ES2260234T3 - Utilizacion de inhibidores del factor de crecimiento placentario para el tratamiento de la angiogenesis patologica, de la arteriogenesis patologica, de la inflamacion, de la formacion tumoral y/o de la perdida vascular. - Google Patents
Utilizacion de inhibidores del factor de crecimiento placentario para el tratamiento de la angiogenesis patologica, de la arteriogenesis patologica, de la inflamacion, de la formacion tumoral y/o de la perdida vascular.Info
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Abstract
Utilización de un inhibidor de la angiogénesis que consiste en un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente al factor de crecimiento placentario destinado a la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, de enfermedades oculares, de la hipertensión pulmonar, de las inflamaciones y los edemas.
Description
Utilización de inhibidores del factor de
crecimiento placentario para el tratamiento de la angiogénesis
patológica, de la arteriogénesis patológica, de la inflamación, de
la formación tumoral y/o de la pérdida vascular.
La presente invención se refiere al campo de la
angiogénesis y la arteriogénesis patológicas. En particular, la
invención describe el fenotipo causado por tensión en un ratón
transgénico (PlGF^{-/-}) que no produce el factor de crecimiento
placentario (PlGF) y que demuestra una respuesta deficiente que
depende del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). Se
ha descubierto que una deficiencia en el PlGF produce una influencia
negativa en distintos procesos patológicos de la angiogénesis, la
arteriogénesis y las pérdidas vasculares que comprenden las
retinopatía isquémica, la formación de tumores, la hipertensión
pulmonar, las pérdidas vasculares (formación de edemas) y las
alteraciones inflamatorias. De este modo la invención se refiere a
moléculas que pueden inhibir la unión del PlGF a su receptor
(VEGFR-1), tales como los anticuerpos monoclonales.
La invención se refiere además a la utilización de dichas moléculas
en el tratamiento de los anteriores procesos patológicos.
La formación anormal de vasos sanguíneos
contribuye a la patogenia de numerosas enfermedades con un nivel
elevado de morbilidad y mortalidad. La aclaración de los mecanismos
subyacentes en el crecimiento muscular puede permitir el desarrollo
de estrategias terapéuticas para estimular el crecimiento vascular
en tejidos isquémicos o para suprimir su formación en los tumores.
Los estudios recientes de reconocimiento génico en embriones han
identificado algunos de los mecanismos implicados en la formación
inicial de los canales endoteliales (angiogénesis) y su posterior
maduración mediante su cobertura con células musculares lisas
(arteriogénesis). Se presentan pruebas de que distintos mecanismos
moleculares pueden intervenir en el crecimiento de vasos sanguíneos
en procesos patológicos, pero los procesos moleculares permanecen en
gran medida sin determinar. Se ha implicado el factor de crecimiento
del endotelio vascular (VEGF) en el desarrollo y crecimiento
patológico del sistema vascular (Ferrara N. et al., Curr
Top Microbiol Immunol 237 1-30). Las
deficiencias en un solo alelo del VEGF provocan anomalías vasculares
fatales (Carmellet P. et al., 1996, Nature 380,
435-439 y Ferrara N. et al., 1996,
Nature 380, 439-442) mientras que la
supresión del VEGF en los recién nacidos o la expresión de una sola
isoforma de VEGF^{120} produce un crecimiento vascular deficiente
(Gerber H. P. et al., Development 126,
1149-1159 y Carmellet P. et al., 1999, Nat
Med 5, 495-502). En los adultos, el VEGF afecta
el crecimiento vascular durante la reproducción, la curación de
heridas y en los trastornos malignos e inflamatorios (Ferrara N.
et al., 1999, Cur Top Microbiol Immunol 237,
1-30). El VEGF se está analizando actualmente con
respecto a la angiogénesis terapéutica en el corazón y extremidades
isquémicas, pero las pruebas químicas iniciales han producido tanto
resultados prometedores como decepcionantes (Isner J. M. et
al., 1999 J Clin Invest 103, 1231-1236).
Una cuestión destacada consiste en si el VEGF puede estimular la
maduración de los vasos con un revestimiento de musculatura lisa
(arteriogénesis). Los canales vasculares desnudos permanecen
vulnerables a lesiones traumáticas, remisiones durante los cambios
de oxígeno y falta de control vasomotor para adaptarse a los cambios
en la venoclisis tisular (Benjamín L. El et al., 1998,
Development 125, 1591-1598). En algunos
trastornos tales como la hipertensión pulmonar la arteriogénesis
excesiva es un fenómeno adverso y difícilmente controlable. En la
hipertensión pulmonar se produce una reestructuración del sistema
vascular pulmonar debido a la proliferación de las células
musculares lisas y a su migración distal alrededor de las arteriolas
terminales, aumentando de este modo la resistencia vascular
pulmonar. Otro aspecto de la VEGF consiste en que dicha molécula
afecta a la permeabilidad y al crecimiento de los vasos adultos
latentes. En el suero humano normal no se encuentran niveles
detectables de VEGF pero en condiciones patológicas tales como en el
cáncer o en trastornos inflamatorios, el VEGF se ve altamente
sobrerregulado e interviene en la formación de edemas adversos. La
formación de edemas también constituye un problema clínico
importante asociado a diversos tumores conducen a ascitis en tumores
peritoneales, pleuritis en el cáncer de pulmón y a los edemas
cerebrales en tumores cerebrales (conduciendo posiblemente a una
hipertensión intracraneal fatal) y con frecuencia facilitan la
metástasis de los tumores. La congestión vascular y los edemas
constituyen unos mecanismos patógenos importantes en el asma, en la
expansión de los infartos cerebrales tras un ataque, en la
esclerosis peritoneal posterior a la diálisis o a intervenciones
abdominales, etc... Se han identificado otros homólogos del VEGF,
pero su función en la angiogénesis y la arteriogénesis continúa sin
aclararse.
Un homólogo interesante del VEGF es el factor de
crecimiento placentario (PlGF) pero su papel en el crecimiento y la
patogenia vascular ha sido poco estudiada (Pérsico M. G. et
al., 1999 Curr Top Microbiol Inmunol 237,
31-40). La patente US nº 5.919.899 describe el PlFG
y su utilización en el tratamiento de trastornos inflamatorios,
heridas y úlceras. Donnini et al., (J. Pathol. 189,
66, 1999) han observado una correlación entre la sobrerregulación
del PlGF y los meningiomas humanos pero resulta claro que no
constituye una indicación de si el PlGF desempeña una función en la
formación de los tumores. La función del PlGF en los edemas fue
estudiada por Monsky et al., (Cáncer Res, 59, 4129,
1999), pero no se encontró ninguna función in vivo del PlGF
en la formación de edemas durante los procesos patológicos de
diversos tumores en ratones y en humanos.
Los inhibidores del PlGF no resultan conocidos
en la especialidad con la excepción del anticuerpo policlonal de
cabra contra el PlGF humano (R&D pharmaceuticals, Abingdon, RU)
y el anticuerpo policlonal de pollo (Gassmann et al., 1990,
Faseb J. 4, 2528). Dichos anticuerpos se utilizan en los
estudios de inmunotransferencia de tipo Western, de histoquímica y
de inmunoprecipitación. Ziche et al.(1997, Lab Invest
76(4): 517-531) describen la utilización de
un anticuerpo inhibidor anti-PlGF para bloquear la
angiogénesis provocada por el PlGF en análisis in vivo. La
función del receptor del PlGF (= VEGFR-1) en la
biología de las células endoteliales también ha permanecido como un
enigma (Sawano A. et al., 1996 Cell Growth Differ 7,
213-221 y Clauss M et al., 1996 J Biol
Chem 271, 17629-17634). Los estudios de
reconocimiento genético proporcionaron resultados contradictorios
sobre la función del VEGFR-1 bien como posible
receptor de la señal (lo que se sugiere por las anomalías vasculares
en los embriones deficientes en VEGFR-1 (Fong G. H.
et al., 1999, Development 126,
3015-3025), bien como zona de unión inerte - un
"sumidero" - para el VEGF, regulando la disponibilidad del VEGF
para el VEGFR-2 angiógeno (lo que se sugiere por el
desarrollo vascular normal en ratones que expresan un
VEGFR-1 truncado, careciendo del dominio de la
tirosina cinasa (Hiratsuka S. et al., 1998 Proc Natl Acad
Sci USA 95, 9349-9354)).
La presente invención se refiere al
descubrimiento sorprendente de que el PlGF es un modulador
específico del VEGF durante diversos procesos patológicos, tales
como la retinopatía isquémica, la oncogenia, las alteraciones
inflamatorias, la curación de heridas, los edemas y la hipertensión
pulmonar. El descubrimiento tiene implicaciones en la inhibición de
las pérdidas vasculares (formación de edemas), las alteraciones
inflamatorias, la oncogenia, la angiogénesis patológica y en la
prevención de la hipertensión pulmonar que tiene lugar durante la
arteriogénesis patológica.
La presente invención pretende proporcionar
herramientas de investigación y tratamientos para pacientes que
padezcan angiogénesis patológica, arteriogénesis patológica y
formación de edemas. En particular, la invención pretende
proporcionar moléculas, tales como anticuerpos, que puedan bloquear
la actividad del PlGF. La invención pretende además utilizar dichas
moléculas en el tratamiento o la prevención, sin limitarse a ello,
de la hipertensión pulmonar, el cáncer, los edemas, la retinopatía
isquémica y las alteraciones inflamatorias. Dicho de otro modo, la
presente invención pretende proporcionar el tratamiento o un
medicamento que pueda utilizarse para tratar la hipertensión
pulmonar, la oncogenia, los edemas, la retinopatía isquémica o las
alteraciones inflamatorias.
Más particularmente, la invención se refiere a
la utilización de un inhibidor de la angiogénesis que consiste en un
anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente al
factor de crecimiento placentario en la preparación de un
medicamento para el tratamiento del cáncer, las enfermedades
oculares, la hipertensión pulmonar, las inflamaciones y los edemas.
La invención resulta de particular interés en el tratamiento de una
enfermedad ocular que consiste en una retinopatía o una alteración
intraocular coroidea, o en una retinopatía isquémica. Más
particularmente, la invención proporciona para su utilización
terapéutica un inhibidor del PlGF que consiste en un anticuerpo
monoclonal o en un fragmento del mismo, tal como, un anticuerpo
monoclonal murino, que puede convertirse en un anticuerpo
humanizado, según una forma de realización particular. Las formas de
realización particulares de la invención se refieren a la
utilización terapéutica de un fragmento de un anticuerpo inhibidor
del PlGF, tal como un fragmento Fab,
F(ab)'2 o scFv.
F(ab)'2 o scFv.
Figura 1: Función del PlGF en el crecimiento
vascular patológico.
a, PlGF - producido constitutivamente por las
células endoteliales (EC) latentes adultas - no resulta esencial en
el mantenimiento del sistema vascular latente adulto,
presumiblemente debido a que resulta ineficaz en presencia de una
expresión mínima del VEGF. Con la expresión del VEGF se sobrerregula
durante la isquemia, las inflamaciones (macrófagos: MO) o las
neoplasias malignas (células tumorales), el PlGF amplifica la
respuesta de las células endoteliales y musculares lisas (SMC) al
VEGF, provocando una intensificación en la angiogénesis, la
permeabilidad vascular y la arteriogénesis. El PlGF puede actuar de
modo autocrino en las células endoteliales, musculares lisas e
inflamatorias, pero se produce también por las células tumorales
circundantes, los cardiomiocitos isquémicos, etc. b, en ausencia de
PlGF, los vasos se forman con normalidad durante el desarrollo, pero
con una respuesta menor al VEGF en las alteraciones patológicas.
En estudios previos, el gen del PlGF se inactivo
en el genoma mediante la recombinación homóloga en embriocitos
indiferenciados (ES) (Carmeliet P. 2000, J. Pathol. 190,
387-405, Carmeliet P. 1999, Curr. Interv.
Cardiol. Reports 1, 332-335 y Carmeliet P. y
Collen D., 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 237,
133-158) Los ratones deficientes en PIGF
(PlGF^{-/-}) son viables y fértiles, y no presentan deficiencias
vasculares espontáneas. En la presente invención se demuestra que el
crecimiento de los canales endoteliales (angiogénesis), la
maduración vascular por parte de las células musculares lisas
(arteriogénesis) y la permeabilidad muscular se ven alterados
significativamente en los ratones PlGF^{-/-} adultos en diversos
trastornos en los que se produce angiogénesis y la formación de
edemas. Dichos trastornos comprenden la retinopatía isquemia, la
formación de tumores, la hipertensión pulmonar, los edemas y las
inflamaciones también conocidos por implicar el VEGF. En otro
aspecto de la invención, se demuestra que la función del PlGF no se
restringe únicamente a la formación de capilares inmaduros, sino que
también comprende la maduración y la estabilización de los vasos
recién formados mediante la estimulación de su recubrimiento con
células musculares lisas (arteriogénesis), una condición previa
terapéutica para la angiogénesis funcional y viable, pero un efecto
adverso en la arteriogénesis patológica como en el caso de la
hipertensión pulmonar.
