ES2265684T3 - Transformacion mediada por particulas de soja con seleccion de glifosato. - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento eficaz para obtener plantas de soja transformadas en su línea germinal usando selección con glifosato, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un constructo de ADN heterólogo que comprende un promotor funcional en plantas conectado operablemente a una secuencia codificadora de ADN, donde la codificadora que codifica una proteína capaz de conferir tolerancia a glifosato a una célula vegetal en la que se expresa la secuencia, y una señal de terminación en 3¿; (b) recubrir copias del constructo de ADN en partículas portadoras de material biológicamente inerte, siendo las partículas portadoras pequeñas de tamaño en relación con una célula de soja; (c) acelerar las partículas recubiertas en el tejido meristemático de un embrión de soja; (d) inducir la formación de brotes a partir del tejido meristemático tratado cultivando el tejido meristemático tratado en un medio de cultivo posterior al bombardeo, que comprende glifosato. (e) cultivar los brotes en un medio de brotes adecuado que contiene glifosato a una concentración suficiente para inhibir de forma significativa el crecimiento de las células de soja no transformadas para generar brotes de soja resistentes a glifosato; (f) regenerar los brotes de la etapa (e) en plantas de soja genéticamente transformadas con mayor tolerancia al herbicida glifosato en relación con las plantas de soja de tipo salvaje.

Description

Transformación mediada por partículas de soja con selección de glifosato.
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
No procede.
Declaración respecto a la investigación patrocinada federalmente
No procede.
Antecedentes de la invención
La ciencia nueva de la ingeniería genética o la biotecnología ha proporcionado una serie de técnicas útiles para la mejora de plantas de cultivo. Muchas de estas mejoras se basan en la ingeniería genética de plantas que implica la transferencia de genes de diversos orígenes en la línea germinal hereditaria de plantas de cultivo de forma que esos genes se puedan cultivar con facilidad en o entre líneas de élite de las plantas para usar en la agricultura moderna. Existe una serie de técnicas disponibles para la introducción de genes extraños en las plantas, un procedimiento conocido como ingeniería genética, o transformación de la planta. En general, las técnicas para la introducción de los genes en las plantas son independientes de los genes transferidos y cualquier técnica que se ha elaborado pata una especie vegetal se puede usar para introducir cualquier gen concreto de interés en la planta. Dado que las técnicas de cultivo para diferentes plantas son bastante diferentes unas de otras y dado que las técnicas de transformación en general requieren intensos cultivos en laboratorio de tejidos de la planta transformada, los procedimientos de transformación suelen ser específicos de especie y los protocolos de transformación específicos que se usan de forma más eficaz con una especie de plantas a menudo no funcionan tan bien con otras especies de plantas.
La mayoría de las técnicas de transformación de plantas depende de la introducción de genes extraños en células individuales del tejido de la especie vegetal mantenido en un cultivo tisular. Por ejemplo, la técnica de transformación de planta más habitual en plantas dicotiledóneas se basa en la capacidad de la bacteria Agrobacterium tumefaciens para transferir una parte de su ADN desde la bacteria al genoma de las células de la planta dicotiledónea individual en cultivo. Normalmente, la construcción del gen extraño que se transfiere a la célula vegetal incluye un gen de interés, que se desea introducir el la línea germinal de la planta, en tándem con un marcador seleccionable que confiere a la célula de la planta transformada resistencia a un agente de selección química. En el caso de la transformación mediada por Agrobacterium, la transformación a menudo se realiza en cultivo de callo, que es una forma de célula vegetal indiferenciada que prolifera en cultivo tisular. A continuación, el protocolo de transformación normalmente requiere la aplicación del agente de selección el tejido del callo vegetal que contiene en su interior algunas células transformadas. El propósito del gen del marcador seleccionable y del agente de selección es separar las células que contienen en ADN introducido de esas células que no se han transformado, donde la separación se lleva a cabo matando todas o casi todas las células no transformadas. Tales técnicas se usan ampliamente para la transformación mediada por Agrobacterium de una amplia variedad de especies dicotiledónea.
Por una variedad de razones, estas técnicas no funcionan bien con todas las plantas, incluso especies de plantas dicotiledóneas. Para la soja, se desarrolló una primera técnica de transformación que tuvo como resultado un gran número de plantas de soja transgénica, donde la técnica se basa en el enfoque de la introducción de genes mediado por partículas. En un procedimiento de introducción de genes mediado por partícula, el ADN que se debe insertar en las células vegetales recubre pequeñas partículas portadoras que, a continuación, se aceleran físicamente en tejidos de la planta. Las partículas portadoras son muy pequeñas en relación con las células de la planta de forma que en realidad introducen el material genético a las células de la planta sin matar dichas células. La introducción de genes mediada por partículas se puede practicar bien con células de cultivo o, en realidad, cultivando tejido vegetal diferenciado. La patente de EE.UU. nº 5.015.580 describe algunos de los primeros esfuerzos para crear plantas de soja transgénicas a través del uso de técnicas de transformación mediada por partículas.
La técnica desarrollada en la patente identificada anteriormente se redefinió con más detalle en el procedimiento descrito en la patente de EE.UU. número 5.503.998, donde se describe un protocolo de transformación mejorado útil para la soja así como otras plantas. En ese procedimiento, no se usa ningún agente de selección. La razón por la que un marcador seleccionable no fue útil o no se usó en tal procedimiento fue que el procedimiento se basó en la transformación de un pequeño número de células contenidas en el meristemo de crecimiento de un embrión inmaduro de una planta de soja. Era difícil llegar a un nivel de aplicación de un agente de selección para los marcadores seleccionables de uso habitual entonces que permitirían seguir creciendo al meristemo en crecimiento, además de que se probó que era tóxico para la mayoría de las células no transformadas. Por tanto, en ausencia de un marcador seleccionable se utilizó un sistema diferente para la soja creada a través del procedimiento descrito en la patente de EE.UU. nº 5.503.998. Dicho procedimiento dependió en su lugar de un marcador fácilmente detectable, denominado marcador seleccionable, incorporado por la beta-glucuronidasa génica o GUS, que se podía detectar con facilidad a través de un ensayo colorimétrico conveniente. En este procedimiento, la introducción de genes mediado por partícula se usó para introducir una construcción genética extraña en el meristemo de un embrión inmaduro que a continuación se indujo para producir directamente brotes de soja. Este procedimiento produjo un gran número de brotes pequeños creados a partir de embriones inmaduros transformados de forma putativa. La mayoría de los brotes creados de este modo no era transgénica. Sin embargo, la disponibilidad de un marcador seleccionable fácilmente detectable, y la relativa facilidad con la que grandes números de brotes se pudieron analizar para determinar la expresión del gen marcador seleccionable, lo convirtieron en práctico y, de hecho, económico, para simplemente crear grandes números de brotes y buscar el caso infrecuente en el que se identificó un brote transformado. Este procedimiento permitió la fácil creación de grandes números de plantas transgénicas de la línea germinal sin el uso de un marcador seleccionable.
