ES2263152T3 - Anticuerpo monoclonal contra el receptor flt4 tirosina quinasa y su uso en diagnostico y terapia. - Google Patents
Anticuerpo monoclonal contra el receptor flt4 tirosina quinasa y su uso en diagnostico y terapia.Info
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Abstract
ANTICUERPOS ANTI-FLT4,ESPECIALMENTE ANTICUERPO ANTI FLT4 MONOCLONALES, QUE SON UTILES COMO UN MARCADOR ESPECIFICO PARA CELULAS ENDOTELIALES DE VASOS LINFATICOS Y HEV, COMO UNA HERRAMIENTA DE DIAGNOSTICO PARA DETECTAR CAMBIOS EN EL TEJIDO LINFATICO, ESPECIALMENTE EN LOS VASOS LINFATICOS Y HEV EN ESTADOS ENFERMOS, TALES COMO LINFAGIOMA, MODULOS LINFATICOS METASTATICOS Y ENFERMEDAD INFLAMATORIA, INFECCIOSA E INMUNOLOGICA.
Description
Anticuerpo monoclonal contra el receptor FLT4
tirosina quinasa y su uso en diagnóstico y terapia.
La presente invención se refiere en general a
receptores tirosina quinasa, sondas de ácido nucleico y anticuerpos
que reconocen específicamente dichos receptores, y al uso de dichas
sondas y anticuerpos para identificar los vasos linfáticos y
vénulas endoteliales altas (VEAs) en tejidos animales y humanos y
las células linfáticas endoteliales en cultivo. Más concretamente,
la presente invención va dirigida a los anticuerpos específicos
para FLT4, un receptor tirosina quinasa, a los métodos para
identificar la expresión del FLT4 en los vasos linfáticos y
fundamentalmente para diagnosticar y tratar las condiciones
patológicas en animales y humanos que involucran cambios en el
tejido linfático, tales como enfermedades inflamatorias, infecciosas
e inmunológicas, ganglios linfáticos metastáticos y
linfangiomas.
linfangiomas.
El endotelio vascular que recubre los vasos
sanguíneos está implicado en la fisiología del sistema vascular, la
vasculogénesis y la angiogénesis embrionarias, la coagulación de la
sangre, la cicatrización de las heridas y la reproducción, así como
en varias enfermedades. El desarrollo del árbol vascular se produce
a través de la angiogénesis y, según algunas teorías, la formación
del sistema linfático empieza poco después del desarrollo arterial y
venoso mediante el brote de las venas (1, 2).
Después del periodo fetal, las células
endoteliales proliferan sólo muy lentamente, salvo durante la
angiogénesis asociada con la neovascularización. Los factores de
crecimiento que estimulan la angiogénesis ejercen sus efectos a
través de receptores tirosina quinasa específicos en la superficie
de las células endoteliales.
El producto proteico del ADNc del receptor FLT4
tirosina quinasa, clonado de una línea eritroleucémica de células
humanas, está N-glicosilado y contiene siete bucles
tipo inmunoglobulina en su dominio extracelular. El dominio
citoplásmico del FLT4 tirosina quinasa es idéntico en
aproximadamente el 80% al nivel de los aminoácidos con los
correspondientes dominios del FLT1 y del KDR, e idéntico en
aproximadamente el 60% con los receptores del factor de crecimiento
derivado de las plaquetas, el factor estimulante de
colonias-1, el factor de células madre y el receptor
FLT3 (3).
Aunque la función biológica del FLT4 no se ha
aclarado todavía, su patrón de expresión restringida indica que sus
funciones pueden implicar el endotelio vascular. Resultados nuestros
anteriores revelaron que la expresión del ARNm del FLT4 en células
endoteliales en los vasos en desarrollo de varios órganos fetales
tal como se describe en Kaipainen et al., J Exp Med
178: 2077-2088, 1993. Una comparación de las señales
del ARNm de los receptores FLT4, FLT1 y KDR/FLK-1
mostró un solapamiento aunque con patrones distintos de expresión
en el tejido del estudio (4). Estos datos sugieren que los
receptores tirosina quinasa codificados por esta familia de genes
pueden tener funciones diferentes en la regulación del crecimiento
y/o la diferenciación de los vasos sanguíneos.
Una función principal del sistema linfático es
proporcionar un retorno para el líquido desde los tejidos y
trasportar muchas sustancias extravasculares de nuevo a la sangre.
Adicionalmente, durante el proceso de maduración, los linfocitos
dejan la sangre, migran a través de los órganos linfoides y otros
tejidos, y entran en los vasos linfáticos, y vuelven a la sangre a
través del conducto torácico. Vénulas especializadas, denominadas
vénulas endoteliales altas (VEAs) les unen a los linfocitos
sanguíneos de nuevo con lo que se provoca su extravasación a los
tejidos. Por tanto, los vasos linfáticos y especialmente los
ganglios linfáticos desempeñan un papel importante en la
inmunología y también son sitios de desarrollo de metástasis de
diferentes tumores.
Desde principios del siglo veintiuno, han
surgido tres diferentes teorías sobre el origen del sistema
linfático. Sin embargo, antes de la presente invención, ha sido
difícil identificar los vasos linfáticos ya que no existen
marcadores específicos para ellos.
Los vasos linfáticos se suelen estudiar con la
ayuda de la linfografía. En la linfografía, el medio de contraste
de los rayos X se inyecta directamente en un vaso linfático. El
medio de contraste se distribuye a lo largo de los vasos eferentes
de drenaje del sistema linfático. El medio de contraste se recoge en
los ganglios linfáticos, donde permanece hasta medio año, y durante
este periodo los análisis por rayos X permiten un seguimiento del
tamaño de los ganglios linfáticos y de su estructura. Este
diagnóstico es especialmente importante en pacientes de cáncer con
metástasis en los ganglios linfáticos y en neoplasias malignas
linfáticas, tales como el linfoma.
La presente solicitud se refiere a los péptidos
FLT4 y otros constructos y al uso del FLT4 como un marcador
específico para las células endoteliales linfáticas.
La invención se refiere a los anticuerpos que
reconocen específicamente el FLT4, especialmente a los anticuerpos
monoclonales, y a las composiciones que contienen dichos
anticuerpos. Además, la presente solicitud describe el uso de estos
anticuerpos monoclonales para fines diagnósticos, para la detección
y medición de la cantidad de receptores FLT4 en tejidos,
especialmente en tejidos linfáticos y en células endoteliales
linfáticas.
En una realización preferida, la invención
proporciona anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente
el receptor FLT4. Más concretamente, esta invención proporciona un
anticuerpo monoclonal designado 9D9F9. La línea hibridoma de
células que produce el anticuerpo monoclonal 9D9F9 se ha depositado
en el Deutsche Sammlong von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH
(DSM) bajo lo provisto en el Tratado de Budapest (número de accesión
DSM ACC2210).
Se proporcionan también los anticuerpos
monoclonales marcados con un marcador detectable. Tal como se emplea
en la presente memoria, el término marcador detectable engloba
cualquier marcador detectable conocido para los expertos en la
materia. Sin embargo, en una realización preferida de la presente
invención, el marcador detectable se selecciona del grupo que
consiste en los radioisótopos, los fluorocromos, los colorantes, las
enzimas y la biotina. Para los fines de esta invención, los
radioisótopos apropiados incluyen, pero no se limitan a, ^{125}I y
^{131}I.
Los anticuerpos monoclonales de la presente
invención pueden también usarse en un método para la detección de
la presencia de los receptores FLT4 en una muestra de células, que
comprende los pasos de exponer una muestra de células a un
anticuerpo monoclonal de la presente invención y detectar la unión
de dicho anticuerpo monoclonal a los receptores FLT4.
