KR19990072423A - 헤지호그단백질의약학조성물및그의용도 - Google Patents
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Abstract
- 이온성 상호작용의 결과로 음-전하 담체로서 헤지호그 단백질(hedgehog protein)과 결합하고;
- 헤지호그 단백질과 결합할 때 상기 헤지호그 단백질을 변성시키지 않으며;
- 중성 조건하에서 단량체 당 0.1 내지 2 이상의 음-전하 잔기를 포함하며;
- 산성 그룹의 형태로 전하를 포함하며;
- 50,000 돌턴 이상의 평균 분자량을 가지며;
- 아가로우즈(agarose)를 포함하지 않는 중합체인 생체적합하고 생분해가능한 친수성 담체에 헤지호그 단백질이 결합하는 것을 특징으로 하는 헤지호그 단백질의 약학 조성물은 지연된 방식으로 생체 조건내에서(in vivo) 담체로부터 헤지호그 단백질을 가역적으로 및 활성형으로 방출한다.
Description
본 발명은 헤지호그(hedgehog) 단백질의 약학 조성물 및 특히 경골과 연골에서의 이 단백질의 국소 방출을 위한 그의 용도에 관한 것이다.
헤지호그(hh) 단백질은 배발생에서 다수의 구조를 형성하는 기능을 담당하는 분비 신호 단백질의 계열로서 이해된다(제이.씨.스미드(J.C.Smith)의 문헌 "Cell 76 (1994) 193 - 196", 엔.페리몬(N.Perrimon)의 문헌 "Cell 80 (1995) 517 - 520", 씨.치앙(C.Chiang) 등의 문헌 "Nature 83 (1996) 407", 엠.제이.비트굿(M.J.Bitgood) 등의 문헌 "Curr. Biol. 6 (1996) 296", 에이.보르트캄프(A.Vortkamp) 등의 문헌 "Science 273 (1996) 613", 씨.제이.레이(C.J.Lai) 등의 문헌 "Development 121 (1995) 2349"). 그것이 생합성 되는 동안, 신호 서열의 절단 및 자가촉매적 절단 후에 20 kD의 N-말단 영역 및 25 kD의 C-말단 영역이 수득된다. N-말단 영역은 천연 형태에서 콜레스테롤을 사용하여 변형된다(제이.에이.포터(J.A.Porter) 등의 문헌 "Science 274 (1996) 255 - 259"). 고등 생물 형태에서 hh 계열은 소닉(sonic), 인디언(indian) 및 데저트(desert) hh(Shh, Ihh, Dhh; 엠.피츠(M.Fietz) 등의 문헌 "Development(Suppl.) (1994) 43 - 51")의 세가지 구성원 이상으로 구성된다. 재조합으로 생성된 헤지호그 단백질들의 활성에 있어서의 차이가 원핵 생물 및 진핵 생물에서의 생성 후에 관찰되었다(엠.하인스(M.Hynes) 등의 문헌 "Neuron 15 (1995) 35 - 44" 및 티.나카무라(T.Nakamura) 등의 문헌 "Biochem.Biophys.Res.Comm. 237 (1997) 465 - 469").
하인스 등은 형질전환된 사람 배(embryo)의 신장 293 세포의 상등액 내 hh(진핵 hh)의 활성을 대장균에서 생성된 hh와 비교하여, 신장 세포주의 상등액으로부터 얻은 hh가 네 배 더 높은 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 오직 진핵 세포에서만 발현되는 잠재적 부가적 보조요소, 번역후 변형, 대장균에서 분리된 hh가 두 개의 부가적 N-말단 아미노산(글리신-세린)을 수반하는 hh를 50% 포함하거나 또는 5 내지 6개 아미노산이 감소된 것에 기인하는 상이한 N-말단, 또는 더 높은 응집 상태(예컨대, 니켈 아가로우즈 비드(bead)에 결합함으로써)가 이 증가된 활성의 이유인 것으로 논의되어 왔다.
나카무라 등은 형질전환된 닭의 배 섬유 아세포의 상등액 내 shh의 활성을, 여전히 N-말단 폴리히스티딘 부분을 갖는 대장균에서 분리된 shh 융합 단백질과 비교하였다. 섬유 아세포의 상등액 내 shh는 C3H10T ½ 세포 내 알칼리성 포스파타아제(AP)의 자극에 관하여 정제된 대장균 단백질보다 7배 더 높은 활성을 갖는다. 진핵 세포의 상등액에만 존재하고 AP의 더 강한 유도를 야기하는 경골 조형 단백질(BMPs)과 같은 분자가 증가된 활성의 이유로서 논의되어 왔다.