No obstante, siempre se desea mejorar la eficacia de todos los protocolos de transformación. Por tanto, la incorporación de un procedimiento para mejorar la eficacia del procedimiento descrito en la patente de EE.UU. identificada sería ventajosa. Un modo de incrementar la eficacia sería encontrar un marcador seleccionable que de hecho funcione con el sistema de transformación embrionario descrito en la misma.
Un enfoque diferente de la transformación de soja se basó en el uso de la bacteria Agrobacterium tumefaciens para introducir genes en células de plantas individuales, Las patentes de EE.UU. nº 5.416.011 y 5.569.834 describen un sistema de transformación de soja basado en la introducción de genes mediada por Agrobacterium a células de cotiledón de soja. Este sistema usa un sistema de marcador seleccionable de antibiótico, que se hace funcionar con este enfoque de transformación.
Un herbicida que ha recibido una atención considerable como candidato para usar en el desarrollo de plantas de ingeniería genética es N-fosfonometil-glicina, o glifosato. El glifosato inhibe la 3-enoil-piruvilshikimato-5-fosfato sintasa (EPSP-sintasa), una enzima de la vía del ácido shikímico. La vía del ácido shikímico es una vía biosintética de plantas y bacterias en la que se producen aminoácidos aromáticos, hormonas vegetales y vitaminas. La EPSP sintasa catalizad la conversión de ácido fosfoenolpirúvico (PEP) y ácido 3-fosfoshikímico en ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshikímico (EPSP).
El glifosato es un herbicida del que no se conoce que produzca ningún efecto adverso para el medioambiente y que se degrada de forma natural en el medioambiente. Sin embargo, el glifosato es inespecífico en que, en general, es eficaz a la hora de inhibir el crecimiento de plantas y malas hierbas de cultivo. Por tanto, el glifosato no puede aplicarse de forma eficaz como agente de control de WEED cuando están presentes plantas de cultivo intolerantes al glifosato.
Además de permitir un control de las malas hierbas mejorado, la introducción de marcadores de resistencia al glifosato en plantas de soja ha facilitado el desarrollo de plantas de soja de ingeniería genética que posean cualidades ventajosas (p. ej., cualidades de almacenamiento mejoradas). La soja resistente al herbicida glifosato ya está recibiendo gran aceptación en el mercado.
Mediante ingeniería genética se pueden obtener plantas tolerantes a glifosato para producir niveles mayores de EPSP sintasa (Shah y col., Science 233: 478-481, 1986). La patente de EE.UU. nº 5.633.435, que por la presente se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia, describe variantes de la EPSP sintasa, cada una de las cuales posee un K_{i} reducido para el glifosato, un K_{m} bajo para PEP y una elevada actividad de EPSP sintasa. Se descubrió que las plantas transgénicas que comprenden un gen de expresión que codifica una EPSP sintasa tolerante a glifosato poseían una mayor tolerancia a los herbicidas que contienen glifosato.
Otro medio por el cual se pueden obtener plantas tolerantes a glifosato consiste en introducir en plantas un gen que codifica una proteína implicada en la degradación del glifosato. La patente de EE.UU. nº 5.463.175, incorporada en la presente memoria descriptiva por referencia, describe un gen que codifica la glifosato oxidorreductasa (GOX), una enzima implicada en la degradación del glifosato. También se describen plantas transgénicas tolerantes a glifosato que comprenden un gen para la glifosato oxidorreductasa heteróloga. La enzima glifosato oxidorreductasa cataliza la escisión del enlace C-N del glifosato, para dar amino metil fosfonato (AMPA) y glioxilato. En condiciones aerobias, se usa oxígeno como sustrato de la reacción. En condiciones anaerobias, otros portadores de electrones tales como metosulfato de fenazina y ubiquinona sirven como aceptores de electrones. También se describieron una variante de la glifosato oxidorreductasa que posee un K_{m} 10 veces menor para el glifosato que la glifosato oxidorreductasa de tipo salvaje y mutantes de esta variante generados mediante mutagénesis específica de sitio.
Con el fin de que el uso de plantas transgénicas útiles en agricultura producidas mediante transformación mediada por partículas sea económicamente viable, es necesario obtener la transformación de la línea germinal de una planta, de modo que la progenie de la planta también llevará el gen de interés. Actualmente la obtención de plantas transgénicas que exhiben expresión transitoria de un gen introducido se ha convertido en un procedimiento directo relativamente rutinario. Sin embargo, la obtención de una planta transformada en su línea germinal mediante procedimientos de transformación mediada por partícula conocidos actualmente en la técnica es un acontecimiento que aparece de pocas veces a regularmente.
Las patentes de EE.UU. 5.633.435 y 5.463.175 describen sojas tolerantes a glifosato obtenidas mediante transformación de inyección de micropartículas. Aunque el procedimiento implica la introducción de un marcador seleccionable en una planta o célula vegetal, el procedimiento de transformación es un procedimiento de cultivo celular muy laborioso.
Aunque el procedimiento descrito en la patente de EE.UU. 5.503.998 proporciona una reducción de la cantidad de trabajo que se debe realizar para identificar un acontecimiento de transformación de una línea germinal, la identificación de transformantes en la línea germinal sigue siendo una empresa muy laboriosa, que requiere la detección selectiva de un gran número de brotes. AL usar este procedimiento, la eficacia de la transformación (expresada como el porcentaje de transformantes en la línea germinal obtenido por explante sometido a bombardeo de partículas) es de sólo aproximadamente un 0,05%. Por tanto, con el fin de obtener una única planta transformada en su línea germinal, se debe someter a aproximadamente 2000 explantes a bombardeo de partículas y detectar de forma selectiva alrededor de 6000-8000 brotes usando el ensayo de destrucción tisular GUS.
Lo que se necesita en la técnica es un procedimiento eficaz para obtener plantas de soja transgénica transformadas en su línea germinal usando selección con glifosato.
Breve resumen de la invención
La presente invención es un procedimiento eficaz para obtener plantas de soja transformadas en su línea germinal usando selección con glifosato.
Es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para obtener plantas de soja transformadas en su línea germinal que sea más eficaz, económica y más fácil de emplear que los procedimientos existentes.
Breve descripción de las figuras
No procede.
