DE102010013555A1

DE102010013555A1 - Verwendung der Biomarker sFlt und PIGF in der Diagnose und Therapie der pulmonalen Hypertonie

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Publication number: DE102010013555A1
Application number: DE102010013555A
Authority: DE
Inventors: Dr. Nef Holger; Prof. Dr. Ghofrani Ardeshir; Prof. Dr. Hamm Christian; Prof. Dr. Grimminger Friedrich; Dr. Möllmann Helge; Prof. Dr. Schermuly Ralf; Prof. Dr. Zeiher Andreas; Prof. Dr. Dimmeler Stefanie
Original assignee: Justus Liebig Universitaet Giessen; Goethe Universitaet Frankfurt am Main
Current assignee: Justus Liebig Universitaet Giessen; Goethe Universitaet Frankfurt am Main
Priority date: 2010-03-31
Filing date: 2010-03-31
Publication date: 2011-10-06
Also published as: WO2011121075A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose, Früherkennung und/oder Risikostratifizierung einer pulmonalen Hypertonie bei einem Subjekt und/oder Überwachung einer Therapie einer solchen Erkrankung bei einem Subjekt, umfassend das Quantifizieren mindestens einer Komponente des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor(VEGF)-Signalwegs als Biomarker, insbesondere das Quantifizieren der Biomarker soluble Fms-like tyrosine kinase-1 (sFlt) und/oder placental growth factor (PlGF). Weiterhin betrifft die Erfindung einen diagnostischen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, und seine Verwendung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose, Früherkennung und/oder Risikostratifizierung einer pulmonalen Hypertonie bei einem Subjekt und/oder Überwachung einer Therapie einer solchen Erkrankung bei einem Subjekt, umfassend das Quantifizieren mindestens einer Komponente des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor(VEGF)-Signalwegs als Biomarker, insbesondere das Quantifizieren der Biomarker soluble Fms-like tyrosine kinase-1 (sFlt) und/oder placental growth factor (PlGF). Weiterhin betrifft die Erfindung einen diagnostischen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, und seine Verwendung.
Beschreibung
Die pulmonale Hypertonie (PH), ist eine schwerwiegende progressive Erkrankung, die unbehandelt innerhalb weniger Jahre zum Tode führt. Klinische Merkmale umfassen einen zunehmenden Anstieg des Blutdrucks im Lungenkreislauf, mit einer darauf folgenden Rechtsherzinsuffizienz. Eine Diagnose einer pulmonalen Hypertonie wird klassisch durch direkte Messung des pulmonal-arteriellen Drucks gestellt. Eine pulmonal-arterielle Druckerhöhung liegt vor, wenn der pulmonal-arterielle Mitteldruck 20 mmHg („Borderlinehypertonie”) bzw. 25 mmHg überschreitet (manifeste pulmonale Hypertonie). Unter dem zunehmenden Gefäßwiderstand nimmt die Leistung des Herzens kontinuierlich ab.
Pathophysiologisch führt bei einer pulmonal-arteriellen Hypertonie (PAH) die Kombination aus muskulärer Gefäßengstellung (Vasokonstriktion), Hypertrophie und Hyperplasie der Gefäßwandzellen (Gefäßremodelling) und in-situ Thrombosierung zu einer Verengung der Lungenstrombahn. Als früheste Störung wird eine endotheliale Dysfunktion in den Gefäßen vermutet. Auslöser dieser pathophysiologischen Prozesse können inflammatorische Stimuli, ein Ungleichgewicht vasoaktiver Mediatoren (z. B. verminderte Produktion von vasodilatierenden und antiproliferativen Mediatoren wie Prostacyclin und Stickstoffmonoxid (NO) sowie eine Erhöhung des Endothelin-1 Spiegels), (auto)-immunologische Prozesse oder chronischer Sauerstoffmangel sein. Von der Gruppe der PAH abzugrenzen sind pulmonalvenöse Hypertonien aufgrund von Linksherzerkrankungen, pulmonale Hypertonien assoziiert mit Lungenerkrankungen und/oder Hypoxie, sowie chronisch thrombo-embolische pulmonale Hypertonien.
Die einleitenden Symptome der PH sind unspezifisch. Zunehmende Belastungsdyspnoe, Leistungsabfall, Müdigkeit und Abgeschlagenheit sind typisch. Später kommen Zeichen der Rechtsherzinsuffizienz, wie Halsvenenstauung und periphere Ödeme, aber auch Zyanose und Angina pectoris hinzu. Hochverdächtig sind Synkopen bei oder nach körperlicher Belastung. Bei unklarer Dyspnoe und Leistungsabfall sollte eine latente oder manifeste PH ausgeschlossen werden. Die Patienten leiden unter stark reduzierter körperlicher Leistungsfähigkeit und Kreislaufstörungen, bis hin zum Versagen der rechten Herzseite, welches schließlich zum Tode des Patienten führt.
Therapeutische Maßnahmen umfassen derzeit zum einen die schnellstmögliche Beseitigung der zur pulmonalen Hypertonie führenden Vorerkrankung. Geschieht dies zu spät, so dass sich bereits eine fixierte Gefäßverengung eingestellt hat, ist nur noch eine palliative Behandlung, oder eine Herz-Lungen Transplantation möglich. Im Rahmen der PAH bestehen derzeit beschränkte therapeutische Optionen, welche nicht kurativ sind. Neben allgemeinen Massnahmen, wie einer Langzeitsauerstofftherapie oder Antikoagulation, wurden in den letzten Jahren verschiedene neue therapeutische Ansätze verwirklicht (Gabe von Endothelinrezeptorantagonisten, Phosphodiesterase-5 Inhibitoren oder Prostazyklin-Analoga), die eine Verbesserung der Leistungsfähigkeit, der Lebensqualität und des Überlebens ermöglichen.
Die retrospektiven Daten der letzten 5 Jahre aus den französischen und irischen Patientenregistern zeigen allerdings, dass die mittlere Überlebenszeit aller neu diagnostizierten PAH Patienten, auch bei Verfügbarkeit spezifischer Medikamente, 4 Jahre nicht übersteigt. Das stellt etwa eine Verdoppelung der mittleren Überlebenszeit im Vergleich zum historischen US-amerikanischen Register aus Zeiten fehlender spezifischer Therapien dar. Die Mortalität der Patienten in den Nachbeobachtungsphasen randomisierter Zulassungsstudien lag innerhalb der ersten 2 Jahre fortgesetzter Therapie meist unter 10%. Diese Diskrepanz spiegelt offensichtlich eine Selektion stabiler Patienten bei der Studienrekrutierung wider.
Die Diagnosestellung in einem frühen Krankheitsstadium führt zu einer längeren Überlebenszeit unter Therapie im Vergleich zu einer Erstdiagnose in fortgeschrittenen Stadien der Erkrankung. Selbst Patienten in funktionellem NYHA Stadium II (Klassifikation der New York Heart Association) haben, wie die kürzlich durchgeführte EARLY Studie zeigte, bereits meist eine mittelschwere pulmonale Hypertonie, die ohne Therapie rasch in NYHA Stadien III–IV übergeht. Eine frühzeitige Therapie führte hier zur Stabilisierung der Patienten. Voraussetzung hierfür ist eine rechtzeitige Erkennung früher Krankheitssignale.
Eine frühzeitige Diagnose ist folglich für eine erfolgreiche Behandlung der Erkrankung unerlässlich. Die genaueste Messung des pulmonal-arteriellen Druckes ist nur über die invasive Messung mittels eines Rechtsherzkatheters möglich. Allerdings sind hiermit nicht unerhebliche Risiken verbunden. Eine nicht-invasive Möglichkeit der Messung des pulmonalarteriellen Druckes ist durch eine echokardiographische Untersuchung zu erreichen. Jedoch ist die Echokardiographie gerade in den Niedergelassenen-Bereichen der ärztlichen Versorgung nur beschränkt verfügbar. Zusätzlich liefert ein Röntgenbild des Thorax weitere Hinweise auf die Erkrankung. Der „6-Minuten-Gehtest” (6-MGT) wird bei Patienten angewendet, um Informationen über die körperliche Leistungsfähigkeit zu erhalten. Gemessen wird die in 6 Minuten gehend zurück gelegte Strecke.
