ES2270416T5 - Vector nucleotídico, composición que lo contiene y vacuna para la inmunización contra la hepatitis. - Google Patents
Vector nucleotídico, composición que lo contiene y vacuna para la inmunización contra la hepatitis. Download PDFInfo
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Abstract
VECTOR NUCLEOTIDICO QUE COMPRENDE AL MENOS UN GEN O UN ADN COMPLEMENTARIO QUE CODIFICA AL MENOS UNA PARTE DE UNA PROTEINA DE UN VIRUS, Y UN PROMOTOR QUE PERMITE LA EXPRESION DE ESTE GEN EN CELULAS MUSCULARES. EL GEN PUEDE SER EL GEN S DEL VIRUS DE LA HEPATITIS B. UNA PREPARACION DE VACUNA QUE CONTIENE ESTE ADN DESNUDO SE INYECTA AL HUESPED PREVIAMENTE PRETRATADO POR UNA SUSTANCIA CAPAZ DE INDUCIR UNA NECROSIS COAGULADORA DE LAS FIBRAS MUSCULARES.
Description
Vector nucleotódico, composición que lo contiene
y vacuna para la inmunización contra la hepatitis.
La presente invención tiene por objeto un vector
para la inmunización contra una hepatitis.
La misma se refiere asimismo a una composición
que contiene este vector.
La inmunización por inyección de ADN desnudo en
los tejidos musculares ha sido el objeto de varios trabajos desde
el inicio de los años 1990.
Así, ULMER et al. (Science, 259,
1745-1749, 1993) han obtenido una protección contra
el virus Influenza por inducción de linfocitos T citotóxicos
inyectando en unos cuadriceps de ratón un plásmido que codifica
para la nucleoproteína Influenza A. El plásmido utilizado lleva, o
bien el promotor del virus del sarcoma de Rous, o bien el promotor
del citomegalovirus.
RAZ et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90, 4523-4527, 1993) han inyectado unos vectores que
comprenden el promotor del virus del sarcoma de Rous y un gen que
codifica para la interleukina-2, la
interleukina-4 o el factor de crecimiento
transformador de tipo \beta1 (TGF-\beta1). Son
mejoradas las respuestas inmunitarias humoral y celular de los
ratones a los que se les ha administrado por vía intramuscular estos
plásmidos.
WANG et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
90, 4156-4160, 1993) han inyectado en los músculos
de ratones un plásmido portador de un gen que codifica para la
proteína de envoltura del virus HIV-1. La inyección
de los plásmidos ha ido precedida por un tratamiento con
bupivacaína en el mismo lugar en el músculo. Los autores constatan
la presencia de anticuerpos capaces de neutralizar la infección por
el virus HIV-1. Se destacará de todas formas que el
ADN ha sido inyectado dos veces por semana para un número total de
cuatro inyecciones.
DAVIS et al. (Informe del 28 Congreso
Europeo sobre el músculo, Bielefeld, Alemania, 21-25
de Septiembre de 1992) han inyectado unos plásmidos portadores de
un gen que codifica para la luciferasa o la
\beta-galactosidasa tratando previamente los
músculos con sucrosa o una cardiotoxina. Los autores observan la
expresión de la luciferasa o de la
\beta-galactosidasa.
Más recientemente, un artículo aparecido en
Science et Avenir (Septiembre 1993, páginas 22-25)
indica que WHALEN y DAVIS han conseguido inmunizar unos ratones
contra el virus de la hepatitis B inyectándoles el ADN puro del
virus en los músculos. Se cita de manera general una inyección
previa de toxina de veneno de serpiente seguida de la inyección de
ADN entre 5 y 10 días más tarde. Se ha precisado que este método no
es práctico.
Estos trabajos habían sido precedidos por otros
experimentos en los que diferentes ADN habían sido inyectados, en
particular en unos tejidos musculares. Así, la solicitud de patente
PCT/US 90/01 515 (publicada con el nº WO-90/11 092)
da a conocer diversas construcciones plasmídicas que pueden ser
inyectadas, en particular en unos tejidos musculares para el
tratamiento de la distrofia muscular. Sin embargo, este documento
precisa que el ADN es inyectado preferentemente en unos
liposomas.
Ocurre lo mismo en la patente canadiense CA
362.966 (publicada con el nº 1.169.793) que describe la inyección
intramuscular de liposomas que contienen ADN que codifica en
particular para los antígenos HBs y HBc. Los resultados descritos
en esta patente mencionan la expresión de antígenos HBs. No se ha
buscado la presencia de anticuerpos anti-HBs.
La solicitud internacional PCT/FR 92/00 898
(publicada con el nº WO-93/06 223) describe unos
vectores virales que pueden ser encaminados por vía sanguínea hasta
unas células diana. Así, estos vectores son reconocidos por los
receptores de células, tales como las células musculares y pueden
ser empleados en el tratamiento de la distrofia muscular o de la
trombosis.
Esta solicitud no se refiere a la inmunización
frente a virus tales como por ejemplo el de la hepatitis B.
Por lo tanto se desprende del estado de la
técnica citado que, aunque ya se conocían estas técnicas de
inmunización frente a la hepatitis por inyección de ADN desnudo,
éstas presentaban un gran número de inconvenientes que no las
hacían prácticas de realizar.