Descripción detallada de la invención
La presente invención está dirigida a un protocolo para la transformación de genes extraños en la línea germinal de variedades de soja de élite. El procedimiento es independiente del genotipo y alcanza el nivel de eficacia no alcanzado antes mediante técnicas de transformación mediada por partículas útiles en la soja. Esta eficacia se obtiene, en parte, a través de la utilización de un sistema de marcador seleccionable basado en el uso del herbicida glifosato. Se ha descubierto que la selección de glifosato tiene una utilidad particular en un protocolo de transformación del tipo descrito en la presente por las características concretas del herbicida glifosato. La planta concentra biológicamente el glifosato en el meristemo de crecimiento de la planta. EL protocolo de transformación descrito en esta solicitud se basa en la transformación directa del tejido meristemático de crecimiento, Como tal, la técnica de transformación funciona junto con el glifosato, dado que ambos concentran sus efectos en la región meristemática de la propia planta en crecimiento. De este modo se minimizan los escapes, o acontecimientos no transformados que sobreviven a la selección, y la selección sigue consiguiendo toxicidad a la mayoría de los tejidos no transgénicos. La eficacia global alcanzada en el procedimiento de transformación es mejor que la que se puede obtener con otros marcadores seleccionables en los sistemas de transformación de soja basados en la transformación de tejido diferenciado.
También se descubrió durante el transcurso del trabajo descrito en la presente que el glifosato produce un efecto de tipo hormonal sobre los brotes de soja tratados. En esencia, el glifosato solo es eficaz a la hora de inducir la formación de múltiples brotes en ejes embrionarios de soja tratada. Esta observación condujo a un protocolo de regeneración sin hormonas que se describe a continuación.
Ejemplos de eficacia elevada, la transformación de la línea germinal de tejido de soja y la regeneración de plantas resistentes a glifosato a partir de células transformadas usando el procedimiento de la presente invención se detallan más adelante. Brevemente, el procedimiento requiere que se proporcionen un constructo de ADN heterólogo que comprende un promotor vegetal, una secuencia de ADN que codifica una proteína que confiere tolerancia a glifosato y una región terminadora de la transcripción sin traducir en 3'. Después, copias del constructo de ADN se recubren sobre partículas portadoras relativamente pequeñas de material biológicamente inerte y se introducen con rapidez en el interior de las células del tejido meristemático de soja. Tras la transformación del meristemo, los transformantes se seleccionan según la tolerancia al glifosato. El tejido tolerante a glifosato se regenera para formar plantas. Los transformantes en la línea germinal pueden, opcionalmente, verificarse mediante la selección de glifosato de la progenie de una planta regenerada a partir de tejido transformado.
Se proporcionan constructos de ADN heterólogos que codifican un gen o genes de expresión en una planta, que confieren tolerancia a glifosato a una planta que comprensa en constructo de ADN en su genoma. Los constructos de ADN comprenden un promotor vegetal conectado operablemente a una región codificadora de ADN que codifica una proteína que confiere tolerancia a glifosato y una señal de terminación en 3'. Preferentemente, el constructo de ADN codifica un gen adicional de interés. Por ejemplo, el constructo de ADN puede incluir un gen cuya expresión tiene como resultado mayores rendimientos o alteración del contenido de nutrientes en las plantas transformadas. En los siguientes ejemplos, las plantas de soja tolerantes a glifosato que expresan GUS o proteína fluorescente verde (GFP) se obtuvieron de tejido se transformaron con constructos de ADN que incluían un gen GUS o un gen GFP. Estos genes, que pueden servir como marcadores seleccionables, se usaron en algunos de los ejemplos que se describen más adelante simplemente porque sus fenotipos se pueden detectar con facilidad en las plantas transformadas. Es razonable esperar que mediante el uso de los constructos de ADN creados a través de técnicas de biología molecular estándar, la presente invención se puede emplear para obtener una planta d e soja que exprese prácticamente cualquier
otro gen.
En una forma de realización alternativa, el procedimiento para obtener plantas de soja transformadas en la línea germinal implica la cotransformación de dos constructos de ADN, uno de los cuales comprende un marcador de tolerancia a glifosato y otro de los cuales comprende un gen de interés.
Un constructo de ADN adecuado comprende una secuencia que codifica una o más de las siguientes enzimas: una ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshikímico sintasa (EPSP sintasa), una glifosato oxidorreductasa (GOX) o una combinación de dos o más enzimas que confieren tolerancia a glifosato. También se prevé el uso de otros genes que confieren resistencia a glifosato.
Un constructo de ADN adecuado puede tener una secuencia de ADN que codifica una EPSP de tipo salvaje, o una EPSP sintasa que se ha sometido a ingeniería genética o a mutagénesis. Preferentemente, la secuencia de ADN codifica una EPSP sintasa que es tolerante a glifosato. Por "EPSP sintasa tolerante a glifosato" se quiere decir una EPSP sintasa que posee un Ki elevado por glifosato y un Km bajo por PEP en relación con los parámetros de una EPSP sintasa a partir de una planta o microorganismo sensible a glifosato. En los siguientes ejemplos, una secuencia de ADN que codifica EPSP sintasa tolerante a glifosato designada CP4 se usó en los constructor de ADN y se descubrió que confería tolerancia a glifosato cuando se introdujeron solos o junto con otros genes de tolerancia a glifosato. El gen que codifica CP4 y la enzima GP4 se describen con detalle en la patente de EE.UU. 5.633.435, cuya descripción se incorpora en la presente memoria descriptiva como referencia. Cabe esperar que cualquier otra EPSP sintasa que tenga un K_{i} bajo por glifosato y un K_{m} alto por PEP funcionaría en la práctica de la presente invención.
Un constructo de ADN puede incluir un gen de glifosato oxidorreductasa de tipo salvaje o un gen de glifosato oxidorreductasa que se haya sometido a ingeniería genética o a mutagénesis. Preferentemente, el gen de glifosato oxidorreductasa tiene un K_{m} bajo por glifosato.
Existe un número de promotores que son funcionales en las células vegetales conocidas en la técnica, incluidos promotores constitutivos de de origen patogénico vegetal tal como los promotores de la nopalina sintasa (NOS) y de la octapina sintasa (OCS), los promotores 19S y 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y el promotor 35S del virus del mosaico de la escrofularia (FMV). Además, en la actualidad se están identificando promotores vegetales que tienden a ser específicos del desarrollo o de tejido. Para crear un constructo de ADN que posea un gen de expresión de tolerancia a glifosato, se puede usar cualquier promotor adecuado que se sabe, o que se pueda descubrir, que produce transcripción de ADN en células vegetales. Para que sea adecuado para usar en la presente invención, el promotor debería ser capaz de causar suficiente expresión génica para dar como resultado la síntesis de una cantidad de EPSP sintasa o de glifosato oxidorreductasa eficaz para convertir a la célula vegetal o a la planta en sustancialmente tolerante a glifosato. Preferentemente, el promotor empleado debería ser capaz de estimular la expresión en tejido meristemático así como estimular la expresión en otros tejidos, ya que se sabe que el glifosato se transloca y acumula en el tejido meristemático de las plantas.
