ES2261274T3

ES2261274T3 - Formulaciones farmaceuticas que comprenden resveratrol y utilizacion de las mismas.

Info

Publication number: ES2261274T3
Application number: ES00991709T
Authority: ES
Inventors: John M. Pezzuto; Richard C. Moon; Mei-Shiang Jang; Aomar Ouali; Shengzhao Lin; Karla Slowing Barillas
Original assignee: Pharmascience Inc
Current assignee: Pharmascience Inc
Priority date: 1999-10-29
Filing date: 2000-10-23
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2020-10-23
Also published as: WO2001030336B1; WO2001030336A3; EP1239849A2; CA2389167C; DE60027463T2; DK1239849T3; DE60027463D1; CY1106107T1; WO2001030336A2; CA2389167A1; US6414037B1; US20020173472A1; WO2001030336A9; EP1239849B1; PT1239849E; ATE323473T1

Abstract

Utilización de un agente activo seleccionado de entre resveratrol, sales, ésteres y amidas farmacológicamente aceptables del mismo, y combinaciones de cualquiera de los anteriores para la preparación de una formulación farmacéutica tópica para la prevención o tratamiento de un estado, trastorno o enfermedad de la piel seleccionados de entre psoriasis, dermatitis por contacto, dermatitis atópica, una epidermolisis bullosa, dermatitis exfoliativa, dermatitis seborreica, eritema multiforme, eritema nodosum, lupus eritematoso discoide y dermatomiositis.

Description

Formulaciones farmacéuticas que comprenden resveratrol y utilización de las mismas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general a formulaciones farmacéuticas y procedimientos de utilización de las mismas. Más particularmente, la invención se refiere a formulaciones farmacéuticas de resveratrol (3,5,4'-trihidroxiestilbeno) que resultan útiles, por ejemplo, en la prevención y el tratamiento de estados de la piel asociados con inflamación, daños por el sol y el envejecimiento. La invención resulta de utilidad en los campos de la administración farmacológica, de la medicina y de la farmacología.

Antecedentes de la técnica

Se ha observado que existen varios compuestos fenólicos biológicamente activos presentes en el vino, particularmente en el vino tinto. Entre estos compuestos se incluyen, por ejemplo, catequina, epicatequina, quercetina, rutina, trans-resveratrol, cis-resveratrol, cis-resveratrol, glucósido de cis-resveratrol y glucósido de trans-resveratrol. Ver, por ejemplo, Goldberg et al., Anal. Chem. 68:1688-1694, (1996). Se ha demostrado que estos compuestos protegen a las lipoproteínas de baja densidad frente a la oxidación. Los isómeros del resveratrol, en particular, se ha descubierto que promueven la relajación vascular a través de la generación de óxido nítrico por el endotelio, y que modulan la síntesis de eicosanoides de una manera que sugiere su utilización en la prevención de las enfermedades cardíacas coronarias (Id., páginas 1688-89). Este descubrimiento explica aparentemente los estudios que demuestran que el consumo moderado de vino tinto tiende a presentar un efecto protector frente a las enfermedades cardíacas (Bertelli et al., Inst. J. Tiss. Reac. XVII(1):1-3, 1995).

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El resveratrol (3,5,4'-trihidroxiestilbeno) se ha identificado como un constituyente no sólo de la piel de la uva (Soleas et al., Am. J. Enol. Vitic. 46(3):346-352, (1995)) sino que se ha descubierto asimismo que se encuentra presente en la nuez de la India, en el eucalipto, y en otras especies vegetales (Goldberg et al., Am. J. Enol. Vitic. 46(2):159-165, (1995)). Gran parte del interés se ha centrado en la actividad antifúngica del compuesto y en su correlación con la resistencia a la infección fúngica (Id., página 159). El resveratrol puede obtenerse comercialmente (típicamente en forma de isómero trans, por ejemplo de Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), o puede aislarse a partir de vino o de la piel de la uva, o puede sintetizarse químicamente. La síntesis típicamente se lleva a cabo mediante una reacción de Wittig uniendo dos fenoles sustituidos mediante un doble enlace de estireno, tal como describen Moreno-Manas et al., Anal. Quim. 81:157-61, (1985), y posteriormente modificado por otros (Jeandet et al., Am. J. Enol. Vitic. 42:41-46, (1991); Goldberg et al., Anal. Chem. 66:3959-63, (1994)).

Existen más estudios sobre el trans-resveratrol que sobre el isómero cis; sin embargo, el isómero cis aparentemente es igual de importante desde un punto de vista biológico. Se han propuesto y evaluado numerosos usos para los isómeros del resveratrol. Jang et al., Science 275:218-220, (1997), han demostrado que el resveratrol presenta actividad quimiopreventiva del cáncer, en ensayos que representan tres etapas principales de la carcinogénesis. Es decir, los autores han descubierto que el compuesto: (1) actúa como antioxidante y antimutágeno y que induce los enzimas de fase II metabolizadores de fármaco; (2) media en los efectos antiinflamatorios e inhibe la ciclooxigenasa y la hidroperoxidasa; y (3) induce la diferenciación celular de la leucemia promielocítica humana. Además, tal como se ha indicado anteriormente, el resveratrol ha sido ampliamente estudiado por su correlación con la utilidad cardiovascular del vino tinto (ver, por ejemplo, Bertelli et al., supra; Pace-Asciak et al., Clinica Chimica Acta 235:207-2191, (1995); y Frankel et al. (24 de abril de 1993), The Lancet 341:1104. También se han propuesto aplicaciones neurológicas (Lee et al., Society for Neuroscience Abstracts 20(1-2):1648, (1994)).

Sin embargo, hasta el momento no es conocida la administración tópica del resveratrol. La presente invención se basa en el descubrimiento inesperado de que la administración tópica del resveratrol resulta extremadamente efectiva en la prevención o el tratamiento de determinados estados, trastornos y enfermedades de la piel, por ejemplo de estados de la piel asociados a inflamación, a daños de la piel asociados a la exposición al sol, y a los efectos del envejecimiento natural. Se ha descubierto además que la administración de resveratrol en la forma de una microemulsión resulta un modo particularmente efectivo de administración del agente activo.

Además, se ha descubierto que el resveratrol resulta útil como agente quimiopreventivo del cáncer. Entre los agentes quimiopreventivos del cáncer conocidos se incluyen los fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAID), tales como la indometacina, la aspirina, el piroxicam y el sulindac, que en su totalidad inhiben la ciclooxigenasa, abreviada en lo sucesivo COX. Resulta importante disponer de una actividad inhibidora de COX en la quimioprevención del cáncer debido a que COX cataliza la conversión del ácido araquidónico en sustancias proinflamatorias, tales como las prostaglandinas, que pueden estimular el crecimiento de las células tumorales y suprimir la vigilancia inmunológica (Plescia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:1848, (1975); Goodwin, Am. J. Med. 77:7, (1994)). Además, COX puede activar carcinógenos produciendo formas que dañan el material genético (Zenser et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 277:545, (1983); Wild et al., Carcinogenesis 8:541, (1987)). Algunos investigadores han buscado nuevos agentes quimiopreventivos del cáncer mediante la evaluación de cientos de extractos vegetales para su potencial de inhibición de COX. Se ha identificado un extracto derivado de Cassia quinquangulata Rich. (Leguminosae) como un potente inhibidor de COX, y a partir del fraccionamiento guiado por bioensayo, se ha identificado el trans-resveratrol como el compuesto activo (ver Mannila et al., Phytochemistry 33:813, 19983, y Jayatilake et al., J. Nat. Prod. 56:1805, (1993)).

Exposición de la invención

De acuerdo con lo expuesto anteriormente, un objetivo principal de la invención consiste en satisfacer las necesidades de la técnica indicadas anteriormente proporcionando un procedimiento para la prevención o el tratamiento de determinados estados, trastornos y enfermedades de la piel.

Otro objetivo de la invención consiste en proporcionar un procedimiento para la administración a un paciente de una formulación que comprende un agente activo seleccionado de entre resveratrol, sales, ésteres y amidas farmacológicamente aceptables del mismo, y combinaciones de cualquiera de los anteriormente indicados.

Otro objetivo de la invención consiste en proporcionar un procedimiento en el que la formulación se administra tópicamente.

Todavía otro objetivo de la invención consiste en proporcionar un procedimiento en el que el estado, trastorno o enfermedad de la piel están asociados a inflamación.

Todavía otro objetivo de la invención consiste en proporcionar un procedimiento en el contexto de la prevención o el tratamiento del daño solar relacionado con la piel y/o de los efectos del envejecimiento natural sobre la piel.

Un objetivo adicional de la invención consiste en proporcionar un procedimiento en el contexto de la prevención de los cánceres de la piel.

