ES2317845T3 - Uso de un polipeptido para detectar un estado patologico asociado con la esclerosis en placas. - Google Patents

Abstract

Polipéptido que consiste en, o que comprende, por lo menos una secuencia peptídica seleccionada de entre la SEC ID nº 68 y la SEC ID nº 7

Description

Uso de un polipéptido para detectar un estado patológico asociado con la esclerosis en placas.

La presente invención se refiere en particular al uso de por lo menos un polipéptido, para obtener una composición de diagnóstico o de pronóstico, destinada a detectar o prevenir un estado patológico asociado a la esclerosis en placas.

La esclerosis en placas es una enfermedad crónica del sistema nervioso central del ser humano, que evoluciona mediante sucesión de fases de remisión y de brote, o según una progresión regular, cuya característica anatomopatológica consiste en la formación de zonas de desmielinización bien delimitadas en la sustancia blanca del cerebro y de la médula espinal.

A nivel histológico, estas zonas presentan en el estado precoz del proceso lesional, una degradación de la mielina peri-axonal asociada con una afección de las células gliales responsable de esta desmielinización. Una activación macrofágica inflamatoria que implica las células microgliales (macrófagos tisulares que residen en el sistema nervioso central), así como, probablemente, unos macrófagos que proceden de monocitos sanguíneos infiltrados, está asociada a este proceso de desmielinización y contribuye a la destrucción de las hojas mielinizadas. En el centro de la zona desmielinizada, se encuentra una depleción relativa en células gliales mientras que se desarrolla una proliferación de astrocitos en la periferia y puede invadir la placa desmielinizada para generar una placa fibrosa o gliótica. Estas estructuras escleróticas son el origen del nombre dado a la enfermedad.

Otra característica de estas placas es su asociación casi sistemática con un elemento vascular alrededor del cual se desarrollan.

A nivel histológico, se observa una alteración frecuente de la barrera hemato-encefálica (BHE) constituida por el endotelio capilar. Uno de los elementos determinantes en el mantenimiento de la BHE está constituido por la presencia subyacente de extensiones citoplásmicas de los astrocitos, denominadas pies astrocitarios. Aparentemente, los pies astrocitarios inducen la formación o permiten el mantenimiento de estructuras de unión estancas que aseguran la cohesión de la barrera endotelial capilar que concretiza la BHE. Ahora bien, diferentes modelos patológicos tienen en cuenta la alteración de la BHE y de una depleción de los pies astrocitarios.

Por otra parte, en el proceso lesional de la SEP, la alteración de la BHE contribuye a amplificar la respuesta inflamatoria asociada, mediante el aflujo de células linfoides que proceden de la circulación sanguínea. La contribución de la inflamación asociada a las células inmunitarias es importante en la SEP y participa en el proceso lesional.

La etiología de la SEP es fuente de un debate de actualidad porque la enfermedad podría tener unos orígenes diversos. Se han emitido unas hipótesis sobre un origen bacteriano y/o vírico. Por otra parte, tal como se describe en la solicitud de patente WO 95/21859, H. Perron et al. han tenido que buscar un o unos agente(s) efector(es) del proceso patogénico que conduce a la formación típica de placas de desmielinización y a una gliosis astrocitaria. En el marco de este estudio, se ha demostrado la presencia en el líquido cefalorraquídeo (LCR) y en el suero de pacientes SEP de por lo menos un factor que presenta una actividad tóxica frente a las células astrocitarias y oligodendrocitarias humanas o animales. Esta actividad tóxica se caracteriza por una desorganización citomorfológica de la red de filamentos intermedios y/o una degradación de las proteínas de dichos filamentos y/o una muerte celular por apoptosis de las células gliales. Han establecido una correlación significativa entre la detección in vitro de esta actividad tóxica en unas muestras de LCR y de suero de pacientes SEP y la esclerosis en placas mediante una dosificación colorimétrica cuantitativa con bromuro de metiltetrazolio (MTT) de las células vivas, tal como se describe en la solicitud de patente WO 95/21859. Por otro lado, C. Malcus-Vocanson et al. han demostrado que la orina es un fluido biológico muy favorable para la detección de la actividad de este factor tóxico y han desarrollado un procedimiento que utiliza la citometría de flujo para detectar y/o cuantificar las células gliales adherentes muertas por apoptosis. Todas las informaciones que se refieren a este procedimiento se describen en la solicitud de patente WO 98/11439.

Se han realizado unos ensayos a partir de una fracción proteica de LCR y de orina de pacientes SEP para intentar identificar este factor tóxico. Se ha separado el contenido proteico de cada fracción sobre gel SDS-PAGE al 12% y se ha observado después de la coloración del gel con plata. Entre las proteínas observadas, se ha encontrado una fracción proteica centrada sobre un peso molecular aparente de aproximadamente 21 kD minoritariamente asociada con la actividad tóxica detectada in vitro, y se ha encontrado una fracción centrada sobre un peso molecular aparente de aproximadamente 17 kD mayoritariamente asociada con esta actividad tóxica.

Una inyección de la fracción que procede de LCR de pacientes SEP en el cerebro de rata Lewis y una observación histológica postmortem de cortes de cerebro de las ratas ha permitido observar, tres meses después de la inyección, una apoptosis de la población astrocitaria y la formación de placas de desmielinización. Todas las informaciones están contenidas en la solicitud de patente WO 97/33466. Estas observaciones están de acuerdo con las que se han podido realizar sobre unos cortes de cerebro de pacientes que padecen SEP, después de la biopsia (N. Benjelloun et al. Cell. Mol. Biol., 1998, 44 (4), 579-583).

Los presentes inventores han identificado y analizado ahora las proteínas asociadas con esta actividad tóxica frente a unas células gliales en unas muestras biológicas de pacientes SEP, en particular en la orina, el líquido cefalorraquídeo y el suero.

Después de la purificación de las proteínas y de la separación sobre gel SDS-TRICINA, los inventores han demostrado la presencia de cuatro bandas de interés de diferentes pesos moleculares aparentes, respectivamente de 8, 14, 18 y 20 kD que corresponden a por lo menos cinco familias de proteínas diferentes. Las proteínas de estas familias han sido analizadas a continuación mediante espectrometría de masas y/o secuenciación y búsqueda de homología en los bancos de datos (NCBI http:/www.ncbi.nlm.nih.gov, Basic Blast Search, Protein Blastp, las secuencias proteicas se introducen en formato FASTA en la base de datos nr, el algoritmo usado es Matrix BLOSUM62, la identidad denominada "Identities" corresponde al número de aminoácidos idénticos proporcionado en porcentaje y la positividad "Positives" corresponde a los aminoácidos que presentan una equivalencia biológica según dichos parámetros del programa expresados en porcentajes). Estas proteínas pertenecen a las familias de las proteínas del Perlecan, del precursor de la proteína plasmática de unión al retinol, de la proteína activadora del gangliósido GM2, de la calgranulina y de la Saposina B. Más precisamente, las proteínas son (i) para la banda de 20 kD el fragmento C-terminal del Perlecan que empieza en el aminoácido 3464 y se termina en el aminoácido 3707 (Murdoch AD et al. J Biol Chem, 1992, 25 de abril; 267 (12):8544-47), y referenciado en el identificador de secuencias en la SEC ID nº 2 (siendo la proteína completa Perlecan referenciada en la SEC ID nº 1), (ii) para la banda de 20 kD el precursor de la proteína plasmática de unión al retinol (Monaco HL et al., Science, 1995, 268 (5213):1039-1041) cuya secuencia se proporciona en la SEC ID nº 4, (iii) para la banda de 18 kD la proteína activadora del gangliósido GM2 (Furst W et al., Euro J Biochem, 1990, 24 de Sep.; 193(3):709-14) identificada en la SEC ID nº 8, (iv) para la banda de 14 kD la calgranulina N (Lagasse E. et al., Mol Cell Biol, 1988, Jun.; 8(6):2402-10) identificada en la SEC ID nº 17 y (v) para la banda de 8 kD la Saposina B (Kleinschmidt T. et al., Biol Chem Hoppe Seyler, 1988, Dic.; 369(12): 1361-5) representada en la SEC ID nº 24. Por otra parte, han demostrado asimismo la presencia de secuencias variantes de dichas secuencias de referencia, en particular para la banda de 18 kD una secuencia variante de la proteína activadora del gangliósido GM2 referenciada en la SEC ID nº 9. Estas secuencias proteicas variantes son el producto de mutaciones a nivel de los genes que codifican para dichas proteínas o son el resultado de fenómenos de cortes y empalmes. Se debe observar por ejemplo que la calprotectina es una variante de la calgranulina B.

El fragmento C-terminal de la proteína Perlecan (SEC ID nº 2) está codificado por ejemplo por la secuencia nucleotídica ADN SEC ID nº 69, teniendo en cuenta el código genético. La proteína precursora de la proteína plasmática de unión al retinol (SEC ID nº 4) está codificada por ejemplo por la secuencia nucleotídica ADN SEC ID nº 70, teniendo en cuenta el código genético. La proteína activadora del GM2 (SEC ID nº 8) está codificada por ejemplo por la secuencia nucleotídica ADN SEC ID nº 31, teniendo en cuenta el código genético. Los péptidos FSWDNCFEGK DPAVIR y YSLPKSEFAV PDLELP procedentes del polipéptido mutado activador del GM2 (SEC ID nº 9) están codificados por las secuencias nucleotídicas ADN SEC ID nº 66 y SEC ID nº 67 respectivamente, teniendo en cuenta el código genético. La proteína calgranulina B (SEC ID nº 17) está codificada por ejemplo por la secuencia nucleotídica ADN SEC ID nº 42, teniendo en cuenta el código genético. La proteína Saposina B (SEC ID nº 24) está codificada por ejemplo por la secuencia nucleotídica ADN SEC ID nº 53, teniendo en cuenta el código genético.

Mediante la expresión "familia de proteínas", se entiende el conjunto de las proteínas codificadas a partir de un mismo gen de ADN y que resultan de un corte y empalme múltiple diferencial del gen y/o de un marco de lectura diferente. El gen ADN está transcrito con unos fenómenos de corte y empalme alternativo lo que conduce a la traducción de diferentes secuencias primarias de proteínas. Todas estas proteínas pertenecen a una misma familia proteica. Se incluyen asimismo en la expresión "familia proteica" las proteínas que presentan por lo menos 70% de identidad, preferentemente por lo menos 80% de identidad y ventajosamente por lo menos 98% de identidad con una secuencia proteica de referencia de la familia.

Mediante la expresión "corte y empalme múltiple", se entiende un corte y empalme que interviene por lo menos una vez en la región nucleotídica de interés.

Por ejemplo, mediante la expresión "familia de proteína precursora de la proteína plasmática de unión al retinol", se designa la familia de proteínas que comprenden por lo menos las proteínas o fragmentos de proteínas de secuencia SEC ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 6, SEC ID nº 7, y las proteínas codificadas por el gen correspondiente según diferentes marcos de lectura.

Por ejemplo, mediante la expresión "familia de proteína activadora del GM2", se entiende la familia de proteínas que comprende por lo menos las proteínas o fragmentos de proteínas de secuencia SEC ID n º 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15, SEC ID nº 16, y las proteínas codificadas por el gen correspondiente según diferentes marcos de lectura, que resultan de un corte y empalme múltiple diferencial del gen y/o de un marco de lectura diferente.

Por ejemplo, mediante la expresión "familia de proteína calgranulina B", se designa la familia de proteínas que comprende por lo menos las proteínas o fragmentos de proteínas de secuencia SEC ID nº 17, SEC ID nº 18, SEC ID nº 19, SEC ID nº 20, SEC ID nº 21, SEC ID nº 22, SEC ID nº 23, y las proteínas codificadas por el gen correspondiente según diferentes marcos de lectura, que resultan de un corte y empalme múltiple diferencial del gen y/o de un marco de lectura diferente. Las proteínas MRP 14 (SEC ID nº 17) y MRP 8 (SEC ID nº 18) tienen una secuencia proteica diferente siendo codificadas al mismo tiempo por un mismo gen; pertenecen a la misma familia proteica.

Por ejemplo, mediante la expresión "familia de proteína Saposina B", se designa la familia de proteínas que comprende por lo menos las proteínas o fragmentos de proteínas de secuencia SEC ID nº 24, SEC ID nº 25, SEC ID nº 26, SEC ID nº 27, SEC ID nº 28, SEC ID nº 29, y las proteínas codificadas por el gen correspondiente según diferentes marcos de lectura, que resultan de un corte y empalme múltiple diferencial del gen y/o de un marco de lectura diferente.

Mediante la expresión "familia de ácidos nucleicos que codifica para una proteína", se entiende el conjunto de las secuencias nucleicas ADNc y/o ARN transcritas a partir de un mismo gen ADN y que resultan de un corte y empalme múltiple diferencial. El gen ADN está transcrito con unos fenómenos de corte y empalme diferenciales y conduce a la síntesis de diferentes ácidos nucleicos (ADNc, ARN) de secuencias diferentes. Se considera que todas estas secuencias ADNc y ARNm pertenecen a una misma familia de ácidos nucleicos.

Por ejemplo, mediante la expresión "familia de ácidos nucleicos que codifican para la familia de proteína precursora de la proteína plasmática de unión al retinol", se designa la familia de ácidos nucleicos que comprende por lo menos los ácidos nucleicos o fragmentos de secuencia SEC ID nº 30.

Por ejemplo, mediante la expresión "familia de ácidos nucleicos que codifican para la familia de proteína activadora del GM2", se designa la familia de ácidos nucleicos que comprende por lo menos los ácidos nucleicos o fragmentos de secuencias SEC ID nº 31, SEC ID nº 32, SEC ID nº 33, SEC ID nº 34, SEC ID nº 35, SEC ID nº 36, SEC ID nº 37, SEC ID nº 38, SEC ID nº 39, SEC ID nº 40, SEC ID nº 41, que resultan de un corte y empalme múltiple diferencial del gen y/o de un marco de lectura diferente.

Por ejemplo, mediante la expresión "familia de ácidos nucleicos que codifican para la familia de proteína calgranulina B", se designa la familia de ácidos nucleicos que comprende por lo menos los ácidos nucleicos o fragmentos de secuencias SEC ID nº 42, SEC ID nº 43, SEC ID nº 44, SEC ID nº 45, SEC ID nº 46, SEC ID nº 47, SEC ID nº 48, SEC ID nº 49, SEC ID nº 50, SEC ID nº 51, SEC ID nº 52, que resultan de un corte y empalme múltiple diferencial del gen y/o de un marco de lectura diferente.

Por ejemplo, mediante la expresión "familia de ácidos nucleicos que codifican para la familia de proteína Saposina B", se designa la familia de ácidos nucleicos que comprende por lo menos los ácidos nucleicos o fragmentos de secuencias SEC ID nº 53, SEC ID nº 54, SEC ID nº 55, que resultan de un corte y empalme múltiple diferencial del gen y/o de un marco de lectura diferente.

Mediante la expresión "corte y empalme", se entiende un mecanismo de escisión de los intrones y de empalme de los exones durante la maduración de los transcritos, y mediante la expresión "corte y empalme diferencial", se entiende la existencia de varios esquemas de corte y empalme de un transcrito primario que desembocan en la formación de diferentes ARN mensajeros y que pueden dar lugar a la síntesis de varias proteínas diferentes (Kaplan y Delpech, Biologie Moléculaire et Médecine, 1993, 2ª edición, Médecine et Sciences, Flammarion, páginas 73-77). Este fenómeno se describe ampliamente en la bibliografía científica. A título de ejemplo, se puede citar el modelo de los genes que codifican para las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas, el modelo del gen de la distrofina, el modelo del gen de la alfa amilasa, el gen de la mielina, etc.

Se sabe que los genes eucariotas, en particular, comprenden unas regiones (exones) que codifican para unos fragmentos de la proteína codificada por dicho gen y otras regiones (intrones) que no tienen ningún equivalente proteico. Esto se debe al hecho de que los genes se transcriben en primer lugar en un ARN "primario" que se corta después mediante unas enzimas de corte y empalme a nivel de sitios nucleotídicos específicos (sitios de corte y empalme). Estas enzimas empalman después las regiones que codifican para la proteína, reconstituyendo así un ARN "secundario" cuyas regiones intrónicas han sido eliminadas. Por otro lado, según los fenotipos celulares (y por lo tanto los tejidos o la diferenciación) estas enzimas no están todas expresadas y, así, se puede cortar y empalmar un mismo ARN de forma diferente en las células de un mismo individuo, generando así unas proteínas con diferencias de secuencia. Sin embargo, estos fenómenos también se pueden aplicar a unas regiones nucleotídicas que son totalmente codificantes (exones), pero que, según diferentes cortes y empalmes posibles generarán varias proteínas diferentes a partir de la misma región nucleotídica, mediante un fenómeno de corte y empalme diferencial entre los diferentes productos proteicos.

Además, se sabe que unas regiones nucleotídicas pueden tener varios marcos de lectura según las tres tramas potenciales del código genético. Así, la presencia de varios codones iniciadores de traducción en varias fases de lectura y/o un corte y empalme de ARN primario que empalma unas secuencias nucleotídicas presentes en unas fases de lecturas diferentes sobre el ADN, permite que una misma región ADN genere unos productos proteicos sin relación entre ellos, desde el punto de vista de la secuencia peptídica.

Por último, el polimorfismo genético que existe entre los individuos de una misma especie y/o unas mutaciones individuales pueden crear o suprimir unos sitios de corte y empalme en una región ADN determinada y modificar así la secuencia y la estructura del o de los productos proteicos producidos normalmente por esta región.

Así, la combinación de estos diferentes fenómenos puede permitir que una misma secuencia nucleotídica que corresponde a un segmento de ADN, identificada como determinante de una región genética de interés en un estudio determinado, comprenda la información necesaria y suficiente para definir toda una familia de ARN cortados y empalmados según unos esquemas diferenciales y alternativos, en unos marcos de lectura diversos y, de este modo evidentemente, de proteínas y de polipéptidos que tienen unas secuencias "mosaicos" según un marco de lectura, incluso según los tres cuadros potenciales y unas mutaciones eventualmente relacionadas con el polimorfismo genético.

Un ejemplo de este fenómeno se puede representar mediante la región nucleotídica del gen env del retrovirus HIV-1. En efecto, varias proteínas diferentes son codificadas por unos segmentos de la misma secuencia: por ejemplo, la glucoproteína de cubierta, y las proteínas reguladoras TAT, REV, NEF, VIF.

Asimismo, se sabe que unas proteínas pueden ser el resultado del ensamblaje de sub-unidades idénticas (homodímeros, homomultímeros) o diferentes (heterodímeros, heteromultímeros). Así, los diferentes productos proteicos codificados por una misma región ADN pueden ensamblarse también entre sí para constituir unas entidades proteicas complejas multiméricas. Este fenómeno se añade a los anteriores y, cuando una proteína es identificada por un fragmento peptídico, se puede identificar lógicamente todos los demás elementos constitutivos de esta proteína compleja y los segmentos ADN y ARN cortados y empalmados que los codifican, así como todos los miembros de la familia de productos proteicos y sus ensamblajes. Se proporciona otro ejemplo por la región de ADN humano que codifica para la familia de proteínas MRP14 o calgranulina B, MRP8, calprotectina, psoriasina, etc.

La presente invención tiene por objeto el uso de por lo menos un polipéptido a) que comprende, o que consiste en la SEC ID nº 68, SEC ID nº 72 o SEC ID nº 9, o b) que comprende o que consiste en por lo menos una proteína para obtener una composición de diagnóstico o de pronóstico, destinada a detectar un estado patológico asociado a la esclerosis en placas (SEP), siendo dicha proteína seleccionada de entre las proteínas cuya secuencia peptídica en el estado nativo corresponde a la SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15, SEC ID nº 16, y las secuencias peptídicas que presentan el menos 70% de identidad, preferentemente por lo menos 80% de identidad y ventajosamente por lo menos 98% de identidad con cualquiera de las secuencias peptídicas citadas anteriormente, y las secuencias peptídicas o los fragmentos de dichas secuencias que pertenecen a la misma familia de proteínas que la proteína activadora del gangliósido GM2. Se pueden usar por lo menos dos polipéptidos citados anteriormente en combinación para obtener una composición de diagnóstico o de pronóstico, destinada a detectar o pronosticar un estado patológico asociado a la SEP.

Preferentemente, la secuencia peptídica de dicho polipéptido comprende o consiste en la SEC ID nº 8.

La invención tiene asimismo por objeto el uso de por lo menos un fragmento nucleotídico para obtener una composición de diagnóstico o de pronóstico destinada a detectar o pronosticar un estado patológico asociado a la SEP, según el cual dicho fragmento nucleotídico se selecciona de entre unos fragmentos que codifican para por lo menos un polipéptido que comprende o que consiste en la SEC ID nº 86, SEC ID nº 72 o SEC ID nº 9, o para por lo menos una proteína, siendo dicha proteína seleccionada de entre las proteínas cuya secuencia peptídica en el estado nativo corresponde a la SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15, SEC ID nº 16, y las secuencias peptídicas que presentan por lo menos 70% de identidad, preferentemente por lo menos 80% y ventajosamente por lo menos 98% de identidad con cualquiera de las secuencias peptídicas anteriores, y los fragmentos complementarios de dichos fragmentos, y las secuencias peptídicas que pertenecen a la misma familia de proteínas que la proteína activadora del gangliósido GM2. Está al alcance del experto en la materia determinar las secuencias nucleicas de los fragmentos nucleotídicos a partir de las secuencias peptídicas y del código genético, siendo parte de sus conocimientos generales.

Preferentemente, dicho fragmento nucleotídico codifica para una proteína que, en el estado nativo, consiste en una secuencia seleccionada de entre cualquiera de las SEC ID nº 8 a 16 citadas anteriormente, y entre las secuencias peptídicas que pertenecen a la misma familia de proteínas que la proteína activadora del gangliósido GM2.

Otro objeto de la invención es el uso de por lo menos un fragmento nucleotídico para obtener una composición de diagnóstico o de pronóstico destinada a detectar o pronosticar un estado patológico asociado a la SEP, según el cual dicho fragmento es una secuencia nucleica seleccionada de entre cualquiera de las SEC ID nº 31, SEC ID nº 32, SEC ID nº 33, SEC ID nº 34, SEC ID nº 35, SEC ID nº 36, SEC ID nº 37, SEC ID nº 38, SEC ID nº 39, SEC ID nº 40, SEC ID nº 41, y sus secuencias complementarias.

La invención se refiere asimismo al uso de un ligando específico de un polipéptido o de un fragmento nucleotídico tal como se ha definido anteriormente para obtener una composición de diagnóstico o de pronóstico, destinada a detectar o a pronosticar un estado patológico asociado a la SEP.

Por el término "ligando", se entiende cualquier molécula susceptible de asociarse al polipéptido, tal como un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un receptor, un sustrato de actividad enzimática, y una enzima cuyo polipéptido es un cofactor. La producción de anticuerpos policlonales y monoclonales forma parte de los conocimientos generales del experto en la materia. Se pueden citar a título de referencia Köhler G. y Milstein C. (1975): Continuous culture of fused cells secreting antibody of prédefined specificity, Nature 256:495-497 y Galfre G. et al. (1977) Nature, 266: 522-550 para la producción de anticuerpos monoclonales, y Roda A., Bolelli G. F.: Production of high-titer antibody to bile acids, Journal of Steroid Biochemistry, Vol. 13, pp. 449-454 (1980) para la producción de anticuerpos policlonales.

