DE69434820T2 - Nukleotidvektor, Zusammensetzung, die diesen enthält, und Vakzin zur Immunisierung gegen eine Hepatitis - Google Patents

Nukleotidvektor, Zusammensetzung, die diesen enthält, und Vakzin zur Immunisierung gegen eine Hepatitis Download PDF

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Description

  • Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist ein Vektor zur Immunisierung gegen eine Hepatitis.
  • Sie bezieht sich außerdem auf eine Zusammensetzung, die diesen Vektor enthält.
  • Die Immunisierung durch Injektion von nackter DNA in die Muskelgewebe war ab dem Jahr 1990 Gegenstand vieler Arbeiten.
  • So erreichten Ulmer et al. (Science, 259, 1745-1749, 1993) einen Schutz gegen das Influenza-Virus durch Induktion der cytotoxischen T-Lymphozyten, indem sie in die Quadriceps von Mäusen ein Plasmid injizierten, das für das Influenza A-Nukleoprotein codiert. Das verwendete Plasmid trägt entweder den Promotor des Rous-Sarkom-Virus oder den Promotor des Cytomegalovirus.
  • Raz et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 4523-4527, 1993) injizierten Vektoren, die den Promotor des Rous-Sarkom-Virus und ein Gen, das für Interleukin-2, Interleukin-4 oder die Wachstumsfaktor-Transformante des Typs β1 (TGF-β1) codiert, umfassen. Die humoralen und zellulären Immunantworten der Mäuse, denen diese Plasmide auf intramuskulärem Weg verabreicht worden waren, wurden verbessert.
  • Wang et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90,4156-4160, 1993) injizierten in die Mausmuskeln ein Plasmid, das ein Gen trägt, das für das Hüllprotein des HIV-1-Virus codiert. Der Injektion der Plasmide ging eine Behandlung mit Bupivacain am selben Ort im Muskel voraus. Die Autoren bewiesen das Vorliegen von Antikörpern, die fähig sind, die Infektion durch das HIV-1-Virus zu neutralisieren. Man wird jedoch feststellen, dass die DNA zweimal pro Woche für eine Gesamtzahl von vier Injektionen injiziert wurde.
  • Davis et al. ( Bericht vom 28. Europäischen Muskelkongress, Bielefeld, Deutschland, 21.-25. September 1992) haben Plasmide, die ein für Luciferase oder für β-Galactosidase codierendes Gen tragen, injiziert, indem sie die Muskeln mit Saccharose oder einem Kardiotoxin vorbehandelten. Die Autoren beobachteten die Expression von Luciferase oder β-Galactosidase.
  • Vor kurzem wies ein Artikel, erschienen in Science et Avenir (September 1993, Seiten 22-25), darauf hin, dass es Whalen und Davis gelungen war, Mäuse gegen Hepatitis B-Virus zu immunisieren, indem sie ihnen nackte DNA des Virus in die Muskeln injizierten. Eine vorangehende Injektion von Schlangengift-Toxin, gefolgt von der DNA-Injektion 5-10 Tage später, wurde allgemein beschrieben. Es wurde dargelegt, dass diese Methode nicht praktikabel ist.
  • Diesen Arbeiten gingen andere Experimente voraus, in denen verschiedene DNA injiziert wurden, insbesondere in muskuläre Gewebe. So offenbart die Anmeldung PCT/US 90/01515 (veröffentlicht unter der Nummer WO 90/11092) verschiedene Plasmidkonstruktionen, die insbesondere in muskuläres Gewebe zur Behandlung der Muskeldystrophie injiziert werden können. Dennoch legt dieses Dokument dar, dass die DNA vorzugsweise in Liposome injiziert wird.
  • Dies gilt auch für das kanadische Patent CA 362.966 (publiziert unter der Nummer 1 169 793), das die intramuskuläre Injektion von Liposomen beschreibt, die DNA enthalten, die insbesondere für die Antigene HBs und HBc codiert. Die in diesem Patent beschriebenen Resultate erwähnen die Expression der Antigene HBs. Das Vorliegen von Anti-HBs-Antikörpern wurde nicht untersucht.
  • Die Internationale Anmeldung PCT/FR 92/00898 (veröffentlicht unter der Nummer WO 93/06223) beschreibt virale Vektoren, die auf dem Blutweg bis zu Targetzellen transportiert werden können. Diese Vektoren werden von den Rezeptoren von Zellen wie beispielsweise den Muskelzellen erkannt und können in der Behandlung von Muskeldystrophie oder Thrombose verwendet werden.
  • Diese Anmeldung betrifft nicht die Immunisierung gegen Virus, wie z.B. das von Hepatitis B.
  • Aus dem Stand der Technik geht hervor, dass, wenn man schon die Immunisierungstechniken gegen Hepatitis durch Injektion nackter DNA kennt, diese eine große Zahl von Unzulänglichkeiten aufweisen, die sie in der Durchführung nicht praktikabel machen.
  • Die nackte DNA, die zum Vakzinieren der Mäuse verwendet wurde, war die nackte DNA des Virus. Dieser Behandlungstyp ist wegen der Risiken für die Patienten für die humane Impfung nicht in Betracht zu ziehen.
  • Schließlich zeigten ältere Versuche, in denen die injizierte DNA in Liposomen enthalten ist, keine Immunantwort.
  • Die Anmelderin beschäftigte sich damit, neue Konstruktionen von Vektoren zu finden, die eine Immunisierung gegen Hepatitis ermöglichen, ohne jedoch negative Konsequenzen für die humane Gesundheit zu haben.
  • Sie beschäftigte sich andererseits damit, einen Zusatzstoff bzw. ein Additiv für Zusammensetzungen zu finden, die diese Konstruktionen enthalten, das eine wirksame Entartung des Muskelgewebes vor der Injektion der DNA ermöglicht und mit den Anforderungen bezüglich der menschlichen Gesundheit kompatibel ist.
