CN103992377A - 一类新的抑制新生血管的小肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类预防和抑制血管新生的多肽及其应用。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。本发明多肽具有多种优点，例如分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度等。

Description

一类新的抑制新生血管的小肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及一类新的抑制新生血管的小肽，所述的小肽是源于人Neuropilin-1的多肽。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。 

背景技术

新生血管的形成是一个极其复杂的过程，它包括：现存血管的扩张、血管通透性的增加、血管周围基质的降解、内皮细胞的激活增殖、迁移以及新的毛细血管样管腔的形成。 

在眼部,约2/3的致盲性疾病均与病理性新生血管有关，例如：单纯疱疹性角膜基质炎引起的角膜新生血管,年龄相关性黄斑变性中的脉络膜新生血管，以及糖尿病视网膜病变或早产儿视网膜病变中的视网膜新生血管等。目前临床上，对于眼部病理性新生血管常规运用激光光凝、光动力学疗法(Photodynamic therapy,PDT)以及经瞳孔温热疗法(Thermal transpupillary therapy,TTT)等进行治疗。然而，这些治疗手段不仅对局部组织易造成破坏，其远期疗效也并不十分令人满意。因此，近年来人们不断尝试开发治疗眼部病理性新生血管更有效的方法。 

在开发有效的血管新生抑制剂时，应充分考虑到眼科用药的特殊性。 

第一，眼部存在多个解剖性和功能性的屏障。全身给药常常由于血-房水屏障和血-视网膜屏障而无法在眼组织局部达到足够的药物浓度；局部给药，如玻璃体腔注射，大于76.5kDa的大分子在理论上很难穿透视网膜作用于视网膜和脉络膜新生血管。对于眼表给药，药物必须要先后穿透亲脂性的角膜上皮细胞紧密连接和亲水性的角膜基质，因此只有具备适当脂溶性、低分子量或能与眼表组织内的转运体(如：氨基酸转运体、寡肽转运体等)结合的药物才能到达前房发挥作用。 

第二，药物在亲水的泪液、房水、玻璃体液中溶解的程度与其有效性呈正相关。 

第三，基于上述主要原因，眼科用药的生物利用度很低；要使之提高，可加大给药的浓度。用于***新生血管的化合物毒副作用较为明显，全身和局部均无法高剂量给药。此外，分子量较大的外源性蛋白质也是敏感的异物源,可对眼部组织(如:葡萄膜)造成免疫损伤。 

第四，目前虽然已经有一系列相对安全的内源性血管新生抑制剂被先后证实，如血管抑素(angiostatin)，它由纤溶酶原Kringle结构域1-4(plasminogen Kringle1-4)组成，可明显抑制血管依赖性肿瘤的生长，但由于其分子量较大且空间构象复杂，故在制备过程中存在重组表达纯化工艺繁琐和内毒素残留等不足。正是由于上述种种条件的限制，目前用于治疗眼部新生血管的药物十分有限，比如重组抗人VEGF单克隆抗体bevacizumab(Avastin)、重组抗人VEGF单克隆抗体片段ranibizumab(Lucentis)等，但它们价格高昂，并且需反复经玻璃体腔给药，甚至可引起血管栓塞等风险。 

由此可见，寻找具有特异生物学活性和生物相容性的小分子抑制剂，经无创或微创的给药途径透过各种眼组织屏障，提高眼局部的生物利用度，降低给药剂量，减少局部和全身的副作用，对新生血管性眼病的临床防治具有十分重要的意义。因此，本领域迫切需要开发一种适于眼球组织的有效安全的小分子新生血管抑制剂。 

发明内容

本发明的目的是提供一类适于眼球组织的有效安全的可抑制血管新生的小分子多肽以及其片段、类似物和衍生物。 

本发明的另一目的是提供含所述多肽的制法和应用。 

在本发明的第一方面，提供了在本发明的第一方面，提供了一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐 

[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xaa10] (I) 

