ES2269127T3 - Utilizacion de la glucosa-6-fosfato isomerasa y de sus anticuerpos para el diagnostico y la terapia de la artritis, y el ensayo de compuestos antiartriticos. - Google Patents
Utilizacion de la glucosa-6-fosfato isomerasa y de sus anticuerpos para el diagnostico y la terapia de la artritis, y el ensayo de compuestos antiartriticos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2269127T3 ES2269127T3 ES00920987T ES00920987T ES2269127T3 ES 2269127 T3 ES2269127 T3 ES 2269127T3 ES 00920987 T ES00920987 T ES 00920987T ES 00920987 T ES00920987 T ES 00920987T ES 2269127 T3 ES2269127 T3 ES 2269127T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- arthritis
- gpi
- serum
- arthritic
- antibodies
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Procedimiento para el diagnóstico de la artritis, que comprende detectar en una muestra de plasma o suero de un paciente, la presencia de autoanticuerpos contra la proteína glucosa-6-fosfato isomerasa (GPI).
Description
Utilización de la
glucosa-6-fosfato isomerasa y de sus
anticuerpos para el diagnóstico y la terapia de la artritis, y el
ensayo de compuestos antiartríticos.
La presente invención se refiere a la
utilización de anticuerpos contra la proteína
glucosa-6-fosfato isomerasa para el
diagnóstico de la artritis y a la utilización de dicha proteína para
el tratamiento de la artritis.
La artritis reumatoidea (RA) es un trastorno
autoinmune incapacitante y frecuente (Feldmann et al., 1996).
Es una enfermedad crónica y progresiva de las articulaciones,
caracterizada por la invasión leucocitaria de la cubierta sinovial
y la hiperplasia de los sinoviocitos residentes. La superproducción
que sigue de las citoquinas y de otros mediadores solubles da lugar
a la destrucción del cartílago, a la erosión ósea y a la
remodelación anárquica de las estructuras articulares. La etiología
y la patogénesis de la RA siguen siendo polémicas. No se sabe si la
enfermedad se inicia por una reacción inflamatoria moderada a un
antígeno microbiano (Ag), a una respuesta autoinmune inapropiada a
un constituyente propio, o a ambas. Se ha postulado y discutido un
papel importante para las células T (Panayi et al., 1992),
las células B (Zvaifler, 1973), y otros leucocitos tales como las
células dendríticas, los macrófagos y los neutrófilos (Thomas y
Lipsky, 1996). La falta de consenso refleja en gran parte dos
factores. La RA es un síndrome heterogéneo, en el que pacientes
distintos muestran ampliamente edades diferentes de inicio, curso
de la enfermedad, perfiles genéticos y respuestas a la intervención
terapéutica. Además, ha existido escasez de modelos de la RA de
animales pequeños, particularmente de los que sucumben
espontáneamente a la enfermedad.
Recientemente, los presentes inventores
generaron un nuevo modelo de artritis de ratón transgénico que
desarrolla espontáneamente una enfermedad con muchas de las
características de la artritis reumatoidea humana ((Kouskoff et
al., 1996), patente US nº 5.675.060). Todos los
ratones transgénicos (tg) con células KRN T receptoras en los
progenitores genéticos C57B1/6xNOD (que se abrevian en la presente
memoria en adelante como ratones K/BxN) desarrollaron un trastorno
articular, que se inició entre las tres y cuatro semanas de edad y
que evolucionó rápidamente hasta que la movilidad del animal se vio
gravemente comprometida; como en los pacientes, la enfermedad es
crónica, progresiva simétrica y presenta una gradación entre leve y
severa. La enfermedad murina muestra todas las características
histológicas importantes de la humana: invasión de leucocitos,
sinovitis, formación de tejido de granulación sinovial, destrucción
del cartílago y del hueso, remodelación anárquica. El modelo de
ratón, como los pacientes, muestra varias anormalidades
inmunológicas, que incluyen la hiperactividad de las células B que
se manifiesta como un aumento en el número de células B,
hipergammaglobulinemia y producción de
auto-anticuerpos.
En los ratones K/BxN se inicia la enfermedad por
el reconocimiento mediante reacción cruzada de las moléculas
A^{g7} NOD-derivadas del Complejo Principal de
Histocompatibilidad por KRN TCR. Así, en los animales K/BxN, se
genera una situación de autoreactividad sistémica, que explica cómo
se desarrolla la enfermedad autoinmune específica de las
articulaciones en presencia de dicha autoreactividad. Se informa
anteriormente de que los linfocitos T son necesarios para el
desarrollo de la artritis, y que el bloqueo de linfocitos T evita la
enfermedad, aunque parecen prescindibles en los estadios más
avanzados de la enfermedad. Los linfocitos B son asimismo críticos
(Kouskoff et al., 1996).
En la presente invención, se descubre que las
células B son necesarias para la artritis espontánea, porque
producen inmunoglobulinas patogénicas dirigidas contra una diana que
se identifica como glucosa-6-fosfato
isomerasa (EC 5.3.1.9). Se muestra que la
glucosa-6-fosfato isomerasa
recombinante puede utilizarse como ensayo diagnóstico de la
artritis murina, y adsorber inmunoglobulinas patogénicas.
En modelos animales, se ha informado previamente
de autoanticuerpos en situaciones de artritis inducida, cuando la
enfermedad es inducida por inmunización con componentes del
cartílago, tales como el colágeno de tipo II. No se ha encontrado
previamente que los anticuerpos contra las proteínas que se expresan
ubicuamente sean artritogénicos.
Los autoanticuerpos se encuentran asimismo en el
suero de los pacientes RA, y tienen algún valor diagnóstico. El
factor reumatoide (RF; Ab contra la porción Fc de IgG) se ha
considerado como una característica de esta enfermedad; sin
embargo, no se encuentra en aproximadamente el 30% de los pacientes
RA y se encuentra en los individuos con otras enfermedades
autoinmunes (Mannik, 1992; Rudolphi et al., 1997) o en
situación de estimulación inmune crónica. Abs contra el cartílago o
los componentes epidérmicos se han detectado asimismo en los
pacientes RA, dirigidos contra el colágeno de tipo II (cII) o la
filagrina, por ejemplo, pero, otra vez, éstos muestran generalmente
una correlación limitada con los parámetros de la enfermedad
(Rudolphi et al., 1997; Claque y Moore, 1984; Sebbag et
al., 1995). Conrad, U et al (Biochem. Genet., 1987, 25
(2-10), 739-54), describe
anticuerpos monoclonales dirigidos contra la GPI.
La presente invención se refiere a anticuerpos
contra la glucosa-6-fosfato
isomerasa (GPI).
Dichos anticuerpos pueden ser policlonales o
monoclonales y las tecnologías utilizadas para su preparación son
conocidas por el experto en la materia.