  • Die Anmelderin hat in überraschender Weise gezeigt, dass man einen Antikörperspiegel erhalten kann, der wirksam ist und anhaltend ist, der weit über dem Spiegel liegt, der es ermöglicht, beim Menschen einen wirksamen und dauerhaften Immunschutz gegen die Infektion durch das Virus der Hepatitis zu erreichen, indem man durch intramuskuläre Injektion einen Vektor, der eine definierte Konstruktion hat, und eine Substanz, die fähig ist, eine Koagulationsnekrose der Muskelfasern zu induzieren, verabreicht.
  • Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist demnach ein Nukleotidvektor, umfassend wenigstens:
    • – ein Gen oder eine komplementäre DNA, die für wenigstens einen Teil eines Proteins eines Virus codiert;
    • – die nicht-translatierte Terminationssequenz des genannten Gens oder der komplementären DNA, die das Polyadenylierungssignal enthält; und
    • – einen Promotor, der die Expression dieses Gens in Muskelzellen erlaubt.
  • Der genannte Vektor kann sich in diesen Zellen nicht replizieren.
  • Er kann auch replikativ sein, was es ermöglicht, eine erhöhte Kopienzahl pro Zelle zu erhalten, und die Immunantwort zu verbessern.
  • Der Vektor wird außerdem so gewählt, dass seine Integration in die Zell-DNA vermieden wird, da bekannt ist, dass solche Integrationen die Onkogene aktivieren und die Karzinogese der Zellen induzieren.
  • Der erfindungsgemäße Vektor ist vorzugsweise ein Plasmid, teilweise bakteriellen Ursprungs, das insbesondere einen bakteriellen Replikationsursprung und ein Gen, das seine Selektion ermöglicht, z.B. ein Gen für Resistenz gegen ein Antibiotikum, trägt.
  • Dieser Vektor kann auch mit einem Replikationsursprung ausgestattet sein, der es ihm ermöglicht, sich in den Muskelzellen seines Wirts zu replizieren, z.B. ein Replikationsursprung des Rinder-Papillomavirus.
  • Das Gen oder die komplementäre DNA, das/die in diesem Vektor enthalten ist, codiert vorteilhafter Weise für ein Strukturprotein eines Virus, kann aber auch für ein Regulatorprotein codieren.
  • Das Gen oder die komplementäre DNA, das/die von diesem Vektor getragen wird, kann für wenigstens einen Teil eines Proteins des Virus einer Hepatitis, insbesondere Hepatitis B, und vorzugsweise das Protein HBs in einer seiner S-Formen, S-preS2 oder S-preS2-preS1, codieren, wenn das Gen das S-Gen ist.
  • Das Virus kann auch für eine andere Hepatitis verantwortlich sein, z.B. eine Hepatitis A oder eine Nicht-A-, Nicht-B-Hepatitis, z.B. Hepatitis C, E oder delta.
  • Die Sequenzen der Gene oder der Proteine der Viren dieser Hepatitis sind in den folgenden Dokumenten beschrieben oder können daraus abgeleitet werden:
    • Patent FR-79 21 811, Patent FR 80 09 039 , Patent EP-81 400 634,
    • Patent FR 84 03 564 , Patent EP 91 830 479 und der Artikel von Najarian et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 2627-2631).
  • Der Vektor kann auch Gene, die wenigstens teilweise für das Protein gp160 des HIV 1-Virus codieren, das mit dem Protein p25 und/oder dem Protein p55 und/oder dem Protein p18 assoziiert ist, oder auch ein Gen, das für das Rev-Protein des HIV 1-Virus codiert, umfassen.
  • Der Vektor kann auch anstelle eines Proteins eines Virus ein Protein eines pathogenen Mikroorganismus, z.B. ein Protein des Bakteriums, das für Diphterie, Keuchhusten, Listeriose verantwortlich ist, Tetanustoxin usw. umfassen.
  • Der Promotor, der von diesem Vektor getragen wird, ist vorteilhafter Weise der Promotor des Cytomegalovirus (CMV). Er kann jedoch jeder andere Promotor sein, der eine wirksame Expression des Gens in den Muskelzellen ermöglicht.
  • Er kann demnach sein:
    • – ein interner oder endogener Promotor, d.h. ein Promotor des Virus, aus dem das Gen stammt; ein derartiger Promotor kann durch ein Regulierungselement des Muskels oder eines anderen Gewebes vervollständigt sein, insbesondere durch ein Aktivatorelement;
    • – ein Promotor eines Gens eines Proteins des Cytoskeletts, insbesondere Desmin, wie es von Bolmont et al. (Journal of submicroscopic cytology and pathology, 1990, 22, 117-122) und Zhenlin et al. (Gene, 1989, 78, 243-254) beschrieben wurde;
    • – der Promotor der Oberflächengene des HBV-Virus.
  • Ganz allgemein kann der Promotor zum Wirt heterolog sein, d.h. er wird natürlicher Weise bei dem Wirt nicht gefunden, vorteilhafter Weise ist er aber homolog, wobei er ursprünglich in einem anderen Gewebe als dem Muskelgewebe aktiv ist.
  • Außer dem Promotor kann der Vektor eine Terminierungssequenz der Transkription umfassen, die stromabwärts des Gens angeordnet ist.
  • Ein derartiger Vektor kann z.B. das Plasmid pCMV/HBS oder pRCCMV-HBS sein, das die Sequenz SEQ ID NO: 1 hat, das bei der Collection Nationale de Cultures des Microorganismes beim Institut Pasteur (CNCM) am 21. Oktober 1993 unter der Eingangsnummer I-1370 hinterlegt wurde.
  • Er kann auch das Plasmid pRSV/HBS sein, das am 21. Oktober 1993 unter der Nummer I-1371 bei der CNCM hinterlegt wurde.
  • Dieses Plasmid hat eine ähnliche Struktur wie pCMV/HBS, umfasst aber den Promotor des Rous-Sarkom-Virus (RSV) anstelle des Promotors des Cytomegalovirus (CMV).
