ES2258568T3 - Prueba genetica para la identificacion de portadores de malformaciones vertebrales complejas en el ganado. - Google Patents
Prueba genetica para la identificacion de portadores de malformaciones vertebrales complejas en el ganado.Info
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Abstract
Un procedimiento para detectar in vitro una malformación vertebral compleja bovina (MVC) en un sujeto bovino, en el que se identifica la presencia de al menos un marcador genético localizado en el cromosoma bovino BTA3, en la región flanqueada por, y que incluye, los marcadores de microsatélite polimórficos BM4129 y BMS 1266 asociados con la malformación vertebral compleja bovina (MVC), en el que el al menos un marcador genético está ligado al gen bovino SLC35A3, comprendiendo dicho procedimiento detectar, en el material genético bovino, la presencia o ausencia de al menos un marcador genético que está ligado a un rasgo de una enfermedad de una malformación vertebral compleja bovina.
Description
Prueba genética para la identificación de
portadores de malformaciones vertebrales complejas en el ganado.
La presente invención se refiere de forma
general a una enfermedad genética observada en bóvidos denominada
Malformación Vertebral Compleja (MVC). Más particularmente, la
invención se refiere a marcadores moleculares para identificar
potenciales portadores bovinos de la MVC y para identificar el locus
del gen de la MVC y mutaciones del mismo responsables de la
malformación vertebral compleja en bóvidos.
La Malformación Vertebral Compleja (MVC) es una
alteración vertebral congénita detectada en vacas lecheras blancas
y negras Holstein-Friesian (HF). La enfermedad ha
sido descrita recientemente (Agerholm y col., 2000). En Dinamarca,
todos los casos diagnosticados hasta hoy (17 de octubre de 2000) han
estado genéticamente relacionados con el anterior toro de élite
estadounidense Holstein Carlin-M Ivanhoe
Bell. Según los datos actuales, la MVC parece heredarse como
una enfermedad autosómica recesiva.
La enfermedad se caracteriza por una
artrogriposis simétrica bilateral congénita de las articulaciones
distales y malformaciones de la columna, principalmente en la
articulación cérvico-torácica, combinada con un peso
corporal reducido (Agerholm y col., 1994).
Externamente existen los siguientes signos
principales: en muchos casos la parte cervical y/o torácica de la
columna parece ser corta. Una contracción simétrica bilateral
moderada de las articulaciones carpales y una grave contracción y
supinación de la articulación metacarpo-falángica
(espolón) son signos constantes. La contracción y la pronación de
la articulación metatarso-falángica y una leve
extensión del tarso también son signos comunes. En la mayoría de
los casos se observa una disposición irregular de la columna
alrededor de la articulación cérvico-torácica.
Puede observarse una escoliosis, y las lesiones pueden estar
presentes en otras regiones de la columna. La disposición irregular
se reconoce a menudo mediante una inspección y una palpación de la
cara ventral de la columna. Sin embargo, las lesiones pueden ser
mínimas y estar restringidas a dos o pocas vértebras. En tales
casos, la columna puede tener una longitud prácticamente normal. Por
lo tanto, se recomiendan examen radiológico de la columna para
excluir malformaciones vertebrales en los casos sospechosos. La
médula espinal tiene un tamaño normal y reposa con el canal
vertebral sin compresiones evidentes. Usando la radiología se
encuentran malformaciones vertebrales complejas consistentes en
hemivértebras, vértebras fusionadas y malformadas, escoliosis y
anquilosis, de grados variables. Esto se demuestra mejor tras la
eliminación del arco vertebral. En algunos casos hay presentes
malformaciones cardiacas, en su mayoría como un amplio defecto del
septo interventricular y una hipertrofia excéntrica del ventrículo
derecho. Pueden producirse malformaciones de los vasos de gran
tamaño. En los pulmones hay presente una atelectasia fetal. El
fluido serohemorrágico está muy presente en la cavidad torácica. Se
ha observado una variedad de otras malformaciones, pero éstas no
son signos constantes ni comunes. A menudo se encuentran lesiones
debidas a distocia.
Se han observado malformaciones en fetos
abortados, en terneras nacidas prematuramente y en terneras
mortinatas nacidas a término. Aún no se han observado casos en
terneras mayores. En general, el peso corporal es reducido, y el
peso corporal es menor en las terneras nacidas prematuramente que en
las terneras nacidas a término.
Adicionalmente, parece haber una frecuencia
aumentada de abortos en vacas inseminadas con el semen de toros
portadores. Actualmente la causa de esto es desconocida.
En la actualidad, la única herramienta
disponible para el diagnóstico de la MVC es un diagnóstico
anatomopatológico basado en la anteriormente descrita presencia de
artrogriposis simétrica bilateral de las articulaciones distales y
malformaciones de la columna, principalmente en la articulación
cérvico-torácica combinado con un peso corporal
reducido. Sin embargo, las contracciones simétricas de las
extremidades son signos comunes y generales en las malformaciones
vertebrales en las terneras. Por lo tanto, existen problemas en el
diagnóstico diferencial, ya que a menudo es difícil diferenciar
entre la MVC y otras malformaciones.