La invención se refiere asimismo a la
utilización de la proteína GPI y de sus anticuerpos para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de la artritis y
para el diagnóstico in vitro de la artritis.
Los anticuerpos según la invención son distintos
de los anticuerpos artitrogénicos que se describen en la técnica
anterior, que se dirigen contra los componentes del cartílago tales
como un colágeno de tipo II. Los anticuerpos de la presente
invención se dirigen principalmente contra proteínas, que se
expresan en muchos tejidos no articulares, pero que se liberan en el
suero.
Otra forma de realización de la presente
invención se refiere a un procedimiento para el diagnóstico de la
artritis, que comprende la detección de autoanticuerpos contra la
proteína GPI en la muestra del plasma o del suero de un
paciente.
El procedimiento para ensayar la presencia o la
cantidad de anticuerpos contra la proteína GPI que se encuentra en
una muestra comprende la unión de dichas proteínas a los anticuerpos
en la muestra y la detección de los anticuerpos unidos a dichas
proteínas.
Los procedimientos para la detección de
anticuerpos en el plasma o suero son bien conocidos en la técnica,
por ejemplo, los ensayos ELISA o RIA. Es posible utilizar un
substrato revestido con GPI, por ejemplo, una placa de ensayo, y
detectar entonces la presencia de anticuerpos fijados a dicha GPI
con anticuerpos marcados adecuados. Entre los marcadores, los que
son preferidos son isótopos radioactivos, compuestos que contienen
un isótopo, enzimas, en particular las enzimas que son susceptibles
a reaccionar con cromógenos, fluorígenos o luminiscentes (por
ejemplo, una peroxidasa o una fosfatasa alcalina), cromóforos,
compuestos cromógenos, fluorígenos o luminiscentes, análogos básicos
y ligandos, tales como la biotina.
Según la presente invención, la proteína GIP
puede ser la misma proteína natural, la proteína recombinante, la
proteína sintética o sólo el epítopo recombinante de dicha proteína.
Así, la presente invención se refiere asimismo a un equipo para
llevar a cabo el diagnóstico de los anticuerpos contra la proteína
GPI, que comprende un agente diagnóstico constituido por una
proteína que es GPI, o un epítopo suyo, capaz de interaccionar con
un autoanticuerpo del plasma o del suero, y un segundo anticuerpo
capaz de unirse a dicho autoanticuerpo, marcándose dicho segundo
anticuerpo para la detección.
En otra forma de realización, la presente
invención se refiere a la utilización de la proteína GPI, que es
capaz de interaccionar con autoanticuerpos para inhibir o eliminar
dichos autoanticuerpos, para tratar o prevenir la artritis.
La invención se refiere asimismo a la expresión
de la proteína GPI in vivo, utilizando un vector que
comprende elementos suficientes para expresar in vivo dicha
GPI. Dicho vector puede ser de origen vírico, puede ser un plásmido
o puede ser puramente sintético o ADN desnudo, tal como se describe
en la tecnología VICAL. La expresión de dichas proteínas
proporcionará proteína GPI para adsorber anticuerpos artritogénicos
(véanse los ejemplos de dicha especificación).
La eficacia de las composiciones
anti-artríticas potenciales puede evaluarse
determinando el efecto de las composiciones sobre la artritis
inducida en ratones normales mediante la inyección de suero de los
ratones K/BxN, o de las inmunoglobulinas de que se derivan de
éstos, o de los anticuerpos anti-GPI. Las
composiciones así evaluadas incluyen, pero no se limitan a:
compuestos químicos, compuestos biológicos tales como anticuerpos,
polipéptidos, agentes anti-inflamatorios, hormonas,
tolerígenos, que inhiben la unión de anticuerpos
anti-GPI a sus dianas, o las consecuencias
patológicas de esta unión.
Esto puede llevarse a cabo: i) administrando una
dosis conocida de suero artritogénico o inmunoglobulinas a un
primer ratón no artrítico, recibiendo asimismo dicho animal la
composición artritogénica que va a ensayarse, administrada antes,
conjuntamente con, o después del suero artritogénico o de las
inmunoglobulinas; ii) detectando el curso de la inflamación a lo
largo del tiempo y la destrucción articular en dicho primer ratón; e
iii) comparando el curso de la inflamación a lo largo del tiempo y
la destrucción articular en dicho primer ratón, con el curso de la
inflamación a lo largo del tiempo y la destrucción articular en un
segundo ratón del mismo genotipo que reciba el mismo suero
artritogénico o las mismas inmunoglobulinas, pero que no ha sido
expuesto a dicha composición anti-artrítica.
Otra posibilidad para la etapa ii) es detectar
el grado de inflamación, la destrucción de las articulaciones y la
deformación de los miembros en dicho primer ratón; y para la etapa
iii) comparar el grado de inflamación, la destrucción de las
articulaciones y la deformación de los miembros en un segundo ratón
del mismo genotipo que recibe el mismo suero artritogénico o las
mismas inmunoglobulinas, pero que no se ha expuesto a dicha
composición anti-artrítica.
En este procedimiento, las inmunoglobulinas
artritogénicas pueden ser anticuerpos monoclonales o sus
combinaciones, especialmente los anticuerpos que se describen a
continuación.
Asimismo, es posible ensayar moléculas que sean
capaces de modular la producción de GPI para tratar la artritis,
pudiendo ser dichas moléculas, por ejemplo, anticuerpos que no son
patogénicos.
Asimismo, es posible utilizar superficies
revestidas con la proteína GPI para el tratamiento del suero en un
circuito extracorpórea para eliminar las cantidades de anticuerpos
patológicos.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
procedimiento para aislar anticuerpos monoclonales capaces de
transferir la artritis, que comprende las etapas siguientes:
- a)
- preparar hibridomas a partir de linfocitos de esplenocitos de mamíferos artríticos, preferentemente a partir de esplenocitos K/BxN del ratón,
- b)
- seleccionar dichos hibridomas en condiciones de dilución limitada en un medio HAT,
- c)
- rastrear hibridomas que produzcan anticuerpos dirigidos contra la proteína GPI en un ensayo ELISA,
- d)
- expansión y clonación de los hibridomas seleccionados en la etapa c),
- e)
- ensayo de dichos anticuerpos producidos por hibridomas seleccionados en la etapa d), en combinación o solos, respecto a su capacidad para transferir la artritis.
El ensayo de la etapa e) puede obtenerse
i):administrando una dosis conocida de dichos anticuerpos a un ratón
normal; ii) detectando el comienzo de la destrucción de las
articulaciones y la deformación de los miembros por inflamación en
dicho ratón.
Debe entenderse que las etapas del procedimiento
anteriores pueden alcanzarse con procedimientos bien conocidos que
pertenecen a la técnica, y que no están limitadas a ningún
procedimiento en particular.