  • Andere Plasmide können sein:
    • – pCMVHB-S1.S2.S, das durch Insertion des Bgl II-Bgl II-Fragments des S-Gens, das aus pCP10 erhalten worden war, in einen pBlueScript-Vektor, welcher so modifiziert worden war, dass er zusätzliche Klonierungsstellen im "Polylinker"-Teil enthält, konstruiert worden war. Das Fragment, das das S-Gen enthält, wurde dann durch KpnI-BssH II-Verdau entfernt, dann in die entsprechenden Stellen des pcDNA 3 (Invitrogen, Rad Systems Europe Ltd., Abingdon GB) kloniert, um das pCMVHB-S1.S2.S zu erhalten. Dieses Plasmid wurde bei der CNCM unter der Nummer I-1411 hinterlegt.
    • – pCMVHB-S2.S, das erhalten wurde, indem der pre-S1-Teil des HBS-Gens des pCMVHB-S1.S2.S durch KpnI/MstI-Verdau eliminiert wurde, dann nach Behandlung mit der Nuclease S1 die zwei Enden ligiert wurden. Das pCMVHB-S2.S wurde bei der CNCM unter der Nummer I-1410 hinterlegt.
    • – pHBV-S1.S2.S, das bei der CNCM unter der Nummer I-1409 hinterlegt wurde, wurde durch Insertion des Bgl II-Bgl II-Fragments des S-Gens, erhalten aus pCP10, in einen pBlueScript-Vektor, der so modifiziert war, dass er zusätzliche Klonierungsstellen im "Polylinker"-Teil enthielt, erhalten;
    • – pBS-SKT-S1.S2.S codiert für die drei Hüllproteine S, S-preS1 und S-preS1-preS2 des HBV-Virus.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf Nukleotidvektoren wie die oben beschriebenen, die einen Promotor umfassen, der mit dem Wirt homolog ist, und eine andere Regulierungssequenz für die Expression eines Gens oder einer komplementären DNA, codierend für eines der vorgenannten Proteine, umfasst.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Vakzin oder ein Medikament, das wenigstens einen Vektor oder eine Nukleotidsequenz – wie oben definiert – enthält.
  • Gegenstand ist auch eine Zusammensetzung, die fähig ist, eine cytotoxische Reaktion zu induzieren, die aus wenigstens einer Nukleotidsequenz besteht, die in den Muskelzellen exprimiert wird, und die einen Promotor, wie er oben definiert ist, enthält.
  • Sie bezieht sich auch auf eine pharmazeutische Nicht-Lipid-Zusammensetzung, die zur Immunisierung gegen eine Virusinfektion wie Hepatitis bestimmt ist, wenigstens umfassend einerseits eine Substanz, die fähig ist, eine Koagulationsnekrose der Muskelfasern zu induzieren, und andererseits einen Vektor, wie er oben beschrieben wurde, oder umfassend eine der Nukleotidsequenzen, wie sie oben beschrieben wurden, vollständig oder partiell. Unter partieller Sequenz versteht man eine Sequenz, die für wenigstens sechs Aminosäuren codiert.
  • Vorteilhafter Weise ist die genannte Substanz Bupivacain.
  • In vorteilhafter Weise ist die genannte Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor in den Muskel des Individuums, das zu immunisieren ist, mindestens 5 Tage nach der Verabreichung des Bupivacains verabreicht wird, und zwar ungefähr an derselben Stelle.
  • Eine solche Vor-Verabreichung von Bupivacain erlaubt es in überraschender Weise, die Wirksamkeit der Verabreichung des Vektors so wie die Immunisierung des Individuums zu verstärken.
  • Vorteilhafter Weise wird der Vektor 10 Tage nach Verabreichung des Bupivacains verabreicht, und zwar ungefähr an derselben Stelle in den Muskel des Individuums.
  • Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann darüber hinaus kompatible und pharmazeutisch annehmbare Adjuvanzien enthalten.
  • Eine solche Zusammensetzung wird vorzugsweise durch intramuskuläre Injektion verabreicht. Die Injektion kann mit Hilfe einer zu diesem Gebrauch bestimmten Spritze, aber auch mit Hilfe einer Flüssigkeitsstrahlpistole, z.B. die, die von Furth et al. (1992, Anal. Biochem. 205, 365-368) beschrieben wurde, verabreicht werden.
  • Die Mengen an Bupivacain, die notwendig sind, um eine ausreichende Degeneration des muskulären Gewebes zu erreichen, um eine optimale Immunisierung zu erhalten, liegen in der Größenordnung von 0,10 mg bis 10 mg pro Dosis der injizierbaren Zusammensetzung.
  • Die zu injizierenden Mengen an Vektoren zur Erreichung einer optimalen Immunisierung des Individuums gegen eine Hepatitis variieren in Abhängigkeit von dem Protein, welches durch das vom Vektor getragene Gen codiert wird. Typischerweise wird man zwischen 0,1 und 1.000 μg Vektoren pro Individuum injizieren.
  • Die Vektoren können durch dem Fachmann bekannte Verfahren erhalten werden, insbesondere durch Synthese oder durch gentechnologische Verfahren.