Por el término "ligando", se entiende asimismo cualquier molécula susceptible de asociarse a un fragmento nucleotídico, tal como un fragmento nucleotídico parcial o totalmente complementario, un polinucleótido complementario, un anticuerpo antiácidos nucleicos. La producción de fragmentos nucleotídicos o de polinucleótidos forma parte de los conocimientos generales del experto en la materia. Se puede citar en particular el uso de enzimas de restricción, y la síntesis química sobre sintetizador automático, por ejemplo sobre unos sintetizadores comercializados por la compañía Applied Biosystem. Por otro lado, se conocen unas técnicas para la producción de anticuerpos antiácidos nucleicos. Se puede citar a título de ejemplos Philippe Cros et al., Nucleic Acides Researc, 1994, Vol. 22, nº 15, 2951-2957; Anderson, W. F. et al. (1988) Bioessays, 8 (2), 69-74; Lee, J. S. et al. (1984) FEBS Lett., 168, 303-306; Malfoy, B. et al. (1982) Biochemistry, 21(22), 5463-5467; Stollar, B. D. et al., J. J. (eds) Methods in Enzymology, Academic Press, pp. 70-85; Traincard, F. et al. (1989) J. Immunol. Meth., 123, 83-91 y Traincard, F. et al. (1989) Mol. Cell. Probes, 3, 27-38).

La invención tiene asimismo por objeto un procedimiento para detectar por lo menos una proteína asociada a la SEP, en una muestra biológica en el que se pone en contacto la muestra biológica con por lo menos un ligando específico de por lo menos un polipéptido, comprendiendo dicho polipéptido por lo menos un polipéptido que comprende, o que consiste en, la SEC ID nº 68, SEC ID nº 72 o SEC ID nº 9, o por lo menos una proteína seleccionada de entre las proteínas cuya secuencia peptídica en el estado nativo corresponde a la SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15, y SEC ID nº 16, y las secuencias peptídicas que presentan por lo menos 70% de identidad, preferentemente por lo menos 80% de identidad y ventajosamente por lo menos 98% de identidad con cualquiera de las secuencias peptídicas SEC ID nº 8, y SEC ID nº 10 a 16, y las secuencias peptídicas o los fragmentos de dichas secuencias que pertenecen a la misma familia de proteínas que la proteína activadora del gangliósido GM2, y se detecta a continuación la formación de un complejo entre dicho polipéptido y dicho ligando. Dicho ligando es ventajosamente un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un receptor, un sustrato de actividad enzimática o una enzima cuyo polipéptido es un cofactor.

Asimismo, la invención se refiere a un procedimiento para detectar por lo menos un ligando asociado a la SEP, en una muestra biológica, caracterizado porque se pone en contacto la muestra biológica con por lo menos un polipéptido que comprende por lo menos un polipéptido que comprende, o que consiste en, la SEC ID nº 68, SEC ID nº 72 o SEC ID nº 9, o por lo menos una proteína, siendo dicha proteína seleccionada de entre las proteínas cuya secuencia peptídica en el estado nativo corresponde a la SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15, y SEC ID nº 16, y las secuencias peptídicas que presentan por lo menos 70% de identidad, preferentemente por lo menos 80% de identidad y ventajosamente por lo menos 98% de identidad con cualquiera de las secuencias peptídicas SEC ID nº 8, y SEC ID nº 10 a SEC ID nº 16, y las secuencias peptídicas que pertenecen a la misma familia de proteínas que la proteína activadora del gangliósido GM2, y se detecta a continuación la formación de un complejo entre dicho polipéptido y dicho ligando. El ligando es cualquier molécula que responde a las condiciones descritas anteriormente.

Preferentemente, en los procedimientos descritos anteriormente, la secuencia del polipéptido comprende o consiste en una secuencia peptídica seleccionada de entre cualquiera de las SEC ID nº 8 y SEC ID nº 10 a 16 anteriores y las secuencias peptídicas que pertenecen a una misma familia de proteínas que la proteína activadora del gangliósido GM2.

La invención tiene asimismo por objeto:

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\vtcortauna un procedimiento de diagnóstico o de pronóstico en el que se dosifica por lo menos un polipéptido definido en la reivindicación 5 b), para detectar o prevenir un estado patológico asociado a la esclerosis en placas, permitiendo la dosificación obtener un valor de concentración que se compara con un valor umbral representativo de la esclerosis en placas.

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\vtcortauna un procedimiento de diagnostico o de pronóstico en el que se detecta por lo menos un polipéptido definido en la reivindicación 5 b), para detectar o prevenir un estado patológico asociado a la esclerosis en placas, caracterizado porque la muestra biológica consiste en unas células o en unos sobrenadantes de dichas células de un paciente susceptible de padecer la esclerosis en placas. La muestra biológica puede ser tal como se ha definido en las reivindicaciones 29 a 31.

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La invención se refiere asimismo a un nuevo polipéptido que comprende por lo menos o que consiste en la secuencia de aminoácidos FSWDNCFEGKDPAVIR, referenciada SEC ID nº 68 o la secuencia de aminoácidos YSLPKSEFAVPDLELP referenciada SEC ID nº 72.

En particular, dicho polipéptido comprende, o consiste en, la SEC ID nº 9. Este polipéptido se usa para obtener una composición de diagnóstico o de pronóstico, destinada a detectar o a pronosticar un estado patológico asociado a la SEP, solo o en mezcla con por lo menos un polipéptido tal como se ha definido anteriormente.

Uno de los objetos de la invención es asimismo un fragmento nucleotídico que codifica para un polipéptido tal como se ha definido anteriormente.

Dicho fragmento nucleotídico, en particular, comprende o consiste en un fragmento que codifica para la SEC ID nº 9. Este fragmento se usa para obtener una composición de diagnóstico o de pronóstico, destinada a detectar un estado patológico asociado a la SEP, solo o en mezcla con por lo menos un fragmento nucleotídico tal como se ha definido anteriormente.

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La invención se refiere asimismo a un procedimiento para detectar por lo menos el polipéptido de referencia SEC ID nº 9 o un fragmento de dicho polipéptido seleccionado de entre un polipéptido que consiste en, o que comprende, por lo menos la SEC ID nº 68 o la SEC ID nº 72, en una muestra biológica según el cual se pone en contacto la muestra biológica con por lo menos un ligando específico de dicho polipéptido, y se detecta a continuación la formación de un complejo entre dicho polipéptido y dicho ligando. La definición de ligando corresponde a la definida anteriormente. Puede tratarse entre otros, de un anticuerpo monoclonal, de un anticuerpo policlonal, de un sustrato de actividad enzimática, o de una enzima cuyo polipéptido es un cofactor, y de un receptor.

Asimismo, se puede poner en contacto la muestra biológica con un ligando específico del polipéptido de referencia SEC ID nº 9, y por lo menos un ligando específico de por lo menos otro polipéptido tal como se ha definido anteriormente, y después se detecta la formación de complejos entre dichos polipéptidos y dichos ligandos específicos de dichos polipéptidos; entendiéndose que por ligando se entiende una molécula que responde a las condiciones descritas anteriormente.

Otro objeto de la invención es un fragmento nucleotídico que codifica para los polipéptidos seleccionados de entre la SEC ID nº 9, SEC ID nº 68 o SEC ID nº 72, y su uso para obtener una composición de diagnóstico o de pronóstico destinada a detectar o a pronosticar un estado patológico asociado a la SEP, eventualmente en asociación con por lo menos un fragmento nucleotídico tal como se ha definido anteriormente, y los fragmentos complementarios de dichos fragmentos.

Mediante la expresión "fragmento polipeptídico", se entiende por lo menos la totalidad o parte de la secuencia peptídica de una proteína, en particular un fragmento polipeptídico que comprende aproximadamente entre 5 y 15 aminoácidos y más precisamente aproximadamente entre 5 y 10 aminoácidos y 6 y 15 aminoácidos. Y mediante la expresión "fragmento nucleotídico", se entiende por lo menos la totalidad o parte de una secuencia nucleotídica, entendiéndose que por secuencia nucleotídica, se incluyen las secuencias ADN y ARN.

En particular, mediante la expresión "fragmento polipeptídico o nucleotídico", se entienden unos fragmentos asociados a una misma unidad molecular, o bien unos fragmentos en un complejo molecular que comprende varias sub-unidades homólogas o heterólogas obtenidas de manera natural o artificial, en particular mediante corte y empalme múltiple diferencial o mediante síntesis selectiva.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento para detectar por lo menos un polipéptido tal como se ha definido anteriormente, en una muestra de un fluido biológico que se ha extraído de un paciente que presenta un estado patológico asociado a la SEP según el cual, eventualmente después de la purificación de dicha muestra de fluido biológico, se analiza mediante espectrometría de masas el perfil de masas obtenido a partir del fluido biológico y se compara con un perfil de masas de referencia.

La presente descripción se refiere asimismo al uso de por lo menos un polipéptido de la invención para definir unos agentes terapéuticamente eficaces, y al uso de estos agentes para prevenir la esclerosis en placas.

Así, otros objetos de la invención son los siguientes:

-

\vtcortauna uso de por lo menos un polipéptido que comprende por lo menos una proteína para ensayar la eficacia de un agente terapéutico para un estado patológico asociado a la SEP, siendo dicha proteína seleccionada de entre las proteínas cuya secuencia peptídica en el estado nativo corresponde a la SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15, y SEC ID nº 16, las secuencias peptídicas que presentan por lo menos 70% de identidad, preferentemente por lo menos 80% de identidad y ventajosamente por lo menos 98% de identidad con cualquiera de las secuencias peptídicas SEC ID nº 8, y SEC ID nº 10 a 16, y las secuencias peptídicas que pertenecen a la misma familia de proteínas que la proteína activadora del gangliósido GM2;

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Según una variante ventajosa de uno de los usos anteriores, el polipéptido se selecciona de la entre SEC ID nº 8;

-

\vtcortauna Uso de por lo menos un fragmento nucleotídico, para ensayar la eficacia de un agente terapéutico para un estado patológico asociado a la SEP, según el cual dicho fragmento nucleotídico se selecciona de entre los fragmentos que codifican para una proteína, siendo dichas proteínas seleccionadas de entre las proteínas cuya secuencia peptídica en el estado nativo corresponde a la SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15, y SEC ID nº 16, las secuencias peptídicas que presentan por lo menos 70% de identidad, preferentemente por lo menos 80% de identidad y ventajosamente por lo menos 98% de identidad con cualquiera de las secuencias peptídicas SEC ID nº 8, y SEC ID nº 10 a 16, y los fragmentos complementarios de dichos fragmentos y los fragmentos que codifican para las secuencias peptídicas que pertenecen a la misma familia de proteínas que la proteína activadora del gangliósido GM2.

-

\vtcortauna Uso para ensayar la eficacia de un agente terapéutico para un estado patológico asociado a la SEP, de proteínas recombinantes y/o codificadas por los fragmentos nucleotídicos definidos en el párrafo anterior;

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La presente descripción se refiere asimismo:

-

\vtcortauna al uso de por lo menos un fragmento nucleotídico, para ensayar la eficacia de un agente terapéutico para un estado patológico asociado a la SEP, según el cual dicho fragmento es un fragmento de una secuencia seleccionada de entre cualquiera de las SEC ID nº 31, SEC ID nº 32, SEC ID nº 33, SEC ID nº 34, SEC ID nº 35, SEC ID nº 36, SEC ID nº 37, SEC ID nº 38, SEC ID nº 39, SEC ID nº 40, y SEC ID nº 41, y sus secuencias complementarias.

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La secuencia nucleica es preferentemente la SEC ID nº 31.

Mediante la expresión "eficacia terapéutica", se entiende el beneficio clínico y biológico adquirido después de la administración de un agente terapéutico con vistas a una mejora, incluso una cura de la enfermedad. Este beneficio se traduce entre otros, por una disminución de las señales clínicas, biológicas, y unos efectos patológicos de la enfermedad después de un análisis clínico por el médico y/o de los análisis biológicos, tales como imágenes por resonancia magnética, análisis de las bandas oligoclonales en el líquido cefalorraquídeo, análisis de potenciales evocados y el ensayo de detección de gliotoxicidad denominado bio-ensayo, cuyo principio se describe en la solicitud de patente WO 98/11439 citada anteriormente. Esta disminución de las señales clínicas y de los efectos patológicos debe conllevar un beneficio para el paciente (Schwartz y Lazar, 1995, Elements de statistique médicale et biologique, ediciones Flammarion; Lazar y Schwartz, 1995, Eléments de statistique médicale et biologique, ediciones Flammarion). La enfermedad estudiada preferentemente es la esclerosis en placas.

Mediante la expresión "composición de uso profiláctico y/o terapéutico", se entiende cualquier composición que comprende un agente terapéuticamente eficaz. Estos agentes terapéuticos son capaces (i) de influenciar de manera cualitativa y/o cuantitativa la actividad biológica y/o la función de las proteínas de interés identificadas en la presente invención, preferentemente la actividad gliotóxica y/o (ii) de modular y/o de inhibir la expresión de estas proteínas y/o (iii) de disminuir la concentración de estas proteínas en un compartimento extracelular y/o intracelular, y/o de sustituir una forma no patógena por una forma patógena, por ejemplo mutada, de una de estas proteínas y/o de modular su fijación a por lo menos uno de sus ligandos; siendo dicho ligando una molécula que responde a los criterios descritos anteriormente. Diferentes agentes terapéuticos están producidos siguiendo los enfoques habituales ampliamente descritos en la bibliografía. Los diferentes grupos de agentes terapéuticos definidos a partir de proteínas de interés identificadas en la presente invención se describen a continuación. Su actividad o eficacia profiláctica y/o terapéutica se evalúa in vitro y/o in vivo.

Evaluación de la eficacia de un agente terapéutico in vitro: se ensayan unas muestras de orina de individuos sanos y de pacientes que padecen la esclerosis en placas, preferentemente en fase activa, para su actividad gliotóxica in vitro siguiendo el protocolo del bio-ensayo descrito en la solicitud de patente WO 98/11439, citado anteriormente. El experimento se realiza en paralelo añadiendo o no en las muestras de orina ensayada el agente terapéutico cuya eficacia se desea ensayar. Se realizan unos ensayos con diferentes concentraciones de este agente, y después con diferentes tiempos de incubación con la muestra, a una temperatura de aproximadamente 37ºC o a temperatura ambiente, para cada concentración de agente ensayado, con la realización del bio-ensayo. La actividad gliotóxica se determina para cada muestra en bruto o purificada de orina de control y de paciente en presencia o en ausencia del agente terapéutico ensayado. Un agente profiláctico y/o terapéutico para la esclerosis en placas es un agente que permite una disminución o una inhibición de la actividad gliotóxica en un fluido biológico de los pacientes, en particular en la orina. Esta disminución o inhibición se evalúa con relación a la actividad gliotóxica detectada en el fluido biológico de los pacientes SEP en ausencia del agente ensayado que fija el límite superior y con relación a la actividad gliotóxica detectada en la orina de un individuo sano que determina el límite inferior (Schwartz y Lazar, 1995, Eléments de statistique médicale et biologique, ediciones Flammarion; Lazar y Schwartz, 1995, Eléments de statistique médicale et biologique, ediciones Flammarion). Se puede evaluar la eficacia terapéutica de varios agentes en combinación en un mismo ensayo.

Antes de evaluar la eficacia de un agente terapéutico se inyectan a un animal unas fracciones de orina purificada y/o por lo menos un polipéptido de la invención y/o por lo menos una proteína obtenida mediante recombinación genética que corresponde a por lo menos un polipéptido de la invención y/o por lo menos a un polipéptido de síntesis cuya secuencia de aminoácidos corresponde a la secuencia de por lo menos un polipéptido de la invención. Se efectúan las inyecciones, con diferentes concentraciones establecidas, a unos animales mamíferos, tales como ratones o ratas, preferentemente una rata Lewis según el protocolo descrito en la solicitud de patente WO 97/33466 citada anteriormente. A unas series de animales se inyectan, por vía intradérmica, intravenosa, intratecal, intracerebral, intramuscular, u otros, diferentes concentraciones de una fracción de orina en bruto o purificada o de por lo menos un polipéptido y/o una proteína, tales como se han definido anteriormente. Se efectúa un control negativo en paralelo. A continuación, se inyecta el agente profiláctico y/o terapéutico a evaluar con diferentes concentraciones y por diferentes vías de administración a un animal mamífero, preferentemente a una rata o a un ratón. Las inyecciones se realizan en una sola dosis o en dosis repetidas, con diferentes tiempos de intervalo entre cada administración. Algunas horas hasta algunas semanas después de la administración, se extraen unas muestras biológicas, preferentemente de la sangre, del suero, del líquido cefalorraquídeo, y de la orina. Sobre estas muestras se realiza entonces un procedimiento de evaluación de la eficacia terapéutica

(i)

una medición de la actividad gliotóxica mediante el bio-ensayo, y/o

(ii)

una medición de la actividad de los polipéptidos y/o de las proteínas de interés de la invención, solos o en combinación tal como se describe por lo menos en: Li et al., 1983, Am J Hum Genet 35:629-634; Li et al., 1988 J Biol Chem 263: 6588-6591; Li et al., 1981 J Biol Chem 256: 6234-6240; Li et al., 1976 J Biol Chem 251:1159; Kase et al., 1996, Febs Letters 393: 74-76; Kishimoto et al., 1992, J Lipid Res 33 : 1255-1267; O'Brien et al., 1991 Faseb J 5: 301-308; Murthy et al.,1993 J Immunol 151: 6291-6301; Murao et al., 1990 Cell growth Differ 1: 447-454, y/o

(iii)

una dosificación de los polipéptidos y/o de las proteínas de interés, solos o en combinación, mediante ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant Assay) y/o transferencia western, usando unos anticuerpos o unos fragmentos de anticuerpos capaces de fijarse a por lo menos uno de los polipéptidos y/o de las proteínas de la invención, o su fragmento, y/o

(iv)

una dosificación de anticuerpos específicos de los polipéptidos y/o de las proteínas de interés o de sus fragmentos, solos o en combinación, o la dosificación de por lo menos un ligando capaz de fijarse a los polipéptidos y/o a las proteínas de interés o de sus fragmentos, y/o

(v)

una dosificación de la respuesta inmune celular "helper" y/o citotóxica inducida contra los polipéptidos y las proteínas de interés o sus fragmentos, y cualquier péptido inmunógeno que se deriva de estos polipéptidos, proteínas y fragmentos, realizando, por ejemplo, un ensayo de activación in vitro de células linfocitos T "helper" específicas del antígeno administrado; cuantificando los linfocitos T citotóxicos según la técnica denominada ELISPOT descrita por Scheiben-bogen et al., 1997 Clinical Cancer Research 3: 221-226. Dicha dosificación es particularmente ventajosa cuando se quiere evaluar la eficacia de un enfoque vacunal para la realización en un paciente determinado o para diagnosticar y/o pronosticar un estado patológico potencial buscando demostrar una respuesta inmune desarrollada naturalmente por el paciente contra el antígeno, los polipéptidos, las proteínas de interés o los fragmentos inmunógenos derivados de estas proteínas.

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Mediante la expresión "ligando capaz de fijarse a una proteína", se entiende cualquier molécula capaz de reconocer la proteína o una parte de la proteína. Esto se puede verificar, por ejemplo, in vitro mediante ensayos Elisa y/o transferencia western.

Mediante la expresión "polipéptidos y/o proteínas de interés para la invención", se designa la proteína activadora del GM2 (SEC ID nº 8), la proteína mutada del activador del GM2 (SEC ID nº 9), las proteínas o fragmentos que pertenecen a la familia de la proteína activadora del GM2 (por ejemplo SEC ID nº 10 a 16) y las secuencias peptídicas que presentan por lo menos 70% de identidad, preferentemente por lo menos 80% de identidad y ventajosamente por lo menos 98% de identidad con cualquiera de las secuencias peptídicas SEC ID nº 8 a 16.

A continuación, se sacrifica el animal y se realizan unos cortes histológicos de diferentes tejidos, preferentemente unos cortes de cerebros. Se realizan diferentes estudios y observaciones para detectar y/o cuantificar los efectos característicos de los polipéptidos y/o de la proteínas activas asociadas a la fracción gliotóxica, es decir, una apoptosis de las células gliales, y/o la apertura de la barrera hemato-encefálica, y/o una desmielinización. Se observa y/o se cuantifica asimismo la presencia o la expresión de los polipéptidos y/o de las proteínas de interés identificados en estos tejidos:

(i)

mediante unos análisis de inmunohistología habituales usando unos ligandos de los polipéptidos y/o proteínas de interés y/o sus fragmentos y/o unos anticuerpos monoclonales o policlonales, o unos fragmentos que se unen a los polipéptidos y/o a las proteínas de interés, o a sus fragmentos, y/o

(ii)

mediante unas técnicas de hibridación in situ habituales usando unos fragmentos de ácidos nucleicos o unos oligonucleótidos definidos a partir de las secuencias polipeptídicas y/o proteicas de interés; y/o

(iii)

mediante unas técnicas de amplificación por PCR y/o RT-PCR in situ usando unos fragmentos de ácidos nucleicos o unos cebadores definidos a partir de las secuencias polipeptídicas y/o proteicas de interés.

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Mediante la expresión "anticuerpo capaz de fijarse a un polipéptido, a una proteína o a sus fragmentos", se entiende cualquier anticuerpo monoclonal o policlonal y cualquier fragmento de dichos anticuerpos capaz de reconocer el polipéptido, la proteína o sus fragmentos. La capacidad de los anticuerpos para reconocer dichos polipéptidos, proteínas o sus fragmentos se verifica in vitro, por ejemplo en ELISA y/o en transferencia western.

Por ejemplo, un anticuerpo capaz de fijarse a la proteína activadora del GM2 (SEC ID nº 8) o a cualquier fragmento de esta proteína se ilustra por Yuziuk et al., 1998 J Biol Chem 273: 66-72, o puede ser producido usando los métodos habituales conocidos por el experto en la materia. Este anticuerpo se puede producir, por ejemplo, después de la inyección a unos ratones o conejos de la proteína natural o cualquier fragmento, y/o de la proteína recombinante o cualquier fragmento, y/o de péptidos definidos y sintetizados a partir de la secuencia proteica de la proteína. Los péptidos inmunógenos usados para la producción de anticuerpos monoclonales anti-GM2 son los péptidos referenciados en la SEC ID nº 58, SEC ID nº 59 y SEC ID nº 60. Un anticuerpo capaz de fijarse a la proteína mutada activadora del GM2 (SEC ID nº 9) o a cualquier fragmento de esta proteína se puede producir usando los métodos habituales definidos anteriormente.

Mediante la expresión "proteína natural y fragmento", se entiende cualquier proteína aislada, purificada total o parcialmente obtenida a partir de una muestra humana o animal y cualquier fragmento obtenido a partir de esta proteína. Por ejemplo, se obtiene la proteína natural correspondiente a la proteína activadora del GM2 (SEC ID nº 8) siguiendo la técnica descrita por DeGasperi et al.,1989 Biochem J. 260: 777-783, Vogel et al., 1987 Arch Biochem Biophys 259: 627-638, Mitsuyama, 1983 Hokkaido Igaku Zasshi 58: 502-512; Hirabayashi et al 1983 J Neurochem 40: 168-175, Conzelmann et al, 1979 Hoppe Seylers Z Physiol Chem 360: 1837-1849, Li et al., 1976 J Biol Chem 251: 1159-1163.

