ES2264563T3 - Particulas semejantes al virus del papiloma, proteinas de fusion y procedimiento para su preparacion. - Google Patents

Particulas semejantes al virus del papiloma, proteinas de fusion y procedimiento para su preparacion.

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ES2264563T3 ES95934663T ES95934663T ES2264563T3 ES 2264563 T3 ES2264563 T3 ES 2264563T3 ES 95934663 T ES95934663 T ES 95934663T ES 95934663 T ES95934663 T ES 95934663T ES 2264563 T3 ES2264563 T3 ES 2264563T3
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNAS PARTICULAS RECOMBINANTES SIMILARES AL VIRUS DEL PAPILOMA OBTENIDAS MEDIANTE EXPRESION DE LAS PROTEINAS ESTRUCTURALES VIRALES L1 Y/O L2 CON DELECION DE UNA O VARIAS SECCIONES DE LA PROTEINA L1 Y/O L2 SIENDO LA CAPACIDAD PARA FORMAR PARTICULAS SIMILARES AL VIRUS COMO MINIMO IGUAL, PREFERIBLEMENTE MAYOR, QUE LA DE LA REPRODUCCION NATIVA Y/O PRODUCCION IN VITRO.

Description

Partículas semejantes al virus del papiloma, proteínas de fusión y procedimiento para su preparación.
La invención se refiere a partículas semejantes al virus del papiloma, proteínas, proteínas de fusión preparadas por vía recombinante, así como a procedimientos para la creación y purificación de estas partículas, proteínas y proteínas de fusión.
Las infecciones por determinados tipos ("de alto riesgo") de virus del papiloma genital humano (HPV), por ejemplo, HPV 16, 18 ó 45, constituyen un factor de riesgo importante para la formación de tumores malignos del tracto ano-genital, de los cuales el cáncer del cuello de útero (cáncer cervical) es, con diferencia, el más frecuente. Según estimaciones de la OMS, aparecen anualmente en todo el mundo medio millón de nuevos casos de esta enfermedad. Debido a esta incidencia, se ha investigado exhaustivamente la relación entre infección por HPV y el cáncer cervical:
a)
Las lesiones precursoras del cáncer cervical (neoplasias intraepiteliales cervicales: CIN) tienen como causa la infección por el virus del papiloma.
b)
Los genomas de determinados tipos de HPV (por ejemplo, 16, 18, 33, 35, 45) se detectan en más de 95% de las biopsias tumorales, así como en las líneas celulares derivadas de las mismas. En función del origen geográfico de los tumores, entre 50 y 70% de los mismos contienen HPV 16.
c)
En todos los casos investigados en este sentido, se trascriben los marcos de lectura E6 y E7 (Wettstein et al., en Pfister H. (ed.): Papillomaviruses and human cancer, pág.155 a 179, Boca Ratón, 1990).
d)
Las proteínas E6 y E7 se detectan en todas las líneas celulares de carcinoma cervical, así como en queratinocitos humanos transformados in vitro, y la mayoría de las pacientes con carcinoma cervical exhibe anticuerpos específicos contra E6 o E7.
e)
La expresión constitutiva de las proteínas E6/E7 es necesaria para la conservación del estado transformado de tumores HPV-positivos.
f)
Los genes E6 y E7 de HPV 16 y HPV 18 son biológicamente activos en los siguientes sistemas experimentales:
-
Inducción de la síntesis de ADN celular en células humanas;
-
Transformación de queratinocitos humanos y otras células en cultivo;
-
Formación de tumores en ratones transgénicos.
Otros tipos de HPV (en primer lugar, HPV 6 y 11) originan verrugas genitales benignas (condilomas acuminados) y se asocian con tumores malignos en casos extremadamente escasos (tipos "de bajo riesgo").
Los virus del papiloma genitales del ser humano se transmiten normalmente por las relaciones sexuales y, en la mayoría de los casos, conducen a una infección persistente de la mucosa ano-genital. De aquí se ha deducido que las infecciones primarias inducen tan sólo una inmunorrespuesta insuficiente, o que el virus ha desarrollado posibilidades de escapar a la vigilancia inmunológica en las células infectadas. Por otra parte, existen buenos indicios de que el sistema inmunológico interviene en la manifestación primaria o en la progresión maligna de las infecciones por el virus del papiloma (véase, por ejemplo, Altmann et al. (1994), en Minson A., Neil J., McCrae M: (eds.): Viruses and Cancer, Cambridge University Press, pág. 71 a 80).
a)
En los virus del papiloma animales (virus del papiloma de conejo y virus del papiloma bovino), se puede impedir la manifestación clínica de las infecciones primarias mediante vacunación con proteínas estructurales del virus, o con extractos de verrugas ("vacunas autólogas").
b)
Los roedores se protegen mediante vacunación con recombinantes vacunales positivos para HPV 16 E6 o E7, o con péptidos sintéticos, antes de la formación del tumor, tras la inoculación de células autólogas transformadas con HPV 16.
c)
La regresión de las verrugas es, a menudo, sistémica y se induce, en el caso de los virus del papiloma animales, por la transferencia de linfocitos de animales "en regresión".
d)
En pacientes con supresión inmunológica (por ejemplo, pacientes con trasplante renal o con infección por VIH), aumenta la incidencia de verrugas genitales, CIN y cánceres ano-genitales.