Von besonderem Wert sind deshalb sog. Biomarker, die mögliche Hinweise auf das Vorliegen einer PH liefern können. Allerdings kann derzeit nur auf die Bestimmung des B-type natriuretic peptide (BNP) zurückgegriffen werden. BNP ist ein sehr früh beschriebener Marker in der PH, für den hinsichtlich diagnostischer und prognostischer Wertigkeit signifikante Daten dokumentiert werden konnten (Munagala VK, Burnett JC, Jr., and Redfield MM, The natriuretic peptides in cardiovascular medicine. Curr Probl Cardiol, 2004. 29(12): 707–69). Allerdings ist die Expression und Bildung von BNP auf das Myokard beschränkt, so dass eine Erkennung der pulmonal-arteriellen Umgestaltung nur nach nachfolgender Schädigung des Myokards, vor allem des rechten Ventrikels möglich ist.
Frühere Untersuchungen konnten zeigen, dass der VEGF-Signalweg im Pathomechanismus von hypoxischen Zuständen, beispielsweise in einer Präeklampsie eine wichtige diagnostische und prognostische Rolle spielt. Aus der Patentanmeldung US 2004/126828 (Karumanchi et al.) ist ein Verfahren zur Diagnose von Präeklampsie oder Eklampsie bekannt, welches die Messung der Konzentration von sFlt-1, VEGF oder PlGF umfasst, wobei die für die drei Marker erhaltenen Ergebnisse miteinander in Beziehung gesetzt werden, um einen so genannten „angiogenen Index” zu ermitteln. Allerdings liegt dem Krankheitsbild Präeklampsie bzw. Eklampsie eine völlig andere Ätiologie als der pulmonalen Hypertonie zugrunde.
Bei vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren handelt es sich um eine Familie von sekretierten Polypeptiden, die durch eine Gruppe von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen in Endothelzellen die Bildung von Blutgefäßen fördern. Die Familie umfasst eine Reihe von verschiedenen VEGF Varianten, insbesondere VEGF-A bis D und den plazentalen Wachstumsfaktor (PlGF). Zur Signalweiterleitung binden unterschiedliche VEGFs an unterschiedliche VEGF-Rezeptoren, beispielsweise bindet VEGF-A an VEGFR-1 (Flt-1) und VEGFR-2.
Flt-1 bindet außer VEGF auch dessen homologen Faktor PlGF und tritt in zwei Formen auf: einerseits als membrangebundene Rezeptortyrosinkinase (Flt-1), welche die angiogenen Signale ins Zellinnere überträgt, und andererseits als eine lösliche Ektodomäne (soluble Flt-1, sFlt-1), deren Aufgabe es ist, die freien Faktoren PlGF oder VEGF in der Zirkulation abzufangen. Da der löslichen Form von Flt-1 eine zytosolische Domäne fehlt, ist die Funktion von sFlt-1 darauf beschränkt, die Menge an zirkulierendem PlGF oder VEGF, die als freie Faktoren zur Aktivierung der membrangebundenen Rezeptoren Flt-1 und Flk-1 (fötale Leberkinase-1) verfügbar sind, zu regulieren.
Aus dem Dokument US 2004/126828 geht hervor, dass eine erhöhte Konzentration von sFlt-1 und eine erniedrigte Konzentration von VEGF als diagnostischer Indikator einer Präeklampsie dienen. Eine bestehende Präeklampsie oder ein erhebliches Risiko, eine solche zu entwickeln, ist festzustellen, wenn der angiogene Index, bestimmt nach der Formel [sFlt-1/VEGF + PlGF] > 20 beträgt, d. h. wenn die Konzentration von s-Flt-1 mehr als 20-mal so hoch ist, wie die von VEGF und PlGF zusammen. Ein sFlt-1-Serumspiegel > 2 ng/ml wird als positiver Indikator einer Präeklampsie angesehen.
Levine et al. befassen sich mit einer Studie an schwangeren Frauen mit Präeklampsie, die eine Messung der Konzentration von angiogenen Faktoren, nämlich sFlt-1, VEGF und PlGF, im Serum von Patientinnen im Vergleich zu Gesunden Frauen umfasst. Interessanterweise konnte festgestellt werden, dass in späteren Schwangerschaftsmonaten die Konzentrationen von sFlt-1 bei Präeklampsie zunahm, bei gleichzeitiger Abnahme der Konzentration von PlGF (Levine et al., 2004, N Engl J Med.).
Widmer et al. beschreibt eine Übersicht der Studien über Präeklampsie und sFlt und kommt zu dem Ergebnis, dass erhöhte Werte von sFlt bei niedrigen PlGF Konzentrationen im dritten Trimester der Schwangerschaft mit Präeklampsie, insbesondere mit schweren Fällen assoziiert sind (Widmer et al., Obstet Gynecol. 2007 Jan.)
In der WO 01/85796 werden Inhibitoren von PlGF sowie ein Verfahren zur Auffindung dieser Substanzen beschrieben. Die Erfindung basiert auf der Wirkung von PlGF als Faktor in der Angiogenese und Arteriogenese sowie auf der negativen Wirkung des Wachstumsfaktors in verschiedenen Erkrankungen, z. B. in der Tumorentstehung, bei inflammatorischen Erkrankungen und auch bei pulmonalem Bluthochdruck. Zwar beschreibt das Dokument die Verwendung der Inhibitoren, insbesondere eines Antikörpers, von PlGF zur Behandlung von pulmonalen Bluthochdruck bei unter Sauerstoffmangel gehaltenen Mäusen, die Verwendung von PlGF als Biomarker in der PH ist jedoch nicht beschrieben.
Eine Studie an Sichelzellenanämiepatienten hat gezeigt, dass eine erhöhte Konzentration von PlGF mit dem Auftreten der pulmonalen Hypertonie – hier eine Komplikation in Folge der Sichelzellenanämie – korreliert (Brittain et al. Blond 2010). Diese Korrelation konnte allerdings ausschließlich in Sichelzellenanämiepatienten nachgewiesen werden. Zudem liegt die Ursache der verstärkten Expression von PlGF in diesem speziellen Fall bei der Hämolyse, die verstärkt bei Sichelzellenanämie auftritt. Durch die Hämolyse wird eine erhöhte Erythropoietin Produktion ausgelöst, die erwiesenermaßen PlGF Expression fördert (Perelman et al, Blond 2003). Demnach handelt es sich hierbei um einen sehr speziellen Zusammenhang des Markers mit Sichelzellenanämie, der sich keinesfalls auf die pulmonale Hypertonie verallgemeinern lässt.
WO 06/045593 beschreibt die Verwendung von sFlt und PlGF als Marker bei der Diagnose und Risikostratifizierung koronarer Herzerkrankungen. Das Verfahren umfasst die Berechnung des Verhältnisses beider Marker, wobei ein Verhältnis von PlGF = hoch und sFlt = niedrig ein negatives Ereignis, zum Beispiel einen Myokardinfarkt und/oder Schlaganfall anzeigt.
Ausgehend vom Stand der Technik war es deshalb die Aufgabe der Erfindung, ein neues Verfahren zur Diagnose, Risikostratifizierung und insbesondere zur Früherkennung einer pulmonalen Hypotonie und zur Überwachung einer Therapie einer solchen Erkrankung zur Verfügung zu stellen, wobei das Verfahren auf einfach bestimmbare Biomarker basiert, um die Nachteile der im Stand der Technik bekannten Diagnoseverfahren, zum Beispiel der Rechtsherzechokardiographie, auszugleichen.
Gelöst wird die oben gestellte Aufgabe in einem ersten Aspekt durch ein Verfahren zur Diagnose, Früherkennung und/oder Risikostratifizierung einer pulmonalen Hypertonie bei einem Subjekt und/oder Überwachung einer Therapie einer solchen Erkrankung bei einem Subjekt, umfassend der Schritte