De este modo, una forma de realización de la
presente invención se refiere a moléculas que comprenden una región
que puede unirse específicamente al factor de crecimiento
placentario y dichas moléculas pueden suprimir o prevenir la
angiogénesis, las pérdidas vasculares (edemas), la hipertensión
pulmonar, la formación de tumores y/o las alteraciones inflamatorias
provocadas por el factor de crecimiento placentario. Por
"supresión" se entiende que puede producirse la supresión como
mínimo en el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e incluso el
100%. La invención se refiere a los antagonistas del PlGF tales como
los anticuerpos anti-PlGF y a los fragmentos
funcionales derivados de los mismos, todos ellos capaces de
interferir o inhibir la transducción de la señal del
VEGFR-1 por el PlGF. Por PlGF también se entiende
sus isoformas, que pueden formarse como resultado de una eliminación
de intrones alternativa, habiéndose descrito tres ARN del PlGF
monoméricos humanos, los precursores de las isoformas
PlGF-1, PlGF-2 y
PlGF-3, que contienen 149, 179 y 219 aminoácidos
respectivamente. En los tejidos normales de ratones, únicamente se
ha identificado un ARN mensajero que codifica el PlGF de ratón
equivalente al PlGF-2 humano.
En una forma de realización específica de la
invención se proporciona un anticuerpo monoclonal murino contra el
PlGF. En otra forma de realización específica el anticuerpo
monoclonal murino es el Mab-PL5D11. Dicho anticuerpo
monoclonal se encuentra disponible en el Departamento de Tecnología
Transgénica y Genoterapia, UZ Gasthulsberg, Herestraat 49,
B-3000 Leuven.
El término "anticuerpo" o
"anticuerpos" se refiere a un anticuerpo caracterizado por
dirigirse específicamente contra el PlGF o cualquier derivado
funcional del mismo, tratándose dichos anticuerpos preferentemente
de anticuerpos monoclonales; o un fragmento de unión con un antígeno
de los mismos, o el F(ab')_{2}, F(ab) o el tipo Fv
de cadena simple, o cualquier tipo de anticuerpo recombinante
derivado de los mismos. Dichos anticuerpos de la invención,
comprendiendo los anticuerpos policlonales específicos preparados
contra el PlGF o cualquier derivado funcional de los mismos, no
presentan reactividad cruzada con otras proteínas. Los anticuerpos
monoclonales de la invención pueden por ejemplo producirse mediante
cualquier hibridoma apto para formarse según los procedimientos
clásicos a partir de esplenocitos de un animal, particularmente de
un ratón o rata inmunizada contra el PlGF o cualquier derivado
funcional de los mismos, y de las células de una estirpe celular de
mieloma, seleccionarse con respecto a la capacidad del hibridoma
para producir anticuerpos monoclonales que reconozcan el PlGF o
cualquier derivado funcional del mismo que se haya utilizado
inicialmente en la inmunización de los animales. Los anticuerpos
monoclonales según dicha forma de realización de la invención pueden
consistir en versiones humanizadas de los anticuerpos monoclonales
de ratón creados mediante la tecnología de ADN recombinante,
apartándose de las secuencias del ADN genómico humano y/o de ratón
que codifican las cadenas pesada y ligera o de los clones de ADNc
que codifican las cadenas pesada y ligera. Alternativamente los
anticuerpos monoclonales según la presente forma de realización de
la invención pueden consistir en anticuerpos monoclonales humanos.
Dichos anticuerpos monoclonales humanos se preparan, por ejemplo,
mediante la repoblación con linfocitos de sangre periférica (PBL)
humanos de ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) tal
como se describe en el documento WO9960846 (PCT/EP99/03605) o
utilizando animales no humanos transgénicos capaces de producir
anticuerpos humanos tal como se describe en la patente US nº
5.545.806. También los fragmentos obtenidos a partir de dichos
anticuerpos monoclonales tales como Fab, F(ab)'_{2} y ssFv
("fragmento variable de cadena simple"), siempre que conserven
las propiedades de enlace originales, forman parte de la presente
invención. Dichos fragmentos se generan habitualmente, por ejemplo,
mediante la digestión enzimática de los anticuerpos con papaína,
pepsina u otras proteasas. Resulta muy conocido por un experto en la
materia que los anticuerpos monoclonales, o los fragmentos de los
mismos, pueden modificarse para diversas utilizaciones. Los
anticuerpos implicados en la invención pueden marcarse mediante un
marcador adecuado de tipo enzimático, fluorescente o radiactivo.
En otra forma de realización de la invención las
moléculas descritas anteriormente pueden utilizarse como medicamento
destinado al tratamiento de trastornos patológicos de la
angiogénesis y/o la arteriogénesis y/o la formación de edemas.
El "edema" es un trastorno provocado por
pérdidas vasculares. La vasodilatación y el incremento de la
permeabilidad durante la inflamación pueden constituir el mecanismo
patógeno predominante. Por ejemplo, los edemas contribuyen a la
expansión de un infarto después de un ataque y pueden provocar
hipertensión intracraneal potencialmente mortal en pacientes de
cáncer. Además, la extravasación de proteínas plasmáticas favorece
la propagación metastática de tumores ocultos y la congestión de las
vías respiratorias puede provocar ataques de asma fatales. El
incremento de las pérdidas vasculares que se produce durante la
inflamación puede provocar disnea, ascitis, esclerosis peritoneal
(en pacientes de diálisis), formación de adherencias (cirugía
abdominal) y propagación metastática. Por "angiogénesis" se
entiende un proceso fundamental por el que se forman nuevos vasos
sanguíneos. El período angiógeno primario en los seres humanos tiene
lugar durante los tres primeros meses de desarrollo embrionario pero
la angiogénesis también ocurre como proceso fisiológico normal
durante períodos de crecimiento tisular, tales como el aumento de la
musculatura o del tejido adiposo durante el ciclo menstrual y el
embarazo. El término "angiogénesis patológica" se refiere a la
formación y el crecimiento de vasos sanguíneos durante el
mantenimiento y la progresión de diversos estados patológicos. En
los vasos sanguíneos (arterioesclerosis, hemangioma,
hemangioendotelioma), en los huesos y en las articulaciones
(artritis reumatoide, sinovitis, destrucción de huesos y cartílagos,
osteomielitis, crecimiento del panículo adiposo, formación de
excrecencias óseas, neoplasias y metástasis), en la piel (verrugas,
granulomas piógenos, crecimiento de pelo, sarcoma de Kaposi,
producción excesiva de colágeno en la cicatrización de las heridas,
edemas alérgicos, neoplasias), en el hígado, en los riñones, en los
pulmones, en los oídos y en otros epitelios (procesos inflamatorios
e infecciosos(entre ellos la hepatitis, la glomerulonefritis,
la neumonía), asma, pólipos nasales, otitis, trasplantes,
regeneración hepática, neoplasias y metástasis), en el útero, en los
ovarios y en la placenta (metrorragia funcional (debida a
dispositivos anticonceptivos intrauterinos), formación de quistes
foliculares, síndrome de hiperestimulación ovárica, endometriosis,
neoplasias), en el encéfalo, en los nervios y en los ojos
(retinopatía de prematuridad, retinopatía diabética, alteraciones
coroideas y otras alteraciones intraoculares, leucomalacia,
neoplasias y metástasis), en el músculo cardíaco y esquelético
debido a sobrecarga de trabajo, en el tejido adiposo (obesidad) en
los órganos endocrinos (tiroiditis, hipertrofia tiroidea,
trasplantes de páncreas), en la hematopoyesis (SIDA (Kaposi),
neoplasias hematológicas (leucemias, etc.), en los vasos linfáticos
(metástasis tumorales, alteraciones linfoproliferativas). Por
"alteraciones retinales isquémicas" se entiende que disminuye
el suministro de sangre y oxígeno a la retina, las zonas periféricas
de la retina pierden su fuente de nutrición y dejan de funcionar
adecuadamente. Las enfermedades comunes que provocan retinopatías
consisten en la retinopatía diabética, la oclusión de la vena
retinal central, la estenosis de la arteria carótida, y la
retinopatía de los drepanocitos. La retinopatía diabética es la
causa principal de pérdida visual en los pacientes diabéticos. En la
retina isquémica se produce el crecimiento de nuevos vasos
sanguíneos (neovascularización). Dichos vasos crecen con frecuencia
en la superficie de la retina, en el nervio óptico o en la parte
frontal ocular en el iris. Los nuevos vasos no pueden sustituir el
flujo de nutrientes necesarios y, en lugar de ello, pueden provocar
diversos problemas tales como la hemorragia vítrea, el
desprendimiento de la retina y el glaucoma descontrolado. Dichos
problemas tienen lugar debido a que los nuevos vasos son frágiles y
propensos a sangrar. Si se detecta en sus primeras etapas, la
retinopatía diabética proliferativa puede a veces detenerse mediante
panretinofotocoagulación. Sin embargo, en algunos casos, la
vitrectomía quirúrgica es la única opción.
Por el término "hipertensión pulmonar" se
entiende una alteración en la que la tensión arterial de las
arterias pulmonares resulta anormalmente elevada. En ausencia de
otros trastornos cardíacos o pulmonares se llama hipertensión
pulmonar primaria. Se produce un estrechamiento difuso de las
arteriolas pulmonares como resultado de la arteriogénesis seguida
por la hipertensión pulmonar como respuesta a un incremento en la
resistencia al flujo sanguíneo. La prevalencia es de 8 de cada
100.000 personas. Sin embargo, la hipertensión pulmonar también
puede producirse como resultado de complicaciones en enfermedades
pulmonares obstructivas crónicas (COPD) tales como el enfisema, la
bronquitis crónica o la fibrosis intersticial difusa y en pacientes
con COPD asmatiforme. La prevalencia de las COPD es de
aproximadamente 5 de cada 10.000 personas.
En otra forma de realización de la invención las
moléculas descritas anteriormente también pueden utilizarse en la
fabricación de un medicamento para tratar las inflamaciones y más
específicamente los trastornos inflamatorios. Tal como se utiliza en
la presente memoria el término "inflamación" significa la
reacción local a traumatismos en tejidos vivos, especialmente la
reacción local de los vasos sanguíneos pequeños, su contenido y sus
estructuras asociadas. El paso de los componentes de la sangre a
través de las paredes del vaso hacia los tejidos constituye la
principal característica de la inflamación, y la acumulación que de
este modo se forma en los tejidos se conoce como exudado o edema.
Cualquier proceso nocivo que dañe los tejidos tales como las
infecciones por bacterias, el calor excesivo, el frío, las lesiones
mecánicas tales como las producidas por aplastamiento, los ácidos,
los álcalis, la irradiación o la infección por virus, puede provocar
la inflamación independientemente del órgano o tejido implicado. Ha
de quedar claro que las enfermedades de animales y seres humanos
clasificadas como "trastornos inflamatorios" y las reacciones
tisulares que van desde las quemaduras hasta la pulmonía, la lepra,
la tuberculosis y la artritis reumatoide constituyen todas ellas
"inflamaciones".