De aquí se ha deducido que debería ser posible desarrollar vacunas específicas contra el virus del papiloma, con el objetivo de impedir la infección primaria y la formación de cánceres genitales.
1.
La prevención de infecciones por HPV mediante la vacunación con proteínas estructurales del virus del papiloma L1 y L2 (vacunación profiláctica) es apropiada.
Dado que el virus del papiloma no se multiplica en cultivos celulares u otros sistemas experimentales hasta alcanzar títulos suficientes, las proteínas virales se pueden preparar sólo con ayuda de vectores recombinantes. Recientemente, se han descrito partículas semejantes al virus (VLP), que se forman tras la expresión de las proteínas estructurales virales L1 y L2 (o L1 solamente) en recombinantes vacunales o baculovirus. La purificación de las VLP se puede llevar a cabo de manera muy sencilla mediante centrifugación en gradientes de CsCl o de sacarosa.
El documento WO 93/02184 describe un método que pone a disposición "Papilloma virus like particles" (VLP's, partículas semejantes al virus del papiloma), que se utilizan en aplicaciones diagnósticas o como vacunas contra infecciones originadas por el virus del papiloma. El documento WO 94/20137 enseña que sólo se necesita la proteína L1 pa-
ra la preparación de VLP. Ésta se puede expresar de forma potenciada tras una mutación en la región 3' no traducida.
El documento WO 94/00152 describe una proteína capsídica principal L1, producida de forma recombinante, que imita el epitopo neutralizante conformacional sobre viriones de papiloma humanos y animales. Estas proteínas recombinantes se pueden utilizar como vacunas que protegen contra infecciones causadas por el virus del papiloma. El documento WO 93/00436 describe una proteína de fusión, que comprende la proteína L2 o fragmentos de la misma, para la vacunación.
2.
Tratamiento de carcinomas cervicales o lesiones precursoras, por inmunoterapia con ayuda de proteínas precoces del virus del papiloma (en primer lugar, E6 ó E7), que se expresan en las células infectadas de manera persistente (vacunación terapéutica).
Se acepta que, por medio de esta inoculación, se activan células T citotóxicas contra lesiones genitales con infección persistente. La población diana está constituida por pacientes con lesiones genitales pre-malignas o malignas asociadas con el HPV.
Las proteínas precoces de HPV se preparan por expresión en E. coli o vectores eucarióticos (por ejemplo, baculovirus o levaduras). La purificación se ve dificultada, sin embargo, por la escasa solubilidad y exige, por lo general, una combinación de cromatografía de intercambio iónico, filtración sobre gel y cromatografía de afinidad.
En la solicitud de PCT WO 93/20844 se expone que la proteína E7 del virus del papiloma de HPB o BPV es terapéuticamente eficaz en la regresión (aunque no en la prevención) de tumores por el virus del papiloma en mamíferos. Adicionalmente, se describen también secuencias de fragmentos de proteínas antígenas preferidas.
Sin embargo, hasta la fecha no se han descrito VLP que sean adecuadas para la vacunación tanto profiláctica como terapéutica. En el procedimiento mencionado en último lugar, el hecho de que, por ejemplo, las proteínas precoces de HPV sólo se puedan purificar de manera compleja debido a su reducida solubilidad, representa un inconveniente.
Resultaría especialmente deseable, sobre todo en lo que se refiere a una vacuna para la vacunación profiláctica y terapéutica, lograr una elevada producción de partículas.
En los procedimientos descritos hasta la fecha es una desventaja que no sea posible la preparación de VLP tras la expresión de L1 en E. coli.
La misión de la presente invención es, por lo tanto, poner a disposición tanto proteínas como VLP preparadas de forma recombinante que sean apropiadas para la vacunación profiláctica y terapéutica, así como procedimientos para la preparación de estas proteínas y VLP. Del mismo modo, debe posibilitarse una purificación sencilla de las proteínas recombinantes obtenidas. Igualmente, debería ser posible la preparación de VLP tras la expresión de L1 en E. coli.
La presente invención resuelve esta tarea de acuerdo con las presentes reivindicaciones independientes. Desarrollos, aspectos y detalles preferidos y adicionales de la invención se describen en las reivindicaciones dependientes de la descripción, así como en las formas de realización preferidas.
De acuerdo con la presente invención, se preparan VLP formadas por proteínas de fusión de proteínas HPV tardías y precoces (o fragmentos de las mismas) ("HVLP"), y que se pueden utilizar para la vacunación profiláctica o terapéutica. Una vacuna de estas características posee, con respecto a las preparaciones convencionales, las ventajas que se describen a continuación:
a)
En caso de vacunación profiláctica, las HVLP impiden mediante la inducción de anticuerpos específicos para L1/L2, no sólo la entrada del virus en las células, sino que eliminan las células ya infectadas (por inducción de células T citotóxicas) en caso que se haya producido anteriormente una infección, o que la inmunorrespuesta no fuera suficiente.
b)
En el caso de vacunación terapéutica, las HVLP eliminan las células infectadas de forma persistente (por ejemplo, en pacientes con CIN o carcinoma cervical), y evitan, sobre todo en pacientes con lesiones CIN, una reinfección.
c)
La purificación de las HVLP es igual de sencilla que la de las VLP sin proteínas HPV precoces.