(a) zur Verfügung stellen einer Probe aus einem Subjekt,
(b) Quantifizieren mindestens eines Markers in genannter Probe, wobei der Marker ausgewählt wird aus einer Komponente des VEGF(vaskulär endotheler Wachstumsfaktor)-Signalwegs,
(c) gegebenenfalls Quantifizieren mindestens eines weiteren Markers, und
(d) Vergleich des/der für die zu untersuchende Probe erhaltenen Ergebnisse/s mit Referenzwerten und/oder den Werten aus einer Referenzprobe.

Bevorzugt ist hierbei das oben genannte Verfahren, wobei die zu untersuchende Probe in-vitro oder ex-vivo zur Verfügung gestellt wird. Insbesondere ist ein erfindungsgemäßes Verfahren ein in-vitro oder ex-vivo Verfahren.
Die Schritte (b) und (c) können nacheinander in dieser Reihenfolge, in umgekehrter Reihenfolge oder zeitgleich durchgeführt werden.
Der Begriff „zur Verfügung stellen” einer zu untersuchenden Probe, wie hier verwendet, umfasst ein Bereitstellen einer Probe, in der das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden kann. Dazu gehört beispielsweise die weitere Verarbeitung von durch Venenpunktion gewonnenem und mit Gerinnungshemmern, insbesondere EDTA, Heparin oder Citrat, behandeltem peripherem Blut zu Serum oder Plasma.
Die Begriffe „Biomarker” und „Marker” bezeichnen endogene Substanzen, z. B. Proteine oder mRNA Moleküle, die beispielsweise das Auftreten eines pathophysiologischen Ereignisses im einem Organismus anzeigen. Als Biomarker werden auch Protein/mRNA kodierende Gensequenzen verstanden. So kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung durch Bestimmung der Gensequenz eines Markers in einer Probe, oder der epigenetischen Veränderungen dieser Sequenz, auf die Menge und/oder Funktionalität von Proteinen/mRNA geschlossen werden.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft ”Diagnose” die Überprüfung, ob ein Subjekt an einer pulmonalen Hypertonie leidet. Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft ”Prognose” die Vorhersage der Wahrscheinlichkeit (in %) ob ein an einer pulmonalen Hypertonie leidendes Subjekt im Beobachtungszeitraum eine Verschlechterung des Krankheitsbildes oder Tod erleiden wird. Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft ”Stratifizierung der Therapie” die Ermittlung der geeigneten therapeutischen Behandlung für die pulmonale Hypertonie, die auftreten wird oder aufgetreten ist. Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft ”Überwachung der Therapie” die Kontrolle und, gegebenenfalls, ein Einstellen der therapeutischen Behandlung eines Subjekts. Im Kontext der vorliegenden Erfindung betrifft ”Therapeutische Behandlung” jede Behandlung, die möglicherweise den pathophysiologischen Zustand eines Individuums verbessert z. B. die Verabreichung von Pharmazeutika, insbesondere Endothelinrezeptorantagonisten, Phosphodiesterase-5 Inhibitoren oder Prostazyklin-Analoga, sowie chirurgische Behandlung (z. B. Herz-Lungen-Transplantation).
Weiter bevorzugt ist eine Ausführungsform des Verfahrens, wobei die zu untersuchende Probe ausgewählt wird aus der Gruppe beinhaltend Blut oder Fraktionen davon, insbesondere Blutplasma und Blutserum; und Gewebeproben, insbesondere histologische Gewebeproben wie histologische Schnitte, eine Suspension von Gewebezellen oder ein Gewebehomogenat.
Dabei muss davon ausgegangen werden, dass bei unterschiedlichen Probenspezies unterschiedliche Referenzwerte der Biomarker zur Feststellung einer pulmonalen Hypertonie verwendet werden. Es wird daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere bei Blutproben, Blutplasma oder Serum unterschieden ob die Probe zentral venöser Herkunft, beispielsweise gemischt venöses Blut aus der Lungenarterie, ist oder aus dem peripheren Blutkreislauf, beispielsweise der Cubitalvene entstammt. Bevorzugte Ausführungsformen des erfinderischen Verfahrens umfassen daher eine zu untersuchende Probe, wobei die Probe zentral venöses Blut ist oder peripheres Blut, insbesondere Blut aus der Cubitalvene, ist.
Erfindungsgemäß weiter bevorzugt ist das Subjekt des vorliegenden Verfahrens ein Säugetier, vorzugsweise ein Mensch.
Bevorzugt ist gemäß einer speziellen Ausführungsform ein Verfahren zur Diagnose, Früherkennung und/oder Risikostratifizierung einer pulmonalen Hypertonie bei einem Subjekt und/oder Überwachung einer Therapie einer solchen Erkrankung bei einem Subjekt der vorliegenden Erfindung, wobei die pulmonale Hypertonie eine pulmonal-arterielle Hypertonie (PAH) ist, aus der Gruppe bestehend aus idiopathische pulmonal-arterielle Hypertonie (IPAH), familiäre pulmonal-arterielle Hypertonie, assoziierte pulmonal-arterielle Hypertonie (APAH) und pulmonale veno-okklusive Erkrankung (PVO) und/oder pulmonal kapilläre Hämangiomatose (PCH); die pulmonale Hypertonie eine pulmonalvenöse Hypertonie in Verbindung mit einer Linksherzerkrankung ist; die pulmonale Hypertonie eine pulmonale Hypertonie in Assoziation mit Lungenerkrankungen und/oder Hypoxämie ist; oder die pulmonale Hypertonie eine chronisch thromboemlisch pulmonale Hypertonie (CTEPH) oder eine pulmonale Hypertonie mit unklaren und/oder multifaktoriellen Mechanismen ist.
Weiter bevorzugt ist ein Verfahren zur Diagnose, Früherkennung und/oder Risikostratifizierung einer pulmonalen Hypertonie bei einem Subjekt, wobei die pulmonale Hypertonie keine Komplikation ist, die in Zusammenhang mit einer Sichelzellenanämie auftritt.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst bevorzugt eine Komponente des VEGF(vaskulär endothelialer Wachstumsfaktor)-Signalwegs ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus VEGF, VEGFR, sFlt und PlGF, insbesondere ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Komponente des VEGF-Signalweg sFlt oder PlGF ist, vorzugsweise sFlt ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren das Quantifizieren eines weiteren Markers in Verfahrensschritt (c) der ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus BNP, VEGF, VEGFR, sFlt und PlGF. Insbesondere bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren, wobei die Markerkombination das Quantifizieren von sFlt und BNP, oder PlGF und BNP, oder weiter bevorzugt sFlt und PlGF umfasst. Darüber hinaus betrifft eine spezielle Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren, umfassend Quantifizieren der Marker sFlt und PlGF in Kombination mit dem Quantifizieren des Markers BNP.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das Quantifizieren des Markers mittels Bestimmung der Proteinkonzentration, der mRNA Konzentration, der DNA-Methylierung und/oder der Bestimmung des Vorhandenseins von „single nucleotide polymorphisms” (SNPs) durchgeführt, insbesondere bevorzugt ist dabei ein Verfahren gemäß der Erfindung, wobei das Bestimmen der Konzentration mittels eines immunologischen Verfahrens mittels an die Marker bindender Moleküle erfolgt.