  • Derartige Verfahren sind insbesondere in dem technischen Handbuch:
    Maniatis T. et al. 1982 – Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor – Herausgeber, New York, beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die Beispiele, die folgen, erläutert, ohne sie zu beschränken. In diesen:
  • ist 1 eine schematische Darstellung des Plasmids pRC/CMV-HBs;
  • sind die 2A bis 2D schematische Darstellungen der Plasmide pCMVHB-S, pCMVHB-S2.S, pCMVHB-S1.S2.S und pHBV-S1.S2.S;
  • sind die 3, 4 und 5 schematische Restriktionskarten der Plasmide pCMVHB-S2.S, pCMVHB-S1.S2.S und pRSV-HBS;
  • veranschaulicht 6 die Sekretion der antigenen Partikel HBs (HBs Ag) in ng/ml (auf der Ordinate) in Funktion der Zahl der Tage (auf der Abszisse) durch Zellen, die die Plasmide pCMVHB-S, pCMVHB-S1.S2.S, pHBV-S1.S2.S, pSVS oder pCMVHB-S2.S tragen;
  • veranschaulichen die 7A und 7B die Präsentation der Antigene preS1 und preS2 auf bestimmten Partikeln der 6 durch die Antikörper Anti-preS1 und Anti-preS2. Die Bildung der Antikörper-Antigen-Komplexe wird durch die optische Dichte (Ordinate) als Funktion der Antigenkonzentration gezeigt;
  • stellen die 8A bis 8D die Anti-HBS-Reaktionen (HBs Ab auf der Ordinate, ausgedrückt in mIU/ml) und die Anti-preS2-Reaktionen (preS2 Ab auf der Ordinate, ausgedrückt als O.D.) von Mäusen dar, die mit pCMVHB-S (8A), pCMVHB-S2.S (8B), pCMVHB-S1.S2.S (8C) bzw. pHBV-S1.S2.S (8D) geimpft worden waren;
  • stellt die 9 die Antikörperreaktion, Immunglobuline IgG und IgM, (Titer auf der Ordinate) einer mit pCMVHB-S2.S geimpften Maus als Funktion der Zahl der Wochen (auf der Abszisse) dar;
  • stellen die 10A bis 10C die Anti-Gruppe-Reaktionen und die Anti-Subtyp-Reaktionen ay dar, die durch die DNA von pCMV-S (DNA) oder das Antigen HBS (prot) bei den Mäusen B10 (10A), B10S (10B) bzw. B10M (10C) induziert wurden;
  • stellen die 10D bis 10F die Anti-Gruppe a-Reaktionen dar, die durch die DNA von pCMV-S (DNA) bzw. das Antigen HBS (prot) bei den Mäusen B10 (10D), B10S (10E) und B10M (10F) induziert wurden;
  • stellt 11 eine lineare Restriktionskarte des Plasmids pBS-SKT-S1.S2.S dar.
  • BEISPIEL 1:
  • Induktion von Antikörpern gegen ein Oberflächenantigen der Hepatitis B durch sequenzielle Injektion von Bupivacain und einem Plasmid das ein Gen trägt, das für das Antigen codiert
  • 1) Materialien und Verfahren
  • 1.1 Vorbehandlung durch Bupivacain.
  • Alle Experimente wurden an den Muskeln des vorderen Schienbeins (Tibia anterior = TA) von C57BL/6J-Mäusen mit einem Alter von 5 bis 7 Wochen durchgeführt.
  • Ein einzelner Zyklus der Degeneration und der Regeneration von Muskelfasern wird in den Muskeln des vorderen Schienbeins von nicht-anästhesierten Mäusen durch intramuskuläre Injektion von 50 μl Marcain (0,5 % Bupivacain, 1 % DMSO), das von Laboratoires Astra, Frankreich, im Handel ist, induziert. Die Lösung wird injiziert, indem eine Tuberkulosespritze und eine Nadel, die in einen Polyethylenmantel eingesetzt war, um die Penetration auf eine Tiefe von 2 mm zu beschränken, verwendet wurden.
  • Marcain ist ein Anästhetikum, die Injektionen in das rechte und linke Bein erfolgen im Abstand von 10 bis 30 Minuten, um eine Überdosierung zu vermeiden.
  • 1.2. Herstellung der DNA
  • Das verwendete Plasmid wurde durch Klonierung in einen pBluescript-Vektor konstruiert, der durch das Xho I-Bgl II-Restriktionsfragment des Plasmids pCP 10 modifiziert war, das das Gen, das für das Oberflächenantigen HBS codiert, und nicht-translatierte Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts, einschließlich des Polyadenylierungssignals, enthält.
  • Das Gen S wurde anschließend durch Verdau mit Hilfe der Enzyme KpnI-BssHII gewonnen, und das Fragment wurde in die Stelle des Vektors pRC/CMV, im Handel von Invitrogen, kloniert. Die fertige Plasmidkonstruktion wurde pCMV-HBS genannt und wurde bei der CNCM unter der Nummer I-1370 hinterlegt.
  • Dieses Plasmid ist schematisch in 1 dargestellt. Der Promotor CMV liegt zwischen dem Nukleotid 228, das die Schnittstelle des MluI ist, und dem Nukleotid 296, das die Schnittstelle des KpnI ist. Das DNA-Fragment, das das Strukturgen des Antigens HBs umfasst, wurde zwischen die Nukleotide 896 und 2852 (Stelle des BssH III) kloniert.
  • Das HBs-Gen erstreckt sich zwischen den Nukleotiden 911 (XhoI-Stelle) und 2768 (Bgl II-Stelle).
  • Die vollständige Sequenz dieses Plasmids ist die Sequenz SEQ ID NO: 1.
  • Die gereinigte Plasmid-DNA wurde durch Standardmethoden hergestellt, im PBS-Puffer wieder aufgelöst und bis zur Injektion bei –20°C gelagert.
  • 1.3 Injektion der DNA
  • Ein bis 5 Tage nach Injektion des Marcains injiziert man an der gleichen Stelle die DNA, wobei die Maus mit Hilfe von Natriumpentobarbital anästhesiert ist (75 mg/kg auf intraperitonealem Weg).
  • Die DNA-Lösung, die 50 μg Plasmid-DNA und 50 μl PBS-Puffer enthielt, wurde im Verlauf der Regeneration des vorderen Schienbeins durch eine einzelne intramuskuläre Injektion in die Muskeln injiziert.
  • Injektionen wurden bilateral vorgenommen, und zwar in die zwei Pfoten der Mäuse, wobei jedes Tier auf diese Weise insgesamt 100 μg rekombinante Plasmid-DNA erhielt. Wie für die Injektion des Marcains injiziert man die DNA-Lösung unter Verwendung der Tuberkulosespritze und der vorstehend beschriebenen Nadel.
  • Für jede Pfote wurde eine einzelne intramuskuläre DNA-Injektion vorgenommen.
  • 2. Resultate
  • Die erhaltenen Resultate sind in der folgenden Tabelle I zusammengefasst.
  • Sie zeigen ganz deutlich, dass die Injektion von DNA nach Behandlung durch das Marcain es ermöglicht, bedeutende Titer an Serum-Antikörpern gegen das Oberflächenantigen der Hepatitis B zu erhalten.