式中， 

Xaa0是无，或1～2个氨基酸构成肽段； 

Xaa1是选自下组的氨基酸：Cys；或Ser； 

Xaa2是选自下组的氨基酸：Ser；或Thr； 

Xaa3是选自下组的氨基酸：Gln；Asn； 

Xaa4是选自下组的氨基酸：Tyr；Trp；Phe；Thr；或Ser； 

Xaa5是选自下组的氨基酸：Ser；或Thr； 

Xaa6是选自下组的氨基酸：Thr；或Ser； 

Xaa7是选自下组的氨基酸：Asn；Gln；His；Lys；或Arg； 

Xaa8是选自下组的氨基酸：Trp；Tyr；或Phe； 

Xaa9是选自下组的氨基酸：Cys；或Ser； 

Xaa10是无，或1～2个氨基酸构成肽段； 

并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性,且所述多肽的长度为9-13个氨基酸。 

更佳地，所述的多肽中： 

Xaa0是无； 

Xaa1是选自下组的氨基酸：Cys；或Ser； 

Xaa2是选自下组的氨基酸：Ser；或Thr； 

Xaa3是选自下组的氨基酸：Gln；或Asn； 

Xaa4是选自下组的氨基酸：Tyr；或Phe； 

Xaa5是选自下组的氨基酸：Ser；或Thr； 

Xaa6是选自下组的氨基酸：Thr；或Ser； 

Xaa7是选自下组的氨基酸：Asn；或Gln； 

Xaa8是选自下组的氨基酸：Trp；或Tyr； 

Xaa9是选自下组的氨基酸：Cys；或Ser； 

Xaa10是无； 

在另一优选例中，所述多肽的长度为9个氨基酸。 

在另一优选例中，所述多肽的长度为8个氨基酸。 

在另一优选例中，所述多肽选自下组： 

(a)具有SEQ IDNO:2所示氨基酸序列的多肽； 

(b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过1-3个(较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。 

在另一优选例中，所述的衍生多肽保留了≥70%的SEQ ID NO:2的所示多肽的抑制血管新生活性。 

在另一优选例中，所述的衍生多肽与SEQ ID NO:2的相同性≥80%，较佳地≥90%；更佳地≥95%。 

本发明还提供了具有抑制血管新生功能的、式I化合物的二聚体和多聚体形式。 

在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸分子，它编码本发明上述的多肽。 

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有： 

(a)本发明上述的多肽或其药学上可接受的盐；和 

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。 

在另一优选例中，所述组合物的剂型为眼药水、针剂(如眼周和眼内注射液)、眼用凝胶或眼药膏。 

在另一优选例中，所述的组合物为缓释剂型。 

在本发明的第四方面，提供了一种本发明所述多肽或药学上可接受的盐的用途，它们被用于制备抑制血管新生或防治与血管新生相关疾病的药物。 

在另一优选例中，所述的与血管新生相关疾病的选自下组：新生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、Berger's病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症或肉瘤状病等。 

在另一优选例中，所述的新生血管性眼病包括累及脉络膜、视网膜、角膜或虹膜，包括老年性黄斑变性、增生性糖尿病视网膜病变、视网膜血管阻断性疾病、早产儿视网膜病变、角膜感染、新生血管性青光眼等。 

在本发明的第五方面，提供了一种抑制哺乳动物血管新生的方法，包括步 骤：给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。 

在另一优选例中，所述的对象是人。 

在另一优选例中，所述的血管新生是与新生血管性眼病相关的血管新生。 

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。 

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。 

图1显示了小肽ZY7对人脐静脉血管内皮细胞HUVECs增殖的影响，小肽ZY7具有显著抑制内皮细胞增殖的效应。相对于VEGF组，VEGF+小肽ZY7组(1μM～100μM)具有显著抑制HUVECs增殖的作用，*P<0.05，**P<0.01，差异具有统计学意义。 

图2显示小肽ZY7对人脐静脉血管内皮细胞HUVECs管腔形成的影响，可见小肽ZY7具有显著抑制内皮细胞管腔形成的效应。 

图2a-2c显示小肽ZY7对HUVECs管腔形成的抑制作用。 

图2a为VEGF组；图2b为VEGF+ZY7(100μM)组；图2c为相对于VEGF组，VEGF+小肽ZY7组(1μM～100μM)具有显著抑制HUVECs管腔形成的作用，*P<0.05，**P<0.01，差异具有统计学意义。 