Unter „Quantifizieren” soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Bestimmung der Expression eines Biomarkers/Markers in einer Probe verstanden werden. Erfindungsgemäß kann dies sowohl direkt über den Nachweis der in der Probe vorhandenen Marker-mRNA oder Marker-Proteine erfolgen, aber auch indirekt über die Analyse der für den Marker kodierenden DNA. So können Mutationen nachgewiesen werden, die innerhalb des Markergens die Expression eines funktionsunfähigen Proteins zur Folge haben, oder auch innerhalb der Promoter Region des Markers, mit der Folge einer Veränderten Kinetik seiner Transkription. Auch epigenetische Veränderungen innerhalb des Genlokus des Markers, insbesondere der nicht-translatierten Regionen (UTRs), haben Einfluss auf die Expression von Markergenen und können mittels des Fachmanns bekannten Techniken überprüft werden. Epigenetische Veränderungen umfassen zum Beispiel DNA Methylierung oder Histonmodifizierung; Nachweistechniken sind dem Fachmann zur Genüge bekannt und können ohne erfinderischen Aufwand für das vorliegende Verfahren angewandt werden.
Das „Quantifizieren” von PlGF und/oder sFlt-1 kann außer in einer Konzentrationsbestimmung, z. B. in Blutplasma oder -serum, auch in einer Bestimmung der Anzahl der Moleküle, z. B. in einem histologischen Gewebeschnitt, bestehen.
Das „Quantifizieren” kann erfindungsgemäß mittels Nachweis der transkribierten mRNA des zu bestimmenden Markers durchgeführt werden. Der Anteil der vorhandenen mRNA Moleküle des Markers wird dabei relativ zu einem internen Standart überprüft, der üblicherweise aus einem in allen Geweben gleichmäßig exprimierten „Housekeeping”-Gens ausgewählt wird. Alle dem Fachmann bekannten Methoden zur mRNA-Quantifizierung können für die vorliegende Erfindung verwendet werden. Beispielsweise kann die Bestimmung der relativen Anzahl an mRNA Molekülen in einer Probe in einer quantitativen Echtzeit PCR nachgewiesen werden. Weitere Verfahren zum Quantifizieren der mRNA-Expression der Marker des erfindungsgemäßen Verfahrens umfassen Microarray Expressionsanalysen, Northern Blots, „deep” Sequenzierung oder auch In-Situ Hybridisierung. Neben der relativen mRNA Konzentration des Markers kann auch die absolute Anzahl der Molekühle in einer Probe nachgewiesen werden.
Erfindungsgemäß umfasst das Verfahren ein „Quantifizieren” der analysierten Marker des vorliegenden Verfahrens in einem weiteren Aspekt alle dem Fachmann zum Nachweis von Proteinen in biologischen Proben bekannte geeignete Verfahren. Das spezifische Verfahren ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung solange nicht wichtig, wie das Verfahren empfindlich genug ist, um die für eine genaue Bestimmung der Konzentrationen der Marker erforderliche Nachweisgrenze zu unterschreiten. Geeignete Verfahren beruhen normalerweise auf der Bindung einer Markierung an den nachzuweisenden Marker und den anschließenden Nachweis dieser Markierung. Die Bindung kann dabei kovalent oder nicht-kovalent sein und/oder direkt oder indirekt erfolgen. Geeignete Messverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung schließen z. B. die Elektrochemilumineszenz ein. Turbidimetrie, Nephelometrie und Latexverstärkte Turbidimetrie oder Nephelometrie können ebenfalls verwendet werden.
Auf Grund ihrer hohen Sensitivität und der Tatsache, dass sich diese Verfahren auch auf Hoch-Durchsatz-Umgebungen anpassen lassen, sind erfindungsgemäß Verfahren bevorzugt, wobei das Bestimmen der Konzentration mittels eines immunologischen Verfahrens mittels an die Marker bindenden Moleküle erfolgt. Beispiele für solche Verfahren sind ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), Sandwich Enzymimmuntests oder Festphasen Immuntests. Bevorzugt ist somit, dass die an die Marker bindenden Moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus anti-Marker-Antikörpern oder Teilen davon und Marker-Rezeptoren oder Teilen davon.
Diese Moleküle können aus einer sehr großen Vielzahl von für die Marker spezifischen Molekülen ausgewählt sein. Bevorzugt ist, dass die an die Marker bindenden Moleküle ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, die spezifisch gegen Marker oder gegen Teile davon gerichtet sind, oder Teilen oder Fragmenten davon und einem Marker-Rezeptor oder Teilen davon oder einem Integrin, z. B. dem Plättchen-Integrin IIb3, oder Teilen davon. Besonders bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei die Antikörper, Teile oder Fragmente davon polyklonale Antikörpern, monoklonale Antikörpern, Fab-Fragmente, scFv-Antikörper und Diabodies umfassen.
Gemäß eines weiteren Aspekts des Verfahrens der vorliegenden Erfindung können Komponenten des Verfahrens an eine feste Phase gebunden vorliegen, somit können die an einen Marker bindenden Moleküle in Lösung oder Matrix-immobilisiert vorliegen. Als Matrices können eine Vielzahl von dem Fachmann bekannten Materialien verwendet werden, wie zum Beispiel Harz-Matrices und/oder herkömmliche Säulenmatrices. Besonders bevorzugt ist weiterhin ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die an einen Marker bindenden Moleküle an eines oder mehrere Detektionsmoleküle aus der Gruppe bestehend aus Fluoresceinthioisocyanat, Phycoerythrin, Enzymen (zum Beispiel Meerrettich-Peroxidase) und magnetisches Bead gekoppelt sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt des erfindungsgemäßen Verfahrens können die an die Marker bindenden Moleküle mit einem Antikörper, an den eine oder mehrere Detektionsmoleküle gekoppelt sind, nachgewiesen werden. Es handelt sich somit um einen indirekten Nachweis der Bindung des Moleküls. Solche zwei-stufigen Nachweise sind dem Fachmann zum Beispiel aus der anti-Antikörper-Nachweistechnik bestens bekannt.
Gemäß einem weiteren Aspekt des Verfahrens der vorliegenden Erfindung können zur Analyse der Probe immunzytologische Verfahren angewandt werden. Dabei sind alle Verfahren geeignet, die eine spezifische Bestimmung anhand der Marker/Molekül-Interaktion erlauben. Bevorzugt sind Verfahren, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sandwich-Enzym-Immuntest, ELISA und Festphasen-Immuntests.
Die für die zu untersuchende Probe ermittelten Ergebnisse werden üblicherweise mit einer Referenzprobe verglichen. Welche Probe als Referenzprobe dienen kann, wird insbesondere von der Art der untersuchten Probe und der Krankengeschichte des Subjekts, aus dem die zu untersuchende Probe stammt, abhängen. Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Verfahren, bei dem die Referenzprobe aus einem oder dem Mittelwert mehrerer Säugetiere stammt, in dem/in denen eine pulmonale Hypertonie ausgeschlossen wurde. Dies muss aber nicht zwangsläufig so sein. Wenn z. B. das Fortschreiten einer Erkrankung bestimmt werden soll, kann auch eine ”alte” Probe desselben Patienten als Referenzprobe verwendet werden. Dem Fachmann ist offensichtlich, welche Proben als Referenzprobe für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind.
Eine Referenzprobe kann von Gesunden oder von Patienten mit oder ohne pulmonale Hypertonie bzw. pulmonale arterielle Hypertonie stammen. Es kann sich auch um eine Probe handeln, der PlGF und/oder sFlt-1 und/oder BNP und/oder ein weiterer Marker der vorliegenden Erfindung in Konzentrationen zugesetzt wurde, die bei Gesunden oder bei Patienten mit einer pulmonalen Hypertonie früher gemessen wurde. Üblicherweise werden verschiedene Referenzproben eingesetzt, welche die verschiedenen möglichen Prognosen, z. B. „nachteiliges Ereignis unwahrscheinlich” bis „nachteiliges Ereignis hoch wahrscheinlich”, angeben. Ein zur Verfügung stellen von Referenzproben erfolgt vorzugsweise auf die gleiche Weise, wie das zur Verfügung stellen der zu untersuchenden Probe. Anstatt des Einsatzes von Referenzproben können auch festgelegte Referenzwerte, die beispielsweise aus einer Tabelle abzulesen sind, verwendet werden. Derartige Referenzwerte können beispielsweise verschiedene Bereiche festlegen, welche die Wahrscheinlichkeit eines Ereignisses oder einer bestimmten Diagnose angeben. Dabei können die Referenzwerte je nach Herkunft der untersuchten Probe von einander abweichen. So sind die Referenzwerte der hier genannten Marker in gemischt venösem Blut aus der Lungenarterie (A. pulmonaris) höher als in peripherem Blut aus der Cubitalvene.