En otra forma de la invención las moléculas
descritas anteriormente también pueden utilizarse en la fabricación
de un medicamento para tratar la formación de tumores. Por
"tumor" se entiende una masa de tejido anormal que aparece sin
ninguna causa evidente a partir de células corporales preexistentes,
no presenta una función concreta, y se caracteriza por una tendencia
a crecer de modo autónomo e incontrolado. Los tumores son bastante
diferentes de las inflamaciones u otras hinchazones debido a que las
células de los tumores presentan una apariencia y otras
características anormales. Las células anormales - el tipo que
generalmente compone los tumores - difiere de las células normales
al haber experimentado una o más de las siguientes alteraciones: (1)
hipertrofia, o un incremento en el tamaño de las células
individuales; dicha característica se encuentra ocasionalmente en
tumores pero resulta muy común en otras alteraciones; (2)
hiperplasia o incremento del número de células en una zona
determinada; en algunos casos puede constituir el único criterio de
formación de un tumor; (3) anaplasia, o regresión de las
características físicas de una célula hacia un tipo más primitivo o
indiferenciado; ésta constituye una característica casi constante en
los tumores malignos, a pesar de que tiene lugar en otros casos
tanto en pacientes sanos como en enfermos. En algunos casos las
células de un tumor son normales en apariencia, reproducciones
fieles de sus células madre; las diferencias entre ellas y las
células corporales normales resultan difíciles de distinguir. Dichos
tumores con frecuencia son benignos. Otros tumores se componen de
células que se presentan distintas de los tipos adultos normales en
tamaño, forma y estructura; habitualmente pertenecen a tumores
malignos. Dichas células pueden presentar formas extrañas o
disponerse de un modo deformado. En los casos más extremos, las
células de los tumores malignos se describen como primitivas o
indiferenciadas, debido a que han perdido la apariencia y las
funciones del tipo particular de célula especializada (normal) que
constituía su predecesora. Por regla general, cuanto menos
diferenciadas sean las células de un tumor maligno, más rápidamente
crecerá dicho tumor. La malignidad se refiere a la capacidad por
parte de un tumor para en última instancia provocar la muerte.
Cualquier tumor, ya sea de tipo benigno o maligno, puede producir la
muerte debido a sus efectos locales si se encuentra situado
"adecuadamente". La definición común y más específica de
malignidad implica la tendencia intrínseca de las células tumorales
para metastatizar (invadir el cuerpo extensamente y diseminarse por
medios sutiles) y finalmente matar al paciente excepto si se pueden
erradicar las células malignas. La metástasis constituye por lo
tanto la característica más destacada de la malignidad. La
metástasis consiste en la tendencia de las células tumorales a ser
transportadas desde su zona de origen vía el sistema circulatorio y
otros canales, que pueden finalmente pueden establecer dichas
células en prácticamente cualquier tejido y órgano del organismo.
Contrariamente, las células de un tumor benigno permanecen
invariablemente en contacto entre sí en una masa sólida centrada en
la zona de origen. Debido a la continuidad física de las células
tumorales benignas, pueden extirparse completamente mediante cirugía
si la ubicación es apta. Pero la diseminación de las células
malignas, poseyendo individualmente cada una de ellas (mediante la
división celular) la capacidad de originar nuevas masas de células
(nuevos tumores) en zonas nuevas y distantes, impide la erradicación
completa mediante un simple procedimiento quirúrgico excepto en las
primeras etapas del crecimiento. Un tumor benigno puede experimentar
una transformación maligna, pero se desconoce la causa de dicho
cambio. También es posible que un tumor maligno permanezca latente,
imitando clínicamente uno de benigno, durante un largo período de
tiempo. Todos los tumores benignos tienden a permanecer localizados
en la zona de origen. Muchos tumores benignos se encuentran
encapsulados. La cápsula consiste en tejido conjuntivo originado a
partir de las estructuras que rodean directamente el tumor.
Los tumores muy encapsulados no se encuentran
anclados a sus tejidos circundantes. Dichos tumores benignos
aumentan de tamaño por acumulación, apartando los tejidos adyacentes
sin implicarlos íntimamente. Entre los tipos principales de tumores
benignos se encuentran los siguientes: los lipomas, que se componen
de células adiposas; los angiomas, que se componen de vasos
sanguíneos o linfáticos; los osteomas, que se forman a partir del
hueso; los condromas, que se originan a partir del cartílago; y los
adenomas, que se originan a partir de las glándulas. En el caso de
los tumores malignos, los ejemplos comprenden los carcinomas (se
producen en tejidos epiteliales, que recubren el cuerpo (la piel) y
revisten las cavidades internas de los órganos (tales como el tórax,
los tractos respiratorio y gastrointestinal, las glándulas
endocrinas y el sistema genitourinario). Los sarcomas se desarrollan
en los tejidos conjuntivos, comprendiendo los tejidos fibrosos, el
tejido adiposo (graso), la musculatura, los vasos sanguíneos, los
huesos y los cartílagos. Un cáncer también puede desarrollarse en el
tejido epitelial y conjuntivo y se denomina carcinosarcoma. El
cáncer de los tejidos formadores de sangres (tal como las leucemias
y los linfomas), los tumores de los tejidos nerviosos (comprendiendo
el encéfalo) y los melanomas (un cáncer de las células cutáneas
pigmentadas) se clasifican por separado.
En una forma de realización específica ha de
quedar claro que el método terapéutico de la presente invención
contra los tumores puede utilizarse también en combinación con otros
tratamientos de tumores conocidos en la especialidad tales como las
irradiaciones, la quimioterapia o la cirugía.
El término "medicamento destinado al
tratamiento" se refiere a una composición que comprende moléculas
tal como las descritas anteriormente y un vehículo o excipiente
farmacéuticamente aceptable (ambos términos pueden utilizarse de
modo intercambiable) destinados al tratamiento de trastornos tales
como las indicados anteriormente. Los vehículos o excipientes aptos
conocidos por los expertos son salinos, disolución de Ringer,
disolución glucosada, disolución de Hank, aceites fijos, oleato de
etilo, glucosa al 5% en disolución salina, sustancias que
intensifican la isotonicidad y la estabilidad química,
amortiguadores del pH y conservantes. Otros excipientes aptos
comprenden cualquier excipiente que por sí mismo no provoque la
producción de anticuerpos nocivos para el paciente al que se
administra la composición tales como proteínas, polisacáridos,
ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos
y copolímeros de aminoácidos.
El "medicamento" puede administrarse
mediante cualquier método apto comprendido en los conocimientos de
los expertos. La vía de administración preferida es la parenteral.
En la administración parenteral, el medicamento de la presente
invención se formulará en forma de dosis unitaria inyectable tal
como una disolución, suspensión o emulsión, junto con los
excipientes farmacéuticamente aceptables tal como se han definido
anteriormente. Sin embargo, la dosificación y el modo de
administración dependerán del paciente. Generalmente, el medicamento
se administra de modo que la proteína, polipéptido o péptido de la
presente invención se proporcione en una dosis comprendida entre 1
\mug/kg y 10 mg/kg, más preferentemente comprendida entre 10
\mug/kg y 5 mg/kg, y todavía más preferentemente comprendida entre
0,1 y 2 mg/kg. Preferentemente, se administra como una dosis en
inyección intravenosa rápida. También puede utilizarse la
venoclisis continua y comprende un suministro subcutáneo continuo
mediante una minibomba osmática. En este caso, el medicamento se
puede suministrar con una dosis comprendida entre 5 y 20
\mug/kg/minuto, más preferentemente comprendida entre 7 y 15
\mug/kg/minuto.
En otra forma de realización los anticuerpos o
los fragmentos funcionales de los mismos pueden utilizarse en la
fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de los
trastornos anteriormente mencionados. Unos ejemplos no restrictivos
los constituyen los anticuerpos policlonales de cabra disponibles
comercialmente de R&D Pharmaceuticals, Abingdon, UK o los
anticuerpos policlonales de pollo (Grassman et al., 1990
Faseb J. 4, 2528). Preferentemente dichos anticuerpos son
humanizados (Rader et al., 2000, J. Biol. Chem- 275,
13668) y más preferentemente se utilizan anticuerpos humanos como
medicamento.
Puede utilizarse una molécula destinada a
inhibir la actividad del PlGF, tal como se ha descrito
anteriormente, en combinación con una molécula destinada a inhibir
la actividad del VEGF, según los mismos niveles de inhibición que se
han descrito anteriormente por el PlGF. De hecho, se ha descubierto
que el PlGF es angiógeno en las zonas en las que se aumentan los
niveles de VEGF.
Pueden utilizarse los polimorfismos del promotor
del PlGF para identificar pacientes que presenten una
predisposición a adquirir angiogénesis patológica, pérdidas
vasculares (edemas), hipertensión pulmonar, formación de tumores y/o
trastornos inflamatorios. De hecho, puede esperarse que los
polimorfismos del promotor puedan originar unos niveles muy
superiores o muy inferiores de PlGF. Por consiguiente, los niveles
más elevados de PlGF pueden conducir a una predisposición a
adquirir angiogénesis patológica, pérdidas vasculares (edemas),
hipertensión pulmonar, formación de tumores y/o trastornos
inflamatorios mientras que los niveles más bajos de PlGF pueden
conducir a una protección ante la angiogénesis patológica, las
pérdidas vasculares (edemas), la hipertensión pulmonar, la formación
de tumores y/o trastornos inflamatorios.
Se obtendrá una comprensión más completa de la
invención haciendo referencia a los siguientes ejemplos
ilustrativos. Todos los materiales iniciales y reactivos que se
presentan a continuación resultan conocidos por los expertos en la
materia y se encuentran disponibles comercialmente o pueden
prepararse utilizando técnicas muy conocidas.
En diversos trastornos patológicos, en
particular cuando se encuentran asociados a una expresión aumentada
del VEGF, la formación de nuevos canales endoteliales (angiogénesis)
se vio alterada significativamente en ratones PIGF^{-/-}. La
proliferación y la angiogénesis de los tumores originados a partir
de embriocitos indiferenciados (ES), procesos de los que se conoce
que el VEGF interviene (Ferrara N. et al., 1996 Nature
380 439-442), resultó que también dependía del PlGF.
De hecho, los tumores originados a partir de embriocitos
indiferenciados (ES) PIGF^{+/+}, obtenidos durante las cuatro
semanas posteriores a la inoculación subcutánea en ratones
nu/nu PIGF^{+/+}, pesaron 4 \pm 1 g (n = 8) y se
presentaron como hemorrágicos y sangraron abundantemente (7 de 8
tumores). Contrariamente, los tumores PIGF^{-/-} en anfitriones
nu/nu PIGF^{-/-} pesaron solamente 1,0 \pm 0,3 g (n = 8)
y presentaban una coloración blanca homogénea con un nivel mínimo de
sangrado (5 de 7 tumores). El crecimiento y la vascularización de
los tumores PIGF^{-/-} se redujo a un mismo nivel que en los
tumores VEGF^{-/-}. Los tumores PIGF^{+/+} y PIGF^{-/-}
contenían densidades vasculares comparables de canales y capilares
endoteliales (diámetro < 8 \mum). Sin embargo, en comparación
con los tumores PIGF^{+/+}, los tumores PIGF^{-/-} contenían un
número inferior de vasos de tamaño medio o grande. En un estudio
previo, demostramos que la formación de los vasos de tamaño medio o
grande dependía del VEGF (Carmeliet P. et al., 1998,
Nature 394, 485-490). La angiogénesis de los
tumores PIGF^{+/+} en los ratones nu/nu PIGF^{-/-} y los
tumores PIGF^{-/-} en los ratones nu/nu PIGF^{+/+} era
comparable a la de los tumores PIGF^{+/+} en los ratones
nu/nu PIGF^{+/+} indicando que la producción de PlGF tanto
por parte del tumor como por el tejido producido por el anfitrión
podía rescatar el fenotipo. Los niveles de transcritos del VEGF eran
comparables entre ambos genotipos (VEGF/10^{3} moléculas de
ARNm HPRT: 280 \pm 20 en los tumores PIGF^{+/+} comparado
con 320 \pm 50 en los tumores PIGF^{-/-}; p = NE) y se
expresaron en las células epiteliales y mesenquimatosas
completamente en los tumores PIGF^{+/+}, mientras que el PIGF se
expresó en las células endoteliales de los vasos pequeños o grandes
(hibridación in situ). La expresión del
VEGF-B y el VEGF-C también resultó
comparable.
La exposición de ratones recién nacidos a
oxígeno al 80% desde P7 hasta P12 provoca la pérdida capilar en la
retina debido a la expresión reducida del VEGF (VEGF/10^{3}
moléculas de ARNm HPRT en las retinas PIGF^{+/+}: 270 \pm 40 en
P7 durante la normoxia comparado con los 100 \pm 10 en P12,
durante la hiperoxia; p < 0,05 comparado con P7; n = 5) (Alón T.
et al., 1995, Nat Med 1, 1024-1028).