Según la presente invención, se pueden preparar VLP a partir del virus del papiloma bovino (BVP) Tipo 1, y de los virus del papiloma humanos 11 y 16 tras la expresión de L1 más L2 o L1 sola en vacunas o baculovirus. Los experimentos demuestran que se pueden delecionar partes de la proteína L1 (secuencias de aminoácidos 311-351, 331-371, 391-431 de BPV 1; 306-315 de HPV 16), sin que se pierda la capacidad para formar VLP. Estas regiones existen en las proteínas L1 de todos los virus del papiloma, de modo que la región delecionada de L1 se puede sustituir por otras proteínas (de virus del papiloma o de otro origen), siendo posible, de esta forma, preparar partículas híbridas semejantes al virus.
Proteínas de fusión, compuestas por proteína L1 delecionada de diferentes tipo de HPV (en primer lugar, HPV 6, 11, 16, 18, 33, 35, 45), y las correspondientes proteínas precoces E1, E2, E4, E5, E6, E7 (o partes de las mismas) se preparan por expresión en recombinantes vacunales que se pueden construir el períodos muy cortos de tiempo. La formación de VLP compuestas por una proteína de fusión L1 se comprueba por microscopia electrónica, y la presencia de la proteína precoz de HPV se ensaya por análisis de transferencia de western con ayuda de antisueros específicos. Para la producción de HPLV a gran escala, la expresión de las proteínas se lleva a cabo en sistemas virales o eucarióticos, preferentemente en baculovirus o en levaduras.
Experimentos correspondientes para la preparación de proteínas de fusión se pueden llevar a cabo con proteínas de otros orígenes.
En la presente invención resultan esenciales las partículas semejantes a virus, preparadas de forma recombinante (virus like particles, VLP) que se forman tras la expresión de las proteínas estructurales virales L1 y/o L2, en donde se delecionan secciones de la proteína L1, sin que se pierda la capacidad para formar VLP.
Según la presente invención, las regiones delecionadas de la proteína L1 del virus del papiloma bovino Tipo 1 se refieren a las secuencias de aminoácidos 311-351. 331-371, 391-431. En el caso de las proteínas L1 del virus del papiloma humano 16, se trata, convenientemente, de la secuencia de aminoácidos 306-315.
En un desarrollo preferido de la presente invención, la región delecionada de las proteínas L1 está sustituida por otras proteínas o fragmentos de proteínas, obteniéndose en este caso proteínas de fusión. La fracción de proteína L1 asciende, de manera conveniente, a aprox. 50 hasta 99%, preferentemente aprox. 60 hasta 90% y, de forma especialmente preferida, aprox. 80%.
Sin embargo, según la presente invención, aun cuando no se mencione de forma explícita en lo sucesivo, se debe delecionar también más de una región de la proteína L1, que han de estar sustituidas, preferentemente, por otras proteínas o fragmentos de proteínas.
De manera especialmente preferida, la región delecionada en la proteína L1 está sustituida por otras proteínas de los virus del papiloma y/o proteínas de otro origen, siendo posible preparar, de esta forma, partículas híbridas semejantes al virus (HVLP).
De acuerdo con la presente invención, se ha demostrado especialmente conveniente llevar a cabo la formación de las VLP a partir de una proteína de fusión L1.
Las proteínas de fusión, en particular para la formación de partículas híbridas semejantes al virus, según un desarrollo adicional de la presente invención, están compuestas convenientemente por una proteína L1 delecionada de diferentes tipos de HPV (virus del papiloma humano), de forma especialmente preferida HPV 6, 11, 16, 18, 33, 35 y 45, y otras proteínas o fragmentos de proteínas. Preferentemente, estas otras proteínas o fragmentos de proteínas son las correspondientes proteínas precoces, o sus fragmentos tales como, por ejemplo, las proteínas precoces E1, E2, E4, E5, E6 y/o E7.
Según el procedimiento según la invención, la expresión de las proteínas de fusión y de las proteínas se lleva a cabo en vectores virales o eucarióticos y, de forma muy especialmente preferida, en baculovirus o en levaduras.
De acuerdo con un desarrollo adicional del procedimiento según la invención, las proteínas de fusión se preparan por expresión en recombinantes vacunales.
El empleo de las proteínas de fusión o de las partículas híbridas semejantes al virus para la preparación de una vacuna profiláctica y terapéutica tiene lugar, según la presente invención, preferentemente tras la adición de otros componentes.