Erfindungsgemäß ist daher eine besonders bevorzugte Ausführungsform des Verfahren, wenn die Ergebnisse der in der Probe bestimmten Proteinkonzentrationen mit einem Referenzwert verglichen werden, wobei eine Konzentration von sFlt > 73 pg/ml in einer Probe peripher abgenommen Blutes eine pulmonale Hypertonie anzeigt. Hierbei ist weiter bevorzugt, dass das periphere Blut aus der Cubitalvene entnommen wurde.
Als Cubitalvenen werden Venen im Bereich der Elle verstanden. Jedoch soll das erfindungsgemäße Verfahren nicht als auf diese Venen beschränkt verstanden werden. Vielmehr sind ganz allgemein Proben bevorzugt, die Blut aus peripheren Körperregionen enthalten, da diese in der klinischen Praxis leicht zugänglich sind und keinen übermäßig invasiven Aufwand für den Patienten bedeuten.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein oben beschriebenes Verfahren, wobei eine Konzentration von sFlt > 2800 pg/ml und/oder eine Konzentration von PlGF > 30 pg/ml in einer Probe gemischt venösen Blutes, insbesondere Blut aus der Lungenarterie, eine pulmonale Hypertonie anzeigt.
Gelöst wird die oben gestellte Aufgabe in einem neuen Aspekt durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Überwachung einer Therapie einer pulmonalen Hypertonie, insbesondere zur Überwachung der Wahrscheinlichkeit des Auftretens eines negativen Ereignisses bei einem Subjekt, wobei das negative Ereignis eine Verschlechterung des Krankheitsbildes, ein Fortschreiten in ein höheres NYHA Stadium, Therapieeskalation oder Tod ist.
Überraschend konnte im Rahmen der vorliegender Erfindung gefunden werden, dass die Konzentration der Marker sFlt und PlGF in einer zu untersuchenden Probe mit der New York Heart Association(NYHA)-Klassifikation korreliert. Die NYHA-Klassifikation wird zur Einteilung der Stadien einer Herzinsuffizienz entsprechend der Leistungsfähigkeit des Patienten angewendet. Somit erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren eine Überwachung einer Therapie und/oder Risikostratifizierung einer pulmonalen Hypertonie bei einem Subjekt anhand der Feststellung der Konzentrationswerte von einer oder mehreren Komponenten des VEGF-Signalwegs, vorzugsweise durch Bestimmung von sFlt und/oder PlGF.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch einen diagnostisches Kit gelöst, umfassend mindestens ein Mittel zum Quantifizieren der Marker der vorliegenden Erfindung in einer zu untersuchen Probe. Solche Mittel sind vorzugsweise mindestens ein Antikörper zum Nachweis von Marker und Mittel zum anschließenden Quantifizieren der Marker. Der Kit kann außerdem andere Komponenten und/oder Enzyme zur Durchführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung, z. B. Gebrauchsanweisungen zur Interpretation der Ergebnisse des Tests im Hinblick auf das Risikoprofil des Patienten und entsprechende Gegenmaßnahmen und Therapievorschläge enthalten.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft einen erfindungsgemäßen diagnostischen Kit, umfassend mindestens ein Mittel zum Quantifizieren von sFlt-1 und/oder mindestens ein Mittel zum Quantifizieren von PlGF in einer zu untersuchen Probe, wobei das Kit weiterhin ein Mittel zur Information umfasst, wonach eine Konzentration von sFlt > 73 pg/ml in einer Probe peripher abgenommen Blutes, vorzugsweise abgenommenen Blutes aus der Cubitalvene, eine pulmonale Hypertonie anzeigt, oder wonach eine Konzentration von sFlt > 2800 pg/ml und/oder eine Konzentration von PIGF > 30 pg/ml in einer Probe gemischt venösen Blutes, insbesondere Blutes aus der Lungenarterie, eine pulmonale Hypertonie anzeigt.
Dabei ist ein besonders bevorzugter erfindungsgemäßer diagnostischer Kit, ein Kit wobei das mindestens ein Mittel zum Quantifizieren von PlGF und/oder sFlt einen Sandwich-Enzym Immuntest, ELISA oder Festphasen-Immuntest umfasst.
Noch ein weiterer Aspekt betrifft einen erfindungsgemäßen diagnostischen Kit, umfassend mindestens eines weiteren Mittels zum Quantifizieren eines weiteren Markers, insbesondere BNP.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann der diagnostische Kit der Erfindung ferner eine oder mehrere vorbereitete Referenzproben umfassen, wobei eine Referenzprobe sFlt und/oder PlGF und/oder BNP in einer Konzentration enthält, die bei Gesunden oder bei Patienten mit einer pulmonalen Hypertonie früher gemessen wurde.
Ein diagnostischer Kit kann weitere Komponenten und/oder Hilfsstoffe umfassen. Beispielsweise kann der Kit weitere Erläuterungen zur Interpretation der Ergebnisse des Tests sowie Therapievorschläge enthalten.
Das gestellte Problem wird außerdem durch die Verwendung eines diagnostischen Kits der vorliegenden Erfindung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gelöst.
Im Folgenden sollen der kurzen Darstellung nähere Erläuterungen und weitere Ausführungen der Erfindung hinzugefügt werden.
Die vorliegende Erfindung soll im Folgenden anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Abbildungen näher erläutert werden, ohne dass die Erfindung dadurch eingeschränkt wird.
: Verteilung der klinischen Zustände der Patienten (in %) nach einem Beobachtungszeitraum von 1 Jahr
: Gemessene sFlt-Konzentration im Serum aus gemischt venösem Blut (in pg/ml) aus Patienten gruppiert nach Ätiologie.
: Gemessene PlGF-Konzentration im Serum aus gemischt venösem Blut (in pg/ml) aus Patienten gruppiert nach Ätiologie
: Gemessene VEGF-Konzentration im Serum aus gemischt venösem Blut (in pg/ml) aus Patienten gruppiert nach Ätiologie
: Korrelation zwischen der sFlt-Konzentration und gemessener hämodynamischer Parameter
: Korrelation zwischen den Stadien der NYHA-Klassifikation und sFlt-Konzentration (n. Spearman-Rank)
: Korrelation zwischen der PlGF-Konzentration und gemessener hämodynamischer Parameter
: Korrelation zwischen den Stadien der NYHA-Klassifikation und der PlGF-Konzentration
: ROC(Receiver Operating Characteristic)-Analyse für sFlt und PlGF als diagnostische Marker (sFlt: AUC (area under the curve) 0.861, p < 0.001, 95% CI 0.832–0.889; PlGF: AUC 0.787, p < 0.001; 95% CI 0.755–0.819).
: Anteil der Patienten mit normalem BNP aber erhöhtem sFLT bzw. PlGF Konzentrationen
: Verteilung der Stadien der NYHA-Klassifikation im Patientenkollektiv der Studie aus Beispiel 2 (BIOSPHERE II)
: sFlt-Konzentrationswerte aus gemischtvenösem Blut (zentral) oder Blut aus der Cubitalvene (peripher) bei Gesunden und bei Patienten mit pulmonaler Hypertonie.
: sFLT-Serumwerte (aus peripherem Blut) der Patienten mit Dyspnoe.
: PlGF-Serumwerte (aus peripherem Blut) der Patienten mit Dyspnoe
: ROC-Analyse für sFlt als diagnostischer Marker bei Patienten mit Dyspnoe (sFlt: AUC 0.79, p < 0.001, 95% CI 0.715–0.860).
: ROC-Analyse für PlGF als diagnostischer Marker bei Patienten mit Dyspnoe (sFlt: AUC 0.62, p = 0.0273, 95% CI 0.521–0.712).
Beispiele
Beispiel 1: Studie sFlt- und PlGF-Konzentration in gemischt venösem Blut aus der Lungenarterie von Patienten mit pulmonaler Hypertonie (BIOSPHERE-I)