  • Diese Resultate sind überraschend, denn die Analyse des Standes der Technik ermöglicht es nicht, anzunehmen, dass ein Plasmid die Induktion von Anti-HBs-Antikörpern ermög lichen würde, die in dem Serum wieder gefunden werden und somit eine wirksame Impfung ermöglichen. Die Einfachheit der Durchführung der Impfung durch Plasmide und die Tatsache, dass es nicht notwendig ist, Wiederholungen durchzuführen, erlaubt es, eine Impfung in großem Maßstab ins Auge zu fassen.
  • BEISPIEL 2:
  • Vergleich der Wirksamkeit der Injektion eines Plasmids in Gegenwart und in Abwesenheit von Lipiden
  • Eine Dosis von 10 μg Plasmid-DNA des Vektors SV40-Luciferase, die im Handel verfügbar ist ("pG12-Kontrollvektor" von Promega, Referenz E1 11) in 50 μl physiologischer Lösung wird in einen Muskel injiziert, der nach dem Verfahren von Davis et al. (Hum. Gene Ther. 4:151-159 (1993)) mit Saccharose vorbehandelt worden war. Die injizierte DNA wurde vorher mit Lipiden wie z.B. Dioctadecylamidoglycylspermin (DOGS) oder den folgenden Gemischen: DOGS + Spermidin und DOGS + Polyethylenglykol (PEG) vermischt. Die Aktivität der Luciferase wird 5 Tage nach der Injektion gemessen.
  • Diese Resultate sind in der später folgenden Tabelle II angegeben.
  • Sie zeigen, dass das Vorliegen von Lipiden (DOGS) in bedeutender Weise die Wirksamkeit der Injektion des Plasmids im Vergleich zu einer Zusammensetzung ohne Lipide (Vergleich) vermindert.
  • BEISPIEL 3:
  • Vergleich der Reaktionen von Mäusen und Kaninchen auf Plasmide die verschiedene Promo toren und Gene der Hülle des Virus HBV tragen.
  • Es wurden vier Plasmide konstruiert, die die Expression von einem, zwei oder drei Hüllproteinen des HBV-Virus ermöglichen. In drei dieser Konstruktionen (pCMVHB-S, pCMVHB-S2.S, pCMVHB-S1.S2.S) wurden die Gene, die für die Hüllproteine des HBV-Virus codieren, unter die Transkriptionskontrolle des Promotors der frühen Gene des CMV-Virus gestellt (1, 2A bis 2C, 3 und 4). Das vierte Plasmid (pHBV-S1.S2.S) verwendet als Transkriptionskontrollelement den Promotor der Oberflächengene des HBV-Virus, der in der Region pre-S 1 dieses Virus enthalten ist (Cattaneo et al. (1983) Nature, 305, 336) (2D). In den vier Konstruktionen ist das verwendete Polyadenylierungssignal in den HBV-Sequenzen, die 3' des Gens S vorliegen, enthalten.
  • 1. In vitro-Kontrolle der Wirksamkeit der Vektoren
  • Um die Wirksamkeit dieser Vektoren in vitro in den eukaryotischen Zellen zu kontrollieren, wurden Maus-Fibroblasten und -myoblasten transfiziert. Ein Plasmid, das die drei Hüllproteine unter der Kontrolle des SV40-Promotors (pSVS) exprimiert, wurde als Kontrolle verwendet (Michel et al. 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 7708-7712). 6 zeigt die Kinetik der Sekretion der HBs-Partikel in den Kulturüberständen. Die schwachen Antigentiter, die durch Transfektion des Vektors pCMVHB-S1.S2.S produziert werden, sind mit einer starken Synthese des großen Hüllproteins ausgehend vom CMV-Promotor kompatibel. Dieses Protein, das in seinem Amino-terminalen Teil myristyliert ist, wird im endoplasmatischen Retikulum zurückgehalten (Ganem (1991), Current Topics in Microbiology and Immunology, 168, 61-83). Die Retention von Proteinen, die pre-S1-Determinanten tragen, in der Zelle wurde durch Immunfluoreszenz bestätigt.
  • Die Zusammensetzung der sekretierten Partikel wurde in einem ELISA-Sandwich-System analysiert, das als Fangantikörper einen monoklonalen Mausantikörper, der spezifisch für die Determinanten pre-S1 (7A) oder pre-S2 (7B) ist, und als zweiten Antikörper ein polyklonales Kaninchen -Anti-HBs-Serum verwendet. Diese Experimente zeigen, dass die AgHBs-Partikel, die vom Vektor pCMVHB-S1.S2.S produziert werden, die Determinanten pre-S 1 und pre-S2 tragen, was das Vorliegen des großen und mittleren Hüllproteins des HBV-Virus anzeigt. Die Partikel, die nach Transfektion des Vektors pCMVHB-S2.S und pHBV-S1.S2.S sekretiert werden, tragen zusätzlich zu den Hbs-Determinanten die Determinanten pre-S2, die für das mittlere Hüllprotein charakteristisch sind.
  • 2) Inokulation der DNA
  • Die DNA, die an einer Quiagen-Säure gereinigt worden war, wurde auf intramuskulärem Weg in einer einzelnen Injektion mit 100 μg (50 μg/Pfote) in den vorderen Muskel der Tibia von C57BL6-Mäusen (8 Mäuse pro Gruppe) injiziert. 5 Tage vor der Injektion war der Muskel durch das Cardiotoxin vorbehandelt worden, um eine Degeneration, gefolgt von einer Regeneration der Muskelzellen zu induzieren, was die Aufnahme der DNA durch diese Zellen begünstigt.
  • Es wurden auch Injektionsexperimente mit der DNA bei dem Kaninchen durchgeführt. In diesem Fall wurde die DNA pCMVHB-S in den normalen Muskel ohne Degeneration entweder mit einer Injektionspistole ohne Nadel, dem Biojector®, oder mit Hilfe herkömmlicher Spritzen, die mit Nadeln ausgestattet sind, verabreicht.
  • 3) Anti-HBs-Reaktionen von Mäusen die mit DNA geimpft worden waren
  • Eine Antikörperantwort gegen HBs wird durch eine einzelne Injektion des einen oder des anderen der vier verwendeten Plasmide induziert.