Por otra parte, el ADN desnudo utilizado para
vacunar unos ratones era el ADN puro del virus. Este tipo de
tratamiento no es previsible para la vacunación humana, debido a los
riesgos que hace correr a los pacientes.
Por último, los experimentos más antiguos en los
que el ADN inyectado está contenido en unos liposomas no han
demostrado ninguna respuesta inmunitaria.
El solicitante se ha comprometido por lo tanto a
encontrar nuevas construcciones de vectores que permitan inmunizar
frente a la hepatitis sin tener por ello consecuencias negativas
para la salud humana.
Se ha comprometido por otra parte a encontrar un
aditivo a unas composiciones que contienen estas construcciones que
permita una degenerescencia eficaz del tejido muscular antes de la
inyección del ADN, y que sea compatible con los imperativos de la
salud humana.
El solicitante ha mostrado de manera
sorprendente que se podía obtener un nivel de anticuerpos eficaz y
duradero ampliamente superior al nivel que permite obtener en el
hombre una protección inmunitaria eficaz y duradera frente a la
infección por el virus de la hepatitis administrando por inyección
intramuscular un vector que tiene una construcción definida, y una
sustancia capaz de inducir una necrosis coagulatoria de las fibras
musculares.
La presente solicitud tiene por lo tanto por
objeto un vector nucleotídico que comprende:
- (i)
- un gen o un ADN complementario que codifica para al menos una parte de la proteína HBs del virus de la hepatitis B,
- (ii)
- la secuencia de terminación no traducida de dicho gen o de dicho ADN complementario, incluyendo la señal de poliadenilación, situada corriente abajo de dicho gen o de dicho ADN complementario,
- (iii)
- un promotor que controla la expresión de dicho gen o de dicho ADN complementario en unas células musculares, siendo dicho promotor seleccionado de entre:
- -
- el promotor del citomegalovirus,
- -
- el promotor de los genes de superficie del virus HBV, y
- -
- el promotor de un gen de una proteína del citoesqueleto
\vskip1.000000\baselineskip
Dicho vector puede no replicarse en estas
células.
También puede ser replicativo lo que permite
obtener un número elevado de copias por célula y mejorar la
respuesta inmunitaria.
El vector es además escogido con el fin de
evitar su integración en el seno del ADN celular, siendo conocidas
tales integraciones por activar los oncogenes e inducir la
cancerización de las células.
Ventajosamente el vector según la presente
invención es un plásmido en parte de origen bacteriano y que lleva
en particular un origen de replicación bacteriana y un gen que
permite su selección, tal como un gen de resistencia a un
antibiótico.
Este vector puede también estar provisto de un
origen de replicación que le permite replicarse en las células
musculares de su huésped, tal como un origen de replicación de virus
del papiloma bovino.
El gen o el ADN complementario llevado por este
vector codifica para al menos una parte la proteína HBs, en una de
sus formas S, S-preS2 o
S-preS2-preS1, en cuyo caso el gen
es el gen S.
Las secuencias de los genes o de las proteínas
de los virus de estas hepatitis están descritas o pueden ser
deducidas de los siguientes documentos:
patente FR-79 21 8111, patente
FR 80.09.039, patente EP- 81.400.634, patente FR 84.03.564, patente
EP
91.830.479 y el artículo de Najarian et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 2627-2631).
91.830.479 y el artículo de Najarian et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 2627-2631).
El vector puede comprender asimismo unos genes
que codifican al menos en parte para la proteína gp160 del virus
HIV1 asociada a la proteína p25, y/o a la proteína p55, y/o a la
proteína p18 o al menos un gen que codifica para la proteína Rev
del virus HIV1.
El promotor llevado por este vector es
ventajosamente el promotor del citomegalovirus (CMV). Puede sin
embargo ser cualquier otro promotor que permita una expresión
eficaz del gen en las células musculares, tal como el definido en
la reivindicación 1.
Así, puede ser:
- -
- un promotor de un gen de una proteína del citoesqueleto, en particular de la desmina tal como se describe por BOLMONT et al. (Journal of submicroscopic cytology and pathology, 1990, 22, 117-122) y ZHENLIN et al. (Gene, 1989, 78, 243-254),
- -
- el promotor de genes de superficie del virus HBV.
\newpage
De manera general, el promotor puede ser
heterólogo al huésped, es decir que no se encuentra en el huésped
de manera natural, pero es ventajosamente homólogo, permaneciendo al
mismo tiempo activo en origen en un tejido distinto al tejido
muscular.
Además del promotor, el vector puede comprender
una secuencia de terminación de la transcripción, situada corriente
arriba del gen.
Un vector de este tipo puede ser el plásmido
pCMV/HBS, o pRCCMV-HBS, que tiene la secuencia SEC
ID nº1, depositado con el nº I-1370 en la Colección
Nacional de Cultivos de Microorganismos del Institut Pasteur (CNCM)
el 21 de octubre de 1993.
Puede también ser el plásmido pRSV/HBS
depositado con el nº I-1371 en la CNCM el 21 de
octubre de 1993.