Hasta ahora, para la preparación de VLP tales como, por ejemplo, de VLP de HPV 16, se ha expresado el marco de lectura abierto (ORF) L1 con ayuda de vectores eucarióticos tales como, por ejemplo, baculovirus. La formación de VLP ("ensamblaje") tiene lugar en el núcleo celular de células infectadas.
Para la presente invención resultan esenciales, por lo tanto, especialmente las partículas semejantes al virus del papiloma preparadas por vía recombinante, que se forman tras la expresión de las proteínas estructurales L1 y/o L2, en las que se ha delecionado una o múltiples secciones de la proteína L1, en donde la capacidad para la formación de partículas semejantes al virus se encuentra elevada en comparación con la formación nativa y/o la producción in vitro.
Según la presente invención, al menos una de las regiones delecionadas en la proteína L1 de un virus del papiloma, se refiere a una deleción, de manera conveniente, en la secuencia de aminoácidos C-terminal, preferentemente con una longitud de alrededor de 1 hasta 34 aminoácidos (AS), preferentemente de 1 hasta 26 aminoácidos (AS) y, en especial, de 26 AS.
Convenientemente, tras la introducción de la deleción C-terminal en la proteína L1, la producción de VLP se incrementa múltiples veces, preferentemente en al menos 10 veces y, en especial, alrededor de 10 a 100 veces.
En un desarrollo preferido de la presente invención, las regiones delecionadas de la proteína L1, especialmente del virus del papiloma bovino, se refiere a 26 aminoácidos C-terminales. De forma especialmente preferida, la deleción C-terminal de 26 AS de longitud (Gly-Ala-Gly-Cys-Ser-Thr-Val-Arg-Lys-Arg-Arg-Ile-Ser-Gln-Lys-Thr-Ser-Ser-Lys-Pro-Ala-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys), correspondiente a la posición de nucleótidos 7016 hasta 7093 GGGG CAGGAT GTT
CAACTGT GAGAAAACGA AGAAT TAGCC AAAAAACTTC CAGTAAGCCT GCAAAAAAAA AAAAAAAA, se introduce en el ORF L1 del virus del papiloma bovino Tipo 1 (BPV 1). De manera conveniente, tras la introducción de la deleción C-terminal en la proteína L1, la producción de VLP aumenta en al menos 10 veces.
Según un desarrollo adicional de la presente invención, la al menos una deleción en la proteína L1, se refiere a una secuencia de aminoácidos homólogos del virus del papiloma humano 15, u otros virus del papiloma.
Según un desarrollo preferido adicional, las regiones delecionadas en la proteína L1 se refieren a 34 aminoácidos C-terminales del virus del papiloma humano Tipo 16 (HPV 16), preferentemente la secuencia de AS Ala-Gly-Leu-Lys-Ala-Lys-Pro-Lys-Phe-Thr-Leu-Gly-Lys-Arg-Lys-Ala-Thr-Pro-Thr-Thr-Ser-Ser-Thr-Ser-Thr-Thr-Ala-Lys-Arg-Lys-
Lys-Arg-Lys-Leu, correspondiente a la posición de nucleótidos 7052 hasta 7153 GCAGGATTGA AGGCCAAACC AAAATTTACA TTAGGAAAAC GAAAAGCTAC ACCCACCACC TCATCTACCT CTACAACTGC TAAACGCA
AA AAACGTAAGC TG, que se introduce en el ORF L1 del HPV 16.
De forma especialmente preferida, la deleción de la proteína L1 comprende la señal de localización nuclear (NLS). La producción de partículas a partir de las proteínas L1 o de las proteínas L1 y de las proteínas L2 tiene lugar especialmente en el citoplasma. Preferentemente, las partículas se segregan en el sobrenadante, siendo especialmente preferida una secreción de aproximadamente 5 hasta 10% de las partículas.
La expresión de proteínas L1 o proteínas L1 y proteínas L2 en E. coli se produce según una forma de realización preferida adicional. En este caso, en la deleción C-terminal en la proteína L1 están incluidas, en particular, 6 histidinas adicionales. De manera conveniente, la preparación de VLP tras la expresión de proteínas L1 o de proteínas L1 y L2 tiene lugar en E. coli.
De acuerdo con la presente invención, las regiones delecionadas adicionales en la proteína L1 del virus del papiloma bovino Tipo 1 son, preferentemente, las secuencias de aminoácidos 311-351, 331-371, 391-431. En el caso de las proteínas L1 del virus del papiloma humano 16, se trata convenientemente de la secuencia de aminoácidos 306-
315.
En un desarrollo preferido de la presente invención, la región adicionalmente delecionada de las proteínas L1 está sustituida por otras proteínas o fragmentos de proteínas, en donde se obtienen proteínas que se designan, en lo sucesivo, como proteínas de fusión. La fracción de proteína L1 asciende, de manera conveniente, a aprox. 50 hasta 99%, preferentemente aprox. 60 hasta 90% y, de forma especialmente preferida, a aprox. 80%.
Sin embargo, según la presente invención, y aun cuando no se mencione explícitamente en lo sucesivo, se debe delecionar también más de una región adicional de la proteína L1, que, preferentemente, está sustituida por otras proteínas o fragmentos de proteínas.