图3显示小肽ZY7对鸡胚***上新生血管的影响：小肽ZY7具有显著抑制新生血管的效应。 

图3a-3c示滤纸片周2.5mm范围内3-5级微血管计数。 

图3a为PBS组；图3b为ZY7(10μl/片)组；图3c为ZY7(50μl/片)组；图3d为相对于PBS组，各浓度的小肽ZY7组均明显抑制鸡胚***新生血管数，且抑制作用呈浓度依赖性，*P<0.05，**P<0.01，差异具有统计学意义。 

图4显示小肽ZY7对小鼠视网膜新生血管的影响：小肽ZY7具有显著抑制小鼠视网膜新生血管的效应。 

图4a为PBS组；图4b为ZY7(2μg/μl)组；图4c为相对于高氧+PBS组，高氧+小肽ZY7组(1μg/μl～2μg/μl)明显抑制小鼠视网膜新生血管数，且抑制作用呈浓度依赖性，*P<0.05，**P<0.01，差异具有统计学意义。 

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了具有抑制血管新生功能的，分子量小于3kD的小分子多肽。具体而言，本发明人应用生物信息学的方法，基于同源性分析和生物学特性等分析，设计了数个候选序列，采用固相法将其合成，分离纯化获得高纯度的小肽ZY7，并运用HPLC及MS对之进行鉴定，再经鸡胚***血管模型、氧诱导小鼠视网膜新生血管模型、VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞增殖模型和人脐静脉内皮细胞管腔模型筛选，获得了一类新型的、具有预防和治疗血管新生相关疾病的小分子多肽。 

本发明的小肽的分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；安全性高，对生物组织毒副作用小；眼局部用药生物利用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用。在此基础上完成了本发明。 

人Neuropilin-1 

Neuropilin是1995年Satoda等人首次报道的一种跨膜糖蛋白。根据neuropilin基因的选择性拼接，可形成两个异构体：Neuropilin-1和Neuropilin-2，两者之间有44%的同源性。与其他Neuropilin家族成员高度保守结构一样，Neuropilin-1为跨膜蛋白，其胞外有3个不同的结构域，分别称为a1/a2、FV/FV III(b1/b2)和MAM(c)，其跨膜区及胞浆内区域归入d结构域。Neuropilin-1基因在人体组织内广泛表达，例如：神经***、内皮细胞、某些肿瘤细胞、心、肺、胎盘等。在新生血管生成过程中，VEGF-165、PlGF-2、VEGF-B、VEGF-E可与Neuropilin-1结合，激活下游的信号转导通路，发挥重要的生物学效应。 

活性多肽 

在本发明中，术语“本发明多肽”、“ZY7多肽”、“ZY7小肽”、“短肽ZY7”或“肽ZY7”可互换使用，都指具有血管新生抑制活性的肽ZY7氨基酸序列(CSQYSTNWC，如SEQ ID NO:1所示)的蛋白或多肽。此外，所述术语还包括具有抑制血管新生功能的、SEQ IDNO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-2个(更佳地为1个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为2个以内，较佳地为1个)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。一种典型的多肽为C末端和/或N末端缺失一个氨基酸，即构成8个氨基酸的多肽。 

本发明还包括ZY7多肽的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持抑制血管新生功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)ZY7多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。 

一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多1个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。 

表1 

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val;Leu;Il e	Val
Arg(R)	Lys;Gln;Asn	Lys
			Asn(N)	Gln;His;Lys;Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu

[0080] 

Cys(C)	Ser	Ser
			Gln(Q)	Asn	Asn
Glu(E)	Asp	Asp
			Gly(G)	Pro;Ala	Ala
His(H)	Asn;Gln;Lys;Arg	Arg
			Ile(I)	Leu;Val;Met;Ala;Phe	Leu
Leu(L)	Ile;Val;Met;Ala;Phe	Ile
			Lys(K)	Arg;Gln;Asn	Arg
Met(M)	Leu;Phe;Ile	Leu
			Phe(F)	Leu;Val;Ile;Ala;Tyr	Leu
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr;Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp;Phe;Thr;Ser	Phe
			Val(V)	Ile;Leu;Met;Phe;Ala	Leu