In einer ersten Studie wurden 256 Patienten mit der Diagnose einer pulmonalen Hypertonie jedweder Genese (IPAH, APAH, PAH mit COPD oder Fibrose, CTEPH, PVH) eingeschlossen. Zum Zeitpunkt des Einschlusses erfolgten bei allen Patienten die Abnahme gemischt venösen Blutes aus der Lungenarterie und die Messung von sFlt und PlGF mittels eines ELISA-Kits (R&D Quantikine), sowie eine zeitgleiche Erfassung der hämodynamischen Parameter der Patienten. Die Charakteristika der in der Studie eingeschlossen Patienten sind in Tabelle 1 zusammengefasst: Tabelle 1: Patientencharakteristika

	IPAH	APAH	LDPAH	CTEPH	PVH
n	70	41	64	59	27
Alter (Jahre)	50.3 [37.1–63.0]	60.8 [49.7-66.4]	67.2 [60.6–72.6]	67.2 [53.8–73.5]	65.6 [56.9–73.3]	p = n. s.
Geschlecht (männlich, n/%)	25/35	15/37	46/71*	31/52	14/51	*p < 0.05
Serum Kreatinin	1.1 [1.0–1.4]	1.2 [1.0–1.5]	1.1 [1.1–1.3]	1.2 [1.0–1.4]	1.2 [1.1–1.6)	p = n. s.

6 MGT Entfernungs (Meter)	378[321–443]	268 [222–424]	251 [150–317]	319 [220–400]	313 [186–410]	p = n. s.
WHO, Klassitikation (NYHA)
NYHA I [n/%]	0/0	0/0	0/0	0/0	1/3.7
NYHA II [n/%]	13/16.9	8/19.5	5/7.8	9/15.2	4/14.8
NYHA III [n/%]	47/61.0	27/65.8%	38/59.3	42/71.9	14/51.9
NYHA IV [n/%]	10/14.2	6/14.6	21/34.4	8/13.5	8/29.6
BNP (pg/ml]	103 [34–169]	118 [51–252]	90 [47–320]	112 [41–322]	150 [102–226)	p = n. s.

PAP Mittel (mmHg)	54.5 [44.0–66.0]	43.0 [39.0–51.0]	32.0 [25.0–44.0]	41.5 [31.0–52.0]	39.0 [35.0–46.0]	p = n. s.
SAP Mittel (mmHg)	86.0 [76.0–98.0]	86.0 [78.0–87.0]	88.5 [82.0–100.0]	87.5 [78.0–97.0]	81.5 [74.0–96.0]	p = n. s.
CVP (mmHG)	6.5 [3.0–11.0]	8.0 [6.0–15.0]	6.0 [2.0–9.0]	6.5 [3.0–10.0]	13.0 [7.0–18.0]	*p < 0.05
PCWP (mmHg)	80 [60–10.0]	8.0 [6.0–11.0]	8.0 [5.0–10.0]	9.0 [7.0–12.0]	17.0 [14.0–25.0]*	*p < 0.05
PVR (dyn × sek/cm^–5)	965 [673–1538]	717 [514–1117]	442 [301–698]	626 [404–951]	282 [201–454)	*p < 0.05

SvO₂	62.2 [53.6–67.9]	61.7 [52.7–64.7]	65.9 [61.2–70.7]	63.6 [58.2–67.4]	64.3 [56.7–71.3]	p = n. s.
SaO₂	91.8 [89.5–93.9]	91.9 [89.9–93.9]	90.9 [87.8–93.7]	91.3 [89.1–93.2]	93.1 [90.7–94.2]	p =n. s.