Un objetivo más de la invención consiste en proporcionar procedimientos en los que se administra resveratrol en forma estereoisoméricamente pura, es decir, en la forma trans o en la forma cis.

Todavía un objetivo adicional de la invención consiste en proporcionar nuevas formulaciones farmacéuticas que comprenden un agente activo seleccionado de entre resveratrol, sales, ésteres y amidas farmacológicamente aceptables del mismo, y combinaciones de cualquiera de los anteriores, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable.

Se dan a conocer en parte objetivos adicionales, ventajas y características nuevas de la invención en la descripción siguiente, y en parte resultarán evidentes para los expertos en la materia tras examinar la exposición siguiente, o se pondrán de manifiesto mediante la puesta en práctica de la invención.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención se proporciona la utilización de un agente activo seleccionado de entre resveratrol, sales, ésteres y amidas farmacológicamente aceptables del mismo, y combinaciones de cualquiera de los compuestos anteriores, para la preparación de una formulación farmacéutica tópica para la prevención o el tratamiento de un estado, trastorno o enfermedad de la piel, seleccionada de entre el grupo constituido por psoriasis, dermatitis por contacto, dermatitis atópica, una epidermolisis bullosa, dermatitis exfoliativa, dermatitis seborreica, eritema multiforme, eritema nodosum, lupus eritematoso discoide y dermatomiositis.

Generalmente, el agente activo es cis-resveratrol, trans-resveratrol, o un complejo en el que se conjugan uno o más de los grupos hidroxilo de los compuestos con un monosacárido o disacárido, por ejemplo glucósido de cis-resveratrol, glucósido de trans-resveratrol, etc. Sin embargo, como apreciarán los expertos en la materia, y como se comenta en detalle en la presente memoria, pueden utilizarse asimismo otras formas de los agentes activos. El estado, trastorno o enfermedad de la piel puede ser psoriasis, dermatitis por contacto (incluyendo la dermatitis por contacto irritativo y la dermatitis por contacto alérgico), dermatitis atópica (conocida asimismo como eccema alérgico), epidermolisis bullosas (incluyendo el penfigus), dermatitis exfoliativa, dermatitis seborreica, eritemas (incluyendo el eritema multiforme y el eritema nodosum), daños causados por el sol o por otras fuentes de luz, lupus eritematoso discoide, dermatomiositis, los efectos del envejecimiento natural, y similares.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una formulación farmacéutica tópica para la utilización en la prevención o tratamiento de estados, trastornos y enfermedades de la piel seleccionados de entre psoriasis, dermatitis por contacto, dermatitis atópica, una epidermolisis bullosa, dermatitis exfoliativa, dermatitis seborreica, eritema multiforme, eritema nodosum, lupus eritematoso discoide, y dermatomiositis, que comprende un portador tópico y una concentración antiinflamatoria terapéuticamente efectiva de un agente activo seleccionado de entre cis-resveratrol, sales, ésteres o amidas farmacológicamente aceptables del mismo, y combinaciones de cualesquiera de los indicados anteriormente. Son preferidos los conjugados de cis-resveratrol con monosacáridos o disacáridos. La formulación está destinada preferentemente a la administración tópica, y de esta manera comprende asimismo un portador tópico farmacéuticamente aceptable seleccionado para corresponder a un tipo de formulación particular, por ejemplo pomada, loción, crema, microemulsión, gel, aceite, solución o similar. La formulación también puede contener uno o más agentes activos y/o aditivos adicionales, tales como solubilizadores, intensificadores de la permeación de la piel, opacificadores, conservantes (por ejemplo antioxidantes), agentes gelificantes, agentes tamponadores, surfactantes, emulsionantes, emolientes, agentes espesantes, estabilizantes, humectantes, colorantes, fragancia, y similares. La inclusión de solubilizantes y/o de intensificadores de la permeación de la piel resulta particularmente preferida.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 contiene gráficos de actividad de COX-1 y de COX-2 frente a la concentración de indometacina y de resveratrol;

la fig. 2 contiene gráficos de actividad hidroperoxidasa COX-1 y COX-2 frente a concentración de indometacina y resveratrol;

la fig. 3 es un gráfico de porcentaje de incidencia de lesiones mamarias en ratones frente a la concentración de resveratrol;

la fig. 4 contiene gráficos de porcentaje de reducción de volumen de pata frente al tiempo (horas) para una inflamación inducida por carragenanos en ratas al utilizar diversos fármacos en comparación con un grupo de control; y

la fig. 5 contiene gráficos de % de incidencia de tumor (a) y de número de tumores (b) frente al tiempo tras el tratamiento con resveratrol.

Modos de poner en práctica la invención Visión general y definiciones

Debe indicarse que, tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones, las formas del singular "un/uno/una", "y" e "el/la" incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un agente activo" en una formulación incluye dos o más agentes activos, la referencia a "un portador" incluye dos o más portadores, etc.

En la presente descripción y en las reivindicaciones adjuntas, se hace referencia a varios términos que se definen con los significados siguientes:

La expresión "administración tópica" se utiliza en su sentido convencional para referirse a la administración media de un fármaco tópico o agente farmacológicamente activo en la piel o mucosa, tal como, por ejemplo, en el tratamiento de diversos trastornos de la piel. En general, cuando se utiliza el término "piel" en la presente memoria, tal como en el contexto de la administración de una formulación tópica en "la piel", debe entenderse que también se concibe como posibilidad la administración en un tejido mucoso.

Las expresiones "agente activo", "fármaco" y "agente farmacológicamente activo" se utilizan indistintamente en la presente memoria para referirse a un material o compuesto químico que resulta adecuado para la administración tópica y que induce el efecto fisiológico deseado. Estas expresiones incluyen derivados, análogos y profármacos de dichos compuestos, así como las sales, ésteres y amidas farmacéuticamente aceptables, y similares.

El término "resveratrol" pretende referirse al isómero cis del resveratrol, al isómero trans del resveratrol, o a una mezcla de los dos isómeros. El término pretende asimismo incluir tanto el agente activo de origen natural, como el compuesto en la forma sintetizada químicamente en el laboratorio. Además, cuando se utiliza el término "resveratrol" en la presente memoria, pretende comprender las sales, ésteres y amidas farmacológicamente aceptables del resveratrol.

Las expresiones "efectiva" o "terapéuticamente efectiva" referidas a la cantidad de un fármaco se refieren a una cantidad no tóxica aunque suficiente de un compuesto para proporcionar el efecto deseado en una relación razonable de beneficio/riesgo bajo cualquier tratamiento médico. El efecto deseado puede ser el alivio de los indicios, síntomas o causas de una enfermedad, o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico.

El término "tratar", tal como en "tratar un estado de la piel", pretende incluir: (1) la prevención del estado, es decir, la evitación de cualquier síntoma clínico del estado, (2) la inhibición del estado, es decir, la detención del desarrollo o progresión de los síntomas clínicos, y/o (3) el alivio del estado, es decir, la inducción de la regresión de los síntomas clínicos.

Los términos "estado", "trastorno" y "enfermedad" se utilizan indistintamente en la presente memoria como haciendo referencia a un estado fisiológico que puede prevenirse o tratarse mediante la administración de un agente activo tal como se describe en la presente memoria.

El término "individual", tal como en el tratamiento de "un individuo", pretende referirse a un individuo mamífero que padece, o tiene tendencia a padecer, un estado, trastorno o enfermedad, tales como los especificados en la presente memoria, e incluye tanto seres humanos como animales.

La expresión "farmacológicamente aceptable" se refiere a un material que no resulta biológicamente, o de otro modo, indeseable, es decir, el material puede administrarse a un individuo junto con el agente activo seleccionado sin causar ningún efecto biológico indeseable ni interaccionar de manera deletérea con cualquiera del resto de componentes de la composición farmacéutica en la que se encuentra contenido. De manera similar, una sal "farmacológicamente aceptable" o un éster "farmacológicamente aceptable" de un agente activo tal como se proporciona en la presente memoria es una sal o un éster que no es biológicamente, o de otro modo, indeseable.

La expresión "intensificador de penetración" o "intensificador de la permeación" tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a un incremento de la permeabilidad de la piel o de un tejido mucosal al agente farmacológicamente activo seleccionado, es decir, de manera que se incrementa la tasa a la que el fármaco permea a través de la piel o una mucosa.

El término "opcional" u "opcionalmente" se refieren a que puede producirse o no la circunstancia indicada posteriormente, de manera que la descripción incluye casos en los que se produce la circunstancia, y casos en los que no se produce. Por ejemplo, la indicación de un aditivo como "opcionalmente presente" en una formulación en la presente invención comprende tanto la formulación que contiene el aditivo como la formulación que no contiene el adi-
tivo.