Por tanto, la invención se refiere a anticuerpos
monoclonales que pueden obtenerse mediante dicho procedimiento y y
a progenies de hibridomas que produzcan dichos anticuerpos. Entre
los anticuerpos que se muestran en el ejemplo 5, se prefieren los
anticuerpos 2.99 y 6.121 (véase la figura 9 a continuación). Estos
anticuerpos pueden utilizarse hasta los mismos extremos que el
suero o las inmunoglobulinas anti-GPI que se han
descrito anteriormente.
Algunas características y ventajas adicionales
de la presente invención se pondrán de manifiesto a partir de los
ejemplos siguientes, que se explicarán haciendo referencia a las
figuras, en las que,
Figura
1
A: Patas de ratones normales a los que se
inyectó 72 horas antes con 150 \mul de suero de un ratón artrítico
K/BxN, o a partir de una camada no artrítica de control (ctl). Se
aprecia que la inflamación y el enrojecimiento en el ratón
inyectado con el suero artrítico. La artritis puede objetivarse
mediante mediciones del espesor del tobillo o de la evaluación del
índice clínico (cuadros a la derecha); la clasificación clínica se
define como: 0, normal; 1, dudoso; 2, dos patas afectadas; 3, tres
patas afectadas; 4, todos los miembros afectados.
B: La patología inducida por la transferencia
de suero se encuentra en todos los receptores, sean o no
transgénicos, pero es más intensa en los receptores que poseen
células T autorreactivas pero que no pueden desarrollar la artritis
por falta de las células B
(K/BxN-\muM^{0/0})
C: Disminución de la artritis, considerada
como índice clínico, después de un corto tiempo de administración
del suero K/BxN (puntos abiertos), pero persistencia después de
inyecciones repetidas (puntos negros).
D: Actividad artritogénica de la fracción IgG
del suero. Cuadro izquierdo: ratones RAG^{0/0} se inyectaron con
cantidades similares (relativas a los volúmenes de inicio) de suero
de ratones artríticos K/BxN (estrellas), eluyéndose la fracción o
el flujo a su través (cruzamientos) a partir de una columna de
proteína G (círculos cerrados). Cuadro derecho; el doble de la
cantidad de IgG de las camadas tg no TCR fue incapaz de inducir la
artritis.
Figura
2
Cortes de la rodilla de un ratón típico K/BxN (a
la izquierda) o de un ratón normal 10 días después de dos
inyecciones de 200 \mul de suero de un animal artrítico K/BxN (a
la derecha). Se aprecia en ambos casos el engrosamiento de la
cubierta sinovial, la infiltración inflamatoria masiva subyacente,
que se extiende sobre el cartílago y comienza su destrucción, y la
presencia de células polimorfonucleares en la cavidad articular.
Tinción con hematoxilina y eosina (H+E), Aumento del objetivo de
10x.
Figura
3
Los extractos de proteínas totales (extracción
NP-40) del tobillo (A), bazo (S) o riñón (K) se
procesaron sobre SDS-PAGE, se transfirieron mediante
electrotransferencia, y se sondearon con suero procedente de un
ratón artrítico K/BxN o de una camada de control. Se indica la
posición de la banda prominente de 60 kD. kD.
\newpage
Figura
4
La proteína de 60 kD de los extractos renales se
inmunopurificó sobre inmunoadsorbentes preparados con
inmunoglobulinas K/BxN. Después de digestión con tripsina, los
péptidos se purificaron mediante HPLC, y varios se secuenciaron
mediante la degradación de Edman automatizada. Las tres secuencias
peptídicas obtenidas pertenecen a la
glucosa-6-fosfato isomerasa, y
están subrayadas. Para confirmar a continuación esta identificación,
se determinó el peso molecular de un cuarto péptido mediante
espectrometría de masas, y coincide perfectamente con la masa de un
fragmento tríptico de GPI (subrayado ondulado).
Figura
5
Se llevó a cabo una transferencia Western como
en la Figura 3, excepto en que la proteína que se cargó fue GPI
recombinante producida en E. coli (como una proteína de
fusión con GST). Las transferencias (borrones) se sondearon con el
suero procedente de un K/BxN artrítico o de un ratón de control.
Figura
6
En este inmunoensayo enzimático, la GPI
recombinante, producida como anteriormente, se utilizó para revestir
los pocillos de las placas ELISA. Éstas se utilizaron para ensayar
la IgG anti-GPI en los sueros de los ratones
artríticos o de control. Los valores que se muestran en la presente
memoria se obtuvieron con diluciones séricas de 1/16.000, pero se
pudieron obtener señales positivas todavía con diluciones tales como
de 1/1.000.000. El único ratón artrítico negativo en el ensayo fue
un animal que se convirtió en artrítico el día en el que se había
tomado la muestra
sérica.
sérica.
Figura
7
A: la GPI recombinante, o la proteína
recombinante de control -GST sola-, producida como anteriormente,
se unió a un soporte sólido, y se utilizó como un inmunoadsorbente
para eliminar anticuerpos anti-GPI a partir del
suero K/BxN. Toda la IgG anti-GPI se encontraba en
la fracción unida, tal como se esperaba. La capacidad para
transferir la artritis se encontró solamente en la fracción unida, y
se eliminó de la fracción que fluía a través de la
columna.
columna.
B: Un experimento representativo, en el que
los ratones normales se inyectaron con varias fracciones del esquema
de purificación que se muestra en A. LA artritis se evaluó y se
clasificó como anteriormente.
Figura
8
Ratones inocentes de 4 semanas de edad de la
cepa C57B1/6 se inyectaron con 200 \mul de un suero común de
ratones K/BxN en los días 0 y 3. A los ratones se les inyectó
asimismo con el anticuerpo de prueba BB5.1, que bloquea el factor C5
de complemento, en los días -2, -1, +1, +5 y +8, o con sólo un
vehículo, El inicio de la artritis fue seguido por la medición del
grosor del tobillo en los días siguientes. Los ratones tratados con
los anticuerpos monoclonales quedaron protegidos de la artritis,
mientras que a los que se inyectó con sólo el vehículo presentaron
la
enfermedad.
enfermedad.
Figura
9
Ratones inocentes de 4 semanas de edad de la
cepa Balb/c se inyectaron con 1 ml de IgG purificada de los mAbs
6.121 y 2.99 anti-GPI disueltos en solución
tamponada salina, o con 1 mg de cada uno de ellos, en los días 0 y
3. El inicio de la artritis fue seguido por la medición del grosor
del tobillo en los días siguientes. Los ratones tratados con los dos
anticuerpos monoclonales en combinación, mostraron artritis, pero no
así los inyectados con mAb
sólo.
sólo.