  • Die Antikörperantwort wurde mit Hilfe eines Kits, der zur Detektion von Antikörpern gegen HBs im Handel ist (Monolisa-Anti-HBs, Diagnostic Pasteur) analysiert. Die AntipreS2-Antikörper wurden in einem ELISA-System detektiert, das an der festen Phase ein Peptid der Region pre-S2 (AA 120-145), die dem Hauptepitop B entspricht, das durch diese Domäne getragen wird, verwendet (Neurath et al. (1985) Nature, 315, 154).
  • Die 8A und 8D zeigen die Kinetik der Anti-HBs-Reaktion (HBs-Ab), die in Milli-Internationalen Units/ml ausgedrückt ist, und der Anti-pre-S2-Reaktion (preS2Ab), die als optische Dichte (492 nm) gemessen wird, für 1/100 verdünnte Seren. Die Entwicklung wird mit Hilfe eines Maus-Anti-Immunglobulin (IgG)-Antikörpers, der mit Peroxidase markiert ist, durchgeführt.
  • Die Injektion des Plasmids pCMVHB-S (8A) induziert eine konstante Synthese von Anti-HBs-Antikörpern. Die Serokonversion wird bei 100 % der Mäuse ab einer Woche nach Injektion mit einem mittleren Antikörpertiter von 48 mIU/ml (12 bis 84 mIU/ml, Standardabweichung (SA) = 28) erreicht, was 4- bis 5-mal höher als der Schwellenwert ist, der bei Menschen erforderlich ist, um Schutz zu verleihen (10 mIU/ml).
  • Die durch eine einzige Injektion des Plasmids pCMVHB-S2.S induzierte Reaktion (8B) ist durch das sehr frühe Auftreten von Anti-HBs-Antikörpern gekennzeichnet. Diese Antikörper erreichen einen mittleren Titer von 439 mIU/ml (104 bis 835 mIU/ml; SA = 227) nach einer Woche, dann nehmen sie ab, um wiederzuzunehmen, und bei 13 Wochen den Anfangswert zu erreichen. Die Bedeutung dieses Antikörperpeaks wird später diskutiert. Ein Peak von Antikörpern IgG gegen Anti-pre-S2 wird nach 2 Wochen beobachtet.
  • Das Auftreten von Anti-HBs-Antikörpern, die durch Injektion der Plasmide pCMVHB-S1.S2.S (8C) und pHBV-S1.S2.S (8D) induziert wurden, ist leicht verzögert, da die Mäuse erst ab 2 Wochen zu 100 % serokonvertierten. Das Profil der Serokonversion ist identisch, es ist durch eine spezifische Anfangsreaktion auf das Antigen pre-S2 gekennzeichnet, gefolgt von einer Anti-HBs-Reaktion, die allmählich ansteigt, um Werte von 488 mIU/ml (91 bis 1034 mIU/ml; SA = 552) (pCMVHB-S1.S2.S) und 1725 mIU/ml (143 bis 6037 mIU/ml; SA = 1808) (pHBV-S1.S2.S) nach 13 Wochen zu erreichen.
  • 4) Anti-HBs-Reaktion der mit DNA geimpften Kaninchen
  • Die in den Tabellen III und IV angegebenen Resultate zeigen, dass die Antikörpertiter, die nach 8 Wochen bei den Kaninchen detektiert wurden, die mit dem Biojector immunisiert wurden, deutlich über denen liegen, die durch Injektion der DNA mit der Nadel erhalten wurden.
  • 5. Qualitative Analyse der humoralen Reaktion
  • ELISA-Systeme, die an der festen Phase HBs-Antigene mit bezüglich der präsentierten Determinanten unterschiedlichen Zusammensetzungen trugen und als zweiten Antikörper spezifisch Antikörper der Maus-IgM oder -IgG verwenden, ermöglichen es, die erhaltene Antikörperreaktion qualitativ zu analysieren.
  • In allen Fällen ist die einzige Injektion der DNA bei der Maus durch das frühe Auftreten von spezifischen IgM des AgHBs, unmittelbar gefolgt von der Umwandlung in Antikörper des IgG-Isotyps, der für die Memory-Reaktion charakteristisch ist, die mit Hilfe von Hilfs-T-Zellen induziert wird. Die Antikörperreaktion auf die Injektion der DNA ist durch ihre Frühzeitigkeit gekennzeichnet. In der Tat wird die Serokonversion 8 bis 10 Tage nach der Injektion, entsprechend dem verwendeten DNA-Typ erhalten, und in allen Fällen ist die Ebene in 4 Wochen erreicht und wird während 12 Wochen kontinuierlich aufrechterhalten.
  • Die Verwendung des HBs-Antigens des heterologen Subtyps (ad), der an den ELISA-Plättchen fixiert ist, ermöglicht es, das Vorliegen von spezifischen Antikörpern der Anti-a-Gruppe im Serum der Mäuse zu zeigen und durch den Unterschied in der Reaktivität gegenüber AgHBs desselben Subtyps (ay) das Vorliegen von spezifischen Antikörpern des Anti-y-Subtyps zu beweisen. Das Vorliegen der spezifischen Antikörper der Determinanten der Gruppe des AgHBs ist sehr wichtig, denn diese sind fähig, in virulenten Versuchen an Schimpansen Schutz gegen Viren des heterologen Subtyps zu verleihen (Szmuness et al. (1982) N. Engl. J. Med. 307, 1481-1486).
  • Die Analyse der durch den Vektor pCMV-S2.S induzierten Reaktion zeigt, dass diese eine beachtliche Ähnlichkeit mit derjenigen zeigt, die man beim Menschen im Verlauf der Infektion beobachten kann. Sie ist durch einen Peak an spezifischen IgM der Region pre-S2 gekennzeichnet, der extrem früh auftritt (8 Tage), unmittelbar gefolgt von einer Umwandlung in Anti-pre-S2-IgG (9). Auf diese Reaktion folgt das Auftreten der Antikörper Anti-HBs-IgM, dann -IgG. Die Produktion der Anti-HBs-Antikörper ist konstant und erreicht nach 4 Wochen ein Maximum. Nach 13 Wochen bleiben die Anti-HBs- und Anti-pre-S2-IgG anhaltend bei einem konstanten Level.
