ES2258830T3 - Proteina hedgehog hidrosoluble en complejo ionico y uso farmaceutico de la misma. - Google Patents

Proteina hedgehog hidrosoluble en complejo ionico y uso farmaceutico de la misma.

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ES2258830T3 ES99116537T ES99116537T ES2258830T3 ES 2258830 T3 ES2258830 T3 ES 2258830T3 ES 99116537 T ES99116537 T ES 99116537T ES 99116537 T ES99116537 T ES 99116537T ES 2258830 T3 ES2258830 T3 ES 2258830T3
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Abstract

Proceso de producción de una composición farmacéutica de aplicación local en humanos que es una solución acuosa límpida y en la cual un componente esencial es un complejo formado por interacción iónica entre un polipéptido farmacéuticamente efectivo seleccionado a partir del grupo que consiste en proteínas hedgehog, proteínas morfogenéticas óseas, factores de crecimiento, eritropoyetina, trombopoyetina, G-CSF, interleucinas e interferones, y un compuesto anfifílico seleccionado a partir del grupo que consiste en un tensioactivo aniónico, zwitteriónico o catiónico, un ácido graso, un alquilsulfonato, una fosfatidil serina, o un fosfatidato, estando el compuesto anfifílico presente en dicha composición a una concentración que no potencia la solubilidad en agua de dicho polipéptido, donde dicha composición presenta un valor de pH que difiere en al menos media unidad de pH de los valores pK de dicho polipéptido y de dicho compuesto anfifílico, y en el que la estructura molecular del polipéptido se mantiene en su estado activo natural y así no se reduce la actividad del polipéptido.

Description

Proteína hedgehog hidrosoluble en complejo iónico y uso farmacéutico de la misma.
La invención está relacionada con una composición de un polipéptido biológicamente efectivo por interacción con un receptor extracelular sobre la membrana celular, estando dicho polipéptido presente en dicha composición en un complejo iónico con un compuesto anfifílico. La invención también está relacionada con el uso de dicha composición.
El uso de compuestos anfifílicos como sistema de administración de fármacos es ampliamente conocido en el campo (cf. Patentes estadounidenses US-P 5.650.393, US-P 5.688.761, US-P 5.665.328, US-P 5.124.081, US-P 5.109.038). También es conocido el uso de formaciones de complejos en forma de micelas entre sustancias activas en superficie y agentes farmacéuticos para mejorar la penetración transdérmica y transmembranosa del agente activo (Tomlinson and Davis, J. Colloid Interf., Sci. 74 (1980) 349). También se conoce ampliamente que los agentes farmacéuticos normalmente tienen unas mejores propiedades de transporte a través de las membranas biológicas en su forma no ionizada que en el estado ionizado.(Cools and Jansen, J. Pharm. PharmacoL 35 (1983) 689-691). También se sabe que los péptidos presentes en una forma ionizada múltiple en valores fisiológicos de pH tampoco son óptimos para el transporte al sitio de acción (administración de fármacos) ya que las moléculas cargadas, y los polipéptidos en particular, presentan una baja solubilidad en lípidos (Hirai et al., Int. J. Pharm. 7 (1991) 317-325). A partir de Okada et al., J. Pharm. Sci 72(1993) 75-78 se sabe que la unión de un contraión liofílico a la parte iónica del agente es ventajoso y por lo tanto mejora la interacción con la membrana biológica y así facilita el transporte de proteínas a través de las membranas intestinales. Por ejemplo, Hazzenga y Berner describen un método mejorado para el transporte transdérmico de agentes activos zwiteriónicos en J. Controlled Release 16 (1991) 77-88.
Otros métodos para la mejora de la interacción de los agentes con membranas biológicas están descritos por ejemplo por Lee et al., Critical Rev. Therp. Drug Carrier Systems 8 (1991) 91-192, Morimoto et al., Arch. Int. Pharmacodyn. 302(1989) 18-26 y Aungst, Int. J. Pharm. 33 (1986) 225-234. Sin embargo, en todos estos métodos el objetivo era aumentar la hidrofobicidad del agente activo para facilitar su penetración a través de membranas biológicas como la piel y depositar dicho agente en la célula. Las sustancias activas en superficie se utilizan con este fin a una concentración por encima de la concentración micélica crítica (CMC, Womack et al., Biochim. Biophys. Acta 733 (1983) 210). Una desventaja de estos métodos es que las elevadas concentraciones de sustancias activas en superficie que se utilizan tienen una muy gran influencia sobre la membrana celular y la pueden dañar.
A raíz de WO 94/08599 se sabe que una solución homogénea de un agente activo puede prepararse para la producción de agentes activos unidos al transportador mediante la adición de una cantidad adecuada de un detergente aniónico procedente de un precipitado, el aislamiento del precipitado y la solución del mismo otra vez en un disolvente orgánico. Esta solución homogénea que contiene un complejo entre el detergente aniónico y el agente activo puede entonces utilizarse para insertar o dispersar el agente activo en una matriz sólida. Además, WO 94/08599 menciona que se puede formar un complejo de la proteína con un detergente aniónico y el agente activo puede liberarse del complejo para la liberación controlada de una proteína.
La actividad de las proteínas se puede mejorar mediante el acoplamiento covalente con compuestos hidrofóbicos como son los ácidos grasos o los esteroides. Sin embargo, estos métodos son complicados y dan lugar a productos no homogéneos debido a la reacción química del acoplamiento (cf. p. ej. Ekrami, H.M. et al., FEBS Letters 371 (1995)283-286, Pepinski, R.B. et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 14037-14045).
El objeto de la invención es proporcionar composiciones de polipéptidos farmacéuticamente efectivos que mejoran la actividad de un polipéptido que las mismas contienen.
