MXPA99008037A - Composicion farmaceutica soluble en agua en un complejo ionico y el uso de la misma - Google Patents

Abstract

Una composición soluble en agua que contiene un complejo de un polipéptido farmacéuticamente efectivo iónico seleccionado del grupo consistente en proteínas de erizo, proteínas morfogenéticas de hueso, factores de crecimiento, eritropoyetina, trombopoyetina, G-CSF, interleucinas e interferones, caracterizado porque dicha composición contiene, adicionalmente, un compuesto anfifílico, formando dicho polipéptido y dicho compuesto anfifílico un complejo iónico, de modo que la formación del complejo no aumenta la solubilidad de dicho polipéptido, es adecuado para aumentar la actividad del polipéptido y/o para la liberación controlada del polipéptido.

Description

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA SOLUBLE EN AGUA EN UN COMPLEJO IÓNICO Y EL USO DE LA MISMA Campo de la Invención La presente invención se refiere a una composición de un polipéptido que es biológicamente efectivo a través de su interacción con un receptor extracelular de la membrana celular, estando dicho polipéptido presente en dicha composición en un complejo iónico con un compuesto anfifílico. La invención se refiere adicionalmente al uso de dicha composición .

Antecedentes de la Invención El uso de compuestos anfifílicos como sistemas de administración de fármacos es bien conocido en el campo (ver patentes estadounidenses Nos. 5,650,393; 5,688,761; 5,665,328; 5,124,081; 5,109,038). La formación de complej os en fo ma de micelas entre sustancias con actividad superficial y agentes farmacéuticos es también conocida, por ejemplo en la mejora de la penetración transdérmica y transmembrana del agente activo (To linson y REF.: 31114 Davis, J., Colloid. Interf., Sci. 74 (1980) 349). Es también conocido que los agentes farmacéuticos presentan habitualmente mejores propiedades de transporte a través de membranas biológicas en su forma no ionizada respecto a su estado ionizado (Cools y Jansen, J. Pharm. Pharmacol. 35 (1983) : 689-691). Es también conocido que los péptidos que están presentes en formas de ionización múltiple a valores de pH fisiológicos no óptimos para su transporte al sitio de acción (transporte del fármaco) puesto que las moléculas cargadas, y en particular los polipéptidos, presentan una baja solubilidad en lípidos (Hirai y cois., Int. J. Pharm. 7 (1991): 317-325). Es conocido a partir de los trabajos de O ada y cois., J. Pharm. Sci, 72 (1993): 75-78, que es ventajoso unir un contraión lipófilo a la parte iónica del agente, mejorando de este modo la interacción con la membrana biológica con el objeto de facilitar el transporte de proteínas a través de las membras intestinales. Por ejemplo, Hazzenga y Berner describen un método mejorado para el transporte transdérmico de agentes activos zwitteriónicos en J. Controlled Reléase 16 (1991) : 77-88.

Otros métodos para mejorar la interacción de agentes con membranas biológicas se describen por ejemplo por Lee y cois., Critical Rev. Therp. Drug Carrier Systems 8 (1991): 91-192, Morimoto y cois., Arch. Int. Pharmcodyn. 302 (1989):18-26 y Aungst, Int. J. Pharm. 33 (1986): 225-234. Sin embargo, en todos estos métodos el objetivo fue aumentar la hidrofobicidad del agente activo con el objetivo de facilitar la penetración a través de membranas biológicas tales como la piel, y hacer llegar dicho agente hasta la célula. Las sustancias con actividad superficial se utilizan para este objetivo a una concentración que está por encima de la concentración micelar crítica (CMC, Womack y cois., Biochim. Biophys. Acta 733 (1983) : 210) . Una desventaja de dichos métodos es que las elevadas concentraciones de las sustancias con actividad superficial que se utilizan tienen una influencia importante sobre la membrana celular y pueden dañarla . Se conoce a partir de WO 94/08599 que una solución homogénea de un agente activo puede prepararse para la producción de agentes activos unidos a vehículo transportador añadiendo una cantidad adecuada de un detergente aniónico para formar un precipitado, aislar el precipitado y disolverlo de nuevo en un solvente orgánico. Esta solución homogénea que contiene un complejo entre el detergente aniónico y el agente activo puede utilizarse seguidamente para embeber o dispersar el agente activo en una matriz sólida. Adicionalmente, WO 94/08599 menciona que puede formarse un complejo de la proteína con un detergente aniónico y que el agente activo puede liberarse del mismo para la liberación controlada de una proteína. Es conocido que la actividad de proteínas puede mejorarse por el acoplamiento covalente a compuestos hidrofóbicos tales como ácidos grasos o esteroides. Sin embargo, estos métodos son complicados y conducen a la formación de productos no homogéneos debidos a la reacción química del acoplamiento (ver por ejemplo Ekra i, H.M. y cois., FEBS Letters 371 (1995): 283-286, Pepinski, R.B. y cois., J. Biol. Chem., 273 (1998): 14037-14045).