Agentes activos para el tratamiento

La invención, tal como se ha indicado anteriormente, implica la administración de resveratrol a un individuo con el fin de prevenir o tratar los estados de la piel con inflamación asociada.

El resveratrol puede administrarse en una forma natural, es decir, tal como se aísla de la piel de la uva, del vino o de otras composiciones derivadas de plantas, o puede administrarse en forma sintetizada químicamente en el laboratorio (por ejemplo utilizando los procedimientos de Moreno-Manas et al., Jeandet et al., o Goldberg et al., (1994), citados anteriormente en la presente memoria), o tal como se obtienen comercialmente, por ejemplo de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Entre los procedimientos preferidos para la obtención de resveratrol de una fuente natural se encuentran: extraer el compuesto de P. capsudatum o de raíces secas de C. quinquangulata, que pueden recolectarse en Perú. El material vegetal seco triturado puede extraerse con un disolvente adecuado, por ejemplo metanol, seguido preferentemente de la concentración y dilución con agua. Tras lavar con hexano o con un disolvente orgánico no polar igualmente adecuado, la capa acuosa puede separarse con, por ejemplo, acetato de etilo. A continuación, el extracto de acetato de etilo se separa en fracciones utilizando, por ejemplo, cloroformo-metanol (0 a 30% de metanol) como eluyente sobre una columna cromatográfica de gel de sílice. Las fracciones con concentraciones más altas de resveratrol pueden agruparse y someterse a una cromatografía de columna adicional hasta obtener el producto a un rendimiento suficientemente elevado.

El agente activo puede administrarse en forma de una sal, éster o amida farmacológicamente aceptable, o en forma de combinaciones de los mismos. Pueden prepararse sales, ésteres y amidas del resveratrol utilizando procedimientos estándar conocidos por los expertos en la materia de la química orgánica sintética y la formulación farmacéutica, descritos, por ejemplo, por J. March, "Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure", 4^{a} edición (New York: Wiley-Interscience, 1992) y en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19^{a} edición (Easton, P.A.: Mack Publishing Company, 1995). Por ejemplo, se preparan sales básicas de adición a partir de fármaco neutro mediante medios convencionales, que implican la reacción de uno o más de los grupos hidroxilos libres del agente activo con una base adecuada. En general, la forma neutra del fármaco se disuelve en un disolvente orgánico polar, tal como metanol o etanol, y la base se añade a la solución resultante. La sal resultante precipita o se retira de la solución mediante la adición de un disolvente menos polar. Entre las bases adecuadas para formar sales básicas de adición se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, bases inorgánicas, tales como hidróxido sódico, hidróxido de potasio, hidróxido amónico, hidróxido de calcio o trimetilamina. La preparación de ésteres implica la funcionalización de grupos hidroxilo que pueden encontrarse presentes en la estructura molecular del fármaco. Los ésteres son típicamente derivados acil-sustituidos de los grupos de alcohol libres, es decir, grupos que se derivan de ácidos carboxílicos de fórmula RCOOH, en la que R es alquilo, y preferentemente es alquilo inferior. Los ésteres pueden reconvertirse en los ácidos libres, si se desea, mediante la utilización de procedimientos convencionales de hidrogenolisis o de hidrólisis. La preparación de las amidas puede llevarse a cabo de una manera análoga. Pueden prepararse otros derivados de los agentes activos utilizando técnicas estándar conocidas por los expertos en la materia de la química orgánica sintética, o pueden deducirse mediante referencia a la literatura pertinente.

Los derivados preferidos del cis-resveratrol y del trans-resveratrol son aquéllos en los que uno o más de los grupos hidroxilo del compuesto, típicamente el grupo 3-hidroxilo, se conjuga con un monosacárido o un disacárido, generalmente con la posición 1 de un monosacárido. Entre los ejemplos de sacáridos que pueden conjugarse con la molécula de resveratrol se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, glucosa, galactosa, maltosa, lactosa y sacarosa. El glucósido de cis-resveratrol y el glucósido de trans-resveratrol resultan particularmente preferidos.

Formulaciones farmacéuticas

En una forma de realización preferida, el agente activo se incorpora en una formulación tópica que contiene un portador tópico que generalmente resulta adecuado para la administración tópica del fármaco y que comprende cualquier material de este tipo conocido en la técnica. Los portadores tópicos se seleccionan de manera que proporcionen la composición en la forma deseada, por ejemplo en forma de pomada, loción, crema, microemulsión, gel, aceite o solución, y pueden estar comprendidos de un material de origen natural o sintético. Resulta esencial, claramente, que el portador seleccionado no afecte negativamente al agente activo o a otros componentes de la formulación tópica. Entre los ejemplos de portadores tópicos adecuados para la utilización en la presente memoria se incluyen agua, alcoholes y otros disolventes orgánicos no tóxicos, glicerina, aceite mineral, silicona, parafina, lanolina, ácidos grasos, aceites vegetales, parabenes o ceras.

Las formulaciones particularmente preferidas en la presente memoria son pomadas, lociones, cremas, microemulsiones y geles incoloros e inodoros.

Las pomadas son preparaciones semisólidas que se basan típicamente en petrolato o en otros derivados del petróleo. La base de pomada específica de utilización, como apreciarán los expertos en la materia, es la que permite una administración óptima del fármaco y, preferentemente, que proporciona asimismo otras características deseadas, por ejemplo emoliencia o similar. Al igual que con otros portadores o vehículos, una base de pomada debe ser inerte, estable, no irritante y no sensibilizadora. Tal como se explica en la obra de Remington, citada en la sección anterior, las bases de pomada pueden agruparse en cuatro clases: bases oleaginosas, bases emulsionables, bases de emulsión, y bases solubles en agua. Las bases de pomada oleaginosas incluyen, por ejemplo, aceites vegetales, grasas obtenidas de animales, e hidrocarburos semisólidos obtenidos del petróleo. Las bases de pomada emulsionables, conocidas asimismo como bases de pomada absorbentes, contienen poco o nada de agua e incluyen, por ejemplo, sulfato de hidroxiestearina, lanolina anhidra y petrolato hidrofílico. Las bases de pomada en emulsión son emulsiones de agua-en-aceite (W/O) o emulsiones de aceite-en-agua (O/W), e incluyen, por ejemplo, alcohol cetílico, monoestearato de glicerilo, lanolina y ácido esteárico. Las bases de pomada solubles en agua preferidas se preparan a partir de polietilenglicoles (PEGs) de diverso peso molecular; nuevamente, puede hacerse referencia a la obra de Remington, supra, para más información.

Las lociones son preparaciones que se aplican sobre la superficie de la piel sin fricción, y son típicamente preparaciones líquidas o semilíquidas en las que las partículas sólidas, incluyendo el agente activo, se encuentran presentes en una base de agua o de alcohol. Las lociones son habitualmente suspensiones de sólidos, y preferentemente, para el presente fin, comprenden una emulsión aceitosa líquida del tipo aceite-en-agua. Las lociones son formulaciones preferidas en la presente memoria para el tratamiento de grandes áreas corporales, debido a la facilidad de aplicación de una composición más fluida. Generalmente resulta necesario que la materia insoluble en una loción se encuentre finamente dividida. Las lociones típicamente contienen agentes de suspensión para producir mejores dispersiones, así como compuestos que resulten útiles para localizar y mantener el agente activo en contacto con la piel, por ejemplo metilcelulosa, o carboximetilcelulosa sódica. Una formulación de loción particularmente preferida para la utilización conjuntamente con la presente invención contiene propilenglicol mezclado con un petrolato hidrofílico, tal como el que puede obtenerse bajo la marca comercial Aquaphor®, de Beiersdorf, Inc. (Norwalk,
CT).

Las cremas que contienen el agente activo son, tal como son conocidas en la técnica, emulsiones líquidas viscosas o semisólidas, de aceite-en-agua o de agua-en-aceite. Las bases de pomada son lavables en agua, y contienen una fase aceite, un emulsionante y una fase acuosa. La fase aceite generalmente comprende petrolato y un alcohol graso, tal como alcohol cetílico o estearílico; la fase acuosa habitualmente, aunque no necesariamente, presenta un volumen superior al de la fase aceite, y contiene generalmente un humectante. El emulsionante en una formulación de crema, tal como se explica en la obra de Remington, supra, generalmente es un surfactante no iónico, aniónico, catiónico o anfotérico.