发明还提供ZY7多肽的类似物。这些类似物与天然ZY7多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。 

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。 

本发明多肽还可以以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使 用。这些盐包括(但不限于)与如下酸形成的盐：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。其他盐包括：与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常规的“前体药物”的形式。 

编码序列 

本发明还涉及编码ZY7多肽的多核苷酸。一种优选的编码序列是(SEQ IDNO:1，编码序列:TGCTCCCAGTATAGCACCAACTGGTGC)，它编码SEQ ID NO:2所示的短肽ZY7。 

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，以SEQ ID NO:1为例，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2序列的多肽，但与SEQ ID NO:1中相应编码区序列有差别的核酸序列。 

本发明的ZY7核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。 

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或ZY多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。 

另一方面，本发明还包括对ZY7多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。 

制备方法 

本发明多肽可以是重组多肽或合成多肽。本发明的多肽可以是化学合成的，或重组的。相应地，本发明多肽可用常规方法人工合成，也可用重组方法生产。 

一种优选的方法是使用液相合成技术或固相合成技术，如Boc固相法、Fmoc固相法或是两种方法联合使用。固相合成可快速获得样品，可根据目的肽的序 列特征选用适当的树脂载体及合成***。例如，Fmoc***中优选的固相载体如连接有肽中C端氨基酸的Wang树脂，Wang树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-烷氧基苄醇；用25%六氢吡啶/二甲基甲酰胺室温处理20分钟，以除去Fmoc保护基团，并按照给定的氨基酸序列由C端逐个向N端延伸。合成完成后，用含4%对甲基苯酚的三氟乙酸将合成的胰岛素原相关肽从树脂上切割下来并除去保护基，可过滤除树脂后***沉淀分离得到粗肽。将所得产物的溶液冻干后，用凝胶过滤和反相高压液相层析法纯化所需的肽。当使用Boc***进行固相合成时，优选树脂为连接有肽中C端氨基酸的PAM树脂，PAM树脂结构为聚苯乙烯，与氨基酸间的手臂是4-羟甲基苯乙酰胺；在Boc合成***中，在去保护、中和、偶联的循环中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保护基团Boc并用二异丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽链缩合完成后，用含对甲苯酚(5-10%)的氟化氢(HF),在0℃下处理1小时，将肽链从树脂上切下，同时除去保护基团。以50-80%乙酸(含少量巯基乙醇)抽提肽，溶液冻干后进一步用分子筛SephadexG10或Tsk-40f分离纯化，然后再经高压液相纯化得到所需的肽。可以使用肽化学领域内已知的各种偶联剂和偶联方法偶联各氨基酸残基，例如可使用二环己基碳二亚胺(DCC)，羟基苯骈三氮唑(HOBt)或1,1,3,3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)进行直接偶联。对于合成得到的短肽，其纯度与结构可用反相高效液相和质谱分析进行确证。 

在一优选例中，本发明多肽ZY7，按其序列，采用固相合成的方法制备，行高效液相色谱纯化，获得高纯度目的肽冻干粉，-20℃贮存。 

另一种方法是用重组技术产生本发明多肽。通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸可用来表达或生产重组的ZY7多肽。一般来说有以下步骤： 

(1).用本发明的编码ZY7多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞； 

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞； 

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。 

重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。 这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。 

由于本发明多肽较短，因此可以考虑将多个多肽串联在一起，重组表达后获得多聚体形式的表达产物，然后通过酶切等方法形成所需的小肽。 

血管新生相关疾病 

在本发明中，血管新生相关疾病没有特别限制，包括本领域中已知的各种与血管新生相关的疾病。代表性的、与血管新生相关的疾病例子包括(但并不限于)：新生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、Berger's病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症或肉瘤状病等。 

优选地，所述的新生血管性眼病包括(但并不限于)：累及脉络膜、视网膜、角膜或虹膜，包括老年性黄斑变性、增生性糖尿病视网膜病变、视网膜血管阻断性疾病、早产儿视网膜病变、角膜感染、新生血管性青光眼等。 