Mediante la expresión "proteína recombinante o fragmento de una proteína recombinante", se hace referencia a cualquier proteína o fragmento de proteína producida en una célula procariota o eucariota a partir de una secuencia nucleotídica que codifica para la proteína o su fragmento y transfectada en la célula, siendo esta proteína o su fragmento purificada a continuación. De manera general, cualquier célula que procede de un organismo procariota o eucariota se puede usar en el marco de la presente invención, pero se prefieren las células que proceden de organismos eucariotas. Se pueden citar a título de ejemplo las células CHO, las células COS, las células Semliki. Para los fines de la presente invención, dicha célula puede ser salvaje o mutante. La proteína recombinante que corresponde a la proteína activadora del GM2 (SEC ID nº 8) se puede producir mediante las técnicas descritas por Yuziuk et al. 1998 J Biol Chem 273: 66-72 y Bierfreund et al., 1999 Neurochem Res 24: 295-300.

Mediante la expresión "secuencia nucleotídica de ADN o fragmento nucleotídico de ADN que codifica para la totalidad o parte de la proteína activadora del GM2 (SEC ID nº 8)", se entiende la secuencia de ácidos nucleicos SEC ID nº 31 o un fragmento de esta secuencia. Mediante la expresión "secuencia o fragmento nucleotídico de ARN que codifica para la totalidad o parte de la proteína activadora del GM2 (SEC ID nº 8)", se entiende cualquier secuencia deducida de la secuencia ADN SEC ID nº 31, teniendo en cuenta el código genético y los fenómenos de corte y empalme.

Mediante la expresión "actividad proteica", se entiende una función característica biológica de la proteína. Esta actividad proteica se puede demostrar mediante unas técnicas conocidas por el experto en la materia. Mediante la expresión "proteína activadora del GM2 (SEC ID nº 8) y proteínas de la misma familia (por ejemplo SEC ID nº 10 a 16)", se entiende por lo menos la actividad detectada por el uso de los protocolos descritos, por ejemplo, por Kase et al., 1996, Febs Letters 393: 74-76, Kishimoto et al., 1992, J Lipid Res 33: 1255-1267 y O'Brien et al., 1991 Faseb J 5: 301-308.

La obtención de un modelo animal transgénico, preferentemente murino, para una patología humana es técnicamente realizable. Brevemente, el animal transgénico se produce usando las técnicas habituales descritas y posee, integrados en su genoma, los ácidos nucleicos que codifican para las proteínas o sus fragmentos.

Antes de evaluar la eficacia de un agente terapéutico y seguimiento terapéutico ex vivo, en el ser humano:

Se administran los agentes terapéuticos a ensayar para una actividad terapéutica y/o para un seguimiento terapéutico, mediante diferentes vías al ser humano, tales como las vías intradérmica, intravenosa, intramuscular, intracerebral, oral, u otras. Se administran al ser humano diferentes dosis. El expediente clínico del paciente en el momento de la primera administración se conoce perfectamente. Se pueden realizar una o varias administraciones con unos tiempos de intervalo diferentes entre cada administración, pudiendo ir desde algunos días hasta algunos años. Se extraen unas muestras biológicas con unos intervalos de tiempo determinados después de la administración del agente terapéutico, preferentemente sangre, suero, líquido cefalorraquídeo y orina. Se realizan diferentes análisis a partir de estas muestras. Justo antes de la primera administración del agente terapéutico, se realizan asimismo estas extracciones y estos mismos análisis. Se realiza asimismo un examen clínico y biológico habitual (IRM, bandas oligoclonales en el líquido cefalorraquídeo, potenciales evocados) en paralelo con los análisis suplementarios que se describen a continuación, a diferentes tiempos del análisis. Después, se efectúa el procedimiento de la invención realizando por ejemplo los análisis siguientes:

(i)

una medición de la actividad gliotóxica mediante el bio-ensayo a partir de muestras de suero, de LCR y de orina, y/o

(ii)

una medición de actividad de las proteínas de interés identificadas en la presente invención, solas o en combinación, tal como se describe por ejemplo en: Li et al., 1983, Am J Hum Genet 35:629-634; Li et al., 1988 J Biol Chem 263: 6588-6591; Li et al., 1981 J Biol Chem 256: 6234-6240; Li et al., 1976 J Biol Chem 251:1159; Kase et al., 1996, Febs Letters 393: 74-76; Kishimoto et al., 1992, J Lipid Res 33: 1255-1267; O'Brien et al., 1991 Faseb J 5: 301-308; Murthy et al.,1993 J Immunol 151: 6291-6301; Murao et al., 1990 Cell growth Differ 1: 447-454, y/o

(iii)

una dosificación de las proteínas de interés o de sus fragmentos, solos o en combinación, en las muestras de sangre/suero, LCR, orina, mediante ELISA y/o transferencia western, usando unos anticuerpos o unos fragmentos de anticuerpos capaces de fijarse a por lo menos una de las proteínas o a uno de sus fragmentos, y/o

(iv)

una dosificación de anticuerpos específicos de las proteínas de interés o de sus fragmentos en unas muestras de sangre/suero, LCR, orina, mediante ELISA y/o transferencia western, usando una proteína natural o un fragmento de la proteína natural y/o una proteína recombinante o un fragmento de esta proteína recombinante, solos o en combinación. Asimismo, se puede realizar una dosificación de ligandos capaces de fijarse a las proteínas de interés identificadas, solas o en combinación, y/o

(v)

una dosificación de la respuesta inmune celular "helper" y/o citotóxica inducida contra las proteínas de interés y cualquier péptido inmunógeno que se deriva de estas proteínas, por ejemplo, realizando un ensayo de activación in vitro de células linfocitos T específicas del antígeno administrado (ejemplo). Por ejemplo, realizando un ensayo de activación in vitro de las células linfocitos T helper específicas del antígeno administrado (ejemplo); Por ejemplo cuantificando los linfocitos T citotóxicos según la técnica denominada ELISPOT descrita por Scheibenbogen et al., 1997 Clinical Cancer Research 3: 221-226. Dicha dosificación es particularmente ventajosa cuando se desea evaluar la eficacia de un enfoque vacunal realizado en un paciente dado o para diagnosticar un estado patológico potencial en un paciente buscando demostrar una respuesta inmune desarrollada naturalmente por dicho paciente contra el antígeno, las proteínas de interés o cualquier fragmento inmunógeno que se deriva de estas proteínas, solos o en combinación, y/o

(vi)

una detección de fragmentos de ADN y/o de ARN que codifican para las proteínas o un fragmento de las proteínas de interés mediante hibridación nucleotídica según las técnicas bien conocidas por el experto en la materia (transferencia Southern, transferencia Northern, ELOSA "Enzyme-Linked Oligosorbent Assay" (Katz JB et al., Am. J. Vet. Res., dic. de 1993; 54 (12):2021-6 y François Mallet et al., Journal of Clinical Microbiology, junio de 1993, p. 1444-1449)) y/o mediante un método de amplificación del ADN y/o del ARN, por ejemplo mediante PCR, RT-PCR, usando unos fragmentos de ácidos nucleicos que codifican para la secuencia de las proteínas de interés.

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Mediante la expresión "polipéptidos y/o proteínas de interés para la invención", se designan la proteína activadora del GM2 (SEC ID nº 8), la proteína mutada del activador del GM2 (SEC ID nº 9), las proteínas o fragmentos que pertenecen a la familia de la proteína activadora del GM2 (por ejemplo SEC ID nº 10 a 16), y las secuencias peptídicas que presentan por lo menos 70% de identidad, preferentemente por lo menos 80% de identidad y ventajosamente por lo menos 98% de identidad con cualquiera de las secuencias peptídicas SEC ID nº 8 a 16.

Mediante la expresión "secuencia de ácidos nucleicos ADN o fragmentos que codifican para los polipéptidos y/o proteínas de interés", se designan la secuencia de ácidos nucleicos (SEC ID Nº 31) que codifica para la proteína activadora del GM2 (SEC ID nº 8), la secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la proteína mutada del activador del GM2 (SEC ID nº 9), las proteínas o fragmentos que pertenecen a la familia de la proteína activadora del GM2 (por ejemplo SEC ID nº 10 a 16).

Una proteína o una variante de una proteína seleccionada más particularmente de entre las secuencias definidas en los identificadores SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, o sus fragmentos, o de entre las secuencias que corresponden a las proteínas de las familias de dichas secuencias (por ejemplo, SEC ID nº 10 a 16), y las secuencias peptídicas que presentan por lo menos 70% de identidad, preferentemente por lo menos 80% de identidad y ventajosamente por lo menos 98% de identidad con cualquiera de las secuencias peptídicas SEC ID nº 8 a 16, independientemente o en combinación, presenta un efecto tóxico directa o indirectamente, frente a células, en particular frente a unas células gliales, que se demuestra mediante el bio-ensayo citado anteriormente. Los auto-anticuerpos producidos en respuesta a la presencia de esta proteína o de estas proteínas están asociados al proceso auto-inmune. Así, la diana del o de los agente(s) terapéutico(s) es por ejemplo (i) la proteína natural o las proteínas naturales o sus variantes con el objetivo de regular su expresión y/o su concentración intracelular y/o su concentración en la circulación, (ii) un anticuerpo específico de por lo menos dicha proteína. El agente terapéutico o los agentes terapéuticos definidos eliminan la diana directamente, mediante la inducción de una respuesta inmune específica y/o la neutralizan.

Mediante la expresión "polipéptidos y/o proteínas de interés", se designan el fragmento C-terminal del Perlecan (SEC ID nº 2), el precursor de la proteína plasmática de unión al retinol (SEC ID nº 4), la proteína activadora del GM2 (SEC ID nº 8), la proteína mutada del activador del GM2 (SEC ID nº 9), la calgranulina B (SEC ID nº 17), la Saposina B (SEC ID nº 24), las proteínas o fragmentos que pertenecen a la familia del precursor de la proteína plasmática de unión al retinol (por ejemplo SEC ID nº 5 a 7), las proteínas o los fragmentos que pertenecen a la familia de la proteína activadora del GM2 (por ejemplo SEC ID nº 10 a 16), las proteínas o fragmentos que pertenecen a la familia de la proteína calgranulina B (por ejemplo SEC ID nº 18 a 23), las proteínas o fragmentos que pertenecen a la familia de la proteína Saposina B (por ejemplo SEC ID nº 25 a 29) y las secuencias peptídicas que presentan por lo menos 70% de identidad, preferentemente por lo menos 80% de identidad y ventajosamente por lo menos 98% de identidad con cualquiera de las secuencias peptídicas SEC ID nº 1 a 29.

A partir de los conocimientos de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de interés identificadas en la presente invención, está al alcance del experto en la materia definir y usar las moléculas descritas anteriormente y/o cualquier molécula capaz de fijarse a dichas moléculas, y/o cualquier molécula capaz de inhibir dichas moléculas.

La respuesta inmune dirigida contra un antígeno específico se puede dividir en dos categorías distintas, una usa los anticuerpos (respuesta inmune de tipo humoral), y la otra las células efectoras citotóxicas tales como, por ejemplo, los macrófagos, los linfocitos citotóxicos (CTL) o las células asesinas (NK) así como los linfocitos T "helper", en particular los linfocitos T CD4+ (respuesta inmune de tipo celular). Más particularmente, los dos tipos de respuesta se distinguen porque los anticuerpos reconocen los antígenos en su forma tridimensional mientras que los linfocitos T, por ejemplo, reconocen unas porciones peptídicas de dichos antígenos, asociadas con unas glucoproteínas codificadas por los genes del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), en particular los genes del complejo mayor de histocompatibilidad de tipo I que se expresan de manera ubiquitaria en la superficie de las células, o los genes del complejo mayor de histocompatibilidad de tipo II que se expresan de manera específica en la superficie de las células implicadas en la presentación de los antígenos (APC). 1) Según un primer aspecto, la respuesta inmune de tipo celular se caracteriza porque las células T de tipo CD4+ (células T helper), a consecuencia de un fenómeno de activación bien conocido (para repaso véase Alberola-lia 1997, Annu Rev Immunol 15, 125-154) producen unas citoquinas que inducen a su vez la proliferación de células APC capaces de producir dichas citoquinas, la diferenciación celular de los linfocitos B capaces de producir unos anticuerpos específicos del antígeno, y la estimulación de los linfocitos T citotóxicos (CTL). 2) Según un segundo aspecto de la respuesta inmune celular, las células efectoras citotóxicas tales como, por ejemplo, los linfocitos de tipo CD8+ (CTL) se activan a) después de la interacción con unos péptidos antigénicos fijados sobre y presentados por las glucoproteínas contenidas en las células ubiquitarias y codificadas por los genes que pertenecen al sistema CMHI, y b) eventualmente por las citoquinas producidas
por los CD4+.

Las proteínas de interés naturales y/o recombinantes identificadas en la presente descripción (SEC ID nº 8, 9), y las secuencias peptídicas o los fragmentos de dichas secuencias que pertenecen a la familia de la proteína activadora del gangliósido GM2 (por ejemplo SEC ID nº 10 a 16), y las secuencias peptídicas que presentan por lo menos 70% de identidad, preferentemente por lo menos 80% de identidad y ventajosamente por lo menos 98% de identidad con cualquiera de las secuencias peptídicas SEC ID nº 8 a 16, o su(s) fragmento(s), se usan en vacunación profiláctica y terapéutica contra las enfermedades auto-inmunes, preferentemente la SEP. Una vacuna comprende una cantidad inmunogénica efectiva de la proteína inmunógena en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y eventualmente un adyuvante y/o un diluyente. Los vehículos, adyuvantes y diluyentes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por el experto en la materia. Se puede citar a título de referencia, el Remington's Pharmaceutical Sciences. El uso de composiciones vacunales es particularmente ventajoso en asociación con un diagnóstico precoz de la enfermedad. La proteína inmunógena se usa en la preparación de un medicamento destinado a la vacunación profiláctica o terapéutica. Las proteínas de interés se pueden eliminar del organismo sin inducir efectos secundarios indeseables. La identificación de dichas proteínas o péptidos vacunas se realiza como sigue: las moléculas candidatas modificadas tal como se ha descrito anteriormente (proteínas naturales, recombinantes, péptidos) se analizan en un ensayo funcional para verificar que han perdido su toxicidad, por ejemplo su actividad gliotóxica usando el ensayo denominado bio-ensayo, y para verificar su inmunogenicidad (i) realizando un ensayo in vitro de proliferación de linfocitos T CD4+ específicos del antígeno administrado (T cell assay) o un ensayo in vitro de citotoxicidad de los linfocitos CD8+ específicos del antígeno administrado y (ii) midiendo entre otros el porcentaje de anticuerpos circulantes dirigidos contra la proteína natural. Estas formas modificadas se usan para inmunizar unos seres humanos mediante unos procedimientos estándares con unos adyuvantes apropiados.

Las vacunas preparadas son inyectables, es decir, en disolución líquida o en suspensión. Opcionalmente, la preparación también puede ser emulsificada. La molécula antigénica se puede mezclar con unos excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Ejemplos de excipientes favorables son el agua, una solución salina, la dextrosa, el glicerol, el etanol, o unos equivalentes o sus combinaciones. Si se desea, la vacuna puede comprender unas cantidades menores de sustancias auxiliares tales como unos agentes "wetting" o emulsionantes, unos agentes que tamponan el pH o unos adyuvantes tales como el hidróxido de aluminio, el dipéptido muramilo, o sus variaciones. En el caso de los péptidos, su acoplamiento a una molécula más grande (KLH, toxina tetánica) aumenta a veces la inmunogenicidad. Las vacunas se administran convencionalmente mediante inyección, por ejemplo, sub-cutánea o intramuscular. Unas formulaciones adicionales favorables con otros modos de administración incluyen unos supositorios y a veces unas formulaciones orales.

Generalmente, la concentración del polinucleótido en la composición usada para una administración in vivo es de 0,1 \mug/ml hasta 20 mg/ml. El polinucleótido puede ser homólogo o heterólogo de la célula diana en la que se introducirá.

La presente descripción se refiere asimismo al uso de vacunas que incluyen unas moléculas de ácidos nucleicos que codifican para las proteínas de interés o unos péptidos inmunógenos o su(s) fragmento(s), no activos, que corresponden a las proteínas de interés (SEC ID nº 8, 9) y las secuencias peptídicas o los fragmentos de dichas secuencias que pertenecen a la familia de proteínas de la proteína activadora del gangliósido GM2 (por ejemplo SEC ID nº 10 a 16) y las secuencias peptídicas que presentan por lo menos 70% de identidad, preferentemente por lo menos 80% de identidad y ventajosamente por lo menos 98% de identidad con cualquiera de las secuencias peptídicas SEC ID nº 8 a 16. Las vacunas de ácidos nucleicos, en particular las vacunas ADN, se administran generalmente en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable en inyección intramuscular.

A partir de la secuencia de aminoácidos de las proteínas de interés descritas (SEC ID nº 8 y 9), y las secuencias peptídicas o los fragmentos de dichas secuencias que pertenecen a la familia de proteínas de la proteína activadora del gangliósido GM2 (por ejemplo SEC ID nº 10 a 16), y las secuencias peptídicas que presentan por lo menos 70% de identidad, preferentemente por lo menos 80% de identidad y ventajosamente 98% de identidad con cualquiera de las secuencias peptídicas SEC ID nº 8 a 16, se pueden sintetizar unos péptidos o unos fragmentos que corresponden a la totalidad o parte de la secuencia primaria de estas proteínas mediante unos métodos habituales de síntesis peptídica o se pueden obtener mediante recombinación genética.

Unas proteínas recombinantes que corresponden a las proteínas de interés, producidas en un sistema celular procariota o eucariota, están disponibles en diferentes equipos y se describen en la bibliografía. Se pueden producir asimismo por el experto en la materia a partir del conocimiento de las secuencias de los genes correspondientes descritos en la bibliografía y teniendo en cuenta la degenerescencia del código genético. Todas las secuencias proteicas identificadas en la presente invención son así susceptibles de ser obtenidas mediante recombinación genética. Los genes se clonan en unos vectores adaptados. Se usan unos vectores diferentes para transformar unas células procariotas (por ejemplo E. coli) y unas células eucariotas (por ejemplo células COS CHO y células Simliki). Las proteínas recombinantes que corresponden a las proteínas de interés o a unos fragmentos de las proteínas de interés, se pueden producir así en unos sistemas celulares procariotas y/o eucariotas. En las células E. coli, las proteínas recombinantes son producidas con una cola poli-histidina. La fracción proteica insoluble se solubiliza en urea 8M. El enriquecimiento del producto se ha efectuado sobre resina quelatada con níquel (Qiagen). Se ha lavado la columna con unas concentraciones decrecientes de urea. Se ha realizado la elución con imidazol en ausencia de urea. La secuencia completa de las proteínas de interés se puede clonar asimismo en un plásmido adaptado y después transferir en el virus de la vacuna para obtener un virus recombinante.

Uso de ligandos capaces de fijarse a las proteínas de interés identificadas en la presente descripción

Son preferentemente unos anticuerpos muy útiles en particular para permitir la realización de composiciones terapéuticas puesto que conducen, por ejemplo, a unas reacciones inmunes, dirigidas específicamente contra epítopos inmunodominantes o contra unos antígenos que presentan una gran variabilidad. Se administra al paciente o bien unos anticuerpos solubles neutralizantes para inhibir su función, o bien unos anticuerpos solubles específicos para eliminar el péptido mediante la formación de complejos inmunes. El uso de anticuerpos capaces de reconocer específicamente por lo menos una proteína se describe para el tratamiento y/o para el seguimiento terapéutico de la esclerosis en placas. Estos anticuerpos son policlonales y preferentemente monoclonales. Preferentemente, estos anticuerpos reconocen el sitio activo de la proteína y fijándose, inhiben la función de la proteína. La capacidad del anticuerpo para fijarse específicamente a la proteína se analiza mediante unas técnicas habituales descritas, como, por ejemplo, mediante unos ensayos ELISA o de transferencia western, usando la proteína o el péptido inmunógeno natural o sintético. Se determina el título del anticuerpo. La capacidad del anticuerpo para neutralizar la función de la proteína se puede analizar mediante diferentes medios, por ejemplo determinando la disminución de la actividad de la proteína o del péptido inmunógeno en presencia del anticuerpo, preferentemente determinando la disminución de la actividad gliotóxica usando el bio-ensayo in vitro.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína diana o una parte de esta proteína son producidos mediante unas técnicas convencionales usadas para producir unos anticuerpos contra unos antígenos de superficie. Se inmunizan unos ratones o unos conejos (i) o bien con la proteína natural o recombinante de interés, (ii) o bien con cualquier péptido inmunógeno de esta proteína de interés, (iii) o bien con unas células murinas que expresan la proteína o el péptido de interés y las moléculas del CMHII. La línea murina Balb/c es la usada más frecuentemente. El inmunógeno es asimismo un péptido seleccionado de entre los péptidos definidos a partir de las secuencias primarias de las proteínas de interés. Por ejemplo, se ha preparado el siguiente inmunógeno: se han acoplado los péptidos SEC ID nº 58, 59 y 60, procedentes de la secuencia del precursor del gangliósido GM2 con una hemocianina de Lymphet Keyhole, abreviado péptido-KLH, como soporte para su uso en inmunización, o acoplado con albúmina sérica humana, abreviado péptido-HSA. Los animales han sido sometidos a una inyección de péptido-KLH o de péptido-HSA, usando adyuvante completo de Freund (IFA). Se han analizado los sueros y los sobrenadantes de cultivo de hibridoma procedentes de los animales inmunizados con cada péptido para la presencia de anticuerpos anti-proteínas mediante un ensayo ELISA usando las proteínas iniciales. Las células esplénicas de estos ratones han sido por consiguiente recuperadas y fusionadas con unas células de mieloma. El polietilenglicol (PEG) es el agente de fusión usado más frecuentemente. Se seleccionan los hibridomas que producen los anticuerpos más específicos y los más sensibles. Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos in vitro mediante cultivo celular de los hibridomas producidos o mediante recuperación de líquido de ascito murino después de la inyección intraperitoneal de los hibridomas en el ratón. Independientemente del modo de producción en sobrenadante o en ascito, es importante purificar a continuación el anticuerpo monoclonal. Los métodos de purificación usados son esencialmente la filtración sobre gel intercambiador de iones o mediante cromatografía de exclusión, incluso la inmunoprecipitación. Para cada anticuerpo, se necesita eligir el método que permite obtener el mejor rendimiento. Un número suficiente de anticuerpos anti-proteínas se criban en unos ensayos funcionales para identificar los anticuerpos más competentes para fijar la proteína de interés y/o bloquear la actividad de la proteína de interés. Los anticuerpos monoclonales seleccionados se humanizan mediante unos métodos habituales de "CDR grafting" (protocolo realizado por numerosas compañías, en forma de servicio). Estos anticuerpos humanizados se pueden ensayar clínicamente en el paciente. La eficacia de estos anticuerpos puede ser seguida por unos parámetros clínicos.

La producción in vitro de anticuerpos, de fragmentos de anticuerpos o de derivados de anticuerpos, tales como los anticuerpos quimeras, producidos mediante ingeniería genética, en unas células eucariotas ya se ha descrito (EP 120 694 o EP 125 023) y es también aplicable a la presente invención.