El objeto se consigue mediante un proceso de producción de una composición farmacéutica como una solución acuosa límpida de aplicación local en humanos mediante la formación, a través de interacción iónica y como componente esencial, de un complejo de un polipéptido farmacéuticamente efectivo seleccionado a partir del grupo formado por proteínas hedgegog, proteínas morfogenéticas óseas, factores de crecimiento, eritropoyetina, trombopoyetina, G-CSF, interleucinas e interferones y un compuesto anfifílico seleccionado del grupo formado por un surfactante hidrofóbico aniónico, zwiteriónico o catiónico, un ácido graso, un alquilsulfonato, una fosfatidil serina o un fosfatidato. En dicha composición, el complejo auxiliar se encuentra en una concentración que no potencia la solubilidad en agua de dicho polipéptido, donde la composición tiene un valor de pH diferente, en al menos media unidad de pH, de los valores pK de dicho polipéptido y dicho compuesto anfifílico y donde la estructura molecular del polipéptido se mantiene en su estado activo natural y por tanto la actividad del polipéptido no se ve reducida. La composición no contiene ningún disolvente orgánico. Para su almacenamiento puede liofilizarse.
En la invención el polipéptido y el compuesto anfifílico son individualmente solubles a las concentraciones usadas en soluciones acuosas, preferiblemente tamponadas, y solamente la combinación de las dos sustancias puede dar lugar a la formación de un complejo mediante interacciones iónicas que hidrofobizan el polipéptido y por tanto empeoran o al menos no mejoran su solubilidad en agua. Sorprendentemente ha acabado resultando que de este modo la actividad de dichos polipéptidos puede mejorarse significativamente.
De acuerdo con la invención la cantidad y proporción del compuesto anfifílico y del polipéptido se seleccionan preferiblemente de manera que la composición acuosa que contiene el complejo iónico es una solución límpida. En el caso de que la composición se use directamente como una solución para administrar a un paciente, si la formación de complejo entre el polipéptido y el compuesto anfifílico da lugar a turbidez entonces la solución es filtrada para proporcionar una solución sin turbidez. En el caso de que la composición se inmovilice en un transportador previamente a la administración, entonces no es necesario evitar la turbidez.
El polipéptido farmacéuticamente efectivo es un polipéptido que puede estar presente en una forma iónica y que es reconocido por un receptor de superficie de membrana (receptor extracelular) al que se une para desarrollar su actividad biológica. Estos polipéptidos son factores de crecimiento (p. ej. NGF, TGF-\beta, FGF, GDF, factores de crecimiento similares a insulina), eritropoyetina, trombopoyetina, G-CSF, interferones como el interferón-\alpha2b, interleucinas como la interleucina-2 o la interleucina-12, proteínas morfogenéticas óseas como BMP-2 o proteínas hedgehog como las proteínas sonic, indian o desert hedgegog. Estas últimas proteínas, las hedgehog, son las preferidas. Los polipéptidos preferiblemente utilizados son los que presentan una actividad (efecto terapéutico o actividad proteica in vitro) que preferiblemente se multiplica por diez o más en el complejo de acuerdo con la invención en comparación con la forma sin complejo. La forma iónica del polipéptido puede obtenerse si ésta está presente en un entorno que difiera con ventaja de su valor pK en al menos 0,5 unidades de pH.
El compuesto anfifílico de acuerdo con la invención se debe entender como un surfactante hidrofóbico aniónico, catiónico o zwitteriónico, un ácido graso, un alquilsulfonato o un lípido. Los surfactantes aniónicos preferidos son detergentes aniónicos como agentes tensoactivos esteroideos como desoxicolatos, colatos, taurocolatos, deshidrocolatos (útiles para polipéptidos catiónicos); los surfactantes zwitteriónicos preferidos son CHAPS (3[(3-colamidopropil)dimetilamonio-1-propanosulfonato) y Zwittergent® (N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato) y los detergentes catiónicos preferidos son bromuro de cetiltrimetilamonio o cloruro de dodecilamonio (útil para polipéptidos aniónicos); uno de los ácidos grasos preferidos es el ácido palmítico (útil para polipéptidos catiónicos). Los alquilsulfatos preferidos son alquilsulfonatos como el decilsulfonato (útil para polipéptidos catiónicos) y los lípidos preferidos son lípidos como fosfatidil serina (útil para polipéptidos aniónicos) y fosfatidato (útil para polipéptidos catiónicos).
El compuesto anfifílico se añade a la composición bajo condiciones que hidrofobizan el polipéptido y por tanto reducen, o al menos no mejoran, la solubilidad en agua del polipéptido. Es importante destacar que, de acuerdo con la invención, en este proceso se forma un complejo iónico soluble en agua entre el polipéptido y el complejo anfifílico. La proporción de polipéptido con relación al compuesto anfifílico en el complejo depende del valor de pH utilizado, de los valores pK de las dos sustancias y de la proporción de concentración. El valor de pH utilizado preferiblemente es el que difiere en al menos media unidad de pH de los valores pK del polipéptido y de la sustancia auxiliar. Cuanto más compuesto anfifílico se añada más compuesto anfifílico se unirá al polipéptido y más hidrofóbico se convertirá el complejo. Esto puede llevar a la precipitación del complejo y, por lo tanto, a la presencia de una mezcla de un complejo soluble e insoluble que ya no es completamente soluble en agua. La adición de un detergente no iónico como un polioxámero como Tween® pueden, sin embargo, como mínimo restaurar en parte la solubilidad en agua del complejo o, si es necesario, se puede filtrar la composición. En este caso el detergente no iónico también puede estar presente en concentraciones que llevan a una formación en micela. Cabe remarcar que el tipo y la concentración del compuesto anfifílico se seleccionan de tal modo que, especialmente con proteínas como un polipéptido, se mantiene la estructura molecular del polipéptido en su forma natural activa y por lo tanto la actividad del polipéptido no se reduce. Normalmente, un exceso molar en diez veces del compuesto anfifílico es suficiente para este propósito. Preferiblemente, con una cantidad de proteínas de 5 mg por ml, se añade del 0,001 al 0,05% (peso por volumen) de compuesto anfifílico.
