KR100468547B1 - 아시네토박토 종 ｓｙ－０１의 리파제 코딩 유전자 및이로부터 발현되는 리파제 - Google Patents

아시네토박토 종 ｓｙ－０１의 리파제 코딩 유전자 및이로부터 발현되는 리파제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아시네토박토 종 SY-01의 입체선택적 기질특이성을 갖는 리파제 및 리프를 코딩하는 유전자 서열 및 이로부터 발현되는 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 아시네토박토 종 SY-01 리파제는 활성이 우수하기 때문에 상기 리파제 코딩 유전자를 포함하는 형질전환된 미생물을 생체 촉매로서 이용하여 광학적으로 순수한 이트라코나졸 합성에 이용할 수 있다.

Description

아시네토박토 종 ＳＹ－０１의 리파제 코딩 유전자 및 이로부터 발현되는 리파제{Gene Coding for Lipase of Acinetobacter Species SY-01 and Protein Expressed Therefrom}
본 발명은 아시네토박토 종 SY-01의 입체선택적 기질특이성을 갖는 리파제 및 리프를 코딩하는 유전자 서열 및 이로부터 발현되는 단백질에 관한 것이다.
상기 아시네토박토 종 SY-01의 리파제는 항진균제의 원료로 사용되는 이트라코나졸의 중간체로서 라세미체 혼합물인 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로페닐)-1,3-디옥솔란-4-메틸 아세테이트를 입체 선택적으로 가수분해한다.
선택적 유기합성법의 한 분야로 생체 촉매를 이용하는 연구가 활발히 진행되고 있는데 이러한 연구는 주로 선진국에서 진행되고 있고 국내 연구는 미미한 상태이다.
리파제는 췌장에서 처음 발견된 후, 아밀라제 및 프로타제와 함께 3대 소화효소로 널리 사용되어 왔으며, 의학, 생리학 및 효소 생화학 등의 분야에서 폭넓게 연구되어 왔다. 리파제(EC 3.1.1.3, 트리아실글리세롤 아실히드롤라제)의 생체내 주기능은 여러 가지 지방질의 가수분해이지만, 반응기에서의 효소반응 조건에 따라 그 역반응인 에스터 합성반응과 트랜스에스터화 반응 등을 촉매하는 특성을 갖고 있다.
이를 이용한 라세미체 카르복실산과 알콜의 입체선택적 분할 방법은 가수분해, 에스테르화, 트랜스에스테르화 반응으로 나눌 수 있다. 가수분해 반응은 완충용액에서 진행되므로 용해 상태의 효소를 사용할 수 있고, 효소반응의 자연환경에 이어서 반응속도가 빠른 반면, 에스테르 기질을 사용하므로 기질의 용해도가 떨어지는 경우도 생긴다. 에스테르화 반응은 일반적으로 유기용매에서 효소반응이 일어나므로 기질의 용해도를 높일 수 있으나, 반응속도가 느리고 유기용매내 수분함량에 따라 반응속도 및 수율에 민감한 반응 특성을 보여 조업상 어려운 단점이 있다. 트랜스에스테르화 반응은 생성물의 분리가 어려운 점이 있으나 에스테르화 반응의 단점들을 많이 보완할 수 있어서 최근에 활발한 연구가 진척되었으며, 주로 키랄 알콜의 분할에 이용될 것이라 기대된다.
그동안 리파제를 이용하여 비스테로이드계 소염 진통제, 기타 다른 약품등 많은 의약품들이 성공적으로 합성되었으며, 현재까지 많은 종류의 리파제가 동물, 식물, 곰팡이 및 세균으로부터 발견되었는데, 그 중에서도 미생물(곰팡이 및 세균)이 생산하는 리파제가 다양한 기질특이성, 내열성, 내알칼리성, 유기용매성 및 입체특이성 등의 특성을 갖고 있는 것으로 밝혀져 산업적으로 널리 이용되고 있다 [Ruben G. et al. Mol. Microbiol. 15(5): 803-818, (1995) 참조].
이트라코나졸은 잘 알려진 항진균제(antifungal agent)로서 시스 형태의 이성질체를 상업적으로 이용할 수 있으나, 라세미체 혼합물 형태로 판매되고 있다. 그러나 이러한 라세미체 형태의 이트라코나졸은 간에 독성이 있고, 부정맥, 메스꺼움, 구토, 과민증, 두드러기, 복통, 두통, 현기증 등의 부작용을 유발할 수 있으므로 현재 화학적 합성법을 사용하여 광학적으로 순수한 이성질체를 제조하려는 연구가 시도되고 있는 실정이지만 생체 촉매를 이용하는 방법은 전무한 실정이다(미국특허 제5,952,502호 및 미국 특허 제5,474,997호).
따라서, 본 발명의 목적은 본 발명은 화학적 합성법이 아니라 생체 촉매인 미생물을 이용하여 광학적으로 순수한 이트라코나졸을 합성하기 위해 미생물로부터 생산되는 리파제의 유전자 서열을 밝히고, 이를 숙주 세포에서 대량 발현시켜 리파제를하는 것이다.
도 1은 본 발명에서 사용한 전체적인 구성도.
도 2는 다양한 제한효소를 이용해 제작한 유전자 지도.
도 3a는 아시네토박토 종 SY-01의 리파제 유전자 및 아미노산 서열.
도 3b는 아시네토박토 종 SY-01의 리프 (Lif) 단백질의 유전자 및 아미노산 서열.
도 4a는 아시네토박토 종 SY-01의 리파제 아미노산과 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) 리파제 아미노산 서열의 상동성 비교도.
도 4b는 아시네토박토 종 SY-01의 리프 아미노산과 아시네토박터 칼코아세티쿠스 리파제 B 아미노산 서열의 상동성 비교도.