킨토(Kinto) 등의 문헌 "FEBS Letters, 404 (1997) 319 - 323"은 hh를 분비하는 섬유 아세포가 콜라겐 상의 근육내 이식(i.m. implantation)에서 이소성 경골(ectopic bone) 형성을 유도한다고 기술하였다. 따라서 헤지호그 단백질은 골유도 활성(osteoinductive activity)을 갖는다.
알긴산을 사용하여 지연 방출(delayed release)하는 단백질 송달 시스템을 제조하는 방법은 국제 공개 제 90/08551 호로부터 공지되어 있다. 이 방법에서는 2상 시스템이 형성되는데, 제 1상은 고농도의 단백질(포화 용액)을 포함하고 제 2상은 알긴산을 포함한다. 그러나 이러한 상 분리는 약학 조성물을 다량으로 제조할 때 수행하기에는 어렵고 복잡하다.
칼슘-알긴산 복합체로부터의 덱스트란의 박동성(pulsatile) 방출이 기쿠치,에이.(Kikuchi,A.) 등의 문헌 "J.Controlled Release 47 (1997) 21 - 29"로부터 공지되어 있다. 그러나, 이러한 복합체에 헤지호그 단백질을 결합시키는 것은 기쿠치에 의해 설명되어 있지 않다.
로빈슨, 씨.제이.(Robinson,C.J.) 등은 문헌 "Trends in Biotechnology 14 (1996) 451 - 452"에서 NGF 또는 NGF-분비 세포의 국소 적용을 위한 방법으로서 알긴산 미세구의 심실내 이식을 기술하였다. 그러나, 헤지호그 단백질에 대한 적용은 설명되어 있지 않다.
다운스,이.씨.(Downs, E.C.) 등은 문헌 "J.Cell.Physiol. 152 (1992) 422 - 429"에서 맥관형성(angiogenesis) 요소에 관한 송달 시스템으로서 알긴산 칼슘 구의 적용을 기술하였다. 그러나, 헤지호그 단백질을 위한 이 방법 또는 이 송달 시스템의 용도는 기술되어 있지 않다.
크레이,씨.제이.(Crey,C.J.) 및 제이.다우셋(J.Dowsett)은 문헌 "Biotechnol.Bioeng. 31 (1988) 607 - 612"에서 인슐린에 관한 송달 시스템으로서 알긴산 칼슘/아연 구의 용도를 기술하였다. 그러나, 헤지호그 단백질의 송달 시스템 제조를 위한 이 방법의 용도는 이로부터 공지되어 있지 않다.
양(Yang) 등의 문헌 "Development 124 (1997) 4393 - 4404"로부터, 약학적으로 유효한 생체내적(in vivo) 활성을 위해서는 체내 작용 부위에서 16시간 이상의 기간동안 국소 헤지호그의 고농도가 유지되어야 한다는 것이 공지되어 있다. 헤지호그-결합된 크로마토그래피 매체 아피겔 씨엠(Affigel CM)과 같이 양 등에 의해 기술된 담체 시스템, 마르티(Marti) 등의 문헌 "Nature 375 (1995) 322 - 325"에 기술된 니켈-아가로우즈, 또는 로페츠-마르티네츠(Lopez-Martinez) 등의 문헌 "Curr.Biol. 5 (1995) 791 - 796"에서 사용된 아피겔 블루(Affigel Blue) 또는 여기에서 사용된 헤파린-아가로우즈 입자들은 그들이 면역원성(immunogenic)이고 염증 반응을 유발시킬 수 있기 때문에 약학적 적용에 부적합하다.