Si un surfactante desnaturalizador como el dodecil sulfato sódico (SDS) se utiliza, por ejemplo, de acuerdo con la invención, este compuesto solo se puede utilizar en concentraciones bajas. Se sabe que el SDS desnaturaliza las proteínas en concentraciones elevadas lo que mejora la solubilidad en agua de estas proteínas, pero en una forma inactiva desnaturalizada. Dichos compuestos anfifílicos como el SDS también pueden formar micelas en concentraciones elevadas además de los complejos deseados de acuerdo con la invención, los que a su vez aumentan la solubilidad del polipéptido. Si el compuesto anfifílico provoca una desnaturalización no deseada del polipéptido se puede determinar fácilmente mediante los métodos que ya conocen los expertos en el campo. Dichos métodos son, por ejemplo, la determinación de actividad o los métodos fisicoquímicos para comprobar la estructura como los IR, la CD y la espectroscopia por fluorescencia.
Una composición farmacéutica acuosa soluble en agua en el sentido de la invención se sobreentiende como una composición que esencialmente comprende partículas no insolubles que contienen el polipéptido farmacéuticamente efectivo. En concreto, una composición farmacéutica acuosa se debe entender de acuerdo con la invención como una composición que no tiene una turbidez visible. Dichas composiciones solubles son posibles cuando el complejo iónico de acuerdo con la invención es completamente soluble en agua en las concentraciones del polipéptido utilizadas, y el surfactante o el complejo no disuelto se quita mediante filtración. Además, de acuerdo con la invención, la composición acuosa no tiene disolventes orgánicos. También, para la fabricación de las composiciones, puede ser necesario disolver dichos compuestos anfifílicos, como ácidos grasos, en una cantidad pequeña de disolventes orgánicos (hasta el 5%, preferiblemente hasta el 1% del volumen de la composición).
Otro asunto a tratar de la invención es un proceso para producir una composición farmacéutica acuosa de acuerdo con la invención que se caracteriza en que el polipéptido farmacéuticamente efectivo y un compuesto anfifílico que empeora o como mínimo no mejora la solubilidad en agua del polipéptido farmacéuticamente efectivo, se combinan en una proporción de concentración y en un valor de pH de manera que un complejo iónico se forma entre el polipéptido y la sustancia auxiliar mediante una interacción iónica.
Y otro asunto a tratar de la invención es el uso de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención para una administración sistémica o local al organismo de los humanos o los mamíferos.
En una realización preferida se utiliza una proteína hedgehog en la composición farmacéutica como el polipéptido farmacéuticamente efectivo. Se sabe que la actividad de las proteínas hedgehog se pueden mejorar mediante una modificación hidrofóbica covalente (Solicitud de patente Europea núm. 99108032.6).
Según la invención, ha resultado de forma sorprendente que la actividad de las proteínas hedgehog se puede aumentar hasta una alcance considerable mediante la formación de un complejo iónico entre una proteína hedgehog y un compuesto anfifílico. En una realización preferida, se obtiene un aumento de la actividad de la proteína hedgehog (comparada a una proteína hedgehog recombinante producida en E. Coli) mediante diez veces o más.
En consecuencia, un asunto a tratar preferido de la invención es una composición farmacéutica que contiene un complejo de una proteína hedgehog y un compuesto anfifílico formado por interacciones iónicas, donde el compuesto está presente en una concentración que empeora o como mínimo no mejora la solubilidad de dicha proteína hedgehog.
Las proteínas hedgehog (hh) se sobreentienden como una familia de proteínas de señal segregadas que son responsables de la formación de varias estructuras de la embriogénesis (J.C. Smith, Cell 76 (1994) 193-196, N. Perrimon, Cell 80 (1995) 517-520, C. Chiang et al., Nature 83 (1996) 407, M.J. Bitgood et al., Curr. Biol. 6 (1996) 296, A. Vortkamp et al., Science 273 (1996) 613, C.J. Lai et al., Development 121 (1995) 2349). Durante su biosíntesis un dominio N-terminal de 20 kDa y un dominio C-terminal de 25 kDa se obtienen después de la división de la secuencia señal y la división autocatalítica. En su forma natural el dominio N-terminal se modifica con colesterol y palmitoilo (J.A. Porter et al., Science 274 (1996) 255-259 y Pepinski et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 14037-14045). En las formas de vida más evolucionadas, la familia de las hh está formada por al menos tres miembros, concretamente sonic, indian y desert hh (Shh, Ihh, Dhh; M. Fietz et al., Development (Suppl.) (1994) 43-51). Se observaron diferencias en la actividad de las proteínas hedgehog producidas de forma recombinante, después de su producción en procariotas y eucariotas (M. Hynes et al., Neuron 15 (1995) 35-44 y T. Nakamura et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237 (1997) 465-469).
En concreto, se utilizan preferiblemente las hh sonic, indian o desert (Fietz M. et al., Development (Suppl.) (1994) 43-51). Preferiblemente se utiliza una proteína hh que tiene una secuencia descrita en el banco de datos del EMBL bajo el número L38518. Las proteínas de la familia hedgehog tienen una homología pronunciada en su secuencia aminoacídica por lo que también es preferible expresar esos ácidos nucleicos que codifican para las proteínas hedgehog que son un 80% o más homologas a la secuencia arriba mencionada de la proteína sonic hedgehog. Preferiblemente las proteínas hedgehog se utilizan tal y como describe en la solicitud internacional núm. WO 99/28454 y en la solicitud de patente Europea núm. 99108032.6.