De forma especialmente preferida, la región delecionada de la proteína L1 está sustituida por otras proteínas de virus del papiloma y/o proteínas de otro origen, siendo posible preparar, de este modo, partículas híbridas semejantes al virus (HVLP).
De acuerdo con la presente invención, se ha demostrado especialmente ventajoso que la formación de las VLP tenga lugar a partir de una proteína L1, una proteína de fusión L1, una proteína L1 y una proteína L2, una proteína de fusión L1 y una proteína L2, una proteína L1 y una proteína de fusión L2, o de la proteína de fusión L1 y una proteína de fusión L2, en donde se produce la deleción de muchas más secciones de la proteína L1. Según un desarrollo adicional de la presente invención, al menos una de las regiones delecionadas en la proteína L1 de un virus del papiloma corresponde a una secuencia de aminoácidos N-terminal.
Según la presente invención, en una forma de realización adicional, al menos una de las regiones delecionadas de la proteína L1 de un virus del papiloma corresponde a secuencias de aminoácidos en la región central de la proteína.
También esenciales para la invención son proteínas, especialmente para la formación de partículas híbridas semejantes al virus, en las que una o múltiples secciones de la proteína L1 han sido delecionadas. Al menos una de las regiones delecionadas en la proteína L1 se refiere a una deleción de una secuencia de aminoácidos C-terminal.
Las proteínas de fusión, especialmente para la formación de partículas híbridas semejantes al virus según un desarrollo adicional de la presente invención, están compuestas convenientemente por una proteína L1 delecionada de diversos virus del papiloma, de forma especialmente preferida de HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35 y 45, y otras proteínas o fragmentos de proteínas de virus del papiloma o de otro origen. De manera preferente, estas otras proteínas o fragmentos de proteínas son las correspondientes proteínas o fragmentos precoces de virus del papiloma tales como, por ejemplo, las proteínas precoces E1, E2, E4, E5, E6 y/o E7.
De acuerdo con el procedimiento según la invención, la expresión de las proteínas y/o de las proteínas de fusión, y la producción de partículas semejantes al virus del papiloma se lleva a cabo en vectores virales, eucarióticos o procarióticos, de forma muy especialmente preferida en recombinantes vacunales, en baculovirus, en levaduras o en bacterias, especialmente en E. coli.
Preferentemente, la producción de partículas se lleva a cabo en el citoplasma. Las partículas se segregan de forma especialmente preferida en el sobrenadante y, de manera muy especialmente preferida, se segregan aproximadamente 5 hasta 10% de las partículas en el sobrenadante.
De acuerdo con la presente invención, mediante la introducción de una deleción C-terminal de 26 aminoácidos (AS) de longitud en la posición de nucleótidos 7016-7093 en el ORF L1 del virus del papiloma bovino Tipo 1 (BPV 1), se incrementa especialmente la producción de VLP en más de 10 veces. De este modo, con idéntica cantidad de proteína L1, tal como se demuestra por ejemplo en una transferencia de western, se pone de manifiesto por microscopia electrónica un incremento del número de partículas. Dado que la deleción comprende, preferentemente, la señal de localización nuclear (NLS), la producción de partículas tiene lugar en el citoplasma y una parte considerable de las partículas se segrega en el sobrenadante. Esto resulta especialmente ventajoso, ya que la purificación se facilita de forma importante.
Las proteínas, preferentemente con la mencionada deleción con 6 histidinas adicionales (proteínas His-L1), se expresan según la presente invención en E. coli. Las proteínas, en particular las proteínas His-L1, se purifican preferentemente por cromatografía de afinidad sobre Ni, en donde las proteínas, de acuerdo con una forma de realización ventajosa, se encuentran presentes, en ese momento, en un tampón de desnaturalización, por ejemplo, hidrocloruro de guanidina 6M. La renaturalización tiene lugar, por ejemplo, en NaCl 150 mM, CaCl_{2} 1 mM, Triton-X 100 al 0,01%, Hepes 10 mM (ácido N-2-hidroxietil-piperazina-N'-2-etanosulfónico), pH 7,4.
La producción (ensamblaje) de VLP se efectúa, según un desarrollo preferido de la presente invención, tras la diálisis de las proteínas, convenientemente tras la diálisis contra NaCl 150 mM, Ca^{2+} 25 mM, DMSO (dimetilsulfóxido) al 10%, Triton-X 100 al 0,1%, ácido tris [tris-(hidroximetil)amino-metano] acético, a un valor de pH de 5,0.
La deleción de secuencias en la proteína L1 de todos los virus del papiloma, que impide el ensamblaje prematuro de las VLP, conduce a un rendimiento mayor en la producción de VLP.
Si en estos casos está implicada la NLS L1, el ensamblaje tiene lugar en el citoplasma. De esta forma, es posible llevar a cabo la purificación de las VLP, según la invención, en el citoplasma en lugar de, como se hacía hasta la fecha, en el núcleo celular. De acuerdo con la invención, son posibles también deleciones más cortas. Según la presente invención, se llevan a cabo deleciones de hasta un aminoácido y/o sustituciones de hasta un aminoácido. En este caso, se demuestra conveniente que ante deleciones o sustituciones cortas de uno a pocos aminoácidos, las propiedades antígenas de las proteínas y de las VLP formadas a partir de las mismas se modifiquen en el menor grado posible con respecto a las propiedades antígenas nativas de las proteínas o VLP.