Por lo tanto, otro aspecto de la presente
invención se refiere a un método para determinar la presencia de
receptores de FLT4 en la muestra de células, que comprende las
etapas de:
- (a)
- exponer una muestra de células a un anticuerpo de la presente invención;
- (b)
- detectar la unión de dicho anticuerpo monoclonal a los receptores de FLT4.
La exposición de una mezcla de células a los
anticuerpos monoclonales de la invención puede llevarse a cabo en
la disolución, como es el caso del análisis activado por
fluorescencia para la clasificación de células, o puede ser en
muestras de tejido sólidas, tales como material de biopsia, o puede
ser con el anticuerpo monoclonal inmovilizado en un soporte sólido,
tal como es el caso de la cromatografía en columna o la adherencia
directa inmunológica. La mezcla de células para exponerse al
anticuerpo monoclonal puede ser cualquier disolución de células
sanguíneas o células de tejido. Preferiblemente, la mezcla de
células proviene de tejido normal o patológico que contiene o que
se sospecha que contiene células linfáticas endoteliales. Después de
la exposición de la mezcla de células a los anticuerpos
monoclonales, aquellas células con los receptores FLT4 se unirán al
anticuerpo monoclonal para formar un complejo de
anticuerpo-receptor FLT4, y por lo tanto, los
receptores FLT4 pueden detectarse mediante métodos conocidos en el
estado de la técnica. Dichos métodos incluyen los métodos
inmunohistoquímicos normales en la técnica, tales como la
inmunofluorescencia, análisis FACS, ELISA, IRMA (un ensayo
inmunoquímico tipo sándwich), la inmunohistoquímica, RIA con marcaje
con ^{125}I y autoradiografía.
La presente invención también proporciona
anticuerpos monoclonales conjugados a un agente que se puede usar
para tomar imágenes. Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término que se puede usar para tomar imágenes, incluye, pero no se
limita a los radioisótopos. Un radioisótopo preferido es el
99m-tecnecio.
En una realización específica, la invención se
refiere a un método para el seguimiento de los vasos linfáticos y
sus células endoteliales en las muestras de tejido y en los
organismos. La presente invención también proporciona métodos de
detección clínicos para describir el estado del tejido linfático, y
especialmente los vasos linfáticos (inflamación, infección,
traumas, crecimiento, neoplasias, etc.) y métodos para detectar los
vasos linfáticos y así la vascularización linfática en un
organismo.
Más específicamente, la presente invención
proporciona un método para detectar e identificar los cambios
linfáticos caracterizados mediante la expresión del FLT4 en
relación con los cánceres metastáticos, y condiciones inflamatorias,
infecciosas e inmunológicas, comprendiendo dicho método las etapas
de
- (a)
- obtener un tejido y/o líquido corporal que se sospecha de cambios linfáticos, y
- (b)
- exponer la muestra a un anticuerpo monoclonal específico para el FLT4 en condiciones apropiadas para formar un complejo entre el anticuerpo monoclonal y el antígeno, y
- (c)
- detectar la presencia de cualquier complejo que se forma.
Un tejido que se puede detectar con este método
es cualquier tejido de tumor sólido precanceroso o canceroso con
células linfáticas que contienen el FLT4 o células que expresan el
receptor FLT4. En una realización de la presente invención, el
anticuerpo monoclonal se marca con un marcador detectable tal como
se describe en la presente memoria. Los métodos de la invención son
útiles para detectar y diferenciar entre varias formas de cáncer,
especialmente las metástasis en los ganglios linfáticos y otros
procesos neoplásicos linfáticos, tales como linfomas, así como
linfangiomas.
La presente invención también proporciona un
método para formar una imagen de los vasos linfáticos, las vénulas
endoteliales altas o ganglios linfáticos en los pacientes humanos.
Este método comprende la administración de anticuerpos marcados y
la detección mediante la imagen en los sitios donde las células que
expresan el FLT4 están presentes, en vasos linfáticos o ganglios
linfáticos.
La invención se refiere además a un método para
estimular o antagonizar la función del FTL4 en la vascularización
linfática y en condiciones inflamatorias, infecciosas e
inmunológicas, comprendiendo dicho método la inhibición de la
vascularización linfática mediada por el FLT4 con cantidades
suficientes de un compuesto que se une al FLT4 para bloquear los
sitios del FLT4 en las células endoteliales que participan en dicha
reacción, especialmente donde la función del FLT4 se asocia con una
enfermedad tal como cánceres metastáticos, linfomas, inflamación
(crónica o aguda), infecciones y enfermedades inmunológicas.
Figura 1. La expresión del ARNm del FLT4 en
tejidos murinos. A. La hibridación del ARN poliadenilado aislado de
los tejidos indicados de ratones adultos. El tamaño de la banda del
ARNm del FLT4 se expresa en kilobases. B Análisis de la protección
por la ARNasa del ARN aislado de embriones murinos a varias edades
de gestación (E8-E18) y de un ratón recién nacido
(1 día). La muestra E8+P contiene también placenta. El tamaño de la
sonda y el fragmento protegido se dan en nt; se utilizó
\beta-actina como control.
Figura 2. La expresión del ARNm del FLT4 en
embriones de 7,5, 8,5 y 11,5 días p.c.. Se presentan los
fotomicrografías de campo oscuro y de campo claro de los
autoradiografías in situ. No se pudo detectar la expresión
del ARNm del FLT4 en un embrión de 7,5 días (A). LA expresión de un
embrión murino de 8,5 días p.c. se presenta en (B) y (C). Las
flechas apuntan a las células positivas para el FLT4 en el endotelio
de la vena posterior cardinal (vc), en el alantoides (al) en (B) y
en los angioblastos (ab) del mesénquima de la cabeza en (C). En la
placenta de 8,5 días p.c., los transcriptos de FLT4 pueden
objetarse en las células endoteliales de las lagunas venosas (lv)
(D). Los paneles E y F muestran una comparación de las señales de
hibridación del FLT4 y del Tie en embriones de 11,5 días p.c. Se
muestra la región de la aorta dorsal en desarrollo y el metanefros
(mn) (20x). Fíjese que la aorta dorsal es negativa para el FLT4,
pero positiva para el ARNm del Tie, mientras que ambas sondas
hibridan con el endotelio de la vena subendocárdico (sv). También,
la sonda del FLT4 da una señal de la vena ureteral (v), mientras el
Tie hibrida generalmente con los capilares ureterales (c, flechas).
Ad: aorta dorsal, sn; surco neural. Barra de escala: 30 \mum.
Figura 3. La expresión del ARNm del FLT4 en un
embrión de 12,5 días. Se muestra una sección sagital a través del
plano axilar. Nótese que el ARNm del FLT4 es prominente en los vasos
dilatados de la axila (ax), en un patrón tipo plexo en la región
periorbital (po), en el tejido paravertebral (flechas) y en el
tejido subcutáneo (sc). c: cerebro, hi: hígado. Barra de escala: 5
\mum.
Figura 4. El FLT4 en embriones de 14 y 16,5
días. Los paneles A y B muestran las imágenes de campos claro y
oscuro de una sección mediosagital. Po: periorbital, mi: mandíbula
inferior, cu: región del cuello, sc: subcutáneo, mt, mesenterio,
ao: aorta, ct: conducto torácico. (C) muestra una sección
transversal de un embrión de 16,5 días después de la tinción con
hematoxilina-eosina. Ti: timo, tr: traquea, e:
esófago, ca: arteria carótida, ba: arteria braquiocefálica, ct:
conducto torácico. (D) muestra una magnificación mayor (40x) de la
región del conducto torácico; los granos autoradiográficos se pueden
distinguir por encima de las células endoteliales. Además, el vaso
pequeño (v) en la parte superior de la fotografía es positivo. Barra
de escala: 10 \mum (A-C), 1 \mum (D).