Uso de vectores que comprenden un gen de interés terapéutico que corresponde a los genes de las proteínas de interés identificadas en la presente invención

La presente descripción se refiere a un material biológico para la preparación de composiciones farmacéuticas destinadas a la prevención y al tratamiento de la esclerosis en placas, comprendiendo la composición una secuencia de ácido nucleico que comprende un gen de interés terapéutico y unos elementos de expresión de dicho gen de interés. Los genes pueden estar no mutados o mutados. Pueden consistir asimismo en unos ácidos nucleicos modificados de manera que no les es posible integrarse en el genoma de la célula diana, o en unos ácidos nucleicos estabilizados con la ayuda de agentes, tales como la espermina.

Dicho gen de interés terapéutico codifica en particular:

(i)

o bien por lo menos para un polipéptido de interés para la invención

(ii)

o bien por lo menos para un anticuerpo policlonal o monoclonal capaz de fijarse a por lo menos un polipéptido de interés para la invención. Puede tratarse en particular de anticuerpo transmembranario nativo, o de fragmento o derivado de dicho anticuerpo, con la condición de que dicho anticuerpo, fragmento o derivado de anticuerpo sea expresado en la superficie de la célula diana del mamífero genéticamente modificada y sea capaz de fijarse a un polipéptido presente en la superficie de una célula efectora citotóxica o de un linfocito T helper implicado en el procedimiento de activación de dicha célula,

(iii)

o bien por lo menos para una molécula inhibidora de por lo menos un polipéptido de interés para la invención,

(iv)

o bien por lo menos para un ligando o cualquier parte de un ligando capaz de fijarse a por lo menos un polipéptido de interés para la invención.

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Más particularmente, mediante la expresión "fragmento de anticuerpo", se entiende los fragmentos F(ab)2, Fab', Fab, sFv (Blazar et al., 1997, Journal of lmmunology 159: 5821-5833; Bird et al., 1988 Science 242: 423-426) de un anticuerpo nativo y mediante el término "derivado", se entiende, por ejemplo, un derivado quimérico de dicho anticuerpo (véase, por ejemplo, las quimeras de los anticuerpos antiCD3 Ratón/Ser humano en Arakawa et al., 1996 J Biochem 120: 657-662 o las inmunotoxinas tales como sFv-toxina de Chaudary et al. 1989, Nature 339: 394-397). Mediante la expresión "anticuerpo transmembranario", se entiende un anticuerpo del que por lo menos una región funcional capaz de reconocer y de fijarse a su antígeno específico está expresada en la superficie de las células dianas para permitir dichos reconocimiento y fijación. Más particularmente, los anticuerpos según la presente descripción consisten en unos polipéptidos de fusión que comprenden los aminoácidos que definen dicha región funcional y una secuencia de aminoácidos (polipéptido transmembranario) que permiten el anclaje en el seno de la doble capa lipídica membranaria de la célula diana o en la superficie externa de esta bi-capa. Las secuencias nucleicas que codifican para numerosos polipéptidos transmembranarios se describen en la bibliografía. Según un caso muy ventajoso, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la cadena pesada del anticuerpo se fusiona con la secuencia de ácido nucleico que codifica para dicho polipéptido transmembranario.

Mediante la expresión "elementos que aseguran la expresión de dicho gen in vivo", se hace referencia en particular a los elementos necesarios para asegurar la expresión de dicho gen después de su transferencia a una célula diana. Se trata en particular de las secuencias promotoras y/o de las secuencias de regulación eficaces en dicha célula, y eventualmente las secuencias requeridas para permitir la expresión en la superficie de las células dianas de dicho polipéptido. El promotor usado puede ser un promotor vírico, ubiquitario o específico de tejido o también un promotor sintético. A título de ejemplo, se mencionarán los promotores tales como los promotores de los virus RSV (Rous Sarcoma Virus), MPSV, SV40 (Simian Virus), CMV (Cytomegalovirus) o del virus de la vacuna, los promotores del gen que codifican para la creatina quinasa muscular, y para la actina. Además es posible eligir una secuencia promotora específica de un tipo celular determinado, o activable en unas condiciones definidas. La bibliografía proporciona un gran número de informaciones relativas a dichas secuencias promotoras.

Por otro lado, dicho ácido nucleico puede comprender por lo menos dos secuencias, idénticas o diferentes, que presentan una actividad de promotor transcripcional y/o por lo menos dos genes, idénticos o diferentes, situados uno con relación al otro de manera contigua, alejada, en el mismo sentido o en el sentido inverso, con la condición que la función de promotor transcripcional o la transcripción de dichos genes no se vea afectada.

Asimismo, en este tipo de construcción de ácido nucleico, es posible introducir unas secuencias nucleicas "neutras" o intrones que no perjudican a la transcripción y que son cortados y empalmados antes de la etapa de traducción. Dichas secuencias y sus usos se describen en la bibliografía (referencia: solicitud de patente PCT WO 94/29471).

Dicho ácido nucleico puede comprender asimismo unas secuencias requeridas para el transporte intracelular, para la replicación y/o para la integración, para la transcripción y/o la traducción. Dichas secuencias son bien conocidas por el experto en la materia.

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Por otra parte, los ácidos nucleicos que se pueden utilizar pueden ser asimismo unos ácidos nucleicos modificados de manera que no les es posible integrarse en el genoma de la célula diana, o unos ácidos nucleicos estabilizados con la ayuda de agentes, tales como por ejemplo la espermina, que como tales no tienen ningún efecto sobre la eficacia de la transfección.

Según un modo de realización, la secuencia de ácido nucleico es una secuencia de ADN o de ARN desnuda, es decir, libre de cualquier compuesto que facilite su introducción en las células (transferencia de secuencia de ácido nucleico). Sin embargo, según un segundo modo de realización de la invención, con el fin de favorecer su introducción en las células dianas y con el fin de obtener las células genéticamente modificadas de la invención, esta secuencia de ácido nucleico puede estar en forma de un "vector", y más particularmente en forma de un vector vírico, tal como, por ejemplo, un vector adenovírico, retrovírico, un vector derivado de un poxvirus, en particular derivado del virus de la vacuna o del Modified Virus Ankara (MVA) o de un vector no vírico tal como, por ejemplo, un vector que consiste en por lo menos dicha secuencia de ácido nucleico complejada o conjugada con por lo menos una molécula o sustancia portadora seleccionada de entre el grupo que consiste en un anfifilo catiónico, en particular un lípido catiónico, un polímero catiónico o neutro, un compuesto polar prótico seleccionado en particular de entre el propilenglicol, el polietilenglicol, el glicerol, el etanol, la 1-metil-L-2-pirrolidona, o sus derivados, y un compuesto polar aprótico seleccionado en particular de entre el dimetilsulfóxido (DMSO), el dietilsulfóxido, el di-n-propilsulfóxido, la dimetilsulfona, el sulfolano, la dimetilformamida, la dimetilacetamida, la tetrametilurea, el acetonitrilo, o sus derivados. La bibliografía proporciona un número importante de ejemplos de dichos vectores víricos y no víricos.

Dichos vectores pueden comprender además y preferentemente unos elementos de apuntado a la diana que pueden permitir dirigir la transferencia de secuencia de ácido nucleico hacia ciertos tipos celulares o ciertos tejidos particulares tales como las células citotóxicas y las células presentadoras del antígeno. Asimismo, pueden permitir dirigir la transferencia de una sustancia activa hacia ciertos compartimentos intracelulares preferidos tal como el núcleo, las mitocondrias o las peroxisomas, por ejemplo. Además, puede tratarse de elementos que facilitan la penetración en el interior de la célula o la lisis de compartimentos intracelulares. Dichos elementos de apuntado a la diana se describen ampliamente en la bibliografía. Por ejemplo, puede tratarse de la totalidad o parte de lectinas, de péptidos, en particular el péptido JTS-1 (véase la solicitud de patente PCT WO 94/40958), de oligonucleótidos, de lípidos, de hormonas, de vitaminas, de antígenos, de anticuerpos, de ligandos específicos de receptores membranarios, de ligandos susceptibles de reaccionar con un anti-ligando, de péptidos fusógenos, de péptidos de localización nuclear, o de una composición de dichos compuestos.

La presente descripción se refiere a un material biológico para la preparación de composiciones farmacéuticas destinadas a la prevención y al tratamiento de mamíferos que padecen la esclerosis en placas, comprendiendo la composición por lo menos un vector que contiene un gen terapéutico tal como se describe a continuación, capaz de ser introducido en una célula diana in vivo y de expresar el gen de interés terapéutico in vivo. La ventaja de esta composición se basa en la posibilidad de mantener a largo plazo un nivel basal de moléculas expresadas en el paciente tratado. Se inyectan unos vectores o ácidos nucleicos que codifican para unos genes de interés terapéutico. Estos vectores y ácidos nucleicos deben ser transportados hasta las células dianas y transfectar estas células en las que se deben expresar in vivo.

Una aplicación de la invención se refiere a la expresión in vivo de secuencias nucleotídicas y/o de vectores tales como se han designado en el párrafo anterior, es decir, unas secuencias que corresponden a unos genes de interés terapéutico que codifican en particular:

(i)

o bien por lo menos para un polipéptido de interés para la invención

(ii)

o bien por lo menos para la totalidad o parte de un anticuerpo policlonal o monoclonal capaz de fijarse a por lo menos un polipéptido de interés para la invención.

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Puede tratarse de un anticuerpo transmembranario nativo, o de un fragmento o derivado de dicho anticuerpo, con la condición de que dicho anticuerpo, fragmento o derivado de anticuerpo sea expresado en la superficie de la célula diana de mamífero genéticamente modificada, y que dicho anticuerpo sea capaz de fijarse a un polipéptido presente en la superficie de una célula efectora citotóxica o de un linfocito T helper e implicado en el procedimiento de activación de dicha célula. Puede tratarse de fragmentos de anticuerpos expresados por unas células capaces de segregar dichos anticuerpos en la circulación sanguínea de un mamífero o paciente portador de las células genéticamente modificadas por el gen que codifica para el anticuerpo,

(i)

o bien por lo menos para una molécula inhibidora de por lo menos un polipéptido de interés para la invención,

(ii)

o bien por lo menos para un ligando o la totalidad o parte del ligando capaz de fijarse sobre por lo menos un polipéptido de interés para la invención.

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Según un modo de realización particular, se trata de usar la terapia génica de manera que se dirige la respuesta inmune contra un polipéptido de interés para la invención. Para ello, resulta evidente que las células a apuntar para la transformación con un vector son unas células que pertenecen al sistema inmune, o bien unas células de tipo linfocitos (CD4/CD8), o bien unas células presentadoras del antígeno (células dendríticas, macrófagos, etc.).

Según un modo de realización particular, se modifican genéticamente, en particular in vivo, las células presentadoras del antígeno (CPA). Las CPA como los macrófagos, las células dendríticas, los microgliocitos, los astrocitos, desempeñan una función en la iniciación de la respuesta inmune. Son los primeros componentes celulares que capturan el antígeno, lo preparan en la célula y expresan unas moléculas del CMHI y del CMHII transmembranarias implicadas en la presentación del inmunógeno a las células T CD4+ y CD8+, producen unas proteínas accesorias específicas que participan en la activación de las células T (Debrick et al.; 1991, J. Immunol 147: 2846; Reis et al., 1993, J Ep Med 178: 509; Kovacsovics-bankowski et al., 1993, PNAS 90: 4942; Kovacsovics-bankowski et al., 1995 Science 267:243; Svensson et al., 1997, J Immunol 158:4229; Norbury et al; 1997, Eur J Immunol 27: 280). Para una vacunación, puede ser ventajoso disponer de un sistema de terapia génica que puede apuntar a la transferencia de gen en dichas células APC, es decir, un gen que codifica para un polipéptido que puede, después de su producción intracelular y de su "processing", ser presentado a las células CD8+ y/o CD4+ por las moléculas de los complejos CMHI y CMHII respectivamente en la superficie de estas células.

Se elige expresar en la superficie de las células CPA in vivo la totalidad o parte de un anticuerpo y/o de un ligando como por ejemplo un receptor, capaz de reaccionar con un polipéptido de interés para la invención. Dichas células fagocitarán entonces específicamente dicha proteína o dicho péptido, "procesarlo" de manera que unos fragmentos de este péptido estén presentes en la superficie de las células presentadoras del antígeno.

La bibliografía propone un gran número de ejemplos de genes que codifican para unos anticuerpos capaces de reaccionar con unos polipéptidos o receptores. Está al alcance del experto en la materia obtener las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para dichos anticuerpos. Se pueden citar, por ejemplo, los genes que codifican para las cadenas ligera y pesada del anticuerpo YTH 12.5 (anti-CD3) (Routledge et al. 1991, Eur J Immunol 21: 2717-2725), del anti-CD3 según Arakawa et al.; 1996, J. Biochem. 120: 657-662. Las secuencias de ácido nucleico de dichos anticuerpos son fácilmente identificables a partir de las bases de datos usadas comúnmente por el experto en la materia. Es posible asimismo a partir de hibridomas disponibles del ATCC clonar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para las cadenas pesadas y/o ligeras de estos diferentes anticuerpos mediante los métodos de amplificación tales como la RT-PCR con la ayuda de oligonucleótidos específicos o las técnicas que usan bancos de ADNc (Maniatis et al., 1982, Molecular cloning. A laboratory manual CSH Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York). Las secuencias así clonadas están entonces disponibles para su clonación en unos vectores. Según un caso preferido de la invención, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la cadena pesada del anticuerpo se fusiona mediante la recombinación homóloga con la secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido transmembranario tal como la glucoproteína rábica o la gp160 (Polydefkis et al., 1990, J Exp Med 171: 875-887). Estas técnicas de biología molecular han sido perfectamente bien descritas.

Se elige expresar en la superficie de las células CPA in vivo unos fragmentos inmunógenos que corresponden a por lo menos un polipéptido de interés para la invención. Para ello, se puede elegir hacer expresar mediante el vector o bien el polipéptido completo, o bien de manera preferida unos polipéptidos seleccionados para reaccionar con unos ligandos y/o receptores específicos. El péptido inmunógeno codificado por el polinucleótido introducido en la célula del vertebrado in vivo se puede producir y/o segregar, preparar y después presentar a una célula presentadora del antígeno (APC) en el contexto de las moléculas del CMH. Las APC así transferidas in vivo inducen una respuesta inmune dirigida contra el inmunógeno expresado in vivo. Las APC poseen diferentes mecanismos para capturar los antígenos: (a) la captura de los antígenos mediante unos receptores membranarios tales como los receptores para las inmunoglobulinas (Fc) o para el complemento disponibles en la superficie de los granulocitos, de los monocitos o macrófagos que permiten una liberación eficaz del antígeno en los compartimentos intracelulares después de la fagocitosis mediada por los receptores, (b) la entrada en las APC por pinocitosis en fase fluida, implicando diferentes mecanismos: la micropinocitosis, es decir, la captura de pequeñas vesículas (0,1 \mum) mediante los pocillos recubiertos de clatrina y la macropinocitosis, es decir, la captura de vesículas más grandes (con un tamaño comprendido entre 0,5 \mum y aproximadamente 6 \mum) (Sallusto et al. 1995, J Exp Med 182:389-400). Mientras que la micropinocitosis existe de manera constitutiva en todas las células, la macropinocitosis se limita a unos tipos celulares, tales como por ejemplo los macrófagos, las células dendríticas, los astrocitos, las células epiteliales estimuladas por unos factores de crecimiento (Racoosin et al., J Cell Sci 1992, 102:867-880). En la presente invención, mediante la expresión "células capaces de macropinocitosis", se entiende las células que pueden realizar los acontecimientos descritos anteriormente y las células que pueden capturar unas macromoléculas preferentemente de entre 0,5 \mum y aproximadamente 6 \mum en el citoplasma.

Según un modo de realización particular, se modifican genéticamente en particular in vivo, las células efectoras citotóxicas o los linfocitos T helper de manera que expresan en su superficie un polipéptido de interés para la invención, unos ligandos de dichas proteínas, naturalmente no expresados por estas células, y capaces de inducir el procedimiento de activación de dichas células, mediante la introducción en estas células de secuencias de ácido nucleico que contienen el gen que codifica para dicho polipéptido. Es posible asimismo seleccionar una secuencia de ácido nucleico que contiene un gen de interés terapéutico que codifica para la totalidad o parte de un anticuerpo dirigido contra un polipéptido de interés para la invención, susceptible de ser expresado en la superficie de las células dianas del paciente a tratar, siendo dicho anticuerpo capaz de fijarse a un polipéptido naturalmente no expresado por estas células efectoras citotóxicas o linfocitos T helper.

Mediante la expresión "células efectoras citotóxicas", se entiende designar los macrófagos, los astrocitos, los linfocitos T citotóxicos (TLC) y las células asesinas (NK), así como sus derivados tales como, por ejemplo, los LAK (Versteeg 1992 lmmunology today 13:244-247; Brittende et al 1996, Cancer 77:1226-1243). Mediante la expresión "linfocitos T helper", se entiende designar en particular los CD4 que permiten después de la activación, la secreción de factores de activación de las células efectoras de la respuesta inmune. Los polipéptidos y en particular los receptores expresados en la superficie de estas células y que están implicados en la activación de dichas células consisten en particular en la totalidad o parte del complejo TCR o el CD3, la totalidad o parte de los complejos CD8, CD4, CD28, LFA-1, 4-1BB (Melero et al., 1998, Eur J Immunol 28:1116-1121), CD47, CD2, CD1, CD9, CD45, CD30, CD40, la totalidad o parte de los receptores de citoquinas (Finke et al., 1998, Gene therapy 5:31-39), tales como IL-7, IL-4, IL-2, IL-15 o GM-CSF, la totalidad o parte del complejo receptor de las células NK tal como, por ejemplo, NKAR, Nkp46; (Kawano et al., 1998 lmmunology 95:5690-5693; Pessino et al., 1998 J Exp Med 188: 953-960), Nkp44, la totalidad o parte de los receptores de macrófagos tales como, por ejemplo, el receptor Fc (Deo et al., 1997, lmmunology Today 18:127-135).

Se han desarrollado numerosas herramientas para introducir diferentes genes heterólogos y/o vectores en unas células, en particular unas células de mamíferos. Estas técnicas se pueden dividir en dos categorías: la primera categoría implica unas técnicas físicas tal como la micro-inyección, la electroporación o el bombardeo de partículas. La segunda categoría se basa en el uso de técnicas en biología molecular y celular con las cuales el gen se transfiere con un vector biológico o sintético que facilita la introducción del material en la célula in vivo. En la actualidad, los vectores más eficaces son los vectores víricos, en particular los adenovíricos y retrovíricos. Estos virus poseen unas propiedades naturales para atravesar las membranas plásmicas, evitar la degradación de su material genético e introducir su genoma en el núcleo de la célula. Estos virus han sido ampliamente estudiados y algunos ya se usan experimentalmente en unas aplicaciones humanas en vacunación, en inmunoterapia, o para compensar unas deficiencias genéticas. Sin embargo, este enfoque vírico adolece de unas limitaciones en particular debido a la capacidad de clonación restringida en estos genomas víricos, el riesgo de diseminar las partículas víricas producidas en el organismo y en el entorno, el riesgo de mutagénesis artefactual por inserción en la célula hospedante en el caso de los retrovirus, y la posibilidad de inducir una fuerte respuesta inmune inflamatoria in vivo durante el tratamiento, lo que limita el número de inyecciones posibles (Mc Coy et al. 1995, Human Gene Therapy 6: 1553-1560; Yang et al., 1996 lmmunity 1: 433-422). Existen otros sistemas alternativos a estos vectores víricos. El uso de métodos no víricos como, por ejemplo, la co-precipitación con el fosfato de calcio, el uso de receptores que imitan los sistemas víricos (para un resumen véase Cotten y Wagner 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4: 705-710), o el uso de polímeros tales como las poliamidoaminas (Haensler y Szoka 1993, Bioconjugate Chem 4: 372-379). Otras técnicas no virales se basan en el uso de liposomas cuya eficacia para la introducción de macromoléculas biológicas como el ADN, el ARN de las proteínas o de las sustancias farmacéuticas activas ha sido ampliamente descrito en la bibliografía científica. En este campo, unos equipos han propuesto el uso de lípidos catiónicos que tienen una fuerte afinidad para las membranas celulares y/o los ácidos nucleicos. De hecho, se ha demostrado que una molécula de ácido nucleico en sí podía atravesar la membrana plásmica de ciertas células in vivo (WO 90/11092), siendo la eficacia dependiente en particular de la naturaleza polianiónica del ácido nucleico. Desde 1989 (Felgner et al., Nature 337: 387-388) los lípidos catiónicos han sido propuestos para facilitar la introducción de moléculas aniónicas amplias, lo que neutraliza las cargas negativas de estas moléculas y favorece su introducción en las células. Diferentes equipos han desarrollado dichos lípidos catiónicos: el DOTMA (Felgner et al., 1987, PNAS 84: 7413-7417), el DOGS o Transfectam^{TM} (Behr et al., 1989, PNAS 86: 6982-6986), el DMRIE y el DORIE (Felgner et al., 1993 methods 5: 67-75), el DC-CHOL (Gao y Huang 1991, BBRC 179: 280-285), el DOTAP^{TM} (McLachlan et al., 1995, Gene therapy 2: 674-622) o la Lipofectamina^{TM}, y las demás moléculas descritas en las patentes W09116024, W09514651 W09405624. Otros grupos han desarrollado unos polímeros catiónicos que facilitan la transferencia de macromoléculas, en particular unas macromoléculas aniónicas en las células. La patente WO 95/24221 describe el uso de polímeros dendríticos, el documento WO 96/02655 describe el uso de la polietilenimina
o polipropilenimina, y los documentos US-A-5.595.897 y FR 2 719 316, el uso de los conjugados polilisina.

Puesto que se desea obtener in vivo una transformación apuntada hacia un tipo celular dado, resulta evidente que el vector usado debe poder ser él mismo "diana", tal como se ha descrito anteriormente.

Uso de células transformadas in vivo o ex vivo con unos vectores que contienen un gen de interés terapéutico definido con relación a los polipéptidos de interés para la invención

Todos los enfoques vacunales no son siempre satisfactorios y conducen por ejemplo a unas reacciones inmunes limitadas dirigidas únicamente contra epítopos inmunodominantes o contra unos antígenos que presentan una gran variabilidad. Asimismo, la presentación incorrecta de los antígenos por las glucoproteínas del sistema CMH en la superficie de las células, no permite desarrollar en el paciente tratado una inmunidad anti-proteína de interés conveniente. Con el fin de paliar estos problemas, ciertos autores han propuesto en el marco de dichos procedimientos vacunales, seleccionar los fragmentos mínimos antigénicos que corresponden a las porciones de péptido susceptibles de ser reconocidos específicamente por los linfocitos T citotóxicos, de expresarlos en las células con el fin de que se asocien a las moléculas del CMHII y que sean presentados en la superficie de las células para inducir en el paciente tratado una reacción inmunitaria perfectamente apuntada (Toes et al. 1997, PNAS 94: 14660-14665). Más particularmente, se ha demostrado que unos epítopos de tamaño muy pequeño (comprendido entre 7 y aproximadamente 13 aminoácidos) que son expresados a partir de minigenes introducidos en un virus de la vacuna, podían inducir una inmunización de tipo celular. Por otro lado, se ha demostrado que varios minigenes podían ser expresados conjuntamente a partir de un mismo vector (esta construcción particular se denomina "string of beads"). Dicha construcción presenta la ventaja de inducir una reacción inmune de tipo CTL sinérgica (Whitton et al.; 1993 J. of Virology 67: 348-352).