(IPAH: idiopathische pulmonalarterielle Hypertonie; APAH: mit PAH assoziierten Erkrankungen; LDPAH: mit Lungenerkrankungen assoziierten pulmonalen Hypertonien; CTEPH: chronisch thrombemolische pulmonale Hypertonie; PVH: pulmonalvenöse Hypertonie; PCWP (Pulmonary capillary wedge pressure); PAP („Pulmonary Arterial Pressure”); SAP („Systolic Arterial Pressure”); CVP („Central Venous Pressure”); PVR („Pulmonary Vascular Resistance”); SvO2 („Venouos Oxygen Saturation”); SaO2 („Arterial Oxygen Saturation”))

Alle Patienten wurden über ein Jahr beobachtet. Der klinische Zustand der Patienten nach dem Beobachtungszeitraum ist in zusammengefasst. Die bis zeigen die Ergebnisse der Messungen. Sowohl die Werte für sFlt als auch für PlGF sind daher in gemischt venösem Blut bei PH Patienten signifikant (p < 0.05) erhöht ( und ). Zudem konnte mittels Regressionsanalysen gezeigt werden, dass eine schwache Korrelation zwischen der sFlt- und PlGF-Werte zur NYHA-Klassfikation besteht. So ist sowohl die Konzentration von sFlt als auch von PlGF in gemischt venösem Blut bei Patienten im Stadium NYHA IV signifikant höher als bei Patienten in den Stadien II und III ( und ).
Des Weiteren wurde die Testgenauigkeit der hier gefundenen neuen Biomarker für PH durch Berechnung der „receiver operating characteristic” (ROC)-Fläche unter der Kurve überprüft ( ). Überraschend zeigte sich eine besonders hohe Testgenauigkeit für die Diagnose der pulmonalen Hypertonie durch die Marker sFlt und PlGF. Hierdurch wurde ein „Cutoff”-Wert (Referenzwert) für sFlt von 2800 pg/ml und für PlGF von 30 pg/ml errechnet. Überraschend konnte festgestellt werden, dass die errechneten Grenzwerte für beide Marker in gemischt venösem Blut 100% Spezifisch waren, also nahezu keine falsch positiven Diagnosen bei den Grenzwerten auftreten (Tabelle 2). Die Sensitivität – das Maß für die Anzahl an falsch negativ gestellten Diagnosen – belief sich bei sFlt auf 68,5% und bei PlGF auf 64,3%. Eine Kombination beider Marker erhöht die Sensitivität des Tests auf 78,5%. Somit muss bei Patienten mit sFlt-Werten > 2800 pg/ml und PlGF-Werten > 30 pg/ml immer von einer pulmonalen Hypertonie ausgegangen werden. Tabelle 2: Sensitivität und Spezifität von sFlt und PlGF als diagnostischer Marker in gemischt venösem Blut aus der Lungenarterie

PPV [%] Sensitivität [%] Spezifität [%] NPV [%]

sFlt Referenzwert: 2800 pg/ml 100 68.5 100 49.7

PlGF Referenzwert: 30 pg/ml 100 64.3 100 48.8

sFlt + PlGF 100 78.5 100 61.3

(PPV: positiver Vorhersagewert, NPV: neganver Vorhersagewert)
Dies war insgesamt ein überraschendes Ergebnis, da in ca. 40% der Patienten mit einem negativen BNP immerhin sFlt und PlGF als relevant erhöht gemessen werden konnte und somit das Vorliegen einer pulmonalen Hypertonie erkannt werden konnte ( ). Dies zeigt insbesondere den Vorteil der hier beschriebenen Biomarker gegenüber bekannten Diagnoseverfahren im Stand der Technik.
Beispiel 2: Studie sFlt- und PlGF-Konzentration in peripherem Blut aus Patienten mit pulmonaler Hypertonie (BIOSPHERE-II)
In einer Weiteren Validierungskohorte sollte der diagnostische Vorhersagewert von sFlt und PlGF in peripherem Blut bestätigt werden. Hierzu wurden konsekutiv 179 Patienten mit erschwerter Atemtätigkeit (Dyspnoe, NYHA I–IV) in die Studie eingeschlossen. Im Gegensatz zu Beispiel 1 wurde bei allen Patienten Blut aus der Cubitalvene, also peripher anstatt gemischt venös aus der Lungenarterie, entnommen Das Durchschnittsalter der Teilnehmer der Studie lag bei 61.1 ± 17.4 Jahren. 27 Patienten (15%) waren dem NYHA Stadium I zuzuordnen, 35 Patienten (20%) waren formal im NYHA Stadium II und 55 Patienten (32%) im NYHA Stadium III. Dem NYHA-Stadium IV waren schließlich 62 Patienten (36%) zuzuordnen ( ). Alle Patienten wurden eine echokardiographischen Untersuchung unterzogen. Um sicher und nicht-invasiv eine pulmonale Hypertonie zu erfassen, wurde entsprechend der Kriterien des Symposiums für pulmonale Hypertonie in Dana Point 2008 ab einem systolischen pulmonal-arteriellen Druck > 45 mmHg eine pulmonale Hypertonie festgestellt. Zudem wurden ein Lungenfunktionstest und ein 6-Minuten-Gehtest (6 MGT) bei allen Teilnehmern der Studie durchgeführt.
Nach echokardiographischen Kriterien zeigten 41 Patienten eine pulmonale Hypertonie (sPAP 65,7 ± 19,0 mmHg). Bei 138 Patienten lag eine Dyspnoe ohne begleitende pulmonale Hypertonie (sPAP 27,1 ± 6,9 mmHg) vor.
Bei Patienten mit pulmonaler Hypertonie lagen sowohl die sFlt- als auch die PlGF Serumwerte in Blut aus der Cubitalvene signifikant höher als bei Patienten mit Dyspnoe ohne pulmonale Hypertonie (sFlt: 259,4 ± 84,7 pg/ml vs 67,2 ± 1,7 pg/ml; PlGF: 21,9 ± 5,1 pg/ml vs 12,8 ± 0,5 pg/ml; und ). Interessanterweise lagen die gemessenen Werte weit unter den Werten, wie sie in Beispiel 1 (der BIOSPHERE-I Studie) gemessen wurden. Weiterführende Untersuchungen ergaben, dass im auch gleichen Patient sFlt und PlGF in zentralvenösem Blut bestimmt höhere Werte ergeben als in peripherem Blut ( ). Die Tatsache, dass in der BIOSPHERE-I Studie nur gemischt venöses Blut und in der BIOSPHERE-II nur peripheres Blut analysiert wurde erklärt die wesentlichen Unterschiede der gemessenen sFlt und PlGF-Werte.
Die statistische Auswertung der gemessenen Daten zeigte eine starke Korrelation zwischen sFlt ( ) bzw. PlGF-Werten ( ) und dem systolisch pulmonalarteriellen Druck (sPAP). Die „receiver operating characteristic”-Fläche unter der Kurve konnte insbesondere für den sFlt eine gute Testgenauigkeit für die Diagnose der pulmonalen Hypertonie nachweisen ( ).
Für sFlt wurde ein optimaler „Cut-off”-Wert (Referenzwert) von 73 pg/ml ermittelt. Im Rahmen dieser Untersuchung konnte somit eine Sensitivität von 78,0% und eine Spezifität von 71.1% kalkuliert werden (Tabelle 3). Hieraus ergab sich ein negativer Vorhersagewert von 91.1%. Der positive Vorhersagewert lag bei 45,1%. Somit kann man schlussfolgern, dass mit einer hohen Wahrscheinlichkeit ein negatives Ereignis (keine pulmonale Hypertonie) bei einem sFlt < 73 pg/ml in peripherem Blut vorausgesagt werden kann. Interessanterweise war bei Patienten mit gesicherter pulmonaler Hypertonie BNP als diagnostischer Marker nur in 55% der Fälle > 80 pg/ml. Dafür war entsprechend in 45% aller Patienten mit gesicherter pulmonaler Hypertonie und BNP < 80 pg/ml sFlt positiv, d. h. > 73 pg/ml. Damit konnte gezeigt werden, dass sFlt in fast der Hälfte aller Fälle eine pulmonale Hypertonie genauer vorhersagen konnte als BNP. Demgemäß stellt sFlt auch bei Messung in peripheren Blutproben einen überraschend vorteilhaften Biomarker zur Verfügung, der eine wertvolle diagnostische Ergänzung zu dem bisherig verwendeten Marker BNP darstellt. Tabelle 3: Sensitivität und Spezifität von sFlt als diagnostischer Marker der pulmonale Hypertonie in peripherem Blut von Patienten mit Dyspnoe