Figura 5. Una comparación de la expresión del
ARNm del FLT4 y del Tie en células endoteliales en cultivo. Un
análisis por el método Northern del ARN poliadenilado de las células
microvasculares del prepucio (MV), vena femoral (VE), aórtico (AO)
y umbilical (HU) humanos. Como comparación, se muestra la señal de
la hibridación del ARNm del receptor Tie tirosina quinasa. Las
bandas que resultan de la unión específica de la sonda al ARN
ribosomal se indican con asteriscos.
Figura 6. El FLT4 en vasos linfáticos del
mesenterio (A, B), del pulmón (C, D), y de la amígdala (E, F) de
adultos humanos. Nótese que sólo vasos linfáticos en A y C dan lugar
a una señal del FLT4, mientras que las venas, los capilares y las
arterias son negativos para el ARNm del FLT4. En la amígdala, se
encuentra una señal en los endotelios de algunos VEAs. Barra de
escala: 200 \mum.
Figura 7. El ARNm del FLT4 en ganglios
linfáticos normales (A, B) y metastáticos (C, D) y en un linfangioma
(E, G). Las flechas indican los senos linfáticos y las VEAs, que
son positivos para el FLT4. Una comparación del FLT4 y las señales
del factor de von Willebrand muestra que ambos están presentes en el
endotelio linfático pero sólo la señal del factor de von Willebrand
está presente en los endotelios capilar (c) y venoso (v). Barras de
escala: 10 \mum (A-D) y 100 \mum
(E-G).
Figura 8. La expresión del FLT4 en vasos
mesentéricos fetales detectados mediante la tinción con la
inmunoperoxidasa. Las secciones se tiñeron con anticuerpos para el
FLT4 purificados mediante técnicas de afinidad (A), con suero
bloqueado con el antígeno (B) y con suero preinmunológico (C) y con
antisuero específico contra el antígeno relacionado con el factor
VIII (D). Nótese que la tinción se limita a algunos pero no todos
los vasos (v). Barra de escala: 0,05 mm.
En reconocimiento de la importancia de
identificar los cambios en tejidos linfáticos, especialmente en los
ganglios linfáticos en relación con cánceres metastáticos y
enfermedades inmunológicas, los presentes inventores han demostrado
que el FLT4 es un marcador específico que detecta el endotelio de
vasos linfáticos y por lo tanto es útil como un marcador de los
cambios linfáticos en estados patológicos en humanos.
Los presentes inventores han demostrado
anteriormente que el patrón de expresión de FLT4 en comparación con
el FLT1 y KDR es muy diferente en los tejidos de fetos humanos de 18
semanas (4). Con tal de entender el papel del FLT4 durante el
desarrollo, los inventores clonaron los ADNc parciales del FLT4
murino. Utilizando estas sondas en hibridación in situ, la
expresión del ARNm del FLT4 durante el desarrollo del ratón se
analizó y se encontró que el FLT4 se expresa durante la
vasculogénesis y angiogénesis del sistema linfático. La relevancia
de estos hallazgos también se confirmó en tejidos humanos normales y
patológicos, ya que el FLT4 se encontró en las células endoteliales
linfáticos de tejidos de humanos adultos tanto en condiciones
normales como patológicas, así como en algunas vénulas endoteliales
altas (VEAs).
La clonación de fragmentos del ADNc del FLT
murino mostró que la secuencia de aminoácidos deducida es casi
idéntica a la secuencia human correspondiente (identidad de
aminoácidos de aproximadamente el 96% en los dos segmentos
estudiados). Más indicios de la identidad del ADNc del FLT4 murino
se obtuvo de la hibridación Northern donde las sondas de ambas
especies proporcionaron la señal típica del ARNm de tejidos de ratón
de 5,8 kb. El análisis del ARN aislado de varios tejidos de ratones
adultos mostró una expresión del FLT4 en el hígado, pulmón,
corazón, bazo, y riñón, con ninguna o poca hibridación en el cerebro
y los testes. Este patrón es similar al patrón descrito
anteriormente por Galland et al (5). Los resultados de la
protección por la ARNasa sugieren que se necesita el gen del FLT4
durante el desarrollo del ratón, empezando desde los embriones de
8,5 días p.c., y los niveles de expresión relativos aparecieron
bastante estables.
Para la hibridación in situ se
seleccionaron dos fragmentos del ADNc del FLT4, que codificaron
secuencias del dominio extracelular. Esto permitió hacer una
distinción clara entre los patrones de la hibridación de los
receptores FLK-1 y FLT-1, que sólo
muestran un grado bajo de identidad de secuencia en la región
extracelular (6, 7, 8, 9). El FLT4, al igual que los genes del
FLK-1, FLT-1, Tie y receptor Tek
endotelial tirosina quinasa, no se expresó en los embriones de 7,5
días p.c.. En un embrión de 8,5 días p.c., las señales más fuertes
se localizan en el alantoides, los angioblastos del mesénquima de
la cabeza y la vena cardinal. En cambio, la aorta dorsal, el
endocardio del corazón y los angioblastos del saco vitelino fueron
negativos, a cambio del Tie, Tek, FLK1 y FLT1, Tie y Tek (10, 8).
La restricción de la expresión del FLT4 al sistema venoso estaba
aún más clara en muestras de los embriones de ratones de 11,5 días,
en los cuales el ARNm del Tie se expresó también en las arterias.
En los embriones de 12,5 días p.c., la señal del FLT4 apareció en
los endotelios venoso y putativamente linfático, pero a diferencia
del receptor Tie tirosina quinasa, los endotelios arteriales fueron
negativos. Durante las etapas más tardías del desarrollo, el ARNm
del FLT4 ha ido restringiéndose a los plexos vasculares que
carecieron de células sanguíneas, que representan los vasos
linfáticos en desarrollo. Sólo el endotelio linfático y algunas
vénulas endoteliales altas expresaron el ARNm del FLT4 en el tejido
de un humano adulto. La expresión aumentada ocurrió en los senos
linfáticos y las vénulas endoteliales altas y en los ganglios
linfáticos metastáticos y en el linfangioma.
Debido a las dificultades para interpretar los
datos de los embriones de ratón, se estudiaron endotelios humanos,
ya que el sistema linfático está mucho mejor definido en humanos.
Además, las células establecidas de varios endotelios pudieron
estudiarse en un cultivo de células con el fin de averiguar si la
especificidad de la expresión del FLT4 persiste en condiciones
in vitro. Se sabe que las líneas de células endoteliales
pierden características de diferenciación al cultivarse in
vitro. Por lo tanto, cabría esperar que fueron negativos para
el FLT4. Las células endoteliales aórticas también carecían del mARN
del FLT4. Sin embargo, se obtuvieron señales de las células
endoteliales humanas cultivadas de la microvasculatura y de las
venas femoral y umbilical. Por ende, al menos algo de la
especificidad de la expresión de FLT4 se mantuvo en el cultivo de
las células.
El análisis de la hibridación in situ de
los tejidos adultos humanos confirmó la restricción del FLT4 al
sistema linfático observado en los embriones de ratón en
desarrollo. La expresión del FLT4 se observó en los endoteliales
linfáticos y en los senos de los ganglios linfáticos humanos. Es
interesante que algunas de las VEAs que tienen un endotelio cuboide
y que se ha comprobado que están implicadas en el transporte de
leucocitos a los ganglios linfáticos, también fueron positivas para
el FLT4. Además, un análisis en paralelo de la hibridación mostró
que los niveles del ARNm del FLT4 se potenciaron en estas
estructuras metastáticas en comparación con los ganglios linfáticos
normales. El FLT4 también fue muy prominente en los linfangiomas,
que son tumores benignos compuestos por estroma de tejido conectivo
y canales linfáticos en crecimiento con un recubrimiento endotelial.