药物组合物和施用方法 

另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明多肽或其药学上可接受的盐；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明多肽的数量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。 

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明多肽。此外，本发明的多肽可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。 

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack  Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。 

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。 

通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。 

一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：眼表、眼周、眼内、肌内、静脉内、皮下、皮内或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。 

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地，可以例举的有眼药水、针剂、眼用凝胶和眼药膏。 

这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。 

例如，眼药水的配制可这样进行：将短肽ZY7或其药学上可接受的盐与基本物质一起溶解于无菌水(在无菌水中溶解有表面活性剂)中，调节渗透压和酸碱度至生理状态，并可任意地加入合适的药物添加剂如防腐剂、稳定剂、缓冲剂、等渗剂、抗氧化剂和增粘剂，然后使其完全溶解。 

本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，短肽ZY7或其盐可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。此外，短肽ZY7或其盐还可通过***预先涂有药物的眼内透镜而得以应用。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。 

当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的短肽ZY7或其药学上可接受的盐的剂量，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。例如，当局部滴眼时，通常其浓度约为0.1-10wt%，较佳地1-5wt%，每日可2-6次给药，每次1-2滴。 

工业应用性 

含有本发明肽或其药学上可接受盐作为活性成分的药物组合物，对血管新生有显著的抑制活性。经动物试验证实，本发明多肽不仅可以抑制鸡胚***的血管新生和氧诱导的小鼠视网膜新生血管，而且可以抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖及管腔形成。 

本发明的主要优点包括： 

(a)本发明多肽ZY7的分子量小，可透过眼组织屏障； 

(b)水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度； 

(c)安全性高，对生物组织毒副作用小；并且眼局部用药生物利用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用； 

(d)可通过固相合成的方法制备，纯度高，产量大，成本低； 

(e)本发明多肽的稳定性好。 

因此本发明多肽有望开发成药物，用于治疗新生血管性眼病及相关的新生血管性疾病，如肿瘤新生血管等。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

制备例 

小肽ZY7及衍生多肽的合成 

采用市售的SYMPHONY型12通道多肽合成仪(美国Protein Technologies公司)，按合成仪的操作手册，采用Fmoc固相法，分别合成序列如SEQ ID NO:2所示的ZY7多肽，以及如SEQ ID NO.:3-6所示的衍生多肽ZY7-1至ZY7-6。 

合成完成后，从树脂上切割多肽(切割液(10/g)：TFA(J.T.Baker)94.5%，水2.5%，EDT(ALDRICH)2.5%，TIS(ALDRICH)1%；切割时间：120min)。将裂解液用氮气(上海比欧气体工业公司)尽量吹干，用***(上海试一化学试剂有限公司)洗六次，然后常温挥干。 

用HPLC(SHIMADZU高效液相色谱仪型号：制备型，分析型，软件：Class-VP.Sevial System，厂商：SHIMADZU)纯化多肽，将粗肽用纯水或者加少量乙腈(Fisher)溶解，按照下列条件分别纯化小肽ZY7及其衍生多肽。 

泵A:0.1%三氟乙酸+超纯水 

泵B:0.1%三氟乙酸+乙腈 

流速:1.0ml/min 

检测体积:30ul 

波长:220nm 

检测柱：Column:Venusi MRC-ODS C18柱(30x250mm) 

检测过程见表2。 

表2 

最后将纯化后的溶液冻干，得到高纯度(>95%)的小肽ZY7以及衍生多肽ZY7-1至ZY7-6。 

取少量的成品小肽ZY7，进行HPLC分析的纯度鉴定和ESI-MS的分子量鉴定。 

结果表明，纯度鉴定小肽ZY7的纯度大于99％，小肽ZY7共有9个氨基酸，分子量为1KD，与预测值相符。 

将白色粉末状的小肽，密封包装，置于-20℃长期保存。 

实施例1 

小肽ZY7对人脐静脉血管内皮细胞增殖活性的影响 

使用MTS方法，具体方法如下： 

将原代人脐静脉血管内皮细胞HUVECs(购自ScienCell公司)接种于96孔板中，接种浓度为2×10⁴/ml；细胞贴壁后加入无血清培养剂ECM37℃培养24小时；之后在各孔中分别加入无血清培养剂ECM作为阴性对照、VEGF(100ng/ml)(购自Sigma公司)作为阳性对照、VEGF(100ng/孔)+不同浓度的小肽ZY7作为处理组；继续培养24小时后，在各孔中加入20μl的MTS溶液(购自Promega公司)；37℃孵育4小时后，利用酶标仪(Bio-Rad公司)测定490nm各孔的吸光度，根据OD490判断细胞的增殖活性，最后运用SPSS11.0.1进行统计分析。 