Se mostró ((Kouskoff et al., 1996),
patente US nº 5.675.060) que los ratones que transportan todos los
elementos genéticos necesarios para que aparezca la artritis KRN,
pero son deficientes en linfocitos B, están libres de la
enfermedad. Para explorar la posibilidad de que el desarrollo de la
artritis en el modelo KRN dependa críticamente de un producto
particular de las células B, se trata de provocar la enfermedad en
los ratones no artríticos transfiriendo suero de los ratones K/BxN.
Apareció una inflamación grave de las articulaciones en los animales
a los que se había inyectado con el suero de los donadores
artríticos K/BxN, pero no en los que recibieron suero de los
controles BxN no artríticos (Fig 1A). La enfermedad podría haberse
inducido con una cantidad tan pequeña como 100 \mul de suero de
K/BxN, mostrando capacidad de reproducción. Se provocó muy
rápidamente, medida mediante la clasificación clínica o el grosor
del tobillo, siendo evidente ya a los dos días después de la
inyección sérica. La artritis pudo obtenerse después de inyectar
suero procedente de los donantes artríticos en ratones normales, en
huéspedes RAG^{0}/^{0} deficientes en linfocitos, o en ratones
K/BxN deficientes en células B (ratones
K/BxN-\muMT^{00}) (Fig 1B). Estos resultados
muestran que los componentes séricos de los ratones K/BxN son
suficientes para conferir la artritis, aunque la enfermedad más
agresiva que se apreció con los últimos animales indica que las
células T K/BxN juegan probablemente un papel accesorio de
potenciación en la fase efectora.
La artritis provocada por la transferencia
sérica presenta todas las características histológicas de la
enfermedad en los ratones K/BxN habituales, incluyendo la invasión
de las células inflamatorias, la hiperplasia de los sinoviocitos, la
formación del tejido sinovial de granulación, y la destrucción del
cartílago (Fig 2A y B).
La artritis inducida por la inyección sérica es
transitoria. En los ratones que habían recibido un par único de
inyecciones, la inflamación de las articulaciones empezó a decrecer
después de aproximadamente 15 días (Fig 1C); después de 30 días,
algunas de las articulaciones aparecían completamente normales,
incluso en los animales que inicialmente se habían mostrado
totalmente artríticos. La fugacidad de la enfermedad pudo superarse
mediante inyecciones repetidas del suero de los ratones artríticos
(Fig 1C). Que esto fuera verdad incluso para los receptores
RAG^{0}/^{0} sugiere que la inestabilidad del compuesto sérico
es la explicación de la naturaleza transitoria de la enfermedad.
El factor sérico artritogénico es una
inmunoglobulina (Ig) producida por las células B: después del
fraccionamiento del suero de los ratones K/BxN en componentes IgG y
no IgG, sólo la fracción IgG es capaz de provocar la artritis en
los huéspedes RAG^{0}/^{0;} su potencia es similar a la del
suero completo (respecto al volumen de inicio) (Fig 1D), como son
las características histológicas de la enfermedad que indujo (datos
no representados).
De esta manera, una Ig producida por los
linfocitos B es clave para el desarrollo de la artritis en los
ratones K/BxN. Se intenta entonces definir sus dianas moleculares.
Al principio, se podría haber imaginado que éstas podrían ser
anticuerpos dirigidos contra componentes específicos de la
articulación, generados de alguna forma por la interacción de las
células transgénicas T reactivas contra la molécula Ag7 en la
superficie de las células B; esto podría prevenir la tolerancia
normal de las células B respecto a los componentes propios, o
inducir la estimulación de las células B policlonales y la síntesis
de Ig reactiva contra componentes propios (quizás poliméricos).
Encaramos el
asunto:
asunto:
1) Mediante análisis inmunohistoquímico de
los ratones RAG^{0/0} después de transferir Ig de los ratones
K/BxN. Estos análisis mostraron el depósito de la Ig transferida no
sólo en el tejido sinovial de la articulación, sino también en las
membranas de revestimiento de muchos o otros órganos (bazo, riñón,
hígado, músculo; datos que no se muestran).
2) Mediante análisis de transferencia
Western; se prepararon extractos proteicos enteros de la
articulación del tobillo y de varios otros órganos de los ratones
RAG^{0/0} (para evitar la presencia de Ig en el extracto), se
sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida
desnaturalizantes (SDS-PAGE), se sometieron a
transferencia, y se sondearon con suero de ratones K/BxN. La unión
de Ig se reveló mediante sondeo con IgG anti-conejo
conjugada con HRP. Como se puede apreciar en la Fig 3, se pudo
detectar una única banda proteica dominante en estas
transferencias, con PM de aproximadamente 60 kD. Esta banda se
apreció repetidamente cuando se utilizaron los sueros de diversos
ratones artríticos K/BxN, pero no con sueros procedentes de camadas
no artríticas de control. Otras proteínas se detectaron con algunos
de los sueros, pero de forma inconsistente y siempre fueron más
débiles que la banda de
60 kD.
60 kD.
Se intentó entonces identificar esta proteína de
60 kD. Con este fin, la IgG de un amplio conjunto de sueros K/BxN se
purificó mediante cromatografía de afinidad en columnas de Proteína
G. Esta Ig purificada (1,5 mg) se unió covalentemente a Sepharosa
activada por CNBr. Esta matriz se utilizó entonces como un
inmunoadsorbente sobre el cual se cargaron 50 mg de extracto
NP-40 del riñón de ratones RAG0/0. La columna se
lavó a fondo, y las proteínas unidas se eluyeron a un pH ácido. Se
analizaron mediante SDS-PAGE y tinción Coomassie.
Tal como se esperaba de los resultados descritos anteriormente, se
apreció una banda dominante de 60 kD. Esta banda se extirpó, se
sometió a digestión la proteína en la rebanada de gel mediante
tripsina, tal como se describe en (Rosenfeld et al, 1992) y
los péptidos resultantes se resolvieron mediante HPLC de fase
inversa. Se identificaron varios péptidos. Tres de ellos se
secuenciaron entonces mediante la degradación de Edman automatizada
en un instrumento 470 A de Applied Biosystems. Las secuencias se
compararon a las bases de datos públicas, utilizando el programa
BLAST en la base de datos Swissprot. Se encontró que los tres
pertenecían a la proteína
glucosa-6-fosfato isomerasa
(aka fosfohexosa-isomerasa; EC 5.3.1.9;
número P06745 de la base de datos Swissprot; número de registro de
la secuencia nº 1230741; que se abrevia en la presente memoria como
GPI). Sus posiciones se muestran en la Fig 4. Otro de los péptidos
obtenido se encontró asimismo que pertenecía a GPI, basándose en el
análisis de espectrometría de masas que coincidió exactamente con el
peso molecular predicho a partir de la secuencia
(Fig 4).
(Fig 4).
El peso molecular de GPI (62636 kD) concuerda
mucho con el PM de la diana del suero K/BxN predicho a partir de las
transferencias Western, atendiendo a la precisión de la estimación
del PM mediante PAGE.