El ARNm del FLT4 se limitó al endotelio linfático de estos tumores
y no se observó en sus arterias, venas y capilares. En el pulmón
humano, pudimos identificar las estructuras linfáticas, que fueron
los únicos vasos positivos para el FLT4 en este
tejido.
tejido.
Los resultados presentados sugieren que el FLT4
es un marcador novedoso de los vasos linfáticos y algunas vénulas
endoteliales altas en los tejidos humanos de adultos. También apoyan
la teoría sobre el origen venoso de los vasos linfáticos. El FLT4,
como un receptor del factor de crecimiento, puede estar implicado en
la diferenciación y el funcionamiento de estos vasos.
Estos resultados, en combinación con los
compuestos de unión del FLT4 según la presente invención, permiten
un marcaje selectivo del endotelio linfático, especialmente mediante
el uso de anticuerpos de la presente invención acoplados a
sustancias radioactivas o con alta densidad de electrones u otras
sustancias indicadoras que pueden visualizarse. Puede ser posible
inyectar en el sistema linfático sustancias que contienen el
receptor del FLT4 según la invención para la detección de las
vénulas endoteliales altas, especialmente las VEAs activadas, que
expresan niveles potenciados del receptor del FLT4. Que conozcamos,
no se disponen de tales marcadores específicos para el endotelio
linfático en la actualidad.
Los siguientes ejemplos se presentan solamente
para ilustrar la presente invención y no limitan el alcance de la
misma de ninguna forma.
Se ensayaron aproximadamente 10^{6} placas de
un biblioteca genómica de iFIX®II de ratones 129SV (Stratagene) con
el fragmento del ADNc del receptor del FLT4 humano que correspondía
al dominio extracelular (3). Un fragmento Bam HI de 2,5 kb se
subclonó de una placa positiva y se secuenció desde ambos extremos.
De este subclón, se empleó la reacción de cadena de polimerasa para
amplificar y clonar un fragmento de exón que correspondía a los
nucleótidos 1745-2049 de la secuencia del ADNc del
FLT4 del ratón en un vector pBluescript KSII+/- (Stratagene)
(9).
Un segundo fragmento que correspondía a los
nucleótidos 1-192 se clonó de forma idéntica.
El ARN total se aisló de embriones en desarrollo
(8-18 días p.c. y en ratones de un día) según
Chomczynski et al. (11). La muestra de los embriones de 8
días también incluyó la placenta.
Para el análisis de la protección por la ARNasa,
la sonda del ARN se generó del plásmido linear del FLT4 obtenido
según el ejemplo 1 con [^{32}P]-UTP y polimerasa
T7 para la orientación antisentido. La sonda de
\beta-actina utilizada corresponde a los
nucleótidos 1188-1279 de la secuencia publicada de
\beta-actina murina (12). Después de la
purificación en un gel con 6% de poliacrilamida/7M urea, los
transcritos marcados se hibridaron a 30 \mug del ARN total
durante la noche a 52ºC. Se digirió el ARN no hibridado con la
ARNasa A (10 U/ml) y T1 (1 \mug/ml) a 37ºC, pH 7,5 durante 1 hora.
Las ARNasas se desactivaron mediante la digestión con proteinasa K
a 37ºC durante 15 minutos y las muestras se analizaron en un gel de
6% poliacrilamida/7M urea.
El patrón de expresión del FLT4 analizado en
este experimento mostró que las señales del ARNm muy débiles se
obtuvieron del pulmón, hígado, corazón, riñón, músculo esquelético y
del bazo, muestras de las que no se detectó señal específica en los
testes y el cerebro (figura 1A). El análisis de las series del ARN
recogidas durante las diferentes fases del desarrollo del ratón en
el ensayo de la protección del ARN mostró que el ARNm del FLT4 se
expresó a lo largo de la embriogénesis desde el día 8 p.c. hasta
ratones recién nacidos sin que hubiera grandes variaciones en la
intensidad de la señal (figura 1B).
Para asignar mejor los transcritos del FLT4 a
células y tejidos, se hibridaron secciones de embriones de ratón de
7,5 y 8,5 días p.c. con moléculas del ARN del FLT4. Los embriones se
derivaron del cruce entre ratones CBA y ratones NMRI. Los ratones
preñados se sacrificaron mediante una dislocación cervical y los
embriones se congelaron inmediatamente o se transfirieron mediante
un tampón de fosfato a paraformaldehido al 4%. Los embriones y los
órganos aisla-
dos se fijaron durante 18 horas a 4ºC, se deshidrataron, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 6 \mum.
dos se fijaron durante 18 horas a 4ºC, se deshidrataron, se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones de 6 \mum.
Las sondas del ARN (antisentido y sentido) de
los nucleótidos 192 y 349 (véase el ejemplo 1) se generaron de
plásmidos lineales con [^{35}S]-UTP. La
hibridación in situ de las secciones se llevó a cabo según
lo descrito por Wilkinson et al (13, 14), con las siguientes
modificaciones: 1) en vez del tolueno, se utilizó xileno antes de
incluir en la cera de parafina, 2) se cortaron secciones de 6
\mum, se colocaron en una capa de agua tratada con dietil
pirocarbonato en la superficie de unos portaobjetos de vidrio
pre-tratados con
3-trietoxisililpropilamina al 2%, 3) se omitió la
hidrólisis de las sondas, y 4) se realizó el lavado de alto
astringencia durante 80 minutos a 65ºC en una solución que contenía
30 mM de DTT y 1 x SSC. Las secciones se cubrieron con una emulsión
de NTB-2 (Kodak) y se almacenaron a 4ºC. Los
portaobjetos se expusieron durante 14 días, se desarrollaron y se
tiñeron con hematoxilina. Las hibridaciones de control con la cadena
sentido y las secciones tratadas con la ARNasa A no exhibieron una
señal específica por encima del fondo.
Tal como se muestra en las figuras 2A y B, el
ARNm del FLT4 no se expresó en los embriones de ratones de 7,5
días, pero señales claras se detectaron en la vena cardinal
posterior (vc) en el día 8,5 del desarrollo. A cambio, el corazón
en desarrollo y la aorta dorsal (ad) fueron negativos para el FLT4
(datos no presentados). En los tejidos extraembrionicos, el FLT4 se
expresó de forma prominente en el alantoides ("al" en el cuadro
B), mientras que los islotes sanguíneos del saco vitelino en
desarrollo fueron negativos (datos no presentados). Por otro lado,
los angioblastos (ab) del mesénquima de la cabeza fueron altamente
positivos para el FLT4 (C). En la placenta en desarrollo, la señal
del FLT4 se observó por primera vez en las venas sinusoidales
periféricas (datos no presentados). En la placenta de 9,5 días
p.c., el endotelio de las lagunas venosas (lv en D) y las células
gigantes parcialmente fusionadas a la membrana de Reichert (datos no
presentados) expresaron el ARNm del FLT4.
Por tanto, aunque la expresión del FLT4 fue muy
prominente en los precursores más tempranos de las células
endoteliales, los angioblastos, dicha expresión parece limitarse a
ciertos vasos de los embriones de 8,5 días p.c. Se sabe que el
receptor Tie se expresa en todas las células endoteliales de los
embriones de ratón en desarrollo y así proporciona un marcador para
estas células. Notablemente, a cambio de la sonda del Tie, la sonda
del FLT4 se hibridó de forma muy débil o casi nada con los
endotelios arteriales de los embriones del día 11,5 p.c., por
ejemplo, con el endotelio de la aorta dorsal en desarrollo (ad en la
figura 2 E, F) o las arterias carótidas (datos no presentados). En
vez de esto, la señal del FLT4 fue mucho más prominente en las
venas en desarrollo. Por ejemplo, la señal del FLT4 se detectó en
venas alrededor de los metanefros en desarrollo (v, sv en E),
mientras que la sonda del Tie reconoció primariamente los capilares
(c) dentro del metanefros (F).