Las microemulsiones son dispersiones termodinámicamente estables e isotrópicamente transparentes de dos líquidos inmiscibles, tales como aceite y agua, estabilizadas por una película interfacial de moléculas surfactantes (Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, New York: Marcel Dekker, 1992, volumen 9). Para la preparación de microemulsiones, resultan necesarios el surfactante (emulsionante), el cosurfactante (coemulsionante), una fase aceite y una fase agua. Entre los surfactantes adecuados se incluye cualquier surfactante que resulte útil en la preparación de emulsiones, por ejemplo emulsionantes que se utilizan típicamente en la preparación de cremas. El cosurfactante (o "coemulsionante") generalmente se selecciona de entre el grupo de derivados del poliglicerol, los derivados de glicerol y los alcoholes grasos. Las combinaciones preferidas de emulsionante/coemulsionante generalmente, aunque no necesariamente, se seleccionan de entre el grupo constituido por: monoestearato de glicerilo y estearato de polioxietileno; polietilenglicol y palmitoestearato de etilenglicol; triglicéridos caprílicos y cápricos y oleil macrogolglicéridos. La fase agua incluye no sólo agua sino además, típicamente, tampones, glucosa, propilenglicol, polietilenglicoles, preferentemente polietilenglicoles de bajo peso molecular (por ejemplo PEG 300 y PEG 400) y/o glicerol, y similares, mientras que la fase aceite generalmente comprende, por ejemplo, ésteres de ácido graso, aceites vegetales modificados, aceites de silicona, mezclas de monoglicéridos, diglicéridos y triglicéridos, monoésteres y diésteres de PEG (por ejemplo oleil macrogolglicéridos), etc.

Las formulaciones de gel son sistemas semisólidos constituidos por suspensiones de partículas inorgánicas pequeñas (sistemas de dos fases) o grandes moléculas orgánicas distribuidas de manera sustancialmente uniforme en un líquido portador (geles de una sola fase). Los geles de una sola fase pueden prepararse, por ejemplo, combinando el agente activo, un portador líquido y un agente gelificante adecuado, tal como tragacanto (al 2 a 5%), alginato sódico (al 2 a 10%), gelatina (al 2 a 15%), metilcelulosa (al 3 a 5%), carboximetilcelulosa sódica (al 2 a 5%), carbómero (al 0,3 a 5%) o alcohol polivinílico (al 10 a 20%), y mezclando hasta producir un producto semisólido característico. Entre otros agentes gelificantes adecuados se incluyen metilhidroxicelulosa, polioxietilén-polioxipropileno, hidroxietilcelulosa y gelatina. Aunque los geles utilizan comúnmente un portador líquido acuoso, pueden asimismo utilizarse alcoholes y aceites como el portador líquido.

Pueden incluirse diversos aditivos, conocidos por los expertos en la materia, en las formulaciones tópicas de la invención. Entre los ejemplos de aditivos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, solubilizantes, intensificadores de la permeación en la piel, opacificadores, conservantes (por ejemplo antioxidantes), agentes gelificantes, agentes tamponadores, surfactantes (particularmente surfactantes no iónicos y anfotéricos), emulsionantes, emolientes, agentes espesantes, estabilizantes, humectantes, colorantes, fragancia, y similares. La inclusión de solubilizantes y/o de intensificadores de permeación en la piel resulta particularmente preferida, junto con emulsionantes, emolientes y conservantes. Una formulación tópica óptima comprende aproximadamente: entre 2% en peso y 60% en peso, preferentemente entre 2% en peso y 50% en peso, de solubilizante y/o de intensificador de la permeación en la piel; entre 2% en peso y 50% en peso, preferentemente entre 2% en peso y 20% en peso, de emulsionantes; entre 2% en peso y 20% en peso de emoliente; y entre 0,01% y 0,2% en peso de conservante, constituyendo el agente activo y el portador (por ejemplo agua), el resto de la formulación.

Un intensificador de la permeación en la piel sirve para facilitar el paso de niveles terapéuticos de agente activo a través de un área de tamaño razonable de piel intacta. Los intensificadores adecuados son bien conocidos en la técnica y entre ellos se incluyen, por ejemplo: los alcanoles inferiores, tales como metanol, etanol y 2-propanol; los alquilmetilsulfóxidos, tales como dimetilsulfóxido (DMSO), decilmetilsulfóxido (C_{10}MSO) y tetradecilmetilsulfóxido; las pirrolidonas, tales como 2-pirrolidona, N-metil-2-pirrolidona y N-(hidroxietil)pirrolidona; urea; N,N-dietil-m-toluamida; C_{2}-C_{6}-alcanodioles; disolventes varios, tales como dimetilformamida (DMF), N,N-dimetilacetamida (DMA) y alcohol tetrahidrofurfurílico y las azacicloheptán-2-onas 1-sustituidas, particularmente 1-N-dodecilciclazacicloheptán-2-ona (laurocapramo; disponible bajo la marca comercial Azone®, de Whitby Research Incorporated, Richmond, VA).

Entre los ejemplos de solubilizantes se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los siguientes: éteres hidrofílicos, tales como dietilenglicol monoetil éter (etoxidiglicol; disponible comercialmente como Transcutol®) y oleato de dietilenglicol monoetil éter (disponible comercialmente como Softcutol®); derivados polietileno del aceite de ricino, tales como el aceite de ricino polioxi 35, el aceite de ricino hidrogenado polioxi 40, etc.; polietilenglicol, particularmente los polietilenglicoles de bajo peso molecular, tales como PEG 300 y PEG 400, y los derivados de polietilenglicol, tales como los glicéridos caprílicos/cápricos PEG-8 (disponibles comercialmente como Labrasol®); los alquilmetilsulfóxidos, tales como DMSO; las pirrolidonas, tales como 2-pirrolidona y N-metil-2-pirrolidona; y DMA. Muchos solubilizantes pueden asimismo actuar como intensificadores de la absorción. Puede incorporarse un solo solubilizador en la formulación, o incorporarse una mezcla de solubilizadores en la misma.

Entre los emulsionantes y coemulsionantes adecuados se incluyen, aunque sin limitación, aquellos emulsionantes y coemulsionantes descritos con respecto a las formulaciones en microemulsión. Entre los emolientes se incluyen, por ejemplo, propilenglicol, glicerol, miristato de isopropilo, y propionato de polipropilenglicol-2 (PPG-2) miristil éter.

Pueden incluirse asimismo otros agentes activos en la formulación, por ejemplo otros agentes antiinflamatorios, analgésicos, agentes antimicrobianos, agentes antifúngicos, antibióticos, vitaminas, antioxidantes, y agentes bloqueantes solares que se encuentran frecuentemente en las formulaciones de pantalla solar, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, antranilatos, benzofenonas (particularmente benzofenona-3), derivados del canfor, cinamatos (por ejemplo metoxicinamato de octilo) dibenzoilmetanos (por ejemplo butilmetoxidibenzoil metano), ácido p-aminobenzoico (PABA) y derivados de los mismos, y salicilatos (por ejemplo salicilato de octilo).

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En las formulaciones tópicas preferidas de la invención, el agente activo se encuentra presente en una cantidad comprendida en el intervalo entre aproximadamente 0,25% en peso y 75% en peso de la formulación, preferentemente en el intervalo entre aproximadamente 0,25% en peso y 30% en peso de la formulación, más preferentemente en el intervalo entre aproximadamente 0,5% en peso y el % en peso de la formulación, y todavía más preferentemente en el intervalo entre aproximadamente 1,0% en peso y 10% en peso de la formulación.

En una forma de realización alternativa, se proporciona una formulación farmacéutica para la administración oral o parenteral, en cuyo caso la formulación comprende una microemulsión que contiene resveratrol, tal como se ha indicado anteriormente, pero que puede contener portadores, vehículos, aditivos farmacéuticamente aceptables alternativos, etc., que resultan particularmente adecuados para la administración oral o parenteral del fármaco. Alternativamente, puede administrarse oral o parenteralmente, sustancialmente tal como se ha indicado anteriormente, sin modificación, una microemulsión que contiene resveratrol.