Este plásmido tiene una estructura similar al
pCMV/HBS pero comprende el promotor del virus del sarcoma de Rous
(RSV) en vez del promotor del citomegalovirus (CMV).
Otros plásmidos pueden ser:
- -
- el pCMVHB-S1.S2.S que ha sido construido por inserción del fragmento Bgl II-Bgl II del gen S, obtenido a partir del pCP10, en un vector pBlueScript modificado para contener unos lugares de clonado suplementarios en la parte "polylinker". El fragmento que contiene el gen S ha sido extraído a continuación por digestión Kpnl-BssH II y después clonado en los lugares correspondientes del pcADN 3 (In vitrogen, Rad Systems Europe Ltd, Abingdon UK) con el fin de obtener el pCMVHB-S1.S2.S. Este plásmido ha sido depositado con el nº I-1411 en la CNCM.
- -
- el pCMVHB-S2.S que ha sido obtenido eliminando la parte pre-S1 del gen HBS del pCMVHB-S1.S2.S por digestión Kpnl/Mstl y después ligando los dos extremos después del tratamiento con la nucleasa S1. El pcMVHB-S2.S ha sido depositado en la CNCM con el nº I-1410.
- -
- el pHBV-S1.S2.S depositado con el nº I-1409 en la CNCM, ha sido obtenido por inserción del fragmento Bgl II- Bgl II del gen S, obtenido a partir del pCP10, en un vector pBlueScript modificado para contener los lugares de clonado suplementarios en la parte "polylinker".
La presente invención se refiere además a unos
vectores nucleotídicos tales como los descritos anteriormente, que
comprenden un promotor homólogo al huésped y otra secuencia de
regulación para la expresión de un gen o de un ADN complementario
que codifica para una de las proteínas citadas anteriormente.
La presente invención tiene además por objeto
una vacuna o un medicamento que contiene al menos un vector, o una
secuencia nucleotídica, tal como se ha definido anteriormente.
Se describe además una composición capaz de
inducir una respuesta citotóxica constituida por al menos una
secuencia nucleotídica expresada en las células musculares y que
comprende un promotor tal como el definido más arriba.
La invención se refiere asimismo a una
composición farmacéutica no lipídica destinada a la inmunización
contra una infección viral tal como una hepatitis que comprende al
menos por una parte una sustancia capaz de inducir una necrosis
coagulatoria de las fibras musculares y por otro un vector tal como
el descrito más arriba o que comprende unas secuencias
nucleotídicas tales como las descritas anteriormente completas o
parciales. Se entiende por secuencia parcial una secuencia que
codifica para al menos 6 aminoácidos.
Ventajosamente dicha sustancia es la
bupivacaína.
De manera ventajosa, dicha composición se
caracteriza porque el vector es administrado en el músculo del
individuo a inmunizar, como mínimo 5 días después de la
administración de la bupivacaína, y sustancialmente en el mismo
lugar.
Una preadministración de bupivacaína de este
tipo permite de manera sorprendente aumentar la eficacia de la
administración del vector así como la inmunización del
individuo.
Ventajosamente, el vector es administrado diez
días después de la administración de la bupivacaína, y
sustancialmente en el mismo lugar en el músculo del individuo.
La presente composición puede además contener
adyuvantes compatibles y farmacéuticamente aceptables.
Una composición de este tipo es administrada
preferentemente mediante una inyección intramuscular. La inyección
puede ser realizada con ayuda de una jeringa asignada para este uso
pero también con ayuda de una pistola de chorro líquido tal como la
descrita por FURTH et al. (1992, Anal. Biochem. 205,
365-368).
Las cantidades de bupivacaína necesarias para
obtener una degenerescencia suficiente del tejido muscular con el
fin de obtener una inmunización óptima son del orden de 0,10 mg a 10
mg por dosis de composición inyectable.
Las cantidades de vectores a inyectar con el fin
de obtener una inmunización óptima del individuo contra una
hepatitis varían en función de la proteína codificada por el gen
llevado por el vector. A título indicativo, se inyectarán entre 0,1
y 1.000 \mug de vectores por individuo.
Los vectores podrán ser obtenidos mediante los
métodos conocidos por el experto en la materia, en particular por
síntesis o por los métodos de ingeniería genética.
Dichos métodos son los descritos en particular
en el manual técnico:
Maniatis T. et al. 1982 - Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor - Ed. New York.
La presente invención es ilustrada sin por ello
estar de ninguna manera limitada por los ejemplos siguientes en los
que:
La figura 1 es una representación esquemática
del plásmido pBC/CMV-HBs.
Las figuras 2A a 2D son unas representaciones
esquemáticas respectivamente de los plásmidos
pCMVHB-S, pCMVHB-S2.S,
pCMVHB-S1.S2.S y pHBV-S1.S2.S.
Las figuras 3, 4 y 5 son unos mapas de
restricción esquemáticos respectivamente de los plásmidos
pCMVHB-S2.S, pHBV-S1.S2.S y
pRSV-HBS.
La figura 6 ilustra la secreción de partículas
antigénicas HBs (HBs Ag) en ng/ml (en ordenadas) en función del
número de días (en abscisas) por unas células portadoras de los
plásmidos pCMVHB-S, pCMVHB-S1.S2.S y
pHBV-S1.S2.S, pSVS o
pCMVHB-S2.S.