도 5는 아시네토박토 종 SY-01로부터 얻은 리파제가 삽입된 재조합 플라스미드를 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)168로 발현한 단백질의 전기영동 사진.
도 6a는 pLIPSM(1) 벡터만 삽입된 바실러스 섭틸리스 168의 활성도 측정 사진.
도 6b는 아시네토 종 SY-01로부터 얻은 리파제가 삽입된 재조합 플라스미드로 형질전환된 바실러스 섭틸리스 168의 활성도 측정 사진.
도 7은 아시네토박토 종 SY-01의 리파제 코딩 유전자로부터 발현된 단백질의 여러 기질에 대한 활성도를 보여주는 그래프.
도 8a는 아시네토박토 종 SY-01의 리파제 코딩 유전자로부터 발현된 단백질에 의한 라세미체 혼합물인 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥솔란-4-메틸아세테이트의 전환율 및 에난티오머 과량(enantiomeric excess) 측정치를 보여주는 그래프.
도 8b는 바실러스 섭틸리스 168 세포 추출물에 의한 라세미체 혼합물인 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥솔란-4-메틸아세테이트 전환율 및 에난티오머 과량 측정치를 보여주는 그래프.
도 8c는 아시네토박토 종 SY-01의 리프가 동시에 발현되었을 때 SY-01 리파제 코딩 유전자로부터 발현된 단백질에 의한 라세미체 혼합물인 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥솔란-4-메틸아세테이트의 전환율 및 에난티오머 과량 측정치를 보여주는 그래프.
도 9는 아시네토박토 종 SY-01의 입체선택적 기질특이성을 갖는 리파제를 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 pSYLipSM(1)의 모식도.
도 10은 본 발명의 리프(Lif) 단백질 코딩 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 pSYLipSM(1)의 모식도.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하고자 심도있게 연구한 결과, 아시네토박토 종 SY-01이 생산하는 기질에 대한 입체선택적 특이성을 갖는 리파제 및 리프를 아시네토박토 종 SY-01으로부터 분리 및 정제하여 그 유전자 서열을 분석함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명은 아시네토박토 종 SY-01로부터 유래된 기질에 대한 입체선택적 특이성을 갖는 리파제를 코딩하는 유전자 및 이로부터 발현되는 아미노산 서열을 갖는 단백질에 관한 것이다.
보다 구체적으로는, 본 발명은 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 아시네토박토 종 SY-01 리파제를 코딩하는 유전자 및 이로부터 발현된 아미노산 서열을 갖는 아시네토박토 종 SY-01 리파제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 아시네토박토 종 SY-01 리프 단백질을 코딩하는 유전자 및 이로부터 발현된 아미노산 서열을 갖는 아시네토박토 종 SY-01 리프 단백질에 관한 것이다.
리파제 발현의 직접적인 조절작용을 수행하는 리프 (Lif) 단백질에 대한 연구는 슈도모나스 세파시아 (Pseudomonas cepacia), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 글루매 (Pseudomonas glumae), 아시네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus) 리파제를 중심으로 이루어져 왔다. 이들 종들의 리파제 단백질의 발현이 리프 단백질에 의해 조절되며, 그 유전자 (lif)가 리파제 유전자의 3'쪽에 위치하고 있으면서, 리파제의 발현에 직접적인 조절작용을 수행한다.
아일랜드 트리니티 대학의 홉슨 (Hobson)은 lif가 없는 경우에도 슈도모나스 세파시아 리파제 mRNA의 번역이 정상적으로 진행되지만, 활성이 없는 리파제가 합성되는 것을 밝혔다. [참조 : Hobson, A. H. et al. Proc. Natil. Acad. Sci. U. S. A. 90: 5682-5686, (1993)]. 또한 홉슨은 Lif 단백질이 리파제에 특이적으로 샤페론(chaperone)으로 작용하고 리파제와 Lif의 단백질이 복합체를 형성한다는 것을 리파제와 Lif의 항체를 이용한 면역학적 실험을 통해서 밝혔다.
지금까지 연구되어 온 Lif 단백질은 i) 리파제 단백질이 번역 과정이나 번역 직후에 작용하며, ii) 비공유결합적으로 작용하며, iii) 리파제의 구조적 폴딩에 관여하며, iv) 리파제 단백질의 화학적 변성 후 활성화시킬 수 있는 능력을 갖고 있다. 이상에서 언급한 사실들을 근거로 해서 네덜란드의 Slater 연구소의 헬링베르프 (Hellingwerf)는 아시네토박터 칼코아세쿠스 리파제의 2단계 분비과정의 모델을 제시한 바 있다.
본 발명자들은 아시네토박토 종 SY-01이 생산하는 기질에 대한 입체선택적 특이성을 갖는 리파제를 얻기 위해 우선 그 유전자를 찾고 클로닝하여 그 염기서열을 결정한 후 염기서열을 바탕으로 단백질을 발현시켜 기질 특이성 및 입체특이성을 갖는 효소인 리파제를 얻고자 하였다.
이를 위해 도 1에 도시된 바와 같은 유전자 클로닝 계통도를 설계하였다. 도 1을 참고로 하여 본 발명을 상세히 설명한다.
먼저, 아시네토박토 종 SY-01는 한국과학기술연구원 수질환경연구센터로부터 입수한 것이며, 상기 균주는 전국 각지의 토양, 폐수, 하천 슬러지 샘플로부터 상기 기질에 활성이 높고 입체선택성이 우수한 리파제 효소를 생산하는 균주를 분리하여 한국종균협회에 기탁한 것이다 (기탁번호: FCC-11111).