  • Die Anti-Subtyp (y)-Reaktion geht der Anti-Gruppe (a)-Reaktion derselben Art, wie sie während der Vakzinierung mit dem rekombinanten Vakzin beschrieben wurde (Tron et al. (1989) (J. Infect.Dis. 160, 199-204) voraus.
  • Die Reaktion, die mit den drei anderen DNA-Vakzinen erhalten wird, zeigt die Klassenumwandlung IgM → IgG, die für die Sekundärantwort charakteristisch ist. Die Antwort ist zunächst gegen den Subtyp gerichtet, bevor sie gegen die Determinanten der Gruppe des AgHBs gerichtet ist.
  • Die Langzeitreaktion, die für die DNA pCMVHB-S untersucht wurde, zeigt, dass der Antikörperpeak in 3 Monaten erreicht ist und dass dieser 6 Monate lang beim gleichen Titer bleibt (Tabelle V).
  • 6) Genetisches Vakzin und Nicht-Reaktion
  • Ein Hauptproblem der Impfung gegen Hepatitis B bleibt die erhöhte Zahl der Individuen, die auf die klassische Impfung nicht reagieren (2,5 bis 5 %). Die Nicht-Reaktion beim Menschen kann mit bestimmten HLA-Typen und mit einem Fehlen der Präsentation des Antigens oder der Stimulation der Helfer-T-Zellen in Korrelation gebracht werden (Krustall et al. (1992) J. Exp. Med. 175, 495-502).
  • Um den möglichen Einfluss der genetischen Impfung auf die Nicht-Reaktion auf AgHBs zu untersuchen, wurde eine Gruppe von Mausstämmen, deren Reaktion auf verschiedene Hüllproteine des HBV-Virus genetisch reguliert ist und durch Millich et Koll. (1986, J. Immunol. 137, 315) gut charakterisiert wurde, verwendet. Die Konstruktion pCMVHB-S, die vorstehend beschrieben wurde, wurde in die Muskeln der Mäuse B10(H-2b),B10.S(H-2s) und B10.M (H-sf) injiziert.
  • Der Stamm B10 reagiert auf die drei Hüllproteine des Virus, der Stamm B10.S reagiert nicht auf AgHBs, allerdings kann die Nicht-Reaktion durch Immunisierung mit den HBsAg-Antigenen, die die Determinanten pre-S2 tragen, umgangen werden. Der Stamm B10M ist auf das Antigen HBs und das Antigen pre-S2 vollständig nicht-reagierend. Eine Antwort in diesem Stamm konnte durch Immunisierung mit AgHBs, die Determinanten pre-S 1 tragen, erhalten werden.
  • Die durch DNA immunisierten Mäuse erhielten eine einzelne Injektion (100 μg) in den sich regenerierenden Muskel. Die Vergleichsmäuse erhielten das Protein in zwei intraperitonealen Injektionen in einem Intervall von 1 Monat, die erste als 2 μg AgHBs, versetzt mit Freunds vollständigem Adjuvans (CFA) und die zweite als 2 μg AgHBs, versetzt mit unvollständigem Freunds Adjuvans (IFA).
  • Die mit der DNA pCMVHB-S erhaltenen Resultate werden durch die 10A bis 10F dargestellt.
    • – Im Stamm B10 (gut reagierend) ist die durch die DNA induzierte Reaktion, die durch das Protein nach einer einzelnen Injektion induziert wurde.
    • – Im Stamm B10S (auf AgHBs in Abwesenheit von pre-S2 nicht reagierend) beobachtet man das Auftreten von Anti-HBs-Antikörpern, die auf den Subtyp spezifisch sind, dann von solchen, die auf die Gruppe spezifisch sind, nach Immunisierung durch die DNA pCMVHB-S. Für die Gruppe spezifische Anti-HBs-Antikörper werden bei den Mäusen, die mit dem Protein HBs immunisiert wurden, nur nach der 2. Injektion erhalten.
    • – Im Stamm B10M (reagiert in Abwesenheit von pre-S 1 nicht auf AgHBs) ermöglicht die Immunisierung durch die DNA es, eine Anti-HBs-Antwort zu erhalten, die für die Gruppe und den Subtyp spezifisch ist, während das Protein nur eine Subtyp-Reaktion induziert und zwei Injektionen benötigt.
  • Die Reaktion, die durch die drei Typen an Vektoren induziert wird, ist vergleichbar.
  • SCHLUSSFOLGERUNG
  • Es ist allgemein bekannt, dass die humorale Reaktion auf das Antigen HBs allein ausreichend ist, um Schutz zu verleihen. Das Vorliegen von Antikörpern, die gegen andere Determinanten (pre-S 1 und pre-S2) gerichtet sind, welche durch die Hüllproteine des Virus getragen werden, die selbstschützend sind, könnte die Qualität dieser Reaktion verbessern. Die Gesamtheit der hier beschriebenen Experimente zeigt, dass die humorale Reaktion, die durch die genetische Anti-Hepatitis B-Vakzinierung induziert wird, in vielen Bereichen derjenigen überlegen ist, die durch die klassische Vakzinierung erreicht werden kann.
  • Als Werte der Serokonversion: Ein Wert von 100 % wird ab 8 Tagen für die Mäuse erreicht, die mit der DNA pCMV-HBs und pCMVHB-S2.S immunisiert worden waren, und das nach einer einzigen Injektion.
  • Als Level der Reaktion: Die Schwelle von 10 mIU/ml, die für den Menschen als ausreichend angesehen wird, um Schutz zu verleihen, wird immer weit überschritten.
  • Als Frühzeitigkeit der Reaktion: Der Vektor pCMVHB-S2.S erlaubt es, in 8 Tagen einen stark erhöhten Anti-pre-S2-Antikörperspiegel zu erhalten, und man sagt, dass diese al lein fähig sind, den Schutz zu verleihen (Itoh et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9174-9178).