Descripción de la Invención El objeto de la invención es proporcionar composiciones de polipéptidos farmacéuticamente efectivos que mejoran la actividad del polipéptido contenido en la misma. El objeto se logra mediante una composición, preferentemente una composición farmacéutica, que contiene un polipéptido farmacéuticamente eficaz seleccionado del grupo consistente en proteínas de erizo, proteínas morfogenéticas de hueso, factores de crecimiento, eritropoyetina, t rombopoyetina , G-CSF, interleucinas e interferones, caracterizado en que dicha composición contiene, adicionalmente, un compuesto anfífílico, formando dicho polipéptido y dicho compuesto anfifílico un complejo iónico, de modo que la formación del complejo no aumenta la solubilidad de dicho polipéptido. La composición no contiene ningún solvente orgánico. La composición puede liofilizarse por motivos de conservación. En la invención, el polipéptido y el compuesto anfifílico son solubles indi idualmente a las concentraciones utilizadas en soluciones acuosas, preferentemente tamponadas, siendo únicamente la combinación de las dos sustancias lo que tiene como resultado la formación de un complejo mediante las interacciones iónicas que hidrofobizan el polipéptido y de este modo empeora, o al menos no mejora, su solubilidad en agua. Se ha hallado de modo sorprendente que de este modo puede mejorarse significativamente la actividad de dichos polipéptidos . De acuerdo con la invención, la cantidad y proporción del compuesto anfifílico y del polipéptido se seleccionan preferentemente de modo que la composición acuosa que contiene el complejo iónico es una solución transparente. Si la formación de complejos entre el polipéptido y el compuesto anfifílico tiene como resultado turbidez, entonces la solución se filtra para obtener una solución sin turbidez, si es que la solución va a utilizarse directamente como una solución para su administración a un paciente. Si la composición va a inmovilizarse en un vehículo transportador antes de la administración al paciente, no es necesario entonces evitar la turbidez.

El polipéptido farmacéuticamente eficaz es un polipéptido que puede estar presente en una forma iónica y que es reconocido y se une a receptores de superficie celular (receptor extracelular ) para desarrollar su actividad biológica. Dichos polipéptidos son factores de crecimiento (por ejemplo NGF, TGF-ß, FGF, GDF, factores de crecimiento del tipo insulina), eritropoyet ina, trombopoyet ina, G-CSF, interferones tales como el interferon a2b, interleucinas tales como interleucina 2 o interleucina 12, proteínas orfogenéticas de hueso tales como 'BMP-2, o proteínas de erizo tales como proteínas de erizo soni c r iridi an o desert . Se prefieren especialmente las proteínas de erizo. Se utilizan preferentemente polipéptidos con una actividad (efecto terapéutico y/o actividad proteica in vitro) que aumenta preferentemente 10 veces o más en el complejo de conformidad con la invención en comparación con la forma no acomplejada. La forma iónica del polipéptido puede obtenerse si está presente en un ambiente que difiere ventajosamente en al menos 0,5 unidades de pH respecto a su valor de pK.

El compuesto anfifílico de conformidad con la invención se entiende como un surfactante hidrofóbico aniónico, zwitteriónico o catiónico, un ácido graso, un alquil sulfonato o un lípido. Los surfactantes aniónicos preferidos son detergentes aniónicos tales como tensoactivos esteroideos tales como desoxicolatos , colatos, taurocolatos , taurodesoxicolatos , deshidrocolatos (útiles para polipéptidos catiónicos); los surfactantes z itteriónicos preferidos son CHAPS (3 [ ( 3-colamídopropil ) imetilamonio] -1-propano-sulfonato) y Z ittergent® (N-dodecil-N, N- imetil-3-a onio-l-propanosulfonato) ; y los detergentes catiónicos preferidos son bromuro de cetiltrimet ilamonio o cloruro de dodecilamonio (útiles para polipéptidos aniónicos); los ácidos grasos preferidos son ácidos grasos tales como ácido palmítico (útiles para polipéptidos catiónicos). Los alquilsulfatos preferidos son alquilsulfonatos tales como decilsulfonato (útil para polipéptidos catiónicos); y los lípidos preferidos son lípidos tales como fosfatidil serina (útiles para polipéptidos aniónicos) y fosfatidato (útil para polipéptidos catiónicos ) .

El compuesto anfifílico se añade a la composición en condiciones que hacen hidrófobo al polipéptido y de este modo se reduce, o al menos no mejora, la solubilidad en agua del polipéptido. Es importante que de acuerdo con la invención, se forma un complejo iónico soluble en agua entre el polipéptido y el compuesto anfifílico en este proceso. La relación de polipéptido respecto a compuesto anfífilico en el complejo dependerá del valor de pH utilizado y de los valores de pK de las dos sustancias, así como de la relación de concentración. Se utiliza un valor de pH que difiere en al menos media unidad de pH respecto de los valores de pK .del polipéptido y de la sustancia auxiliar. Cuanto más compuesto anfifílico se añada, más compuesto anfifílico se une al polipéptico, y más hidrófobo se torna el complejo. Esto puede conducir a la precipitación del complejo, y en consecuencia a la presencia de una mezcla de compuesto soluble e insoluble que ya no es completamente soluble en agua. Sin embargo, la adición de un detergente no iónico tal como un polioxámero como Tween® puede restaurar, al menos parcialmente, la solubilidad en agua del complejo, o bien la composición puede filtrarse de ser necesario. En este caso, el detergente no iónico puede estar presente también en concentraciones que conducen a la formación de micelas. Debe hacerse notar que el tipo y concentración de compuesto anfifílico se selecciona de modo que, especialmente en el caso de proteínas tales como polipéptidos, la estructura molecular del polipéptido queda retenida en su forma activa natural, por lo que en consecuencia no se reduce la actividad del polipéptido. Normalmente, un exceso molar de 10 veces de un compuesto anfifílico es suficiente para este propósito. Preferentemente, con una cantidad de proteína de 5 µg de proteína por ml , se añaden de un 0,001 a un 0,05% (peso por volumen) de compuesto anfifílico . Si se utiliza un surfactante desnaturalizante, tal como dodecil sulfato sódico (SDS) de conformidad con la invención, este compuesto puede utilizarse únicamente a concentraciones bajas. Es conocido que el SDS desnaturaliza proteínas a concentraciones elevadas, lo cual mejora la solubilidad en agua de estas proteínas, si bien en una forma desnaturalizada inactiva. Dichos compuestos anfifílicos como el SDS pueden formar también micelas a concentraciones superiores junto con los complejos deseados de acuerdo con la invención, lo cual puede a su vez aumentar la solubilidad del polipéptido. Una persona experta en el campo podrá determinar fácilmente_ por métodos habituales si el compuesto anfífílico provoca la desnaturalización no deseada del polipéptido. Dichos métodos incluyen por ejemplo la determinación de la actividad o métodos fisicoquímicos para controlar la estructura, tales como IR, CD y espectroscopia de fluorescencia. Una composición farmacéutica acuosa soluble en agua en el sentido de la invención debe interpretarse como una composición que esencialmente no comprende ninguna partícula insoluble que contenga el polipéptido farmacéuticamente efectivo. En particular, una composición farmacéutica acuosa debe interpretarse de conformidad con la invención como una composición que no posee una turbidez visible. Dichas composiciones solubles son posibles cuando el complejo iónico de conformidad con la invención es completamente soluble en agua a las concentraciones utilizadas de polipéptido y surfactante o el complejo no disuelto se elimina por filtración. De conformidad con la invención, la composición acuosa no contiene adicionalmente solventes orgánicos. Adicionalmente, podría ser necesario, para la fabricación de las composiciones, disolver los compuestos anfifílicos tales como los ácidos grasos en una pequeña cantidad de solvente orgánico (hasta un 5%, preferentemente hasta un 1% del volumen de la composición) . Un objeto adicional de la invención es un proceso para la producción de una composición farmacéutica acuosa de acuerdo con la invención que se caracteriza en que un polipéptido farmacéuticamente eficaz y un compuesto anfifílico que empeora o al menos no mejora la solubilidad en agua del polipéptido farmacéuticamente efectivo se combinan en una relación de concentraciones y a un valor de pH tal que se forma un complejo iónico entre el polipéptido y una sustancia auxiliar mediante interacción iónica. Un objeto adicional de la invención es el uso de la composición farmacéutica de conformidad con la invención para una administración local o sistémica en el cuerpo de humanos o mamíferos.