En el ejemplo que figura más adelante, los constructos de ADN se colocaron como cubierta sobre partículas portadoras de oro como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.015.580, que se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia. Cabe esperar que la presente invención podría practicarse usando otros procedimientos para recubrir partículas portadoras, y que materiales de alta densidad biológicamente inertes distintos al oro pueden emplearse con éxito como partículas portadoras de ADN.
En los siguientes ejemplos se usó tejido meristemático expuesto para obtener plantas de soja tolerantes a glifosato. Se descubrió que el uso de tejido meristemático aumentaba en gran medida la frecuencia de las plantas de línea germinal transformada resistentes a glifosato obtenidas en relación a las obtenidas con el procedimiento de las patentes de EE.UU. números 5.463.175 y 5.633.435, en los que embriones intactos sirvieron como tejido diana, de acuerdo con el procedimiento de Christou y col. (Plant Physiol. 87: 671-674, 1988). Se sabe que el glifosato se acumula en el meristemo de las plantas de soja. La acumulación de glifosato en el meristemo puede ser la responsable del incremento espectacular de la incidencia de transformantes de línea germinal en relación con los acontecimientos de transformación totales obtenidos cuando se usa tejido meristemático para la transformación y regeneración de plantas de soja tolerantes a glifosato. Aunque la selección de glifosato se había usado antes para seleccionar plantas resistentes y para seleccionar células resistentes individuales indiferenciadas (como en el callo), no se disponía de base de experiencia para el uso de glifosato para seleccionar células individuales de un meristemo de planta en crecimiento diferenciado.
La selección sobre la base de resistencia a glifosato puede ser la única base para la identificación de plantas recombinantes o puede usarse junto con otros procedimientos de selección o de detección selectiva, En los siguientes ejemplos, la selección de glifosato se isa asola o junto con detección selectiva de expresión de GUS para identificar plantas transgénicas. Aunque en general es preferible poder obtener una selección eficaz usando un único marcador, tal como un marcador de tolerancia a glifosato, puede haber casos en los que es deseable o necesario usar más de un marcador para identificar los recombinantes.
Con tolerancia a glifosato se quiere decir la capacidad de una célula vegetal o planta transformada con un gen de tolerancia a glifosato para crecer en un medio que contenga glifosato a una concentración suficiente para inhibir de forma significativa las células no transformadas mientras se permite el crecimiento de células transformadas. Preferentemente, la concentración de glifosato es suficiente para inhibir el crecimiento de al menos aproximadamente el 80% de los explantes no transformados. LA concentración de glifosato debería ser suficiente para impedir la supervivencia del tejido no transformado, pero no tan grande como para reducir el vigor de las plantas transformadas. En los siguientes ejemplos, la selección de glifosato para células vegetales tolerantes a glifosato se llevó a cabo a concentraciones de glifosato en el intervalo de aproximadamente 0,01 mM a 1,0 mM. En algunos casos, la selección inicial se realizó a una concentración de glifosato superior, por ejemplo glifosato 0,2 mM, y el explante se transfirió posteriormente a una concentración de glifosato menor, por ejemplo 0,075 mM. Se encontró que las concentraciones en el intervalo de 0,025 mM a 0,2 mM proporcionaban una inhibición significativa de tejido no transformado sin afectar gravemente al vigor de los transformantes regenerados. Sin embargo, se prevé que el uso de glifosato a concentraciones que caigan fuera del intervalo usado en los ejemplos también sería útil en la presente invención.
Otros factores que pueden afectar a la eficacia de la identificación de un transformante que exprese un gen de resistencia incluyen el tiempo y la duración de la exposición al agente selectivo. Por tanto también se investigó. el efecto de variar estos parámetros y los resultados se resumen más adelante. Usando el procedimiento de la presente invención, los explantes transformados con un gen de tolerancia al glifosato se colocan en un medio que contiene glifosato inmediatamente después del bombardeo con partículas y/o durante varios días después del bombardeo sin que afecte a la eficacia de la transformación o al número de escapes. El término "escapes" como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a explantes no transformados que no se pueden distinguir de los explantes transformados sobre la base de a selección con glifosato sola. Tras un periodo de selección posterior al bombardeo, puede ser ventajoso, pero no parece ser necesario, eliminar tal selección con glifosato, para disminuir el estrés o los brotes de la planta en crecimiento. Se ha encontrado que al eliminar la selección durante la fase de elongación de los brotes y después no resta valor a la eficacia del procedimiento global.
Se puede pensar en el protocolo de transformación de plantas global como consistente en varias fases, cada una de ellas con requerimientos de medio únicos, los medios de ejemplo se describen más adelante. Existe una fase de acondicionamiento pre bombardeo, el tratamiento de introducción de partículas real, el cultivo posterior al bombardeo en el que se inducen los brotes, la elongación de los brotes y, después, la formación de las raíces y el endurecimiento de la planta. Se ha descubierto que sólo aplicando selección de glifosato durante un tiempo limitado durante el cultivo posterior al bombardeo es suficiente como para incrementar de forma espectacular la eficacia global del procedimiento de transformación. La aplicación de la selección de glifosato en otras fases todavía no es eficaz a la hora de aumentar la eficacia.
La eficacia de la transformación como se usa en la presente memoria descriptiva se calcula determinando el porcentaje de transformantes en la línea germinal como función del número de explantes sometidos a bombardeo con partículas.
Los procedimientos descritos en la presente se basan en la inducción directa de brotes a partir de meristemos de soja embrionaria tratada. Aunque el término "regeneración" se usa en la presente para describir la recreación de una planta completa a partir de tales meristemos tratados, el procedimiento de regeneración en este contexto es mucho menos difícil y menos arduo que la regeneración de plantas completas a partir de tejido vegetal no diferenciado, tal como tejido de callos o protoplastos. Mediante la inducción de la formación directa de brotes a partir de meristemos embrionarios tratados, los brotes en crecimiento diferenciados se crean directa y rápidamente, que crecen fácilmente en muchos medios diferentes en plantas de soja completas. La forma de hacer que este procedimiento funciones es la inducción directa de brotes diferenciados a partir del meristemo embrionario tratado. Durante en transcurso de esta investigación se encontró que el glifosato desempeña un papel sorprendente en este procedimiento.