  • Als Anhalten der Reaktion: Die Anti-HBs-Antikörper bleiben während mehr als 6 Monaten bei einem erhöhten Titer.
  • Im Hinblick auf die Qualität der Reaktion: Die erhaltenen Antikörper gehören zum IgG-Typ, die für eine von Helfer-T-Zellen abhängige Reaktion und damit eine Memory-Reaktion charakteristisch sind.
  • Bezüglich der antiviralen Aktivität: Die Antikörper sind für den viralen Subtyp spezifisch, aber insbesondere für die Gruppe spezifisch und damit geeignet, einen gekreuzten Schutz zu verleihen.
  • Im Hinblick auf die biologische Deutung: Das Profil der durch Immunisierung mit pCMVHB-S2.S erhaltenen Reaktion ahmt vollständig dasjenige nach, das man beim Menschen während einer ausgebrochenen Virusinfektion beobachten kann.
  • TABELLE I Induktion von Antikörpern gegen das Oberflächenantigen der Hepatitis B
    Figure 00160001
  • TABELLE II
    Figure 00170001
  • TABELLE III Immunisierung mit Biojector®
    Figure 00170002
  • TABELLE IV Immunisierung durch Injektion mit Hilfe einer Nadel
    Figure 00180001
  • TABELLE V Langzeit-Reaktion einer mit pCMVHB-S immunisierten Maus
    Figure 00180002
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00190001
  • Figure 00200001
  • Figure 00210001
  • Figure 00220001
  • Figure 00230001

Claims (30)

  1. Nukleotidvektor, umfassend wenigstens: – ein Gen oder eine komplementäre DNA, die für wenigstens einen Teil eines Proteins eines Virus codiert. – die nicht-translatierte Terminationssequenz des Gens oder der komplementären DNA, die das Polyadenylierungssignal enthält; und – einen Promotor, der die Expression dieses Gens in Muskelzellen erlaubt.
  2. Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus das einer Hepatitis-Erkrankung ist.
  3. Vektor nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass er in den Zellen nicht repliziert.
  4. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen für wenigstens einen Teil eines Proteins des Virus von Hepatitis B codiert.
  5. Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein das S,S-préS2-Protein oder S-preS2-PreS1-Protein ist.
  6. Vektor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen das S-Gen ist.
  7. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Virus, das einer Hepatitis A oder einer nicht-A-, nicht-B-Hepatitis wie Hepatitis C, E oder Delta ist.
  8. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Promotor der Promotor des Cytomegalovirus ist.
  9. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass er das Plasmid pCMV-HBS ist, das am 21. Oktober 1993 bei der CNCM unter der Nummer I-1370 hinterlegt wurde.
  10. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass er das Plasmid pCMVHB-S1.S2.S ist, das bei der CNCM unter der Nummer I-1411 hinterlegt wurde.
  11. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass er das Plasmid pCMVHB-S2.S ist, das bei der CNCM unter der Nummer I-1410 hinterlegt wurde.
  12. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass er das Plasmid pRSV-HBS ist, das am 21. Oktober 1993 bei der CNCM unter der Nummer I-1371 hinterlegt wurde.
  13. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor derjenige der Oberflächengene des HBV-Virus ist.
  14. Vektor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass er das Plasmid pHBV-S1.S2.S ist, das bei der CNCM unter der Nummer I-1409 hinterlegt wurde.
  15. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass er einen internen Promotor enthält.
  16. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass er einen Promotor eines Gens eines Proteins des Cytoskeletts enthält.
  17. Vektor nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass er den Promotor des Desmins enthält.
  18. Vektor nach einem der Ansprüche 16 und 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor zum Wirt homolog ist, dem der Vektor verabreicht werden muss.
  19. Vektor nach einem der Ansprüche 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass er Gene enthält, die wenigstens teilweise für das Protein gp160 des Virus HIV 1, assoziiert mit dem Protein p25 und/oder dem Protein p55 und/oder mit dem Protein p18, codieren.
  20. Vektor nach einem der Ansprüche 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass er wenigstens ein Gen enthält, das für das Protein Rev des Virus HIV 1 codiert.
  21. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, der einen Promotor, der mit dem Wirt homolog ist, und eine andere Regulierungssequenz für die Expression eines Gens oder einer komplementären DNA, codierend für S, S-preS2 oder S-preS1, preS2, enthält.
  22. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, der einen Promotor, der mit dem Wirt homolog ist, und eine andere Regulierungssequenz für die Expression eines Gens oder einer komplementären DNA, codierend für das Protein gp160, assoziiert mit p25 und/oder p55 und/oder p18, enthält.
  23. Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, der einen mit dem Wirt homologen Promotor und eine andere Regulierungssequenz für die Expression eines Gens oder einer komplementären DNA, codierend für das Protein Rev, enthält.
  24. Vakzin, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 20 oder eine Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 21 bis 23 enthält.
  25. Zusammensetzung, die fähig ist, eine cytotoxische Reaktion zu induzieren, die aus wenigstens einer Nukleotidsequenz besteht, die in den Muskelzellen exprimiert wird, und die einen Promotor, wie er in einem der Ansprüche 15 bis 18 definiert ist, enthält.
  26. Pharmazeutische Nicht-Lipid-Zusammensetzung, die zur Immunisierung gegen eine Virusinfektion wie Hepatitis bestimmt ist, umfassend einen Vektor nach einem der Ansprüche 1 bis 20 oder umfassend die vollständige oder partielle Nukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 21 bis 23.
  27. Zusammensetzung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Vektor in den Muskel des zu immunisierenden Individuums mindestens 5 Tage nach Verabreichung von Bupivacain genau an dieselbe Stelle verabreicht wird.
  28. Zusammensetzung nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor 10 Tage nach Verabreichung von Bupivacain verabreicht wird.
  29. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 27 und 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Verabreichung durch intramuskuläre Injektion erfolgt.
  30. Zusammensetzung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die intramuskuläre Injektion mit Hilfe einer Flüssigkeitsstrahlpistole durchgeführt wird.
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