상기 균주는 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로페닐)-1,3-디옥솔란 -4-메틸 아세테이트로 명명된 라세미체 기질에 대한 높은 입체선택성을 나타내면서 라세미체 혼합물을 단일 이성질체로 분할할 수 있는 리파제 생산 균주이다.
본 발명자들은 상기 아시네토박토 종 SY-01로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 본 균주가 속하는 종의 특성상 서로간의 아미노산 서열 상동성이 매우 높은 것을 이용하여 이들간의 아미노산 서열 상동성을 분석한 후, 리파제만이 갖는 특유의 활성화 아미노산 서열 부분(활성 부위)과 아미노산의 C-말단의 상동성이 높은 부위의 아미노산 서열을 이용하여 프라이머를 제작하였으며, 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
SY-01 N' : 5'-TAYCCNATHATHCTNGTNCAY-3'
SY-01 C' : 5'-NARNGCNGCNARNGCRTCYTG-3'
이를 사용하여 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였고 이로부터 6개의 PCR 산물을 얻었으며, 이들 전부를 pGEM T easy 벡터에클로닝한 후, 사슬 종결 방법으로 유전자 서열을 결정한 후 유사성을 찾기 위해 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 프로그램을 사용하였다. 그 중 하나의 클론이 리파제와 아주 높은 유사성(유전자 서열 동일성 : 88%)을 보여, 이 클론을 사용해 중합효소 연쇄반응을 실시하여 리파제 전체 유전자를 얻기 위한 플라스미드 라이브러리(plasmid library)의 유전자 탐색 프로브(probe)로 사용하였다.
플라스미드 라이브러리를 제작하기에 앞서 다양한 제한효소를 사용하여 게놈 DNA를 절단하여 전반적인 유전자 지도를 제작하였으며 (도 2 참조), 이 유전자 지도를 바탕으로 플라스미드 라이브러리를 제작하여 콜로니 혼성화(colony hybridization)와 서던 블로팅(Southern blotting)을 이용하여 전체 리파제 유전자 및 리프 유전자를 찾아내었다.
아시네토박토 종 SY-01 리파제 단백질을 얻기 위해, 상기 리파제 유전자를 함유하는 클론을 2개의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 중합 효소 연쇄 반응시킨 후 아가로스 겔 상에서 분리하여 유전자 절편을 수득하고, 이 절편을 제한효소 BamHI과 SalI으로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pLIPSM(1)에 결합시켜 플라스미드 pSYLipSM(1)를 제조하였다..
상기 사용된 합성 올리고뉴클레오티드는 상기 사용한 제한효소의 절단 부위를 포함하며, 단백질 번역 개시 부위에 정확히 결합될 수 있도록 설계하고, 그 서열은 다음과 같다.
LP-N: 5'-AACTGTAACGTAAGCAGTTG-3'
LP-C: 5'-CTTTAGTTGGACCACCAACA-3'
상기 플라스미드 pSYLipSM(1)을 발현 숙주인 바실러스 섭틸리스 168에 형질전환시킨 후, 배지에 접종하여 진탕배양한 후 세포를 원심 분리한 다음 상등액을 분리하였다. 얻어진 상등액을 크로마토그래피 등으로 분리하여 전기영동시켜 단백질 밴드를 확인할 수 있다.
pSYLipSM(1)를 포함하는 바실러스 섭틸리스 168 균주(Bacillus subtilis 168/pSYLipSM(1))는 2002년 6월 5일자로 한국 생명공학 연구원 유전자 은행(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁되었으며, 기탁 기관에 의해 부여된 수탁 번호는 KCTC 10267BP이다.
본 발명의 아시네토박토 종 SY-01 리파제는 라세미체 혼합물인 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥솔란-4-메틸아세테이트 전환율 및 에난티오머 과량 측정을 통해 입체선택적 기질특이성을 갖고 높은 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌다.
또한, 본 발명에서 규명한 Lif 유전자의 서열은 아시네토박터 칼코세티쿠스 RAG-1의 Lif 유전자 서열과 매우 높은 뉴클레오티드 서열 상동성(80% 이상)을 가지고 있음을 밝혔으며, 이들이 지금까지 연구되어온 Lif 단백질의 역할과 매우 유사한 기능을 가졌음을 알 수 있다.
이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의해 더 구체적으로 설명하나, 본 발명이 이에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
<실시예 1> 리파제 유전자의 클로닝
게놈 DNA를 적당한 크기로 자르는 제한효소인EcoRI과HindIII로 게놈 DNA를 완전히 절단한 후, 같은 제한효소로 절단한 pBluescruipt II KS(+)에 삽입한 후, 상기 플라스미드로 에피쿠리안 콜라이(Epicurian Coli) XL2-블루 초수용성(supercompetent) 세포를 형질전환시켜 적어도 콜로니수가 20,000 내지 30,000개가 되도록 라이브러리를 제조하였다. 스크리닝 혼성화 과정은 이들 라이브러리의 콜로니들을 양성 전하를 갖도록 제조된 나일록 멤브레인에 옮긴 후 변성(denaturalization) 용액(0.5 M NaOH, 1.5M NaCl)에서 5분간 변성시키고, 중화 용액(0.5 M Tris-Cl(pH 7.4), 1.5 M NaCl)에서 5분간 중화시킨 후 멤브레인을 완전히 건조시켜 UV 가교결합시켰다. 이들 나일론 멤브레인을 방사능으로 표지된 프로브와 함께 65℃에서 Modifed Church 완충액 (0.25 M Na2HPO4, 1% 카사미노산, 7% SDS, 1 mM EDTA)에서 12시간 동안 혼성화시켰다. 프로브는 랜덤 프라이밍 (random priming) 방법을 통해32P-dCTP로 표지하였다. 혼성화를 마친 멤브레인은 세척 용액 I (2xSSC, 0.1% SDS)과 세척 용액 II (1xSSC, 0.1% SDS)로 세척하여 배경(background) 신호를 제거한 후 X-선 필름에 24시간 노출시켰다.