Para crear formación de múltiples brotes independientes a partir de meristemos de soja tratados, era prioritario practicar el uso de tratamientos hormonales sobre el tejido tratado, principalmente usando BAP. En la presente se ha encontrado que el propio glifosato induce la formación de múltiples brotes independientes obviando la necesidad de la hormona. De hecho, como se describe en el Ejemplo 2 más adelante, la omisión del BAP y la dependencia del uso de glifosato solo para la selección y para la formación de brotes, permite un procedimiento que en realidad es más eficaz que el basado en formación de brotes inducido por hormonas. De nuevo, esta es una indicación de la interacción única entre esta molécula y el meristemo de soja en crecimiento que no ocurre con otros agentes.
En los ejemplos siguientes, los explantes de soja se sometieron a uno o dos bombardeos de partículas, con un intervalo de cuatro horas entre los dos bombardeos. Cabe esperar razonablemente que la presente invención se pueda practicar con variaciones en el número o la frecuencia de los bombardeos Un procedimiento de transformación que emplee un único bombardeo o más de dos bombardeos podría ser igualmente útil. La presente invención también está destinada a abarcar un procedimiento en el que los explantes se someten a múltiples bombardeos separados por un periodo de tiempo más prolongado o más corto que cuatro horas.
Los explantes transformados que expresan actividad de tolerancia a glifosato se regeneran en plantas completas. La elección de la metodología para la etapa de regeneración no es crucial para la presente invención. Se puede emplear cualquier procedimiento de regeneración de plantas de soja. Las formulaciones de los medios empleados en el desarrollo de este procedimiento se describen en los ejemplos. Cabe esperar que otros medios adecuados para la regeneración de plantas serían eficaces en la práctica de la presente invención.
Los ejemplos no limitantes siguientes están destinados a ser puramente ilustrativos.
Ejemplo 1 Procedimientos y materiales Preparación de los medios
Los medios empleados en el desarrollo de plantas de soja resistentes a glifosato se prepararon usando procedimientos estándar conocidos para el experto en la técnica. Las formulaciones de los medios se pueden encontrar en las referencias citadas o en la Tabla de medios (Tabla 4).
Preparación del meristemo para la transformación mediante bombardeo con partículas
Los ejes embrionarios se escincidieron de las semillas germinadas en medio de germinación de judías líquido (BGM) durante la noche a 20ºC en oscuridad. La composición del BGM se proporciona en el Apéndice. El tejido primario de las hojas se eliminó cuidadosamente para exponer la región meristemática. Los explantes se sembraron en medio OR perpendicular a la superficie, con los meristemos orientados lejos del medio, y los explantes se incubaron durante la noche a 15ºC en oscuridad. El medio OR es medio MS, modificado por Barwale y col. (Planta 167: 473-481, 1986) más 3 mg/l BAP, 200 mg/l de carbenicilina, 62,5 mg/l de cefotaxima y 60 mg/l de Benomil.
Preparación de láminas para el bombardeo de partículas
Una preparación de perlas para recubrir las láminas en expansión se preparó del siguiente modo. Cinco \mul de ADN (1 mg/ml) se añadieron a 100 \mul de espermidina 0,1M. La solución espermidina/ADN se transfirió a un vaso que contenía 10 mg de perlas de 0,71 \mum se agitó con vórtex completamente. Gota a gota y en agitación con vórtex continua se añadieron cien \mul de CaCl_{2} al 10%. La mezcla se dejó reposar durante 10 minutos, durante los cuales se produjo precipitación. Se eliminó el sobrenadante y al precipitado ADN/oro se resuspendió en 20 ml de etanol al 100%. Una alícuota de 320 \mul de la preparación de perlas se usó para recubrir cada lámina BLASTING. Las perlas se dejaron sedimentar durante aproximadamente 30 segundos, se eliminó el etanol y las láminas se dejaron secar.
Transformación y regeneración de explantes
Los explantes se transfirieron a un medio diana (8% de carboximetilcelulosa de baja densidad, 2% de carboximetilcelulosa de viscosidad media 0,4% de agar lavado) con los meristemos hacia arriba. Los explantes se bombardearon dos veces, con un intervalo de cuatro horas entre bombardeos, usando un instrumento de introducción de genes mediado por partículas de descarga eléctrica. Tras el bombardeo con partículas, los explantes se transfirieron a medio OR y: 1) se mantuvieron en un medio con glifosato; 2) se transfirieron a medio sin glifosato durante tres o cuatro días y después se transfirieron a medio con glifosato; o 3) se expusieron a glifosato durante un periodo de 14 días inmediatamente después del bombardeo. Los explantes se incubaron a 23ºC en oscuridad durante 2 ó 4 días. A continuación, los explantes de transfirieron a medio MSR (medio OR modificado sin hormona NAA más 0,4 mg/ml de BAP y 0,04 mg/ml de IBA) que contiene glifosafo de 0 a 0,2 mM y se colocaron a 28ºC en oscuridad durante 7 días. Los cultivos se aclimataron a la luz colocando los cultivos en un banco a la sombra durante dos días a 28ºC, seguido por su transferencia a luz completa (16 h de luz/8 h de oscuridad) durante dos días.
Una vez que los explantes estaban completamente verdes, se transfirieron a medio vegetal de madera (WPM) (McCown & Lloyd, Proc. Internacional Plant Propagation Soc., 30:421, 1981) con la adición de 0,04 mg/l de BAP, 200 mg/l de carbenicilina, 60 mg/l de benomil y glifosato de 0 a 0,2 mM. Los explantes se transfirieron normalmente tras dos semanas a WPM reciente con glifosato hasta que se completó la recolección.
Los brotes alongados estaban listos para su recolección a las cinco o seis semanas después del bombardeo. Sólo se recolectaron los brotes con tallos alongados (de aproximadamente 2,54 cm de longitud), trifoliáceos completos y una punta en crecimiento activo. Los brotes recolectados se transfirieron a medio de enraizamiento de judías (BRM; véase la Tabla de medios) que contiene glifosato de 0 a 0,025 mM. Las cosechas se continuaron semanalmente hasta que se realizaron de tres a cuatro cosechas.
En ocasiones, los brotes no transformados emergían en explantes que se habían mantenido más de dos meses tras la transformación o se habían incubado en medio en el que el glifosato se ha degradado. Se descubrió que los brotes no transformados podían distinguirse fenotípicamente de los brotes transformados sobre la base de los trifoliáceos estrechos y largos, los internódulos cortos y el aspecto de tipo árbol característico de los brotes no transformados. Los brotes no transformado se descartaron. Los explantes no descartados se transfirieron a WPM fresco que contiene glifosato.
