - glu)
obtenido de IGF-1. Es un nuevo péptido neuroactivo
con un efecto potente sobre la liberación de acetilcolina y
dopamina en cortes corticales. Los estudios previos realizados
usando GPE apoyan el concepto de que los productos proteolíticos del
precursor de IGF-1 juegan un papel en la regulación
de las funciones cerebrales.
El objetivo de este ejemplo era presentar el
efecto de GPE sobre la función de islotes porcinos aislados in
vitro.
- -
- Aislamiento de células de los islotes con dos pancreasas;
- -
- Aislamiento después del protocolo descrito anteriormente;
- -
- Medios RPMI añadidos con Cirpoxin, nicotinamida, Albúmina de suero humano
- -
- GPE, IGF1 (1 - 3), Bachem AG, Nº de Lote 0538925, solución madre de 100 \mug/ml (en agua): diluir adicionalmente en medio RPMI hasta la concentración final: 1 \mug/ml (1:100), 0,1 \mug/ml (1:1000) y 0,01 \mug/ml (1:10000)
- 1.
- GPE 0,01 \mug/ml
- 2.
- GPE 0,1 \mug/ml
- 3.
- GPE 1,0 \mug/ml
Mantener las células 3 días en cultivo antes del
Estímulo Estático de la Glucosa (SGS). El SGS implica exposición de
las células a concentraciones bajas y altas de glucosa para
comprobar la producción de insulina. Usando concentración de 0,1
\mug/ml añadir GPE a dos placas 14 horas antes del SGS (día 2
después del aislamiento).
La exposición de islotes porcinos de neonatos en
cultivo a GPE aumentó la respuesta de insulina a glucosa hasta 11,5
en comparación con las células de control. (Índice de estimulación
de control 13,3 en comparación con 24,8 cuando se usó GPE). La
viabilidad de las células fue > 85% tinción DTZ, AO/PI).
Una concentración de 0,01 \mug/ml de GPE en
cultivo es suficiente para producir respuesta óptima durante la
exposición a glucosa. No se consiguió ningún beneficio adicional
aumentando la concentración de GPE en cultivo. Véase la Figura 5 a
continuación.
Los resultados sugieren que podría usarse GPE
durante el cultivo de células de los islotes porcinos para mejorar
la calidad y función de las células antes del transplante. Además
GPE es un nuevo péptido neuroactivo descubierto en el cerebro
humano.
La lignocaína es un estabilizante de membrana y
un inhibidor de fosfolipasa A2. Cuando se usa a una concentración 1
mM durante la digestión con Colagenasa de páncreas porcino de 7 días
de edad, se produce un aumento de 2 veces en el rendimiento de
islotes.
La función endocrina de los islotes se evaluó
después de 3 días en cultivo mediante estímulo estático de la
glucosa. Los islotes aislados con Lignocaína durante la digestión
produjeron un aumento de 3 veces en la secreción de insulina en
respuesta a la exposición a glucosa.
Conclusión: El uso de Lignocaína durante la
digestión del páncreas aumenta la producción de insulina/g de
páncreas en 6 veces.
Se prepararon islotes de cerdos neonatos recién
preparados mediante procedimiento de aislamiento convencional y se
cultivaron durante dos días en medio RPMI con adiciones
convencionales.
Se incluyeron Estreptomicina (100 mcg/ml) y
Penicilina (100 U/ml) en un matraz y Ciproxin (3 mcg/ml) en
otro.
Se recogieron los islotes y se sometió una
alícuota a estimulación con teofilina y glucosa a alta
concentración.
La liberación comparativa de insulina de los
islotes - una medida de viabilidad - se muestra en la Figura 4.
Se obtuvieron pancreasas de lechones neonatos de
7 días e edad como anteriormente y se extrajeron los islotes
mediante el mismo proceso, variando solamente la fuente y la
cantidad de colagenasa. El rendimiento/gramo de páncreas se muestra
en la Figura.
Se evaluó la viabilidad de los islotes extraídos
usando estas variaciones en la fuente y cantidad de colagenasa
usando yoduro de propidio y ditizona para el contenido de
insulina.
- Tinción de DTZ > 85%
- AO/PI > 85%
Después se evaluó la funcionalidad de los
islotes mediante estímulo estático de la glucosa como anteriormente.
Los resultados se muestran en la figura a continuación.
Es evidente que las preparaciones de Liberase® a
concentraciones adecuadas dieron rendimientos y funciones más altas
in vitro que la concentración de Colagenasa P previamente
optimizada.