먼저 1차 스크리닝에서는 5개의 양성 신호를 얻은 후, 이 양성 신호를 나타내는 콜로니를 사용하여 2차 스크리닝을 실시한 결과, 20여 개의 강한 양성 신호를 보이는 클론을 얻었다. 양성 신호를 나타내는 클론 20개 중 6개를 선택하여 플라스미드를 분리하였다. 분리한 플라스미드를EcoRI과HindIII로 절단하여 나일론 멤브레인으로 옮긴 후 콜로니 라이브러리에서 사용한 프로브를 사용하여 서던 블로팅을실시한 결과 찾고자 하는 유전자가 있는 것을 다시 확인할 수 있었다. 이 중 1개의 클론을 디데옥시뉴클레오티드 사슬종결법을 이용하여 유전자의 염기서열을 결정하였다 (도 3 참조). 염기서열의 분석결과, 리파제 유전자의 3'쪽의 말단 서열에 바로 뒤이어 리프 유전자도 함께 존재함이 밝혀졌다. 도 3a는 리파제 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 나타내고, 여기서 이중선은 시그날 서열 영역을 의미하고, 점선은 활성 부위를 의미한다. 도 3b는 리프 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다.
이들 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열들을 기존에 밝혀진 아시네토박터 칼코아세티쿠스의 리파제 및 리프의 아미노산과 서열 상동성을 비교한 결과, 매우 가까운 상동성을 가지고 있음을 보였다(도 4 참조). 도 4a는 아시네토박토 종 SY-01의 리파제 아미노산과 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) 리파제 아미노산 서열의 상동성 비교도이고, 도 4b는 아시네토박토 종 SY-01의 리프 아미노산과 아시네토박터 칼코아세티쿠스 RAG-1의 리프 아미노산 서열의 상동성 비교도이다.
<실시예 2> 아시네토박토 종 SY-01의 리파제 코딩 유전자로부터 단백질의 과잉발현
아시네토박토 종 SY-01의 리파제로부터 단백질을 과잉발현하기 위하여 대전 바이오리더스(주)에서 입수한 pLIPSM(1) 벡터에 아시네토박토 종 SY-01의 리파제 전체 유전자를 삽입한 후, 이를 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결법을 이용하여 유전자의 염기서열을 확인하였다. 상기 재조합 플라스미드로 바실러스 섭틸리스 168을 형질전환시킨 후, 상기 리파제 유전자가 배지내로 분비됨을 확인하였다(도 5 참조). 도 5에서, M은 표준 분자량 마커, 레인 1은 pLIPSM(1) 벡터만 삽입된 음성 대조군의 펠렛, 레인 2는 pLIPSM(1) 벡터만 삽입된 음성 대조군의 상등액, 레인 3은 리파제 유전자를 포함하는 pLIPSM(1) 벡터로 형질전환된 바실러스 섭틸리스 168의 배지, 레인 4는 리파제 유전자를 포함하는 pLIPSM(1) 벡터로 형질전환된 바실러스 섭틸리스 168의 배양 펠렛, 레인 5는 리파제 유전자를 포함하는 pLIPSM(1) 벡터로 형질전환된 바실러스 섭틸리스 168의 배양 상등액을 나타낸다.
이들이 리파제 활성을 갖는지를 확인하기 위하여 로다민 (Rhodamin) B 안료 및 리파제 기질인 올리브유가 들어있는 로다민 B 플레이트에서 재조합된 플라스미드가 삽입된 바실러스 섭틸리스 168을 배양한 후, UV에서 형광을 이용하여 이들의 활성을 확인하였다(도 6참조). 도 6a는 pLIPSM(1) 벡터만 삽입된 바실러스 섭틸리스 168에 대해 시험한 결과를 나타내고, 도 6b는 리파제 유전자를 포함하는 pLIPSM(1) 벡터로 형질전환된 바실러스 섭틸리스 168의 활성 측정 결과이다.
<실시예 3> 아시네토박토 종 SY-01의 리파제 코딩 유전자로부터 발현된 단백질의 활성도 측정
아시네토박토 종 SY-01의 리파제 유전자로부터 발현된 리파제의 활성도는 다음과 같은 방법으로 측정하였다.
리파제의 활성도를 측정하기 위한 기질로는p-NP(니트로페닐)-아세테이트,p-NP-부티레이트,p-NP-카프로에이트,p-NP-카프릴레이트,p-NP-카프레이트,p-NP-라우레이트,p-NP-미리스테이트,p-NP-팔미테이트,p-NP-스테아레이트 등을 n-헥산에 녹여서 사용하였다. 96웰 마이크로플레이트에서, 200 ㎕의 반응용액 (10 mMCaCl2함유 20 mM Tris-HCl (pH 10),3 mM 기질)에 정제된 리파제 단백질 10 ㎍을 첨가한 후, 반응 혼합액을 50 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 진행된 후, 반응액과 동량의 아세톤을 첨가하여 반응을 정지시키고, 405 nm에서 방출된p-니트로페놀의 흡광도를 측정하였다. 이때 대조군으로서 단백질이 첨가되지 않은 반응물에 대해서도 동일한 시험을 수행하였다 (도 7 참조).
도 7에서 활성도 수치는 가장 좋은 활성도를 100으로 설정하고, 이에 대한 상대적인 백분율로 환산하여 나타낸 것이다. 도 7에 도시된 바와 같이, 본 발명의 아시네토박토 종 SY-01 리파제는 대조군에 비해 상이한 기질에 대하여 약 50% 이상의 우수한 활성을 보임을 알 수 있다.