La introducción de una deleción C-terminal o sustitución, como las anteriormente mencionadas, en las proteínas de fusión L1 conduce también a un incremento de la producción de VLP híbridas. En este caso, se deben incluir también las VLP que contienen solamente proteínas de fusión L1, así como VLP híbridas, que contienen una proteína de fusión L1 y una proteína L2 o L1.
Para ello, se preparan VLP compuestas por proteínas de fusión de proteínas de HPV precoces o tardías (o fragmentos de las mismas) ("HVLP"), y que se pueden utilizar para la vacunación profiláctica o terapéutica. Una vacuna de este tipo posee, con respecto a los preparados convencionales, las ventajas que se describen a continuación:
a)
En caso de vacunación profiláctica, las HVLP impiden, mediante la inducción de anticuerpos específicos L1/L2, no sólo la entrada del virus en las células, sino que eliminan las células ya infectadas (por la inducción de células T citotóxicas), en caso que se haya producido previamente una infección, o si la inmunorrespuesta humoral no fue suficiente.
b)
En caso de vacunación terapéutica, las HVLP eliminan las células infectadas de forma persistente (por ejemplo, en pacientes con CIN o carcinoma cervical), e impiden, sobre todo en pacientes con lesiones CIN, una reinfección.
c)
La purificación de las HVLP es igual de sencilla que la de las VLP sin proteínas HPV precoces.
Las VLP del virus del papiloma bovino (BPV) Tipo 1 y de los virus del papiloma humanos 11 y 16 se pueden preparar tras la expresión de L1 más L2, o de L1 sola en vacunas o baculovirus. Los experimentos demuestran que se pueden delecionar partes de la proteína L1 (secuencias de aminoácidos 311-351, 331-371, 391-431 de BPV; 306-315 de HPV 16), sin que se pierda la capacidad para formar VLP. Estas regiones existen en las proteínas L1 de todos los virus del papiloma, de modo que la región delecionada de L1 se puede sustituir por otras proteínas (de virus del papiloma o de otro origen), y que, de esta forma, se pueden preparar partículas híbridas semejantes al virus.
Las proteínas de fusión, compuestas por una proteína L1 delecionada de diversos tipos de HPV (en primer lugar, HPV 6, 11, 16, 18, 33, 35, 45) y las correspondientes proteínas precoces E1, E2, E4, E5, E6, E7 (o partes de las mismas), se preparan mediante expresión en recombinantes vacunales, que se pueden construir en un período muy corto de tiempo. La formación de VLP, compuestas por una proteína de fusión L1, se comprueba por microscopia electrónica, y la presencia de la proteína HPV precoz se ensaya por análisis de transferencia de western con ayuda de antisueros específicos. Para la producción a gran escala de HPLV, la expresión de las proteínas se lleva a cabo en sistemas virales, eucarióticos o procarióticos, preferentemente en baculovirus, en levaduras, o en E. coli.
El uso de las proteínas de fusión o de las partículas híbridas semejantes al virus para la preparación de una vacuna profiláctica o terapéutica se efectúa, de acuerdo con la presente invención, tras la adición de otros componentes.
Los correspondientes experimentos para la preparación de proteínas de fusión se pueden llevar a cabo con proteínas de otros orígenes.

Claims (46)

1. Partículas semejantes al virus del papiloma, preparadas por vía recombinante, que se forman tras la expresión de las proteínas estructurales L1 o L1 y L2 virales, caracterizadas porque se deleciona una o múltiples regiones de la proteína L1, conservándose la capacidad para formar partículas semejantes al virus.
2. Partículas semejantes al virus según la reivindicación 1, caracterizadas porque las regiones delecionadas en la proteína L1 se refieren a las secuencias de aminoácidos 311-351, 331-371, 391-431 del virus del papiloma bovino de Tipo 1.
3. Partículas semejantes al virus según la reivindicación 1, caracterizadas porque las regiones delecionadas en la proteína L1 se refieren a la secuencia de aminoácidos 306-315 del virus del papiloma humano 16.
4. Partículas semejantes al virus del papiloma, preparadas por vía recombinante, formadas tras la expresión de las proteínas estructurales L1 o L1 y L2 virales, caracterizadas porque se delecionan una o múltiples regiones de la proteína L1, en donde se incrementa la capacidad para formar partículas semejantes al virus en comparación con la formación nativa y/o la producción in vitro.
5. Partículas semejantes al virus según la reivindicación 4, caracterizadas porque al menos una de las regiones delecionadas en la proteína L1 de un virus del papiloma se refiere a secuencias de aminoácidos C-terminales.
