JP4614765B2 - L2ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス16l1タンパク質、それから調製したウイルス様粒子および該粒子の調製方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ヒト・パピローマウイルスのポリペプチド、詳細にはウイルス様粒子(VLP)またはキャプソメアを調製する方法に関する。
本発明の第1の形態によれば、
HPV L2ペプチドをコードするDNA配列を、L1ポリペプチドをコードするDNA配列に導入し;
L1ポリペプチドおよびL2ペプチドの配列を含むDNA配列を、中で該DNA配列を発現し得る宿主細胞に導入し;
該DNA配列を発現させ;ついで
L2ペプチドを含む得られたキメラL1ポリペプチドを回収する
工程を含む、HPV L2ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドを作製する方法を提供する。
LVEETSFIDAGAP(配列番号:1)、またはその修飾体もしくは誘導体である配列を有し得、但し、その修飾配列または誘導配列は、配列番号:1の配列に少なくとも80%相同性を有し、かつ、HPVに対する免疫原性応答を誘起するペプチドをコードする配列である。
異種ペプチドをコードするDNA配列を、L1ポリペプチドをコードするDNA配列に導入し;
L1ポリペプチドおよび異種ペプチドの配列を含むDNA配列を、該DNA配列を発現し得る宿主細胞に導入し;
該DNA配列を発現させ;ついで
異種ペプチドを含む得られたキメラL1ポリペプチドを回収する
工程を含む、異種ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドを作製する方法を提供する。
キメラ構築物の設計
HPVの少ない方のキャプシドタンパク質、L2の領域(aa)108−120のHPV6および16に対する共通の中和エピトープであるペプチド:
LVEETSFIDAGAP(配列番号:1)
をコードするプライマーを合成した。
A: E−Fループ(配列番号:4および5)
C: D−Eループ(配列番号:6および7)
E: L1のh4へリックスとJ領域との間の領域(配列番号:8および9)
F: h4へリックス(配列番号:10および11)
H: 内部C−Dループ(配列番号:12および13)
キメラ構築物は、L2ペプチドをコードする3'末端を用いて設計したプライマーを用いるPCRによって調製した。pSKプラスミドベクターにクローン化したHPV 16SA−optL1遺伝子(配列番号:3および4)をテンプレートとして用いた。以下のDNA配列:
TGGTGCACCA−3'(配列番号:14)
ウェスタンブロットは、ウサギにおいてペプチドに対して作らせたポリクローナルL2抗体(The Jake Gittlen Cancer Research Institute, The Milton S. Hershey Medical Centre, Hersey Pennsylvania, USAのNeil Christensen博士から得た)がキメラL1粒子(55kD)に結合することを示し、これはL2エピトープがキメラ構築物によって発現されていることを示している。
電子顕微鏡観察の結果は、キメラ構築物から形成された粒子が野生型HPV L1遺伝子によって生成されたものと同一でないことを示した。形成された粒子は主として部分的に分解されているかまたは部分的にバラバラになった状態であり、一般的に互いに凝集しているように見える。
6セットの5匹のBalb/cマウスを動物実験に用いて、キメラVLPの接種が免疫応答を誘起するかを判定した。5のキメラ構築物から生成したキメラVLPおよび非キメラHPV16 L1(SA−opt)から生成したキメラVLPを100μgの濃度で2の皮下部位に注射した。0、2および4週目に動物に接種した。血液試料および膣洗液を種々の期間に採取した。
結果は、高い免疫応答が達成されたことを示している。
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Claims (31)
- 免疫原性HPV L2ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、
(i)E−Fループ;
(ii)D−Eループ;
(iii)h4ヘリックスおよびJ領域の間の領域;
(iv)h4ヘリックス;および
(v)内部C−Dループ
から選択されるL1ポリペプチドの表面領域
でL1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに導入し;
L1ポリペプチドおよびL2ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、中で該ポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞に導入し;
該ポリヌクレオチドを発現させ;ついで
L2ペプチドを含む得られたキメラL1ポリペプチドを回収する
工程を含む、免疫原性HPV L2ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドを作製する方法。 - 該HPV L1ポリペプチドおよび/または該HPV L2ペプチドが、HPV−16のポリペプチドまたはペプチドである請求項1記載の方法。
- 該HPV L2ペプチドが、以下のアミノ酸配列:
LVEETSFIDAGAP(配列番号:1)または配列番号:1に対して少なくとも80%の同一性を有し、かつ、HPVに対する免疫原性応答を誘起することができるペプチドをコードする配列を有する請求項1または2記載の方法。 - 該L1ポリヌクレオチドの1またはそれを超えるヌクレオチドが、L2ポリヌクレオチドの導入の点において欠失している、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
- 該L1ポリヌクレオチドから欠失したヌクレオチドの数が、挿入したL2ヌクレオチドの数に対応する請求項4記載の方法。
- 該ポリペプチドの発現が、原核生物または真核生物の発現系のいずれかにおいてである請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 該キメラ・ポリペプチドが、図6、8、10、12および14のいずれか1に記載のアミノ酸配列(配列番号:5、7、9、11および13)またはその修飾体を有し、但し、該修飾体は挿入したL2ペプチドの修飾体であって配列番号:1の配列に少なくとも80%同一であり、かつ、該キメラ・ポリペプチドはHPVに対する免疫原性応答を誘起することができる請求項1ないし6のいずれか1項に記載の方法。
- 該キメラ・ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、図5、7、9、11および13のいずれか1に記載のヌクレオチド配列(配列番号:4、6、8、10および12)またはその修飾体を有し、但し、該修飾体は挿入したL2ポリヌクレオチドの修飾体であって配列番号:1の配列に少なくとも80%の同一性を有するペプチドをコードし、かつ、該ポリヌクレオチドはHPVに対する免疫原性応答を誘起することができるキメラ・ポリペプチドをコードする請求項1ないし6のいずれか1項に記載の方法。