La proteína precursora sonic hedgehog humana está formada por los aminoácidos del 1 al 462 de la secuencia descrita en el banco de datos del EMBL bajo el número L38518. Los aminoácidos del 1 al 23 representan el péptido señal, los aminoácidos del 24 al 197 representan el dominio señal maduro, los aminoácidos del 32 al 197 representan el dominio señal reducido por ocho aminoácidos y los aminoácidos del 198 al 462 representan el dominio C-terminal autoprocesado después de la escisión autoproteolítica.
El efecto farmacéutico de la proteína hedgehog preferiblemente se sobreentiende como un efecto neurológico en las células nerviosas, preferiblemente osteogénesis o osteoinducción, y especialmente preferente la condrogénesis o la condroinducción tal y como se describe en Kinto et al., FEBS Letters, 404 (1997) 319-323 para la inducción ósea, por Miao et al. en J. Neurosci. 17 (1997) 5891-5899 para el efecto en las células nerviosas y por Stott et al. en J. Cell Sci. 110 (1997) 2691-2701 para la inducción celular del cartílago.
Las soluciones de las proteínas hedgehog a concentraciones elevadas son necesarias para preparar las matrices transportadoras que están recubiertas con, o insertadas en, los complejos de acuerdo con la invención de tal manera que tienen una eficacia farmacéutica adecuada para su aplicación local. Se ha desvelado que los transportadores que se pueden utilizar farmacéuticamente preferiblemente deberían contener una concentración de proteína hedgehog de 0,1 a 10 mg/ml de transportador y más. Las proteínas hedgehog son intrínsecamente poco solubles. Sin embargo, sorprendentemente, se ha descubierto que la solubilidad de las proteínas hedgehog aumenta de forma drástica y la estabilidad de las proteínas hh mejora a bajas concentraciones (<1 mg/ml o menos) en soluciones que contienen arginina o iones de arginino. Por lo tanto es preferible añadir arginina o iones de arginino a la solución acuosa y al complejo unido al transportador.
La actividad de la proteína hedgehog en referencia a la invención se entiende como la actividad de la fosfatasa alcalina (estimulación de la expresión de la fosfatasa alcalina) que puede inducir el polipéptido en células de mamífero (actividad en la prueba de fosfatasa alcalina). En este método se cultiva una línea celular de fibroblastos murinos en un medio de cultivo que contiene suero fetal bovino. Posteriormente se añade una muestra esterilizada por filtración, se lisan las células después de unos 5 días y se determina la fosfatasa alcalina en el lisado celular mediante la escisión de un sustrato cromogénico (pNP, p-nitrofenol)(J. Asahina, Exp. Cell. Res. 222 (1996) 38-47 y T. Nakamura (1997)).
La composición farmacéutica de acuerdo con la invención contiene una dosis farmacológicamente efectiva de la proteína hh y puede administrarse sistémicamente o, preferiblemente, de forma local. Es preferible utilizar las proteínas de acuerdo con la invención en combinación con otras proteínas de la familia hedgehog o con factores de crecimiento óseo como las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) (Wozney et al., Cell. Mol. Biol. of Bone, Bone Morphogenetic Proteins and their Gene Expression (1993) Academic Press Inc., 131-167) o con hormonas paratiroideas (Karablis et al., Genes and Development 8 (1994) 277-289) o con factores de crecimiento similares a insulina (IGF-I o II) o con la familia de factores de crecimiento transformantes (TGF-\beta, GDF). Estas otras proteínas también pueden estar presentes en los complejos de acuerdo con la invención, aunque no necesariamente.
Por consiguiente, otro asunto a tratar de la invención es un proceso para la producción de una composición farmacéutica preferiblemente soluble en agua de una proteína hedgehog a través de la combinación de dicha proteína hedgehog con un compuesto anfifílico bajo condiciones que permitan la formación de un complejo iónico entre la proteína hedgehog y el compuesto anfifílico.
Otro asunto adicional de la invención es el uso de un complejo de una proteína hedgehog de acuerdo con la invención para producir una composición farmacéutica en la que se utiliza el complejo como componente esencial de la composición y se combina opcionalmente con sustancias auxiliares farmacéuticas adicionales apropiadas, preferiblemente en una solución acuosa tamponada. En otra realización preferida, el complejo hedgehog de acuerdo con la invención se encuentra en una mezcla de una forma disuelta y precipitada, o solamente en una forma precipitada, que permite una liberación retardada de la proteína hedgehog o una aplicación local en el sitio de acción in vivo. La liberación de la proteína en el sitio de acción es más lenta a partir de esta mezcla que a partir de una formulación farmacéutica completamente disuelta.
Además es preferible que la producción de la composición farmacéutica incorpore sustancias auxiliares como cloruro sódico, azúcares (manitol, sacarosa, lactosa, glucosa, trehalosa, preferiblemente entre 20 y 100 mg/ml), aminoácidos como glicina, arginina, metionina o cisteína, antioxidantes como EDTA, citrato, tioglicerol, acetilcisteína, polietilenglicol (1-10% en peso), agentes antiinflamatorios, antestésicos locales, antibióticos o estabilizantes.
En otra realización preferida se prefiere una composición farmacéutica de la proteína hedgehog de acuerdo con la invención que contiene suramina y este hecho se puede utilizar para sacar provecho.
La composición farmacéutica puede contener sustancias auxiliares farmacéuticas adicionales y preferiblemente está liofilizada.
En una realización preferida la composición farmacéutica contiene proteína hedgehog en una concentración de entre 0,1 y 10 mg/ml, preferiblemente entre 0,1 y 5 mg/ml.
En una realización preferida la composición farmacéutica contiene adicionalmente un tampón farmacéuticamente aceptable que es biocompatible preferiblemente en un intervalo de pH entre 4 y 10, particularmente preferible en un intervalo de pH entre 6 y 8. La concentración del tampón es preferiblemente de entre 10 y 500 mmol/l, más preferiblemente entre 10 y 100 mmol/l. Es imprescindible seleccionar las concentraciones de sales de manera que no interfieran en la formación del complejo debido a una fuerza iónica elevada.