Protocolo de puesta en contacto de las células y del fragmento antigénico

La presentación de los fragmentos antigénicos por las moléculas CMHI se basa en un procedimiento intracelular identificado (véase Groettrup et al., 1996 lmmunology Today 17: 429-435 para un repaso) durante el cual unos péptidos antigénicos de tamaños muy cortos (aproximadamente 7 a 13 aminoácidos) son producidos mediante degradación de un polipéptido más complejo contra el cual la reacción inmune final estará dirigida. Estos péptidos cortos se asocian después a las moléculas del CMHI o del CMHII para formar un complejo proteico que se transporta a la superficie celular con el fin de presentar dichos péptidos a los linfocitos T citotóxicos circulantes o a los linfocitos T helper circulantes, respectivamente. Conviene además observar que la especificidad de las moléculas CMH I o CMH II frente a unos péptidos antigénicos varía en función de las moléculas CMH I o CMH II (ejemplo para el CMHI: HLA-A, HLA-B, etc.) y del alelo (ejemplo para el CMH I: HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11) considerados. En el seno de una misma especie animal, de un individuo a otro, existe una gran variabilidad de los genes que codifican para las moléculas del sistema CMH (a este respecto, véase en particular George et al., 1995, lmmunology Today 16: 209-212).

Según un modo de realización particular, las células tales como las células dendríticas, los macrófagos, los astrocitos, los linfocitos T CD4+, los linfocitos T CD8+, se modifican de manera que expresan en su superficie unos anticuerpos específicos del péptido apuntado. El péptido es neutralizado por los anticuerpos expresados en la superficie de las células. Estas células son preferentemente inmunes, preferentemente del paciente, preferentemente citotóxicas, modificadas para expresar la totalidad o parte de un anticuerpo específico del polipéptido diana.

Aislamiento de células mononucleadas a partir de sangre periférica

En 1968, Boyum describió una técnica rápida que permite, mediante centrifugación de la sangre sobre gradiente de densidad, separar las células mononucleadas (linfocitos y monocitos) con un buen rendimiento (rendimiento teórico de 50%, es decir, 10^{6} células/ml de sangre). Se centrifugan 50 ml de sangre periférica extraída estérilmente en unos tubos heparinizados durante 20 minutos a 150 g a 20ºC. Las células recuperadas se diluyen en dos volúmenes de sangre periférica inicial de PBS estéril. Se depositan 10 ml de esta suspensión sobre 3 ml de una disolución de Ficoll-Hypaque (medio de separación de los linfocitos, Flow). Después de la centrifugación durante 20 minutos a 400 g y 20ºC sin desaceleración, las células mononucleadas se sedimentan en la interfaz PBS-Ficoll, en una capa densa, opalescente, mientras que la casi totalidad de los glóbulos rojos y de los polinucleares se sedimentan en el fondo del tubo. Las células mononucleadas se recuperan y se lavan en PBS estéril.

Internalización de los antígenos mediante las células presentadoras del antígeno

Tratamiento previo de las células presentadoras del antígeno: las células presentadoras del antígeno se lavan previamente con un tampón PBS-BSA al 0,5% (p/v) después se enumeran, y se pre-incuban a continuación en presencia de diferentes inhibidores de reducción tres veces en PBS-BSA al 0,5% que contiene de 10 \muM a 10 mM final de DTNB (ácido 5-5'-ditio-bis-2-nitrobenzoico) o de NEM (N-etilmaleimida). Las etapas ulteriores de fijación de antígenos en la superficie celular o de internalización de antígenos se realizan asimismo en presencia de las diferentes concentraciones de inhibidores.

Protocolo de internalización de los antígenos mediante las células presentadoras del antígeno

Se internalizan 8\cdot10^{6} células en presencia de una cantidad saturante de proteínas radiomarcadas con yodo 125 (1 \mug) en unos micropocillos en 70 \mul. Después de una hora de incubación a 4ºC con agitación, los antígenos se fijan en la superficie de las células. La suspensión celular se lava dos veces en PBS-BSA, y los residuos celulares se recogen en 70 \mul de tampón y se incuban a 37ºC durante diferentes periodos que alcanzan hasta 2 horas. Las células y los sobrenadantes se separan mediante centrifugación a 800 g durante 5 minutos a 4ºC. Para periodos más largos de incubación, se suprime la etapa preliminar de pre-fijación de los antígenos en la superficie de las células. Las células se diluyen en un medio RPMI-SVF al 10% en presencia de 20 mM de Hepes, con 10^{6} células/ml. Las células se incuban en presencia de un exceso de antígeno durante diferentes periodos a 37ºC (1 \mug de moléculas/5\cdot10^{7} células monocitos/macrófagos o/10^{8} células B-EBV).

Todos los agentes terapéuticos definidos en el marco de la presente descripción se usan para prevenir y/o tratar la esclerosis en placas, solos o en combinación. Se pueden usar asimismo para evaluar su eficacia in vitro o in vivo.

Administración en el ser humano de los agentes terapéuticos

El material biológico según la invención se puede administrar in vivo en particular en forma inyectable. Se puede prever asimismo una inyección por vía epidérmica, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intracerebral, mediante jeringa o cualquier otro medio equivalente. Según otro modo de realización, mediante administración oral o cualquier otro medio perfectamente conocido por el experto en la materia y aplicable a la presente invención. La administración se puede realizar en una única dosis o repetida, una o varias veces después de un cierto tiempo de intervalo. La vía de administración y la dosificación más apropiadas varían en función de diferentes parámetros tales como, por ejemplo, el individuo o la enfermedad a tratar, del estado y/o de la evolución de la enfermedad, o también del ácido nucleico y/o de la proteína y/o del péptido y/o de la molécula y/o de la célula a transferir o del órgano/tejido diana.

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Para la realización del tratamiento del mamífero mencionado en la presente invención, es posible disponer de composiciones farmacéuticas que comprenden un material biológico tal como se ha descrito anteriormente, ventajosamente asociado con un vehículo farmacéuticamente aceptable para la administración al ser humano o al animal. El uso de dichos soportes se describe en la bibliografía (véase por ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª ed. 1980, Mack Publishing Co). Este vehículo farmacéuticamente aceptable es preferentemente isotónico, hipotónico o presenta una baja hipertonicidad y tiene una fuerza iónica relativamente baja, tal como, por ejemplo, una disolución de sacarosa. Por otra parte, dicha composición puede contener unos disolventes, unos vehículos acuosos o parcialmente acuosos tales como agua estéril, libre de agente pirógeno y unos medios de dispersión por ejemplo. El pH de estas composiciones farmacéuticas se ajusta y se tampona convenientemente según las técnicas habituales.

Figuras

La figura 1 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína GM2AP.

La figura 2 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína MRP 14.

La figura 3 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína Saposina.

La figura 4 representa la dosificación de la proteína MRP8 (ng/ml - en ordenadas) en las orinas de pacientes que padecen esclerosis en placas (SEP), en las orinas de pacientes que padecen otras enfermedades neurológicas (AMN) y en las orinas de controles considerados sanos (TS). n significa el número de orinas ensayadas por categoría.

La figura 5 representa la dosificación de la proteína MRP14 (ng/ml - en ordenadas) en las orinas de pacientes que padecen esclerosis en placas (SEP), en las orinas de pacientes que padecen otras enfermedades neurológicas (AMN) y en las orinas de controles considerados sanos (TS). n significa el número de orinas ensayadas por categoría.

La figura 6 representa la dosificación de la proteína MRP8/14 (ng/ml - en ordenadas) en las orinas de pacientes que padecen esclerosis en placas (SEP), en las orinas de pacientes que padecen otras enfermedades neurológicas (AMN) y en las orinas de controles considerados sanos (TS). n significa el número de orinas ensayadas por categoría.

La figura 7 representa las concentraciones medias de las proteínas MRP8, MRP14, MRP8/14 (ng/ml - en ordenadas) en las orinas de pacientes que padecen esclerosis en placas (SEP), en las orinas de pacientes que padecen otras enfermedades neurológicas (AMN) y en las orinas de controles considerados sanos (TS). n significa el número de orinas ensayadas por categoría.

La figura 8 representa la dosificación de la proteína GM2AP (ng/ml - en ordenadas) en las orinas de pacientes que padecen esclerosis en placas (SEP), en las orinas de pacientes que padecen otras enfermedades neurológicas (AMN) y en las orinas de controles considerados sanos (TS). n significa el número de orinas ensayadas por categoría. MS significa SEP, OND significa AMN y Healthy significa extracciones de controles supuestos sanos (TS).

La figura 9 representa la dosificación de la proteína Saposina B (\mug/ml - en ordenadas) en las orinas de pacientes que padecen esclerosis en placas (SEP), en las orinas de pacientes que padecen otras enfermedades neurológicas (AMN) y en las orinas de controles considerados sanos (TS). n significa el número de orinas ensayadas por categoría. MS significa SEP, OND significa AMN y Healthy significa extracciones de controles supuestos sanos (TS).

La figura 10 representa: figura 10A, la dosificación de la proteína GM2AP en ng/ml en las orinas de un paciente SEP en forma remitente progresiva (curva clara) y la gliotoxicidad en porcentaje de células muertas estimadas por el ensayo MTT (curva oscura); figura 10B, la dosificación de la proteína Saposina B en \mug/ml en las orinas de un paciente SEP en forma remitente progresiva (curva clara) y la gliotoxicidad en porcentaje de células muertas estimadas por el ensayo MTT (curva oscura).

La figura 11 representa el producto de las concentraciones de las proteínas GM2AP y Saposina B en ngx\mug/ml^{2} en las orinas de un paciente SEP en forma remitente progresiva (curva clara) y la gliotoxicidad en porcentaje de células muertas estimadas por el ensayo MTT (curva oscura).

La figura 12: figura 12A, la dosificación de la proteína GM2AP en ng/ml en las orinas de un paciente SEP en forma progresiva (curva clara) y la gliotoxicidad en porcentaje de células muertas estimadas por el ensayo MTT (curva oscura); figura 12B la dosificación de la proteína Saposina B en \mug/ml en las orinas de un paciente SEP en forma progresiva (curva clara) y la gliotoxicidad en porcentaje de células muertas estimadas por el ensayo MTT (curva oscura).

La figura 13 representa el producto de las concentraciones de las proteínas GM2AP y Saposina B en ngx\mug/ml^{2} en las orinas de un paciente SEP en forma progresiva (curva clara) y la gliotoxicidad en porcentaje de células muertas estimadas por el ensayo MTT (curva oscura).

La figura 14 representa la correlación entre las concentraciones en GM2AP (ng/ml - en ordenadas izquierda), las concentraciones en Saposina B (\mug/ml - ordenadas derecha) y la gliotoxicidad en porcentaje de células muertas estimadas mediante el ensayo MTT (en abscisas). Dos rectas de correlación estimadas se representan en el gráfico. Las líneas en negrita se refieren a las concentraciones en Saposina B; las líneas en negro claro se refieren a las concentraciones en GM2AP.

Ejemplos Ejemplo 1 Recogida y grupos de orinas

Se han extraído unas muestras de orina de volúmenes diferentes a partir de individuos sanos (SEP negativos) que no tienen aparentemente ninguna enfermedad neurológica o auto-inmune. Se ha ensayado la actividad tóxica de cada extracción frente a células astrocitarias murinas in vitro usando el ensayo MTT. En total, se ha constituido un grupo de 20 litros de orina (grupo SEP negativo). Paralelamente, se han extraído unas muestras de orina de volúmenes diferentes a partir de individuos que padecen esclerosis en placas (SEP positivos) en diferentes etapas de la enfermedad. Se ha ensayado la actividad tóxica de cada extracción frente a células astrocitarias murinas in vitro usando el ensayo MTT. En total, se ha constituido un grupo de 80 litros de orina (grupo SEP positivo).

Ejemplo 2 Purificación de las proteínas urinarias

Los grupos de orina SEP positivo y SEP negativo, recogidos y ensayados según el ejemplo 1, han sido purificados para obtener una concentración en proteínas elevada y eliminar al máximo las proteínas de alto peso molecular.

Precipitación: se han efectuado unas precipitaciones con sulfato de amonio (Prolabo - ref. 21 333 365) sobre los grupos de orina SEP positivo y SEP negativo. Se ha usado el porcentaje de 60% de sulfato de amonio saturado para 40% de orina, es decir, 390 gramos de sulfato de amonio por litro de orina. Cada grupo se ha repartido en fracciones de 1,8 litros en unos frascos de 2 litros para mejorar la precipitación. Se ha efectuado la precipitación durante 2 x 8 horas, a temperatura ambiente, con agitación suave. Después de la centrifugación de los grupos de orina a 3.000 rpm durante 10 min, a una temperatura de 10ºC, el residuo obtenido se recoge en un tampón Tris 20 mM que contiene CaCl_{2} 1 mM y urea a 0,25 M. Después la mezcla se ha centrifugado a 3.000 rpm durante 10 min. El sobrenadante contiene las proteínas concentradas. Se usa o bien inmediatamente para la etapa siguiente, o bien se congela si la etapa siguiente no se puede efectuar en continuo.

Cromatografía por intercambio de iones: se ha pasado después la disolución que contiene las proteínas sobre un gel DEAE fast Flow (comercializado por PHARMACIA). Esta etapa se efectúa a baja presión sobre una columna PHARMACIA llena de gel. Los tampones se llevan a la columna mediante una bomba peristáltica que permite un caudal regular. El tampón de equilibrado de la columna es el tampón Tris 20 mM, pH 7. La fracción que corresponde al sobrenadante de precipitación y que contiene una cantidad de sales demasiado elevada se dializa contra este tampón antes de su depósito sobre la columna. Una elución mediante un gradiente salino permite recuperar las proteínas. El gradiente de elución se efectúa por niveles de NaCl 100, 200, 300, 500 mM en el tampón de equilibrado de la columna. Las fracciones de elución se ensayan mediante el ensayo MTT y se conservarán solamente las fracciones positivas, es decir, la fracción eluida a 200 mM NaCl. Estas fracciones podrán ser tratadas inmediatamente o conservadas en el estado liofilizado.

Purificación: Se ha usado una cromatografía de exclusión estérica basada en la diferencia de tamaño y de forma de las proteínas a eluir. La fracción que corresponde a la elución 200 mM NaCl se deposita sobre la columna. Durante la elución, las proteínas de baja masa molecular son retenidas y por lo tanto se eluyen más tarde que las moléculas grandes. Se han efectuado las purificaciones sobre HPLC con una columna TosoHaas TSK Prep G 3000 SW, de un diámetro de 21,5 mm y de una longitud de 300 mm, y el límite de exclusión en masa molecular es de 500.000 daltons. El tampón de elución usado contiene fosfato 100 mM, sulfato de sodio 100 mM, a pH 6,8. La separación de la mezcla de proteínas se ha efectuado en 60 minutos. Se ha conservado sólo la fracción que corresponde a una masa de 15-20.000 daltons. Esta fracción se dializa en un tampón Tris 20 mM que contiene CaCl_{2} 0,2 mM, pH 7,2, y después se liofiliza.

En cada etapa, sólo se han conservado las fracciones que presentan una actividad tóxica significativa para la etapa siguiente. Se ha efectuado un control de la actividad tóxica de las proteínas en cada etapa, con la ayuda del ensayo MTT. Sólo se han conservado las fracciones que presentan una actividad tóxica significativa para la etapa de purificación suplementaria descrita en el ejemplo 3.

Ejemplo 3 Purificación suplementaria de las proteínas urinarias mediante cromatografía en fase inversa

Se han recogido en agua destilada unos grupos de orina que proceden de pacientes SEP (grupo SEP positivo) y de pacientes no SEP (grupo SEP negativo), obtenidos después de la purificación según el ejemplo 2, y después se han diluido con una disolución TFA al 0,2%/acetonitrilo al 10% para obtener una concentración final de aproximadamente 130 a 140 \mug/ml.

Se ha efectuado la separación mediante HPLC de fase inversa C8 sobre una columna Brownlee Aquapore (nombre comercial) comercializada por la compañía Perkin Elmer (características de la columna: 300 angstroms/7 \mum/(100 x 4,6 mm). Se han usado respectivamente dos columnas distintas para los grupos positivo y negativo. Se han realizado las inyecciones mediante multi-inyecciones de 250 \mul. Se han eluido las proteínas con un gradiente lineal de 5% a 15% de tampón B en 5 min, y después de 15% a 100% de tampón B en 95 min, con un caudal de 0,5 ml/min. Los tampones de separación A y B usados son respectivamente el tampón TFA al 0,1% (Pierce nº 28904)/agua MilliQ y el tampón TFA al 0,09%/acetonitrilo al 80% (Baker). Se ha efectuado la detección mediante la medición de la absorbancia UV a 205 y 280 nm. Se ha efectuado la recogida de las fracciones en fracciones de 1,5 ml y de 0,5-1 ml en la zona de interés. Se han congelado las fracciones después de la recogida en hielo seco.

Las fracciones recogidas se han secado a continuación en speed vac y se han recuperado en 100 \mul de TFA al 0,1%/acetonitrilo al 20%. Se han transferido 20 \mul de las fracciones en unos eppendorfs de 500 \mul, se han secado y lavado dos veces con 100 \mul de agua MilliQ, y después se han secado nuevamente.

La actividad tóxica de las proteínas contenidas en cada fracción recogida después de la elución ha sido determinada con la ayuda del ensayo MTT. Sólo se ha considerado la fracción 21 que presenta una actividad tóxica significativa: el número de esta fracción corresponde al orden de la elución en función de las condiciones enunciadas en este ejemplo.

Ejemplo 4 Análisis de las proteínas obtenidas mediante separación sobre HPLC sobre gel SDS-TRICINA

El grupo de recogida de la fracción 21 obtenida mediante HPLC, tal como se ha descrito en el ejemplo 3, y que procede de 20 inyecciones del grupo SEP positivo, se ha depositado sobre un gel SDS-TRICINA al 16% pre-vertido de 10 pocillos y de 1 mm de espesor (comercializado por la compañía Novex). Las condiciones de uso del gel corresponden a las preconizadas por el fabricante. La muestra se recupera en 75 \mul de tampón de muestra una vez concentrado (SDS-TRICINA nº LC 1676, 1 ml dos veces concentrado + 50 \mul de \beta-mercaptoetanol (Pierce) diluido al 1/2 en agua) y 25 \mul de la muestra de depositan sobre el gel en tres veces. El grupo de recogida de la fracción 21 que procede de 6 inyecciones del grupo SEP negativo se ha depositado sobre el gel en las mismas condiciones que las descritas para el grupo SEP positivo. La migración sobre los dos geles se ha efectuado en paralelo en la misma cuba de migración (XCELL II NOVEX (nombre comercial)) a un voltaje constante de 125 mV durante 2 horas. La cuba se dispone en un tanque que contiene hielo. Se han coloreado los geles directamente después de la migración mediante coloración con zinc/imidazol (kit de coloración 161-0440 comercializado por la compañía BIORAD) para obtener una coloración negativa reversible. Las bandas de proteínas son translúcidas sobre fondo opaco.

Ejemplo 5 Digestión con tripsina de las bandas de gel

Todas las bandas de proteínas visualizadas en los depósitos de la fracción 21 han sido cortadas y sometidas a una proteolisis mediante tripsina.

Las bandas de geles se cortan con escalpelo en láminas de 1 mm y se transfieren a unos tubos eppendorfs. Los eppendorfs se someten a un pico de centrifugación para hacer caer los trozos de gel y, después de la centrifugación, se añaden 100 \mul de tampón de lavado (100 mM NHaCO_{3}/CH_{3}CN al 50%) a los trozos de gel. Después de 30 min de agitación a temperatura ambiente, se retira el sobrenadante por fracciones de 20 \mul, y se renueva la etapa de lavado dos veces. Los eppendorfs se secan durante 5 min en speed vac. Se recuperan 20 \mug de tripsina (Modified sequenal grade PROMEGA V5111) en 200 \mul de tampón de digestión (5 mM TRIS, pH 8) y se disuelven durante 30 min a temperatura ambiente, con agitación intermitente, y se añaden 20 a 30 \mul de tripsina resuspendida a los trozos de gel. Se centrifugan los eppendorfs y se conservan en cámara caliente a 28ºC durante la noche. Después de la digestión, las bandas de gel se pueden usar inmediatamente para las mediciones de masas o congelar para un uso ulterior.

Ejemplo 6 Digestión química con CNBR de las bandas de gel

En la eventualidad de una proteína resistente a las escisiones enzimáticas, en particular a la acción de la tripsina tal como se ha descrito en el ejemplo 5, se han tratado las bandas entre 16 kD y 20 kD con CNBR. Las bandas de gel, ya usadas para las digestiones con la tripsina, se secan durante 5 a 10 min en speed vac. Se ha preparado una disolución de CNBR (FLUKA) a 200 mg/ml en 70% de ácido fórmico (BAKER). Se han usado 20 \mul de esta disolución para rehidratar los trozos de gel. La reacción se realiza durante 20 h a temperatura ambiente y en oscuridad. Los péptidos se extraen 3 veces durante 30 min con 100 \mul de TFA al 0,1%/acetonitrilo al 60%. Las disoluciones de extracción se reúnen y se concentran hasta 20 \mul. Estas muestras se diluyen 5 veces en TFA al 0,1%/agua. Las condiciones de separación son las descritas para los péptidos de la digestión con la tripsina.

Ejemplo 7 Análisis mediante espectrometría MALDI-TOF

Se añaden 30 \mul de tampón de extracción (TFA al 2%/acetonitrilo al 50%) a las muestras. Los eppendorfs a analizar se someten a una centrifugación de 5 min, y después a una sonicación de 5 min y por último a una centrifugación de 1 min. En un disco de acero inoxidable, se realizan 14 depósitos de 0,5 \mul de matriz (ácido \alpha-ciano-4-hidroxi-trans-cinámico con saturación en acetona). Se obtiene una fina capa microcristalina uniforme. Se depositan 0,5 \mul de una disolución de TFA al 2%/agua sobre esta sub-capa sobre los 14 depósitos, y después se añaden 0,5 \mul de muestra a analizar. En esta gota así formada, se añaden 0,5 \mul de una disolución a saturación de ácido de ácido \alpha-ciano-4-hidroxi-trans-cinámico en acetonitrilo al 50%/agua. Después de un secado a temperatura ambiente durante 30 min, los depósitos cristalinos se lavan con 2 \mul de agua que se evacuan inmediatamente mediante un soplo de aire. Todos los espectros se obtienen sobre un espectrómetro de masas BRUKER BIFLEX (marca comercial) equipado de un reflectrón. Las mediciones (90 a 120 tiros láser sobre el conjunto del depósito) se acumulan para obtener un espectro de masas que sea lo más representativo del conjunto de los péptidos presentes en el sándwich matriz-muestra. Para cada depósito, se ha realizado una calibración con los péptidos de la autolisis de la tripsina con el fin de poder usar una precisión de medición inferior a 100 ppm. Las búsquedas en los bancos de datos se han realizado en MS-FIT PROTEINPROSPECTOR (http://prospector.ucsf.edu). Los parámetros comunes, usados en estas búsquedas son (1) base de datos: NCBlnr, (2) una tolerancia de 100-50 ppm, (3) las cisteínas no están modificadas, (4) las metioninas pueden estar
oxidadas, (5) intervalo de peso molecular: 1.000-100.000 Da, (6) hasta 3 sitios de corte pueden ser ignorados.