En una realización preferida, se utiliza una proteína de erizo en la composición farmacéutica como el polipéptico farmacéuticamente efectivo. Es conocido que la actividad de las proteínas de erizo puede mejorarse por modificación hidrofóbica covalente (Solicitud de Patente Europea Núm. 99108032.6) . De conformidad con la invención se ha descubierto sorprendentemente que la actividad de las proteínas de erizo puede aumentarse en gran medida mediante la formación de un complejo iónico entre una proteína de erizo y un compuesto anfifílico. En una realización preferida, se obtiene un aumento en la actividad de la proteína de erizo (en comparación con una proteína de erizo recombinante producida en E. Coli) de 10 veces o más . En consecuencia, un objeto preferido de la invención es una composición farmacéutica que contiene un complejo de una proteína de erizo y un compuesto anfifílico formado por interacciones iónicas en el que el compuesto está presente a una concentración que empeora, o que al menos no mejora, la solubilidad de dicha proteína de erizo.

Las proteínas de erizo (hh) son conocidas como una familia de proteínas señalizadoras secretadas, las cuales son responsables de la formación de numerosas estructuras durante la embriogénesis (J.C. Smith, Cell 76 (1994) 193 - 196, N. Perrimon, Cell 80 (1995) 517 - 520, C. Chiang et al., Nature 83 (1996) 407, M. J. Bitgood et al., Curr. Biol. 6 (1996) . 296 • A. Vortkamp et al., Science 273 (1996) 613, C. J. Lai et al., Development 121 (1995) 2349). Durante su biosíntesis se obtienen un dominio N-terminal de 20 kDa y un dominio C-terminal de 25 kDa tras la escisión de la secuencia señal y la escisión autocatalí t ica . En su forma natural el dominio N-terminal es modificado con colesterol o palmitoílo (J.A. Porter et al., Science 274 (1996) 255 - 259, Pepinski et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 14037 -14045) . En las formas superiores la familia hh está compuesta por al menos tres miembros llamados hh sonx c , i ndi an y deser t (Shh, Ihh, Dhh; M. Fietz et al., Development (Suppl.) (1994) 43 - 51). Se observaron diferencias en la actividad de las proteínas de erizo que fueron producidas de modo recombinante tras la producción en procariotas y eucariotas (M. Hynes et al., Neuron 15 (1995) 35-44 y T. Nakamura et al., Biochem. Biophys. Res. Com . 237 (1997) 465 - 469) . Se utilizan preferentemente hh soni c , i n di a n o desert (Fietz M., y cois., Development (suppl.) (1994): 43-51). Se utiliza preferentemente una proteína hh que tiene una secuencia descrita en el banco de datos del EMBL con el número de acceso L38518. Las proteínas de la familia de las proteínas de erizo presentan una pronunciada homología en su secuencia de aminoácidos, motivo por el cual es preferible expresar aquellos ácidos nucleicos que codifican las proteínas de erizo que son 80% o más homologas a las secuencias anteriormente mencionadas de la proteína de erizo soni c . Las proteínas de erizo se utilizan preferentemente tal como se describen por ejemplo en la Solicitud Internacional Núm. WO 99/28454 y en la Solicitud de Patente Europea Núm. 99108032.6. La proteína precursora de la proteína de erizo soni c humana se compone de los aminoácidos 1 - 462 de la secuencia descrita en el banco de datos EMBL bajo el No. L38518. Los aminoácidos 1 - 23 representan el péptido señal, los aminoácidos 24 - 197 representan el dominio de señal maduro, los aminoácidos 32 - 197 representan el dominio de señal acortado en ocho aminoácidos y los aminoácidos 198 -462 representan el dominio C-terminal autoprocesado tras la escisión autoproteolítica . El efecto farmacológico de la proteína de erizo se entiende preferentemente como un efecto neurológico sobre células nerviosas, preferentemente osteogénesis y/o osteoinducción, y especialmente preferentemente condriogénesis y/o condroinducción, tal como se describe en Kinto y cois., FEBS Letters, 404 (1997): 319-323 para la inducción ósea, por Miao y cois., en J. Neurosci. 17 (1997): 5891-5899 para el efecto sobre las células nerviosas, y por Stott y cois., en J. Cell. Sci. 110 (1997): 2691-2701 para la inducción de células de cartílago. Se requieren soluciones proteínas de erizo a elevadas concentraciones para producir matrices vehículo que estén recubiertas o embebidas con proteínas de erizo de modo que presenten una eficacia farmacéutica adecuada cuando sean aplicadas localmente. Se ha comprobado que los vehículos apropiados farmacéuticamente, recubiertos con proteína de erizo, deberían contener preferiblemente una concentración de proteína de erizo entre 0,1 - 10 mg/ml de vehículo y más. Las proteínas de erizo inherentemente son poco solubles. Sin embargo, se ha comprobado sorprendentemente que la solubilidad de las proteínas de erizo aumenta considerablemente y que la estabilidad de las proteínas de erizo se mejora a bajas concentraciones (<1 mg/ml o menos) en soluciones que contienen arginina o iones de argininio. Es por tanto preferible añadir arginina o iones argininio a la solución acuosa y al complejo unido al vehículo. Se entiende por actividad de la proteína de erizo dentro del sentido de la invención como la actividad de fosfatasa alcalina (estimulación de la expresión de fosfatasa alcalina) que el polipéptido puede inducir en células de mamífero (actividad en el test de la fosfatasa alcalina) . En este método una línea celular de fibroblasto de ratón es cultivada en un medio que contiene suero fetal de ternera. Subsiguientemente, se añade la muestra filtrada estéril, se lisan las células tras aproximadamente 5 días y se