6. Partículas semejantes al virus según la reivindicación 5, caracterizadas porque la al menos una sección delecionada en la región C-terminal en la proteína L1 se refiere a una secuencia de aminoácidos con una longitud de aproximadamente 1 hasta 34 aminoácidos, preferentemente 1 hasta 26 aminoácidos, de un virus del papiloma.
7. Partículas semejantes al virus según una de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizadas porque tras la inserción de, especialmente, la deleción C-terminal en la proteína L1, la producción de VLP se incrementa de manera múltiple, preferentemente en al menos 10 veces y, de forma especialmente preferida, en alrededor de 10 hasta 100 veces.
8. Partículas semejantes al virus según una de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizadas porque las regiones delecionadas en la proteína L1 se refieren a 26 aminoácidos C-terminales del virus del papiloma bovino.
9. Partículas semejantes al virus según la reivindicación 8, caracterizadas porque la deleción C-terminal de 26 AS de longitud (Gly-Ala-Gly-Cys-Ser-Thr-Val-Arg-Lys-Arg-Arg-Ile-Ser-Gln-Lys-Thr-Ser-Ser-Lys-Pro-Ala-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys), correspondiente a la posición de nucleótidos 7016 hasta 7093 GGGGCAGGAT GTTCAACTGT GA
GAAAACGA AGAATTAGCC AAAAAACTTC CAGTAAGCCT GCAAAAAAAA AAAAAAAA, se introduce en el ORF L1 del virus del papiloma bovino de Tipo 1.
10. Partículas semejantes al virus según una de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizadas porque las regiones delecionadas en la proteína L1 se refieren a 34 aminoácidos C-terminales del virus del papiloma humano del Tipo 16 (HPV 16).
11. Partículas semejantes al virus según la reivindicación 10, caracterizadas porque la deleción C-terminal, de 34 AS de longitud (Ala-Gly-Leu-Lys-Pro-Lys-Phe-Thr-Leu-Gly-Lys-Arg-Lys-Ala-Thr-Pro-Thr-Thr-Ser-Ser-Thr-Ser-Thr-Thr-Ala-Lys-Arg-Lys-Lys-Arg-Lys-Leu), correspondiente a la posición de nucleótidos 7052 hasta 7153 GCAG
GATTGA AGGCCAAACC AAAATTTACA TTAGGAAAAC GAAAAGCTAC ACCCACCACC TCATCTACCT
CTACAACTGCATAAACGCAAA AAACGTAAGC, se introduce en el ORF L1 del virus del papiloma humano del Tipo 16 (HPV 16).
12. Partículas semejantes al virus según una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizadas porque la al menos una deleción en la región C-terminal en la proteína L1 se refiere a una secuencia de aminoácidos homólogos del virus del papiloma humano 16 o de otros virus del papiloma.
13. Partículas semejantes al virus según una de las reivindicaciones 4 a 12, caracterizadas porque la deleción de la proteína L1 comprende la señal de localización nuclear (NLS).
14. Partículas semejantes al virus según una de las reivindicaciones 4 a 13, caracterizadas porque la producción de partículas a partir de las proteínas L1 o las proteínas L1 y L2 tiene lugar en el citoplasma.
15. Partículas semejantes al virus según una de las reivindicaciones 4 a 14, caracterizadas porque las partículas se segregan en el sobrenadante.
16. Partículas semejantes al virus según la reivindicación 15, caracterizadas porque aprox. 5 hasta 10% de las partículas se segrega en el sobrenadante.
17. Partículas semejantes al virus según una de las reivindicaciones 4 a 16, caracterizadas porque la expresión de las proteínas L1 o de las proteínas L1 y L2 se lleva a cabo en E. coli.
18. Partículas semejantes al virus según la reivindicación 17, caracterizadas porque en la deleción C-terminal en la proteína L1 se introducen 6 histidinas.
19. Partículas semejantes al virus según una de las reivindicaciones 17 a 18, caracterizadas porque la preparación de VLP se lleva a cabo tras la expresión de proteínas L1 o de proteínas L1 y L2 en E. coli.
20. Partículas semejantes al virus según una de las reivindicaciones 4 a 19, caracterizadas porque las restantes regiones delecionadas en la proteína L1 se refieren a las secuencias de aminoácidos 311-351, 331-371, 391-431 del virus del papiloma bovino del Tipo 1.
21. Partículas semejantes al virus según la reivindicación 20, caracterizadas porque las restantes deleciones en la proteína L1 se refieren a la secuencia de aminoácidos 306-315 del virus del papiloma humano 16.
22. Partículas semejantes al virus según una de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizadas porque la región delecionada de proteínas L1 está sustituida por otras proteínas o fragmentos de proteínas, para obtener una proteína de fusión.
23. Partículas semejantes al virus según la reivindicación 22, caracterizadas porque la fracción de proteína L1 asciende aprox. a 50-99%, preferentemente aprox. a 60 hasta 90% y, de forma especialmente preferida, a aprox. 80% de la proteína de fusión.
24. Partículas semejantes al virus según las reivindicaciones 22 y 23, caracterizadas porque la región delecionada en la proteína L1 está sustituida por otras proteínas de virus del papiloma y/o proteínas de otro origen, a través de lo cual se pueden preparar partículas híbridas semejantes al virus.