Tal como se puede apreciar en la figura 3, el
ARNm del FLT4 se distribuye en varias regiones de un embrión de
ratón de 12,5 días, estando especialmente prominente en el vaso
dilatado de la región axilar (ax). Un vaso de FLT4 positivo con una
estructura similar se observó en la sección mediosagital en la zona
yugular (datos no presentados). Un patrón tipo plexo de los vasos
que expresan el FLT4 apareció en la región periorbital (po) y los
vertebres en desarrollo (vb). Además, se pudo ver justo por debajo
de la piel en desarrollo, una red vascular positiva para el FLT4
(sc). Señales más débiles de los capilares se obtuvieron de varias
regiones, entre ellas, el cerebro en desarrollo (c) El ARNm del
FLT4 pudo detectarse también en los vasos pequeños de la región del
cuello, del hocico en desarrollo y en la base de la lengua en
desarrollo así como en la región de la cola (datos no presentados).
Es más, el hígado (hi) fue altamente positivo para el ARNm del FLT4
con un patrón de punteado.
Durante el desarrollo adicional, parecía que el
ARN del FLT4 se restringía más a ciertos vasos del embrión. Un
embrión de 14,5 días ilustra bien este patrón restringido de
expresión (figura 4 A, B). En la sección mediosagital de la figura
4, se aprecia la señal más prominente del FLT4 a lo largo de la
columna vertebral en desarrollo en su parte anterior. La señal
parecía originarse de las células endoteliales en el conducto
torácico (ct), que es el vaso linfático más grande que se forma en
este momento del desarrollo. En cambio, la aorta dorsal (ad) y la
vena cava inferior (vc) fueron negativas. Los vasos dilatados en la
región mesentérica también fueron altamente positivos para el FLT4.
Además, tal como ocurre en los embriones de 12,5 días p.c., las
redes de vasos cerca de las fronteras anatómicas en la mandíbula
(ma) periorbital (po) así como en la región del cuello (cu)
contenían endotelios positivos para el FLT4. Estructuras similares
estuvieron presentes en el espacio pericárdico y en todo el tejido
subcutáneo (sc). Notablemente, y a cambio de los vasos negativos
para el FLT4, todos los vasos positivos para el FLT4 carecían de
células sanguíneas en su lumen. Estos patrones de expresión
sugieren que el FLT4 se limita a los vasos linfáticos del endotelio
en este momento del desarrollo.
Un sitio adicional donde se observó la expresión del FLT4 fue en las sinusoides de la médula ósea en desarrollo (mo).
Un sitio adicional donde se observó la expresión del FLT4 fue en las sinusoides de la médula ósea en desarrollo (mo).
Las fotografías de una sección transversal del
tórax superior de un embrión de 16,5 días p.c. hibridado con una
sonda del FLT4 se presentan en los cuadros C y D de la figura 4. La
sección que se presenta en C se ha teñido con
hematoxilina-eosina para visualizar los diferentes
tipos de los vasos en esta zona. Estos incluyen las arterias
carótida y braquicefálica (ac, ab), la vena cava (vc) y el conducto
torácico, que es de un tamaño más pequeño y carece del tejido
muscular y conectivo circundante (flecha). Una magnificación de la
región del conducto torácico se muestra en el cuadro D, donde se
pueden apreciar los granos del FLT4 autoradiográficos. Las células
endoteliales del conducto torácico así como un vaso pequeño (v)
próximo hibridan con la sonda del FLT4.
Los resultados de la hibridación in situ
descritos en el ejemplo 3 mostraron que el FLT4 se expresa en las
células endoteliales venosas y más tarde en los vasos linfáticos y
en algunas células endoteliales venosas pero no en los endotelios
arteriales. Con tal de averiguar si esta regulación se mantuviera
in vitro, estudiamos células endoteliales en cultivo
mediante un análisis del Northern y un análisis de la
hibridación.
Las células endoteliales humanas de la aorta,
vena femoral, vena umbilical y de los microvasos del prepucio se
aislaron, se cultivaron y se caracterizaron tal como ha descrito
anteriormente Van Hinsberg (15, 16). A continuación, se usaron a
una densidad confluyente después de cinco a ocho pasos (relación de
división 1:3) para el aislamiento del ARN poliadenilado.
Las líneas de células endoteliales
EA-hy926, BCE y LEII no expresaron el FLT4 (datos no
presentados). Sin embargo, células microvasculares, venosas y
umbilicales humanas cultivadas dieron positivas para los ARNs
específicos de 5,8 y 4,5 kb para el FLT4, mientras que las células
endoteliales aórticas fueron negativas (figura 5). A cambio, otro
gen del receptor endotelial tirosina quinasa, Tie, se expresó como
un ARNm de 4,4 kb en todos los tipos de célula endotelial
estudiados.
Los resultados obtenidos en el ejemplo 3
indicaron que el ARNm del FLT4 se limita en mayor medida al
endotelio de los vasos linfáticos durante el desarrollo. En vista
del significado potencial de este hallazgo en humanos, también
estudiamos el FLT4 en tejidos adultos humanos con la sonda del FLT
humano. La sonda del FLT humano utilizada fue un fragmento de
EcoRI-Sph1 que correspondía a los pares de bases
1-595 del ADNc (3). La sonda del factor de von
Willebrand fue un fragmento de EcoRI-HindIII que
correspondía a los pares de bases 1-2334 (17).
De forma rutinaria, fijamos material para enviar
a un diagnóstico histopatológico. Se obtuvo tejido de pulmón normal
de una resección del lóbulo inferior del pulmón izquierdo afectado
por un cáncer epidermoide. El mesenterio y los ganglios linfáticos
mesentéricos se obtuvieron de un paciente con un adenocarcinoma del
colon. Un ganglio linfático normal contiguo a la glándula salival
se nucleó porque tenía un tamaño anormal. Las amígdalas de dos
pacientes y dos apéndices no presentaron cambios diagnósticos. Dos
linfangiomas y tres linfangiomas quísticos se estudiaron con
resultados similares.
Para los tejidos humanos, que fueron muestras
rutinarias fijadas con formalina al 10% para el diagnóstico
histopatológico, el protocolo normal in situ proporcionó sólo
una señal de fondo, mientras que el tratamiento con microondas en
vez de la proteinasa K permitió una hibridación específica (18,
19).
En el mesenterio, el pulmón y los endotelios
linfáticos del apéndice (lv) proporcionaron señales del FLT4,
mientras que las venas (v), arterias (a) y capilares (c) fueron
negativos (figura 6A-D y datos no presentados).
Para estudiar si el FLT4 se expresa en las VEAs, se estudiaron las
amígdalas. De hecho, en las amígdalas, se detectaron granos
autoradiográficos específicos para el FLT4 en algunas VEAs (E,
F).
Una porción de un ganglio linfático mesentérico
humano (ver el ejemplo 5) se analizó para detectar la expresión del
FLT4. Los resultados se presentan en la figura 7.
El FLT4 se expresa en los senos linfáticos (sl)
y los vasos linfáticos aferentes y eferentes (datos no presentados).
El mismo patrón se observa en un ganglio linfático que contiene
metástasis de adenocardinoma (C, D). Algunas VEAs en ganglios
linfáticos tanto normales como metastáticos fueron positivas
también. En el cuadro E, la expresión del FLT4 se muestra en un
linfangioma quístico (véase la comparación con la sección teñida con
hematoxilina-eosina en F). Fue notable que la
especificidad del FLT4 hacia los endotelios linfáticos fuera
evidente en una comparación con las señales in situ del
factor de von Willenbrandt en todos los vasos sanguíneos (F).