Con la reexposición al aire ambiente en P12, la isquemia retinal
sobrerregula la expresión del VEGF (VEGF/10^{3} moléculas de ARNm
HPRT: 390 \pm 50 en P13, p < 0,05 comparado con P7; y 165 \pm
50 en P17; n = 5) induciendo de este modo la dilatación venosa, la
tortuosidad arterial y la extensión capilar de la cámara posterior
del ojo por P17 (Kern, T. S. et al., 1996., Arch
Ophtalmol. 114, 986-990). Continúa sin conocerse
la función del PlGF en la retinopatía isquémica. Los niveles de
transcritos del PlGF (PlGF/10^{3} moléculas de ARNm
HPRT) fueron de: 40 \pm 10 en P7 (normoxia), 10 \pm 2 en
P12 (hiperoxia), 90 \pm 10 en P13 (regreso a la normoxia) 12 \pm
2 en P17. A pesar de un desarrollo vascular retinal comparable
durante la normoxia y una pérdida capilar comparable durante la
hiperoxia (P12) en ambos genotipos, los ratones PIGF^{-/-}
desarrollaron \sim75% de fiebre y unas crestas vítreas
neovasculares significativamente menores por P17 que los ratones
PIGF^{+/+} (células endoteliales por sección: 10 \pm 2 en los
ratones PIGF^{-/-} comparado con 48 \pm 4 en los ratones
PIGF^{+/+}; n = 6, p < 0,05). Además, los ratones PIGF^{-/-}
presentaron unos valores reducidos de dilatación venosa (índice de
dilatación semicuantitativo, véase métodos: 0,9 \pm 0,05 en los
ratones PIGF^{-/-} comparado con 1,7 \pm 0,03 en los ratones
PIGF^{+/+}; p < 0,05) y de tortuosidad arterial (índice de
tortuosidad: 0,8 \pm 0,05 en los ratones PIGF^{-/-} comparado
con 2,3 \pm 0,2 en los ratones PIGF^{+/+}; p < 0,05).
La permeabilidad vascular, un rasgo
característico del VEGF (Ferrara N. et al., 1999 Curr Top
Microbiol Immunol 237 1-30), se vio reducida
sistemáticamente en los ratones PIGF ^{-/-} comparado con los
ratones PIGF^{+/+}. Previamente se había implicado el VEGF en la
permeabilidad vascular de la piel (Brown, L. F. et al., 1995,
J Immunol 154, 2801-2807), pero la función
del PlGF permanece sin determinar. Se utilizaron diversos modelos:
(i) La inyección intradérmica de 1, 3 ó 10 ng de VEGF_{165}
provocó un grado menor de extravasación de azul de Evans en los
ratones PIGF^{-/-} que en los ratones PIGF^{+/+} (análisis de
Miles). (ii) La sensibilización de la piel con ovoalbúmina provocó
un grado menor de extravasación del plasma en los ratones
PIGF^{-/-} que en los ratones PIGF^{+/+} (Casals - Stenzel J.
et al., 1987, Inmunopharmacology 13,
177-183) (reacción de Arthus: 12 \pm 1 \mul de
plasma extravasado tras la administración del excipiente comparado
con 130 \pm 5 \mul de plasma tras la administración de la
ovoalbúmina en los ratones PIGF^{+/+}; p < 0,05; n = 12 en
comparación con los 11 \pm 1 \mul de plasma tras la
administración del excipiente comparado con 13 \pm 1 \mul de
plasma tras la administración de la ovoalbúmina en los ratones
PIGF^{-/-}; p = NE; n = 12). (iii) La extravasación de plasma en
los vasos en piel normal resultó similar en ambos genotipos (mg de
plasma x 10^{5}/min.mg de tejido: 35 \pm 5 en los ratones PIGF
^{+/+} comparado con 35 \pm 4 en los ratones PIGF ^{-/-}; p =
NE; n = 7) pero no aumenta de un modo significativo más en los
ratones PIGF^{+/+} que en los ratones PIGF^{-/-} a continuación
de producir una herida en la piel (60 \pm 4 en los ratones PIGF
^{+/+} comparado con 40 \pm 4 en los ratones PIGF^{-/-} p <
0,05; n = 10). De este modo, el PlGF aumentó específicamente la
permeabilidad vascular como respuesta al VEGF y no a la
histamina.
En la curación de las heridas de la piel
interviene el crecimiento interior de vasos, que inicialmente
comprenden células endoteliales (angiogénesis) y posteriormente ven
rodeados por células musculares lisas (arteriogénesis). Se ha
implicado el VEGF en el crecimiento capilar durante la curación de
la piel (Detmar M. et al., 1998, J.Invest. Dermatol.
111, 1-6), pero la función del PlGF permanece
desconocida. La curación de las incisiones cutáneas se vio
ligeramente retardada en los ratones PIGF^{-/-} comparado con los
ratones PIGF^{+/+}. Ambos genotipos contenían densidades
comparables de vasos teñidos con trombomodulina en la piel ilesa
(vasos/mm ^{2}; 240 \pm 80 en los ratones PIGF^{+/+} comparado
con 200 \pm 80 en los ratones PIGF^{-/-}; p = NE; n = 5). La
tinción de la musculatura lisa con \alpha-actina
puso de manifiesto una densidad de vasos comparable (i) que no se
vieron cubiertas ni envueltas por unas pocas células musculares
lisas (vasos/mm^{2}; 58 \pm 14 en los ratones PIGF^{+/+}
comparado con 40 \pm 12 en los ratones PIGF^{-/-}; p = NE; n =
5), y (ii) que se vieron completamente cubiertas por al menos una
capa de células musculares lisas (vasos/mm^{2}; 15 \pm 5 en los
ratones PIGF^{+/+} comparado con 19 \pm 1 en los ratones
PIGF^{-/-}; p = NE; n = 5). Durante los cuatro días posteriores a
la herida, el PlGF se expresó en las células endoteliales y el PlGF
y el VEGF se vieron sobrerregulados en los queratinocitos de la
epidermis hiperplásica del borde de la herida en los ratones
PIGF^{+/+}, cuando se formaron los nuevos vasos (hibridación in
situ; no se ilustra). Ambas cepas comprendían un crecimiento
interior de vasos comparable en la zona de la herida (vasos teñidos
con trombomodulina/mm^{2}; 240 \pm 50 en los ratones
PIGF^{+/+} comparado con 180 \pm 50 en los ratones
PIGF^{-/-}; n = 5; p = NE). Sin embargo, ambos genotipos
difirieron en el grado de nuevos vasos cubiertos por células
musculares lisas SMA-positivas. El número de vasos
que no se cubrieron o lo hicieron de un modo incompleto con células
musculares lisas fue de 40 \pm 7 en los ratones PIGF^{+/+}
comparado con 84 \pm 13 en los ratones PIGF^{-/-} (p < 0,05;
n = 5), mientras que el número de vasos que se vieron cubiertos
completamente por al menos una capa de células musculares lisas fue
de 75 \pm 18 en los ratones PIGF^{+/+} comparado con 30 \pm 10
en los ratones PIGF^{-/-} (p < 0,05). De este modo, la falta de
PlGF altera la cobertura de los nuevos canales endoteliales con
células musculares lisas.
La hipertensión pulmonar debida a la
reestructuración del sistema vascular pulmonar provocada por la
hipoxia constituye una complicación potencialmente mortal en las
enfermedades pulmonares obstructivas crónicas (COPD). Aunque el
VEGF se ve altamente sobrerregulado en los pulmones de los pacientes
con CODP (Cool C. D. et al., 1999 Am J Pathol 155,
411-419) y de animales hipóxicos (Christou H. et
al, 1998, Am J Respil Cell Mol Biol 18,
768-776), se desconoce su papel en el proceso.
Sorprendentemente, no hay información disponible sobre la expresión
o la función del PlGF. Por lo tanto, se expusieron los ratones
adultos a hipoxia (10% de O_{2}) durante 4 semanas, ya que ello
provoca hipertensión pulmonar debido a un aumento de la
"muscularización" de los vasos pulmonares (Hales C. A. et
al., 1983, Am Rev Respir Dis 128,
747-751). La proporción entre el peso del ventrículo
derecho (RV) y el ventrículo izquierdo (LV) - un modo de
determinación de la hipertrofia del RV - resultó comparable en ambos
genotipos durante la normoxia (32 \pm 2% en los ratones
PIGF^{+/+} comparado con 33 \pm 2% en los ratones PIGF^{-/-};
n = 4; p = NE), se incrementó significativamente a continuación de
la hipoxia en los ratones PIGF^{+/+} 48 \pm 4%; n = 5; p <
0,05 comparado con la normoxia), pero se vio mínimamente afectada
por la hipoxia en los ratones PIGF ^{-/-} (37 \pm 2%; n = 6; p
< 0,05 en comparación con la normoxia y en comparación con los
ratones PIGF^{+/+}). Se observaron diferencias genotípicas
significativas en la reestructuración vascular pulmonar. La tinción
con elastina de los pulmones normóxicos demostró que ambos genotipos
presentaban una densidad comparable de arteriolas intraacinares de
paredes finas que contenían únicamente una lámina de elastina
interna (IEL), o arteriolas de paredes gruesas que contenían una IEL
intacta y además una lámina elástica externa (EEL) incompleta (Tabla
1). Las arteriolas de paredes gruesas que contenían dos láminas
elásticas intactas alrededor de la circunferencia entera se
detectaron únicamente ocasionalmente en ambos genotipos (Tabla 1).
La hipoxia provocó una reestructuración vascular significativa en
los ratones PIGF^{+/+}, produciendo una fracción superior de vasos
de paredes gruesas con una EEL parcial o completa a costa de los
vasos de paredes finas con una única IEL (Tabla 1). Contrariamente,
la reestructuración vascular resultó mucho menos significativa en
los ratones PIGF^{-/-}, produciendo una menor fracción de vasos de
paredes gruesas con una IEL y EEL completas (Tabla 1). La
inmunotinción de la \alpha-actina del músculo liso
(SMA) confirmaron que los ratones PIGF^{+/+} contenían un
gradosignificativamente superior de arteriolas muscularizadas que
los ratones PIGF^{-/-} a continuación de la hipoxia (Tabla 1). La
protección contra la hipertensión pulmonar en los ratones
PIGF^{-/-} no fue debida a una respuesta reducida de
vasoconstricción (la presión del RV aumentó en un 31 \pm 4% en los
ratones PIGF^{+/+} comparado con el 34 \pm 5% en los ratones
PIGF^{-/-} como respuesta a 30 minutos al 7% de O_{2}; p = NE)
así como tampoco fue debida a unos niveles inferiores de hematocrito
(48 \pm 3% en los ratones PIGF^{+/+} comparado con el 53 \pm
3% en los ratones PIGF^{-/-}; p = NE). Por lo tanto, el PlGF
modula significativamente la reestructuración arterial.
Vasos por 10^{3} alvéolos | ||||
ratones PIGF ^{+/+} | ratones PIGF ^{-/-} | |||
20% O_{2} | 10% O_{2} | 10% O_{2} | 10% O_{2} | |
Presencia de láminas elásticas | ||||
\hskip0.5cm IEL simple | 11 \pm 2 | 3.6 \pm 0.6* | 11 \pm 1 | 5.6 \pm 0.6*, # |
\hskip0.5cm IEL + EEL incompleta | 11 \pm 2 | 12 \pm 1 | 10 \pm 2 | 11 \pm 1 |
\hskip0.5cm IEL + EEL completa | <0.5 | 6 \pm 1* | <0.5 | 3 \pm 1*, # |
Coberturas por células musculares lisas | ||||
\hskip0.5cm Ausente | 2.4 \pm 0.9 | 0.5 \pm 0.3* | 3.1 \pm 0.7 | 3.4 \pm 0.7* |
\hskip0.5cm Incompleta | 11 \pm 1 | 12 \pm 2 | 8 \pm 2 | 11 \pm 1 |
\hskip0.5cm Completa | 1.2 \pm 0.5 | 11 \pm 2*,# | 2.6 \pm 2 | 2.8 \pm 2*, # |
Los datos representan el número (media \pm
error estándar de la media en 5 ratones) de vasos por 10^{3}
alvéolos que contienen una única lámina elástica interna (IEL), una
IEL más una lámina elástica externa (EEL) incompleta, o una IEL más
una EEL completa. Además, se muestra la densidad de vasos que no se
encontraban rodeados por células musculares lisas teñidas con
\alpha-actina del músculo liso (ausente) y las que
se encontraban rodeadas por ellas de un modo incompleto o completo.
*: p < 0,05 comparado con la normoxia (20% de O_{2}). #: p <
0,05 comparado con los ratones PIGF^{+/+}.