- 該キメラL1ポリペプチドが、ウイルス様粒子および/またはキャプソメアに会合することができる請求項1ないし8のいずれか1項に記載の方法。
- 該ウイルス様粒子またはキャプソメアが免疫原性である請求項9記載の方法。
- 中に配列番号:1または少なくとも80%の同一性を有する配列の免疫原性HPV L2ペプチドをコードするポリヌクレオチドが、
(i)E−Fループ;
(ii)D−Eループ;
(iii)h4ヘリックスおよびJ領域の間の領域;
(iv)h4ヘリックス;および
(v)内部C−Dループ
から選択されるL1ポリペプチドの表面領域で挿入されており、かつ、該HPV L2ペプチドを発現することができる、キメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリヌクレオチド。 - 該L1ポリヌクレオチドの1またはそれを超えるヌクレオチドが、L2ポリヌクレオチドの導入の点で欠失している請求項11記載のHPV L1ポリヌクレオチド。
- L1ポリヌクレオチドから欠失したヌクレオチドの数が、L2ペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入したヌクレオチドの数に対応する請求項12記載のHPV L1ポリヌクレオチド。
- 図5、7、9、11および13のいずれか1に記載のDNA配列(配列番号:4、6、8、10および12)、またはその修飾体であるDNA配列を有し、但し、その修飾DNA配列は配列番号:4、6、8、10および12のいずれか1の挿入領域の修飾体であって配列番号:1の配列に少なくとも80%の同一性を有し、ここに該HPVポリヌクレオチドは、
(i)E−Fループ;
(ii)D−Eループ;
(iii)h4ヘリックスおよびJ領域の間の領域;
(iv)h4ヘリックス;および
(v)内部C−Dループ
から選択されるL1ポリペプチドの表面領域で免疫原性HPV L2ペプチドを提示するキメラL1ペプチドをコードし、該キメラL1ペプチドはHPVに対する免疫原性応答を誘起することができるヒト・パピローマウイルス(HPV)ポリヌクレオチド。 - 請求項11ないし14のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項15記載のベクターを含む宿主細胞。
- (i)E−Fループ;
(ii)D−Eループ;
(iii)h4ヘリックスおよびJ領域の間の領域;
(iv)h4ヘリックス;および
(v)内部C−Dループ
から選択されるL1ポリペプチドの表面領域に
アミノ酸配列:
LVEETSFIDAGAP(配列番号:1)
を有するペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチド。 - キメラHPV L1ウイルス様粒子またはキャプソメアである請求項17記載のポリペプチド。
- 図6、8、10、12および14のいずれか1に記載のアミノ酸配列(配列番号:5、7、9、11および13)、またはその修飾体である配列を有し、但し、その修飾体は配列番号:5、7、9、11および13に記載の配列のいずれか1内の配列番号:1の修飾体であって配列番号:1の配列に少なくとも80%の同一性を有し、ここにHPVポリペプチドは、
(i)E−Fループ;
(ii)D−Eループ;
(iii)h4ヘリックスおよびJ領域の間の領域;
(iv)h4ヘリックス;および
(v)内部C−Dループ
から選択されるL1ポリペプチドの表面領域で
免疫原性HPV L2ペプチドを提示するキメラL1ペプチドであり、該キメラL1ペプチドはHPVに対する免疫原性応答を誘起することができるヒト・パピローマウイルス(HPV)ポリペプチド。 - 異種ペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ヌクレオチド位置241−279、391−429、520−558、1240−1278および1291−1329(配列番号:12、6、4、10および8)のいずれか1のL1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに導入し;
該L1ポリペプチドおよび異種ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、該ポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞に導入し;
該ポリヌクレオチドを発現させ;ついで
異種ペプチドを含む得られたキメラL1ポリペプチドを回収する
工程を含む、異種ペプチドを含むキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドを作製する方法。 - 該異種ペプチドが、いずれか他のHPVペプチドであるか、またはB−細胞もしくはT−細胞特異的ないずれかの免疫原性エピトープに由来する請求項20記載の方法。
- 該L1ポリヌクレオチドの1またはそれを超えるヌクレオチドが、該異種ポリヌクレオチドの導入の点で欠失している請求項20または21記載の方法。
- 該L1ポリヌクレオチドから欠失したヌクレオチドの数が、挿入した異種ヌクレオチドの数に対応する請求項22記載の方法。
- 免疫原性応答を誘導するための、請求項17ないし19のいずれか1に記載のキメラ・ヒト・パピローマウイルス(HPV)L1ポリペプチドまたは請求項11ないし14のいずれか1項に記載の免疫原性応答を誘導するためのポリヌクレオチド。
- HPV6、16または18の処置に使用するための請求項24記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチド。
- 好適な宿主中のHPVおよび/または導入したペプチドに対する免疫原性応答を誘導することができる請求項24または25に記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチド。
- さらに、医薬上の賦形剤および/または補助剤を含む請求項24ないし26のいずれか1項に記載のポリペプチドまたはポリヌクレオチド。
- HPV感染症を予防的または治療的に処理する方法において使用するための薬物を製造する方法における、請求項17ないし19のいずれか1項に記載のポリペプチドまたは請求項11ないし14のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドの使用。
- HPV感染症がHPV6、16または18である請求項28記載の使用。
- 該薬物がHPVおよび/または好適な宿主中の誘導したペプチドに対する免疫原性応答を誘導することができる請求項28または29に記載の使用。
- 該薬物がさらに医薬上の賦形剤および/または補助剤を含む請求項28ないし30のいずれか1項に記載の使用。
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