Un fragmento del ADNc del FLT4 que codifica los
40 aminoácidos con el extremo carboxi de la forma corta se clonó
como un fragmento de EcoRI de 657 bp en el vector de expresión
bacteriana pGEX-1IT (Pharmacia) en un marco con la
región que codifica la glutatión S transferasa. La proteína de
fusión resultante, GST-FLT4, se produjo en E.
coli y se purificó mediante cromatografía de afinidad con una
columna de glutatión-sefarosa 4B. La proteína
purificada se liofilizó, se disolvió en PBS, se mezcló con un
adyuvante de Freund y se utilizó para la inmunización de conejos.
Se utilizaron antisueros después de la cuarta inmunización de
recuerdo.
Los tejidos de los fetos humanos de 17 y 20
semanas se obtuvieron de abortos legales inducidos por
prostaglandinas. El estudio recibió la aprobación del Comité Ético
del Hospital Central Universitario de Helsinki. La edad de
gestación se estimó midiendo la longitud del pie del feto. Los
tejidos se impregnaron en Tissue-Tek (Miles) y se
congelaron de inmediato y se almacenaron a -70ºC.
Se practicó una absorción cruzada del antisuero
anti-FLT4 en una columna de
GST-sefarosa para eliminar los anticuerpos
anti-GST y se purificó mediante una cromatografía de
afinidad GST-FLT4. Se fijaron varias secciones
criostatas de los tejidos con un grosor de 6 \mum con acetona y se
trataron con H_{2}O_{2} al 0,3% en metanol durante 30 minutos
para bloquear la actividad peroxidasa endógena. Después del lavado,
las secciones se incubaron con suero normal del cerdo al 5%. A
continuación, las secciones se incubaron con anticuerpos contra el
FLT4, se lavaron, y los anticuerpos unidos se detectaron con IgG
anti-conejo de cerdo conjugado con peroxidasa
seguido de una tinción para la actividad peroxidasa con
3,3-diaminobenzidina al 0,2% (Amersham) como
sustrato. Las secciones se contratiñeron en hematoxilina de
Meyer.
La tinción con inmunoperoxidasa
anti-FLT4 del mesenterio de fetos humanos mostró una
proteína FLT4 en el endotelio de varios vasos (figura 4A), mientras
las tinciones de control con anticuerpos anti-FLT4
bloqueados con antígenos (B) y sueros preinmunes (C) fueron
negativos. Para comparación, la figura 4 muestra los resultados de
la tinción con un antisuero contra el antígeno relacionado con el
factor VIII, que es específico para las células endoteliales
vasculares.
Fusión I
Ratones varones Balb/c de cuatro meses se
inmunizaron mediante una inyección intraperitoneal de la proteína
FLT4 producida mediante técnicas de recombinación (véase el ejemplo
7) en un medio concentrado (150 \mug/ratón), emulsificado con el
adyuvante completo de Freund. Inyecciones de recuerdo de 150 \mug
se administraron en intervalos de tres a cuatro semanas y una
inyección de recuerdo final (10 \mug del FLT4 en PBS administrado
por vía intraperitoneal) se administró después de otro intervalo de
tres semanas. Cuatro días después de la dosis final de la inyección
de recuerdo, se sacrificaron los ratones y las células linfoides
esplénicas murinas se fusionaron con células de plasmacitomas SP
2/0 a una relación de 2:1, respectivamente.
Las células fusionadas se cosecharon en placas
de cultivo de 96 pocillos (NUNC) en medio Ex-Cell
320 (SERALAB) que contenía suero fetal bovino al 20% y el
suplemento HAT
(hipoxantina-aminopterina-timidina;
GIBCO, 043-01060H; diluido 50 veces). Las células
se cultivaron a +37ºC en una atmósfera del 5% de CO_{2}. Después
de 10 días, el medio suplementado con HAT se cambió a medio de
cultivo de células con el suplemento HT (GIBCO;
043-01065H, diluido 50 veces). El medio HT es
idéntico al medio HAT, salvo que no contiene la aminopterina.
Después de tres semanas, la producción de
anticuerpos específicos se determinó mediante el ensayo
inmunofluorométrico específico para los antígenos (IFMA), descrito
en el ejemplo 10. Los clones maestros se clonaron mediante
diluciones tal como se ha descrito en Staszewski et al.,
Yale Journal of Biology and Medicine, 57:
865-868 (1984). Los clones positivos se expandieron
en placas de cultivo de tejido de 24 pocillos (NUNC), se clonaron
de nuevo, y se re-ensayaron de nuevo siguiendo el
mismo método. Los clones positivos se ensayaron mediante la
clasificación de células por medio del análisis activado por
fluorescencia para clasificación de células (FACS).
Los clones estables secretaron inmunoglobulinas
que pertenecen a la clase de IgF1, salvo uno, que produjo Ig que
probablemente pertenecía a la clase de IgA. La subclase del
anticuerpo monoclonal se determinó mediante un anticuerpo
monoclonal de rata para la subclase murina como un conjugado de
biotina (SEROTEC) en IFMA.
Los ratones Balb/c se utilizaron para producir
anticuerpos monoclonales en el líquido ascítico. Los hibridomas
descritos anteriormente se inyectaron por vía intraperitoneal en los
ratones después del pre-tratamiento de los animales
con pristano (2,6,10,14-tetrametil pentadecano al
98%, ALDRICH-CHEMIE D7924 Steinheim, Núm. de Cat. T
2, 280-2). 0,5 ml de pristano (i.v.) se inyectó
aproximadamente dos semanas antes de las células hibridoma. La
cantidad de células inyectadas fue aproximadamente 7,5 a 9 x
10^{6} por ratón. La ascitis se recogió de 10 a 14 días después de
la inyección de los hibridomas.
Fusión II
Los ratones Balb/c (hembras) de dos meses se
inmunizaron mediante la inyección intraperitoneal de una proteína
FLT4 producida mediante la recombinación (véase el ejemplo 7) (20
\mug/ratón), se emulsificaron con el adyuvante completo de
Freund. Inyecciones de recuerdo de 20 \mug se administraron a
intervalos de tres a cuatro semanas y una inyección de recuerdo
final (10 \mug de FLT4 en PBS administrado i.v.) se administró
después de otro intervalo de tres semanas. Cuatro días después de
la dosis final de la inyección de recuerdo, se sacrificaron los
ratones y las células linfoides esplénicas murinas se fusionaron con
células de plasmacitomas SP 2/0 a una relación de 2:1,
respecti-
vamente.
vamente.
Las células fusionadas se cosecharon en placas
de 96 pocillos (FALCON) en medio OptiMEM 1 (con Glutamax 1,
51985-026, GIBCO BRL) que contenía suero fetal
bovino al 20% y el suplemento HAT (hipoxantina-
aminopterina-timidina; GIBCO BRL
21060-017; diluido 50 veces). Las células se
cultivaron a +37ºC en una atmósfera del 5% de CO_{2}. Después de
10 días, el medio suplementado con HAT se cambió a un medio de
cultivo de células suplementado con HT (GIBCO BRL;
41065-012, diluido 50 veces). El medio HT es
idéntico al medio HAT, pero no contiene aminopterina.
Después de tres semanas, la producción de
anticuerpos específicos se determinó mediante el ensayo
inmunofluorométrico específico para los antígenos (IFMA), descrito
en el ejemplo 9. Los clones maestros se clonaron mediante diluciones
limitadas tal como se describe en Staszewski et al., Yale
Journal of Biology and Medicine, 57: 865-868
(1984). Los clones positivos se expandieron en placas de cultivo de
tejido de 24 pocillos (FALCON), se reclinaron, y se
re-ensayaron con el mismo método. Los clones
positivos se ensayaron mediante la clasificación de células por
medio de la florescencia activada (FACS).