GPI constituye una enzima esencial de la vía
glicolítica. Es una enzima que se expresa en esencialmente todos
los tejidos, tanto normales como tumorales, con algunas variaciones
cuantitativas, desde los estadios más tempranos de la embriogénesis
hasta el final en la vida de los animales (West et al., 1990;
Hallbook et al., 1989; Warner et al., 1985). Es
normalmente una enzima citoplásmica, pero la GPI soluble puede
encontrarse en el suero; se encuentra elevada en los pacientes
tumorales (órganos varios), pero no de forma que haga de ella un
marcador fidedigno (véase por ejemplo (Neri et al., 1983;
Schwemmer et al., 1985; Paulick et al., 1987; Gomm
et al., 1988; Gurney et al., 1986)). GPI se ha
purificado asimismo independientemente como "Neuroleuquina",
"factor de maduración", o "Factor Autocrino de Motilidad",
factores secretados de a menudo una potencia limitada como agente
neurotrófico, o como agentes que promueven la migración celular o la
diferenciación de las células tumorales (Gurney et al.,
1986; Faik et al., 1988; Niinaka et al., 1998; Xu
et al., 1996). Las deficiencias genéticas en GPI dan lugar a
síndromes de anemia hemolítica (véase por ejemplo (Kanno et
al., 1996; Baronciani et al., 1996)).
Para confirmar que GPI es la proteína reconocida
por las Ig que se encuentran en el suero K/BxN, producimos GPI
recombinante en E. coli. La secuencia codificante de la GPI
murina se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa,
y el producto se clonó en el plásmido
pGEx-4T-3 (Pharmacia). La proteína
recombinante, un producto de fusión con
Glutatión-S-transferasa, se purificó
mediante cromatografía de afinidad en una columna de
Glutatión-Sepharosa 4B. El producto se caracterizó
sobre SDS-PAGE, y mostró el tamaño esperado (datos
no representados). El gel se sometió a transferencia, y las tiras
se sondearon con suero procedente de K/BxN o de controles de camadas
no transgénicas. Como puede apreciarse en la Fig 5, todos los sueros
K/BxN reaccionaron intensamente, mientras que los sueros de control
fueron negativos, confirmando que la proteína GPI es la diana
molecular de los anticuerpos anti-60 kD en el suero
K/BxN.
La proteína recombinante se utilizó asimismo en
los ensayos inmunoenzimáticos (ELISA) para detectar la reactividad a
la GPI en los sueros de ratones K/BxN de distintas edades. Como se
describió anteriormente (Kouskoff et al., 1996), la artritis
KRN aparece entre los 28 y 32 días de edad. Como se muestra en la
Fig 6, el ensayo detectó una reactividad significativa superior a
la anterior, hasta diluciones de 1/20.000, en sueros de los ratones
K/BxN. No se apreció dicha reactividad en las camadas de control. El
ensayo puede, por tanto, servir como un buen ensayo diagnóstico de
la artritis en estos ratones.
¿Constituyen los anticuerpos
anti-GPI todas las especificidades patogénicas del
suero K/BxN, y puede su eliminación eliminar el potencial patogénico
del suero? Para considerar esta cuestión, se unen 5 mg de GPI
recombinante o de la proteína GST de control, preparadas como se ha
explicado anteriormente, con Sepharosa conjugada a CNBr. Se
aplicaron secuencialmente a estas columnas conjuntos de sueros de
los ratones K/BxN. Las proteínas unidas se eluyeron con pH ácido, y
se ensayaron mediante transferencia a ratones inocentes, junto con
una alícuota del material de inicio y de fracciones de flujo a su
través. Como se aprecia en la Fig 7, toda la actividad artritogénica
se encontró en la fracción unida a la columna conjugada a GPI, y
ninguna de las correspondientes al flujo a su través, incluso las
últimas, contenía la mayor parte de la in inmunoglobulina. Estos
resultados demuestran que los anticuerpos anti-GPI
constituyen verdaderamente la Ig patogénica en el suero de los
ratones artríticos K/BxN, y que pueden adsorberse con la proteína
GPI recombinante.
A partir de estos datos, se concluye que los
anticuerpos anti-GPI producidos en los ratones
transgénicos, provocan artritis. Se descubrió (datos no publicados)
que las células T que expresan el receptor KRN son estimuladas
específicamente por células presentadoras de antígenos expuestas al
antígeno GPI. Estas células T a su vez estimulan a las células B que
producen inmunoglobulinas anti-GPI, que internalizan
efectivamente a GPI y reciben de esta forma ayuda de las células T
más fácilmente que las células B no específicas (Lanzavecchia,
1985). Se propone, pues, que las células T auto reactivas contra
GPI o las proteínas relacionadas circulantes, que se encuentran en
cantidades limitadas en la circulación y son pues incapaces de
inducir una tolerancia que paralice el sistema inmune, podrían
inducir anticuerpos artritogénicos similares en condiciones humanas
como RA.
La transferencia de suero desde los K/BxN
artríticos ofrece un modelo en el que pueden ensayarse formulaciones
antiartríticas potenciales mediante administración concomitante con
el suero artritogénico o las inmunoglobulinas.
Como ejemplo, se probó la capacidad del
anticuerpo monoclonal anti-c5 para interferir con la
artritogénesis en el modelo K/BxN. Se seleccionó este reactivo a
causa de la evidencia primaria que implica a los componentes del
complemento, y en particular a C5, en la generación de lesiones
articulares en otros modelos murinos de artritis y en los pacientes
RA humanos (Watson et al, 1987; Wang et al, 1995). Se
inyectó a los ratones con suero artritogénico procedente de ratones
K/BxN, y al mismo tiempo que el anticuerpo monoclonal BB5.1
anti-c5, conocido por bloquear la actividad de C5
(Frei et al, 1987) Como puede apreciarse en la Fig 8, los
ratones a los que se inyectó el anticuerpo monoclonal
anti-c5, se protegieron de la enfermedad.
Si las inmunoglobulinas que se encuentran en el
suero de los ratones K/BxN pueden transferir la artritis, se podrán
aislar asimismo anticuerpos (mAbs) que sean capaces asimismo de
transferir la enfermedad a los receptores inocentes. Esplenocitos
procedentes de ratones K/BxN de 30 y 50 días de edad se fusionaron
según los protocolos estándar para la obtención de hibridomas (St
Groth y Scheidegger, 1980), seleccionándose los hibridomas en medio
HAT, en condiciones de dilución limitante, en placas de 96 pocillos.