본 발명자들은, 헤지호그 단백질이 오직 이온성 상호작용을 통해서만 담체와 결합하는 한, 킨토 등에 의해 기술된 hh-발현 세포를 위한 생체적합하고 생분해성인 담체 콜라겐 역시 최적의 헤지호그 단백질의 국소 약학적 적용에 부적합하다는 것을 발견했다. 생리적 조건(약 pH 7 및 약산(pH 4.5까지))하에서 헤지호그 단백질을 콜라겐 담체에 결합시켰을 때 대부분의 적용된 헤지호그 단백질이 기재로부터 수분 이내에 방출되는 것이 발견되었다. 본 발명자들이 발견한 바에 따르면, 이러한 불충분한 결합은 헤지호그 단백질 및 담체 사이의 충분한 이온성 상호작용이 결여된 것에 기인한다. 산성 조건(pH 4.5 미만)하에서 결합하는 경우에는, 다량의 적용된 헤지호그 단백질이 변성되고 비가역적으로 담체에 결합된다.
도1은 콜라겐 기재로부터의 shh의 시험관내(in vitro) 방출을 나타낸다.
도2는 알긴산 칼슘 캡슐로부터의 shh의 시험관내 방출을 나타낸다.
도3은 히알루론산 겔로부터의 shh의 시험관내 방출을 나타낸다.
도4는 알긴산/콜라겐 기재로부터의 shh의 시험관내 방출을 나타낸다.
그러므로 본 발명의 목적은 담체가 절첩된(folded) 구조의 활성형 헤지호그 단백질과 결합하고 생체내적으로 지연된 방식으로 활성 형태의 헤지호그 단백질을 방출할 수 있는 생체적합한 담체를 갖는 헤지호그 단백질의 약학 조성물을 제공하는 것이다. 그러한 제형은 경골 및 연골 손상을 복구하는데 특히 적합할 뿐아니라, 또한 신경 손상 복구 또는 전신 송달에 사용될 수도 있다.
본 발명의 목적은,
- 이온성 상호작용의 결과로 음-전하 담체로서 헤지호그 단백질과 결합하고;
- 헤지호그 단백질과 결합할 때 헤지호그 단백질을 변성시키지 않으며;
- 중성 조건하에서 단량체 당 0.1 내지 1, 바람직하게는 0.1 내지 2 이상의 음-전하 잔기를 포함하며;
- 전하를 황산, 카르복실 또는 인산 그룹과 같은 산성 그룹의 형태로 포함하며;
- 담체의 평균 분자량이 50,000 돌턴 이상인 중합체인 생체적합한 친수성 담체에 헤지호그 단백질이 결합하는 것을 특징으로 하는 헤지호그 단백질의 약학 조성물에 의해 달성된다.
놀랍게도, 만일 헤지호그 단백질이 음으로 하전된 가용성 또는 불용성 중합체 기재에 결합되면 생체내적으로 균일(homogeneous) 및/또는 염증 반응 없이 지연된 방식으로 생체 조건내에서 활성 형태로 가역적으로 담체로부터 방출될 수 있다는 것이 판명되었다.
바람직하게는 친수성 담체 기재가 사용되고 특히 바람직하게는 가용성 또는 불용성 유기 친수성 담체 기재가 사용된다. 담체 기재는, 특히 바람직하게는 히알루론산(그의 화학적으로 교차결합된 형태 포함), 황산 콘드로이틴, 황산 폴리비닐 ,황산 케라틴, 황산 덱스트란, 펙틴, 카라기난(carrageenans) 및 그밖의 친수콜로이드, 황산 알긴산(sulfated alginate), 황산 더마탄, 알긴산, 바람직하게는 알긴산 칼슘과 같은 음이온성 다당류, 또는 둘 이상의 그러한 음이온성 다당류의 조합, 또는 중량%가 10 내지 50%인 이들 하전된 다당류와 특히 콜라겐과 같은 다른 중합체와의 조합으로 구성된다. 본 발명에서 불용성 기재란, 실온에서 10 내지 20 시간 이내에 시험관내적으로(in vitro) 완충 용액내에서 기재가 필수적으로 분해되지 않거나 가시적으로 용해되지 않는 것을 의미한다. 이와 관련하여 본 발명에 따라 사용되는 담체는 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만의 중성 다당류를 포함하는 것이 바람직하고, 필수적으로 중성 다당류를 포함하지 않는 것이 특히 바람직하다. 분자량 106돌턴 이상, 특히 분자량 4 × 106돌턴을 갖는 히알루론산이 담체 기재로서 특히 적합하다.
추가의 실시태양에서 수산인회석(hydroxylapatite) 또는 인산 삼칼슘과 같은 무기 불용성 인산에 기초하는 친수성 담체도 또한 본 발명에 따라 불용성 담체 기재로 적합하다는 것이 판명되었다.