25. Partículas semejantes al virus según una de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizadas porque la formación de las partículas semejantes al virus se lleva a cabo a partir de una proteína L1, una proteína de fusión L1, una proteína L1 y una proteína L2, una proteína de fusión L1 y una proteína L2, una proteína L1 y una proteína de fusión L2, o de una proteína de fusión L1 y una proteína de fusión L2.
26. Partículas semejantes al virus según una de las reivindicaciones 4 a 25, caracterizadas porque al menos una de las regiones delecionadas en la proteína L1 de un virus del papiloma se refiere a secuencias de aminoácidos N-terminales.
27. Partículas semejantes al virus según una de las reivindicaciones 4 a 26, caracterizadas porque al menos una de las regiones delecionadas en la proteína L1 de un virus del papiloma se refiere a secuencias de aminoácidos de la región central de la proteína.
28. Proteínas de fusión para la formación de partículas híbridas semejantes al virus del papiloma, según una de las reivindicaciones 22 a 25, caracterizadas porque las proteínas de fusión contienen proteínas L1 delecionadas de diferentes virus del papiloma, y otras proteínas o fragmentos de virus del papiloma o de otro origen.
29. Proteínas de fusión para la formación de partículas híbridas semejantes al virus del papiloma, según una de las reivindicaciones 22 a 25, en donde las proteínas de fusión contienen proteínas L1 delecionadas de diferentes virus del papiloma y otras proteínas o fragmentos de virus del papiloma o de otro origen, caracterizadas porque las otras proteínas o fragmentos son proteínas precoces de virus del papiloma o fragmentos de las mismas.
30. Proteína de fusión según la reivindicación 28 ó 29, caracterizada porque se refiere a proteínas precoces E1, E2, E4, E5, E6, E7, o fragmentos de las mismas.
31. Proteínas de fusión según una de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizadas porque se refieren a proteínas L1 delecionadas de diferentes tipos de HPV tales como HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 45.
32. Procedimiento para la expresión de las proteínas de fusión, según una de las reivindicaciones 28 a 31, caracterizado porque la expresión de las proteínas y proteínas de fusión se lleva a cabo en vectores virales o eucarióticos.
33. Procedimiento para la expresión de las proteínas de fusión y la producción de partículas semejantes al virus del papiloma, según una de las reivindicaciones 4 a 31, caracterizado porque la expresión de las proteínas L1 y/o L2 y de las proteínas de fusión se lleva a cabo en vectores virales, eucarióticos o procarióticos.
34. Procedimiento según una de las reivindicaciones 32 ó 33, caracterizado porque las proteínas L1 y/o L2 o las proteínas de fusión se preparan por expresión en recombinantes vacunales.
35. Procedimiento según una de las reivindicaciones 32 ó 33, caracterizado porque la expresión de las proteínas L1 y/o L2 y de las proteínas de fusión se lleva a cabo en baculovirus o en levaduras.
36. Procedimiento según la reivindicación 33, caracterizado porque la expresión de las proteínas L1 y/o L2 y de las proteínas de fusión se lleva a cabo en E. coli.
37. Procedimiento según la reivindicación 36, caracterizado porque la purificación, especialmente de las proteínas L1, tiene lugar mediante cromatografía de afinidad sobre Ni y renaturalización, preferentemente en NaCl 150 mM, CaCl_{2} 1 mM, Triton-X 100 al 0,01%, Hepes 10 mM a pH 7,4.
38. Procedimiento según la reivindicación 37, caracterizado porque las proteínas, en el momento de la purificación, están presentes en tampón de desnaturalización.
39. Procedimiento según la reivindicación 38, caracterizado porque el tampón de desnaturalización es hidrocloruro de guanidina 6M.
40. Procedimiento según una de las reivindicaciones 33 a 39, caracterizado porque el ensamblaje de las VLP se produce después de la diálisis.
41. Procedimiento según la reivindicación 40, caracterizado porque la diálisis se lleva a cabo contra NaCl 150 mM, Ca^{2+} 25 mM, DMSO 10 mM, Triton-X 100 al 0,1% y ácido Tris acético 10 mM, a pH = 5,0.
42. Procedimiento según una de las reivindicaciones 33 a 41, caracterizado porque la producción de partículas tiene lugar en el citoplasma.
43. Procedimiento según una de las reivindicaciones 33 a 42, caracterizado porque las partículas se segregan en el sobrenadante.
44. Procedimiento según la reivindicación 43, caracterizado porque aproximadamente 5 hasta 10% de las partículas se segregan en el sobrenadante.
45. Uso de las proteínas de fusión según una de las reivindicaciones 28 a 31 para la preparación de una vacuna para la vacunación profiláctica y/o terapéutica, preferentemente tras la adición de otros componentes.
46. Uso de las partículas híbridas semejantes al virus, según una de las reivindicaciones 1 a 27, para la preparación de una vacuna para la vacunación profiláctica y/o terapéutica, preferentemente tras la adición de otros componentes.
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