Los híbridos se rastrearon respecto a la producción de
inmunoglobulinas reactivas para GPI, ensayando los sobrenadantes de
los cultivos en un ensayo ELISA con GPI recombinante como un
antígeno unido y una IgG antirratón como un reactivo de revelado. Se
seleccionaron varios pocillos positivos respecto a la expansión,
clonando mediante dilución limitante y ensayando la estabilidad de
las progenies de hibridoma. Se obtuvieron de este modo once
progenies estables de hibridoma que producían IgG
anti-GPI (véase la Tabla 1 a continuación)
Anticuerpo monoclonal | Péptido reconocido | Isotipo |
1,8 | 277-312 | IgG1, \kappa |
1,7 | 1-36 | IgG1 |
1,11 | 47-82 | IgG1 |
1,24 | 24-59 | IgG1, \kappa |
2,99 | conf. | IgG1, \kappa |
2,56 | 300-335 | IgG2b, \kappa |
2,67 | 277-312 | IgG2b, \kappa |
6,149 | 277-312 | IgG1, \kappa |
6,121 | 277-312 | IgG1, \kappa |
6,65 | conf. | IgG1, \lambda |
6,96 | 277-312 | IgG1, \kappa |
La capacidad de estos anticuerpos monoclonales
para transferir la enfermedad, se ensayó mediante purificación
Proteína-G de cantidades de mg de la IgG producida
por estos hibridomas y la inyección intravenosa en receptores Balb/c
inocentes. Como puede apreciarse en la Figura 9, la inyección
conjunta de la inmunoglobulina anti-GPI de las
células de hibridoma 6.121 y 2.99 provocó artritis en los
receptores, pero ninguno de los anticuerpos pudieron inducir la
enfermedad cuando se inyectaron solos. Entre estos anticuerpos,
algunos actúan, tales como el 2.99 y el 6.121, mientras que otros
no lo hacen. Sin embargo, la etapa e) del procedimiento para aislar
los anticuerpos capaces de transferir la artritis según la
invención, permite seleccionar los (anticuerpos) que actúan.
Baronciani, L., Zanella, A.,
Bianchi, P., et al. (1996). Study of the
molecular defects in glucose phosphate isomerasedeficient patients
affected by chronic hemolytic anemia. Blood. 88,
2306-2310.
Claque, R.B. y Moore, L.J.
(1984). IgG and IgM antibody to native type II collagen in
rheumatoid arthritis serum and synovial fluid. Evidence for the
presence of collagen-anticollagen immune complexes
in synovial fluid. Arthritis Rheum. 27,
1370-1377.
De St Groth, S.F. y Scheidegger
D., 1980. Production of monoclonal antibodies: strategy and
tactics. J. Immunol. Meth. 35:1
Faik, P., Walker, J.I.,
Redmill, A.A., y Morgan, M.J. (1988). Mouse
glucose-6-phosphate isomerase and
neuroleukin have identical 3' sequences. Nature 332,
455-457.
Feldmann, M., Brennan, F.M., y
Ravider, N.M. (1996). Rheumatoid Arthritis.
Cell 85, 307-310.
Frei, Y., Lambris, J. y
Stockinger, B. 1987. Generation of a monoclonal
antibody to mouse C5. Mol. Cell. Probes,
1:141-9
Gomm, S.A., Keevil, B.G.,
Thatcher, N., Hasleton, P.S., y Swindell, R.S.
(1988). The value of tumour markers in lung cancer. Br. J.
Cancer 58, 797-804.
Gurney, M.E., Heinrich, S.P.,
Lee, M.R., y Yin, H.S. (1986). Molecular
cloning and expression of neuroleukin, a neurotrophic factor for
spinal and sensory neurons. Science 234,
566-574.
Hallbook, F., Persson, H.,
Barbany, G., y Ebendal, T. (1989). Development
and regional expression of chicken neuroleukin
(glucose-6-phosphate isomerase)
messenger RNA. J. Neurosci. Res. 23,
142-151.
Kanno, H., Fujii, H.,
Hirono, A., et al. (1996). Molecular analysis
of glucose phosphate isomerase deficiency associated with hereditary
hemolytic anemia. Blood. 88, 2321-2325.
Korganow AS, Ji H,
Mangialaio S, Duchatelle V, Pelanda R.,
Martin T, Degott C, Kikutani H, Rajewsky
K, Pasquali JL, Benoist C, Mathis D
(1999). From systemic T cell self-reactivity
to organ-specific autoimmune disease via
immunoglobulins. Immunity. Apr;
10(4):451-61.
Kouskoff, V., Korganow,
A-S., Duchatelle, V., Degott, C.,
Benoist, C., y Mathis, D. (1996).
Organ-specific disease provoked by systemic
autoreactivity. Cell 87, 811-822.
Lanzavecchia, A. (1985).
Antigen-specific interaction between T and B cells.
Nature 314, 537-539.
Mannik, M. (1992). Rheumatoid
factors in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J.
Rheumatol. Suppl. 32, 46-49.
Matsumoto I, Staub A,
Benoist C, Mathis D. (1999). Arthritis provoked
by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme.
Science. Nov 26;286(5445):1732-5.
Neri, B., Becucci, A.,
Ciapini, A., Comparini, T., Guidi, G., y
Guidi, S. (1983). Chronobiological aspects of
phosphohexoseisomerase in monitoring multiple myeloma.
Oncology. 40, 332-335.
Niinaka, Y., Paku, S.,
Haga, A., Watanabe, H., y Raz, A.
(1998). Expression and secretion of neuroleukin/
phosphohexose isomerase/maturation factor as autocrine motility factor by tumor cells. Cancer Res. 58, 2667-2674.
phosphohexose isomerase/maturation factor as autocrine motility factor by tumor cells. Cancer Res. 58, 2667-2674.
Panayi, G.S., Lanchbury, J.S., y
Kingsley, G.H. (1992). The importance of the T cell in
initiating and maintaining the chronic synovitis of rheumatoid
arthritis. Arthritis Rheum. 35, 729-735.
Paulick, R., Caffier, H., y
Paulick, M. (1987). Comparison of serum CEA, PHI, and
TPA as tumor markers in breast cancer patients. Cancer Detect.
Prev. 10, 197-203.
Rosenfeld, J., Capdevielle, J.,
Guillemot, J-C., y Ferrara, P.
(1992). In-gel digestion of proteins for
internal sequence analysis after one- or
two-dimensional gel electrophoresis. Analytical
Biochemistry 203, 173-179.
Rudolphi, U., Rzepka, R.,
Batsford, S., et al. (1997). The B cell
repertoire of patients with rheumatoid arthritis. II. Increased
frequencies of IgG+ and IgA+ B cells specific for mycobacterial
heat-shock protein 60 or human type II collagen in
synovial fluid and tissue. Arthritis Rheum. 40,
1409-1419.
Schwemmer, B., Schutz, W.,
Kuntz, R.M., y Lehmer, A. (1985). Simultaneous
determination of six tumor markers in patients with prostatic
carcinoma and bladder tumors. Urol. Res. 13,
133-136.