본 발명에 따른 지연 방출은 14시간 이상의 설정 기간을 초과하는 약리학적 유효량의 헤지호그 단백질의 방출로서 이해된다. 약리학적 효과는, 경골 유도에 관한 킨토 등의 문헌 "FEBS Letters, 404 (1997) 319 - 323", 신경 세포에서의 효과에 관한 미아오(Miao) 등의 문헌 "J.Neurosci. 17 (1997) 5891 - 5899", 및 연골 세포 유도에 관한 스코트(Scott) 등의 문헌 "J.Cell.Sci. 110 (1997) 2691 - 2701"에 기술되어 있는 바와 같은, 신경 세포에서의 신경학적 효과, 연골 형성 및/또는 연골 형성 유도 및 바람직하게는 경골 형성 및/또는 경골 유도로서 이해된다.
효소적으로 분해가능한 담체는, 생체내 국소 적용이 수행되는 세포로부터 분비되는 효소(예컨대 프로테아제)에 의해 분해될 수 있는 담체로서 바람직하게 사용된다. 그러나, 담체의 반감기는 12시간 이상이어야 하지만, 몇 주일 수도 있다. 만일 담체가 다당류로 구성된다면, 이 담체는 세포내에 존재하고 분비되는 글리코시다제 및 가수분해효소에 의해 바람직하게 분해된다. 그러나, 이러한 담체의 생분해성은 모든 경우에 필수적이지는 않다. 만일 골다공증 또는 신경성 질병을 치료하기 위해 방출이 수행된다면, 생분해성은 필수적이지 않다. 그러나, 이러한 담체는 바람직하게는 생리적 조건하에서 용해성이 낮고 따라서 비교적 장기간(몇 주 내지 몇 달)동안 신체에 의해 흡수된다.
헤지호그 단백질로 코팅되어 국소적으로 적용될 때 적절한 약학적 효능을 나타내는 담체 기재를 생성하는데 고농도의 헤지호그 단백질의 용액이 필수적이다. 바람직하게는 약학적으로 사용될 수 있는 헤지호그 단백질로 코팅된 담체가 1 내지 5mg/ml, 바람직하게는 담체 1ml 당 3mg 이상의 헤지호그 단백질의 농도를 포함해야 한다는 것이 판명되었다. 담체가 10 mg/ml 이상의 농도로 헤지호그 단백질을 포함하는 것이 특히 바람직하다. 헤지호그 단백질은 본질적으로 잘 용해되지 않는다. 그러나, 놀랍게도 헤지호그 단백질의 용해성이 아르기닌 또는 아르기니니움 이온(바람직하게는 황산 아르기니니움)을 포함하는 용액 내에서 엄청나게 증가한다는 것이 판명되었다. 따라서 본 발명의 또다른 주제는 아르기닌 및 아르기니니움 이온을 포함하고 바람직하게는 완충된 3 mg/ml 이상의 농도의 헤지호그 단백질의 수용액에 관한 것이다. 본 발명의 또다른 주제는, 담체 기재를 아르기닌 또는 아르기니니움 이온을 포함하는 3 mg/ml 농도의 헤지호그 단백질 용액과 반응시켜 이러한 방법으로 코팅된 담체 기재를 분리함을 특징으로 하는 헤지호그 단백질로 코팅된 담체 기재의 제조 방법에 관한 것이다.
이러한 용액은 약학적 유효 농도로 헤지호그 단백질을 포함하는 담체 기재를 생성하는데 적합하고 약학적 적용에도 적합하다. 따라서 본 발명의 또다른 주제는 담체 기재 1ml 당 3mg 이상, 바람직하게는 10 mg 이상의 헤지호그 단백질 및 아르기닌 또는 아르기니니움 이온을 포함하는 담체 기재에 관한 것이다. 아르기닌의 농도는 바람직하게 pH 6 내지 8 범위에서 10 내지 500 mmol/l가 바람직하다.