Las figuras 7A y 7B ilustran la constatación
sobre ciertas partículas de la figura 6 de los antígenos PreS_{1}
y PreS_{2} por respectivamente unos anticuerpos
anti-preS_{1} y anti-preS_{2}.
La formación de los complejos anticuerpo-antígeno
es constatada por la densidad óptica (en ordenadas), en función de
la concentración en antígeno.
Las figuras 8A a 8D representan las respuestas
anti-HBS (HBs Ab en ordenadas, expresadas en mUl/ml)
y anti-preS2 (preS2 Ab en ordenadas, expresada en
D.O.) de los ratones vacunados por respectivamente
pCMVHB-S (8A), pCMVHB-S2.S (8B),
pCMVHB-S1.S2.S (8C) y pHBV-S1.S2.S
(8D).
La figura 9 ilustra la respuesta anticuerpo,
inmunoglobulinas lgG y IgM (títulos en ordenadas), de un ratón
vacunado por el pCMVHB-S2.S en función del número de
semanas (en abscisas).
Las figuras 10A a 10C representan las respuestas
antigrupo y antisubtipo ay inducidas por el ADN del
pCMv-S (ADN) o el antígeno HBS (prot)
respectivamente, en los ratones B10 (10A), B10S (10B) y B10M
(10C).
Las figuras 10D a 10F representan las respuestas
antigrupo a inducidas por el ADN del pCMV-S (ADN) o
el antígeno HBS (prot) respectivamente, en los ratones B10 (10D),
B10S (10E) y B10M (10F).
La figura 11 representa un mapa lineal de
restricción del plásmido
pBS-SKT-S1.S2.S.
Todos los experimentos han sido realizados sobre
unos músculos de la tibia anterior (TA) de unos ratones C57BL/6J de
5 a 7 semanas de edad.
Se induce un ciclo único de degenerescencia y de
regeneración de las fibras musculares en los músculos de la tibia
anterior de ratones no anestesiados, mediante inyección
intramuscular de 50 \mul de marcaína (bupivacaína 0,5%, DMSO 1%)
comercializada por los laboratorios Astra, Francia. La solución es
inyectada utilizando una jeringa de tuberculosis y una aguja
insertada en un manguito de polietileno, con el fin de limitar la
penetración a una profundidad de 2 mm.
Siendo la marcaína un anestésico, las
inyecciones en las piernas derecha e izquierda son espaciadas entre
10 y 30 minutos con el fin de evitar una sobredosis.
El plásmido utilizado ha sido construido por
clonación en un vector pBluescript modificado del fragmento de
restricción Xho I-Bgl II del plásmido pCP10 que
contiene el gen que codifica para el antígeno de superficie HBS y
unas secuencias no traducidas corriente arriba y corriente abajo que
incluyen la señal de poliadenilación.
El gen S es recuperado a continuación por
digestión con ayuda de las enzimas Kpnl-BssHII y el
fragmento ha sido clonado en el lugar del vector pRC/CMV
comercializado por In vitrogen. La construcción plasmídica
final ha sido denominada pCMV-HBS y depositada con
el nº I-1370 en la CNCM.
Este plásmido es representado esquemáticamente
en la figura 1. El promotor CMV está situado entre el nucleótido
228 que es el lugar de corte de la Mlul y el nucleótido 896, que es
el lugar de corte de la Kpnl. El fragmento de ADN que comprende el
gen de estructura del antígeno HBs ha sido clonado entre los
nucleótidos 896 y 2852 (lugar de la BssH III).
El gen HBs se extiende entre los nucleótidos 911
(lugar Xhol) y 2768 (lugar Bgl II).
La secuencia completa de este plásmido es la
secuencia SEC ID nº1.
El ADN plasmídico purificado ha sido preparado
mediante los métodos estándar, resuelto en tampón PBS y almacenado
a -20ºC hasta la inyección.
Uno a cinco días después de la inyección de la
marcaína, se ha inyectado en el mismo lugar el ADN, siendo
anestesiado el ratón con ayuda de pentobarbital de sodio (75 mg/kg
vía intraperitoneal).
La solución de ADN que contiene 50 \mug de ADN
plasmídico y 50 \mug de tampón PBS ha sido inyectada a través de
la piel en los músculos en curso de regeneración de la tibia
anterior mediante una inyección única intramuscular.
Se han realizado unas inyecciones de manera
bilateral, en las dos patas de los ratones, recibiendo así cada
animal en total 100 \mug de ADN plasmídico recombinante. Como para
la inyección de marcaína, se inyecta la solución de ADN utilizando
la jeringa de tuberculosis y la aguja descrita anteriormente.
En cada pata se ha realizado una sola inyección
intramuscular de ADN.
Los resultados obtenidos están resumidos en la
tabla I siguiente.
Muestran de forma muy clara que la inyección de
ADN después del tratamiento con la marcaína permite obtener unas
proporciones importantes de anticuerpos séricos frente al antígeno
de superficie de la hepatitis B.
Estos resultados son sorprendentes, no
permitiendo el análisis del estado de la técnica suponer que un
plásmido permitiría la inducción de anticuerpos
anti-HBs que se pueden encontrar en el suero y
permitiendo así una vacunación eficaz.