结果见图1，可见小肽ZY7有明显抑制人脐静脉血管内皮细胞HUVECs增殖的效应，并呈浓度依赖性，相对于VEGF组，VEGF+小肽ZY7组(1μM～100μM)具有明显抑制HUVECs增殖的作用，*P<0.05，**P<0.01，差异具有统计学意义。 

实施例2 

小肽ZY7对人脐静脉血管内皮细胞管腔形成活性的影响 

使用Matrigel基质胶方法，具体方法如下： 

在96孔板中加入Matrigel基质胶(购自BD公司)50μl/孔，37℃孵育30分钟。待其结成固体状后，将原代人脐静脉血管内皮细胞HUVECs接种于基质胶表面，接种浓度为8×10⁶/ml；并在各孔中分别加入无血清培养剂ECM作为阴性对照、VEGF(100ng/ml)(购自Sigma公司)作为阳性对照、VEGF(100ng/ml)+不同浓度的小肽ZY7作为处理组,37℃继续培养。于处理后6小时在200倍镜下对孔板中细胞随机取3个视野进行拍照，并利用软件Image-Pro Plus Program5.1(Media Cybernetics,Inc.)计算其中形成的管腔最大直径的总和，最后运用SPSS11.0.1进行统计分析。 

结果见图2，小肽ZY7于6小时即有明显抑制人脐静脉血管内皮细胞HUVECs管腔形成的效应，并呈浓度依赖性。图2a-2c显示小肽ZY7对HUVECs管腔形成的抑制作用。图2a为VEGF组；图2b为VEGF+ZY7(100μM)组；图2c为 相对于VEGF组，VEGF+小肽ZY7组(1μM～100μM)具有明显抑制HUVECs管腔形成的作用，*P<0.05，**P<0.01，差异具有统计学意义。 

实施例3 

小肽ZY7抗鸡胚***新生血管效应的测定 

使用鸡胚***模型，具体方法如下： 

将生后1-2天的种鸡蛋消毒后装入恒温恒湿箱(T=37℃，湿度H=60-70%)孵育5天(24小时计一天)，每天早晚各翻蛋一次；之后将含有醋酸可的松(5μg/μl，5μl/片)的滤纸片(Whatman quantitative filter papers，Sigma,ashless，Grade42，Cat No1442-042，42.5mmΦ×100circles)分别滴加PBS(5μl/片)或低浓度(2μg/μl)、高浓度(10μg/μl)的小肽ZY7(5μl/片)，滤纸片风干后置于种鸡蛋***大血管之间并密封种鸡蛋；继续将种鸡蛋置于恒温恒湿箱(温度T=37℃，湿度H=60-70%)孵育2天(24小时计一天)，不翻蛋；之后完全暴露鸡胚***，拍照(范围为滤纸片周5mm)并对3-5级微血管计数(范围为滤纸片周2.5mm)，运用SPSS11.0.1进行统计分析。 

结果见图3，可见相较PBS组，小肽ZY7在低浓度(10μg/片)及高浓度(50μg/片)时均有明显抑制鸡胚***新生血管的作用。图3a-3c显示了滤纸片周2.5mm范围内3-5级微血管计数。图3a为PBS组；图3b为ZY7(10μg/片)组；图3c为ZY7(50μg/片)组；图3d为相对于PBS组，各浓度的小肽ZY7组均明显抑制鸡胚***新生血管数，且抑制作用呈浓度依赖性，*P<0.05,**P<0.01，差异具有统计学意义。 