Normalmente el enraizamiento tuvo lugar aproximadamente de una a cuatro semanas después de la transferencia a BRM. Después de desarrollar el sistema radicular, las plantas se transfirieron al suelo. Las plantas se mantuvieron en banco húmedo durante diversos días en un invernadero. Una ves que las plantas se habían endurecido, se transfirieron a condiciones de invernadero estándar, Una vez que una planta desarrolló de tres a cinco trifoliáceos, podía analizarse para determinar la presencia del marcador seleccionable o del gen de interés.
Construcción de plásmido
Los plásmidos se construyeron usando técnicas biológicas moleculares estándar conocidas para el experto habitual en la técnica. Los casetes de expresión contenidos en cada constructo empleado en los ejemplos se resumen en la Tabla 1, con el promotor el primero, seguido por el gen. El gen de CP4 usado en la construcción de los plásmidos enumerados en la Tabla 1 es el gen CP4syn, un gen sintético que codifica la CP4 EPSP sintasa. El gen se describió en la patente de EE.UU. nº 5.633.435, que se incorpora en la presente memoria descriptiva como referencia. El gen GOX empleado en la construcción de estos plásmidos era el gen GOXsyn, un gen de glifosato oxidasa sintética descrito en la patente de EE.UU. nº 5.463.175, que se incorpora en la presente memoria descriptiva como
referencia.
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TABLA 1
Plásmido Características
wrg4750 FMV CP4, FMV GUS, NOS NPT
pMON17204 FMV CP4, e35S GUS, FMV GOX, 35S NPTII
wrg4818 FMV CP4, e35S GFP
Pmon26140 FMV CP4 ) introducido en
WRG5306 Ubi 2 GUS ) cotransformación 
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Detección selectiva para el gen GUS en plantas de soja transformadas
Los brotes tolerantes a glifosato putativos se sometieron a detección selectiva para la expresión de GUS usando el ensayo de destrucción tisular GUS como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.503.998. Las semillas de una planta R0 tolerante a glifosato se pudieron evaluar para identificar acontecimientos de transformación de la línea germinal mediante la exposición secciones de semillas afeitadas (incluida una porción del cotiledón) a añil-glucurónido (5-bromo-4-cloro-3-indolil glucurónido) y visualizando la formación de un color azul. La semilla de la que se corta una sección es capaz de germinar y desarrollar en una planta. De este modo, las semillas que dan lugar a plantas transformadas en línea germinal R1 pueden identificarse con facilidad.
Detección selectiva del gen GFP en plantas de soja transformadas
La expresión del gen GFP se determinó en tejido de hoja y/o secciones de semilla afeitada usando un microscopio de fluorescencia de acuerdo con el procedimiento de Pang y col. (Pant Physiol. 112: 893-900, 1996).
Detección selectiva para CP4 usando LEISA
La presencia del gen de CP4 en plantas tolerantes a glifosato se confirmó mediante ELISA. El ensayo es un ensayo tipo sándwich de con inmunoadsorción con anticuerpos ligado a enzimas que detecta los niveles de proteína CP4 presentes en extractos de tejido vegetal. Los niveles de CP4 es las muestras de las plantas se compararon con un patrón de referencia purificado de CP4. Brevemente, placas de poliestireno de 96 pocillos se recubrieron con anti-CP4 de conejo purificada. El extracto de tejido vegetal y los patrones de referencia de CP4 se añadieron a posciclos recubiertos con anticuerpos adecuados. A continuación, las placas se incubaron durante 30 minutos a 37ºC y se lavaron. A las placas se añadieron anticuerpos anti CP4 conjugados de peroxidasa de rábano, se incubaron durante 30 minutos a 37ºC y los anticuerpos antiCP4 sin unir se eliminaron mediante lavado. Para visualizar la presencia de un sándwich de anticuerpos, a cada pocillos se añadió sustrato TMB y el pocillo se añadió para determinar el desarrollo de un color azul. La acción de peroxidasa en el sustrato TMB tiene como resultado la formación de un producto azul soluble. La reacción de peroxidasa se detiene ácido fosfórico 1M, lo que hace que el producto se ponga amarillo. La cantidad de CP4 presente en un pocillo está directamente relacionada con la intensidad del color en dicho pocillo.
Resultados Eficacia de la transformación usando selección con glifosato
Las eficacias de la transformación para cada ensayo se determinaron mediante el cálculo del porcentaje de familias transformadas en la línea germinal R1 obtenidas por explante sometido a bombardeo con partículas. Las eficacias de transformación obtenidas usando este procedimiento variaron de 0,89 a 5,21% (Tabla 2).
TABLA 2
Plásmido Explantes Línea germinal Eficacia de la transformación
en Familias R1 (según el marcador R1)
positivas para R1
wrg4750 96 1 1,04%
(FMV CP4, FMV GUS, NOS NPT) 96 3 3,13%
pMON17204 56 1 1,79%
(FMV CP4, e35s GUS, FMV GOX, 35s NPT) 56 2 1,79%
112 3 1,79%
112 1 2,68%
112 1 0,89%
56 2 1,79%
112 2 1,79%
112 2 1,79%
56 2 3,57%
96 1 2,08%
96 1 1,04%
96 1,04%
wrg4818 100 3 3,00%
(FMV CP4, e35s GFP) 100 4 4,00%
pMON26140/5306X 4688 38 0,81%
(FMV CP4, y Ubi 3 GUS) 
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Efecto del tiempo y la duración de la exposición a glifosato sobre la eficacia de la transformación y los escapes
El tiempo de exposición a glifosato de los explantes de soja tras el bombardeo con partículas no tuvo ningún efecto significativo sobre la eficacia de la transformación. Si el tiempo de exposición a glifosato afectara a la eficacia de la transformación se habría esperado que un retraso en la exposición incrementara la eficacia de la transformación. Sin embargo no se observó tal efecto; en consecuencia, no se obtiene ventaja alguna de retrasar la exposición a glifosato. Los datos recogidos hasta la fecha no indican que la exposición inmediata a glifosato parezca reducir el número de "escapes" (Tabla 3). Por tanto, en la práctica de la presente invención, los explantes transformados se transfieren a medio con glifosato inmediatamente después del bombardeo con partículas.
Incidencia de los transformante en la línea germinal usando cotransformación
Se descubrió que los transformantes en la línea germinal se pueden obtener con frecuencia elevada (eficacia de la transformación de aproximadamente un 0,8%) usando cotransformación de un constructo de ADN que contiene un gen de interés y un constructo de ADN que contiene un marcador glifosato de expresión (Tabla 3). Un gen GUS heterólogo colocado bajo el control de un promotor de ubiquitina (Ubi-GUS) se encontró en aproximadamente el 80% de las plantas tolerantes a glifosato obtenidas mediante cotransformación de un constructo que contiene el gen Ubi-GUS y un plásmido que contiene FMV-CP4.