Se estudió la proliferación y supervivencia de
las células endoteliales como respuesta al VEGF. El VEGF_{165}
estimuló la proliferación de las células endoteliales de los ratones
PIGF^{+/+} (Tabla 2) y los protegió contra la apoptosis provocada
por la carencia de suero (0,1% de suero) o por el enriquecimiento
con TNF-\alpha (10 ng/ml). Contrariamente, el
VEGF_{165} no consiguió estimular la proliferación o proteger las
células endoteliales en los ratones PIGF^{-/-} ante la carencia de
suero o la apoptosis provocada con TNF-\alpha
(Tabla 2). El PlGF por sí solo no resultó ni mitógeno ni
antiapoptósico para las células endoteliales de ambos genotipos.
Tampoco afectó la respuesta de las células endoteliales en los
ratones PIGF^{+/+} ante el VEGF (Tabla 2), probablemente debido a
que las células endoteliales de los ratones PIGF^{+/+} ya
producían PlGF en una grado suficiente (el grado variable de
producción de PLGF por parte de las células endoteliales y las
cantidades relativas de VEGF presentes en las condiciones de cultivo
pueden explicar de hecho por qué algunos, pero no otros, habían
observado previamente una respuesta angiógena in vitro). Sin
embargo, el PlGF rescató la proliferación deficiente y la respuesta
de supervivencia de las células endoteliales de los ratones
PIGF^{-/-} ante el VEGF_{165} (Tabla 2). Se descubrió también
que el PlGF modulaba la respuesta mitógena al VEGF por parte de las
células musculares lisas, de las que se sabe que expresan el
VEGFR-1 y el VEGFR-2 (Grosskreutz
C. L. et al., 1999, Microvasc Res 58,
128-136). De hecho, el VEGF estimuló la
proliferación de las células musculares lisas de los ratones
PIGF^{+/+} pero no de los ratones PIGF^{-/-}. El PlGF, ineficaz
por sí solo, restauró la capacidad de respuesta de las células
PIGF^{-/-} ante el VEGF. EL PlGF moduló específicamente la
actividad del VEGF, ya que las células PIGF^{-/-} y PIGF^{+/+}
presentaban unas respuestas comparables al bFGF. Por lo tanto, el
PlGF afectó a las células musculares lisas y endoteliales únicamente
cuando se estimularon con VEGF.
El mecanismo del que se ha descubierto que
desempeña una función en la sinergia entre el VEGF y el PlGF: (i)
El PlGF sobrerreguló la expresión del VEGF, tal como se ha sugerido
previamente (Bottomley M. J., et al, 2000, Clin Exp
Immunol 119, 182-188). La expresión del VEGF por
parte de los fibroblastos PIGF^{-/-} se incrementó con el PlGF
(producción del VEGF por 10^{6} células/ml/24 h: 180 \pm 10 pg a
continuación del tratamiento con excipiente en comparación con los
440 \pm 10 pg a continuación del tratamiento con 100 ng/ml de PlGF
durante 24 horas; p < 0,05 en comparación con el excipiente).
Unos resultados similares se obtuvieron en los fibroblastos
PIGF^{+/+} (producción del VEGF por 10^{6} células/ml/24 h: 200
\pm 8 pg a continuación del tratamiento con excipiente en
comparación con los 430 \pm 5 pg a continuación del tratamiento
con 100 ng/ml de PlGF durante 48 horas; p < 0,05 en comparación
con el excipiente). La provocación de la producción del VEGF por
parte del PlGF fue, sin embargo, inferior a la provocada por la
hipoxia (1% de O_{2}) (expresada por 10^{6} células/ml/24 h:
3200 \pm 150 pg para las células PIGF^{+/+}; 2400 \pm 150 pg
en las células PIGF^{-/-}; p < 0,05 en comparación con la
normoxia). La respuesta inmunitaria del VEGF también se vio
incrementada en los ratones PIGF^{+/+} a continuación del
tratamiento con 1,5 \mug de PlGF_{132}/24 h.
Proliferación endotelial | ||
PIGF^{+/+} | PIGF^{-/-} | |
Excipiente | 11 \pm 2 | 11 \pm 1 |
VEGF^{120} (100 ng/ml) | 22 \pm 1* | 12 \pm 1 |
VEGF^{165} (100 ng/ml) | 36 \pm 4* | 12 \pm 2 |
VEGF^{165} (300 ng/ml) | 42 \pm 3* | 13 \pm 3 |
VEGF-E (100 ng/ml) | 32 \pm 1* | 13 \pm 1 |
PLGF (100 ng/ml) | 11 \pm 1 | 11 \pm 1 |
VEGF^{165} (100 ng/ml) + PLGF (100 ng/ml) | 33 \pm 3* | 33 \pm 2* |
VEGF ^{165} (100 ng/ml) | ||
\hskip0.5cm + anti-NP1 MoAb | 27 \pm 3* | N.D. |
\hskip0.5cm + anti-NP2 MoAb | 34 \pm 3 | N.D. |
\hskip0.5cm + anti-VEGFR-1 Ab | 23 \pm 5* | 12\pm 2 |
\hskip0.5cm + anti-VEGFR-2 MoAb | 15 \pm 2* | N.D. |
VEGF^{165} (100 ng/ml) + PLGF (100 ng/ml) | ||
\hskip0.5cm + anti-VEGFR-1 Ab | 22 \pm 4 | 21 \pm 4 |
\hskip0.5cm + anti-VEGFR-2 MoAb | 13 \pm 3 | 17 \pm 2 |
bFGF (50 ng/ml) | 35 \pm 2* | 35 \pm 5* |
bFGF (50 ng/ml) + PLGF (100 ng/ml) | 32 \pm 3* | 33 \pm 1* |
Los datos representan la media \pm desviación
típica de 9 de 12 experimentos. * p < 0,05 en comparación con el
control (excipiente). Ninguno de los anticuerpos afectó la
proliferación endotelial inicial en ausencia del VEGF (no se
muestra) Ab: antisuero policlonal; MoAb: anticuerpos monoclonales;
bFGF: factor básico de crecimiento de los fibroblastos.
Debido a que el VEGF desempeña una función en
los fenotipos de angiogénesis, arteriogénesis y permeabilidad
anteriormente mencionados, investigamos si el PlGF determinaba la
respuesta al VEGF. La implantación subcutánea de matrigel (Passaniti
A. et al., 1992, Lab Invest 67,
519-528) enriquecido con VEGF_{165} (VEGF_{165})
provocó una fuerte respuesta angiógena en los ratones PIGF^{+/+}
pero no en los ratones PIGF^{-/-} (contenido de hemoglobina: 0,28
\pm 0,02 g/dl en los ratones PIGF^{+/+} comparado con 0,02 \pm
0,02 g/dl en los ratones PIGF^{-/-}; n = 15; p < 0,05).
Contrariamente, el factor básico de crecimiento de los fibroblastos
(bFGF) provocó una respuesta angiógena similar en ambos genotipos
(contenido de hemoglobina: 0,28 \pm 0,02 g/dl en los ratones
PIGF^{+/+} comparado con 0,25 \pm 0,02 g/dl en los ratones
PIGF^{-/-}; n = 15; p = NE). Dichas observaciones se confirmaron
mediante el análisis histológico y la inmunotinción para el antígeno
relacionado con el factor VIII endotelial.
La respuesta reducida de las células
endoteliales PIGF^{-/-} ante el VEGF se confirmó utilizando
células endoteliales PIGF^{-/-} en cultivo primario. El
VEGF_{165} 100 ng/ml) resultaba quimiotáctico para las células
endoteliales PIGF^{+/+} pero no para las células endoteliales
PIGF^{-/-}, aunque ambos tipos respondían de un modo comparable al
bFGF. El PlGF (100 ng/ml) por sí solo no resultó quimiotáctico para
las células endoteliales de ambos genotipos, y no afectó a la
respuesta de las células endoteliales PIGF^{+/+} ante el VEGF,
probablemente debido a que las células endoteliales ya producen un
nivel abundante de PlGF. Sin embargo, el PlGF restauró completamente
la migración deficiente de las células endoteliales PIGF^{-/-}
como respuesta al VEGF_{165}. El PlGF también aumentó la actividad
quimiotáctica del VEGF en las células musculares lisas, de las que
se conoce que expresan el VEGFR-1 y el
VEGFR-2 (Grosskreutz C. L. et al., 1999
Microvasc Res 58, 128-136). El VEGF estimuló
la migración de las células musculares lisas PIGF^{+/+} pero no
las células musculares lisas PIGF^{-/-}, mientras que el bFGF
estimuló las células musculares lisas de ambos genotipos. Se
observaron unos efectos similares en la proliferación de las células
musculares lisas. A pesar de que el PlGF solo no estimuló las
células, rescató la respuesta deficiente de las células musculares
lisas ante el VEGF, subrayando que el PlGF resulta esencial para la
actividad biológica del VEGF. Por lo tanto, el PlGF determina y
amplifica sinérgicamente la respuesta al VEGF.
Se inyectan ratones silvestres con distintas
concentraciones de anticuerpos murinos anti-PIGF (0
\mug, 1 \mug, 5 \mug, 10 \mug y 50 \mug). Los anticuerpos
murinos anti-PIGF se generan en ratones
PIGF^{-/-}. Pasado un período de 72 horas los ratones se
introducen durante 4 semanas en una cámara hermética bajo hipoxia
normobárica (FiO_{2} al 10%). Al cabo de 28 días se sacrificaron
los ratones y se utilizaron para un análisis histológico tal como se
describe en la sección de materiales y métodos. El ratón de control
con 0 \mug de anticuerpos murinos anti-PIGF
desarrolla una reestructuración vascular pulmonar grave provocada
por la hipoxia. Los anticuerpos murinos anti-PIGF
evitan dicha reestructuración vascular pulmonar a concentraciones
muy bajas.
La oclusión de una arteria de irrigación supone
una complicación frecuente de la arterioesclerosis o de la
reestenosis arterial y priva a los tejidos situados más adelante de
oxígeno y nutrientes. Sin embargo, el aumento coincidente de
colaterales debido a la activación endotelial y al crecimiento del
músculo liso (arteriogénesis adaptativa), puede permitir la
perfusión a las zonas isquémicas y evitar la necrosis tisular en el
territorio de la arteria ocluida. A pesar de que se ha demostrado
que la administración de la proteína del VEGF o la transferencia del
gen del VEGF aumenta el crecimiento colateral, la función del VEGF
endógeno permanece controvertida. El PLGF no se ha implicado
previamente en dicho proceso. Los macrófagos desempeñan una función
en la arteriogénesis adaptativa, pero se desconoce la función del
PlGF. Por lo tanto, se estudió la función de los macrófagos en la
arteriogénesis de las arteriolas colaterales tras la ligación de la
arteria femoral. Se descubrió que los macrófagos
Mac3-positivos - de los que se conoce que desempeñan
una función esencial en el crecimiento colateral - se adherían al
endotelio y que se infiltraban en y atravesaban la pared de otros
colaterales tres días a continuación de la ligación. Sin embargo, se
infiltraron más colaterales con macrófagos
Mac3-positivos en los ratones PIGF^{+/+} que en
los ratones PIGF^{-/-} (45 de 66 colaterales PIGF^{+/+}
comparado con 29 de 67 colaterales PIGF^{-/-}; p < 0,05; n = 5
ratones). Ello puede relacionarse con la conocida actividad
quimiotáctica del PIGF en los monocitos. De hecho, utilizando otro
modelo de atracción de leucocitos (inyecciones locales de
endotoxinas en la base) se infiltraron tres veces más leucocitos en
los vasos de los ratones PIGF^{+/+} que en los de los ratones
PIGF^{-/-} (CD45 células positivas/vaso: 5,2 \pm 1 en los
ratones PIGF^{+/+} comparado con 1,5 \pm 0,2 \mum en los
ratones PIGF^{-/-}; n = 5; p < 0,05). Los macrófagos pueden
modular también el crecimiento colateral mediante la producción de
PIGF (8 \pm 2 PIGF/103 moléculas de ARNm HPRT; n = 5). Otro
rasgo característico de la arteriogénesis adaptativa consiste en la
extravasación de la fibronectina, proporcionando un dispositivo de
migración para las células musculares lisas. La extravasación de la
fibronectina resultó superior en los colaterales PIGF^{+/+} que en
los PIGF^{-/-}, tal como pudo comprobarse por el mayor número de
vasos colaterales, rodeados por depósitos inmunorreactivos con la
fibronectina (57 de 80 de los colaterales PIGF^{+/+} comparado con
21 de 83 colaterales PIGF^{-/-}; n = 5 ratones; p < 0,05
mediante la prueba de la \square^{2}). El aumento en la
permeabilidad de los colaterales PIGF^{+/+} puede estar provocado
por la sinergia entre el PIGF y el VEGF, del que se conoce que se
libera por los macrófagos activados. Los niveles de VEGF en los
macrófagos peritoneales estimulados por tioglicolato fue de 200
\pm 11 VEGF/103 moléculas de ARNm HPRT (n = 5). Por lo
tanto, el PIGF resulta esencial para el crecimiento colateral.