<실시예 4> 아시네토박토 종 SY-01 리파제 코딩 유전자로부터 발현된 단백질의 이성질체 반응 측정
바실러스 섭틸리스 168로부터 SY-01의 리파제가 과잉 발현된 배양 세포의 상등액 1 ml (약 5 ㎎ 리파제/1 ℓ 세포 상등액)을 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8) 9 ml에 혼합한 후, n-헥산 중에 10 g/ℓ의 농도로 용해되어 있는 라세미체 혼합물인 시스-2-브로모메틸-2-(2,4-디클로로페닐)-13-디옥솔란-4-메틸 아세테이트 (cis-BDDM) 용액 200 ㎕를 첨가하였다. 반응은 50 ℃에서 250 rpm으로 2시간 이상 반응시키면서 시간별로 활성도를 측정하였으며, 반응이 끝난 후 n-헥산 200 ㎕를 첨가하여 SY-01 리파제 단백질에 의해 분해된 시스-BDDM의 전환율과 에난티오머 과량(ee)을 HPLC를 이용하여 측정하였다 (도 8 참조). HPLC 분석은 키랄 컬럼(Diacel Chiralcel OD, 용출액: 부피비 95:5의 n-헥산/이소프로판올; 유속 1.0 ml/min) 에 의해 이루어졌으며, 도 8에 표시된 기질의 전환율(반응물에서 생성물로의 전환율) 및 ee값 (생성된 생성물 중에서 원하는 생성물 형태로 전환된 반응비율)의 측정식은 다음과 같다.
A →C (1)
B →D (2)
여기서, A와 B는 라세미체 반응전 기질을 의미하며, C 와 D는 라세미체 반응물을 의미한다. 이때 전환율(c)은 ([C]+[D])/([A]+[B]+[C]+[D])이다. 또한 기질의 에난티오머 과량은 ([B]-[A])/([A]+[B])이며, B는 A에 비해 반응비율이 더 낮다. 생성물의 에난티오머 과량 (eep)는 ([C]-[D])/([C]+[D])이다.
도 8a는 Tris-HCl 완충액 (pH 8)에서 본 발명의 SY-01 리파제를 코딩하는 유전자가 삽입된 플라스미드로 형질전환된 바실러스 섭틸리스 168 배양 상등액과 기질을 9시간 동안 반응시킨 후 HPLC를 이용하여 측정한 에난티오머 선택도를 보여주는 그래프이고, 도 8b는 Tris-HCl 완충액 (pH 8)에서 본 발명의 SY-01 리파제 코딩 유전자로 형질전환되지 않은 바실러스 섭틸리스 168 세포 배양액을 기질과 반응시킨 후 HPLC를 이용하여 측정한 에난티오머 선택도를 보여주는 그래프이고, 도 8c는 상기한 바와 유사하게, 본 발명의 SY-01 리파제 코딩 유전자와 리프 유전자를 포함하는 도 10에 도시한 플라스미드로 형질전환된 바실러스 섭틸리스 168 배양 상등액과 기질을 9시간 동안 반응시킨 후 HPLC를 이용하여 측정한 아시네토박토 종 SY-01의 리프가 동시에 발현될 때 SY-01 리파제 코딩 유전자로부터 발현된 단백질에 의한 에난티오머 선택도를 보여주는 그래프이다.
상기 반응에 의해 측정한, SY-01 리파제 단독에 의한 기질의 전환율 및 ee값과 리프(Lif) 동시 발현시의 SY-01 리파제에 의한 기질의 전환율 및 ee값은 각각 하기 표 1 및 2에 나타낸 바와 같다.
반응시간 %ee 전환율(%)
바실러스 섭틸리스168 배양 상등액(음성 대조군) SY-01 리파제함유 배양 상등액 바실러스 섭틸리스168 배양 상등액(음성 대조군) SY-01 리파제함유 배양 상등액
5h 3.32 16.2 - 4.9
7h 3.91 19.49 - 33.12
9h 6.34 28.36 - 50.12
반응시간 %ee 전환율(%)
SY-01 리파제만발현된 배양 상등액 SY-01 리파제/Lif 동시 발현된배양 상등액 SY-01 리파제만 발현된 배양상등액 SY-01 리파제/Lif동시 발현된배양 상등액
7h 20.22 15 44.68 67
상기 표에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 리파제 코딩 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 바실러스 섭틸리스 168은 대조군에 비해 우수한 전환율과 ee값을 갖는 것으로 입증되었고, 이것은 본 발명의 리파제가 이트라코나졸의 중간체로서 라세미체 혼합물인 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로페닐)-1,3-디옥솔란-4-메틸 아세테이트를 입체 선택적으로 가수분해한다는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 리프 단백질이 본 발명의 리파제와 동시에 발현될 경우 리파제만 발현된 경우보다 우수한 전환율을 보인다는 것이 입증되었다.