Sebbag, M., Simon, M.,
Vincent, C., et al. (1995). The
anti-perinuclear factor and the
so-called anti-keratin antibodies
are the same rheumatoid arthritis-specific
autoantibodies. J. Clin. Invest. 95,
2672-2679.
\newpage
Thomas, R. y Lipsky, P.E.
(1996). Presentation of self peptides by dendritic cells:
possible implications for the pathogenesis of rheumatoid arthritis.
Arthritis Rheum. 39, 183-190.
Wang Y, Rollins SA, Madri
JA, Matis LA. 1995. Anti-c5 monoclonal
antibody therapy prevents collagen-induced arthritis
and ameliorates established disease. Proc Natl Acad Sci USA.
92:8955-9.
Warner, C.M., Briggs, C.J.,
Balinsky, D., y Meyer, T.E. (1985). Glucose
phosphate isomerase activity in C57BL/6 and a mice of different
ages. Gerontology. 31, 315-320.
Watson WC, Brown PS,
Pitcock JA, Townes AS. 1987. Passive transfer
studies with type II collagen antibody in B10.D2/old and new line
and C57B1/6 normal and beige strains: evidence of important roles
for C5 and multiple inflammatory cell types in the development of
erosive arthritis Rheum. 30:460-5.
West, J.D., Flockhart, J.H.,
Peters, J., y Ball, S.T. (1990). Death of mouse
embryos that lack a functional gene for glucose phosphate isomerase.
Genet Res. 56, 223-236.
Xu, W., Seiter, K.,
Feldman, E., Ahmed, T., y Chiao, J.W.
(1996). The differentiation and maturation mediator for human
myeloid leukemia cells shares homology with neuroleukin or
phosphoglucose isomerase. Blood. 87,
4502-4506.
Zvaifler, N.J. (1973). The
immunopathology of joint inflammation in rheumatoid arthritis.
Adv. Immunol. 265, 265-3.
Claims (17)
1. Procedimiento para el diagnóstico de la
artritis, que comprende detectar en una muestra de plasma o suero de
un paciente, la presencia de autoanticuerpos contra la proteína
glucosa-6-fosfato isomerasa
(GPI).
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende un ensayo ELISA de la muestra.
3. Procedimiento según las reivindicaciones 1
ó 2, que comprende un ensayo RIA de la muestra.
4. Procedimiento según las reivindicaciones 1
a 3, que comprende la utilización de un substrato revestido con la
proteína glucosa-6-fosfato isomerasa
(GPI).
5. Procedimiento según la reivindicación 4,
en el que la proteína
glucosa-6-fosfato isomerasa (GPI) es
una proteína recombinante.
6. Utilización de la proteína
glucosa-6-fosfato isomerasa (GPI) y
sus anticuerpos para el diagnóstico de la artritis in
vitro.
7. Procedimiento para producir un mamífero
artrítico no humano, en el que la artritis es inducida por la
inyección repetida de anticuerpos contra la proteína
glucosa-6-fosfato isomerasa
(GPI).
8. Procedimiento para producir un ratón
artrítico, en el que la artritis es inducida por la inyección
repetida de anticuerpos contra la proteína
glucosa-6-fosfato isomerasa (GPI) o
del suero del ratón transgénico artrítico K/BxN o de sus
fracciones.
9. Procedimiento para determinar el potencial
antiartrítico de una composición, caracterizado por la
evaluación del efecto de la administración de dicha composición
sobre el proceso artrítico del animal producido mediante el
procedimiento según la reivindicación 7 u 8.
10. Procedimiento según la reivindicación 9,
que comprende i) detectar el curso temporal de la inflamación y la
destrucción de las articulaciones en un ratón no artrítico, al que
se le administró una dosis conocida de suero artritogénico o de
inmunoglobulinas y que recibió asimismo la composición
anti-artrítica, para ser ensayado antes, junto con o
después del suero artritogénico o de la inmunoglobulina; e ii)
comparar el curso temporal de la inflamación y la destrucción de
las articulaciones en dicho primer ratón con el curso temporal de
la inflamación y la destrucción de las articulaciones en un segundo
ratón del mismo genotipo que recibió el mismo suero artritogénico o
las mismas inmunoglobulinas, pero que no se expuso a dicha
composición anti-artrítica.
11. Procedimiento según la reivindicación 9,
que comprende i) detectar el grado de inflamación, la destrucción
de las articulaciones y la deformación de los miembros en un primer
ratón no artrítico, al que se le administró una dosis conocida de
suero artritogénico o de inmunoglobulinas que recibió asimismo la
composición anti-artrítica, para ser ensayado
antes, junto con o después del suero artritogénico o de la
inmunoglobulina; e ii) comparar el grado de inflamación, la
destrucción de las articulaciones y la deformación de los miembros
en un segundo ratón del mismo genotipo que recibió el mismo suero
artritogénico o las mismas inmunoglobulinas, pero que no se expuso a
dicha composición anti-artrítica.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11, en el que las inmunoglobulinas
artritogénicas son anticuerpos monoclonales o sus combinaciones.
13. Utilización de un kit que comprende por lo
menos una proteína glucosa-6-fosfato
isomerasa (GPI) o un fragmento de la misma, que comprende un epítopo
inmunoestimulatorio para el diagnóstico in vitro de la
artritis.
14. Procedimiento para aislar anticuerpos
monoclonales capaces de transferir la artritis, que comprende las
etapas que consisten en:
- a)
- preparar hibridomas a partir de linfocitos de esplenocitos de mamíferos artríticos,
- b)
- seleccionar dichos hibridomas en condiciones de dilución limitada en un medio HAT,
- c)
- rastrear hibridomas que produzcan anticuerpos dirigidos contra la proteína glucosa-6-fosfato isomerasa (GPI) en un ensayo ELISA,
- d)
- expansión y clonación de los hibridomas seleccionados en la etapa c),
- e)
- ensayo de dichos anticuerpos producidos por los hibridomas seleccionados en la etapa d), en combinación o solos, respecto a su capacidad para transferir la artritis, en el que la etapa e) se consigue detectando el inicio de la destrucción de las articulaciones y la deformación de los miembros por la inflamación en el ratón normal al que se administró una dosis conocida de dichos anticuerpos.
15. Procedimiento según la reivindicación 14,
en el que los hibridomas se preparan a partir de los esplenocitos de
ratones K/BxN.
16. Composición capaz de transferir la artritis
en un animal, caracterizada porque comprende una combinación
de anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína
glucosa-6-fosfato isomerasa
(GPI).