Debido a que la deficiencia en PlGF reduce el
fenotipo de distintos procesos patológicos de angiogénesis,
arteriogénesis y pérdidas vasculares comprendiendo la retinopatía
isquémica, la formación de tumores, la hipertensión pulmonar, las
pérdidas vasculares (formación de edemas) y los trastornos
inflamatorios, las moléculas que pueden inhibir la formación de
PlGF, o de unirse al PlGF, a su receptor (VEGFR-1) o
la transducción de la señal iniciada por el PlGF puede resultar útil
en el tratamiento de dichos procesos patológicos. Los anticuerpos
monoclonales contra el PlGF-2 murino se produjeron
esencialmente tal como se ha descrito previamente (Declerck P. J.
et al (1995) J. of Biol. Chem. 270, 8997, utilizando,
sin embargo, con los genes PlGF inactivados. Se inmunizaron los
ratones mediante la inyección subcutánea de PlGF-2
(R&D Systems). En total se produjeron 120 hibridomas de los que
15 presentaron un 50% de inhibición, 38 presentaron un 70% de
inhibición y 5 presentaron una inhibición completa del
PlGF-2m a su receptor (Fit-1) Esto
se determinó mediante una prueba ELISA inmunofuncional en la que se
recubrieron unas placas con 98 pocillos con 100 \mul de 1
\mug/ml de Fit-lm/quimera Fc durante la noche a
temperatura ambiente en PBS. Tras bloquear durante 1 hora con BSA al
1% en PBS, se aplicaron a la placa 100 \mul de una mezcla de 70
\mul de medio de hibridoma preincubado con 70 \mul de
PlGF-2m a 10 ng/ml durante 2 horas a temperatura
ambiente. Se incluyó una medida de PlGF-2m
comprendida entre 20 ng/ml y 156 pg/ml (diluida en
PBS-Tween. BSA-EDTA). Se incubaron
las placas durante 1 hora a 37ºC y 1 hora a temperatura ambiente, se
lavaron 5 veces con PBS-Tween y se aplicaron 100 pl
de anti PlGF-2 murino de cabra biotinilado a 200
ng/ml durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar 5
veces con PBS-Tween, se aplicaron 100 \mul del
conjugado de avidina y HRP (equipo Vectastorin ABC) durante 1 hora a
temperatura ambiente. Tras lavar 5 veces con
PBS-Tween, la placa se reveló con 90 \mul de
ofenilendiamina en una disolución amortiguadora del pH de citrato
fosfato a un pH de 5,0 durante 30 minutos y se determinó a 490
nm.
Se subclonaron los cinco clones positivos
(PL1H5, :PL5D11, PL9F7, PL13F11, PL17A10), se hicieron proliferar y
se inyectaron en ratones (ratones con los genes PlGF inactivados en
un fondo de la cepa Balb/c) para producir ascitis. Se purificaron
los anticuerpos monoclonales en proteína-A y
sefarosa y se analizaron de nuevo en relación con la inhibición del
PlGF-2m con el Fit-1/Fc. Los
resultados (Tabla 3) indicaron que los Mab-PL5D11
inhiben notablemente la unión del PlGF-2m con su
receptor. Se seleccionaron los Mab para el análisis en el modelo de
edema (aplicación cutánea de aceite de mostaza).
Exceso molar comparado con el PIGF-2m | ||||||
Nº | 10 X | 5 X | 2,5 X | 1,25 X | Sin anticuerpo | |
1 | PL1 H5G5 | 66 | 64 | 63 | 89 | 100 |
2 | PL5D11D4 | 10 | 15 | 22 | 43 | 100 |
PL5D11F10 | 14 | 19 | 22 | 35 | 100 | |
3 | PL13F11C8 | 57 | 70 | 83 | 100 | 100 |
4 | PL17A10E12 | 40 | 46 | 60 | 89 | 100 |
PL17A10F12 | 41 | 41 | 53 | 90 | 100 | |
Anticuerpo 1 C 8 irrelevante de control negativo | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | |
Concentración de PIGF-2m en ng/ml | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | |
Concentración de anticuerpo en ng/ml | 200 | 100 | 50 | 25 | 0 |
Se pintaron las orejas de ratones suizos con
aceite de mostaza y se determinó la extravasación de azul de Evans.
Se inyectaron anticuerpos por vía intravenosa a 300 \mug/kg 30
minutos antes de la inyección del azul de Evans y de la aplicación
del aceite de mostaza. Brevemente, 100 \mul del agente de prueba
se inyectan mediante un catéter en la vena yugular y 30 minutos más
tarde se procede a la inyección intravenosa de 300 \mul de azul de
Evans al 0,5%. Se pinta una oreja con aceite de mostaza al 0,1% y se
repinta de nuevo 15 minutos más tarde. Pasados 30 minutos se procede
a la venoclisis de una disolución salina que contiene 100 U/ml de
heparina vía el ventrículo izquierdo, y a continuación de para
formaldehído al 3% en una disolución amortiguadora de pH de citrato.
Se amputaron las orejas, se diseccionaron en segmentos pequeños y se
obtuvo el extracto durante la noche en formamida a 55ºC. La
absorbancia del fluido extraído se determinó a 610 nm. Los
anticuerpos anti PlGF, que bloquearon la respuesta de las células
endoteliales al PlGF en las células (Tabla 4), redujeron las
pérdidas vasculares provocadas por la aplicación del aceite de
mostaza en las orejas de los ratones genéticamente intactos
(unidades de absorbancia relativa/oreja 13 \pm 3 tras la
aplicación de aceite de vaselina; 53 \pm 7 tras la aplicación de
aceite de mostaza más las IgG de control; 26 \pm 5 tras la
aplicación de aceite de mostaza más anti-PlGF; n =
5; p < 0,05.
Grupo | A^{610 \ nm} | p | ||
Sin anticuerpo | 0.76 \pm 0.09 | - | ||
PL5D11D4 | 10 \mug | 0.50 \pm 0.05 | 0.12 | |
PL17A10E12 | 10 \mug | 0.37 \pm 0.04 | 0.03 |
Se ha analizado una genoteca tetramérica con
respecto a su capacidad para inhibir, en las pruebas ELISA, el
enlace entre el factor 2 de crecimiento placentario recombinante de
ratón (PlGFm) [R&D systems, nº de cat. 645-PL]
y el receptor 1 del factor de crecimiento endotelial vascular
recombinante de ratón (VEGF Rl) quimera Fit-1/Fc
[R&D systems, nº de cat. 471-F1]. La prueba
ELISA se realizó siguiendo el presente procedimiento. Se ha
revestido el receptor en una placa de microvaloración [Costar, nº de
cat. 3590] a 1 \mug/ml en 50 mM de NaH_{2}PO_{4}, 150 mM de
NaCl a un pH de 7,5 (PBS), 100 \mul/pocillo, durante 16 horas a
temperatura ambiente. Se han lavado 5 veces los pocillos con PBS que
contenía Tween al 0,004% (PBS-T) y se han bloqueado
con seroalbúmina bovina (BSA) al 1% en PBS, 150 \mul/pocillo,
durante 2 horas a temperatura ambiente. Se ha lavado la placa 5
veces con PBS-T y se han añadido a cada pocillo 100
\mul de PlGFm diluido a 8 ng/ml en PBS a un pH de 7,5, BSA al
0,1%, 5 mM de EDTA, Tween al 0,004% (PBET). Tras la incubación
durante 1 hora a 37ºC y una hora a temperatura ambiente, se lavó de
nuevo la placa y se añadieron anticuerpos biotinilados anti PlGFm
[R&D systems, nº de cat. BAF-465] a 200 ng/ml en
PBET, 100 \mul/pocillo y se incubaron durante 2 horas a
temperatura ambiente. Se ha lavado la placa 5 veces con
PBS-T y se han añadido a cada pocillo 100 \mul de
una solución que contenía un sistema de avidina y biotina (equipo
Vectastatin elite ABC, Vector laboratories, nº de cat. PK 6100).
Dicha disolución se ha preparado mezclando una gota de la disolución
A y una gota de la disolución B en 2,5 ml de
Tris-HC1 50 mM, y diluyendo dicha mezcla en un
factor de 1/100 en PBET. Tras 1 hora de incubación se lavó la placa
del mismo modo que anteriormente, y se añadieron a cada pocillo 90
\mul/pocillo de una disolución que contenía 1 mg/ml de
O-fenilendiamina (0PD) en una disolución
amortiguadora del pH de citrato a un pH de 5. Tras 40 minutos se
paró la reacción en desarrollo añadiendo 30 \mul/pocillo de ácido
sulfúrico 3M. Se realizó la lectura de la placa a 490 nm con un
lector para la prueba ELISA. A fin de analizar la actividad de la
genoteca, cada grupo de la genoteca se añadió en competición con el
PlGFm utilizando un excedente molar de 1000 veces (1:1000, 1:2000
significa un excedente molar de 2000; 1:1500 significa un excedente
molar de 1500, etc.). Los resultados del examen se presentan en la
Tabla 5.
30 grupos de 900 distintos péptidos tetraméricos
se analizaron en relación con la posibilidad de interferir con el
enlace del PlGF2m con el VEGFR1m. Claramente, el grupo 4 de la tabla
5 (con D-Glu en la posición terminal) presenta una
actividad inhibidora cuando se compara con los dos anticuerpos anti
PlGF para interferir con el enlace (mAb de R&D y mAb de
fabricación propia) entre el PlGF2m y el VEGFR1m.