본 발명의 아시네토박토 종 SY-01 리파제는 활성이 우수하기 때문에 상기 리파제 코딩 유전자를 포함하는 형질전환된 미생물을 생체 촉매로서 이용하여 광학적으로 순수한 이트라코나졸 합성에 이용할 수 있다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Gene Coding for Lipase of Acinetobacter Species SY-01 and Protein Expressed Therefrom <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1612 <212> DNA <213> Acinetobacter sp. <220> <221> CDS <222> (596)..(1609) <400> 1 gtattcgaca atgattatgt gtgatgctcg agtgcatttt agatatgcgc agttaactat 60 aaccatgaga ctatctgagt gcgtgctgca tagaatccaa tgccatcttc ttttgttaat 120 tcgattgtaa cgtgtaatta cctttttaaa agaacttaag ctgattttat agcttagatc 180 ttgtaattga tcagtctcat aacacctgtt ccccaaaata attcttgggc gctaatgttc 240 cattgagaaa cgacttcgct taatacatga acataagagc tactaataaa atgctgttgg 300 tggcggggaa tactcatagt tttaagcaaa ttccatttta aaactgatca aattaaatca 360 aaaagtaatc tagctgttgt gatttgaaaa attacattca tcggaatttt acgaatcaag 420 caaaattttg gcatgtattg ttatgatttt ggcacgcttt gttttagtct aaaatttata 480 caatctagca agggagtata attctgaagt tcttttgtat gcttggaatg aatccgcata 540 caaagtttaa ggactcaatc gttgtaataa aaatgaaaaa tgctaggagc aaaat 595 gtg aag aaa aaa tat tta aat gct atg gtg tta atg acg ggt atg cta 643 Val Lys Lys Lys Tyr Leu Asn Ala Met Val Leu Met Thr Gly Met Leu 1 5 10 15 gca agc agt gga tct gtt gta cat gca ggt ttg ttt gat ttt tta gca 691 Ala Ser Ser Gly Ser Val Val His Ala Gly Leu Phe Asp Phe Leu Ala 20 25 30 cca aaa gca tta tgg caa aac tgt aac gta agc agt tgt acg gtt ggt 739 Pro Lys Ala Leu Trp Gln Asn Cys Asn Val Ser Ser Cys Thr Val Gly 35 40 45 gga agt act aac gtt aca tct agt tat gct aaa acc aag tat cca att 787 Gly Ser Thr Asn Val Thr Ser Ser Tyr Ala Lys Thr Lys Tyr Pro Ile 50 55 60 tta cta gct cac gga atg gca ggt ttt tct gct gta ggc cca ttg caa 835 Leu Leu Ala His Gly Met Ala Gly Phe Ser Ala Val Gly Pro Leu Gln 65 70 75 80 tat tgg aat gga att aca gag gac ctc gtt ggt aat gga gcc aat gta 883 Tyr Trp Asn Gly Ile Thr Glu Asp Leu Val Gly Asn Gly Ala Asn Val 85 90 95 ttt gtc gca caa caa gct tct ttt aat tca tca gaa gta cgt ggt gaa 931 Phe Val Ala Gln Gln Ala Ser Phe Asn Ser Ser Glu Val Arg Gly Glu 100 105 110 caa tta tta ctt caa acc aaa cag gtg ctt gcg att aca ggc gct caa 979 Gln Leu Leu Leu Gln Thr Lys Gln Val Leu Ala Ile Thr Gly Ala Gln 115 120 125 aaa gta aat tta atc ggc cat agt cat ggt tca caa tca gtt cgt tat 1027 Lys Val Asn Leu Ile Gly His Ser His Gly Ser Gln Ser Val Arg Tyr 130 135 140 gtt gca agt tta ttg cca gat aaa gtg gca tca gtg acg gct gtt ggt 1075 Val Ala Ser Leu Leu Pro Asp Lys Val Ala Ser Val Thr Ala Val Gly 145 150 155 160 ggt cca act aaa ggt tca gaa gtt gca gat gtc gta gat tca gtt gtt 1123 Gly Pro Thr Lys Gly Ser Glu Val Ala Asp Val Val Asp Ser Val Val 165 170 175 aaa tca cct gtt ggt cct gca ctt gca cct att atc gcg gcg gga gta 1171 Lys Ser Pro Val Gly Pro Ala Leu Ala Pro Ile Ile Ala Ala Gly Val 180 185 190 aat gcc ttt ttc tca tta gta gga att ggt tct ggt cat tat tat gat 1219 Asn Ala Phe Phe Ser Leu Val Gly Ile Gly Ser Gly His Tyr Tyr Asp 195 200 205 cag gat gca ctc gcg ggg tta aac tca tta acg aca cgt ggt tct gct 1267 Gln Asp Ala Leu Ala Gly Leu Asn Ser Leu Thr Thr Arg Gly Ser Ala 210 215 220 aac ttt aat caa cgt ttt cca gca gct gtt cca aca acg gct tgt ggc 1315 Asn Phe Asn Gln Arg Phe Pro Ala Ala Val Pro Thr Thr Ala Cys Gly 225 230 235 240 tca ggt aca gag ttg gtt aat ggt gtc cgt tat tac tca tgg agt gga 1363 Ser Gly Thr Glu Leu Val Asn Gly Val Arg Tyr Tyr Ser Trp Ser Gly 245 250 255 acg agc cca ttt acc aat gcg ctt gat cca ttg gat tat gca tta aca 1411 Thr Ser Pro Phe Thr Asn Ala Leu Asp Pro Leu Asp Tyr Ala Leu Thr 260 265 270 gcg aca tct tta tta att cct agt gaa aat gat ggt tta gtt cca cgc 1459 Ala Thr Ser Leu Leu Ile Pro Ser Glu Asn Asp