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TABLA 3
Plásmido Explantes Plantas R0 ELISA R1 Familias Eficacia de la
CP4+ Gus/GFP + transformación
(según R1Gus+)
wrg4750
(FMV CP4, FMV GUS, NOS NPT)
Exp 31. Gly 0,2 mM, retraso 3 días 96 3 3/3 1/3 1,04%
Exp 31. Gly 0,1 mM, retraso 3 días 96 6 5/6 1/3 3,13%
TABLA 3 (continuación)
Plásmido Explantes Plantas R0 ELISA R1 Familias Eficacia de la
CP4+ Gus/GFP + transformación
(según R1Gus+)
pMON17204
(FMV CP4, e35s GUS, FMV GOX,
35s KAN)
Exp 5. Gly 0,1 mM, constante 56 9 Sin datos 1/9 1,79%
Exp 7. Gly 0,05 mM, constante 56 8 Sin datos 1/8 1,79%
Exp 7. Gly 0,1 mM, retraso 4 días 112 6 Sin datos 2/6 1,79%
Exp 7. Gly 0,2 mM, retraso 4 días 112 6 Sin datos 3/4 2,68%
Exp 20. Gly 0,01 mM, retraso 4 días 112 6 Sin datos 1/6 0,89%
Exp 20. Gly 0,01 mM, constante 56 5 Sin datos 1/5 1,79%
Exp 20. Gly 0,05 mM, retraso 4 días 112 7 Sin datos 2/7 1,79%
Exp 20. Gly 0,1 mM, retraso 4 días 112 3 Sin datos 2/3 1,79%
Exp 20. Gly 0,1 mM, constante 56 3 Sin datos 2/3 3,57%
Exp 33. Gly 0,1 mM, retraso 3 días 96 3 3/3 2/2 2,08%
Exp 33. Gly 0,075 mM, retraso 3 días 96 5 3/5 1/5 1,04%
Exp 33. Gly 0,075 mM, constante 96 3 3/3 1/2 1,04%
wrg4818
(FMV CP4, e35s GFP) 100 8 7/7 3/3 3,00%
Exp 33. Gly 0,1/0,075 mM, retraso 3 días 100 7 3/3 4/5 4,00%
Ejemplo 2 Procedimientos y materiales
Los medios, procedimientos y materiales se usaron como en el Ejemplo1 anterior, a excepción de lo que se indica en la presente a continuación.
Preparación de láminas para el bombardeo de partículas
Se usaron partículas de oro (perlas) de aproximadamente 1\mum de tamaño. Tras añadir CaCl_{2}, la precipitación y la eliminación del sobrenadante, el precipitante se resuspendió en 10 ml de etanol al 95%. Las partículas recubiertas de ADN se aplicaron a las láminas portadoras a una densidad de 0,1 mg/cm^{2}.
Transformación y regeneración
Una vez que los ejes embrionarios se escindieron y germinaron, como se describe en el Ejemplo 1, los explantes de plantaron en WPM y se almacenaron durante la noche a 15ºC.
TABLA 4
Exp. ID nº Explantes Brotes positivos la fenotipo visual Eficacia (en la recolección de brotes)
2215 992 294 30%
2216 624 114 18%
2228 640 100 16%
2229 640 241 38%
2241 512 90 18%
2242 512 67 13%
2248 512 136 27%
2249 512 66 13%
Los explantes se dispusieron en placas diana en matrices de 16 explantes y se sometieron a un único acontecimiento de introducción de genes mediada por partícula (blasto).
Los explantes se cultivaron después en presencia de glifosato pero la ausencia de las fitohormonas BAP o IBA. El medio usado tanto después del bombardeo y durante el disparo fue WPM con glifosato 0,075 mM sin BAP. El medio de enraizamiento usado fue como en el Ejemplo 1 suplementado con triptófano 0,500 mM, tirosina y fenila-
lanina.
Los resultados se resumen en la Tabla 4.
Resultados
Este protocolo se ha usado a escala de producción de ocho duplicados, usando el plásmido pWRG4750. Se sometieron primero a detección selectiva sobre la base del fenotipo visual. Los brotes no transformados aparecieron dulzones y claramente menos fuertes. Los números de la columna "Brotes positivos al fenotipo visual" fueron números de brotes emergidos de los tejidos tratados que parecían estar sanos y se resistentes a glifosato.
La eficacia en el momento de la recogida de los brotes es simplemente el número de brotes fenotípicamente positivos dividido por el número de explantes tratados. La eficacia media en dicha etapa fue del 22%.
La eficacia total del procedimiento depende, por supuesto, de la verificación de la expresión génica. Los brotes de los procedimientos 2215 y 2216 se sometieron a detección selectiva para la expresión génica (GUS). De los dos experimentos, respectivamente el 87% (257) y el 89% (101) de los brotes fenotípicamente positivos también fueron positivos para GUS. Suponiendo que estos resultados sean normales, la eficacia del procedimiento total de plantas transgénicas sería de aproximadamente el 20%, un índice muy eficaz.
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TABLA 5
Medio de germinación de judías (BGM 2,5%)
Compuesto Cantidad por litro
Reserva BTN 1 10 ml
Reserva BT Nº 2 10 ml
Reserva BT Nº 3 3 ml
Reserva BT Nº 4 3 ml
Reserva BT Nº 5 1 ml
Sacarosa 25 g
Ajustar a pH 5,8
Dispensado en frascos de 1 litro de medio, esterilizado en autoclave
Adiciones antes de usar: Por 1 L
Cefotaxima (50 mg/ml) 2,5 ml
Reserva de fungicida "Antilife" 3 ml
Reserva BT para el medio de germinación de judías
Preparar y almacenar cada reserva individualmente, Disolver cada producto químico de forma exhaustiva en el orden enumerad antes de añadir el siguiente. Ajustar el volumen de cada reserva en consecuencia. Almacenar a 4ºC.