En otra realización de la invención la composición farmacéutica contiene el complejo de acuerdo con la invención insertado en un transportador biocompatible y, por ejemplo, puede utilizarse como un implante. El transportador es preferiblemente un polímero:
-
que no desnaturaliza la proteína hedgehog cuando está insertado en el transportador,
-
y que tiene un peso molecular medio de al menos 10.000 Da.
Estos polímeros son, por ejemplo, ácido hialurónico, colágeno, alginato o polímeros orgánicos como PLGA (copolímero del ácido poliláctico y glicólico) o derivados del mismo. Si el complejo se encuentra insertado en un transportador entonces no es necesario que el complejo sea completamente soluble en una solución como sí lo era en el caso de la composición farmacéutica acuosa antes descrita. Dado que el complejo unido al transportador se aplica localmente en el organismo, preferiblemente como un complejo de polipéptido hedghog en hueso o cartílago, se libera del complejo lentamente en forma soluble para así desarrollar el efecto biológico deseado.
Otro asunto a tratar de la invención es el uso de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención que se encuentra inmovilizada sobre (unida de forma reversible a) un transportador biocompatible de aplicación local en el cuerpo humano o en animales. Transportadores de este tipo son por ejemplo ácido hialurónico, colágeno, alginato o polímeros orgánicos como PLGA o derivados del mismo.
El complejo de acuerdo con la invención se encuentra preferiblemente situado sobre un transportador biocompatible de modo que el transportador pueda liberar el complejo localmente in vivo en una forma activa. Estas formulaciones son especialmente adecuadas para reparar defectos óseos o cartilaginosos pero también pueden utilizarse para corregir defectos neuronales o para una administración sistémica.
La composición farmacéutica de acuerdo con la invención contiene preferiblemente un polímero que actúa básicamente como una sustancia estructural que preferiblemente también tiene una función adhesiva para las células. El colágeno es un ejemplo de esta sustancia estructural.
En otra realización preferida la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se utiliza para reducir los efectos secundarios sistémicos externos al sitio de acción cuando se administra de forma local. La administración local de un polipéptido farmacéuticamente efectivo que no está totalmente inmovilizado o que no tiene una semivida local extremadamente corta puede llevar a una dispersión del polipéptido, o por lo menos una parte del mismo, más allá del sitio de acción deseado donde conduce a efectos sistémicos no deseados. Estos efectos sistémicos no deseados se pueden reducir considerablemente o incluso evitar a través de la invención. El método es adecuado para los polipéptidos que presentan una actividad aumentada diez veces o más en el complejo iónico si se compara con la forma que no constituye un complejo, mientras que el complejo tiene una menor solubilidad en una solución acuosa tamponada que el polipéptido que no forma un complejo. Estos polipéptidos son preferiblemente proteínas hedgehog, "cytoldnes" o factores de crecimiento como NGF.
De acuerdo con la invención, en este método se aplica preferiblemente de forma local un complejo iónico del polipéptido y el compuesto anfifílico en una cantidad tal que el polipéptido muestra una actividad en el complejo que corresponde a su dosis terapéutica (dosis efectiva) in vivo. La cantidad de complejo debe seleccionarse de modo que cuando el complejo se disocia, cosa que sucede por ejemplo cuando se diluye de 10 a 20 veces bajo condiciones fisiológicas (p. ej. en sangre), la actividad del polipéptido es solamente un 20% o menos de la dosis terapéutica. Por tanto, en una aplicación local como la descrita del complejo de acuerdo con la invención, el polipéptido farmacéuticamente efectivo muestra su efecto terapéutico completo como es el caso del crecimiento óseo local en el sitio de acción deseado cuando el polipéptido es un factor de crecimiento óseo como un citostático o el efecto de inducción de apoptosis cuando el polipéptido es un agente tumoricida. Cuando el complejo difunde desde el sitio de acción el complejo se diluye bajo las condiciones fisiológicas externas al sitio de acción, lo cual lleva a la disociación. Esto conlleva un descenso de la concentración del polipéptido en forma de complejo y un aumento de la concentración del polipéptido que no está en forma de complejo. Debido a que la actividad de este último es considerablemente menor que la del primero, el efecto terapéutico también se ve reducido fuera del sitio de acción.
Otro asunto a tratar relacionado con la invención es el uso de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para aplicación local en humanos caracterizada por la administración del complejo en una cantidad tal que el polipéptido en forma de complejo muestra una actividad que corresponde a su dosis terapéutica, mientras que la misma cantidad de polipéptido que no se encuentra en forma de complejo mostraría una actividad correspondiente a un 20% o menos de la dosis terapéutica.
Otro asunto a tratar relacionado con la invención es un proceso para la producción de una composición farmacéutica para la administración local en humanos caracterizada por el uso de un complejo de un polipéptido farmacéuticamente efectivo y de un compuesto anfifílico formado mediante interacción iónica como componente esencial, en el que el compuesto está presente en una concentración que empeora la solubilidad en agua del polipéptido farmacéuticamente efectivo, y el complejo es administrado en una cantidad en la que el polipéptido en forma de complejo muestra una actividad que corresponde a su dosis terapéutica mientras que la misma cantidad de polipéptido que no está en forma de complejo mostraría una actividad correspondiente al 20% o menos de la dosis terapéutica.
Los siguientes ejemplos, publicaciones y las figuras ilustran aún más la invención, el alcance protector de la cual se obtiene de las reivindicaciones de la patente. Los métodos descritos deben entenderse como ejemplos que describen el objeto de la invención aún después de posibles modificaciones.
Fig. 1 muestra la dependencia de la inducción de la fosfatasa alcalina en un ensayo celular mediante shh respecto a concentraciones cada vez mayores de desoxicolato.