Utilidad

Las formulaciones farmacéuticas de la invención resultan útiles para el tratamiento de seres humanos y animales que padecen, o que presentan la tendencia a padecer, determinados estados, trastornos o enfermedades de la piel asociados o causados por inflamación, daños provocados por el sol o el envejecimiento natural. Por ejemplo, las composiciones resultan útiles en la prevención o el tratamiento de la psoriasis, la dermatitis por contacto (incluyendo la dermatitis por contacto irritativa y la dermatitis por contacto alérgico), la dermatitis atópica (conocida asimismo como eccema alérgico), las epidermolisis bullosas (incluyendo el penfigus), la dermatitis exfoliativa, la dermatitis seborreica, los eritemas (incluyendo el eritema multiforme y el eritema nodosum), los daños causados por el sol o por otras fuentes de luz, el lupus eritematoso discoide, la dermatomiositis, el cáncer de piel y los efectos del envejecimiento natural. Las formulaciones se administran tópicamente, en la piel o en tejido mucosal, en forma de pomada, loción, crema, microemulsión, gel, solución o similar, tal como se ha indicado en la sección anterior, dentro del contexto de un régimen de dosificación efectivo para producir el resultado deseado. La dosis preferida de agente activo se encuentra comprendida en el intervalo entre aproximadamente 0,005 y aproximadamente 1 micromol por kg por día, preferentemente entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 0,75 micromoles por kg por día, más típicamente entre aproximadamente 0,075 y aproximadamente 0,5 micromoles por kg por día. Los expertos en la materia apreciarán que la cantidad y espaciado óptimos de las dosis individuales se determinan a partir de la naturaleza y grado del estado bajo tratamiento, el sitio de administración, y el individuo particular sometido a tratamiento, y que estos óptimos pueden determinarse mediante técnicas convencionales. Es decir, un régimen de dosificación óptimo para cualquier paciente particular, es decir, el número y frecuencia de las dosis, puede determinarse utilizando ensayos convencionales de determinación de curso de tratamiento. Generalmente, un régimen de dosificación en la presente memoria implica la administración de la formulación tópica por lo menos una vez al día, y preferentemente una a cuatro veces al día, hasta la remisión de los síntomas.

Las formulaciones tópicas de la invención pueden utilizarse asimismo como composiciones quimiopreventivas. Cuando se utilizan en un procedimiento quimiopreventivo, se trata la piel susceptible previamente a la aparición de ningún estado visible en un individuo particular.

Parte experimental

Los ejemplos siguientes se ofrecen para proporcionar a los expertos en la materia una exposición y descripción completas de cómo preparar y utilizar las formulaciones de la invención, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención. Se ha procurado garantizar la exactitud con respecto a los datos numéricos (por ejemplo cantidades, temperaturas, etc.), pero debe preverse la existencia de algunos errores y desviaciones. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, la temperatura es en ºC y la presión es la atmosférica o aproximadamente la atmosférica. Todos los disolventes, reactivos y componentes de formulación eran de grado farmacéutico.

Ejemplo 1 Preparación de una crema de resveratrol

Se preparó una composición farmacéutica tópica que contenía trans-resveratrol en la forma de una crema, de la manera siguiente:

Fase	Componente	% en peso
1	Palmitoestearato de polietilenglicol y de etilenglicol	5%
	Triglicéridos caprílicos/cápricos	5%
	Oleil macrogolglicéridos (Labrafil M 1944CS)	4%
	Alcohol cetílico	5,5%
	Propionato de PPG-2 miristil éter (Crodamol PMP)	6%

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(Continuación)

Fase	Componente	% en peso
2	Goma xantano	0,3%
	Agua purificada	48%
3	Propilenglicol	1%
	Metilparabén	0,18%
	Propilparabén	0,02%
4	Trans-resveratrol	10%
	Dietilenglicol monoetil éter (Transcutol)	15%

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La composición se preparó de la manera siguiente. Se dispersó la goma xantano en agua, y se dejó reposar. La fase 1 (la fase aceite) se calentó hasta 75ºC. A continuación, la fase 2 se calentó hasta 75ºC. Bajo agitación a alta velocidad, se mezcló la fase 1 con la fase 2. La temperatura se mantuvo a 75ºC y se continuó la agitación rápida durante 10 minutos. La mezcla se enfrió lentamente mientras se continuaba la agitación a velocidad baja. A 40ºC, se añadió la fase 3. A continuación, se dispersó el trans-resveratrol en el dietilenglicol monoetil éter, se calentó hasta 40ºC y después se enfrió hasta 30ºC bajo agitación lenta (fase 4). A 30ºC, se añadió la fase 4 a la crema, se mezcló bien, y se enfrió hasta la temperatura ambiente bajo agitación lenta. Se obtuvo una crema estable blanque-
cina.

Ejemplo 2 Microemulsión de resveratrol

Se preparó una microemulsión de resveratrol que presentaba los componentes siguientes:

Componente	% en peso
Trans-resveratrol	10%
Dietilenglicol monoetil éter (Transcutol)	47,4%
Triglicéridos caprílicos/cápricos PEG-8 (Labrasol)	23,7%
Oleil macrogolglicéridos (Labrafil M 1944 CS)	7,9%
PEG 400	4,7%
Agua	0,3%

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El trans-resveratrol se dispersó en dietilenglicol monoetil éter. Se añadieron los glicéridos caprílicos/cápricos PEG-8 y oleil macrogolglicéridos, bajo agitación. A continuación, se añadió lentamente PEG 400, nuevamente bajo agitación, seguido de la adición de agua. Se obtuvo una microemulsión ligeramente amarilla transparente y estable.

Ejemplo 3 Ensayo de inhibición de la inflamación inducida por TPA

La inhibición de la inflamación inducida por la aplicación repetida de 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) puede utilizarse para indicar la eficacia de diversas formulaciones utilizadas para tratar la inflamación. El procedimiento de ensayo está modificado respecto al descrito por Marks et al., Cancer Res. 36:2636, (1976). Es conocido que el TPA induce cambios en la piel murina que resultan similares a muchos de los cambios inflamatorios y epiteliales que se producen en enfermedades humanas de la piel, tales como la psoriasis. De esta manera, este modelo basado en el ratón se cree que también es un buen indicador de la respuesta en el ser humano.

La composición del Ejemplo 1 (1 g, eliminando cualquier exceso) se aplica inicialmente en ambos oídos de diez ratones. A continuación, se aplica el estímulo inflamatorio (es decir, TPA) en el oído derecho de cada ratón. Cuatro horas después, se mide el edema mediante el pesado de discos que se han extraído del oído con pinzas de biopsia. Un grupo de control recibió TPA en el oído derecho y la composición sin el resveratrol en el oído izquierdo. Se calculó la proporción de peso entre discos que recibieron composición y TPA, y los que recibieron solo TPA, proporcionando el porcentaje de inhibición de la hinchazón del control. Se llevó a cabo el mismo procedimiento para la microemulsión del Ejemplo 2. La composición del Ejemplo 1 proporcionó una inhibición del 72% de la hinchazón, mientras que la microemulsión del Ejemplo 2 proporcionó una inhibición del 74% de la hinchazón en comparación con el control. De esta manera, se demostró que ambas formulaciones proporcionaban una inhibición efectiva de la inflama-
ción.

Ejemplo 4 Inhibición de la formación de células de quemadura solar

Se aplicó la composición del Ejemplo 1 (1 g aplicado a un área de 1 cm^{2}, eliminando cualquier exceso) en la piel de ratones. Se irradió la piel con UV-B (100 mJ/cm^{2}) (lámpara sanitaria SE20/SLE, Toshiba). Veinticuatro horas después, se obtuvo una biopsia de la piel en el área de tratamiento y en un área libre de tratamiento sirvió como control. Las muestras de biopsia se tiñeron con hematoxilina y eosina, después de lo cual se contó el número de células de quemadura solar en un microscopio. Se calculó la proporción entre el número de células de quemadura solar en áreas que habían recibido el tratamiento y el número en áreas libres de tratamiento, proporcionando el porcentaje de inhibición de la formación de células de quemadura solar. Se repitió el mismo procedimiento utilizando la microemulsión del Ejemplo 2. Se demostró que la composición del Ejemplo 1 daba lugar a 76% menos de células de quemadura solar y que la microemulsión daba lugar a 79% menos de células de quemadura solar. De esta manera, se demostró que ambas formulaciones proporcionaban una inhibición efectiva de la formación de células de quemadura so-
lar.

Ejemplo 5 Inhibición de la formación de arrugas en ratones sin pelo

Se aplicó a cada ratón sin pelo (HR/ICR, 6 semanas de edad), la composición del Ejemplo 1 (1 g aplicado en un área de 1 cm^{2}, eliminando cualquier exceso). Aproximadamente 10 minutos después, se irradiaron los ratones con UV-B utilizando 6 bombillas de lámparas sanitarias (SL20-SLE, Toshiba), de manera que la dosis por irradiación no fuese superior a 1 MED (dosis eritematógena mínima). La aplicación de la formulación seguida de la irradiación se repitió cinco veces cada semana a lo largo de dieciséis semanas. Aunque la energía de irradiación se mide utilizando un UV-radiómetro (UVR-305/S65D, Tokyo Optical K.K.) de manera que la dosis por irradiación no supere 1 MED, la energía se irradió a una intensidad de 0,28 mW/cm^{2} hasta una dosis total de 100 mJ/cm^{2}. Como control, se aplicó una composición igual en todos los respectos a la composición del Ejemplo 1 excepto en que carecía de resveratrol, y el ratón se irradió de manera similar siguiendo el protocolo proporcionado anteriormente. Se llevó a cabo el mismo procedimiento para la microemulsión del Ejemplo 2.