实施例4 

小肽ZY7抗小鼠视网膜病理性新生血管效应的测定 

使用缺氧诱导小鼠视网膜病变模型，具体方法如下： 

将出生后7天的C57BL/6连同哺乳母鼠同时置于氧浓度约为75%±2%的环境中饲养。5天后取出小鼠，并于取出后当天及第三天在小鼠玻璃体内分别注射0.5μl的低浓度(0.5μg/μl)、中浓度(1μg/μl)、高浓度(2μg/μl)的小肽ZY7及对照样品PBS，术后将小鼠置于正常空气中继续饲养以建立缺氧诱导小鼠视网膜病变模型，5天后取出小鼠眼球，固定于4%多聚甲醛中，石蜡包埋后进行切片，并对之进行HE染色。在200倍光镜下，对视网膜新生血管的内皮细胞核进行计 数，并运用SPSS11.0.1进行统计分析。 

结果见图4，小肽ZY7在中浓度(1μg/μl)及高浓度(2μg/μl)时均有明显抑制小鼠视网膜病理性新生血管的作用，*P<0.05，**P<0.01,具有统计学意义。 

实施例5 

衍生多肽的活性测试 

按实施例3所示的方法，测定各ZY7衍生多肽的抗鸡胚***新生血管效应。结果如表3所示： 

表3 

样品	序列	SEQ ID NO.:	微血管计数
				衍生多肽1(ZY7-1)	CSQYGTNWC	3	47
衍生多肽2(ZY7-2)	CSQYSNSWC	4	44
				衍生多肽3(ZY7-3)	SSQYGTNWC	5	49
衍生多肽4(ZY7-4)	CSQYSTNYC	6	45
				衍生多肽5(ZY7-5)	ASCSQYSTNWCSA	7	47
衍生多肽6(ZY7-6)	CSQYSTNW	8	52
				对照(PBS)			66

结果表明，与对照组相比，衍生多肽1-6在低浓度(10μg/片)都具有显著抑制鸡胚***新生血管的作用。 

实施例6 

眼药水的制备 

利用常规技术，混合以下组分，制得1%眼药水，其配方如下： 

经5位志愿者试用一周，每日3次，每次1滴/眼。结果表明该眼药水可 抑制眼部的血管新生。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

Claims (10)

1.一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐

[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[Xaa10](I)

式中，

Xaa0是无，或1～2个氨基酸构成肽段；

Xaa1是选自下组的氨基酸：Cys；或Ser；

Xaa2是选自下组的氨基酸：Ser；或Thr；

Xaa3是选自下组的氨基酸：Gln；Asn；

Xaa4是选自下组的氨基酸：Tyr；Trp；Phe；Thr；或Ser；

Xaa5是选自下组的氨基酸：Ser；或Thr；

Xaa6是选自下组的氨基酸：Thr；或Ser；

Xaa7是选自下组的氨基酸：Asn；Gln；His；Lys；或Arg；

Xaa8是选自下组的氨基酸：Trp；Tyr；或Phe；

Xaa9是选自下组的氨基酸：Cys；或Ser；

Xaa10是无，或1～2个氨基酸构成肽段；

并且所述的多肽具有抑制血管新生的活性,且所述多肽的长度为9-13个氨基酸。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，Xaa0为1～2个氨基酸的肽段。

3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，Xaa10为1～2个氨基酸的肽段。

4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过1-3个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制血管新生功能的由(a)衍生的多肽。

5.一种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的多肽。

6.一种药物组合物，其特征在于，它含有：

(a)权利要求1所述多肽或其药学上可接受的盐；和

(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为针剂、眼药水、眼用凝胶或眼药膏。

8.如权利要求1所述的多肽或药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备抑制血管新生或防治与血管新生相关疾病的药物。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的与血管新生相关疾病的选自下组：新生血管性眼病、肿瘤、缺血性心脏病、非炎症性心肌病、冠状动脉硬化、闭塞性动脉硬化、动脉栓塞、动脉血栓、Berger's病、慢性炎症、炎症性肠病、溃疡、风湿性关节炎、硬皮症、银屑病、不育症和肉瘤状病。

10.一种抑制哺乳动物血管新生的方法，其特征在于，包括步骤：给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。