Ejemplo 8 Secuenciación N-terminal de los péptidos de digestión (i) Extracción y separación mediante HPLC de los péptidos de digestión

Después de las mediciones de masa sobre la totalidad de la digestión, se extrae el resto de los péptidos en 3 veces 30 min en un baño de sonicación con TFA al 0,1%/acetonitrilo al 60%. Las disoluciones de extracción se reúnen y se secan hasta 20 \mul en speed vac. Después de la dilución en 80 \mul de tampón A (TFA al 0,1%/agua), las extracciones de las bandas de gel, digeridas con tripsina, se inyectan sobre una columna C18/MZ-Vydac/(125 x 1,6)mm/5 \mum. La elución de los péptidos se realiza a un caudal de 150 \mul/min y en un gradiente comprendido entre 5% de tampón B (TFA al 0,09%/acetonitrilo al 80%) y 40% de tampón B en 40 min, y después entre 40% de tampón B y 100% de tampón B en 10 min. La detección se realiza mediante la medición de la absorbancia UV a 205 m. La recogida de los picos se efectúa en unos tubos eppendorfs de 500 \mul. Las fracciones se conservan sobre hielo, y para la banda de 18-20 kD del grupo 21 SEP positivo, se analizan mediante espectrometría de masas MALDI-TOF.

(ii) Secuenciación N-terminal

Se han analizado las fracciones que corresponden a un único pico de masas mediante degradación de Edman sobre un secuenciador (modelo 477A PERKIN ELMER/Applied Biosystems). Las condiciones de secuenciación son las descritas por el fabricante. Se ha usado un microcartucho para el depósito de las muestras, y se han identificado los PTH-AminoAcid con un sistema HPLC online (modelo 120A PERKIN ELMER/Applied Biosystems).

El depósito de la fracción a secuenciar se ha realizado en varios depósitos de 15 \mul con unos secados intermedios. El tubo que ha contenido el péptido se lava con 15 \mul de ácido fórmico al 85% (BAKER). Las secuencias de aminoácidos corresponden siempre a las masas medidas. Los péptidos, cuyas masas no corresponden a la proteína principal identificada, han sido secuenciados en prioridad. De esta manera, ha sido posible identificar hasta tres proteínas en una banda de gel.

Ejemplo 9 Resultados y discusión

Después de la HPLC inversa del grupo de control SEP negativo y del grupo SEP positivo, se ha determinado la actividad tóxica de cada fracción de elución usando el ensayo MTT. Sólo la fracción 21 del grupo SEP positivo presenta una actividad tóxica in vitro. La fracción 21 del grupo de control SEP negativo no presenta ninguna actividad tóxica. Se ha confirmado la actividad tóxica de la fracción 21 del grupo SEP positivo in vitro mediante FACS, tal como se describe en la solicitud de patente WO 98/11439 sobre unas células astrocitarias murinas.

Se ha observado el contenido proteico de la fracción 21 del grupo de control SEP negativo y del grupo SEP positivo después de la separación sobre gel SDS-TRICINA al 16% y de la coloración del gel con zinc/imdazol. Se han encontrado unas proteínas de pesos moleculares aparentes elevados en las dos fracciones. Por el contrario, cinco bandas diferentes y de pesos moleculares aparentes bajos son visibles sólo en la fracción 21 del grupo SEP positivo (bandas 8, 14, 18 y 20 kD). A cada banda corresponde por lo menos una proteína y unas variantes de dichas proteínas que tienen un peso molecular aparente próxima del de la proteína nativa. Estas secuencias variantes presentan un porcentaje de homología o de identidad con las secuencias nativas de por lo menos 70%, preferentemente de por lo menos 80% y ventajosamente de por lo menos 98%.

Las proteínas de interés de la fracción 21 del grupo SEP positivo se analizan a continuación mediante espectrometría de masas y/o secuenciación y búsqueda de homología en los bancos de datos. Los resultados muestran la presencia de cinco bandas de proteínas que migran entre 22 y 5 kD en la fracción 21 del grupo SEP positivo y unas variantes de dichas proteínas.

Estas proteínas son el fragmento C-terminal del Perlecan, que empieza en el aminoácido 3464 y termina en el aminoácido 3707 de la secuencia proteica completa, identificada en el identificador de secuencias SEC ID nº 2, el precursor de la proteína plasmática de unión al retinol cuya secuencia se proporciona en la SEC ID nº 4, la proteína activadora del gangliósido GM2 identificada en la SEC ID nº 8, la calgranulina B identificada en la SEC ID nº 17 y la Saposina B representada en la SEC ID nº 24. Tal como se ha descrito anteriormente, se han identificado asimismo unos homólogos o unas variantes de dichas proteínas mediante secuenciación. Estas secuencias proteicas homólogas o variantes son el producto de mutaciones a nivel de los genes que codifican para dichas proteínas. A título de ejemplo, la SEC ID nº 9 presenta 99% de homología o de identidad con la SEC ID nº 8 de la proteína activadora del gangliósido GM2, y el fragmento de SEC ID nº 9 que empieza en el aminoácido 34 y termina en el aminoácido 202 presenta 98,88% de
homología o de identidad con el fragmento correspondiente de la proteína nativa identificada en la SEC ID nº 8.

Ejemplo 10 Puesta en evidencia de las proteínas en una muestra urinaria

Se han extraído unas muestras de orina que proceden de un individuo SEP negativo y de un paciente SEP positivo. Estas muestras de orina han sido purificadas según el protocolo descrito anteriormente. Las fracciones de elución finales 21 han sido analizadas separadamente mediante espectrometría de masas. El perfil de masa de cada fracción que corresponde a cada muestra de orina ha sido comparado con el perfil de masas obtenido para las proteínas identificadas en los ejemplos anteriores. Los resultados muestran que para la muestra de orina que procede del paciente SEP positivo las masas corresponden a las moléculas (i) fragmento C-terminal del Perlecan, (ii) precursor de la proteína activadora del gangliósido GM2, (iii) calgranulina B y (iv) Saposina B identificadas anteriormente. Por el contrario, no se ha identificado ninguna de estas masas en el perfil de masa obtenido después del análisis de la muestra de orina procedente del individuo SEP negativo. El procedimiento descrito se puede utilizar como ensayo de diagnóstico.

Ejemplo 11 Ensayo en transferencia western

Se han realizado unas transferencias western sobre diferentes fracciones de orina en bruto o purificada tal como se ha descrito en el ejemplo 2. En paralelo, se ensayan unas muestras de orina que proceden de individuos sanos y de pacientes que padecen esclerosis en placas. Las muestras se depositan sobre un gel de electroforesis que permite separar las diferentes proteínas en función de su masa molecular bajo la acción de un campo eléctrico. Las transferencias western se realizan después de la transferencia de las proteínas del gel sobre una membrana. Para revelar las proteínas transferidas, la membrana se satura con tampón de saturación, y después se incuba con un anticuerpo directamente marcado con fosfatasa alcalina. El anticuerpo usado es un anticuerpo anti-calgranulina (anticuerpo monoclonal de ratón, clon CF 145 sub-tipo IgG 2b comercializado por la compañía Valbiotech: referencia MAS 696p lote PC96G696). El sustrato de la enzima es el dicloruro de 3,3'-(1,1'-bifenil)4,4'diazonio y se añade 2-naftalenil fosfato de sodio (comercializado con la denominación \beta Naphtyl acid phosphate Sigma ref. N7375 y/o dianisine Tetrazotized D3502) para la revelación de las bandas y la visualización de las proteínas unidas al anticuerpo. Una molécula de masa molecular aparente de aproximadamente 14.000 se revela en las orinas purificadas de pacientes que padecen SEP, con una señal relativamente intensa. Esta proteína corresponde a la calgranulina B (masa molecular aparente: 14 kD). Por el contrario, no se observa ninguna señal a partir de orina de individuos sanos. Esta observación confirma la presencia de esta proteína específicamente en las orinas de pacientes que padecen SEP y la realización de un procedimiento de detección que usa un anticuerpo que reconoce la proteína.

Ejemplo 12 Producción de anticuerpos monoclonales

La producción de anticuerpos monoclonales mediante ascitis impone una compatibilidad del sistema H-2 entre el hibridoma y el ratón productor. Veinte ratones hembras Balb/c, de 6 semanas de edad sufren una inyección de 0,5 ml de Pristane (2-6-10-14 ácido tetrametilpentadecano) en su cavidad peritoneal, para la producción de ascitis (Porter et al., 1972). Una semana a 10 días más tarde, se inyectan 5\cdot10^{6} a 10\cdot10^{6} hibridomas diluidos en 0,5 ml de tampón estéril NaCl 0,145M, Na_{2}HPO_{4} 10 mM, Kcl 2,7 mM, KH_{2}PO_{4} 1,5 mM a pH 7,4, por vía intraperitoneal. La ascitis aparece una a dos semanas más tarde. Los líquidos de ascitis presentes en la cavidad peritoneal se recogen entonces con una jeringa después de la incisión del peritoneo. El líquido recogido se centrifuga a 3.000 g durante 15 minutos a temperatura ambiente, se filtra sobre gasa para eliminar la grasa, y después se tampona añadiendo 1/20º de su volumen de tris-HCl 1M a pH 8,0. Este método permite obtener unas cantidades de anticuerpos 10 veces superiores a las obtenidas mediante el cultivo de hibridomas.

Las inmunoglobulinas presentes en el líquido de ascitis se liberan mediante las sales (sulfato de amonio o sulfato de sodio). El líquido de ascitis se precipita mediante el sulfato de amonio al 40%. Después de 20 minutos en frío la disolución se centrifuga durante 15 minutos a 8.000 g a 4ºC. El precipitado se lava y se resuspende en frío en una disolución de sulfato de amonio al 40%, y después se centrifuga nuevamente. El nuevo precipitado enriquecido con IgG se pone de nuevo en disolución en tampón PBS y se dializa durante una noche contra el tampón Tris-HCl 25 mM, NaCl 150 mM pH 7,4. Paralelamente, una columna de agarosa-Proteína A (o proteína G) (comercializada en forma dializada, Pierce) se lava extensivamente con el tampón Tris-HCl 25 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4. La disolución enriquecida con IgG se deposita sobre la columna y después se lava la columna. Los IgG retenidos por la columna se eluyen a pH ácido (glicina 200 mM pH 2,8). Las fracciones eluidas se neutralizan con un volumen de Tris-Base 1M pH 10,5. El contenido en inmunoglobulinas de cada fracción recogida se cuantifica mediante la lectura de absorbancia a 280 nm (e 1%, 1 cm = 14,0 Prahl y Porter 1968). Las fracciones ricas se agrupan. El grado de purificación de las IgG agrupadas se analiza mediante electroforesis en gel de acrilamida en presencia de SDS. Las IgG purificadas se dializan durante una noche contra el tampón Tris-HCl 25 mM, NaCl 150 mM pH 7,4, se filtran estérilmente, se alicuotan y se conservan a -20ºC. Su concentración final se determina mediante la lectura de la absorbancia a 280 nm o mediante la dosificación mco-BCA. Los péptidos inmunógenos referenciados en la SEC ID nº 53, SEC ID nº 54, SEC ID nº 55, SEC ID nº 56, SEC ID nº 57, SEC ID nº 58, SEC ID nº 59 y SEC ID nº 65 se han usado para la producción de anticuerpos monoclonales, según el protocolo descrito anteriormente. Pero está al alcance del experto en la materia definir otros protocolos para la producción de anticuerpos monoclonales, por ejemplo a partir de las técnicas descritas por Köhler y Milstein y por Galfre G. et al., citados anteriormente, o unas técnicas que se derivan de éstas.

Producción de proteínas recombinantes y de anticuerpos policlonales y monoclonales Proteínas recombinantes

Las proteínas recombinantes GM2AP (SEC ID nº 73) y Saposina B (SEC ID nº 74) usadas para realizar la gama patrón de este estudio se han producido en sistema procariota y purificado a partir de los clones de estas dos proteínas obtenidos en el laboratorio usando los métodos y protocolos bien conocidos por el experto en la materia.

Anticuerpos anti-GM2AP o anti-Saposina B

Los anticuerpos anti-GM2AP o anti-Saposina B usados para realizar el estudio han sido producidos en el laboratorio o donados generosamente. Se han usado unos anticuerpos policlonales anti-Saposina B o anti-GM2AP (Li et al, Glycoconjugate, 1984) para el estudio (véanse los ejemplos siguientes): se denominan SAP84 y GM2AP84.

Se han producido y purificado unos anticuerpos policlonales anti-GM2AP o anti-Saposina B en el laboratorio usando los protocolos y métodos bien conocidos por el experto en la materia: se han inyectado 50 \mug de proteína GM2AP o Saposina B procariota comprada a unos conejos en los días D0, D28 y D56; se han realizado dos inyecciones de recuerdo una vez al mes durante dos meses consecutivos. Los dos anticuerpos policlonales anti-GM2AP y dos anticuerpos policlonales anti-Saposina B se han obtenido así, y se ha verificado su especificidad frente a la proteína recombinante mediante transferencia western y mediante Elisa.

Se han producido y purificado unos anticuerpos policlonales anti-péptidos GM2AP o Saposina B en el laboratorio usando los protocolos y los métodos bien conocidos por el experto en la materia: se han inyectado 75 \mug de péptidos GM2AP o Saposina B definidos, producidos y acoplados con KLH en el laboratorio en los días D0, D28 y D56; se han realizado varios recuerdos una vez al mes durante 5 meses consecutivos con inyección de 75 \mug cada vez. Así, se han obtenido cuatro anticuerpos policlonales anti-péptidos GM2AP, cuatro anticuerpos policlonales anti-péptidos Saposina B y cuatro anticuerpos policlonales de conejos anti-péptidos MRP 14, y se ha verificado su especificidad frente a la proteína recombinante mediante transferencia western y mediante Elisa. La secuencia de los péptidos GM2AP, Saposina B y MRP 14 elegidos se describen en las figuras 1 a 3.

Se ha obtenido:

-

\vtcortauna un anticuerpo anti-mezcla de dos péptidos de 13 y 15 aminoácidos de GM2AP: 189-190; un anticuerpo anti-péptido de 18 aminoácidos de GM2AP: 191-192 (véase la figura 1),

-

\vtcortauna un anticuerpo anti-mezcla de dos péptidos de 13 y 19 aminoácidos de MRP14: 193;

-

\vtcortauna un anticuerpo anti-péptido de 17 aminoácidos de MRP14: 195-196 (véase la figura 2),

-

\vtcortauna un anticuerpo anti-mezcla de tres péptidos de 12, 15 y 15 aminoácidos de Saposina B: 74-75; otro anticuerpo anti-mezcla de 3 péptidos de 12, 15 y 15 aminoácidos de Saposina B: 72-73 (véase la figura 3).

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Se han producido y purificado unos anticuerpos monoclonales anti-fracción nativa en el laboratorio usando los protocolos y los métodos bien conocidos por el experto en la materia. La "fracción nativa" corresponde a la fracción de elución citotóxica obtenida a partir del grupo de los 80 litros de orina de pacientes SEP y después de la purificación. Es la última fracción de elución la que contiene las tres proteínas GM2AP, Saposina B, y MRP14. Se han inyectado 30 \mug de esta fracción de purificación a tres ratones en los días D0, D14, D28, y se ha efectuado la extracción el D38. Después del "screening" y de la fusión celular, protocolos conocidos por el experto en la materia para el establecimiento de hibridomas y de anticuerpos monoclonales, se han re-inyectado los hibridomas al ratón, y se ha recuperado el líquido de ascitis 10 días después. Se han purificado los anticuerpos sobre columna sefarosa-proteína A, y se ha verificado la especificidad frente a la fracción usada para la inmunización mediante transferencia western y mediante Elisa. Así, se han obtenido cuatro anticuerpos monoclonales: 19C1A7, 3D3F9, 18C8C5 y 7D12A8.

Ejemplo 13 Dosificación de las proteínas MRP14 en las orinas mediante la técnica ELISA

Las proteínas MRP14, MRP18 y el heterocomplejo MRP8/14 han sido dosificados en unas orinas humanas usando (i) o bien una técnica de dosificación Elisa según el procedimiento conocido por el experto en la materia y usando los anticuerpos anti-MRP descritos en los ejemplos anteriores; (ii) o bien el kit "MRP Enzyme Immunoassay" comercializado por BMA Biomedicals AG, Augst, Suiza, usando los anticuerpos del kit, siendo el protocolo realizado según el prospecto del kit.

Detección de MRP14 y MRP8/14 en unas orinas

Las dosificaciones han sido realizadas a partir de 17 orinas de individuos que proceden de la población activa (TS), de 27 orinas de pacientes que padecen esclerosis en placas (SEP) y de 7 orinas de pacientes que padecen otras enfermedades neurológicas (AMN).

- La figura 4 ilustra los porcentajes de MRP8 dosificados en estas orinas: mientras que la concentración en MRP8 es casi nula en las orinas AMN, no existe realmente ninguna diferencia de distribución entre las orinas TS y SEP. Se observa sin embargo que las diferencias observadas son casi despreciables puesto que las concentraciones dosificadas son extremadamente bajas.

- La figura 5 ilustra los porcentajes de MRP14 dosificados en las mismas orinas: mientras que no existe realmente ninguna diferencia de distribución de las concentraciones entre las orinas TS y AMN, las concentraciones son más elevadas en ciertas orinas SEP.

- La figura 6 ilustra los porcentajes de heterodímero MRP8/14 dosificados en las mismas orinas: mientras que no existe realmente ninguna diferencia entre las concentraciones de las orinas TS y AMN, se observan unas concentraciones más fuertes en ciertas orinas SEP, que corresponden quizás a una sub-población de pacientes SEP caracterizada por una actividad de la enfermedad. MRP8/14 dosificado en las orinas es un marcador de la actividad de la enfermedad SEP caracterizada por un pico de inflamación.

- La figura 7 recapitulativa confirma que no existe ninguna diferencia significativa de concentración en MRP8 y en MRP14 entre las orinas TS, AMN y SEP, mientras que se observa una baja diferencia de concentración en MRP8/14 entre estas orinas, siendo esta concentración más elevada en media en las orinas SEP y siendo un marcador de la actividad de la enfermedad (pico de inflamación).

Ejemplo 14 Protocolos ELISA usados para la dosificación de las proteínas GM2AP y Saposina B

Se han dosificado las proteínas GM2AP o Saposina B en unas orinas humanas usando unos anticuerpos policlonales anti-GM2AP o anti-Saposina B, siguiendo el protocolo de Elisa descrito por Gardas et al. (Glycoconjugate Journal 1, 37-42, 1984). Las principales etapas se describen brevemente a continuación:

En cada etapa, los pocillos de una microplaca de 96 pocillos se llenan con 200 \mul de la disolución designada. Los pocillos se "recubren" en primer lugar con una disolución de GM2AP (proteína recombinante procariota) diluida al 50 ng/ml en un tampón carbonato-bicarbonato, pH 9,6. Después de la incubación durante una noche a 4ºC, la disolución se elimina y los pocillos se lavan cuatro veces con tampón PBS pH 7,4 que contiene Tween-20 al 0,05% (PBS-Tween). Las microplacas así recubiertas se almacenan a 4ºC durante aproximadamente 2 semanas.

Las muestras de orina con tres diluciones diferentes (20x, 40x y 80x u otras diluciones apropiadas) se incuban con una dilución apropiada del anticuerpo policlonal de conejo anti-GM2AP o anti-Saposina B durante una noche a 4ºC. Se usa una serie de diluciones estándares de una proteína recombinante comprendida entre 2,0 y 62,5 ng/ml para realizar la gama patrón, y se tratan de la misma manera. Todas las diluciones se realizan en tampón PBS-Tween que contiene 1 mg/ml de ovoalbúmina. Así, 0,2 ml de cada disolución incubada se añade en unos pocillos "recubiertos" por duplicado y las placas se dejan durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan entonces cuatro veces en PBS-Tween y se llenan otra vez con una disolución de anticuerpos de cabra anti-IgG de conejo acoplados con la peroxidasa y diluida aproximadamente 1.200 veces. Después de una incubación de 2 horas a temperatura ambiente, los pocillos se lavan cuatro veces en PBS-Tween y se llenan nuevamente con el reactivo de coloración. El reactivo de coloración consiste en 100 mg de ácido 2,2'-azino-di-(3-etilbenzotiazolina)sulfónico y 10 \mul de 30% de peróxido de hidrógeno durante una hora a temperatura ambiente, y se estima el grado de coloración de cada micropocillo mediante lectura de absorbancia a 405 nm.

Se construye una curva estándar indicando en las abscisas la concentración de GM2AP de la gama patrón o de Saposina B con una escala logarítmica y en las ordenadas el porcentaje de absorbancia con una escala lineal. El porcentaje de absorbancia de la muestra es la relación de absorbancia entre la muestra de orina y el control que contiene sólo el antisuero, sin el antígeno disoluble.

Se diluye una disolución de proteína recombinante GM2AP producida en sistema procariota, y de concentración 3 mg/ml en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6, y se añaden 50 \mul en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos, es decir, 50 \mul por pocillo de una disolución al 0,5 \mug/ml. Las placas así preparadas se incuban durante una noche a temperatura ambiente. Se ha purificado y diluido el anticuerpo policlonal anti-GM2AP producido en el laboratorio (conejo 79) en tampón PBS-Tween al 0,05% en presencia de suero de caballo al 10%. Esta disolución se diluye al 1/8.000º. La disolución se usa para realizar una gama patrón con 8 puntos de gama que cubren las concentraciones de 0 a 500 ng/ml. Se realiza una pre-incubación durante una noche a temperatura ambiente entre 100 \mul de anticuerpos y 100 \mul de muestra de orina a dosificar o de disolución de proteína recombinante GM2AP o Saposina B que sirven para la gama patrón. Después de lavar la microplaca en PBS-Tween, se añaden 50 \mul de la mezcla de incubación por pocillo, y después se incuba durante dos horas a temperatura ambiente. La microplaca se lava nuevamente en PBS-Tween, y después se añaden 50 \mul de anticuerpo anti-IgG de conejo acoplado con la peroxidasa y diluidos al 1/5.000 en cada micropocillo de la placa, y se incuban durante dos horas a temperatura ambiente. Después de nuevos lavados de la microplaca, se añaden 100 \mul de OPD en cada pocillo y se incuban durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se estima la coloración de cada pocillo, proporcional a la concentración de GM2AP o de Saposina B reconocida por el anticuerpo específico usado, mediante lectura de absorbancia.