Los clones 2E11 y 6B2 secretaron las
inmunoglobulinas que pertenecen a la clase IgF_{1}, los clones
2B12 produjeron Ig que pertenece a la subclase IgM. La subclase
IgG_{1} de ratón se determinó con el anticuerpo monoclonal de
rata contra la subclase murina de cadena larga como conjugado de
biotina (SEROTEC) en IFMA y la subclase murina IgM se determinó con
el equipo para medir isotopos de anticuerpos monoclonales (formato
de tira reactiva) (19663-012, Life Technologies
Inc.)
El dominio extracelular del FLT4 que se describe
en el ejemplo 7 se marcó de acuerdo con lo descrito en Mukkala
et al. en Anal. Biochem. 176(2):
319-325, 1989, con la siguiente modificación: un
exceso molar de 250 veces de isotiocianato DTTA-Eu
(N1 quelato, WALLAC, Finlandia) se añadió a la solución del FLT4
(0,5 mg/ml en PBS) y el pH se ajustó a aproximadamente 9 mediante
la adición de 0,5 mol/L de tampón de carbonato de sodio, pH 9,8. El
marcaje se llevó a cabo durante la noche a +4ºC. Las moléculas de
marcaje no unidas se eliminaron utilizando PD-10
(PHARMACIA, Suecia) con tampón de TSA (50 mmol/L,
Tris-HCl, pH 7,8 que contenía 0,15 mol/l NaCl) como
eluyente.
Después de la purificación, se añadió 1 mg/ml de
albúmina de suero bovino (BSA) al FLT4 marcado y se almacenó a
+4ºC. El número de iones de europio que se había incorporado por
cada molécula de FLT4 fue 1,9, una cifra que se determinó mediante
la medición de la fluorescencia a una relación que correspondía a la
de estándares de EuCl_{3} conocidos (Hemmilä et al.,
Anal. Biochem., 137: 335-343, 1984).
Los anticuerpos producidos en el ejemplo 8 se
rastrearon mediante un ensayo inmunofluorométrico tipo sándwich con
tiras de micropocillos (NUNC, polysorb) recubierto de Ig
anti-murino de conejo (Z 259, DAKOPATTS). Los
pocillos previamente recubiertos se lavaron una vez con la solución
de lavado DELFIA en el equipo Platewash 1296-024
(WALLAC). El tampón de ensayo DELFIA se utilizó como un tampón de
dilución para los sobrenadantes de los cultivos de células y para
el suero de los ratones esplenectomizados (a diluciones de entre
1:1000 a 1:100.000) utilizados como control positivo en el ensayo de
rastreo preliminar.
Una incubación durante la noche a +4ºC (o como
alternativa, durante 2 horas a temperatura ambiente) se comenzó con
agitación en un agitador Plateshake (1296-001,
WALLAC) durante 5 minutos seguidos de cuatro lavados con la solución
de lavado tal como se ha descrito anteriormente.
Se añadió el FLT4 marcado con Europio a una
dilución de 1:500 en 100 \mul del tampón del ensayo. Después de 5
minutos en un agitador Plateshake y una hora de incubación a
temperatura ambiente, las tiras se lavaron tal como se ha descrito
anteriormente.
Se añadió una solución de potenciación (DELFIA)
a 200 \mul/pocillo. Las placas se agitaron durante 5 minutos en
un agitador Plateshake y se midió la intensidad de la fluorescencia
con ARCUS-1230 (WALLAC) durante
10-15 minutos (Lövgren et al., en: Collins
W.P. (Ed) Alternative Microassays, John Wiley & Sons Ltd,
1985, pp. 203-216).
Los anticuerpos monoclonales contra el FLT4
resultantes y los resultados correspondientes del FACS se resumen en
la tabla 2.
Clones MAb | LTR%^{(a)} | NEO%^{(b)} | Recuentos DELFIA |
1B1 | 67,3 | 1 | 20625 |
1B1D11 | 75 | 1,2 | 19694 |
1B1F8 | 76,1 | 1,4 | 18580 |
4F6 | 69,9 | 1,2 | 23229 |
4F6B8G12 | 75 | 0,3 | 24374 |
4F6B8H11 | 75,9 | 0,3 | 28281 |
4F6B8E12 | 74,8 | 0,4 | 27097 |
4F6B8G10 | 75,3 | 0,4 | 26063 |
Clones MAb | LTR%^{(a)} | NEO%^{(b)} | Recuentos DELFIA |
9D9 | 45,1 | 0,75 | 17316 |
9D9D10 | 71,7 | 2,3 | 18230 |
9D9F9 | 73 | 1,8 | 11904 |
9D9G6 | 74,3 | 2,9 | 16743 |
9D9G7 | 70,7 | 1,3 | 17009 |
10E4 | 24,2 | 1,4 | 39202 |
10E4B10E12 | 32,3 | 0,3 | 42490 |
10E4B10G10 | 36,5 | 0,3 | 54815 |
10E4B10F12 | 45,6 | 0,4 | 43909 |
10E4B10G12 | 45,7 | 0,5 | 35576 |
11G2 | 30,2 | 1,6 | 11304 |
11G2D12 | 74,4 | 1,5 | 14660 |
11G2G9 | 74,2 | 0,9 | 10283 |
11G2H7 | 74,4 | 2,1 | 25382 |
^{(a)} Resultados del FACS con células transfectadas con LTR | |||
^{(b)} Resultados del FACS con células NEO (control) |
Se observó que un clon, designado
anti-FLT4 9D9F9, secretó de forma estable el
anticuerpo monoclonal que se determinó que pertenecía a la clase
inmunoglobulina IgG1 mediante IFMA. El hibridoma 9D9F9 se depositó
en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos de Células,
Departamento de Cultivos de Células Humanas y Animales y de Virus,
Mascheroder Weg 1b, 3300 Braunschweig, Alemania, el 23 de marzo,
1995, y se le proporcionó el número de accesión ACC2210.
El dominio extracelular del FLT4 que se describe
en el ejemplo 7 se marcó según lo descrito por Mukkala et
al., en Anal. Biochem. 176(2): 319-325,
1989, con la siguiente modificación: se añadió un exceso molar de
250 veces de isotiocianato DTTA-Eu (quelato N1,
Wallac, Finlandia) a la disolución de FLT4 (0,5 mg/ml en PBS) y el
pH se ajustó a 9 mediante la adición de un tampón de carbonato de
sodio a 0,5 mol/L y un pH de 9,8. El marcaje se llevó a cabo durante
la noche a +4ºC. El marcado no unido se eliminó utilizando
PD-10 (PHARMACIA) con tampón TSA (50 mmol/L
Tris-HCl, pH 7,8 que contenía 0,15 mol/L NaCl) como
eluyente.
Después de la purificación, se añadió 1 mg/ml de
albúmina de suero bovino (BSA) al FLT4 marcado y se almacenó a
+4ºC. El número de iones de europio que se incorporaron por cada
molécula de FLT4 fue 1,9 tal como se determinó midiendo la
fluorescencia a una relación que correspondía a la de estándares de
EuCl_{3} conocidos (Hemmil et al., Anal. Biochem., 137:
335-343, 1984).
Los anticuerpos producidos en el ejemplo 8 se
rastrearon con un IFMA específico para FLT4 utilizando micropocillos
(Nunc, Polysorb) recubiertos con Ig anti-ratón de
conejo (Z 259 DAKO). Los pocillos precubiertos se lavaron una vez en
la disolución de lavado (Wallac) con el equipo DELFIA Platewash.