placa 1 | ||
OD 490 nm | ||
mPIGF 8 ng/ml | 100 | 0,993 |
mPIGF 5 ng/ml | 67,673716 | 0,672 |
R\amp{1}D mAb (1:5) | 51,0574018 | 0,507 |
1 D-Ala | 80,5639476 | 0,8 |
2 D-Asp | 75,52877009 | 0,75 |
3 D-Val | 80,5639476 | 0,8 |
4 D-Glu | 57,4018127 | 0,57 |
5 L-Cha | 87,6132931 | 0,87 |
6 D-Phe | 79,0533736 | 0,785 |
7 D-Thr | 83,5850957 | 0,83 |
8 D-Met | 84,592145 | 0,84 |
9 D-Cys(Acm) | 91,6414904 | 0,91 |
10 D-Lys | 88,8217523 | 0,882 |
11 D-Tyr | 90,6344411 | 0,9 |
12 D-Pro | 93,6555891 | 0,93 |
13 D-Leu | 95,367573 | 0,947 |
14 D-His | 107,75428 | 1,07 |
15 D-Gln | 101,711984 | 1,01 |
16 D-Trp | 101,711984 | 1,01 |
17 D-Arg | 105,740181 | 1,05 |
18 D-Asn | 106,747231 | 1,06 |
19 D-lle | 103,222558 | 1,025 |
20 D-Arg(Tos) | 103,323263 | 1,026 |
placa 2 | ||
OD 490 nm | ||
mPIGF 8 ng/ml | 100 | 0,991 |
mPIGF 5 ng/ml | 71,6448032 | 0,71 |
21 D-ser | 83,6528759 | 0,829 |
22 L-Cys(Acm) | 83,8546922 | 0,831 |
23 L-Cys(Bzl) | 84,7628658 | 0,84 |
24 L-Cys(p-MeBzl) | 89,3037336 | 0,885 |
25 L-Cys(tBu) | 92,0282543 | 0,912 |
26 L-Mt(O) | 83,9556004 | 0,832 |
27 L-Met(O2) | 78,6074672 | 0,779 |
28 L-Glu(a-Oall) | 92,244898 | 0,904 |
29 b-Ala | 100 | 0,98 |
30 Gly | 92,1428571 | 0,903 |
4 D-Glu 1:500 | 86,1884368 | 0,805 |
4 D-Glu 1:1000 | 59,1006424 | 0,552 |
4 D-Glu 1:1500 | 48,2869379 | 0,451 |
4 D-Glu 1:2000 | 39,9357602 | 0,373 |
2 D-Asp 1:500 | 89,9357602 | 0,84 |
2 D-Asp 1:1000 | 78,9079229 | 0,737 |
2 D-Asp 1:1500 | 78,0513919 | 0,729 |
2 D-Asp 1:2000 | 74,9464668 | 0,7 |
14 D-His 1:500 | 96,6809422 | 0,903 |
14 D-His 1:1000 | 101,391863 | 0,947 |
14 D-His 1:1500 | 100,535332 | 0,939 |
14 D-His 1:2000 | 96,8950749 | 0,905 |
El análisis morfométrico de la angiogénesis
miocárdica, renal y retinal en ratones recién nacidos se realizó
tal como se ha descrito (Carmeliet P. et al., 1999, Nat
Med 5, 495-502). Análisis en matrigel: El
crecimiento de capilares hacia el interior en matrigel se realizó
tal como se ha descrito (Passaniti A. et al., 1992, Lab
Invest 67, 519-528). Brevemente, se inyectaron
por vía subcutánea 500 \mul de matrigel helado conteniendo
heparina (300 \mug/ml) y VEGF (100 ng/ml) o factor básico de
crecimiento de los fibroblastos (bFGF; 100 ng/ml). Después de 7
días, el sedimento de matrigel con los vasos recién formados se
diseccionó para analizar la vascularización reciente. Se homogeneizó
una parte a fin de determinar el contenido en hemoglobina
determinado utilizando el reactivo de Drabkin (Sigma, S. Quentin
Fallavier, Francia), mientras que la otra parte se fijó en
paraformaldehído al 1% para su análisis histológico. Modelo
ES-tumor: En la formación de tumores obtenidos a
partir de embriocitos indiferenciados (ES), se inyectaron por vía
subcutánea 5 x 10^{6} células de ES en ratones Nu/Nu
PIGF^{+/+} o en ratones Nu/Nu PIGF^{-/-}, obtenidos
mediante entrecruzamiento de ratones Nu/Nu PIGF^{+/-}, tal
como se ha descrito (Carmeliet P. et al., 1998,
Nature 394, 485-490). Se determinaron
cuantitativamente las densidades vasculares al contar el número de
cordones endoteliales y capilares (diámetro < 8 \mum), vasos de
tamaño medio (diámetro de 10 a 25 \mum) o vasos grandes (diámetro
> 30 \mum) por campo (1,2 mm^{2}) en un número de campos
ópticos escogidos aleatoriamente comprendido entre 6 y 8 en de 3 a
5 secciones adyacentes (separadas 320 \mum) por tumor utilizando
el sistema de formación de imágenes Quantimet Q600. Modelo de
retina isquémica: Se provocó la isquemia retinal disponiendo los
ratones recién nacidos P7 en una jaula con oxígeno hiperbárico (80%)
durante 5 días, después de los cuales se devolvieron a unas
condiciones de aire normal durante 5 días más, tal como se ha
descrito (Smith, L. E. et al., 1994, Invest Ophtalmol Vis
Sci 35, 101-111). La angiografía fluorescente
arterial de la retina y el recuento de células endoteliales en las
secciones transversales de la retina se determinaron tal como se ha
publicado (Hammes H. P. et al., 1996 Nat Med 2, 529
-533). La dilatación venosa y la tortuosidad arterial se
determinaron semicuantitativamente en una escala comprendida entre 0
y 3. Modelos de heridas: La reestructuración vascular durante
la curación de heridas en la piel se analizó durante los 4 días
posteriores a la producción de una herida en la piel de 10 mm de
profundidad en la espalda del ratón, tal como se ha descrito (Frank
S. et al., 1995 J. Biol Chem, 270,
12607-12613). La curación de las heridas se evaluó
mediante determinaciones diarias de la anchura de la herida.
Hipertensión pulmonar: Se dispusieron unos ratones adultos
durante 4 semanas en una cámara hermética sometida a hipoxia
normobárica (FiO_{2} 10%), tal como se ha descrito (Hales C. A.
et al., 1983 Am Rev Respir Dis 128,
747-751). Después de 28 días los ratones se
utilizaron para determinar su hematocrito, empleando un contador
celular automático (sistema Abbott Cell-Dyn 1330,
Abbott Park, IL) y realizar un análisis histológico. La presión en
el ventrículo derecho (RVP) se determinó en ratones anestesiados y
ventilados (pentobarbital sódico, 60 mg/kg, i. p.) mediante punción
transtorácica utilizando micromanómetros de alta fidelidad (Millar)
después de la inhalación de una mezcla gaseosa que contenía un 20%
de O_{2} o un 7% de O_{2}. Para el análisis histológico, los
ratones se sometieron a perfusión de paraformaldehído en una
disolución amortiguadora del pH de fosfato al 1% a una presión de
100 cm de H_{2}O vía el corazón y a una presión de 30 cm de
H_{2}O a través de la tráquea. La visualización de las láminas
elásticas internas (IEL) y de las láminas elásticas externas (EEL)
se alcanzó utilizando la coloración de elastina de Hart. La
reestructuración vascular pulmonar provocada por la hipoxia se
valoró al contar el número de vasos periféricos sin muscularizar
(únicamente IEL), y parcialmente muscularizados (IEL más EEL
incompletas) o totalmente muscularizadas (IEL más EEL completas)
(señalados en las estructuras de las vías respiratorias distales a
los bronquiolos terminales) por 100 alvéolos en campos que contenían
5 x 500 alvéolos (Hales C. A. et al., 1983, Am Rev Respir
Dis 128, 747-751).
Reacción de Arrthus (formación de edemas
provocados por alérgenos en la piel) (Casals - Stenzel J. et
al., 1987, Inmunopharmacology 13,
177-183): se sensibilizaron los ratones mediante la
inyección intraperitoneal (i. p.) de disolución salina (1 ml/kg) que
contenía ovoalbúmina (40 \mug/kg; Sigma, St. Louis, MO) y
Al(OH)_{3} (0,2 mg/mi; añadidos a la disolución de
antígeno 1 h antes de la inyección) en los días 0 y 2. Se
determinaron cuantitativamente las pérdidas vasculares 14 días
después de la presensibilización al determinar la cantidad de
seroalbúmina bovina (BSA) 1251 y azul de Evans inyectados,
acumulándose en la zona cutánea de la inyección. Por lo tanto, se
afeitó el pelaje de la piel dorsal de los ratones anestesiados y se
inyectaron por vía i. v. 1,5 \muCi/kg de BSA-1251
(2,8 \muCi/\mug; NEN-Dupont, Francia) mezclados
con una disolución del colorante azul de Evans en disolución salina
(15 mg/kg). Diez minutos más tarde se inyectó ovoalbúmina (100
ng/zona) en 4 zonas intradérmicas. Después de 60 minutos, se
determinó cuantitativamente el grado de pérdidas vasculares: (i)
determinando el diámetro de la mácula edematosa (visualizada por su
coloración) utilizando un micrómetro; y (ii) determinando la
cantidad de proteínas plasmáticas extravasadas en cada zona cutánea
(expresadas como \mul de plasma extravasado) después de normalizar
los 1251-cpm en la piel (10 mm de punción) para el
1251-cpm en 1 \mul de plasma. Análisis de Miles:
se analizó la permeabilidad vascular utilizando el análisis de Miles
(McClure N., 1994 J Pharmacol Toxicol Methods). Brevemente,
se afeitaron los ratones, se les inyectó 50 \mul de una disolución
que contenía azul de Evans al 0,5% en una disolución salina 45
minutos antes de la inyección intradérmica de 20 \mul de
disolución salina amortiguadora de fosfato (PBS) que contenía 1, 3 ó
10 ng de VEGF_{165} humana recombinante; se tomaron fotografía 45
minutos más tarde. Curación de la piel: A continuación de afeitar,
se realizó una incisión normalizada en la piel de 15 mm de
profundidad en la espalda de los ratones anestesiados, procediendo
con cuidado a fin de no dañar el músculo subyacente. La
extravasación de la BSA-1251 (expresada como g de
plasma/g de tejido/minuto) se determinó tal como se ha descrito
(Tritón R. G. et al., 1999, Invest Ophtalmol Vis Sci
40, 689-696).
Cultivo de células musculares lisas y
endoteliales: A fin de obtener células endoteliales capilares de
ratón, se inyectaron los ratones anestesiados por vía s. c. con 500
mu\l de matrigel helado que contenía bFGF (100 ng/ml) y heparina
(100\mug/ml). Después de 7 días, se diseccionó el sedimento de
matrigel y se dispersó enzimáticamente utilizando colagenasa de tipo
II al 0,1% (Sigma, St. Louis, MO). Las células endoteliales de ratón
se cultivaron siguiendo el procedimiento habitual en matraces T75
recubiertos con gelatina al 0,1% en medio M131 enriquecido con MVGS
al 5% (Gibco-BRL). Las células musculares lisas de
la aorta del ratón se sembraron y se cultivaron tal como se ha
descrito (Herbert J. M. et al., 1997, FEBS Lett 413,
401-404). Antes de la estimulación, se dejó las
células sin alimento en un medio con suero al 0,5% durante 24 h,
después de las cuales se estimularon las células con VEGF_{165}
humano y/o PlGF murino, o bFGF (todos obtenidos en R&D,
Abingdon, UK) durante 24 h antes de analizar el número total de
células Proliferación) o el número de células migradas después de la
realización de la herida (migración).
Se ha sintetizado una genoteca tetramérica
utilizando aminoácidos obtenidos con
9-fluorenilmetoxicarbonilo
(Fmoc) disponible comercialmente (pureza > 99%). Se listan todos los derivados en la Tabla 6 junto con los números de catálogo y los nombres de la compañía (proveedora) de la que se han adquirido.
(Fmoc) disponible comercialmente (pureza > 99%). Se listan todos los derivados en la Tabla 6 junto con los números de catálogo y los nombres de la compañía (proveedora) de la que se han adquirido.
Número | Código de | Monómero | Derivado protegido | Proveedor | Número de |
3 letras del | catálogo | ||||
monómero | |||||
1 | D-Ala | D-Alanina | N\alpha-Fmoc-D-Alanina | Chem-Impex Intl | 02372 |
2 | D-Asp | Ácido D-aspártico | N\alpha-Fmoc - Ácido D- | Chem-Impex Intl | 02478 |
aspártico (éster t-butílico) | |||||
3 | D-Val | D-Valina | N\alpha-Fmoc-D-Valina | Chem-Impex Intl | 02471 |
4 | D-Glu | Ácido D- | N\alpha-Fmoc - Ácido D- | Chem-Impex Intl | 02479 |
glutámico | glutámico (éster t- | ||||
butílico) | |||||
5 | L-Cha | L- Ciclohexilalanina | N\alpha-Fmoc-L- | Sygena | FC-01-003- |
Ciclohexilalanina | 117 | ||||
6 | D-Phe | D-Fenilalanina | N\alpha-Fmoc-D-Fenilalanina | Novabiochem | 04-13-1030 |
7 | D-Thr | D-Treonina | N\alpha-Fmoc-D-Treonina | Chem-Impex Intl | 02483 |
(éter O-t-butílico) | |||||
8 | D-Met | D-Metionina | N\alpha-Fmoc-D-Metionina | Novabiochem | 04-13-1003 |
9 | D-Cys | D-Cisteína(S- | N\alpha-Fmoc-D-Cisteína(S- | Novabiochem | 04-13-1054 |
(Acm) | acetamidometil) | acetamidometil) | |||
10 | D-Lys | D-Lisina | N\alpha-Fmoc-D-Lisina(n^{\varepsilon}-t- | Alexis | 104-041- |
butiloxicarbonilo) | G005 | ||||
11 | D-Tyr | D-Tirosina | N\alpha-Fmoc-D-Tirosina | Chem-Impex Intl | 02465 |
(éter O-t-butílico) | |||||
12 | D-Pro | D-Prolina | N\alpha-Fmoc-D-Prolina | Novabiochem | 04-13-1031 |
13 | D-Leu | D-Leucina | N\alpha-Fmoc-D-Leucina | Chem-Impex Intl | 02427 |
14 | D-His | D-Histidina | N\alpha-Fmoc-D-Histidina | Alexis | 104-034- |
(N^{\Gamma}-tritilo) | G005 | ||||
15 | D-Gln | D-Glutamina | N\alpha-Fmoc-D-Glutamina | Novabiochem | 04-13-1056 |
(N-tritilo) | |||||
16 | D-Trp | D-Triptófano | N\alpha-Fmoc-D-Triptófano | Chem-Impex Intl | 02484 |
(N^{in}-t-butiloxicarbonilo) | |||||
17 | D-Arg | D-Arginina | N\alpha-Fmoc-D-Arginina(N^{\Gamma}- | Alexis | 104-113- |
pentametilcroma n) | G005 | ||||
18 | D-Asn | D-Asparagina | N\alpha-Fmoc-D-Asparagina | Chem-Impex Intl | 02477 |
(N-tritilo) |
Número | Código de | Monómero | Derivado protegido | Proveedor | Número de |
3 letras del | catálogo | ||||
monómero | |||||
19 | D-lle | D-Isoleucina | N\alpha-Fmoc-D-Isoleucina | Chem-Impex Intl | 03448 |
20 | D-Arg(Tos) | D-Arginina(N^{\Gamma}- | N\alpha-Fmoc-D-Arginina | Chem-Impex Intl | 02382 |
tosilo) | (N^{\Gamma}-tosilo) | ||||
21 | D-Ser | D-Serina | N\alpha-Fmoc-D-Serina(éter | Alexis | 104-066- |
O-t-butílico) | G005 | ||||
22 | L-Cys | L-Cisteína(S- | N\alpha-Fmoc-L-Cisteína(S- | Chem-Impex Intl | 02396 |
(Acm) | acetamidometil) | acetamidometil) | |||
23 | L-Cys(Bzl) | L-Cisteína(S- | N\alpha-Fmoc-L-Cisteína(S- | Novabiochem | 04-12-1015 |
bencilo) | bencilo) | ||||
24 | L-Cys(p- | L-Cisteína(S-p- | N\alpha-Fmoc-L-Cisteína(S- | Chem-Impex Intl | 02399 |
MeBzl) | metil-bencilo) | p-metoxi-bencilo) | |||
25 | L-Cys(tBtu) | L-Cisteína(S- | N\alpha-Fmoc-L-Cisteína(S- | Novabiochem | 04-12-1016 |
terc-butilo) | terc-butilo) | ||||
26 | L-Met(O) | L-Metionina | N\alpha-Fmoc-L-Metionina | Novabiochem | 04-12-1112 |
sulfona | sulfota | ||||
27 | L-Met(O)_{2} | L-Metionina | N\alpha-Fmoc-L-Metionina | Novabiochem | 04-12-1113 |
sulfóxido | sulfóxido | ||||
28 | L-Glu(\beta- | Ácido L-glutámico | N\alpha-Fmoc-Ácido L- | Novabiochem | 04-12-1158 |
OAll) | (\beta-alilo) | glutámico (\beta-alilo) | |||
29 | \beta-Ala | \beta-Alanina | N\alpha-Fmoc-\beta-Alanina | Chem-Impex Intl | 02374 |
30 | Gly | Glicina | N\alpha-Fmoc-Glicina | Chem-Impex Intl | 02416 |
La genoteca se ha construido en la siguiente
estructura (Fassina G. et al., (1996) J. Mol. Recog.