determina la fosfatasa alcalina en el lisado celular por medio de la escisión de un sustrato cromogénico (pNP, p-nitrofenol) (J. Asahina, Exp. Cell. Res. 222 (1996) 38 - 47 y T. Nakamura (1997)) . La composición farmacéutica según la invención contiene una dosis farmacológicamente efectiva de la proteína hh y puede ser administrada localmente o sistémicamente, preferentemente localmente. Es preferible usar las proteínas según la invención en combinación con otras proteínas de la familia del erizo o factores de crecimiento del hueso como proteínas morfogenéticas del hueso (BMPs) (Wozney et al., Cell. Mol. Biol. Of Bone, Bone Morphogenetic Proteins and their Gene Expression (1993) Academic Press Inc., 131-167) u hormonas parat iroideas (Karablis et al., Genes y Development 8 (1994) 277-289) o factores de crecimiento del tipo insulina (IGF-I) o II) o la familia de factores de crecimiento transformadores (TGF-ß, GDF ) . Estas otras proteínas pueden estar presentes, aunque no es imprescindible su presencia, en los complejos de conformidad con la invención. Por lo tanto, es un objeto adicional de la invención un proceso para la producción de una composición farmacéutica preferentemente soluble en agua de una proteína de erizo mediante la combinación de dicha proteína de erizo con un compuesto anfifílico en condiciones que permiten la formación de un complejo iónico entre la proteína de erizo y el compuesto anfifílico. Un objeto adicional de la invención es el uso de dicho complejo de proteína de erizo de conformidad con la invención para producir una composición farmacéutica en la que el complejo se utiliza como componente esencial de la composición y está combinado opcionalmente con sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables adicionales, preferentemente en una solución tamponada acuosa. En una realización adicional preferida, el complejo de erizo de conformidad con la invención está presente en una mezcla de una forma disuelta y precipitada o únicamente en una forma precipitada que permite una liberación controlada de la proteína de erizo o una aplicación local en el sitio de acción in vivo. La liberación de la proteína en el sitio de acción es más lenta a partir de esta mezcla que a partir de una formulación farmacéutica completamente disuelta. Además es preferible para la producción de la composición añadir sustancias auxiliares como azúcares (manitol, sucrosa, lactosa, glucosa, sacarosa, trehalosa, preferiblemente entre 20 - 100 mg/ml) o aminoácidos como glicina o arginina, metionina, cisteína, así como antioxidantes como EDTA, citrato, tioglicerol, acetilcisteína , polietilenglicol (1 - 10% en peso), agentes antiinflamatorios, anestésicos locales, antibióticos y/o estabilizantes. En una realización preferida adicional una composición de proteína de erizo según la invención conteniendo suramina es preferida y puede ser usada vent aj os amenté . La composición puede contener sustancias auxiliares farmacéuticas adicionales y está preferentemente liofilizada. En una realización preferida la composición farmacéutica contiene proteína de erizo a una concentración entre 0,1 - 10 mg/ml, preferentemente entre 0,1 y 5 mg/ml. En una realización preferida la composición farmacéutica adicionalmente contiene un tampón aceptable farmacéuticamente que es biocompatible, preferiblemente en el rango entre pH 4 y pH 10, particularmente preferiblemente en el rango entre pH 6 y pH 8. La concentración del tampón se encuentra preferiblemente entre 10 - 500 mmol/1, más preferentemente entre 10 - 100 mmol/1. Es imprescindible seleccionar las concentraciones de sal de modo que no interfieran con la formación del complejo debido a la fuerza iónica elevada. En otra realización de la invención, la composición farmacéutica contiene el complejo de conformidad con la invención embebido en un vehículo que es biocompatible y que puede por ejemplo ser utilizado como un implante. El vehículo es preferentemente un polímero que: - no desnaturaliza la proteína de erizo cuando está embebida en el vehículo, - tiene un peso molecular promedio de al menos 10000 Da. Tales polímeros son por ejemplo ácido hialurónico, colágeno, alginato o polímeros orgánicos tales como PLGA (copolímero de ácido poliláctico y glicólico) o derivados de los mismos. Si el complejo está embebido en un vehículo, no es necesario que el complejo sea completamente soluble en solución, como era útil para la composición farmacéutica acuosa descrita anteriormente. Puesto que el complejo unido al vehículo se aplica localmente en el cuerpo, preferentemente en forma de un complejo de polipéptido de erizo en hueso o cartílago, se libera lentamente en forma soluble a partir del complejo desarrollando de este modo su efecto biológico deseado. Un objeto adicional de la invención es el uso de una composición farmacéutica de conformidad con la invención que está inmovilizada sobre (o que está unida reversiblemente a) un vehículo biocompatible para la aplicación local sobre el cuerpo de seres humanos o sobre animales. Dichos vehículos biocompatibles son por ejemplo ácido hialurónico, colágeno, alginato o polímeros orgánicos tales como PLGA o derivados de los mismos. El complejo de conformidad con la invención se localiza preferentemente en un vehículo biocompatible en el que el vehículo puede liberar el complejo localmente in vivo en una forma activa. Dichas formulaciones son especialmente adecuadas para la reparación de defectos de hueso o cartílago, pero pueden utilizarse también para la reparación de defectos neuronales o para una administración sistemática .