Se inyectaron por vía intraperitoneal islotes
preparados con la mejor concentración de Liberase® P y H de esta
manera en ratones CD1 hechos diabéticos mediante estreptozotocina
intravenosa. La dosis usada fue 10 islotes/g de peso corporal del
ratón. Diez días después de dicho tratamiento se evaluó la cantidad
de ratones que ya no eran diabéticos.
1/7 de los ratones tratados con Liberase® P y
4/7 de los aislados con Liberase H no eran diabéticos.
Se realizaron experimentos similares usando
ratones NOD espontáneamente diabéticos. De los ratones
supervivientes 10 días después del transplante 3/7 de los islotes
tratados con Liberase P y 3/3 de los islotes de Liberase H ya no
eran diabéticos.
Las nuevas microcápsulas de tamaño medio (300 -
400 \mu MSM) se preparan atomizando la suspensión de islotes -
alginato a través de un generador de microgotas especial.
El alginato de sodio usado para este
procedimiento se extrae de fuentes de materia prima (algas) y se
prepara en forma ultrapura en polvo (Keltone LVCR).
El procedimiento de encapsulación implica
extrudir una mezcla de islotes y solución de alginato de sodio
(1,6%) a través de una aguja generadora de gotas en un baño de
cationes gelificantes (cloruro de calcio). Los islotes atrapados en
el gel de calcio - alginato se recubren después con
poli-L-ornitina cargada
positivamente seguida de un recubrimiento externo de alginato
(0,05%). El núcleo central de alginato se licua después mediante la
adición de citrato de sodio. La mayoría de cápsulas contienen 3
islotes y tienen un diámetro de 300 a 400 \mum.
Los islotes encapsulados se mantienen en cultivo
celular, y después se comprueba la contaminación, la liberación de
insulina y la viabilidad antes del transplante.
Como se usan en este documento:
- -
- "Administrar" incluye auto - administrar:
- -
- "Sin caseína" cuando se refiere a leche como se usa en este documento, se refiere a leche que no contiene un factor diabetogénico, particularmente a leche que no contiene variante de la \beta-caseína que estimula la actividad diabetogénica en seres humanos. En referencia a la Solicitud de PCT Internacional WO 96/14577, por ejemplo una variante no diabetogénica, puede ser la variante A2 de \beta-caseína. Los contenidos totales de los documentos PCT/NZ95/00114 (WO 96/14577) y PCT/NZ96/00039 (WO 96/36239) se incluyen en este documento a modo de referencia.
- -
- "Sin caseína" como se usa en este documento con respecto a consideraciones dietéticas significa al menos evitar sustancialmente (preferiblemente evitar totalmente) dicha leche que contenga factores diabetogénicos obtenidos.
- -
- IgF1 es Factor de Crecimiento Humano Similar a Insulina I y es un potente factor de crecimiento mitogégico que media en las actividades promotoras del crecimiento de la hormona del crecimiento después del nacimiento. Tanto IGF-1 como IGF-2 se expresan en muchos tipos celulares y pueden tener funciones endocrinas, autocrinas y paracrinas.
- -
- El tripéptido N-terminal de IgF-1 o "GPE" es el tripéptido amino - terminal glicina - prolina - glutamato de IGF-1.
- -
- "Albúmina de mamífero" como se usa en este documento significa albúmina de suero de mamíferos, preferiblemente albúmina de suero humano (HSA).
- -
- "colagenasa apropiada" significa preferiblemente Liberase®, idealmente humana o porcina, idealmente Liberase H®.
- -
- "reducido mecánicamente" como se usa en este documento incluye cualquier proceso donde se aumenta el área de superficie de tejido pancreático, por ejemplo, triturado, molido, picado mecánico o con chorro de agua, etc...
Claims (34)
1. Un método para preparar una
preparación de islotes porcinos xenotransplantables capaces después
del xenotransplante de producir insulina porcina en un mamífero
receptor apropiado, en el que el método incluye o comprende las
etapas de:
- (i)
- preparar un cultivo de páncreas recogido, páncreas que se ha recogido de lechones en o cerca del periodo de gestación completo;
- (ii)
- simultáneamente con la etapa (i) y/o después de la etapa (i) extraer células \beta de los islotes pancreáticos del cultivo del páncreas recogido; y
- (iii)
- someter al páncreas o las células de los islotes a un anestésico;
- en el que los islotes (al menos en alguna etapa en la realización del método) se exponen a nicotinamida y en el que la extracción se realiza usando una colagenasa adecuada.