Gly Leu Val Pro Arg 275 280 285 tgt tcg agt cat ctt ggt aca gtt att cgt gat aat tat gcg ttt aat 1507 Cys Ser Ser His Leu Gly Thr Val Ile Arg Asp Asn Tyr Ala Phe Asn 290 295 300 cac ttg gat gaa gtc aat caa ata tta ggc ttg gtt ggc ttc tta caa 1555 His Leu Asp Glu Val Asn Gln Ile Leu Gly Leu Val Gly Phe Leu Gln 305 310 315 320 aac cct gtt acg cct tat cgt act caa gca aat cgt ttg aaa aat cag 1603 Asn Pro Val Thr Pro Tyr Arg Thr Gln Ala Asn Arg Leu Lys Asn Gln 325 330 335 gga ctt taa 1612 Gly Leu <210> 2 <211> 338 <212> PRT <213> Acinetobacter sp. <400> 2 Val Lys Lys Lys Tyr Leu Asn Ala Met Val Leu Met Thr Gly Met Leu 1 5 10 15 Ala Ser Ser Gly Ser Val Val His Ala Gly Leu Phe Asp Phe Leu Ala 20 25 30 Pro Lys Ala Leu Trp Gln Asn Cys Asn Val Ser Ser Cys Thr Val Gly 35 40 45 Gly Ser Thr Asn Val Thr Ser Ser Tyr Ala Lys Thr Lys Tyr Pro Ile 50 55 60 Leu Leu Ala His Gly Met Ala Gly Phe Ser Ala Val Gly Pro Leu Gln 65 70 75 80 Tyr Trp Asn Gly Ile Thr Glu Asp Leu Val Gly Asn Gly Ala Asn Val 85 90 95 Phe Val Ala Gln Gln Ala Ser Phe Asn Ser Ser Glu Val Arg Gly Glu 100 105 110 Gln Leu Leu Leu Gln Thr Lys Gln Val Leu Ala Ile Thr Gly Ala Gln 115 120 125 Lys Val Asn Leu Ile Gly His Ser His Gly Ser Gln Ser Val Arg Tyr 130 135 140 Val Ala Ser Leu Leu Pro Asp Lys Val Ala Ser Val Thr Ala Val Gly 145 150 155 160 Gly Pro Thr Lys Gly Ser Glu Val Ala Asp Val Val Asp Ser Val Val 165 170 175 Lys Ser Pro Val Gly Pro Ala Leu Ala Pro Ile Ile Ala Ala Gly Val 180 185 190 Asn Ala Phe Phe Ser Leu Val Gly Ile Gly Ser Gly His Tyr Tyr Asp 195 200 205 Gln Asp Ala Leu Ala Gly Leu Asn Ser Leu Thr Thr Arg Gly Ser Ala 210 215 220 Asn Phe Asn Gln Arg Phe Pro Ala Ala Val Pro Thr Thr Ala Cys Gly 225 230 235 240 Ser Gly Thr Glu Leu Val Asn Gly Val Arg Tyr Tyr Ser Trp Ser Gly 245 250 255 Thr Ser Pro Phe Thr Asn Ala Leu Asp Pro Leu Asp Tyr Ala Leu Thr 260 265 270 Ala Thr Ser Leu Leu Ile Pro Ser Glu Asn Asp Gly Leu Val Pro Arg 275 280 285 Cys Ser Ser His Leu Gly Thr Val Ile Arg Asp Asn Tyr Ala Phe Asn 290 295 300 His Leu Asp Glu Val Asn Gln Ile Leu Gly Leu Val Gly Phe Leu Gln 305 310 315 320 Asn Pro Val Thr Pro Tyr Arg Thr Gln Ala Asn Arg Leu Lys Asn Gln 325 330 335 Gly Leu <210> 3 <211> 1121 <212> DNA <213> Acinetobacter sp. <220> <221> CDS <222> (81)..(1118) <400> 3 tctaaacatt aagggagtag agagctactc ccttaaccaa caaaagattt aaaacggaat 60 aataaataga gcaagggact atg aaa att aaa ctt ttg aat aat cga atc atc 113 Met Lys Ile Lys Leu Leu Asn Asn Arg Ile Ile 1 5 10 ttc tta ggt ttg atg gtg tgc tta ctg ctc tca ttg gtc ttg atc tat 161 Phe Leu Gly Leu Met Val Cys Leu Leu Leu Ser Leu Val Leu Ile Tyr 15 20 25 ttt ata ttt aaa cca gaa gcg caa aaa cat gag aat gac ctc aat caa 209 Phe Ile Phe Lys Pro Glu Ala Gln Lys His Glu Asn Asp Leu Asn Gln 30 35 40 caa aac caa tta tca tcc gag aat aat aat att caa aaa atc gac gat 257 Gln Asn Gln Leu Ser Ser Glu Asn Asn Asn Ile Gln Lys Ile Asp Asp 45 50 55 aca aat cat aaa gga aaa ata cca aat ctt gcg ccg tct tta cag ggc 305 Thr Asn His Lys Gly Lys Ile Pro Asn Leu Ala Pro Ser Leu Gln Gly 60 65 70 75 aca gaa ata gat tgt cca att caa gtg gat gca aat gga aaa tta atc 353 Thr Glu Ile Asp Cys Pro Ile Gln Val Asp Ala Asn Gly Lys Leu Ile 80 85 90 tta acc gta ggt att cgc agt tgt ttt gac tat ttc ttt tct agt cta 401 Leu Thr Val Gly Ile Arg Ser Cys Phe Asp Tyr Phe Phe Ser Ser Leu 95 100 105 ggt gaa aaa act gaa acg gaa ctt atc tcg gat att cga caa tat ctt 449 Gly Glu Lys Thr Glu Thr Glu Leu Ile Ser Asp Ile Arg Gln Tyr Leu 110 115 120 aaa gca act tta cct gac agt gct tca agt tat gcg agt tat ttg cta 497 Lys Ala Thr Leu Pro Asp Ser Ala Ser Ser Tyr Ala Ser Tyr Leu Leu 125 130 135 gat cag tat gtt gca tat att cat gca tta aaa aat cta aaa tct aca 