A continuación, se determinó el nivel de formación de arrugas utilizando los estándares siguientes (índices de arruga): (1) no se formaron arrugas; (2) se formaron cantidades reducidas de arrugas; (3) se formaron cantidades moderadas de arrugas; y (4) se formaron cantidades considerables de arrugas.

Con el fin de analizar las arrugas, se obtuvieron, utilizando un agente de formación de imágenes hidrofílico exaflex, hidrofílico vinil silicona, réplicas de diferentes áreas de piel (3 réplicas por ratón), cada una de ellas de forma redonda y un diámetro de 1 cm. Se orientó cada réplica horizontalmente y se iluminaron en ángulo de 30º. El área de sombras formada por las arrugas se analizó como proporción de área mediante la utilización de un aparato de análisis de imágenes.

Se muestran los resultados a continuación:

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Ejemplo	Índice de arruga	Proporción de área del análisis de imágenes (%)
1	2,06	3,01
2	1,97	2,85
control	3,78	6,46

De esta manera, se demostró que ambas formulaciones inhibían la formación de arrugas.

Ejemplo 6 Prevención del daño solar en seres humanos

Tras establecer una MED (dosis eritematógena mínima) para cada uno de 10 pacientes, se aplicó la composición del Ejemplo 1 (bajo oclusión) a cada paciente 2 horas antes de la irradiación con UVB. Se expusieron a irradiación UVB dos áreas de piel por paciente: un área que recibió la composición del Ejemplo 1 y un área que recibió la misma composición pero sin resveratrol. Una hora después de la irradiación UVB, cada paciente recibió una nueva aplicación de la misma composición en el área apropiada de la piel. Durante los tres días siguientes, se evaluó cada paciente y se fotografiaron los sitios de irradiación. Se compilaron y se evaluaron los resultados de los 10 pacientes. Se siguió el mismo procedimiento para la microemulsión del Ejemplo 2. Se demostró que el resveratrol protege del daño solar en el ser humano.

Ejemplo 7 Resveratrol administrado tópicamente en la quimioprevención

Se descubrió que el resveratrol inhibía sucesos celulares asociados a la iniciación, promoción y progresión de los tumores. Tal como se comenta posteriormente en la presente memoria, se demostró la actividad del resveratrol a partir de la capacidad de éste de inhibir la actividad ciclooxigenasa de COX-1 (es decir, una dosis efectiva mediana ED_{50} de 15 \mum). Esta actividad se correlaciona con la promoción antitumoral. Aunque la actividad inhibidora del resveratrol era inferior a la de algunos NSAIDs, tal como la indometacina (ED_{50} = 2,3 \muM), la actividad del resveratrol era mucho mayor que la actividad de compuestos tales como la aspirina (ED_{50} = 880 \muM). Además, al contrario que la indometacina y que la mayoría de otros NSAID, el resveratrol inhibió la actividad hidroperoxidasa de COX-1 (ED_{50} = 3,7 \muM).

La inhibición mediada por el resveratrol era específica de la actividad ciclooxigenasa de COX-1 debido a que no había actividad discernible al evaluar la asimilación de oxígeno con COX-2, una forma inducible del enzima asociada con respuestas tales como la inflamación, y la inhibición de la actividad hidroperoxidasa de COX-2 (ED_{50} = 85 \muM) era muy reducida en comparación con la actividad observada con COX-1.

Estos resultados se ilustran en los gráficos de las figs. 1 a 3. La fig. 1 muestra los efectos de inhibición de la indometacina sobre COX-1 y del resveratrol sobre COX-1 y COX-2. La fig. 1 incluye gráficos de porcentaje de actividad frente a concentración de indometacina o de resveratrol (en \muM). Se midió la actividad de COX mediante la medición del oxígeno a 37ºC. El procedimiento se describe en F.J.G. Van der Ouderaa et al., Methods Enzymol. 86:60, (1982), y R.J. Kulmacz et al., en: Prostaglandins and Related Substances. A Practical Approach, C. Benedetto et al., editores (IRL Press, Oxford, 1987), páginas 209-227, las cuales se incorporan a la presente memoria en su totalidad como referencia. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de ácido araquidónico 0,6 mM a una mezcla que contenía fosfato sódico 0,1 M (molar) (pH 7,4), fenol 1,0 mM (milimolar) y hemina 0,01 mM; se utilizaron microsomas (0,2 mg de proteína) derivadas de vesículas seminales de oveja como fuente cruda de COX-1 o COX-2 recombinante humana (0,1 mg de proteína); y el compuesto de ensayo. La fig. 1 muestra el drástico efecto de inhibición del resveratrol sobre COX-1.

La fig. 2 muestra el efecto de inhibición de la indometacina sobre la actividad hidroxiperoxidasa de COX-1 y del resveratrol sobre la actividad hidroxiperoxidasa de COX-1 o de COX-2. La actividad hidroxiperoxidasa se determinó mediante espectrofotometría. Las mezclas de reacción contenían tris-NCl 0,1 M (pH 8,5), hemina 1,2 \muM (micromolar), N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilendiamina (TMPD) 0,24 mM, COX-1 (36 \mug de proteína) o COX-2 (45 \mug de proteína) y un compuesto de ensayo. Se utilizó peróxido de hidrógeno (250 \muM) para iniciar la reacción, y se midieron los cambios de absorbancia a 595 nm (nanómetros). Se calculó la actividad de inhibición comparando la tasa inicial de cambio de absorbancia en presencia de un compuesto de ensayo con la observada con disolvente dimetilsulfóxido (DMSO) únicamente. Cada punto representa la media de dos determinaciones réplicas. La fig. 2 muestra que el resveratrol inhibe fuertemente la actividad hidroxiperoxidasa de COX-1.

La fig. 3 muestra la inhibición de lesiones preneoplásicas inducidas por DMBA (7,12-dimetilbenz(a)antraceno) en un cultivo de glándula mamaria de ratón debida al tratamiento de resveratrol. Las glándulas mamarias se incubaron con resveratrol durante 10 días y con DMBA durante 24 horas el día tres. El procedimiento se describe en Moon et al., en: Chemistry and Biology of Retinoids, editores Dawson et al. (Boca Raton, FL: CRC Press, 1990), en las páginas 501-518. El porcentaje de incidencia de lesiones mamarias se determinó tras 14 días adicionales de incubación. Los datos de los grupos tratados con resveratrol se compararon con los grupos de control y los resultados se expresan en porcentaje. El resveratrol demostró una capacidad excelente de inhibir las lesiones preneoplásicas inducidas por DMBA en cultivos de glándula mamaria de ratón.

Basándose en los resultados ilustrados en las figs. 1 a 3, se investigó la actividad antiinflamatoria del resveratrol. En un modelo de inflamación inducida por carragenanos en ratas, el resveratrol redujo significativamente el edema pedal tanto en la fase aguda (3 a 7 horas) como en la fase crónica (24 a 144 horas). La actividad supresora de edema del resveratrol fue superior a la de la fenilbutazona, y similar a la de la indometacina. Estos datos se muestran en la fig. 4. En global, los datos de la fig. 4 demuestran la capacidad del resveratrol de inhibir la promoción de tumores.

En particular, la fig. 4 muestra los efectos del resveratrol (a 3 mg/kg y a 8 mg/kg de peso corporal), de la fenilbutazona y de la indometacina sobre la inflamación inducida por carragenanos en ratas. El procedimiento se describe en Slowing et al., J. Ethnopharmacol. 43:9, (1994), incorporada a la presente memoria como referencia. En estos ensayos, se dividieron en grupos de siete animales, ratas Wistar hembras (peso corporal de entre 150 y 200 g). Todas las ratas recibieron 0,1 ml de adyuvante completo de Freund, disponible de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, mediante inyección intradérmica en la cola. Los animales se utilizaron 7 días después de la inyección de adyuvante. Una hora después de la administración oral de resveratrol (3 ú 8 mg por kilogramo de peso corporal) o de fármacos de referencia, incluyendo la fenilbutazona (80 mg/kg) y la indometacina (5 mg/kg), las ratas se inyectaron con 0,1 ml de una suspensión al 2% (p/v) de carragenanos en solución salina en la pata trasera izquierda. Para el grupo de control, se utilizó como el vehículo una mezcla 1:1 de Tween 80 (es decir, polisorbato 80, disponible de ICI Americas, Inc., Wilmington, DE) y agua (0,2/3,3, v/v) y metilcelulosa al 1% (p/v). Se midió el volumen de la pata trasera izquierda de cada rata mediante pletismografía hidráulica en una Letica, modelo L17500, antes de la inyección de adyuvante, y nuevamente 6 días después, antes de la inyección de carragenanos. Se determinaron los volúmenes de pata dentro de las 3 a 144 horas de la inyección del carragenano. Se calculó la inhibición del edema respecto al edema medio del grupo de control tratado con vehículo.