La facilidad de realización de la vacunación
mediante unos plásmidos, y el hecho de que no sea necesario hacer
recordatorios, permite prever una vacunación a gran escala.
Una dosis de 10 \mug de ADN plasmídico del
vector SV40-Luciferasa disponible en el comercio
("pGL2-Control Vector" de Promega, referencia
E1 11) en 50 \mul de solución fisiológica es inyectada en un
músculo tratado previamente con sucrosa según el método de Davis
et al. (Hum. Gene Ther. 4:151-159 (1993)). El
ADN inyectado es mezclado previamente con unos lípidos tales como
el dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS) o las mezclas
siguientes: DOGS + espermidina, y DOGS + polietilenglicol (PEG). La
actividad de la luciferasa es medida 5 días después de la
inyección.
Estos resultados figuran seguidamente en la
tabla II.
Muestran que la presencia de lípidos (DOGS)
disminuye de forma importante la eficacia de la inyección del
plásmido respecto a una composición sin lípidos (testigo).
Se han construido cuatro plásmidos que permiten
la expresión de una, dos o tres proteínas de envoltura del virus
HBV. En tres de estas construcciones (pCMVHB-S,
pCMVHB-S2.S, pCMVHB-S1.S2.S) los
genes que codifican para las proteínas de envoltura del virus HBV
están colocadas bajo el control transcripcional del promotor de los
genes precoces del virus CMV (figura 1, figura 2A a 2C, figuras 3 y
4). El cuarto plásmido (pHBV-S1.S2.S) utiliza como
elemento de control transcripcional el promotor de los genes de
superficie del virus HBV contenido en la región
pre-S1 de este virus (Cattaneo et al. (1983)
Nature, 305, 336) (figura 2D). En las cuatro construcciones, la
señal de poliadenilación utilizada está contenida en las secuencias
HBV presentes en 3' del gen S.
Para controlar la eficacia de estos vectores
in vitro en unas células eucariotas, se han transfectado
unos fibroblastos o unos mioblastos de ratón. Se ha utilizado como
control un plásmido que expresa las tres proteínas de envoltura
bajo control del promotor SV40 (pSVS) (Michel et al. 1984,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7708-7712). La
figura 6 muestra la cinética de secreción de las partículas HBs en
los sobrenadantes de cultivo. Los bajos contenidos de antígeno
producidos por transfección del vector
pCMVHB-S1.S2.S son compatibles con una fuerte
síntesis de la gran proteína de envoltura a partir del promotor CMV.
Esta proteína que es miristilada en su parte amino terminal, es
retenida en el retículo endoplasmático (Ganem, (1991), Current
Topics in Microbiology and Inmunology, 168, 61-83).
Se ha confirmado por inmunofluorescencia la retención en la célula
de proteínas que llevan unos determinates
pre-S1.
La composición de las partículas secretadas ha
sido analizada en un sistema ELISA sándwich utilizando como
anticuerpo de captura un anticuerpo monoclonal de ratón específico
de los determinantes pre-S1 (figura 7 A) ó
pre-S2 (figura 7B) y como segundo anticuerpo un
suero policlonal de conejo anti-HBs. Estos
experimentos muestran que las partículas de AgHBs producidas a
partir del vector pCMVHB-S1.S2.S llevan unos
determinantes pre-S1 y pre-S2 que
firman la presencia de la proteína de envoltura grande y mediana del
virus HBV. Las partículas secretadas después de la transfección del
vector pCMVHB-S2.S y pHBy.-S1.S2.S llevan, además de
los determinantes Hbs, unos determinantes pre-S2
característicos de la proteína media de envoltura.
El ADN purificado sobre columna Quiagen ha sido
inyectado por vía intramuscular en una sola inyección de 100 \mug
(50 \mug/pata) en el músculo anterior de la tibia de ratón C57/BL6
(8 ratones por grupo). Cinco días antes de la inyección, el músculo
ha sido tratado previamente con la cardiotoxina con el fin de
inducir una degenerescencia seguida de una regeneración de las
células musculares favoreciendo así la captura del ADN por estas
células.
Se han realizado también unos experimentos de
inyección de ADN en el conejo. En este caso el ADN
pCMVHB-S ha sido administrado en el músculo normal
sin degenerescencia, o bien mediante una pistola de inyección sin
aguja el Biojector®, o bien mediante unas jeringas convencionales
provistas de agujas.
Se induce una respuesta anticuerpo
anti-HBs por una única inyección de uno u otro de
los cuatro plásmidos utilizados.
La respuesta anticuerpo ha sido analizada
mediante kits comerciales de detección de anticuerpos
anti-HBs (Monolisa anti-Hbs,
Diagnostic Pasteur). Los anticuerpos anti-preS2 son
detectados en un sistema ELISA utilizando sobre la fase sólida un
péptido de la región pre-S2 (AA
120-145) que corresponde al epítopo B mayor llevado
por este ámbito (Neurath et al., (1985), Nature, 315,
154).