545 Asp Gln Tyr Val Ala Tyr Ile His Ala Leu Lys Asn Leu Lys Ser Thr 140 145 150 155 agt agc ttt aca aca gga gac gct gaa ggt ttt caa aaa gta ctt gat 593 Ser Ser Phe Thr Thr Gly Asp Ala Glu Gly Phe Gln Lys Val Leu Asp 160 165 170 caa atg tac aaa gtt cag cag caa ttt ttc aat tca gca gaa att aat 641 Gln Met Tyr Lys Val Gln Gln Gln Phe Phe Asn Ser Ala Glu Ile Asn 175 180 185 gcg tta ttc gga aat gaa cgt aac ttg aat caa ttt aat att gat caa 689 Ala Leu Phe Gly Asn Glu Arg Asn Leu Asn Gln Phe Asn Ile Asp Gln 190 195 200 atg cgt att cat gcg aat aag agt ttg aat gct caa cag aaa gcc acc 737 Met Arg Ile His Ala Asn Lys Ser Leu Asn Ala Gln Gln Lys Ala Thr 205 210 215 gag ttg gca aac ttg att gac caa tta cca tcg act ttg gct gat ggt 785 Glu Leu Ala Asn Leu Ile Asp Gln Leu Pro Ser Thr Leu Ala Asp Gly 220 225 230 235 gtt cga gtg 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1121 <210> 4 <211> 346 <212> PRT <213> Acinetobacter sp. <400> 4 Met Lys Ile Lys Leu Leu Asn Asn Arg Ile Ile Phe Leu Gly Leu Met 1 5 10 15 Val Cys Leu Leu Leu Ser Leu Val Leu Ile Tyr Phe Ile Phe Lys Pro 20 25 30 Glu Ala Gln Lys His Glu Asn Asp Leu Asn Gln Gln Asn Gln Leu Ser 35 40 45 Ser Glu Asn Asn Asn Ile Gln Lys Ile Asp Asp Thr Asn His Lys Gly 50 55 60 Lys Ile Pro Asn Leu Ala Pro Ser Leu Gln Gly Thr Glu Ile Asp Cys 65 70 75 80 Pro Ile Gln Val Asp Ala Asn Gly Lys Leu Ile Leu Thr Val Gly Ile 85 90 95 Arg Ser Cys Phe Asp Tyr Phe Phe Ser Ser Leu Gly Glu Lys Thr Glu 100 105 110 Thr Glu Leu Ile Ser Asp Ile Arg Gln Tyr Leu Lys Ala Thr Leu Pro 115 120 125 Asp Ser Ala Ser Ser Tyr Ala Ser Tyr Leu Leu Asp Gln Tyr Val Ala 130 135 140 Tyr Ile His Ala Leu Lys Asn Leu Lys Ser Thr Ser Ser Phe Thr Thr 145 150 155 160 Gly Asp Ala Glu Gly Phe Gln Lys Val Leu Asp Gln Met Tyr Lys Val 165 170 175 Gln Gln Gln Phe Phe Asn Ser Ala Glu Ile Asn Ala Leu Phe Gly Asn 180 185 190 Glu Arg Asn Leu Asn Gln Phe Asn Ile Asp Gln Met Arg Ile His Ala 195 200 205 Asn Lys Ser Leu Asn Ala Gln Gln Lys Ala Thr Glu Leu Ala Asn Leu 210 215 220 Ile Asp Gln Leu Pro Ser Thr Leu Ala Asp Gly Val Arg Val Phe Met 225 230 235 240 Gln Phe Ala Glu Leu Pro Gln Leu Thr Lys Glu Ile Gln Glu Lys Gly 245 250 255 Gly Ser Ala Gln Glu Ile Arg Asn Met Arg Glu Ser Leu Leu Gly Ala 260 265 270 Glu Ala Ala Asp Arg Leu Glu Lys Val Asp Gln Glu Glu Ala Arg Trp 275 280 285 Gln Lys Gln Val Asn Ser Tyr Leu Ser Glu Arg Glu Gln Ile Leu Lys 290 295 300 Ser Asn Val Ser Asp Ser Asn Lys Gln Gln Ser Ile Glu Gln Leu Arg 305 310 315 320 Asn Ser Thr Phe Ala Thr Lys Glu Asn Leu Leu Arg Ala Gln Ser Tyr 325 330 335 Glu Ile Met Asn Asp Gln Lys Lys Leu Asn 340 345 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic probe <400> 5 aactgtaacg taagcagttg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic probe <400> 6 ctttagttgg accaccaaca 20

Claims (10)

  1. 서열 2에 기재된 아시네토박토종 SY-01 리파제 아미노산 서열을 코딩하는 유전자.
  2. 서열 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 아시네토박토종 SY-01 리파제.
  3. 제1항 기재의 아시네토박토종 SY-01 리파제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  4. 삭제
  5. 제3항 기재의 재조합 벡터로 형질전환된 바실러스 섭틸리스.
  6. 제5항에 있어서, 수탁 번호 KCTC 10267BP의 바실러스 섭틸리스 168/pSYLipSM(1)인 바실러스 섭틸리스.
  7. 제5항 기재의 바실러스 섭틸리스를 배양하는 단계 및
    배양된 세포에서 발현된 아시네토박토 종 SY-01 리파제를 회수하여 정제하는 단계
    를 포함하는, 아시네토박토 종 SY-01 리파제의 제조 방법.
  8. 서열 5 또는 서열 6의 염기 서열로 이루어진 합성 프로브.
  9. 서열 4에 기재된 아시네토박토종 SY-01 리프 단백질 아미노산 서열을 코딩하는 유전자.
  10. 서열 4에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 아시네토박토종 SY-01 리프 단백질.
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KR100658193B1 (ko) * 2005-03-25 2006-12-15 한국해양연구원 신규 저온성 리파제, 이를 암호화하는 유전자 및형질전환된 대장균과 이를 이용한 리파제 대량 생산방법 및생산된 리파제의 응용

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