17. Utilización de una composición según la
reivindicación 16, para transferir la artritis en animales de ensayo
no humanos.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US13073099P | 1999-04-22 | 1999-04-22 | |
US130730P | 1999-04-22 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2269127T3 true ES2269127T3 (es) | 2007-04-01 |
Family
ID=22446051
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES00920987T Expired - Lifetime ES2269127T3 (es) | 1999-04-22 | 2000-04-21 | Utilizacion de la glucosa-6-fosfato isomerasa y de sus anticuerpos para el diagnostico y la terapia de la artritis, y el ensayo de compuestos antiartriticos. |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1171157B1 (es) |
JP (2) | JP4633265B2 (es) |
AT (1) | ATE335502T1 (es) |
CA (1) | CA2370867C (es) |
DE (1) | DE60029942T2 (es) |
DK (1) | DK1171157T3 (es) |
ES (1) | ES2269127T3 (es) |
WO (1) | WO2000064469A2 (es) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020146753A1 (en) * | 2001-04-06 | 2002-10-10 | Henrik Ditzel | Autoantibodies to glucose-6-phosphate isomerase and their participation in autoimmune disease |
WO2005072290A2 (en) | 2004-01-23 | 2005-08-11 | Joslin Diabetes Center | Methods of treating, reducing, or preventing autoimmune conditions |
EP1757186B1 (en) * | 2004-05-31 | 2011-10-05 | Japan Science and Technology Agency | Restless legs syndrome/periodic appendicular dyskinesia model animal |
CN105223356A (zh) * | 2015-10-20 | 2016-01-06 | 常州英赞美科生物科技有限公司 | Gpi胶乳增强免疫比浊法体外定量测定诊断试剂盒 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0720885B2 (ja) * | 1985-09-27 | 1995-03-08 | 帝人株式会社 | 単純ヘルペスウイルス感染症の予防又は治療剤 |
US5675060A (en) * | 1994-05-19 | 1997-10-07 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Transgenic arthritic mice expressing a T-cell receptor transgene |
JPH08245397A (ja) * | 1995-01-13 | 1996-09-24 | Ajinomoto Co Inc | グルコース−6−リン酸イソメラーゼ阻害剤からなる自己分泌型運動因子活性阻害剤 |
US5977311A (en) * | 1997-09-23 | 1999-11-02 | Curagen Corporation | 53BP2 complexes |
WO1999017796A2 (en) * | 1997-10-02 | 1999-04-15 | Leukosite, Inc. | Modulation of lerk-2-mediated cell adhesion |
AUPP589398A0 (en) * | 1998-09-14 | 1998-10-08 | Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The | Immunogenic compositions and uses thereof |
-
2000
- 2000-04-21 ES ES00920987T patent/ES2269127T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-21 DK DK00920987T patent/DK1171157T3/da active
- 2000-04-21 JP JP2000613459A patent/JP4633265B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-04-21 EP EP00920987A patent/EP1171157B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-21 WO PCT/IB2000/000600 patent/WO2000064469A2/en active IP Right Grant
- 2000-04-21 CA CA2370867A patent/CA2370867C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-21 DE DE60029942T patent/DE60029942T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-04-21 AT AT00920987T patent/ATE335502T1/de active
-
2010
- 2010-05-06 JP JP2010106680A patent/JP5231477B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2002544474A (ja) | 2002-12-24 |
EP1171157A2 (en) | 2002-01-16 |
CA2370867A1 (en) | 2000-11-02 |
JP5231477B2 (ja) | 2013-07-10 |
CA2370867C (en) | 2011-12-06 |
DK1171157T3 (da) | 2006-10-30 |
JP2010252795A (ja) | 2010-11-11 |
DE60029942T2 (de) | 2007-03-08 |
WO2000064469A3 (en) | 2001-05-25 |
DE60029942D1 (de) | 2006-09-21 |
WO2000064469A2 (en) | 2000-11-02 |
ATE335502T1 (de) | 2006-09-15 |
JP4633265B2 (ja) | 2011-02-16 |
EP1171157B1 (en) | 2006-08-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2317845T3 (es) | Uso de un polipeptido para detectar un estado patologico asociado con la esclerosis en placas. | |
CN101367875B (zh) | N-11端截短的β-淀粉样蛋白的单克隆抗体、组合物、方法和用途 | |
ES2259478T3 (es) | Metodos para tratar trastornos asociados con la ige y composiciones para este uso. | |
ES2346691T3 (es) | Diagnostico, tratamiento y prevencion de trastornos vasculares usando autoanticuerpos il-1alfa. | |
CN110054690B (zh) | 用于治疗的抗肾上腺髓质素(ADM)抗体或抗ADM抗体片段或抗ADM非Ig骨架 | |
BRPI9607171B1 (pt) | anticorpo monoclonal anti-cd6 humano, usos dos mesmos para o diagnóstico in vitro de psoríase, composição farmacêutica e reagente contendo o dito anticorpo | |
EP0807125A1 (en) | Monoclonal antibodies anti-cd6 and their uses | |
ES2297852T3 (es) | Aplicaciones terapeuticas de laminina y de fragmentos proteicos obtenidos a partir de laminina. | |
CA2664327A1 (en) | Method for detecting and treating skin disorders | |
JP2009236925A (ja) | フォンビルブランド因子特異的切断酵素を主成分とする診断薬および医薬品 | |
Nakajima et al. | Relationship between human IgE-binding factors (IgE-BF) and lymphocyte receptors for IgE. | |
ES2616179T3 (es) | Inmunorregulación en cáncer, enfermedades inflamatorias crónicas y autoinmunitarias | |
ES2269127T3 (es) | Utilizacion de la glucosa-6-fosfato isomerasa y de sus anticuerpos para el diagnostico y la terapia de la artritis, y el ensayo de compuestos antiartriticos. | |
CN105899528B (zh) | 用于维持最佳体重和血糖的新的多肽激素的鉴定 | |
US20060088501A1 (en) | Duffy antigen receptor for chemokines and use thereof | |
JPH02479A (ja) | snRNP−A抗原及びそのフラグメント | |
US7662375B2 (en) | Use of glucose-6-phosphate isomerase and antibodies thereto for the diagnosis and therapy of arthritis, and test of anti-arthritic compounds | |
ES2320139T3 (es) | Uso de t-cadherina soluble para el tratamiento de trastornos metabolicos. | |
KR20000070256A (ko) | 라미닌의 니도겐-결합 도메인에 결합하는 항체, 이의 제조방법및 용도 | |
US20060241036A1 (en) | Soluble human interleukin 18 receptor-alpha, method of assaying the same, assay kit and medicinal composition | |
ES2362655T3 (es) | Métodos y composiciones para suprimir la diferenciación de fibrocitos. | |
Takazawa et al. | Development of Quantitative System for the Soluble Human IGF-II Receptor | |
EP1054905A1 (en) | Derivatised antibodies with exposed carbohydrate chains capable of binding to immobilised igg | |
WO2010127642A1 (es) | Anticuerpos que reconocen sulfatidos y proteoglicanos sulfatados y su uso | |
PL223641B1 (pl) | Ultraczuły test diagnostyczny do detekcji antygenu PSA |