Fig. 2 muestra la dependencia de la formación de agregado respecto a la concentración de desoxicolato.
Ejemplo 1 Análisis de la actividad de distintas formulaciones hedgehog en una prueba celular: Inducción de la fosfatasa alcalina
Se siembran 5000 células de la línea pluripotente mesenquimal murina C3H10T1/2 (ATCC CCL-226) en cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos. Las células están en DMEM, 2 mM de glutamina, 100 UI de penicilina/ml, 100 \mug de estreptomicina/ml y un 10% de suero fetal bovino. Al día siguiente el medio se reemplaza por otro medio que contiene shh humana (0,5 o 50 \mug/ml) en formulaciones diferentes (0; 0,00016; 0,00052; 0,0013; 0,0019 o 0,01% de desoxicolato sódico), o las diversas formulaciones hedgehog se añaden directamente. La prueba se detiene a los 5 días. Para ello se decantan los sobrenadantes y las células se lavan una vez con PBS. Las células se lisan en 50 \mul de Triton® X-100 al 0,1% y se congelan a -20ºC. Tras descongelar, se utilizan alícuotas de 25 \mul para la determinación de las proteínas y para determinar la actividad de la fosfatasa alcalina.
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Determinación de las proteínas según las instrucciones del fabricante Pierce:
A la mezcla se le añaden 75 \mul de agua bidestilada y a continuación se le añaden 100 \mul de reactivo de proteína BCA (Pierce Micro BCA, No. 23225). La absorbancia se mide a 550 nm tras 60 minutos.
Determinación de la actividad de la fosfatasa alcalina según las instrucciones del fabricante Sigma:
A la mezcla se le añaden 100 \mul de tampón de reacción (Sigma 221). Se disuelve una cápsula de sustrato (Sigma 104-40) en 10 ml de H_{2}O, después se toman 100 \mul de esta solución y se le añaden a la muestra de prueba mediante una pipeta. La absorbancia se mide a 405 nm. Durante la reacción la fosfatasa alcalina transforma el p-nitrofenilfosfato en p-nitrofenol (pNP). Las absorbancias medidas se convierten en nmol de pNP mediante curvas estándar.
En la figura 1 se muestran las actividades de diversas formulaciones hedgehog en nmol pNP/min/mg de proteína. Esto muestra que, para concentraciones iguales de proteína, las actividades de las formulaciones hedgehog estudiadas aumentaron considerablemente al incrementar las concentraciones de desoxicolato.
Ejemplo 2 Valoración del par iónico hidrofóbico de hshh (dímero)
Se mezcla proteína sonic hedgehog recombinante humana (dímero, 0,8 mg/ml en 50 mM de Tris-Cl, pH 7,4 o en Tween 80 al 0,1%, 50 mM de Tris-Cl, pH 7,4) con concentraciones crecientes de desoxicolato sódico. La absorbancia a 360 nm se mide como indicador de turbidez (formación de agregados insolubles en agua compuestos por complejos iónicos proteína-detergente). A partir de la figura 2, es fácilmente deducible que la transición a agregados insolubles en agua sucede por encima de cerca de un 0,04% de desoxicolato sódico. La formación de agregados insolubles en agua puede evitarse en gran medida en presencia de Tween 80 al 1%. Las absorbancias consideradas no se corrigen para la dilución.
Ejemplo 3 Análisis de las formulaciones de NGF en un ensayo de bioactividad: Ensayo de desarrollo neuronal en los ganglios raquídeos
La actividad biológica de NGF se determinó mediante el análisis morfométrico del desarrollo in vitro de neuronas de los ganglios raquídeos (DRG). En pocas palabras, se diseccionaron DRG lumbares de pollo embrionarios E7-E8, se liberaron del tejido conectivo que les rodeaba y, tras la digestión con un 0,1% de tripsina durante 20 min. a 37ºC, se disociaron por trituración mediante una pipeta Pasteur de extremo redondeado. Las células contaminantes, como los fibroblastos, se eliminaron mediante resembrado de toda la preparación celular en placas de cultivo de plástico durante 2 horas. Bajo estas condiciones las neuronas no se unen al sustrato mientras que los fibrolastos y otras células no neuronales se unen al plástico del cultivo. Las neuronas "limpias" se obtuvieron mediante recogida del sobrenadante y se sembraron sobre placas de plástico de poli-omitina/laminina (48 pocillos) a una densidad de 10.000 células/pocillo en medio de HAM F14 con un 5% de FBS. Se estableció una curva de valoración dosis-respuesta para NGF desde aproximadamente 1 pg/ml hasta 15 ng/ml. La actividad neurotrófica se cuantificó mediante el recuento de las neuronas diferenciadas viables que desarrollaron neuritas de tamaño superior al doble de diámetro del pericarion tras 48 horas de incubación con diferentes formulaciones de NGF. Los datos se representaron como el número medio de determinaciones dobles de neuronas diferenciadas frente a la concentración de formulaciones NGF de prueba y se determinaron las actividades estimulatorias semimáximas de NGF (EC50) en varias formulaciones diferentes (Tabla 1).
TABLA 1 Actividad estimulatoria semimáxima de las formulaciones NGF (EC50)
Formulación EC50 (pg/ml)
NGF (no aditivo) 75
NGF (0,006% de desoxicolato sódico) 17
NGF (0,02% de desoxicolato sódico) 10
Estos datos muestran claramente que la actividad específica de NGF aumenta en las formulaciones que contienen un aditivo anfifílico (aquí: desoxicolato sódico).