La composición farmacéutica de conformidad con la invención contiene preferentemente un polímero que actúa esencialmente como una sustancia estructural que posee preferentemente también una función de adhesión para las células. Dicha sustancia estructural es por ejemplo colágeno. En una realización preferida adicional, la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se utiliza para reducir los efectos secundarios sistémicos fuera del sitio de acción deseado cuando se administra localmente. La administración local de un polipéptido farmacéuticamente eficaz que no está completamente inmovilizado o que no tiene una vida media local extremadamente breve puede conducir a la dispersión del polipéptido o al menos de parte del mismo más allá del sitio de acción deseado, lo cual conduce a acciones sistémicas no deseadas. Estos efectos sistémicos no deseados pueden ser reducidos considerablemente o incluso evitados por la invención. El método es adecuado para polipéptidos que tienen una actividad aumentada en 10 veces o más en el complejo iónico en comparación con la forma no acomplejada, de modo que el complejo tiene una solubilidad menor en una solución acuosa tamponada que el polipéptido no acomplejado. Dichos polipéptidos son preferentemente proteínas de erizo, citoquinas y factores de crecimiento tales como NGF. De conformidad con la • invención, un complejo iónico del polipéptido y el compuesto anfifílico se aplican preferentemente localmente en este método en una cantidad tal que el polipéptido exhibe una actividad en el complejo que se corresponde con su dosis terapéutica (dosis efectiva) in vivo. La cantidad de complejo debe seleccionarse de modo que el complejo se disocia, lo que por ejemplo ocurre cuando se diluye de 10 a 20 veces en condiciones fisiológicas, por ejemplo en la sangre, la actividad del polipéptido es entonces sólo un 20% o menos de la dosis terapéutica. De este modo, en dicha aplicación local del complejo de acuerdo con la invención el polipéptido farmacéuticamente efectivo muestra un efecto terapéutico completo tal como crecimiento local del hueso en el lugar de acción deseado cuando el polipéptido es un factor de crecimiento de hueso tal como un citostático o un efecto inductor de la apoptosis cuando el polipéptido es un agente tumoricida. Cuando el complejo difunde 'desde el sitio de acción, el complejo se diluye en las condiciones fisiológicas que prevalecen fuera del lugar de acción, lo cual conduce a la disociación. Esto tiene como resultado un descenso de la concentración del polipéptido acomplejado y un aumento en la concentración de polipéptido no acomplejado. Puesto que la actividad del polipéptido no acomplejado es considerablemente menor que la del polipéptido complejado, su efecto terapéutico se reduce asimismo fuera del sitio de acción . Un objeto adicional de la invención es el uso de una composición farmacéutica de conformidad con la invención para la aplicación local en humanos que se caracteriza en que el complejo se administra en una cantidad tal que el polipéptido acomplejado exhibe una actividad que se corresponde con su dosis terapéutica, mientras que la misma cantidad de polipéptido en una forma no acomplejada exhibiría una actividad del 20% o menos de la dosis terapéutica . Un objeto adicional de la invención es un proceso para la producción de una composición farmacéutica para la administración local en seres humanos que se caracteriza en que un complejo de un polipéptido farmacéuticamente efectivo y un compuesto anfifílico formado por interacción iónica se utiliza como componente esencial, en el que el compuesto está presente a una concentración tal que empeora la solubilidad en agua del polipéptido farmacéuticamente eficaz, y el complejo se administra en una cantidad tal que el polipéptido acomplejado exhibe una actividad que se corresponde con su dosis terapéutica, mientras que la misma cantidad de polipéptido en una forma no acomplejada exhibiría una actividad del 20% o menos de la dosis terapéutica . Los siguientes ejemplos, publicaciones y figuras contribuirán a una mejor comprensión de la invención, el alcance protector de la cual se deriva de las reivindicaciones de la patente. Los métodos descritos deben ser entendidos como ejemplos que siguen describiendo el objeto de la invención incluso tras modificaciones.

Breve descripción de las Figuras Figura 1: se muestra la dependencia de la inducción de fosfatasa alcalina en un ensayo en células por shh a concentraciones crecientes de desoxicolato . Figura 2: muestra la dependencia de la formación de agregados de la concentración de desoxicolato .