본 발명에서 활성이란, 포유동물 세포내에서 폴리펩티드가 유도할 수 있는 알칼리성 포스파타아제의 활성(알칼리성 포스파타아제의 발현 촉진)으로서 이해된다(알칼리성 포스파타아제 분석에서의 활성). 이를 위해 쥐 간엽 세포주를 송아지 태아 혈청을 포함하는 배지에서 배양한다. 이어서 살균 여과한 샘플을 첨가하고, 세포를 약 5일후에 용해하여 색소형성 기질(pNP, p-nitrophenol)의 절단에 의해 세포 용해물에서 알칼리성 포스파타아제를 측정한다(제이.아사히나(J.Asahina)의 문헌 "Exp.Cell.Res. 222 (1996) 38 - 47 및 티.나카무라 (1997)).
본 발명에서 헤지호그 단백질은 배발생에서 다수의 구조를 형성하는 기능을 담당하는 분비 신호 단백질로서 이해된다. 소닉, 인디언 또는 데저트 hh가 특히 바람직하게 사용된다(피츠 엠.(Fietz M.) 등의 문헌 "Development(Suppl.) (1994) 43 - 51"). 번호 L38518호로 이엠비엘 데이터베이스(EMBL database)에 기재된 바와 같은 서열을 갖는 hh 단백질이 바람직하게 사용된다. 헤지호그 계열의 단백질은 그 아미노산 서열에서 뚜렷한 동종관계를 나타내는데, 이것이 상기-언급된 소닉 헤지호그 단백질의 서열과 80% 이상의 동종성이 있는 헤지호그 단백질을 암호화하는 핵산을 발현하는 것이 또한 바람직한 이유이다.
사람 소닉 헤지호그 전구 단백질은 번호 L38518호로 이엠비엘 데이터베이스에 기재된 아미노산 1 내지 462 서열로 구성된다. 아미노산 1 내지 23은 신호 펩티드를 나타내고, 아미노산 24 내지 197은 성숙 신호 영역을 나타내고 아미노산 32 내지 197은 8개의 아미노산이 감소된 신호 영역을 나타내고, 아미노산 198 내지 462는 자가분해적(autoproteolytic) 절단 이후의 자가-처리(auto-processing) 영역을 나타낸다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 바람직하게는 세포에 대한 흡착 기능도 갖지만 이온성 상호작용에 기초하여 헤지호그 단백질에 결합하지는 않는, 필수적으로 지지 구조 물질로서 작용하는 부가적인 중합체를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 이 물질은 가용화된 단백질 또는 부분적으로 가수분해된 단백질로서 예를 들면 변형되지 않은(intact) 단백질 섬유의 형태로 사용될 수 있는 생분해성 단백질 또는 가수분해성 분해 산물이다. 이러한 지지 구조 물질은 바람직하게는 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴 또는 피브린이다. 지지 구조 물질은 본 발명에 따라 기술된 생체적합한 친수성 담체보다 적은 양으로 존재하는 것이 바람직하다. 따라서 지지 구조 물질의 비율은 바람직하게는 30% 이하, 바람직하게는 10% 이하이다. 그러나, 지지 구조 물질은 친수성 담체와 비교하여 과량으로 존재할 수도 있다. 이와 관련하여는, 치료 유효량의 헤지호그 단백질이 친수성 담체에 결합되는 것을 확실하게 보장할 정도로 본 발명에 따른 약학 조성물에서 친수성 담체의 양이 충분히 높아야 할 필요가 있을 따름이다. 따라서 헤지호그 단백질에 비해 친수성 담체를 5배 이상 과량으로 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 약학 조성물의 제조를 위한 헤지호그 단백질의 담체에 대한 결합은 pH 4.5 이상에서 수행되어야 한다. 상기에서 지적한 바와 같이, pH 4.5 미만에서는 헤지호그 단백질은 변성되고 단백질 담체-유사 콜라겐에 비가역적으로 결합한다는 것이 발견되었다. 따라서 헤지호그 단백질의 담체에 대한 결합은 중성 pH 범위에서 수행되어야 한다.
친수성 담체와 별도로 추가의 지지 구조 화합물을 포함하는 담체는 예를 들면 단백질/다당류 복합체이다. 바람직한 복합체는 미국 특허 제 4,614,794 호에 기술되어 있다.
pH 4.5 이상, 바람직하게는 중성 범위(pH 6 내지 8)내의 pH에서 헤지호그 단백질을 친수성 담체와 반응시켜 헤지호그 단백질의 담체에 대한 결합을 수행함으로써 약학 조성물을 제조한다. 반응은 완충용액 내에서 바람직하게 수행된다. 담체로서 콜라겐과 같은 생분해성 단백질을 부가적으로 포함하는 기재를 사용할 때에는 pH 4.5이상에서 반응시킴으로써, 헤지호그 단백질(보다 낮은 pH 값에서는 변성됨)의 생분해성 단백질에 대한 비가역적 결합을 확실하게 방지할 것이다. 이러한 조건하에서는 헤지호그 단백질이 소수성 개질을 포함하지 않는 한, 헤지호그 단백질의 생분해성 단백질에 대한 결합은 일어나지 않거나 단지 무시할 수 있는 정도로 발생하여, 생분해성 단백질은 단지 지지 구조 물질로서만 작용한다는 것이 발견되었다.