Ejemplo 4 Composiciones farmacéuticas con desoxicolato
Para la producción de la composición farmacéutica se dializan 100 ml de una solución acuosa de 5 mg/ml o de 1 mg/ml de Hshh (proteína sonic hedgehog humana) en 50 mmol/l de tampón Tris; pH 7,4; frente a una solución sin desoxicolato durante 24 horas a 4ºC. Después de la diálisis, se añade desoxicolato sódico de una solución madre mientras se agita para obtener una composición farmacéutica acuosa de 1 mg/ml o 5 mg/ml de Hshh en solución de formulación. La solución se esteriliza por filtración y se almacena a 4ºC. Se utilizan de 0,05 a 2 ml de la solución para la inyección en humanos o animales.
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4.1 Formulación de proteína hedgehog hidrofobizada de forma iónica en solución salina acuosa con tampón fosfato (baja en desoxicolato sódico)
Solución de formulación:
NaCl 150 mmol/l
Tampón de fosfato sódico 10 mmol/l
Desoxicolato sódico 0,05% (p/v)
pH 7,4 
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4.2 Formulación de proteína hedgehog hidrofobizada de forma iónica en solución salina acuosa con tampón fosfato (alta en desoxicolato sódico)
Solución de formulación:
NaCl 150 mmol/l
Tampón de fosfato sódico 10 mmol/l
Desoxicolato sódico 0,1% (p/v)
pH 7,4 
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4.3 Formulación de proteína hedgehog hidrofobizada de forma iónica en tampón fosfato de baja fuerza iónica (baja en desoxicolato sódico)
Solución de formulación:
NaCl 30 mmol/l
Tampón de fosfato potásico 20 mmol/l
Desoxicolato sódico 0,05% (p/v)
pH 6,5 
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4.4 Formulación de proteína hedgehog hidrofobizada de forma iónica en tampón fosfato de baja fuerza iónica (alta en desoxicolato sódico)
Solución de formulación:
NaCl 30 mmol/l
Tampón de fosfato potásico 20 mmol/l
Desoxicolato sódico 0,1% (p/v)
pH 6,5 
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Ejemplo 5 Composiciones farmacéuticas de proteína hedgehog hidrofobizada de forma iónica en solución salina con lípidos, ácidos grasos o esteroides, tamponada con fosfato
Para la producción de la composición farmacéutica se dializaron 100 ml de una solución acuosa de 1 mg/ml o de 2 mg/ml de Hshh en 50 mmol/l de tampón Tris, pH 7,4; frente a una solución de la formulación sin lípidos, ácidos grasos ni colato durante 24 horas a 4ºC. Tras la diálisis se añaden 0,01 g de fosfatidato; 0,01 g de fosfatidil serina; 0,01 g de palmitato; 0,05 g de colato; 0,05 g de taurodesoxicolato ó 0,05 g de taurocolato a partir de soluciones madre mientras se agita para obtener una composición farmacéutica acuosa de 1 mg/ml o de 2 mg/ml de Hshh en una solución de formulación. La solución se filtra de forma estéril y se almacena a 4ºC. Se utilizan de 0,05 a 2 ml de la solución para la inyección en humanos o en animales.
Solución de formulación:
NaCl 150 mmol/l
Tampón de fosfato sódico 10 mmol/l
Fosfatidato 0,01% (p/v)
pH 7,4 
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Solución de formulación:
NaCl 100 mmol/l
Tampón de fosfato sódico 10 mmol/l
Fosfatidil serina 0,01% (p/v)
pH 7,4 
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Solución de formulación:
NaCl 150 mmol/l
Tampón de fosfato potásico 20 mmol/l
Palmitato sódico 0,01% (p/v)
pH 7,4 
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Solución de formulación:
NaCl 150 mmol/l
Tampón de fosfato sódico 10 mmol/l
Colato sódico 0,05% (p/v)
pH 7,4 
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Solución de formulación:
NaCl 100 mmol/l
Tampón de fosfato sódico 10 mmol/l
Taurodesoxicolato sódico 0,05% (p/v)
pH 7,4 
\vskip1.000000\baselineskip
Solución de formulación:
NaCl 150 mM
Tampón de fosfato potásico 20 mM
Taurocolato sódico 0,05% (p/v)
pH 7,4 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 6 Composiciones farmacéuticas de proteínas morfogenéticas óseas (BMP-2) hidrofobizadas de forma iónica en tampones de arginina
Para la producción de la composición farmacéutica se dializan 100 ml de una solución acuosa de 0,4 mg/ml de BMP-2 frente a 500 mmol/l de arginina en 10 mmol/l de tampón de fosfato de potasio pH 6,0 durante 24 horas a 4ºC. Después de la diálisis, se añaden 0,01 g (de palmitato) ó 0,05 g (de desoxicolato o de taurodesoxicolato) a partir de una solución madre mientras se agita para obtener una composición farmacéutica acuosa de 0,4 mg/ml de BMP en solución de formulación. La solución se esteriliza por filtración y se almacena a 4ºC. Se utilizan de 0,05 a 2 ml de la solución para inyección en humanos o en animales.
\newpage
Solución de formulación:
Arginina 500 mmol/l
Tampón de fosfato potásico 10 mmol/l
Desoxicolato sódico 0,05% (p/v)
pH 6,0 
\vskip1.000000\baselineskip
Solución de formulación:
Arginina 500 mmol/l
Tampón de fosfato potásico 10 mmol/l
Palmitato sódico 0,01% (p/v)
pH 6,0 
\vskip1.000000\baselineskip
Solución de formulación:
Arginina 500 mmol/l
Tampón de fosfato potásico 10 mmol/l
Taurodesoxicolato sódico 0,05% (p/v)
pH 6,0 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 7 Composiciones farmacéuticas de Interleucina-2 hidrofobizada de forma iónica en solución salina tamponada con fosfato
Para la producción de la composición farmacéutica se dializan 100 ml de una solución acuosa de 1 o 2 millones de UI de Interleucina-2 en 50 mmol/l de tampón Tris, pH 7,4 frente a la solución de la formulación sin el compuesto anfifílico durante 24 h a 4ºC. Tras la diálisis se añaden durante agitación 0,05 g de desoxicolato, 0,01 g de fosfatidil serina o 0,01 g de palmitato sódico a partir de soluciones madre para obtener una composición farmacéutica acuosa de 1 o 2 millones de UI de Interleucina-2 en solución de formulación. La solución se esteriliza por filtración y se conserva a 4ºC. Se utilizan de 0,05 a 2 ml de la solución para la inyección en humanos o en animales.