PPV [%] Sensitivität [%] Spezifität [%] NPV [%]

sFlt Referenzwert: 73 pg/ml 45,1 78.0 71.1 91.7

(PPV: positiver Vorhersagewert, NPV: negativer Vorhersagewert)
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 2004/126828 [0013]
WO 01/85796 [0016]
WO 06/045593 [0018]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Munagala VK, Burnett JC, Jr., and Redfield MM, The natriuretic peptides in cardiovascular medicine. Curr Probl Cardiol, 2004. 29(12): 707–69 [0009]
Levine et al., 2004, N Engl J Med. [0014]
Widmer et al., Obstet Gynecol. 2007 Jan. [0015]
Brittain et al. Blond 2010 [0017]
Perelman et al, Blond 2003 [0017]

Claims

Verfahren zur Diagnose, Früherkennung und/oder Risikostratifizierung einer pulmonalen Hypertonie bei einem Subjekt und/oder Überwachung einer Therapie einer solchen Erkrankung bei einem Subjekt, umfassend der Schritte (a) zur Verfügung stellen einer Probe aus einem Subjekt, (b) Quantifizieren mindestens eines Markers in genannter Probe, wobei der Marker ausgewählt wird aus einer Komponente des VEGF(vaskulär endotheler Wachstumsfaktor)-Signalwegs, (c) gegebenenfalls Quantifizieren mindestens eines weiteren Markers, und (d) Vergleich des/der für die zu untersuchende Probe erhaltenen Ergebnisse/s mit Referenzwerten und/oder den Werten aus einer Referenzprobe.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zu untersuchende Probe in-vitro zur Verfügung gestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die zu untersuchende Probe ausgewählt wird aus der Gruppe beinhaltend Blut, Blutplasma, Blutserum, wobei die zu untersuchende Probe peripheres abgenommen wurde, vorzugsweise aus der Cubitalvene, und Gewebeproben, insbesondere histologische Gewebeproben.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Subjekt ein Säugetier, vorzugsweise ein Mensch ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die pulmonale Hypertonie eine pulmonal-arterielle Hypertonie (PAH) ist, aus der Gruppe bestehend aus idiopathische pulmonal-arterielle Hypertonie (IPAH), familiäre pulmonal-arterielle Hypertonie, assoziierte pulmonal-arterielle Hypertonie (APAH) und pulmonale veno-okklusive Erkrankung (PVO) und/oder pulmonal kapillare Hämangiomatose (PCH); die pulmonale Hypertonie eine pulmonalvenöse Hypertonie in Verbindung mit einer Linksherzerkrankung ist; die pulmonale Hypertonie eine pulmonale Hypertonie in Assoziation mit Lungenerkrankungen und/oder Hypoxämie ist; oder die pulmonale Hypertonie eine chronisch thromboemlisch pulmonale Hypertonie (CTEPH) oder eine pulmonale Hypertonie mit unklaren und/oder multifaktoriellen Mechanismen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei eine Komponente des VEGF(vaskulär endotheler Wachstumsfaktor)-Signalwegs ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus sFlt, PlGF, VEGF und VEGFR.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Komponente des VEGF-Signalweg sFlt oder PlGF ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der weitere Marker in Verfahrensschritt (c) ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus sFlt, PlGF, BNP, VEGF und VEGFR, wobei das Verfahren vorzugsweise das Quantifizieren von sFlt und/oder PlGF umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Quantifizieren des Markers mittels Bestimmung der Proteinkonzentration, der mRNA Konzentration, der DNA-Methylierung und/oder der Bestimmung des Vorhandenseins von SNPs durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Bestimmen der Konzentration mittels eines immunologischen Verfahrens mittels an die Marker bindender Moleküle erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die immunologischen Verfahren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Sandwich-Enzym-Immuntest, ELISA und Festphasen-Immuntests.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei eine Konzentration von sFlt > 73 pg/ml in einer Probe peripher abgenommen Blutes, vorzugsweise Blut aus der Cubitalvene, eine pulmonale Hypertonie anzeigt.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1–12 zur Überwachung einer Therapie einer pulmonalen Hypertonie, insbesondere zur Überwachung der Wahrscheinlichkeit des Auftretens eines negativen Ereignisses bei einem Subjekt, wobei das negative Ereignis eine Verschlechterung des Krankheitsbildes, ein Fortschreiten in ein höheres NYHA Stadium, Therapieeskalation oder Tod ist.
Diagnostischer Kit, umfassend mindestens ein Mittel zum Quantifizieren von sFlt-1 und/oder mindestens ein Mittel zum Quantifizieren von PlGF in einer zu untersuchen Probe, wobei das Kit weiterhin ein Mittel zur Information umfasst, wonach eine Konzentration von sFlt > 73 pg/ml in einer Probe peripher abgenommen Blutes, vorzugsweise abgenommenen Blutes aus der Cubitalvene, eine pulmonale Hypertonie anzeigt.
Diagnostischer Kit nach Anspruch 14, wobei das mindestens ein Mittel zum Quantifizieren von PlGF und/oder sFlt einen Sandwich-Enzym Immuntest, ELISA oder Festphasen-Immuntest umfasst.