Se determinó el porcentaje de reducción comparando el volumen de pata de las ratas en el grupo de control (tratadas únicamente con carragenanos) con el volumen de las patas de las ratas en el grupo tratado con fármaco. Se repitió la dosificación diariamente durante 7 días. Las horas se refiere a horas tras la inyección de carragenanos. Los datos para el grupo de la indometacina a las 120 horas y a las 140 horas no resultaron fiables debido a la inducción de lesiones secundarias. Los gráficos en la fig. 4 muestran que el resveratrol resultó efectivo en la reducción de la inflamación inducida por carragenanos en ratas.

Se descubrió asimismo que el resveratrol inhibía sucesos asociados con la iniciación de tumores. Por ejemplo, el resveratrol inhibió la formación de radicales libres (ED_{50} = 27 \muM) de una manera dosis-dependiente, al tratar células de la leucemia promielocítica humana (HL-60) con TPA. El procedimiento se describe en Sharma et al., Cancer Res. 54:5848, (1994). En estos ensayos, se mantuvieron células HL-60 en medio RPMI 1640 (disponible de Gibo BRL, Gran Island, NY) suplementada con suero bovino al 5% inactivado por calor, penicilina G sódica (100 U/ml) y sulfato de estreptomicina (100-\mug/ml) (Gibco BRL) a 37ºC en una atmósfera humidificada de 5% de dióxido de carbono en aire. Se indujo la diferenciación mediante un tratamiento de 7 días con DMSO al 1,3%, y las células se cultivaron en placas de 96 pocillos (1 x 10^{6} células por pocillo) en solución salina equilibrada de Hank que contenía Hepes 30 mM, pH 7,6. Tras la adición de TPA (8 \muM) para inducir la formación de radicales libres, se añadieron citocromo c (160 \muM) y resveratrol. Las células se incubaron durante 1 hora a 37ºC y se determinó la actividad antioxidante mediante el seguimiento de la absorbancia a 550 nm. Se utilizó la misma mezcla de reacción, aunque sin células HL-60, como control de blanco.

El resveratrol funcionó asimismo como antimutágeno, tal como ilustra la inhibición dosis-dependiente de la respuesta mutagénica inducida por el tratamiento de Salmonella typhimurium cepa TM677 con 7,12-dimetil-benz(a)antraceno (DMBA) (ED_{50} = 4 \muM). Este procedimiento se describe en Shamon et al., Anticancer Res. 14:1775, (1995), incorporado a la presente memoria como referencia. En estos ensayos, se preparó una mezcla de reacción que contenía Salmonella typhimurium cepa TM677, homogenizado S9 de hígado derivado de ratas tratadas previamente con Aroclor 1254, un sistema generador de NADPH (NADPH es la forma reducida de la nicotinamida adenina dinucleótido fosfato) y diversas concentraciones de resveratrol, que se añadieron un minuto antes de la adición de DMBA 80 \muM. Tras la incubación durante 2 horas a 37ºC, se recuperaron las bacterias mediante centrifugación, se resuspendieron, y se sembraron en placas (por triplicado) en ágar mínimo en presencia o en ausencia de 8-azaguanina. A continuación, las placas se incubaron durante 48 horas a 37ºC, y los resultados se expresan como fracciones de mutantes, es decir, el número medio de colonias capaces de crecer en presencia de 8-azaguanina dividido por el número medio de colonias capaz de crecer en ausencia de 8-azaguanina, tras corregir para los factores de dilución. Se calculó el porcentaje de inhibición respecto a las placas de control que habían sido tratadas únicamente con
DMSO.

Además, el resveratrol indujo la actividad de quinona reductasa en cultivo de células de hepatoma de ratón (Hepa 1c1c7) (concentración requerida para doblar la actividad, 21 \muM) (ver Prochaska et al., Anal. Biochem. 169:328, (1988)). Este resultado es importante porque los enzimas de fase II, tales como la quinona reductasa, son capaces de destoxificar metabólicamente los carcinógenos. Ver Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3247, (1994). Se observó un perfil de respuesta idéntico en cultivo de células de hepatoma PB^{1}Cl (un derivado de las células Hepa 1c1c7 que no es capaz de inducir el enzima de fase I), indicando que el resveratrol es un inductor monofun-
cional.

Además, la capacidad del resveratrol de inhibir la etapa de progresión de la carcinogénesis se sometió a ensayo mediante tratamiento de células HL-60 en cultivo con resveratrol (ver Suh et al., Anticancer Res. 15:233, (1995)). Bajo condiciones normales de cultivo, estas células presentan una capacidad proliferativa ilimitada. De una manera dosis-dependiente, la expresión inducida por resveratrol de la actividad de reducción del nitroazul de tetrazolio, un marcador de la formación de granulocitos (ED_{50} = 11 \muM), y la actividad no específica de esterasa ácida, un marcador de la formación de macrofase (monocitos) (ED_{50} = 19 \muM). Concurrentemente, se inhibió la incorporación de [^{3}H]-timidina (ED_{50} = 18 \muM), lo que es indicativo de la diferenciación terminal a un fenotipo no prolifera-
tivo.

Con el fin de evaluar más directamente la actividad quimiopreventiva del cáncer del resveratrol, se investigaron los efectos del resveratrol en un modelo de cultivo de glándula mamaria de ratón. El resveratrol inhibía, de manera dosis-dependiente, el desarrollo de lesiones preneoplásicas inducidas por DMBA (ED_{50} = 3,1 \muM) (ver la fig. 3). No se observaron indicios de toxicidad, según el examen morfológico de las glándulas.

Además, se estudió la tumorogénesis en el modelo de dos etapas de cáncer de piel de ratón en el que se había utilizado el DMBA como iniciador y el TPA como promotor. Durante un estudio de 18 semanas, los ratones tratados con DMBA más TPA desarrollaron una media de dos tumores por ratón con una incidencia de tumores del 40%, tal como se ilustra en la fig. 5(a).

En particular, la fig. 5 muestra el efecto del resveratrol sobre la tumorogénesis en el modelo de dos etapas en piel de ratón. Seis grupos de 20 ratones CD-1 hembras (de entre 4 y 5 semanas de edad) se trataron tópicamente con 200 \mumoles de DMBA en 0,2 ml de acetona en la región dorsal afeitada (ver Gerhäuser et al., Nature Med. 1:260, (1995)). Una semana después, los ratones se trataron con 5 \mumoles de TPA en 0,2 ml de acetona solos o conjuntamente con 1, 5, 10 ó 25 \mumoles de resveratrol en 0,2 ml de acetona, dos veces por semana durante 18 semanas. Los animales se pesaron semanalmente y se observaron para el desarrollo de tumores una vez cada semana. La fig. 5A muestra el porcentaje de incidencia de tumores observables en la piel. La fig. 5B muestra el número total de tumores observables en la piel. En global, la fig. 5 muestra que el resveratrol redujo enormemente la incidencia de tumores en el modelo de piel de ratón.

La aplicación de 1, 5, 10 ó 25 \mumoles de resveratrol, junto con TPA dos veces por semana durante 18 semanas, redujo el número de tumores en la piel por ratón en el 68, 81, 76 y 98%, respectivamente, y se redujo el porcentaje de ratones con tumores en el 50, 63, 63 y 88%, respectivamente (fig. 5(b)). No se observaron indicios manifiestos de toxicidad inducida por el resveratrol, según la inspección visual de la piel, el examen morfológico general de los sistemas orgánicos principales, o los cambios de peso corporal, en comparación con los contro-
les.

Para demostrar además la capacidad del resveratrol de actuar como agente quimiopreventivo del cáncer, se llevaron a cabo ensayos para determinar si el resveratrol poseía actividad contra la transformación neoplásica inducida químicamente en las células C3H/10T1/2 clon 8. Esta línea celular 10T1/2 de fibroblastos embrionarios de ratón se ha utilizado ampliamente como sistema experimental para estudiar la transformación neoplásica inducida por una diversidad de agentes, tales como los hidrocarburos policíclicos, los agentes metilantes y los rayos X. En estos experimentos, se llevaron a cabo ensayos de transformación en dos etapas con 3-metilcolantreno (MCA) o con DMBA como inductor, y con TPA como promotor.