\vskip1.000000\baselineskip
Solución de formulación:
NaCl 150 mmol/l
Tampón de fosfato sódico 10 mmol/l
Desoxicolato 0,05% (p/v)
pH 7,4 
\vskip1.000000\baselineskip
Solución de formulación:
NaCl 150 mmol/l
Tampón de fosfato sódico 10 mmol/l
Fosfatidil serina 0,01% (p/v)
pH 7,4 
\vskip1.000000\baselineskip
Solución de formulación:
Tampón de fosfato potásico 20 mmol/l
Palmitato sódico 0,01% (p/v)
pH 7,4 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 8 Composiciones farmacéuticas de Interferón alfa hidrofobizado de forma iónica en solución salina tamponada con fosfato
Para la producción de la composición farmacéutica se dializan 100 ml de una solución acuosa de 4 o 40 millones de UI de Interferón alfa-2b en 50 mmol/l de tampón Tris, pH 7,4 frente a la solución de formulación sin el compuesto anfifílico durante 24 h a 4ºC. Tras la diálisis se añaden 0,05 g de desoxicolato, 0,01 g de fosfatidil serina o 0,05 g de taurodesoxicolato a partir de una solución madre para obtener una composición farmacéutica acuosa de 4 o 40 millones de UI de Interferón alfa-2b en solución de formulación. La solución se esteriliza por filtración y se conserva a 4ºC. Se utilizan de 0,05 a 2 ml de la solución para la inyección en humanos o en animales.
\vskip1.000000\baselineskip
Solución de formulación:
NaCl 150 mmol/l
Tampón de fosfato sódico 10 mmol/l
Desoxicolato 0,05% (p/v)
pH 7,4 
\vskip1.000000\baselineskip
Solución de formulación:
NaCl 100 mmol/l
Tampón de fosfato sódico 10 mmol/l
Fosfatidil serina 0,01% (p/v)
pH 7,4 
\vskip1.000000\baselineskip
Solución de formulación:
NaCl 150 mmol/l
Tampón de fosfato potásico 20 mmol/l
Taurodesoxicolato sódico 0,05% (p/v)
pH 7,4 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 9 Composiciones farmacéuticas de NGF humano hidrofobizado de forma iónica en tampones de acetato
Para la producción de la composición farmacéutica, a 100 ml de una solución acuosa de 1 o 2 mg/ml de NGF humano en 100 mmol/l de tampón acetato sódico pH 6,0 se le añaden durante agitación 0,05 g de desoxicolato, 0,01 g de fosfatidato o 0,05 g de taurodesoxicolato a partir de una solución madre para obtener composiciones farmacéuticas acuosas. La solución se esteriliza por filtración y se conserva a 4ºC. Se utilizan de 0,05 a 2 ml de la solución para la inyección en humanos o en animales.
\vskip1.000000\baselineskip
Solución de formulación:
NGF humano 1 mg/ml
Tampón de acetato sódico 100 mmol/l
Desoxicolato 0,05% (p/v)
pH 6,0 
\vskip1.000000\baselineskip
Solución de formulación:
NGF humano 2 mg/ml
Tampón de acetato sódico 100 mmol/l
Fosfatidato 0,01% (p/v)
pH 6,0 
\vskip1.000000\baselineskip
Solución de formulación:
NGF humano 1 mg/ml
Tampón de acetato sódico 100 mmol/l
Taurodesoxicolato sódico 0,05% (p/v)
pH 6,0 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 10 Producción de un gel de alginato que contiene proteínas hedgehog
Se agita una alícuota de la solución de formulación del Ejemplo 4.1 en una solución madre de alginato sódico acuoso al 1% (p/v) (Pronota Biopolymer, Noruega) de tal manera que se forma una mezcla gelatinosa de alginato y proteína. Este gel se utiliza directamente como matriz para inyectables en una cantidad de 0,05 a 2 ml.
Ejemplo 11 Producción de una mezcla de colágeno que contiene BMP-2
100 ml de una de las soluciones de formulación del Ejemplo 6 se añaden gota a gota sobre esponjas de colágeno (Helistat, Integra Life Science, USA) de un tamaño de 10 x 10 x 3 mm. Los transportadores cargados se congelan (-70ºC) y se liofilizan. La esponja se utiliza de forma local en la curación de fracturas óseas.
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Claims (2)

1. Proceso de producción de una composición farmacéutica de aplicación local en humanos que es una solución acuosa límpida y en la cual un componente esencial es un complejo formado por interacción iónica entre un polipéptido farmacéuticamente efectivo seleccionado a partir del grupo que consiste en proteínas hedgehog, proteínas morfogenéticas óseas, factores de crecimiento, eritropoyetina, trombopoyetina, G-CSF, interleucinas e interferones, y un compuesto anfifílico seleccionado a partir del grupo que consiste en un tensioactivo aniónico, zwitteriónico o catiónico, un ácido graso, un alquilsulfonato, una fosfatidil serina, o un fosfatidato, estando el compuesto anfifílico presente en dicha composición a una concentración que no potencia la solubilidad en agua de dicho polipéptido, donde dicha composición presenta un valor de pH que difiere en al menos media unidad de pH de los valores pK de dicho polipéptido y de dicho compuesto anfifílico, y en el que la estructura molecular del polipéptido se mantiene en su estado activo natural y así no se reduce la actividad del polipéptido.
2. El proceso como se reivindica en la reivindicación 1, caracterizado porque el complejo está inmovilizado en un transportador biocompatible.
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