9, 564, Marino M. et al., Nat. Biotechn. (1997) 18,
735):
en la que G representa el
aminoácido glicina y K representa el aminoácido
L-Lisina alcanzándose tres niveles aleatorios al
aplicar el método de juntar i dividir (Furka A. et al.,
(1991) Int. J. Pept. Protein. Res. 37, 487, Lam K. S. (1991)
Nature 354, 82). El número total de péptidos generados
(N_{t}) puede calcularse mediante la siguiente
fórmula:
N_{t} =
B^{X}
En la que B es el número de monómeros utilizados
(30) y x es el número de aleatorización (3).
La Estructura inicial se ha preparado mediante
síntesis manual en fase sólida iniciándose a partir de 419 mg de
resinas de poliestireno 4-hidroximetilfenoxiacético
(PS-HMP) derivadas de la Fmoc-Gly
(sustitución 0,75 mmol/g, Novabiochem nº de cat.
04-12-2053), correspondiendo a 314
\mumol de glicina en la que se han realizado dos acoplamientos
posteriores con
Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH
(Chem- Impex Intl. nº de cat. 01578). Se ha dispuesto la resina en
un cartucho de 35 ml de polipropileno dotado de un tabique de
polipropileno (AllTech, nº de cat. 210425) y se ha lavado 3 veces
con 4,0 ml de N,N dimetilformamida (DMF, grado de síntesis
peptídica, Labscan nº de cat. H6533). A fin de eliminar la
protección de Fmoc, la resina se ha tratado durante 15 minutos con
5,0 ml de piperidina al 20% (BIOSOLVE LTD nº de cat. 16183301) en
DMF y a continuación se ha lavado 3 veces con 4,0 ml de DMF. Para
enlazar la primera lisina, se han disuelto 1,5 mmol de
Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH
(0,87 g) en 6,0 ml de DMF y a continuación se ha activado añadiendo
3,0 ml de una disolución 0,5 M de tetrafluoborato de
2-(1H-Benzotriazol-il)-1,1,3,3,-tetrametil-uranio
(TBTU, > 99%, Chem-Impex Intl, nº de cat. 02056)
y 1-hidroxibenzotriazol (HOBt,
SIGMA-ALDRICH, nº de cat. H2006) en DMF y 3,0 ml de
una disolución 1 M de Diisopropiletilamina (DIEA,
SIGMA-ALDRICH, nº de cat. D-3887) en
DMF. Después de 4 minutos agitando a temperatura ambiente se ha
transferido la disolución a la resina y se ha agitado durante 30
minutos. A fin de eliminar el excedente de aminoácidos se ha lavado
la resina 3 veces con 4,0 ml de DMF. La desprotección de los grupos
Fmoc-lisina se ha logrado tratando la resina durante
15 minutos con 5,0 ml de piperidina al 20% en DMF y lavando 3 veces
con 4,0 ml de DMF para eliminar el excedente de reactivos. Para
enlazar la segunda lisina, se han disuelto 3,0 mmol de
Fmoc-L-Lys (Fmoc)-OH
(1,77 g) en 6,0 ml de DMF y a continuación se ha activado añadiendo
6,0 ml de una disolución 0,5 M de TBTU y HOBt en DMF y 6,0 ml 1 de
DIEA en DMF. Después de 4 minutos agitando a temperatura ambiente se
ha transferido la disolución a la resina y se ha agitado durante 30
minutos. Se ha lavado la resina 3 veces con 4,0 ml de DMF. Los
grupos finales Fmoc se han eliminado mediante el tratamiento con
10,0 ml de piperidina al 20% en DMF durante 15 minutos. A
continuación se ha sometido la resina a los siguientes lavados:
Disolvente | Nº de lavados | Volumen (ml) |
DMF | 3 | 4,0 |
MeOH* | 3 | 4,0 |
Et_{2}O** | 3 | 4,0 |
*Metanol (MeOH, LabScan, nº de cat A3513) | ||
**Éter etílico (Et_{2}0, LabScan, nº de cat A3509) |
Se ha secado la resina aplicando una corriente
de nitrógeno y se ha pesado. El peso final de la resina resultó
de
442 mg.
442 mg.
La genoteca se ha generado aplicando el
siguiente procedimiento:
La resina se ha transferido a un tubo graduado
de 50 ml de polipropileno y se han añadido 35 ml de DFM:DCM (2:3)
(DCM, diclorometano, LabScan, nº de cat. H6508L). La suspensión se
ha mezclado completamente y se han dispensado fracciones de 1,0 ml
en 30 jeringas de polipropileno (3 ml) dotadas de un tabique de
separación en la parte inferior (Shimadzu Corp nº de cat
292-05250-02). El volumen restante
de la suspensión se ha diluido hasta 35 ml con DMF: DCM (2:3) y las
fracciones de 1,0 ml se han dispensado de nuevo en las jeringas. El
tubo graduado se ha llenado otra vez con 30 ml y los alícuotas de
1,0 ml se han distribuido en las jeringas. Las jeringas se han
secado al vacío desde el fondo y las resinas se han lavado una vez
con 1,0 ml de DMF. Las jeringas, marcadas con números del 1 al 30,
contenían una fracción equivalente de resina correspondiente a
aproximadamente 10 \mumol de la estructura (40 \mumol de grupos
NH_{2}).
Se han preparado disoluciones iniciales 0,75 M
en DMF de 30 aminoácidos (listados en la Tabla 5) y se han
almacenado a 4ºC hasta su utilización. Para realizar los
acoplamientos y la desprotección de las subgenotecas, desde la
presente etapa en adelante, se ha utilizado un sintetizador
peptídico de 8 canales PSSM8 (Shimadzu corp.). Se han dispuesto las
jeringas en el sintetizador y se han dispensado 267 \mul (200
\mumol) de aminoácido en tubos de polipropileno de 2 ml
(Eppendorf, nº de cat. 24299). La máquina realiza las activaciones,
las acilaciones, las desprotecciones y los lavados automáticamente.
Las activaciones se han realizado utilizando 400 \mul de una
disolución 0,5 M en DMF de TBTU y HOBt más 400 \mul de una
disolución 1 M en DMF de DIEA. Las acilaciones se han llevado a cabo
durante 30 minutos mezclando las suspensiones haciendo burbujear
nitrógeno desde el extremo inferior de las jeringas. Se ha realizado
la desprotección durante 15 minutos con 0,9 ml de piperidina al 20%
y DMF, mientras que los lavados se han realizado con 0,9 ml de DMF
(3 veces, 2 minutos).
En la primera serie se han acoplado los
aminoácidos 1 a 8, en la segunda serie los aminoácidos 9 a 16, en la
tercera serie los aminoácidos 17 a 24 y en la serie final los
aminoácidos 25 a 30.
Se han añadido 500 \mul de DMF:DCM (2:3) a
cada jeringa y se han suspendido las resinas haciéndolas girar
suavemente. Se han extraído las suspensiones de las jeringas, se han
recogido en un tubo de 50 ml de polipropileno (graduado) y se han
mezclado completamente agitando enérgicamente. Después de la
adición de DMF:DCM (2:3) hasta un volumen final de aproximadamente
35 ml, los alícuotas de 1,0 ml de la suspensión se han redispensado
en las 30 jeringas, repitiendo las operaciones descritas en la etapa
1 ("División de la resina en 30 alícuotas iguales"). Al final
las resina se han lavado una vez con 1,0 ml de DMF.
- Se ha repetido todo el procedimiento descrito en la etapa 2 ("Acoplamiento del primer residuo aleatorio").
- Se han repetido todas las operaciones descritas en la etapa 3 ("Mezcla y reescisión de las resinas").
- Se ha repetido todo el procedimiento descrito en la etapa 2 ("Acoplamiento del primer residuo aleatorio").
Se han lavado 3 veces las resinas con 1 ml de
DCM, 3 veces con 1 ml de MeOH, y 2 veces con 1 ml de Et_{2}O. A
continuación se han secado las resinas al vacío.
Se han preparado una nueva mezcla con 30 ml de
TFA-H_{2}O-TIS (100:5:5; v/v/v)
(TIS, triisopropilsilano, SIGMA-ALDRICH, nº de cat.
23.378-1) y se han añadido 800 \mul a cada
jeringa. Después de mezclar con una agitadora vorticial durante 3
horas, se han filtrado las resina recogiendo directamente la
disolución acídica en tubos de 15 ml de polipropileno (etiquetados
con números del 1 al 30) conteniendo 5 ml de Et_{2}O frío. Los
precipitados blancos se han separado por centrifugación a 3000 rpm
durante 10 minutos y se desechan los disolventes orgánicos. Los
precipitados se han lavado una vez con 5 ml de Et_{2}O frío y
después de la centrifugación se han disuelto en 2,0 ml de H_{2}O,
CH_{3}CN y TFA en una proporción de 50:50:1 y se han liofilizado.
Se han preparado 10 mg/ml de disoluciones iniciales de las genotecas
peptídicas en DMSO y se han almacenado en viales cerrados
herméticamente a -80ºC.
Claims (6)
1. Utilización de un inhibidor de la
angiogénesis que consiste en un anticuerpo o un fragmento del mismo
que se une específicamente al factor de crecimiento placentario
destinado a la preparación de un medicamento para el tratamiento del
cáncer, de enfermedades oculares, de la hipertensión pulmonar, de
las inflamaciones y los edemas.
2. Utilización según la reivindicación 1, en el
que dicha enfermedad ocular consiste en una retinopatía o en un
trastorno intraocular coroideo.
3. Utilización según la reivindicación 1, en el
que dicha enfermedad ocular consiste en una retinopatía
isquémica.
4. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho anticuerpo consiste en un
anticuerpo monoclonal murino.
5. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho anticuerpo consiste en un
anticuerpo humanizado.
6. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho fragmento consiste en un
fragmento Fab, F(ab)'2 o scFv.
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