Se diluye una disolución de proteína recombinante GM2AP o Saposina B producida en sistema procariota, y de concentración 3 mg/ml en tampón carbonato 50 mM, pH 9,6, y se añaden 50 \mul en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos, es decir, 50 \mul por pocillo de una disolución al 1,5 \mul/ml. Las placas así preparadas se incuban durante una noche a temperatura ambiente. Los anticuerpos policlonales anti-péptidos GM2AP producidos en el laboratorio (conejo 190 y conejo 191) purificados se usan solos o en mezcla diluidos al 1/1.000 para cada uno en tampón PBS-Tween 0,05% en presencia de suero de caballo 10%. La gama patrón se realiza usando proteína recombinante procariota GM2AP o Saposina B diluida de manera que se cubre la gama de concentración 0 a 1.500 ng/ml con 8 puntos. Se pre-incuban 100 \mul de anticuerpos (un anticuerpo o los dos juntos) en presencia de 100 \mul de muestra de orina a ensayar o de disolución GM2AP o Saposina B recombinante, durante una noche a temperatura ambiente. Después de lavar la microplaca en PBS-Tween, se añaden 50 \mul de la mezcla de incubación por pocillo y después se incuban durante dos horas a temperatura ambiente. La microplaca se lava nuevamente en PBS-Tween, y después se añaden 50 \mul de anticuerpos anti-IgG de conejo acoplado con la peroxidasa, diluidos al 1/5.000 en cada micropocillo de la placa y se incuban durante dos horas a temperatura ambiente. Después del lavado de la microplaca, se añaden 100 \mul de OPD en cada pocillo y se incuban durante 20 minutos a temperatura ambiente. La coloración de cada pocillo, proporcional a la concentración de GM2AP Saposina B reconocida por el anticuerpo específico usado, se estima mediante la lectura de absorbancia.

Ejemplo 15 Dosificación de las proteínas GM2AP en las orinas

Se ha dosificado la proteína GM2AP en las orinas de 22 pacientes que padecen esclerosis en placas (SEP), 5 pacientes de otras enfermedades neurológicas (OND) y 9 individuos seleccionados de entre la población activa y se han recogido durante una visita médica (Healthy), siguiendo el protocolo de Elisa descrito a continuación, usando unos anticuerpos policlonales anti-GM2AP. Los pacientes SEP seleccionados para este estudio son unos pacientes a todos los niveles, es decir, con diferentes estados y perfiles de la enfermedad, y diferentes tratamientos, etc.

Los resultados de la dosificación se muestran en la figura 8. Mientras que sólo 0/5 orinas OND y 2/9 orinas denominadas "Healthy" presentan una concentración en GM2AP superior a 200 ng/ml, 10/22 (es decir, el 45%) presentan una concentración superior a 200 ng/ml.

Estos resultados indican que aunque la proteína GM2AP está presente en una concentración muy baja (<400 ng/ml) en las orinas de individuos de la población activa, está presente en una concentración más fuerte en las orinas de pacientes SEP. Sin embargo, 12 orinas SEP presentan asimismo unos porcentajes bajos de GM2AP. Entre estos 12 pacientes, 10 están en tratamiento. Las fuertes concentraciones urinarias de GM2AP parecen ser un marcador de la patología SEP, y más precisamente un marcador de un estado o de una forma de la enfermedad, de la actividad de la enfermedad, y está seguramente influenciado por cualquier tratamiento en curso. Se observa que dos individuos de la población activa tienen unas concentraciones elevadas de GM2AP (estos dos casos han sido incluidos voluntariamente en el estudio, porque ambos presentaban una actividad gliotóxica en sus orinas al contrario de los demás individuos de esta misma categoría). Es imposible saber si se trata de individuos sanos, o que padecen una patología, o de individuos que padecen una esclerosis en placas puesto que las muestras de los individuos denominados "Healthy" han sido recogidas de manera anónima, sin conocer el informe clínico.

Se han detectado unas concentraciones urinarias más elevadas de GM2AP en las orinas de pacientes SEP; una concentración elevada de GM2AP puede ser entonces un marcador de la patología SEP, y más precisamente de una forma de la enfermedad, de un estado de la enfermedad, de un periodo de actividad, y puede estar influenciada por cualquier tratamiento en curso. Estas concentraciones urinarias elevadas en GM2AP pueden tener asimismo un valor predictivo de un principio de agravación de la enfermedad, o de una SEP benigna al principio de su evolución, etc.

Los valores absolutos de las concentraciones GM2AP detectados en las orinas dependen de la afinidad y de la especificidad del anticuerpo usado, pero de manera general, la tendencia entre los tres grupos de individuos se conserva independientemente del anticuerpo usado.

Ejemplo 16 Dosificación de las proteínas Saposina B en las orinas

Se ha detectado la proteína Saposina B en las mismas muestras de orinas que las usadas para el estudio de la detección de GM2AP. Se han realizado las dosificaciones en paralelo con las de la GM2AP, en un mismo estudio, siguiendo el protocolo de Elisa descrito a continuación, usando unos anticuerpos policlonales anti-Saposina B.

Los resultados de la dosificación de Saposina B se muestran en la Figura 9. 0/5 orinas OND y 2/9 orinas Healthy presentan una concentración en Saposina B superior a 2 \mug/ml, mientras que 6/22 (es decir, el 27%) presentan una concentración superior a 2 \mug/ml.

Estos resultados indican que la proteína Saposina B está presente en cada orina (población denominada sana o población denominada enferma) con unas concentraciones no despreciables, es decir, <2 \mug/ml. Estos resultados de dosificación son compatibles con los descritos en la bibliografía. Sin embargo, incluso si la Saposina B está presente en cada orina, parece estar presente en concentraciones más fuertes en ciertas orinas SEP. Este aumento de concentración de Saposina B en las orinas SEP puede estar enmascarada por la concentración basal de esta proteína en el estado ordinario. Así, las fuertes concentraciones urinarias de Saposina B parecen ser un marcador de la patología SEP, y más precisamente un marcador de un estado o de una forma de la enfermedad, de la actividad de la enfermedad, y está seguramente influenciado por cualquier tratamiento en curso. La Saposina B dosificada sola parece ser sin embargo un marcador un poco menos discriminante de una forma o de una actividad de la enfermedad que la GM2AP. Se observa otra vez que dos individuos de la población activa tienen unas concentraciones elevadas de Saposina B y que son los mismos dos individuos que presentaban asimismo una fuerte concentración de GM2AP en sus orinas.

En conclusión, unas concentraciones urinarias más elevadas de Saposina B se detectan en las orinas de pacientes SEP; una concentración elevada de Saposina B puede ser entonces un marcador de la patología SEP, y más precisamente de una forma de la enfermedad, de un estado de la enfermedad, de un periodo de actividad, y puede estar influenciado por cualquier tratamiento en curso. Estas concentraciones urinarias elevadas en GM2AP pueden tener asimismo un valor predictivo de un principio de agravación de la enfermedad, o de una SEP benigna al principio de su evolución, etc. Pero de manera general, las fuertes concentraciones de Saposina B solas parecen ser unos marcadores menos discriminantes que las fuertes concentraciones de GM2AP solas.

Los valores absolutos de las concentraciones de Saposina B detectados en las orinas dependen de la afinidad y de la especificidad del anticuerpo usado, pero de manera general, la tendencia entre los tres grupos de individuos se conserva independientemente del anticuerpo usado.

Ejemplo 17 Co-dosificación de las proteínas GM2AP y Saposina B en las orinas

Los autores muestran las concentraciones de GM2AP dosificada en las muestras de orina descritas en la Figura 5 con relación a la concentración de Saposina B dosificada en estas mismas muestras y descrita en la Figura 6.

En el gráfico que han obtenido, no representado, se desprende claramente que:

-

\vtcortauna cuanto más elevada es la concentración en GM2AP en las orinas, más elevada es la concentración en Saposina B. (Se ha mostrado que no era un caso general con otras proteínas y que eso no traduce ninguna perturbación renal, con la dosificación de la creatinina en paralelo para cada una de las muestras ensayadas);

-

\vtcortauna las concentraciones elevadas de GM2AP y de Saposina B son características de las muestras SEP (con la excepción de las dos orinas de la población activa, mencionadas anteriormente). Estas concentraciones elevadas conjuntas de GM2AP y de Saposina B son unos marcadores de la patología SEP, más precisamente de una ventana de la enfermedad.

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En conclusión, este análisis confirma que unas concentraciones urinarias elevadas de GM2AP (>400 ng/ml) y de Saposina B (>2 \mug/ml) son co-detectadas en las orinas de pacientes SEP y pueden representar unos marcadores de la patología SEP, más precisamente de una forma de la enfermedad, de un estado de la enfermedad, de un periodo de actividad, y pueden estar influenciados por cualquier tratamiento en curso. Es ventajoso dosificar las dos proteínas en paralelo en cada muestra, y considerar las dos concentraciones.

Determinación de GM2AP y de Saposina B en la orina de dos pacientes en cinética

Paciente SEP nº 1

Forma remitente progresiva

Se han recogido unas orinas de este paciente durante la evolución de su enfermedad. El paciente ha sido hospitalizado el D0 por un brote. Éste ha sufrido el D1 un flash de corticoides y después ha sido monitorizado desde un punto de vista clínico (el flash ha aportado una mejora clínica). La figura 10 muestra el perfil de dosificación de la GM2AP y de la Saposina B en estas orinas durante la evolución, y la figura 11 muestra el perfil del producto de dos concentraciones en GM2AP y Saposina B, que traduce una co-detección de concentraciones elevadas. Las concentraciones en GM2AP y Saposina B elevadas en el momento del brote y de la hospitalización, disminuyen progresivamente en el tiempo después del flash de corticoides hasta 90 días.

Paciente SEP nº 2

Forma progresiva

Se han recogido unas orinas de este paciente durante la evolución de su enfermedad. El paciente ha sido hospitalizado a D0 por un brote. Éste ha sufrido el D1 un flash de Endoxan y después se ha monitorizado en el tiempo desde un punto de vista clínico (el flash ha aportado una mejora clínica y el D60 se han observado unas señales de agravación de la enfermedad). La figura 12 muestra el perfil de dosificación de la GM2AP y de la Saposina B en estas orinas durante la evolución, y la figura 13 muestra el perfil del producto de las dos concentraciones en GM2AP y Saposina B, que traducen una co-detección de concentraciones elevadas. Las concentraciones en GM2AP y Saposina elevadas en el momento del brote y de la hospitalización, disminuyen progresivamente en el tiempo después del flash de Endoxan (o también denominado ciclofosfamida) hasta 23 días y parecen aumentar para ser elevadas el D60, mostrando así una perfecta correlación con la evolución de las señales clínicas.

Estos resultados confirman que:

-

\vtcortauna unas concentraciones fuertes de GM2AP y Saposina B en las orinas son unos marcadores de la patología SEP, y en particular la co-detección de las fuertes concentraciones de las dos proteínas conjuntamente (traducido por el producto de las dos concentraciones);

-

\vtcortauna las fuertes concentraciones de GM2AP y Saposina B en las orinas son unos marcadores de la actividad de la enfermedad (en este caso durante el brote) o son unos marcadores influenciados por los tratamientos inmunosupresores tales como los corticoides o el Endoxan que bajan las concentraciones.

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Este ejemplo ilustra el hecho de que estos marcadores se pueden usar entre otros:

-

\vtcortauna para realizar un seguimiento terapéutico de un paciente y evaluar el beneficio terapéutico de un tratamiento para un paciente determinado; o

-

\vtcortauna para predecir una agravación de la enfermedad, predecir un pico de actividad, etc., y

-

\vtcortauna para decidir una (re)toma terapéutica anticipada sobre las señales clínicas.

Ejemplo 18 Correlación entre la detección de las proteínas MRP14, GM2AP y Saposina B en las orinas y la gliotoxicidad medida en estas orinas

Con el fin de verificar una correlación entre la presencia de estas proteínas solas o en combinación en las orinas y la gliotoxicidad de las orinas, se han determinado en paralelo las concentraciones en proteína de interés y la gliotoxicidad de un muestreo de orinas de pacientes que padecen esclerosis en placas (SEP), de pacientes que padecen otras enfermedades neurológicas (OND) y de individuos que proceden de la población activa denominada "Healthy". Entre los pacientes SEP, se observan unos pacientes con diferentes formas y estados de la enfermedad, con tratamiento o no, en diferentes actividades de la enfermedad.

Las proteínas MRP, GM2AP y Saposina B ha sido dosificadas en unas orinas humanas siguiendo los protocolos Elisa descritos anteriormente. Las dosificaciones analizadas en este ejemplo son las descritas en los ejemplos anteriores. Cada muestra de orina analizada en Elisa ha sido analizada mediante el ensayo MTT para medir la gliotoxicidad de cada muestra. La gliotoxicidad se expresa en porcentaje de células muertas (estimado mediante colorimetría usando las sales de tetrazolio) de una línea celular astrocitaria murina (CLTT1.1) después de 48 horas de incubación en presencia de orina centrifugada.

Los autores han representado la concentración de GM2AP en función de la gliotoxicidad de las orinas determinada mediante el ensayo MTT.

Se han indicado en un gráfico no representado 22 orinas SEP, 5 orinas AMN y 9 orinas denominadas "Healthy". Son las mismas orinas que han sido estudiadas en los ejemplos 15 y 16. Se observa que todas las orinas de control (OND y Healthy) tienen unos porcentajes en GM2AP bajos (< 400 ng/ml) y una gliotoxicidad baja (<15%), con la excepción de una orina de control Healthy (ya mencionada en el ejemplo 15) para la cual se observa una fuerte concentración en GM2AP y una gliotoxicidad.

Las orinas SEP se reparten en tres sub-poblaciones:

-

\vtcortauna orinas con baja concentración en GM2AP (<400 ng/ml) y baja gliotoxicidad (<15%),

-

\vtcortauna orinas con baja concentración en GM2AP (<400 ng/ml) y gliotoxicidad (>15%), o sea esencialmente 3 orinas,

-

\vtcortauna orinas con fuerte concentración en GM2AP (>400 ng/ml) y fuerte gliotoxicidad (>15%).

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Estas tres sub-poblaciones traducen quizás unas sub-poblaciones SEP, es decir diferentes formas o estados de la enfermedad, diferentes actividades de la enfermedad, diferentes beneficios terapéuticos, etc.

Sin embargo, se puede apreciar que todas las orinas que presentan una fuerte concentración en GM2AP presentan asimismo una fuerte gliotoxicidad.

En conclusión: se observa una correlación entre concentración urinaria elevada en GM2AP y gliotoxicidad (todas las orinas con una fuerte concentración en GM2AP son gliotóxicas (10/10), y todas las orinas con una baja concentración en GM2AP no son gliotóxicas (<15%), con la excepción de 3/12 orinas SEP). Esto traduce la implicación de la proteína GM2AP en el mecanismo de gliotoxicidad, sola o en combinación, en su forma natural o modificada, pero reconocible por un anticuerpo anti-GM2AP. Además, la co-detección de una fuerte concentración en GM2AP en las orinas y de una fuerte gliotoxicidad se correlaciona con una sub-población de pacientes que padecen SEP.

Los autores han representado la concentración en Saposina B en función de la gliotoxicidad de las orinas determinada mediante el test MTT.

22 orinas SEP, 5 orinas AMN y 9 orinas denominadas "Healthy" han sido indicadas en un gráfico no representado. Son las mismas orinas que se han estudiado en los ejemplos 15 y 16. Se observa que cuanto más ricas son las orinas en Saposina B, más gliotóxicas son. Existe una correlación bastante clara entre concentración de Saposina B y gliotoxicidad de las orinas.

En conclusión: se observa una correlación entre concentración urinaria elevada en Saposina B y gliotoxicidad. Esto traduce la implicación de la proteína Saposina B en el mecanismo de gliotoxicidad, sola o en combinación, en su forma natural o modificada pero reconocible por el anticuerpo anti-Saposina B usado para la dosificación.

Los autores han representado el producto de las concentraciones en GM2AP y Saposina B en función de la gliotoxicidad de las orinas dosificada mediante el ensayo MTT.

Las 22 orinas SEP, 5 orinas AMN y 9 orinas denominadas "Healthy" de los ejemplos 15 y 16 han sido indicadas en un gráfico no representado. La gliotoxicidad de estas orinas se analiza en función del producto de las concentraciones en GM2AP y Saposina B, es decir, en función de la co-detección de las dos proteínas en las orinas. Se observa muy claramente una correlación entre el producto de las dos concentraciones GM2AP y Saposina B y la gliotoxicidad, mucho más importante que considerando únicamente una sola proteína. Se observa que 5/5 de las orinas OND tienen un producto de concentración GM2AP y Saposina B baja y una gliotoxicidad baja; 8/9 de las orinas "healthy" tienen un producto de concentración GM2AP y Saposina B baja y/o una gliotoxicidad baja. 8/9 de las orinas "Healthy" tienen un producto de concentración GM2AP y Saposina B baja y/o una gliotoxicidad baja. Por el contrario, se distinguen esencialmente tres sub-poblaciones de orinas SEP:

-

\vtcortauna orinas de baja concentración en GM2AP, Saposina B y baja gliotoxicidad (<15%),

-

\vtcortauna orinas de fuerte concentración en GM2AP, Saposina B y fuerte gliotoxicidad (>15%).

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Estas dos sub-poblaciones traducen quizás unas sub-poblaciones SEP, es decir, diferentes formas o estados de la enfermedad, diferentes actividades de la enfermedad, diferentes beneficios terapéuticos, etc. Sin embargo, es muy importante observar que todas las orinas que presentan una fuerte concentración en GM2AP y Saposina B, es decir, que tienen conjuntamente una fuerte concentración en GM2AP y Saposina B, presentan asimismo una fuerte gliotoxicidad. Las dos sub-poblaciones de pacientes SEP son tanto más marcadas y claras por cuanto que se consideran conjuntamente los tres marcadores: gliotoxicidad, concentración elevada en GM2AP y concentración elevada en Saposina B. Esto se confirma en la figura 14.

En conclusión: se observa una correlación entre concentración urinaria elevada de GM2AP y Saposina B y gliotoxicidad. Todas las orinas con una fuerte concentración en GM2AP y Saposina B son gliotóxicas, y todas las orinas con una baja concentración en GM2AP y Saposina B no son gliotóxicas (<15%), con la excepción de 2 orinas/22 SEP. Esto traduce la implicación de las dos proteínas GM2AP y Saposina conjuntamente o en combinación en el mecanismo de gliotoxicidad, en su forma natural o modificada pero reconocible por los anticuerpos anti-GM2AP y anti-Saposina B usados para la dosificación. Además, la co-detección de una fuerte concentración urinaria en GM2AP y Saposina B y de una fuerte gliotoxicidad correlaciona con una sub-población de pacientes que padecen SEP (estado, forma, actividad, tratamiento de la enfermedad), con relación a otra sub-población. Estos tres marcadores considerados conjuntamente permiten discriminar entre dos sub-poblaciones de pacientes SEP.

Evolución de la gliotoxicidad y de las concentraciones en GM2AP y Saposina B en función de la evolución de la enfermedad de dos pacientes después y durante el tratamiento.

La correlación entre gliotoxicidad, fuerte concentración en GM2AP y Saposina B en las orinas y patología SEP ha sido asimismo confirmada midiendo estos tres parámetros en la orina de dos pacientes durante la evolución de su enfermedad.

Paciente nº 1: SEP forma remitente-progresiva, hospitalizado el D0 por un brote y que ha recibido un flash de corticoides el D1. Después del flash, el paciente ha mostrado una mejora clínica hasta el D90 - (véanse las figuras 10 y 11).

Paciente nº 2: SEP forma progresiva, hospitalizado el D0 por un brote y que ha recibido un flash de Endoxan (también denominado ciclofosfamida) el D1. El D60, el paciente presenta nuevamente unas señales clínicas de agravación de su enfermedad - (véanse las figuras 13 y 14).

Para los dos pacientes, se ha mostrado:

-

\vtcortauna una correlación entre la gliotoxicidad urinaria y la evolución clínica de la enfermedad (cuando las señales clínicas son graves, la gliotoxicidad es elevada; cuando las señales clínicas disminuyen a consecuencia del tratamiento, la gliotoxicidad disminuye y se estabiliza; cuando las señales de agravación aparecen después del tratamiento, la gliotoxicidad parece aumentar nuevamente),

-

\vtcortauna una correlación entre el porcentaje de gliotoxicidad en las orinas de pacientes y las concentraciones de GM2AP y Saposina B, y

-

\vtcortauna una correlación entre las concentraciones elevadas de GM2AP y Saposina B y la evolución clínica de la enfermedad.

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En conclusión: la dosificación de las proteínas GM2AP y Saposina B en las orinas es un buen marcador discriminativo de una sub-población de la SEP (estado, forma, actividad, tratamiento de la enfermedad). Las proteínas GM2AP y/o Saposina B están implicadas en el mecanismo de gliotoxicidad, solas o en combinación, en su forma natural o en una forma reconocible por los anticuerpos policlonales usados para su dosificación. Como las proteínas GM2AP y Saposina son co-detectadas en fuerte concentración en las orinas gliotóxicas, es posible que estas dos proteínas actúen en combinación para inducir la gliotoxicidad.

Ejemplo 19 Análisis inmunohistoquímico de la expresión de las proteínas

GM2, SAPB, MRP14 y MRP8 en un sistema de cultivo productor de gliotoxina in vitro (cultivos de monocitos), así como en el tejido cerebral normal y patológico de SEP y de controles.

Protocolo: Se han realizado en paralelo unos cultivos de monocitos de un paciente que padece SEP y de un control sano, según el protocolo presente descrito brevemente. A partir de sangre periférica de estos dos voluntarios extraída sobre ACD, los PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) se aíslan sobre Ficoll usando la técnica conocida por el experto en la materia. Las células recuperadas (a nivel del anillo) se lavan dos veces en medio RPMI. Las células se enumeran entonces sobre Kovas-slide y se inoculan en frasco primario de 25 cm^{2} o sobre una lámina Labteck (8 cúpulas) (en permanox) en medio RPMI suplementado con 15% de suero AB humano el D0. Las células se cultivan sobre unas láminas alveoladas de tipo "Labtek" con el fin de disponer de un soporte directo para el análisis de los monocitos que se adhieren al soporte y se diferencian ulteriormente en macrófagos. Para las láminas, se inoculan así 2\cdot10^{6} células a razón de 0,25\cdot10^{6} células/pocillo. Para los frascos, se inoculan 4\cdot10^{6} células a razón de 0,25\cdot10^{6} células/pocillo. El D1, se recuperan las células en suspensión y se lavan dos veces los pocillos de los Labteck o los frascos en RPMI (previamente calentado a 37ºC) antes de añadir medio RPMI suplementado con 5% de suero AB humano. El D1, D3, D6, D9, D12 o D14, D15, se cambia el medio de cultivo; se recogen los sobrenadantes, y se fijan las células sobre láminas usando las técnicas conocidas por el experto en la materia. En cada cambio de medio, se han fijado por lo menos dos láminas en paraformaldehído y se han conservado para el análisis inmunohistoquímico.

Composición del medio: RPMI (500 ml) con 15 ml de glutamato 200 mM, 5 ml de piruvato de sodio 100 \muM, 5 ml de aminoácidos no esenciales (100x), unos antibióticos penicilina y estreptomicina 100.000 U/\mul y unos anticuerpos anti-interferón humanos a 100 U/\mul.

Resultados: Se han estudiado así en cinética cuatro cultivos de monocitos: dos cultivos de monocitos que proceden de sangre de individuos de control y dos cultivos de monocitos que proceden de pacientes SEP. En diferentes tiempos del cultivo (D0, D1, D3, D6, D9, D12, etc.) los sobrenadantes correspondientes han sido asimismo recuperados. Una vez completada la cinética, se han incubado las láminas que corresponden a los diferentes días de cultivos en presencia de anticuerpos policlonales anti-GM2A, SAP-B, MRP8 y MRP14. Se ha estimado la gliotoxicidad de cada sobrenadante así recuperado mediante el ensayo MTT. Se ha determinado asimismo la concentración en proteína GM2AP, MRP14 y Saposina B en cada sobrenadante mediante el protocolo Elisa tal como se ha descrito en los ejemplos 13 y 14.