Ejemplo 1 Análisis de la actividad de diferentes formulaciones de proteínas de erizo en un ensayo celular : Inducción de fosfatasa alcalina. Se muestran en cada pocilio de una placa de microtitulación de 96 pocilios 5000 células de línea pluripotencial mesenquimatosa de ratón C3H10T1/2 (ATCC CCL-266) . Las células están en DMEM, glutamina 2 mM, penicilina 100 Ul/ml, estropt imicina 100 µg/ml y suero bovino fetal al 10%. Al día siguiente el medio se reemplaza por medio que contiene shh humana (0, 5 ó 50 µg/ml) en diferentes formulaciones (0, 0,00016, 0,00052, 0,0013, 0,0019 ó 0,01% de desoxicolato sódico), o bien las diversas formulaciones de proteínas de erizo se añaden directamente. El ensayo se para después de transcurridos 5 días. Se decantan los sobrenadantes y las células se lavan una vez con PBS. Las células se lisan en 50 µl de Tritón" X-100 0,1% y se congelan a -20°C. Después de descongelar, se utilizan alícuotas de 25 µl para la determinación de proteínas y para determinar la actividad de la fosfatasa alcalina. Determinación de proteínas de conformidad con las instrucciones del fabricante Pierce: Se añaden 75 µl de H20 redestilada a la mezcla, y seguidamente se añaden 100 µl de reactivo de proteínas BCA (Pierce Micro BCA, Núm. 23225). La absorbancia se mide a 550 nm tras 60 min. Determinación de la actividad fosfatasa alcalina de conformidad con las instrucciones del fabricante Sigma: Se añaden a la mezcla 100 µl de tampón de reacción (Sigma 221) . Se disuelve una cápsula de sustrato (Sigma 104-40) en 10 ml de H 0 y seguidamente se añaden 100 µl con pipeta a la mezcla de ensayo. La absorbancia se mide a 405 nm. Durante la reacción, la fosfatasa alcalina convierte el p-nitrofenilfosfato en p-nitrofenol (pNP). Las absorbancias medidas se convierten en nmol de pNP mediante curvas estándar. Las actividades de diversas formulaciones de proteínas de erizo en nmol/pNP/min/mg de proteína se representan en la Figura 1. Se muestra que, a las mismas concentraciones de proteínas, las actividades de las formulaciones de proteínas de erizo examinadas aumentaron considerablemente con concentraciones crecientes de desoxicolato. Ejemplo 2 Titulación de par iónico hidrofóbico de hshh (dimero) La proteína de erizo sonic humana recombinante (dimero, 0,8 mg/ml en 50 M de Trís-Cl , pH 7,4, o en Tween 80 0,1%, 50 mM de Tris- Cl, pH 7,4) se mezcla con concentraciones crecientes de desoxicolato sódico. La absorbancia a 360 nm se mide como un indicador de la turbidez (formación de agregados insolubles en agua compuestos por complejos iónicos de proteína-detergente). Resulta obvio de la Figura 2 que la transición a agregados insolubles en agua se produce aproximadamente por encima de 0,04% de desoxicolato sódico. La formación de agregados insolubles en agua puede evitar.se en gran medida en presencia de Tween 80 0,1%. Las absorbancias mencionadas no están corregidas para la dilución. Ejemplo -3 Análisis de las formulaciones NGF en un ensayo de bioactividad : ensayo de desarrollo de la neurona ganglionar de raíz dorsal. Se determinó la actividad NGF mediante el ensayo morfométrico de desarrollo de neuronas dorsales de la raíz ganglionar (DRG) in vitro. De forma resumida, DRG's lumbares se diseccionaron de embriones de pollo E7-E8, se despojaron de tejido conjuntivo adyacente y se disociaron por trituración a través de una pipeta pasteur moldeada a fuego, tras la digestión con un 0,1% de tripsina durante 20 minutos a 37°C. Las células contaminantes, tales como los fibroblastos, se eliminaron preplaqueando toda la preparación de células en placas de cultivo de tejidos de plástico durante 2 horas. En estas condiciones, las neuronas no se unen al sustrato, mientras que los fibroblastos y otras células no neuronales se adhieren al plástico del cultivo de tejidos. Las neuronas "limpias" se recogieron recuperando el sobrenadante y plaqueándolo en placas de plástico recubiertas de poliornitina/laminina (48 pocilios) a una densidad de 10.000 células por pocilio en medio HAM'sF14 conteniendo FBS al 5%. Se tituló una curva de dosis respuesta para NGF a partir de aproximadamente 1 pg/ml hasta 15 ng/ml. La actividad neurotrófica se cuantificó mediante el recuento de neurones diferenciadas viables que desarrollaron neuritas mayores que dos veces el diámetro del pericarion después de 48 horas de incubación con diferentes formulaciones de NGF. Los datos se representaron como el número medio de determinaciones dobles de neuronas diferenciadas respecto a la concentración de la formulación de ensayo de NGF, determinándose la mitad de las actividades estimuladoras máximas (CE50) de NGF en varias formulaciones diferentes (Tabla 1). i¿ Tabla 1 ACTIVIDAD ESTIMULADORA MÁXIMA DE FORMULACIONES DE GF (CE50) 1 i t- r\ "**—™11 ". 2_ ^ "» Ó T ^E ,50 (pg/r.I1 ¡ 1 v-*i :s?r. aditivo' ! -7 1 :NGF ídesoxicolatc scd ec C,00D°=. ' -" 1 INGF ¡?esox colanc sódico C,02°o) ' 10 | Estos datos muestran a las claras que la actividad específica de NGF está aumentada en ormulaciones que contienen un aditivo anfifílico (en este caso desoxicolato sódico) .