Las figuras 8A a 8D muestran la cinética de la
respuesta anti-HBs (HBs-Ab)
expresada en miliunidades internacionales/ml y de la respuesta
anti-pre-S2 (preS2Ab) medida en
densidad óptica (492 nm) para unos sueros diluidos al 1/100. Se
realiza la revelación con ayuda de un anticuerpo antiinmunoglobulina
(IgG) de ratón marcado con peroxidasa.
La inyección del plásmido
pCMVHB-S (figura 8A) induce una síntesis constante
de los anticuerpos anti-HBs. Se obtiene la
reconversión en el 100% de los ratones desde una semana después de
la inyección con una proporción media de anticuerpos de 48 mUl/ml
(de 12 a 84 mUl/ml, desviación tipo (SD)=28), lo que es de 4 a 5
veces superior al umbral requerido en el hombre para conferir la
protección (10 mUl/ml).
La respuesta inducida por una única inyección de
plásmido pCMVHB-S2.S (figura 8B) se caracteriza por
la aparición muy precoz de anticuerpos anti-HBs.
Estos anticuerpos alcanzan una proporción media de 439 mUl/ml (de
104 a 835 mUl/ml; SD=227) en una semana y después disminuyen para
volver a aumentar y alcanzar a las 13 semanas la proporción
inicial. El significado de este pico de anticuerpos será discutida
más adelante. Se observa un pico de anticuerpos IgG
anti-pre-S2 a las dos semanas.
La aparición de anticuerpos
anti-HBs inducidos por la inyección de plásmidos
pCMVHB-S1.S2.S (figura 8C) y
pHBV-S1.S2.S (figura 8D) es retardada ligeramente
puesto que los ratones se seroconvierten al 100% únicamente a
partir de las dos semanas. El perfil de la seroconversión es
idéntico, se caracteriza por una respuesta inicial específica del
antígeno pre-S2 seguida de una respuesta
anti-HBs que aumenta gradualmente hasta alcanzar
unas proporciones de 488 mUl/ml (de 91 a 1.034 mUl/ml; SD=552)
(pCMVHB-S1.S2.S) y 1.725 mUl/ml (de 143 a 6.037
mUl/ml; SD=1.808) (pHBV-S1.S2.S) a las 13
semanas.
Los resultados presentados en las tablas III y
IV muestran que las proporciones de anticuerpos detectadas a las 8
semanas en los conejos inmunizados con Biojector son
significativamente superiores a las obtenidas por inyección del ADN
con aguja.
Unos sistemas ELISA sobre la fase sólida de unos
antígenos HBs de unas composiciones variadas respecto a unos
determinantes presentados y utilizando como segundo anticuerpo unos
anticuerpos específicos de los IgM o de los IgG de ratones han
permitido analizar cualitativamente la respuesta anticuerpo
obtenida.
En todos los casos, la inyección única del ADN
en el ratón se caracteriza por la aparición precoz de IgM
específicos del AgHBs seguido inmediatamente por la conversión en
anticuerpo de isotipos IgG característicos de la respuesta memoria
inducida con ayuda de células T auxiliares. La respuesta anticuerpo
a la inyección del ADN se caracteriza por su precocidad. En efecto,
la seroconversión es obtenida 8 a 15 días después de la inyección
según el tipo de ADN utilizado y en todos los casos la meseta es
alcanzada en cuatro semanas y mantenida de manera sostenida durante
12 semanas.
La utilización del antígeno HBs de subtipo
heterólogo (ad) fijado sobre las placas ELISA permite evidenciar la
presencia, en el suero de los ratones inmunizados, de anticuerpos
específicos de grupo anti-a, y por diferencia de
reactividad respecto al AgHBs del mismo subtipo (ay), de anticuerpos
específicos del subtipo anti-y. La presencia de los
anticuerpos específicos de los determinantes de grupo del AgHBS es
muy importante puesto que éstos son capaces de conferir la
protección contra unos virus subtipo heterólogos durante las pruebas
virulentas en el chimpancé (Szmuness et al. (1982) N. Engl.
J. Med. 307, 1481-1486).
El análisis de la respuesta inducida por el
vector pCMV-S2.S muestra que ésta presenta una
similitud destacable con la que se puede observar en el hombre
durante la infección. Se caracteriza por un pico de IgM específicos
de la región pre-S2 extremadamente precoz (8 días)
seguido inmediatamente por una conversión en IgG
anti-pre-S2 (figura 9). Esta
respuesta es seguida por la aparición de los anticuerpos
anti-HBs IgM y después IgG. La producción de los
anticuerpos anti-HBs es constante y alcanza un
máximo a las 4 semanas. A las 13 semanas unos IgG
anti-HBs y
anti-pre-S2 persisten con un nivel
constante.
La respuesta antisubtipo (y) precede la
respuesta antigrupo (a) de la misma forma que ya se ha descrito
durante la vacunación con la vacuna recombinante (Tron et
al., (1989) (J. Infect. Dis. 160, 199-204).
La respuesta obtenida con los otros tres ADN
vacuna muestra la conmutación de clase IgM\rightarrowIgG
característica de la respuesta secundaria. Siendo la respuesta
primero dirigida contra el subtipo antes de serlo contra los
determinantes del grupo del AgHBs.