Los resultados de inmunofluorescencia sobre células fijadas se resumen a continuación; se puede observar:

-

\vtcortauna una ausencia de expresión de MRP8 en todos los estados de los 2 cultivos.

-

\vtcortauna una clara expresión de MRP8-14 en el periodo entre D9 y D15, encontrada en los dos cultivos, aunque más fuerte en el cultivo SEP. Esta expresión parece correlacionar una etapa de diferenciación macrofágica.

-

\vtcortauna una expresión muy baja (baja intensidad y bajo número de células) se observa al principio del cultivo en el cultivo de control y corresponde probablemente a la presencia fisiológica de GM2A en los lisosomas macrofágicos.

-

\vtcortauna en el cultivo SEP, se observa una expresión mucho más clara de GM2A (intensidad más fuerte y número de células más importante), con un marcado citoplásmico relativamente homogéneo entre D3 y D6, desaparece el D9 y se observa nuevamente el D14-D15, con un marcado intenso y localizado en la periferia citoplásmica, resaltando el contorno interno de la membrana plásmica. Estas observaciones no se encuentran en el conjunto de las láminas de control.

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El análisis con el anticuerpo anti-SAP-B no ha permitido obtener un marcado inmuno-histoquímico interpretable.

En los cultivos de monocitos SEP ya efectuados, 3/3 han presentado un pico de gliotoxicidad el D9, y 2/3 un pico más bajo el D6. No se ha detectado ningún pico en los cultivos de monocitos de 2/2 de controles no-SEP analizados en paralelo. Asimismo, la dosificación de las proteínas MRP14, GM2AP y Saposina B en el sobrenadante de los cultivos celulares durante la cinética ha mostrado que las proteínas SapB y GM2AP son detectadas por Elisa en los sobrenadantes de los monocitos SEP y no en los de los monocitos de control, en los días D6 y sobre todo D9 de cultivo; las proteínas no se detectan más allá de esta cinética. Se observa que los anticuerpos usados para la dosificación pueden reconocer las formas fisiológicas de las proteínas, pero también unas formas complejadas y/o modificadas.

Se constata por lo tanto que el periodo D6-D9 durante el cual se observa una gliotoxicidad más importante en el sobrenadante, está cubierto por el periodo D3-D15 durante la cual se observa una producción menos diferenciada del control negativo de GM2A en las células con unas fluctuaciones cuantitativas y cualitativas de su expresión celular (cantidad de expresión y localización celular).

Ejemplo 20 Técnica de inmunohistología sobre cortes de cerebros en parafina

Los cortes histológicos preparados en parafina se desparafinan en xileno y alcohol antes de sufrir un pretratamiento que tiene como objetivo desenmascarar los antígenos; este pretratamiento puede corresponder a (i) dos veces 5 minutos al microondas (750W) en presencia de un tampón de citrato de sodio, ácido cítrico, (ii) un tratamiento con ácido mediante incubación durante 15 minutos en una disolución de ácido periódico al 1% o mediante incubación durante 5 minutos en una disolución de ácido fórmico al 99%. Las peroxidasas endógenas se bloquean a continuación mediante incubación de las láminas durante 30 minutos en agua oxigenada al 1% y después mediante un lavado extensivo en agua durante 15 minutos. El ruido de fondo se bloquea incubando las láminas durante 30 minutos en presencia de PBS Triton al 0,03%, suero Donkey al 10% (para los anticuerpos policlonales) o suero Goat al 10% (para los anticuerpos monoclonales). Se realiza un marcado con el anticuerpo primario aplicando 100 a 200 \mul de disolución de anticuerpos primarios por lámina (0,5 a 5 \mug/ml según el título) en PBS Triton al 0,03% y después incubando durante 2 horas a temperatura ambiente. Las láminas se aclaran después 3 veces en PBS-Triton durante 10 minutos. Se realiza un marcado con el anticuerpo secundario usando unos anticuerpos biotinilados capaces de fijarse específicamente a los anticuerpos primarios, por ejemplo unos anti-IgG de conejo o anti-IgG de ratón diluidos en PBS-Triton al 0,03%. Las láminas se lavan y se incuban en una disolución durante 2 horas (2 \mul del complejo estreptavidina-biotina-peróxidos, 1.600 \mul de PBS-Triton al 0,03%). Las láminas se lavan nuevamente antes de ser reveladas a oscuras en el tampón A y después aclaradas con agua antes de la observación microscópica. Tampón A para 5 láminas: 25 ml de Tris 0,05 M, pH 7,6, 2,5 ml de imidazol 1 M, 15 ml de agua estéril, 2 ml de DAB 5 mg/ml, 5 ml de níquel de amonio al 10%, 30 \mul de H_{2}O_{2} al 1%.

Se han usado los mismos anticuerpos para un estudio inmunohistoquímico, según la técnica descrita brevemente a continuación, sobre unas láminas parafinadas obtenidas mediante corte con microtomo de cerebros extraídos post-mortem de SEP y de controles fallecidos de patologías no-neurológicas.

Los resultados del análisis se resumen a continuación:

No existe ningún marcado de los cerebros "no-SEP" y SEP en la sustancia gris y la sustancia blanca "normal" (no lesionada) con los diferentes anticuerpos anti-MRP8, MRP14, GM2A. Una reactividad no específica no ha permitido interpretar los resultados con el anticuerpo anti-Saposina B en esta aplicación inmunohistoquímica.

Por el contrario, se observa, en las zonas de placas de los cerebros SEP:

-

\vtcortauna una reactividad anti-MRP14 en las células macrofágicas y microgliales, que tiene una distribución relativamente homogénea sobre toda la extensión de las zonas de desmielinización (placas),

-

\vtcortauna una reactividad más baja (menos frecuente) anti-MRP8 relacionada esencialmente con los infiltrados linfoides perivasculares,

-

\vtcortauna una clara reactividad anti-GM2A en los macrófagos y microgliocitos de las zonas de placas, con una densidad particular en las zonas que constituyen la "pared glial" en límite periférico de placa. Asimismo se ha encontrado un marcado de algunos astrocitos en las zonas de desmielinización.

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Estas diferentes observaciones demuestran que existe una hiperexpresión particular de las proteínas MRP-14 y GM2A en los cultivos de monocitos de SEP que producen una actividad gliotóxica en su sobrenadante, así como en las zonas que definen unas placas de desmielinización en los cerebros de SEP. Demuestran por lo tanto la realidad de la coincidencia entre su co-expresión anormal, la producción de actividad gliotóxica y las lesiones de desmielinización.

Además, su producción anormal en el contexto de la SEP, en las células macrofágicas sanguíneas así como en las del cerebro, indica que está justificado realizar su dosificación en los fluidos biológicos para correlacionar su cantidad con la actividad lesional e inflamatoria de la SEP.

Ejemplo 21 Medición de la actividad de las células T mediante proliferación de las células T (Sredni et al., 1981)

Se lavan las células T dos veces en medio de cultivo para eliminar cualquier traza de IL2 presente en el medio inicial de cultivo. Se irradian unos linfocitos B (EBV-LCL) o unos monocitos/macrófagos considerados como células presentadoras del antígeno, a 10.000 rads, se lavan dos veces con medio de cultivo (RPMI). Se incuban juntos 2\cdot10^{4} células T (2\cdot10^{5} células/ml) y 2\cdot10^{4} células B autólogas irradiadas (2\cdot10^{5} células/ml) en presencia de una gama de concentración creciente del antígeno con un volumen final de 200 \mul en unos micropocillos. Después de 48 horas de cultivo a 37ºC, se añade 1 \muCi de 3H-timidina en 50 \mul de medio RPMI en cada pocillo. Las células T, únicas en dividirse, incorporan la timidina tritiada en el ADN. Después de 18 horas de cultivo, las células de cada micropocillo se recogen sobre unas pastillas de lana de vidrio mediante aspiración. Después de la lisis osmótica de las células, la radioactividad incorporada en el ADN se absorbe sobre las pastillas (cell Harvester 530, Inotech). Cada pastilla secada se dispone en un tubo de plástico que contiene 2 ml de centelleante; la radioactividad b adsorbida sobre cada una de las pastillas se cuantifica en un contador beta con centelleo líquido (LKB Rackbeta 1217). Los resultados se expresan como media aritmética de cpm/cultivo ("golpes por minuto").

Ejemplo 22 Protocolo de detección de la asociación entre los péptidos y las moléculas de histocompatibilidad (enfoque APC transformadas con un péptido que se fija al CMHI) 1) Material

Las fuentes de moléculas de histocompatibilidad son actualmente de dos tipos principales: las células mutantes y las moléculas de histocompatibilidad purificadas.

La célula mutante usada es la célula humana T2 que es una variante de la línea T1 producida mediante fusión del linfoma T CEM y del linfoma B 721.174 (Salter y Cresswell Embo J 1986, 5: 943-949). Esta célula que está desprovista de transportadores de péptidos contiene unas cadenas pesadas de moléculas de clase I libres de péptidos que podrán aceptar unos péptidos exógenos.

Se pueden usar asimismo unas moléculas de histocompatibilidad de clase I purificadas mediante cromatografía de afinidad a partir de líneas de células B humanas transformadas mediante EBV. En este caso, los péptidos endógenos deben ser eliminados mediante un tratamiento con urea 1,5 M y sosa 12,5 mM (pH 11,7) durante 1 hora a 4ºC, seguido de su eliminación mediante una columna de desalación (PDLO, Pharmacia). Las moléculas de histocompatibilidad se vuelven a poner inmediatamente en presencia de los péptidos a ensayar en un tampón PBS con Tween 20 al 0,05%, EDTA 2 mM, NP40 al 0,1% y CHAPS 6 mM, en presencia de 2 \mug/ml de B2m para facilitar la reasociación (Gnjatic et al., Eur J Immunol 1995 25: 1638-1642).

Los péptidos ensayados tienen generalmente de 8 a 10 residuos, a veces 11 ó 12. Se han sintetizado mediante Néosystems (Estrasburgo), o mediante Chiron mimotopes (Victoria, Australia). Se usan con unas concentraciones comprendidas entre 100 \muM y 0,1 nM.

2) Protocolo del ensamblaje (Connan et al., Eur J Immunol 1994, 24:777; Couillin et al. Eur J Immunol 1995, 25: 728-732)

Unas alícuotas de 8\cdot10^{5} células en un volumen de 64 \mul, repartidas en unos tubos microfuga Eppendorf, se ponen en presencia de un tampón de lisis que contiene 10 mM de PBS, pH 7,1, 1% de NP40, unos inhibidores de proteasas (1 mM de PMSF), 100 \muM de yodoacetamida, 2 \mug/ml de aprotinina, 10 \muM de leupeptina, 10 \muM de pepstatina y 10 \mug/ml de inhibidor de tripsina). La lisis se realiza en presencia de los péptidos a ensayar durante 30 minutos o 1 hora a 37ºC. Después de la eliminación del material no solubilizado mediante una centrifugación a 15.000 rpm/minuto a 4ºC, se adiciona el sobrenadante de 140 \mul de PBS que contiene Tween 20 al 0,05%, 3 mM de azida de sodio, 1 mM de PMSF y 10 mg/ml de albúmina bovina. Se incuba cada muestra durante 20 horas a 4ºC en 2 pocillos de una placa de microtitulación de tipo Nunc, Maxisorb, previamente recubiertos de un anticuerpo monoclonal (10 \mug/ml en PBS) que reconoce las moléculas de histocompatibilidad que tienen una(s) conformación(es) conforme(s) para la representación de péptidos y parecida(s) a la(s) presente(s) en la superficie de las células. La placa recubierta de anticuerpos se satura previamente mediante albúmina bovina a 10 mg/ml en PBS-Tween antes de la puesta de la muestra. El segundo anticuerpo que permite la detección del ensamblaje de las moléculas de histocompatibilidad se dirige contra la B2m. Se acopla o bien a la biotina (NHS-LC biotin, Pierce) o bien a la fosfatasa alcalina (P-552, Sigma) y se incuba con 2 \mug/ml durante una hora a 37ºC. En el caso del uso de la biotina, se realiza una incubación de 45 minutos a 20-25ºC con estreptavidina acoplada con fosfatasa alcalina (E-2636, Sigma). La actividad de la fosfatasa alcalina se mide usando como sustrato el 4-metil-umbeliferil-fosfato (M-8883, Sigma) a 100 \muM en dietianolamina 50 mM, pH 9,5 con MgCl_{2} 1 mM. La lectura se realiza a 340/460 nm con la ayuda de un citofluorímetro.

3) Estabilidad de los complejos HLA/péptidos

Se ha estudiado la estabilidad de los complejos citados anteriormente puesto que condiciona la buena presentación del antígeno y la inducción de la respuesta T. Para ello, se ha usado o bien HLA purificado, o bien el lisado de la célula T2. Con el HLA purificado, se han eliminado los péptidos endógenos (tal como se describe en 2)) y después se ha puesto en presencia del péptido a ensayar en tubo Eppendorf a 37ºC, durante unos tiempos variables desde algunos minutos hasta varios días. La fase siguiente de incubación sobre placa de 96 pocillos (tal como se ha descrito en 2)) con el anticuerpo anti-HLA se realiza durante una hora a 37ºC. La revelación se efectúa de manera habitual. Con el lisado de la célula T2, todas las incubaciones se realizan asimismo a 37ºC, después de la adición de todos los inhibidores de proteasas.

<110> BIOMERIEUX STELHYS

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<120> Uso de un polipéptido para detectar, prevenir o tratar un estado patológico asociado a una enfermedad degenerativa, neurológica o auto-inmune

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<130> SEP22

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<140>

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<141>

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<150> FR9909372

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<151> 15-07-1999

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<160> 75

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 4393

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

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<210> 2

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<211> 195

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

16

17

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<210> 3

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<211> 508

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

18

19

20

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<210> 4

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<211> 199

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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21

\newpage

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<210> 5

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<211> 199

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 199

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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23

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 182

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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24

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25

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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26

27

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 193

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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28

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<210> 10

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<211> 178

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

30

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<210> 11

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<211> 200

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

31

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

33

34

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<210> 13

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<211> 193

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

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35

350

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<210> 14

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<211> 193

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

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<211> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 193

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

38

39

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 17

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40

41

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<210> 18

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<211> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

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<211> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

43

430

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

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<211> 92

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

44

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<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 85

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 24

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48

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<210> 25

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<211> 381

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

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49

50

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 379

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

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51

52

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 527

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

54

55

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

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<211> 523

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

56

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 380

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

58

59

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4124

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

61

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 579

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 633

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1047

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1706

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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<400> 34

66

660

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<210> 35

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<211> 633

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

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<211> 1047

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1706

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

69

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<210> 38

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<211> 1043

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 38

70

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<210> 39

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<211> 1047

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

72

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<210> 40

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<211> 1705

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

73

\newpage

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<210> 41

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<211> 1043

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 41

74

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<210> 42

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<211> 342

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 42

75

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<210> 43

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<211> 4195

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 43

76

77

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<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 477

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 406

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

79

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 425

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 565

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

81

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 430

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 305

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

83

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 452

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4439

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

85

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 565

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2724

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2171

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35465

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

91

92

93

94

95

96

97

98

99

100

101

102

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14327

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

103

104

105

106

107

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

108

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

109

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

110

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

111

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

112

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

113

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

114

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

115

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

116

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

117

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

118

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 585

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

119

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 597

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

120

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 579

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

121

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

122

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211>

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

123

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211>

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

124

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211>

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

125

Claims (33)

1. Polipéptido que consiste en, o que comprende, por lo menos una secuencia peptídica seleccionada de entre la SEC ID nº 68 y la SEC ID nº 72.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una proteína cuya secuencia peptídica corresponde a la SEC ID nº 9.

3. Polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque consiste en una proteína cuya secuencia peptídica corresponde a la SEC ID nº 9.

4. Fragmento nucleotídico que codifica para un polipéptido tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Uso de por lo menos un polipéptido para obtener una composición de diagnóstico o de pronóstico destinada a detectar un estado patológico asociado a la esclerosis en placas, siendo dicho polipéptido seleccionado de entre:

a)

los polipéptidos tales como se han definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3,

b)

los polipéptidos que comprenden por lo menos, o que consisten en, una proteína seleccionada de entre las proteínas cuya secuencia peptídica en el estado nativo corresponde a las secuencias peptídicas SEC ID nº 8, SEC ID nº 9, SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15 y SEC ID nº 16, las secuencias peptídicas que presentan por lo menos 70% de identidad, preferentemente por lo menos 80% de identidad y ventajosamente por lo menos 98% de identidad con cualquiera de las secuencias peptídicas SEC ID nº 8 y SEC ID nº 10 a SEC ID nº 16, y las secuencias peptídicas que pertenecen a la misma familia que la proteína activadora del gangliósido GM2.

6. Uso según la reivindicación 5, caracterizado porque dicha proteína se selecciona de entre la proteína cuya secuencia peptídica en el estado nativo corresponde a la SEC ID nº 8 y las secuencias peptídicas que presentan por lo menos 70% de identidad, preferentemente 80% de identidad y ventajosamente por lo menos 98% de identidad con la secuencia peptídica SEC ID nº 8.

7. Uso según la reivindicación 5, caracterizado porque la secuencia peptídica de dicho polipéptido comprende la SEC ID nº 8.

8. Uso según la reivindicación 5, caracterizado porque la secuencia peptídica de dicho polipéptido consiste en la SEC ID nº 8.

9. Uso según la reivindicación 5, en el que dicho polipéptido se selecciona de entre los polipéptidos b), que está asociado al uso de una detección de una actividad gliotóxica.

10. Uso de por lo menos un fragmento nucleotídico, para obtener una composición de diagnóstico o de pronóstico destinada a detectar o pronosticar un estado patológico asociado a la esclerosis en placas, según el cual dicho fragmento nucleotídico se selecciona de entre unos fragmentos que codifican para por lo menos un polipéptido tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 5.

11. Uso según la reivindicación 10, caracterizado porque dicho fragmento nucleotídico codifica para una proteína seleccionada de entre las proteínas cuya secuencia peptídica en el estado nativo corresponde a las secuencias peptídicas SEC ID nº 8, SEC ID nº 10, SEC ID nº 11, SEC ID nº 12, SEC ID nº 13, SEC ID nº 14, SEC ID nº 15 y SEC ID nº 16.

12. Uso según la reivindicación 10, caracterizado porque dicho fragmento se selecciona de entre cualquiera de las SEC ID nº 31, SEC ID nº 32, SEC ID nº 33, SEC ID nº 34, SEC ID nº 35, SEC ID nº 36, SEC ID nº 37, SEC ID nº 38, SEC ID nº 39, SEC ID nº 40, SEC ID nº 41, y sus secuencias complementarias.

13. Uso de un ligando específico de un polipéptido o de un fragmento nucleotídico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para obtener una composición de diagnóstico o de pronóstico destinada a detectar o a pronosticar un estado patológico asociado a la esclerosis en placas.

14. Procedimiento para detectar por lo menos una proteína asociada a la esclerosis en placas en una muestra biológica, caracterizado porque se pone en contacto la muestra biológica con por lo menos un ligando específico de por lo menos un polipéptido tal como se ha definido en la reivindicación 5, y se detecta a continuación la formación de un complejo entre dicho polipéptido y dicho ligando.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque dicho ligando es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un receptor, un sustrato de actividad enzimática o una enzima cuyo polipéptido es un cofactor.

\newpage

16. Procedimiento para detectar por lo menos un ligando asociado a la esclerosis en placas en una muestra biológica, caracterizado porque se pone en contacto la muestra biológica con por lo menos un polipéptido tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y 5, y se detecta a continuación la formación de un complejo entre dicho polipéptido y dicho ligando.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, caracterizado porque el ligando es un anticuerpo, un receptor, un sustrato de actividad enzimática o una enzima cuyo polipéptido es un cofactor.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado porque la secuencia de dicho polipéptido comprende una secuencia peptídica seleccionada de entre cualquiera de las SEC ID nº 8 y SEC ID nº 10 a 16.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado porque la secuencia de dicho polipéptido consiste en una secuencia peptídica seleccionada de entre cualquiera de las SEC ID nº 8 y SEC ID nº 10 a 16.

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, caracterizado porque la muestra biológica es la orina, el líquido cefalorraquídeo o el suero.

21. Procedimiento para detectar en una muestra biológica por lo menos un polipéptido tal como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se pone en contacto la muestra biológica con por lo menos un ligando específico de dicho polipéptido, y se detecta a continuación la formación de un complejo entre dicho polipéptido y dicho ligando.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, caracterizado porque dicho ligando es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un receptor, un sustrato de actividad enzimática o una enzima cuyo polipéptido es un cofactor.

23. Procedimiento según la reivindicación 21 ó 22, caracterizado porque la muestra biológica es la orina, el líquido cefalorraquídeo o el suero.

24. Procedimiento para detectar por lo menos un polipéptido tal como se ha definido en la reivindicación 5 o en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en una muestra de un fluido biológico que ha sido extraído de un paciente que presenta un estado patológico asociado a la esclerosis en placas, según el cual, eventualmente después de la purificación de dicha muestra, se analiza mediante espectrometría de masas el perfil de masas obtenido a partir de dicha muestra y se compara con un perfil de masa de referencia.

25. Procedimiento de diagnóstico o de pronóstico, en el que se dosifica en una muestra, por lo menos un polipéptido según la reivindicación 5 b), para detectar o prevenir un estado patológico asociado a la esclerosis en placas, permitiendo la dosificación obtener un valor de concentración que se compara con un valor umbral representativo de la esclerosis en placas.

26. Procedimiento según la reivindicación 25, en el que el valor umbral se obtiene mediante un ensayo ELISA para una muestra de orina, siendo este valor de 400 ng/ml para la proteína activadora del gangliósido GM2, para el anticuerpo GM2AP84.

27. Procedimiento de diagnóstico o de pronóstico, en el que se detecta en una muestra por lo menos un polipéptido según la reivindicación 5 b), para detectar o prevenir un estado patológico asociado a la esclerosis en placas, caracterizado porque la muestra biológica consiste en unas células o unos sobrenadantes de dichas células de un paciente susceptible de padecer la esclerosis en placas.

28. Procedimiento según la reivindicación 27, en el que la muestra biológica consiste en unas células monocitos o macrófagos o unos sobrenadantes de estas células.

29. Procedimiento según la reivindicación 27 ó 28, en el que la muestra biológica consiste en unas células en cultivo o unos sobrenadantes de estas células en cultivo, después de un tiempo comprendido entre 6 y 12 días de cultivo, preferentemente después de 9 días.

30. Procedimiento según la reivindicación 27 ó 28, en el que la muestra biológica consiste en unas células ex vivo preferentemente monocitos o macrófagos.

31. Uso de por lo menos un polipéptido tal como se ha definido en la reivindicación 5 b), para ensayar la eficacia de un agente terapéutico para un estado patológico asociado a la esclerosis en placas.

32. Uso de por lo menos un fragmento nucleotídico, para ensayar la eficacia de un agente terapéutico para un estado patológico asociado a la esclerosis en placas, según el cual dicho fragmento nucleotídico se selecciona de entre los fragmentos que codifican para un polipéptido tal como se ha definido en la reivindicación 5 b).

33. Uso para ensayar la eficacia de un agente terapéutico para un estado patológico asociado a la esclerosis en placas, de proteínas recombinantes y/o codificadas por los fragmentos nucleotídicos definidos en la reivindicación 32.