Ejemplo 4 Composi ciones farmacéuticas con deso icolato Para la producción de la composición farmacéutica, 100 mi de una solución acuosa de 5 mg/ml o 1 mg/ml de Hshh (proteína de erizo sonic humana) en 50 mmol /l de tampón Tris, pH 7,4, se dializan contra la solución de formulación sin desoxicolato durante 24 h a 4 ° C . Tras la diálisis se añade desoxicolato sódico a partir de una solución madre con agitación para obtener una composición farmacéutica acuosa de 1 mg/ml o 5 mg/ml de Hshh en solución de formulación. La solución se esteriliza por filtración y se conserva a 4°C. se emplean de 0,05 a 2 ml de la solución para la inyección en seres humanos o mamíferos. 4.1 Formulación de proteína de erizo hidrofobizada iónicamente en solución salina tamponada con fosfatos (baja concentración de desoxicolato sódico) Solución de formulación: NaCl: 150 mmol /l Tampón fosfato sódico 10 mmol/l Desoxicolato sódico: 0,05% (p/v) pH. 7,4 4.2 Formulación de proteína de erizo hidrofobizada iónicamente en solución salina tamponada con fosfatos (elevada concentración de desoxicolato sódico) Solución de formulación NaCl : 150 mmol /l Tampón fosfato sódico 10 mmol /l Desoxicolato sódico: 0.1% (p/v) PH 7, 4 4.3 Formulación de proteína de erizo hidrofobizada iónicamente en tampón fosfato de baja fuerza iónica (baja concentración de desoxicolato sódico ) Solución de formulación NaCl : 30 mmol /l Tampón fosfato sódico 20 mmol /l Desoxicolato sódico: 0,05% (?/v) pH. 6, 5 4.4 Formulación de proteína de erizo hidrofobi zada iónicamente en tampón fosfato de baja fuerza iónica (elevada concentración de desoxicolato sódico ) Solución de formulación NaCl 30 mmol /l Tampón fosfato sódico 20 mmol /l Desoxicolato sódico: 0,1% (p/v) pH. 6,5 Ejemplo 5 Composiciones farmacéuticas de proteína de erizo hidrofobizada iónicamente en solución salina tamponada con fosfatos con lípidos, ácidos grasos o esteroides . Para la producción de la composición farmacéutica se dializan 100 ml de solución acuosa de 1 mg/ml o 2 mg/ml de Hshh en 50 mmol/l de tampón Tris , pH 7,4, contra una solución de formulación sin lípidos, ácidos grasos o colato durante 24 horas a 4°C. Tras la diálisis se añaden a partir de soluciones madre 0,01 g de fosfatidato, 0,01 g de fosfatidil serina, 0,01 g de palmitato, 0,05 g de colato, 0,05 g de taurodesoxicolato o 0,05 g de taurocolato con agitación para obtener una composición farmacéutica acuosa de 1 mg/ml o 2 mg/ml de Hshh en solución de formulación. La solución se esteriliza por filtración y se conserva a 4°C. Se emplean de 0,05 a 2 ml de la solución para la inyección en seres humanos o animales.

Solución de formulación: NaCl: 150 mmol/1 Tampón fosfato sódico 10 mmol /l Fosfatidato : 0,01% (p/v) pH. 7,4 Solución de formulación NaCl: 100 mmol /l Tampón fosfato sódico 10 mmol /l Fosfatidilserina 0,01% (p/v) PH 7,4 Solución de formulación NaCl: 150 mmol /l Tampón fosfato sódico 20 mmol /l Palmitato sódico: 0,01% (p/v) pH. 7,4 Solución de formulación NaCl: 150 mmol/1 Tampón fosfato sódico 10 mmol /l Colato sódico: 0,05% (?/v) pH. 7,4 Solución de formulación: NaCl 100 mmol/1 Tampón fosfato sódico: 10 mmol /l Taurodesoxicolato sódico 0,05% (p/v) pH. 7,4 Solución de formulación NaCl 150 mmol /l Tampón fosfato sódico 20 mmol /l Taurocolato sódico: 0, 05% (p/v) pH 7,4 E emplo 6 Composiciones farmacéuticas de proteína morfogenética de hueso (BMP-2) hidrofobi zada iónicamente en tampones de arginina. Para la producción de la composición farmacéutica se dializan 100 ml de solución acuosa de 0,4 mg/ml de BMP-2 se dializa contra arginina 500 mmol /l en tampón _ fosfato potásico 10 mmol/1, pH 6,0, durante 24 horas a 4°C. Tras la diálisis, se añaden con agitación a partir de una solución madre 0,01 g de palmitato o 0,05 g de desoxicolato o taurodesoxicolato para obtener una composición farmacéutica acuosa de 0,4 mg/ml de BMP en solución de formulación. La solución se esteriliza por filtración y se conserva a 4°C. Se emplean de 0,05 a 2 ml de la solución para la inyección en seres humanos o animales.

Solución de formulación Arginina: 500 mmol /l Tampón fosfato sódico 10 mmol /l Desoxicolato sódico: 0,05% (p/v) pH. 6, 0 Solución de formulación: Arginina : 500 mmol /l Tampón fosfato potásico. 10 mmol /l Desoxicolato sódico: 0,01% (p/v) PH. 6, 0 Solución de formulación Arginina : 500 mmol /l Tampón fosfato potásico: 10 mmol /l Taurodesoxicolato sódico 0,05% (p/v) pH. 6, 0 Ejemplo 7 Composiciones farmacéuticas de interleucina 2 hidrofobizada iónicamente en solución salina tamponada con fosfatos. Para la producción de la composición farmacéutica se dializan 100 ml de solución acuosa de 1 ó 2 millones de Ul de interleucina-2 en tampón Tris 50 mmol/1, pH 7,4, contra solución de formulación sin el compuesto anfifílico durante 24 horas a 4°C. Tras la diálisis se añaden con agitación a partir de soluciones madre 0,05 g de desoxicolato, 0,01 g de palmitato sódico o 0,01 g de fosfatidil serina para obtener una composición farmacéutica acuosa de 1 6 2 millones de Ul de interleucina-2 en solución de formulación La solución se esteriliza por filtración y se conserva a 4°C. se emplean de 0,05 a 2 ml de la solución para la inyección en seres humanos o animales.