2. Un método de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dichos lechones están en de -20 a +10
días del periodo de gestación completo.
3. Un método de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dichos lechones están en de -7 a +10
días del periodo de gestación completo.
4. Un método de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha colagenasa
es Liberase® humana o porcina.
5. Un método de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el cultivo
comprende además páncreas recogido en una albúmina de mamífero de
soporte sustancialmente libre de agentes microbiológicos no
humanos.
6. Un método de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que dicha albúmina de mamífero es albúmina
de suero humano (HSA).
7. Un método de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que los islotes se
tratan con nicotinamida después de su extracción del páncreas.
8. Un método de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además la
etapa de tratar los islotes con uno de IgF-1 o el
tripéptido N-terminal de IgF-1
(GPE).
9. Un método de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que la etapa de tratar los islotes comprende
el tratamiento de los mismos con GPE.
10. Un método de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 8 y 9, en el que la exposición a
IgF-1 o GPE es mayor para las células de lechones
más allá del periodo de gestación completo.
11. Un método de acuerdo con la
reivindicación 8, en el que hay exposición a IgF-1
para todas las células extraídas sin tener en consideración su
relación con el periodo de gestación completo.
12. Un método de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior, en el que dicho anestésico es
lignocaína.
13. Un método de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior, en el que la etapa (ii) del método incluye
reducir mecánicamente el páncreas recogido en presencia del
anestésico.
14. Un método de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior, en el que se asocia un antibiótico con las
células de los islotes.
15. Un método de acuerdo con la
reivindicación 14, en el que dicho antibiótico es ciprofloxacin.
16. Un método de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende además la etapa de encapsular las
células de los islotes con un material xenotransplantable
biocompatible, siendo dicho material in vivo poroso a glucosa
y a insulina.
17. Un método de acuerdo con la
reivindicación 16, en el que el material biocompatible es un
alginato adecuado.
18. Un método de acuerdo con la
reivindicación 17, en el que el alginato está en forma ultra
pura.
19. Un método de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 16 a 18, en el que cada islote o grupo de
islotes está atrapado en un entorno de alginato o similar a alginato
biocompatible poroso a insulina y a glucosa in vivo.
20. Un método de acuerdo con la
reivindicación 19, en el que la encapsulación proporciona un entorno
que previene, una vez implantado, el contacto directo del tejido
con los islotes.
21. Un método de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 16 a 20, en el que la etapa de encapsular
las células de los islotes incluye presentar islotes y una solución
de alginato adecuada en una fuente de cationes compatibles para
atrapar de este modo los islotes en un gel de alginato -
cationes.
22. Un método de acuerdo con la
reivindicación 21, en el que el gel de cationes alginato es gel de
calcio - alginato.
23. Un método de acuerdo con la
reivindicación 21, en el que el alginato en forma ultra pura
comprende alginato de sodio, y la solución de islotes y alginato de
sodio se presenta en forma de gota en un baño de cationes
adecuados.
24. Un método de acuerdo con la
reivindicación 23, en el que la solución de islotes y alginato de
sodio es del 1,6% p/p.
25. Un método de acuerdo con la
reivindicación 23, en el que los cationes adecuados son cloruro de
calcio.
26. Un método de acuerdo con la
reivindicación 21, en el que los islotes revestidos de gel se
recubren con un material cargado positivamente y a partir de
entonces se les proporciona un recubrimiento externo de un alginato
adecuado.
27. Un método de acuerdo con la
reivindicación 26, en el que el material cargado positivamente es
poli-L-ornitina.
28. Un método de acuerdo con la
reivindicación 26, en el que el gel que atrapa a los islotes dentro
del recubrimiento externo se licua después.
29. Un método de acuerdo con la
reivindicación 28, en el que el licuado implica o sucede mediante la
adición de citrato de sodio.
30. Un método de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 16 a 29, en el que la encapsulación produce
cápsulas.
31. Un método de acuerdo con la
reivindicación 30, en el que las cápsulas contienen una pluralidad
de células de los islotes.
32. Un método de acuerdo con la
reivindicación 31, en el que las cápsulas contienen tres células de
los islotes.
33. Un método de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 31 ó 32, en el que las cápsulas tienen un
diámetro de aproximadamente 300 a 400 micrómetros.
34. Un método de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 28 a 33 en el que después del licuado del
alginato que atrapa los islotes hay etapas adicionales de:
- (i)
- lavar las cápsulas; y
- (ii)
- recubrir adicionalmente las cápsulas con un alginato adecuado.
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