소수성으로 개질된(친유성화된) 헤지호그 단백질은 개질되지 않은 hh 단백질(예컨대, 원핵 생물에서 재조합적으로 생산된)과 비교하여 표면 소수성의 증가를 나타내는 헤지호그 단백질이다. 단백질의 친유성화의 정도는 헤이크,제트.(Haque,Z.) 등의 문헌 "J.Agric.Food Chem. 30 (1982) 481"에 따라 지질 층에서 통합에 의해 측정된다. 이러한 친유성화 hh 단백질은 비-친유성화 hh 단백질과 동일한 방법으로 본 발명에 따라 친수성 담체에 결합하지만, 또한 소수성 상호작용을 통해 생분해성 단백질에도 결합한다.
약학 조성물의 제조를 위하여, EDTA와 같은 항산화제, 시트르산, 폴리에틸렌 글리콜(1 내지 10 중량%), 세제, 바람직하게는 폴리소르베이트(트윈 20(Tween 20, 등록상표) 또는 트윈 80(등록상표)) 또는 폴리옥시에틸렌과 같은 비-이온성 세제(바람직하게는 0.005 내지 1 중량%), 항-염증 성분, 국소 마취제, 항생제 및/또는 지질, 지방산 및 글리세롤과 같은 안정화제 뿐만 아니라 당(만니톨, 자당, 유당, 포도당, 자당, 트리할로스(trehalose), 바람직하게는 20 내지 100 mg/ml) 또는 글리신 또는 아르기닌과 같은 아미노산과 같은 보조 물질을 첨가하는 것이 바람직하다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 수라민(suramin)을 함께 포함하는 본 발명에 따른 헤지호그 단백질의 약학 조성물이 바람직하고 이것은 유리하게 사용될 수 있다.
약학 조성물은 부가적인 약학 보조 물질을 포함할 수 있다.
바람직한 실시태양에서 약학 조성물은 0.1 내지 100 mg/ml 농도의 헤지호그 단백질을 포함한다.
바람직한 실시태양에서 약학 조성물은 바람직하게는 pH 4 내지 pH 10의 범위의, 특히 바람직하게는 pH 6 내지 8의 범위내의, 특별하게는 약 pH 7의 값의 생체적합한 약학적으로 허용가능한 완충액을 부가적으로 포함한다. 약학 조성물의 pH 값은 변성 및 헤지호그 단백질에 복합된 아연의 해리를 방지하기 위해 편의상 pH 4 보다 커야 한다. 완충액의 농도는 바람직하게는 1 내지 500 mmol/l, 특히 5 내지 150 mmol/l 및 특히 바람직하게는 10 내지 100 mmol/l이다. 적합한 실시태양에서는 pH 7.2의 20 mmol/l 인산 칼륨 완충액, pH 7.2의 100 mmol/l 염화 아르기닌이 완충액으로 사용된다.
본 발명의 약학 조성물을 주사용 겔로서 사용할 때에는 상기 약학 조성물을 주사 당 100㎕ 내지 2㎖의 양으로 투여한다.
더 나아가, 하기 실시예, 문헌 및 도면은 특허청구범위로부터 기인되는 본 발명의 보호범위를 예시한다. 하기 기술된 방법은 그것이 변형되더라도 본 발명의 주제를 기술하는 실시예로서 이해되어야 한다.
실시예 1
hh 단백질을 포함하는 알긴산 겔의 제조
hh 단백질 용액의 일정량(50mg/ml 자당 내의 1mg/ml shh 용액, 50mM 인산 칼륨, pH 7.2)을 나트륨-알긴산 모액(프로노바(Pronova), 바이오폴리머(Biopolymer), NO)(물 내, 0.1% 이상)과 교반하여 젤라틴질의 알긴산 단백질 혼합물을 형성한다. 이 겔은 직접적으로 주사용 기재로서 사용될 수 있거나 또는 나아가 알긴산 칼슘 캡슐로 처리될 수 있거나, 또는 친유성 물질로서 저장된다.