La respuesta a largo plazo, estudiada para el
ADN pCMVHB-S, muestra que el pico de anticuerpos es
alcanzado en 3 meses y que éstos persisten en una proporción igual
a 6 meses más tarde (Tabla V)
Un problema mayor de la vacunación contra la
hepatitis B sigue siendo el número elevado de
no-contestadores a la vacunación clásica (2,5 a
5%). La no respuesta en el hombre ha podido ser correlacionada a
ciertos tipo HLA (Krustall et al., (1992) J. Exp. Med. 175,
495-502) y a un defecto de la presentación del
antígeno o de la estimulación de las células T auxiliares.
Para estudiar el impacto posible de la
vacunación genética sobre la no respuesta al AgHBs, se ha utilizado
un panel de cepas de ratones cuya respuesta a las diferentes
proteínas de envoltura del virus HBV es regulada genéticamente y ha
sido bien caracterizado por Millich et al. (1986 J. Immunol.
137, 315). La construcción pCMVHB-S
descrita anteriormente ha sido inyectada en los músculos de los ratones B10 (H-2^{b}) B10.S (H-2^{s}) y B10.M
(H-2^{f}).
descrita anteriormente ha sido inyectada en los músculos de los ratones B10 (H-2^{b}) B10.S (H-2^{s}) y B10.M
(H-2^{f}).
La cepa B10 responde a las tres proteínas de
envoltura del virus, la cepa B10.S no responde a la AgHBs pero la
no respuesta puede ser rodeada por inmunización con unos antígenos
HBsAg portadores de unos determinantes pre-S2. La
cepa B10M es totalmente no contestadora al antígeno HBs y al
antígeno pre-S2. Una respuesta en esta cepa ha
podido ser obtenida por inmunización con unos AgHBs portadores de
las determinantes pre-S1.
Los ratones inmunizados por al ADN han recibido
una única inyección (100 \mug) en el músculo en regeneración. Los
ratones testigo han recibido la proteína en dos inyecciones
intraperitoneales con un mes de intervalo, la primera de 2 \mug
AgHBs adyuvada con adyuvante completo de Freund (CFA) y la segunda
de 2 \mug de AgHBs con adyuvante incompleto de Freund (IFA).
Los resultados obtenidos con el ADN
pCMVHB-S son ilustrados por las figuras 10A a
10F.
- -
- En la cepa B10 (buena contestadora) la respuesta inducida por el ADN es más precoz que la respuesta inducida por la proteína después de una única inyección.
- -
- En la cepa B10S (no contestadora a la AgHBs en ausencia de pre-S2) se observa la aparición de anticuerpos HBs específicos del subtipo y después específicos del grupo después de la inmunización con ADN pCMVHB-S. Se han obtenido unos anticuerpos anti-HBs específicos del grupo en los ratones inmunizados con la proteína HBs únicamente después de la 2ª inyección.
- -
- En la cepa B10M (no contestadora a la AgHBs en ausencia de pre-S1) la inmunización por ADN permite obtener una respuesta anti-HBs específica de grupo y de subtipo mientras que la proteína induce una respuesta únicamente de subtipo y necesita dos inyecciones.
La respuesta inducida por los tres tipos de
vectores es comparada en las tres cepas de ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
Generalmente se admite que la respuesta humoral
al antígeno HBs es suficiente por sí sola para conferir la
protección. La presencia de anticuerpos dirigidos contra otros
determinantes (pre-S1 y pre-S2)
llevados por las proteínas de envoltura del virus, a su vez
protectores, podría mejorar la calidad de esta respuesta. El
conjunto de experimentos indicados en este documento muestra que la
respuesta humoral inducida por la vacunación genética antihepatitis
B es, en muchos campos, superior a la que se puede obtener mediante
la vacunación clásica.
En términos de proporción de seroconversión: se
obtiene la proporción del 100% después de 8 días para los ratones
inmunizados con los ADN pCMV-HBs y
pCMVHB-S2.S y esto después de una única
inyección.
En términos de nivel de respuesta: el umbral de
10 mUl/ml considerado suficiente en el hombre para conferir la
protección es sobrepasado ampliamente.
En términos de precocidad de la respuesta; el
vector pCMVHB-S2.S permite obtener en 8 días un
nivel muy elevado de anticuerpos
anti-pre-S2 y se sabe que éstos son
capaces, por sí solos, de conferir la protección (Itoh et
al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83,
9174-9178).
En términos de persistencia de la respuesta: los
anticuerpos anti-HBs persisten a un nivel elevado
durante más de 6 meses.
En términos de calidad de la respuesta: los
anticuerpos obtenidos son de tipo IgG característicos de una
respuesta dependiente de las células T auxiliares y por lo tanto de
una respuesta de memoria.
En términos de actividad antiviral: los
anticuerpos son específicos del subtipo viral pero sobre todo
específicos del grupo y por lo tanto susceptibles de conferir una
protección cruzada.
En términos de significación biológica: el
perfil de la respuesta obtenida por inmunización con
pCMVHB-S2.S mima completamente el que se puede
observar, en el hombre, durante una infección viral resuelta.