Reserva BT n^{o} 1 (1 litro)
KNO_{3} 50,5 l
NH_{4}NO_{3} 24,0 g
MgSO_{4}7H_{2}O 49,3 g
KH_{2}PO_{4} 2,7 g
Reserva BT n^{o} 2 (1 litro)
CaCl_{2}7H_{2}O 17,6 g 
\newpage
Reserva BT n^{o} 3 (1 litro)
H_{3}BO_{3} 0,62 g
MnSO_{4}H_{2}O 1,69 g
ZnSO_{4}7H_{2}O 0,86 g
KI 0,083 g
NaMo_{4}2H_{2}O 0,072 g
CaSO_{4}-5H_{2}O 0,25 ml de 1,0 mg/ml reserva
CoCl_{4}-6H_{2}O 0,25 ml de 1,0 mg/ml reserva
Reserva BT n^{o} 4 (1 litro)
Na_{2}EDTA 1,116 g
FeSO_{4}7H_{2}O 0,834 g
Reserva BT n^{o} 5 (500 ml) (almacenar en envase envuelto en papel de aluminio)
Tiamina-HCl 0,67 g
Ácido nicotínico 0,25 g
Piridoxina-HCl 0,41 g
Medio de enraizamiento de judías (BRM)
Compuesto Cantidad por 4 L:
Sales MS 8,6 g
Mioinositol (grado de cultivo celular) 0,40 g
Reserva vitamina SBRM 8 ml
L-Cisteína (10 mg/ml) 40 ml
Sacarosa (ultrapura) 120 g
Ajustar a pH 5,8 32 g
Agar lavado
Adiciones después de esterilizar en autoclave
SBRM/Reserva de hormona TSG 20,0 ml
Premezclas hormonales para cultivo tisular de soja
MSR/TSG premezcla de hormonas
Usar 10,0 ml por litro
Almacenar en oscuridad a 4ºC
Cantidad por 1 litro Cantidad por 20 litros
0,80 ml BAP (0,5 mg/ml) 16,0 ml BAP (0,5 mg/ml)
0,040 ml IBA (1,0 mg/ml) 0,80 ml IBA (1,0 mg/ml)
9,16 ml SDW
OR/TSG premezcla de hormonas
Usar 10,0 ml por litro
Almacenar en oscuridad a 4ºC 
\newpage
Cantidad por 1 litro Cantidad por 30 litros
6,0 ml BAP (0,5 mg/ml) 180,0 ml BAP (0,5 mg/ml)
0,037 ml NAA (1,0 mg/ml) 1,11 ml NAA (1,0 mg/ml)
3,96 ml SDW 118,8 ml SDW
WPM/TSG premezcla de hormonas
Usar 10,0 ml por litro
Almacenar en oscuridad a 4ºC
Cantidad por 1 litro Cantidad por 50 litros
0,080 ml BAP (0,5 mg/ml) 14,0 ml BAP (0,5 mg/ml)
9,92 ml SDW 496,0 ml SDW
SBRM/TSG premezcla de hormonas (medio de enraizamiento de soja)
Usar 10,0 ml por litro para BRM
Almacenar en oscuridad a 4ºC
Cantidad por 1 litro Cantidad por 40 litros
6,0 ml IAA (0,033 mg/ml) 240,0 ml IAA (0,033 mg/ml)
4,0 ml SDW 160,0 ml SDW
Base de vitaminas para el medio de enraizamiento de soja (1 litro)
Glicina 1,0 g
Ácido nicotínico 0,25 g
Piridoxina HCl 0,25 g
Tiamina HCl 0,25 g
Disolver un ingrediente cada vez, llevar hasta el volumen, almacenar en un frasco cubierto con papel de aluminio en refrigerador durante no más de un mes.
Base de sales ms 3 veces menor (1 litro)
H_{2}BO_{3} 1,86 g
MnSO_{4}H_{2}O 5,07 g
ZnSO_{4}7H_{2}O 2,58 g
KI 0,249 g
NaMoO2H_{2}O 7,5 \mul
CaSO_{4}-5H_{2}O Reserva (1,0 mg/ml) 7,5 \mul
CoCl_{2}-6H_{2}O Reserva (1,0 mg/ml) 7,5 \mul
Disolver un producto químico cada vez, ajustar el volumen, almacenar en un refrigerador.
Base de fungicida antilife (100 ml)
Bravo (75% WP) 1,0 g
Benomil (50% OF) 1,0 g
Captán (50% WP) 1,0 g
Añadir a 100 ml de agua destilada estéril.
Agitar bien antes de usar.
Almacenar a 4ºC en oscuridad durante no más de una semana.

Claims (13)

1. Un procedimiento eficaz para obtener plantas de soja transformadas en su línea germinal usando selección con glifosato, que comprende las etapas de:
(a) proporcionar un constructo de ADN heterólogo que comprende un promotor funcional en plantas conectado operablemente a una secuencia codificadora de ADN, donde la codificadora que codifica una proteína capaz de conferir tolerancia a glifosato a una célula vegetal en la que se expresa la secuencia, y una señal de terminación en 3';
(b) recubrir copias del constructo de ADN en partículas portadoras de material biológicamente inerte, siendo las partículas portadoras pequeñas de tamaño en relación con una célula de soja;
(c) acelerar las partículas recubiertas en el tejido meristemático de un embrión de soja;
(d) inducir la formación de brotes a partir del tejido meristemático tratado cultivando el tejido meristemático tratado en un medio de cultivo posterior al bombardeo, que comprende glifosato.
(e) cultivar los brotes en un medio de brotes adecuado que contiene glifosato a una concentración suficiente para inhibir de forma significativa el crecimiento de las células de soja no transformadas para generar brotes de soja resistentes a glifosato;
(f) regenerar los brotes de la etapa (e) en plantas de soja genéticamente transformadas con mayor tolerancia al herbicida glifosato en relación con las plantas de soja de tipo salvaje.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que en el medio usado en la etapa (f) no hay glifosato.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el constructo de ADN comprende adicionalmente un gen de interés.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la inducción de la formación directa de brotes en la etapa (d) además comprende la adición de una hormona.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la hormona es BAP.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que en la etapa (d) la inducción de la formación directa del brote se consigue a través de la aplicación de glifosato sin el uso de otra hormona vegetal.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el constructo de ADN comprende un gen de la EPSP sintasa.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el gen de la EPSP sintasa es CP4.
9. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el constructo de ADN comprende además un gen que codifica una enzima seleccionada a partir del grupo constituido por glifosato oxidorreductasa.
10. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de evaluar el aspecto morfológico de los brotes como una medida de la tolerancia a glifosato y descartar antes de la etapa (f) los brotes que tienen un aspecto morfológico anormal.
11. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el nivel de glifosato usado en la etapa (e) se encuentra entre 0,01 y 1,0 mM de glifosato en el medio de cultivo.
12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el número de brotes transgénicos recuperado en forma de un porcentaje del número de meristemos tratados es de al menos un 1%.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el número de brotes transgénicos recuperado en forma de un porcentaje del número de meristemos tratados es de aproximadamente un 20%.
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