Solución de formulación NaCl: 150 mmol /l Tampón fosfato sódico 10 mmol /l Desoxicolato 0,05% (p/v) pH. 7,4 Solución de formulación NaCl 150 mmol /l Tampón fosfato sódico 10 mmol /l Fosfatidil serina: 0,01% (p/v) pH. 7,4 Solución de formulación NaCl: 150 mmol/1 Tampón fosfato potásico 20 mmol /l Palmitato sódico: 0,01% (p/v) pH: 7,4 Ejemplo 8 Composiciones farmacéuticas de interferón alfa hidrofobizada iónicamente en solución salina tamponada con fosfatos. Para la producción de la composición farmacéutica se dializan 100 ml de solución acuosa de 4 ó 40 millones de Ul de interferon- a2b en tampón Tris 50 mmol/1, pH 7,4, contra solución de formulación sin el compuesto anfifílico durante 24 horas a 4°C. Tras la diálisis, se añaden con agitación a partir de soluciones madre 0,05 g de desoxicolato, 0,05 g de taurodesoxicolato o 0,01 g de fosfatidil serina para obtener una composición farmacéutica acuosa de 4 ó 40 millones de Ul de interferon- a2b en solución de formulación La solución se esteriliza por filtración y se conserva a 4 ° C . Se emplean de 0,05 a 2 ml de la solución para la inyección en seres humanos o animales.

Solución de formulación NaCl 150 mmol /l Tampón fosfato sódico 10 mmol /l Desoxí colato : 0,05% (p/v) pH. 7,4 Solución de formulación NaCl : 100 mmol /l Tampón fosfato sódico 10 mmol/1 Fosfat idilserina : 0,01% (?/v) PH 7,4 Solución de formulación NaCl: 150 mmol /l Tampón fosfato potásico: 20 mmol/1 Taurodesoxicolato sódico 0,05% (p/v) pH. 7,4 Ejemplo 9 Composiciones farmacéuticas de NGF humano hidrofobizada iónicamente en tampones acetato. Para la producción de la composición farmacéutica se dializan 100 ml de solución acuosa de 1 ó 2 mg/ml de NGF humano en 100 mmol/1 de tampón acetato sódico, pH 6,0, se añaden con agitación a partir de soluciones madres 0,05 g de desoxicolato, 0,05 g de taurodesoxicolato o 0,01 g de fosfatidato para obtener una composición farmacéutica acuosa. La solución se esteriliza por filtración y se conserva a 4°C. Se emplean de 0,05 a 2 ml de la solución para la inyección en seres humanos o animales .

Solución de formulación NGF humano: 1 mg/ml Tampón acetato sódico: 100 mmol /l Desoxicolato : 0,05% (p/v; pH. 6, 0 Solución de formulación NGF humano: 2 mg/ml Tampón acetato sódico 100 mmol /l Fosfatidato: 0,01% (p/v: pH 6, 0 Solución de formulación: NGF humano: 1 mg/ml Tampón acetato sódico: 100 mmol/l Taurodesoxicolato sódico 0,05% (?/v: PH. 6,0 Ejemplo 10 Producción de un gel de alginato que contiene proteínas de erizo. Una alícuota de la solución de formulación del Ejemplo 4.1 se agita con una solución madre de alginato sódico acuoso 1% (p/v) (Pronova Biopolymer, Noruega) de modo que se forma una mezcla de proteína de alginato gelatinosa. Este gel se utiliza directamente como matriz inyectable en una cantidad de 0,05 a 2 ml .

Ejemplo 11 Producción de una mezcla de colágeno conteniendo BMP-2. Se añaden gota a gota 100 µl de las soluciones de formulación del Ejemplo 6 sobre esponjas de colágeno (Helistat, Integra Life Science, EE.UU.) con un tamaño de 10 x 10 x 3 mm. Los vehículos cargados se congelan (-70°C) y se liofilizan. La esponja se utiliza localmente para la cicatrización de fracturas de hueso.

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Claims (11)

R E I V I N D I C A C I O N E S

1. Una composición acuosa que contiene un polipéptido farmacéuticamente efectivo seleccionado del grupo consistente en proteínas de erizo, proteínas morfogenét icas de hueso, factores de crecimiento, eritropoyetina, trombopoyetina, G-CSF, interleucinas e interferones , caracterizada porque dicha composición contiene, adicionalmente, un compuesto anfifílico, formando dicho polipéptido y dicho compuesto anfifílico un complejo iónico, de modo que la formación del complejo no aumenta la solubilidad de dicho polipéptido.

2. La composición tal como se reivindica en la reivindicación 1 en forma liofilizada.

3. La composición tal como se reivindica en la reivindicación 2, caracterizada porque el complejo está inmovilizado en un vehículo biocompatible .

4. La composición tal como se reivindica en la reivindicación 3, caracterizada porque el complejo está presente en una mezcla de una forma disuelta y precipitada.

5. La composición tal como se reivindica en las reivindicaciones de 1 a , caracterizada porque dicha composición tiene un valor de pH en solución acuosa que difiere al menos en media unidad de pH de los valores de pK de dicho polipéptido y de dicho surfactante.

6. La composición tal como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque dicho polipéptido es una proteína de erizo.

7. La composición tal como se reivindica en las reivindicaciones de 1 a 6, caracterizada porque el compuesto anfifílico es desoxicolato.

8. El uso de una composición como se reivindica en las reivindicaciones de 1 a 7 para la liberación controlada o la aplicación local de la proteína de erizo en el cuerpo humano.

9. El proceso para la producción de una composición farmacéutica para la aplicación local en seres humanos, caracterizado porque se utiliza como componente esencial un complejo de polipéptido farmacéuticamente efectivo seleccionado del grupo consistente en proteínas de erizo, proteínas morfogenéticas de hueso, factores de crecimiento, eritropoyetina, trombopoyetina, G-CSF, interleucinas e interferones, y de un compuesto anfifílico formado por interacción iónica, en el que el compuesto auxiliar está presente a una concentración que no aumenta la solubilidad en agua de dicho polipéptido.

10. Proceso tal y como se reivindica en la reivindicación 9, caracterizado porque el complejo está inmovilizado sobre un vehículo biocompatible.

11. Un método para aumentar la actividad de un polipéptido que es reconocido y se une a un receptor de superficie celular, caracterizado por la formación de un complejo iónico entre dicho polipéptido y un compuesto anfifílico.