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\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: INSTITUT PASTEUR
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 28, rue du Doctor Roux
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: PARÍS
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 75724
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vector nucleotídico, composición que lo contiene y vacuna para la inmunización contra la hepatitis.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/ MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- SISTEMA LOGÍSTICO: PatentIn Release #1.0, Versión # 1.25 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5618 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE RAMIFICACIONES: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CONFIGURACIÓN: circular
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: pRCCMV-HBS
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº:1:
Claims (21)
1. Vacuna que comprende:
- -
- un vector nucleotídico, comprendiendo dicho vector nucleotídico:
- (i)
- un gen o un ADN complementario que codifica para al menos una parte de la proteína HBs del virus de la hepatitis B;
- (ii)
- la secuencia de terminación no traducida de dicho gen o de dicho ADN complementario, incluyendo la señal de poliadenilación, situada corriente abajo de dicho gen o de dicho ADN complementario,
- (iii)
- un promotor que controla la expresión de dicho gen o de dicho ADN complementario en unas células musculares, siendo dicho promotor seleccionado de entre:
- -
- el promotor del citomegalovirus,
- -
- el promotor de los genes de superficie del virus HBV, y
- -
- un promotor de un gen de una proteína del citoesqueleto, y
- -
- unos adyuvantes compatibles y farmacéuticamente aceptables.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Vacuna según la reivindicación 1,
caracterizada porque dicho vector nucleotídico no se replica
en las células.
3. Vacuna según una de las reivindicaciones 1 y
2, caracterizada porque dicho gen o dicho ADN complementario
codifica para la proteína S, S-preS2 o
S-preS2-preS1.
4. Vacuna según una de las reivindicaciones 1 a
3, caracterizada porque dicho gen es el gen S.
5. Vacuna según una de las reivindicaciones 1 a
4, caracterizada porque dicho vector nucleotídico es el
plásmido pCMV-HBS depositado con el nº
I-1370 en la CNCM el 21 de octubre de 1993.
6. Vacuna según una de las reivindicaciones 1 a
4, caracterizada porque dicho vector nucleotídico es el
plásmido pCMVHB-S1.S2.S depositado en la CNCM con
el nº I-1411.
7. Vacuna según una de las reivindicaciones 1 a
4, caracterizada porque dicho vector nucleotídico es el
plásmido pCMVHB-S2.S depositado en la CNCM con el
nº I-1410.
8. Vacuna que comprende como vector nucleotídico
el plásmido pRSV-HBS depositado con el nº
I-1371 en la CNCM el 21 de octubre de 1993.
9. Vacuna según una de las reivindicaciones 1 a
4, caracterizada porque dicho vector nucleotídico es el
plásmido pHBV-S1.S2.S depositado en la CNCM con el
nº I-1409.
10. Vacuna según una de las reivindicaciones 1 a
3, caracterizada porque el promotor de una proteína del
citoesqueleto es el promotor de la desmina.
11. Composición farmacéutica no lipídica
destinada a la inmunización contra una infección viral por el virus
de la hepatitis que comprende un vector nucleotídico tal como el
definido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y una
sustancia capaz de inducir una necrosis coaguladora de las fibras
musculares.
12. Composición según la reivindicación 11,
caracterizada porque dicho vector es administrado en el
músculo del individuo a inmunizar, como mínimo cinco días después
de la administración de bupivacaína, sustancialmente en el mismo
lugar.
13. Composición según la reivindicación 11,
caracterizada porque el vector es administrado diez días
después de la administración de la bupivacaína.
14. Composición según una de las
reivindicaciones 12 y 13, caracterizada porque la
administración se realiza mediante inyección intramuscular.
15. Composición según la reivindicación 13,
caracterizada porque la inyección intramuscular se realiza
con ayuda de una pistola de chorro líquido.
\newpage
16. Vector nucleotídico que comprende:
- (i)
- un gen o un ADN complementario que codifica para al menos una parte de la proteína HBs del virus de la hepatitis B,
- (ii)
- la secuencia de terminación no traducida de dicho gen o de dicho ADN complementario, incluyendo la señal de poliadenilación, situada corriente abajo de dicho gen o de dicho ADN complementario,
- (iii)
- un promotor que controla la expresión de dicho gen o de dicho ADN complementario en unas células musculares, siendo dicho promotor seleccionado de entre:
- -
- el promotor del citomegalovirus,
- -
- el promotor de los genes de superficie del virus HBV, y
- -
- el promotor de un gen de una proteína del citoesqueleto.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Vector nucleotídico según la reivindicación
16, caracterizado porque es el plásmido
pCMV-HBS depositado con el nº
I-1370 en la CNCM el 21 de octubre de 1993.
18. Vector nucleotídico según la reivindicación
16, caracterizado porque es el plásmido
pCMVHB-S1.S2.S depositado en la CNCM con el nº
I-1411.
19. Vector nucleotídico según la reivindicación
16, caracterizado porque es el plásmido
pCMVHB-S2.S depositado en la CNCM con el nº
I-1410.
20. Vector nucleotídico según la reivindicación
16, caracterizado porque es el plásmido
pHBV-S1.S2.S depositado en la CNCM con el nº
I-1409.
21. Vector nucleotídico que es el plásmido
pRSV-HBS depositado con el nº I-1371
en la CNCM el 21 de octubre de 1993.
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