실시예 2
hh 단백질을 포함하는 콜라겐 혼합물의 제조 (비교예)
a) pH 7.4의 20mM 인산 칼륨, 또는
b) pH 4.5의 50mM 아세트산 나트륨, 또는
c) pH 2의 트리플루오로아세트산 내의 100㎕의 hh 용액(1mg/ml hh)을 10 × 10 × 3mm 크기의 콜라겐 해면체(sponge)(헬리스타트(Helistat), "인테그라 라이프 사이언스(Integra Life Sciences), 미국)에 적가한다. 그 후 결합된 담체를 냉각시키고(-70℃), 친유성화하여 분석한다. 이를 위하여 결합된 해면체를 완충액(10mmol/l 인산 칼륨, 150mmol/l NaCl, pH 7.2)내에서 적합한 용적으로 37℃에서 반응시킨다. 방출된 hh의 양을 RP-HPLC에 의해 측정한다.
실시예 3
3.1 Ca-알긴산 캡슐의 제조
hh 단백질을 포함하는 실시예 1에 기술된 알긴산 겔을 CaCl2용액(약 1.5%)에 계속 교반하면서 적가한다. 단백질을 포함하는 Ca-알긴산 복합체가 자발적으로 형성된다. 형성된 캡슐의 크기는 방울의 크기에 의존하고 원하는 대로 변화시킬 수 있다. CaCl2용액 내에서 5 내지 10분 반응시킨 후에, 캡슐을 여과하여 완충액(20mmol/l 인산 칼륨, pH 7.2)에서 세척한다. 이 캡슐은 직접적으로 이식물로 사용되거나 또는 나아가 친유성화에 의해 처리될 수 있다.
3.2 친유성화
Ca-알긴산 캡슐을 -70℃에서 냉각하고 이어서 친유성화한다. 친유성화는 캡슐의 안정한 저장을 가능하게 하고, 나아가, 캡슐이 건조 상태에서 취급하기가 더 용이한 까닭에 이식을 촉진하기도 한다.
실시예 4
Shh의 시험관내 방출
시험관내 방출 동력학의 분석은, shh가 콜라겐 기재로부터는 수 분 및 약 20 이내에 방출되는 반면에(도 1), Ca-알긴산 캡슐로부터는 Shh가 지연된 방식으로 70시간 이상의 기간을 초과하여 방출된다는 것을 나타낸다(도 2). shh를 포함하는 친유성화된 알긴산 구를 10mM 인산 칼륨, 150mM NaCl, pH 7.2(로타텀(Rotatherm))에서 37℃로 반응시켰다. 5분, 1시간, 5시간, 10시간, 1일, 34시간, 2일, 3일 및 6일 후에 샘플을 채취하고, SDS 폴리아크릴아미드 전기영동에 의해 shh 함량을 분석한다(도 2). 알긴산 캡슐로부터 방출된 shh의 누적량을 시간에 대하여 좌표화한다.
저분자량(LMW; 분자량 약 1.3 × 106돌턴) 또는 고분자량(HMW; 분자량 약 4 × 106돌턴)의 히알루론산 유형을 사용하여 2.5% 히알루론산 겔로부터의 shh의 방출 동력학을 조사한 결과를 도 3에 나타낸다. 이를 위해, shh가 결합된 히알루론산 겔을 투석 튜브(분리 크기 300,000 돌턴)안에 채우고 튜브를 PBS에서 37℃로 반응시킨다. 상기 언급한 시간에서 방출 매체의 샘플을 채취하여 역상 HPLC에 의해 shh 함량에 대해 분석하였다. 결합된 헤지호그 단백질의 일부가 지연된 방식으로 방출되는 것이 분명하다. 단백질의 다른 일부는 히알루론산에 결합한 채로 남아있고 생체 조건내에서 히알루론산의 분해에 의해 방출될 수 있다.