El tampón de ensayo de DELFIA se utilizó como un
tampón de dilución para el cultivo de sobrenadantes de las células
(dilución 1:2 en el rastreo preliminar) y para el suero de los
ratones esplenectomizados (diluciones 1:1000 y 1:100.000) que se
utilizó como control positivo. Como estándar, el
anti-FLT49 9D9F9 purificado (subclase murina IgG1)
se usó a concentraciones entre 1,0 ng/ml y 250 ng/ml. Las muestras
se agitaron primero a temperatura ambiente durante 5 minutos en el
equipo Plateshake (Wallac) y a continuación se incubaron durante
aproximadamente 18 horas a +4ºC. Los marcos se lavaron primero
cuatro veces, luego se añadió el FLT4 marcado en el Eu (1:2000 en
100 \mul de tampón de ensayo) y finalmente se incubaron los marcos
durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar tal como
se ha descrito, se añadió la disolución de potenciación (200
\mul/pocillo, Wallac) y los marcos se agitaron durante 5 minutos
en el equipo Plateshake. La intensidad de la fluorescencia se midió
con el ARCUS-1230 (Wallac).
Los anticuerpos monoclonales resultantes contra
el FLT4 y los resultados correspondientes se resumen en la tabla
3.
Una curva estándar para la cuantificación de los
anticuerpos anti-FLT4 se construyó con
anti-FLT4 9D9F9 purificado mediante afinidad. El
intervalo linear se extendió desde 1,0 ng/ml hasta 250 ng/ml.
El lisado de las células NIH 3T3
co-transfectadas con el constructo pLTRFLT4 que
expresa el FLT4 completo en la superficie se sometió a una
electroforesis en SDS-PAGE al 6,5%; las proteínas se
transfirieron a la membrana nitrato nitrocelulosa (0,45 \mum,
SCHLEICHER & SCHUELL) y se llevó a cabo una inmunotransferencia
con los sobrenadantes de los cultivos de las células MAb (1:10, 50
mmol/L TRIS - tampón de 40 mmol/L de glicina que contenía metanol
al 4% y SDS al 0,04%). La especificidad del MAb se detectó mediante
la incubación con Ig anti-ratón de conejo conjugado
en HRP (P 161, DAKO, con dilución de 1:1000 en tampón TRIS de 20
mmol/L a pH 7,5 que contenía 150 mmol/L de solución salina, y polvo
de leche al 5%) y ECL (quimioluminiscencia potenciada,
AMERSHAM).
Clones MAb | LTR%^{(a)} | NEO^{(b)} | Prod. Aprox. de | WB |
MAb ng/ml/10^{6} | ||||
células | ||||
2B12E10 | 39,5 | 6,0 | 440 | + |
2E11D11 | 44,6 | 8,8 | 110 | + |
2E11F9 | 49,5 | 4,5 | 100 | + |
2E11F12 | 46,0 | 4,1 | 180 | + |
2E11G8 | 41,2 | 7,8 | 160 | + |
6B2E12 | NF | NF | 1390 | + |
6B2F8 | NF | NF | 470 | + |
6B2G6 | NF | NF | 630 | + |
6B2H5 | NF | NF | 740 | + |
6B2H8 | NF | NF | 1800 | + |
^{(a)} Resultados del FACS con células LTR transfectadas | ||||
^{(b)} Resultados del FACS con células NEO (control) | ||||
NF: No funcional en el FACS | ||||
^{(c)} \begin{minipage}[t]{158mm} Cuantificación de la producción de MAb basada en anticuerpo anti-FLT 9D9F9 purificado mediante afinidad como estándar.\end{minipage} |
Como se deduce de lo anterior, los anticuerpos
según la presente invención son útiles en el diagnóstico y la
identificación de los vasos linfáticos, las células endoteliales
linfáticas, las vénulas endoteliales altas, los linfangiomas, los
ganglios linfáticos metastáticos, y otras condiciones patológicas
del sistema linfático, la detección y el seguimiento de la
extensión de la metástasis, en la estimulación e inhibición de las
células endoteliales de los vasos linfáticos y las vénulas altas
linfáticas, en la introducción selectiva de moléculas en las
células endoteliales y en la toma de imágenes de los vasos
linfáticos en sujetos enfermos. Otras utilidades de lo descrito en
la presente invención son evidentes para alguien que conoce la
técnica.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Alitalo, Kari
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Nyyrikintie 4 A
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: ESPOO
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: FINLANDIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL: FIN-02100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Kaipainen, Arja
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Messeniuksenkatu 7 A 9
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: HELSINKI
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: FINLANDIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL: FIN-00250
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Korhonen, Jaana
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Agricolankatu 7 C 68
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: HELSINKI
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: FINLANDIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL: FIN-00530
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Mustonen, Tuija
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Pihlajatie 8 A 2
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: HELSINKI
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: FINLANDIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL: FIN-00270
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Pajusola, Katri
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Kasteholmantie 4 A 8
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: HELSINKI
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: FINLANDIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL: FIN-00900
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Matikainen, Marja-Terttu
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Lankkistentanhua 12
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: MYÄMÄKI
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: FINLANDIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL: FIN-23100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Karnani, Päivi
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Mullintie 10 B 62
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: TURKU
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: FINLANDIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL: FIN-20300
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: RECEPTOR FLT4 DE TIROSINA QUINASA Y SU USO EN EL DIAGNÓSTICO Y LA TERAPIA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- INFORMACIÓN INFORMÁTICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE INFORMÁTICO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Compatible con el PC IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión 1.25 (OEP)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL
\vskip0.500000\baselineskip
- NÚMERO DE SOLICITUD: WO TO BE ASIGNADO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/257754
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 9-JUN-1994
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID Nº 1
Claims (7)
1. El uso de un anticuerpo monoclonal contra el
dominio extracelular del receptor FLT4 tirosina quinasa para la
preparación de una composición diagnóstica para tomar imágenes de
los vasos linfáticos, los ganglios linfáticos o las vénulas
endoteliales altas (VEAs).
2. El uso de un anticuerpo monoclonal contra el
dominio extracelular del receptor FLT4 tirosina quinasa para la
preparación de una composición diagnóstica para detectar el tejido
linfático, los vasos linfáticos, o las vénulas endoteliales altas
(VEAs).
3. El uso de la reivindicación 2, en donde el
tejido linfático para la detección es el tejido de un ganglio
linfático.
4. El uso de un anticuerpo monoclonal contra el
dominio extracelular del receptor FLT4 tirosina quinasa para la
preparación de una composición farmacéutica para inhibir la
vascularización linfática mediada por el FLT4 que se asocia con una
enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: cánceres
metastáticos, linfomas, linfangiomas, la inflamación (crónica o
aguda), infecciones, y enfermedades inmunológicas.
5. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 4, en donde dicho anticuerpo monoclonal es un anticuerpo
monoclonal anti-FLT4 producido de una línea de
hibridoma de células depositada con el número DSM ACC 2210.
6. Un método para la toma de imágenes in
vitro de vasos linfáticos en una muestra de tejido, que
comprende los pasos de:
(a) aplicar un anticuerpo
anti-FLT4 marcado para permitir su detección a dicha
muestra de tejido con sospecha de contener vasos linfáticos; y
(b) detectar dicho anticuerpo
anti-FLT4 marcado para permitir su detección que
está unido a dicha muestra de tejido.
7. Un método para diagnosticar enfermedades
caracterizadas por cambios en los vasos linfáticos y las
VEAs, que comprende los pasos de:
(a) exponer una muestra de tejido obtenida de un
paciente con sospecha de padecer una enfermedad caracterizada
por cambios en las células linfáticas y las VEAs a un anticuerpo
anti-FLT4 marcado;
(b) lavar dicha muestra de tejido; y
(c) detectar la presencia de dicho anticuerpo
anti-FLT4 marcado para permitir su detección en
dicha muestra de tejido.
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