Las células C3H10T1/2 Cl 8 se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC CCL 226, Rockville, MD) y se mantuvieron en medio basal de Eagle con sales de Earle (EBME) que contenían suero de feto bovino al 10% (v/v) (FBS, Gibco Laboratories, Chagrin Falls, OH) sin antibióticos, y bicarbonato sódico (2,2 g/l). Las células se sembraron a 5 x 10^{4} por matraz de 75 cm^{2} y se cultivaron en un incubador humidificado que contenía 5% de dióxido de carbono en aire a 37ºC. Las células utilizadas en todos estos experimentos se subcultivaron entre 10 y 13
veces.

Se llevaron a cabo ensayos de transformación en dos etapas en células C3H10T1/2 de acuerdo con un procedimiento modificado respecto al descrito en Mondal et al., Cancer Res. 36:2254-2260, (1976). Se sembraron mil células obtenidas de matraces confluyentes frescos por pocillo en placas de 12 pocillos que contenían 2 ml de medio (12 pocillos por punto experimental). Tras la incubación a 37ºC durante tres días, se añadieron MCA o DMBA (2 mg/ml de solución madre en DMSO), proporcionando concentraciones finales de 0,25 \mug/ml. Se extrajo el medio que contenía carcinógeno de los cultivos en crecimiento tras 24 horas y las células se enjuagaron una vez con PBS antes de la adición de EBME fresco suplementado con FBS al 10% y con gentamicina (25 \mug/ml). Tras cinco días de incubación adicional sin carcinógeno, se cambió el medio por medio fresco que contenía TPA (0,1 \mug/ml) o TPA y diferentes concentraciones de resveratrol. Se añadieron TPA y compuestos de ensayo al medio cada vez que se cambiaba el medio. El medio se cambió en todas las placas dos veces por semana. Tras alcanzar la confluencia, se redujo la concentración de FBS al 5% y se añadió anfotericina B (fungizona, 1,5 \mug/ml) al medio (ver Reznikoff et al., Cancer Res. 33:3239-3249, (1973), y Bertram, Cancer Lett. 7:289-298, (1979)). Se llevaron a cabo cambios posteriores de medio cada semana. Los cultivos se fijaron con metanol y se tiñeron con Giemsa en la séptima semana. Se registraron los focos transformados de tipo II y III de acuerdo con las enseñanzas de Landolph: "Transformation Assay of Established Cell Lines: Mechanism and Application", editores Kakunaga et al. (Toronto: Oxford University Press, 1985), páginas 185-199.

La Tabla 1 resume los efectos de diversos agentes quimiopreventivos, incluyendo el resveratrol, sobre la transformación neoplásica inducida químicamente.

TABLA 1

Efectos de diversos agentes quimiopreventivos sobre la transformación
neoplásica inducida químicamente
Tratamiento	Nº total de	Nº total de	Nº total de focos/nº	Nº de focos en	Pocillos con
	tipo II	tipo III	de pocillos	pocillos/nº total	focos (%)
			registrados	de pocillos
control de DMSO al 0,5%	0	0	0/12	0/12	0
MCA (5,0)*	9	2	11/12	8/12	67
MCA (0,25)	0	0	0/12	0/12	0
MCA (0,25); TPA (0,1)	8	0	8/12	7/12	58
MCA (0,25); TPA (0,1);	3	0	3/12	2/12	17
resveratrol 2,5 \muM
MCA (0,25; TPA (0,1));	3	1	4/12	2/12	17
resveratrol 5,0 \muM
DMSO al 0,5%	0	0	0/12	0/12	0
MCA (0,25); TPA (0,1);	1	0	1/12	1/12	8,3
resveratrol 10
control de DMSO al 0,5%	0	0	0/12	0/12	0
DMBA (5,0)	4	0	4/12	2/12	17
DMBA (0,25)	1	0	1/12	1/12	8,3
DMBA (0,25); TPA (0,1)	4	0	4/12	4/12	33
DMBA (0,25); TPA (0,1);	3	0	3/12	3/12	25
resveratrol 2,5
DMBA (0,25); TPA (0,1);	1	1	2/12	2/12	17
resveratrol 5,0
control de DMSO al 0,5%	0	0	0/12	0/12	0
DMBA (0,25); TPA (0,1);	1	1	2/12	2/12	17
resveratrol 10 \muM
DMBA (0,25); TPA (0,1);	0	0	0/12	0/12	0
aspirina 200 \muM
DMBA (0,25); TPA (0,1);	0	0	0/12	0/12	0
acetato de
todo-trans-retinilo (0,3)
DMBA (0,25); TPA (0,1);	4	0	4/12	4/12	33
Vit. E 100 \muM
*Números en paréntesis, concentración (\mug/ml)

Los ensayos y datos anteriores demuestran que el resveratrol puede administrarse a mamíferos como profiláctico contra los cánceres inducidos químicamente.

Claims

1. Utilización de un agente activo seleccionado de entre resveratrol, sales, ésteres y amidas farmacológicamente aceptables del mismo, y combinaciones de cualquiera de los anteriores para la preparación de una formulación farmacéutica tópica para la prevención o tratamiento de un estado, trastorno o enfermedad de la piel seleccionados de entre psoriasis, dermatitis por contacto, dermatitis atópica, una epidermolisis bullosa, dermatitis exfoliativa, dermatitis seborreica, eritema multiforme, eritema nodosum, lupus eritematoso discoide y dermatomiositis.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que la formulación farmacéutica tópica comprende además un portador tópico.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que el agente activo es cis-resveratrol o una sal, éster o amida farmacológicamente aceptable del mismo.

4. Utilización según la reivindicación 3, en la que el agente activo es cis-resveratrol.

5. Utilización según la reivindicación 3, en la que el agente activo es un conjugado de cis-resveratrol y un monosacárido o disacárido.

6. Utilización según la reivindicación 5, en la que el agente activo es el glucósido de cis-resveratrol.

7. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que el agente activo es trans-resveratrol o una sal, éster o amida farmacológicamente aceptable del mismo.

8. Utilización según la reivindicación 7, en la que el agente activo es trans-resveratrol.

9. Utilización según la reivindicación 7, en la que el agente activo es un conjugado de trans-resveratrol y un monosacárido o disacárido.

10. Utilización según la reivindicación 9, en la que el agente activo es el glucósido de trans-resveratrol.

11. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que el agente activo comprende una mezcla de cis-resveratrol y trans-resveratrol.

12. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que la formulación farmacéutica tópica comprende una pomada, una loción, una crema, una emulsión, una microemulsión, un gel o una solución.

13. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que la formulación farmacéutica tópica contiene de 0,25% en peso a 75% en peso de agente activo.

14. Utilización según la reivindicación 13, en la que la formulación farmacéutica tópica contiene de 0,25% en peso a 30% en peso de agente activo.

15. Utilización según la reivindicación 14, en la que la formulación farmacéutica tópica contiene de 0,5% en peso a 15% en peso de agente activo.

16. Utilización según la reivindicación 15, en la que la formulación farmacéutica tópica contiene de 1,0% en peso a 10% en peso de agente activo.

17. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que la formulación farmacéutica tópica debe ser administrada por lo menos una vez al día.

18. Utilización según la reivindicación 17, en la que la formulación farmacéutica tópica debe ser administrada una a cuatro veces al día.

19. Utilización de un agente activo seleccionado de entre resveratrol, sales, ésteres o amidas farmacológicamente aceptables del mismo, y combinaciones de cualquiera de los anteriores para la preparación de una formulación farmacéutica que comprende una microemulsión para la prevención o el tratamiento de un estado, trastorno o enfermedad de la piel seleccionados de entre psoriasis, dermatitis de contacto, dermatitis atópica, una epidermolisis bullosa, dermatitis exfoliativa, dermatitis seborreica, eritema multiforme, eritema nodosum, lupus eritematoso discoide y

\hbox{dermatomiositis.}

20. Formulación farmacéutica tópica para la utilización en la prevención o tratamiento de estados, trastornos y enfermedades de la piel seleccionados de entre psoriasis, dermatitis por contacto, dermatitis atópica, una epidermolisis bullosa, dermatitis exfoliativa, dermatitis seborreica, eritema multiforme, eritema nodosum, lupus eritematoso discoide y dermatomiositis, que comprende un portador tópico y una concentración antiinflamatoria terapéuticamente efectiva de un agente activo seleccionado de entre cis-resveratrol, sales, ésteres o amidas farmacológicamente aceptables del mismo, y combinaciones de cualesquiera de los anteriores.

21. Formulación según la reivindicación 20, en la que el agente activo es cis-resveratrol.

22. Formulación según la reivindicación 20, en la que el agente activo es un conjugado de cis-resveratrol y un monosacárido o disacárido.

23. Formulación según la reivindicación 22, en la que el agente activo es el glucósido de cis-resveratrol.