콜라겐-알긴산 기재(피브라콜(Fibracol), 등록상표, 미국 특허 제 4,614,794 호 참조)로부터의 shh의 방출 동력학을 조사한 결과를 도 4에 나타낸다. 이를 위하여 PBS에서 피브라콜 해면체(1 × 1 × 0.3 cm)에 0.2mg의 hshh를 결합시켰다. 결합된 해면체를 냉각하고(-70℃), 친유성화하여, PBS의 적절한 용적에서 37℃에서 반응시켰다. 상기 언급된 시간에서 방출 매체의 샘플을 채취하여 역상 HPLC에 의해 shh 함량에 대해 분석하였다. 결합된 헤지호그 단백질의 약 10 내지 20%만이 매체 안으로 방출되고 대부분은 콜라겐-알긴산 기재에 결합된 채로 남는 것이 분명하다. 이 대부분은 생체 조건내에서 기재의 분해에 의해 방출될 수 있다.
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본 발명에 따른 헤지호그 단백질의 약학 조성물은 생체내적으로(in vivo) 지연된 방식으로 담체로부터 헤지호그 단백질을 활성형으로 가역적으로 방출하였다.
Claims (16)
- - 이온성 상호작용의 결과로 음-전하 담체로서 헤지호그 단백질(hedgehog protein)과 결합하고;- 헤지호그 단백질과 결합할 때 헤지호그 단백질을 변성시키지 않으며;- 중성 조건하에서 단량체 당 0.1 내지 2 이상의 음-전하 잔기를 포함하며;- 산성 그룹의 형태로 전하를 포함하며;- 50,000 돌턴 이상의 평균 분자량을 가지며;- 아가로우즈(agarose)를 포함하지 않는 중합체인 생체적합한 친수성 담체에 헤지호그 단백질이 결합하는 것을 특징으로 하는 헤지호그 단백질의 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서,담체가 유기 친수성 담체 기재 또는 무기 불용성 인산으로 구성되는 약학 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,담체가 음이온성 다당류 또는 무기 불용성 인산으로 구성되는 약학 조성물.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,친수성 담체가 히알루론산인 약학 조성물.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,0.1 내지 100mg/ml의 농도로 헤지호그 단백질을 포함하는 약학 조성물.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,pH 4 내지 10의 범위에서 완충된 약학 조성물.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,아르기닌 또는 아르기니니움 이온을 포함하는 약학 조성물.
- - 이온성 상호작용의 결과로 음-전하 담체로서 헤지호그 단백질과 결합하고;- 헤지호그 단백질과 결합할 때 헤지호그 단백질을 변성시키지 않으며;- 중성 조건하에서 단량체 당 0.1 내지 2 이상의 음-전하 잔기를 포함하며;- 산성 그룹의 형태로 전하를 포함하며;- 50,000 돌턴 이상의 평균 분자량을 가지며;- 아가로우즈를 포함하지 않는 중합체인 생체적합한 친수성 담체에 결합하는 헤지호그 단백질을 필수 성분으로서 약학적 유효량으로 사용하는, 상기 헤지호그 단백질을 포함하는 약학 조성물의 제조 방법.
- 제 8 항에 있어서,헤지호그 단백질이 0.1 내지 100mg/ml의 농도로 사용되는 방법.
- 헤지호그 단백질을 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물의 형태로 사람의 신체에 국소적으로 적용시키는, 사람의 신체에서 헤지호그 단백질을 지연 방출시키는 방법.
- 제 10 항에 있어서,헤지호그 단백질이 0.1 내지 100mg/ml의 농도로 적용되는 방법.
- 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,친수성 담체가 히알루론산인 방법.
- 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,친수성 담체에 대한 헤지호그 단백질의 결합이 pH 4.5 이상에서 반응시킴으로써 수행되는 방법.
- 담체 기재 ml 당 3mg 이상의 헤지호그 단백질 및 10mmol/l 이상의 아르기닌 또는 아르기니니움 이온을 포함하는 불용성 담체 기재.
- 3mg/ml 이상의 농도의 헤지호그 단백질 및, 10mmol/l 이상의 아르기닌 또는 아르기니니움 이온을 포함하는 용액과 담체 기재를 반응시키고 이러한 방법으로 코팅된 담체 기재를 분리하는, 헤지호그 단백질을 포함하는 불용성 담체 기재의 제조 방법.
- 제 15 항에 있어서,친수성 담체에 대한 헤지호그 단백질의 결합이 pH 4.5 이상에서 반응시킴으로써 수행되는 방법.
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