El hecho de que el defecto genético parezca ser
extendido por el toro Carlin-M Ivanhoe Bell,
que ha sido usado intensamente en todo el mundo, hace que sea de
una importancia económica significativa ser capaces de evaluar si
los toros de reproducción actuales y potenciales son portadores del
defecto.
Con objeto de obtener una estimación de la
frecuencia de potenciales animales portadores de la MVC entre la
población de ganado danesa, los presentes y mentores han extraído
información sobre el pedigrí de la base de datos de ganado nacional
danesa. En el momento de la extracción (octubre de 2000) había
registrados 919.916 vacas y novillos de pura raza, y 169.821 toros
de pura raza y terneros. Bell se encontró 707.915 veces en
los pedigríes de las vacas y los novillos y 161.043 veces en los
pedigríes machos. En las Tablas 1 y 2 a continuación, se muestra el
número de apariciones de Bell en cada generación de los
pedigríes.
| Generaciones NR | Frecuencia | Porcentaje | Frecuencia acumulativa |
| 2 | 21240 | 3,0 | 21244 |
| 3 | 202460 | 28,6 | 223704 |
| 4 | 321043 | 45,4 | 544747 |
| 5 | 133956 | 18,9 | 678703 |
| 6 | 27307 | 3,9 | 706010 |
| 7 | 1869 | 0,3 | 707879 |
| 8 | 36 | 0,0 | 707915 |
\vskip1.000000\baselineskip
| Generación | Frecuencia | Porcentaje | Frecuencia acumulativa |
| 2 | 436 | 0,3 | 436 |
| 3 | 20144 | 12,5 | 20580 |
| 4 | 82394 | 51,2 | 102974 |
| 5 | 44545 | 27,7 | 147519 |
| 6 | 12455 | 7,7 | 159974 |
| 7 | 1040 | 0,6 | 161014 |
| 8 | 29 | 0,0 | 161043 |
Aunque estas cifras también incluyen algunas
apariciones dobles y triples de Bell en los pedigríes, los
datos demuestran claramente que una mayoría del ganado danés
Holstein es portadora potencial de la MVC. Claramente, el problema
es inmenso en una escala global.
Por lo tanto, hay una gran demanda en la
industria del ganado de una prueba genética que permita la
identificación de ganado de varias razas que sea portador potencial
de la MVC (por ejemplo, antes del establecimiento detectable de los
síntomas clínicos).
Previamente a la presente invención no se había
aplicado el cartografiado de microsatélite al gen causante de las
anteriores malformaciones vertebrales complejas, que no ha sido
aislado ni caracterizado. Por lo tanto, hasta donde saben los
inventores, el procedimiento diagnóstico según la invención,
descrito con más detalle a continuación, no ha sido previamente
sugerido ni descrito.
Consecuentemente, la presente invención, que
comprende el cartografiado del locus de la enfermedad para la MVC,
ha proporcionado una prueba de ADN basada en marcadores de
microsatélite localizados en el cromosoma bovino BTA3. La capacidad
de la prueba para definir el estado de portador de los animales
descendientes de Bell ha sido confirmada, lo que surge a
partir de los ejemplos, a continuación.
En su aspecto más amplio, la presente invención
proporciona un procedimiento para detectar una malformación
vertebral compleja bovina (MVC) en un sujeto bovino, en el que se
identifica la presencia de al menos un marcador genético localizado
en el cromosoma bovino BTA3, en la región flanqueada por, y que
incluye, los marcadores de microsatélite polimórficos BM4129 y BMS
1266 asociados con la malformación vertebral compleja bovina (MVC),
en el que el al menos un marcador genético está ligado al gen bovino
SLC35A, comprendiendo dicho procedimiento detectar en el material
genético bovino la presencia de al menos un marcador genético que
está ligado a un rasgo de una enfermedad de una malformación
vertebral compleja bovina.
En un aspecto adicional, la invención concierne
a un kit de diagnóstico para su uso para detectar la presencia en
un sujeto bovino de al menos un marcador genético asociado con la
malformación vertebral compleja bovina (MVC), que comprende al
menos una secuencia de oligonucleótidos elegida del grupo formado
por la ID. SEC. Nº: 1, la ID. SEC. Nº: 2, la ID. SEC. Nº: 3, la ID.
SEC. Nº: 4, la ID. SEC. Nº: 5, la ID. SEC. Nº: 6, la ID. SEC. Nº:
1, la ID. SEC. Nº: 8, la ID. SEC. Nº: 9, la ID. SEC. Nº: 10, la ID.
SEC. Nº: 11, la ID. SEC. Nº: 12, la ID. SEC. Nº: 13, la ID. SEC.
Nº: 14, la ID. SEC. Nº: 15, la ID. SEC. Nº: 16, la ID. SEC. Nº: 33,
la ID. SEC. Nº: 34, la ID. SEC. Nº: 35, la ID. SEC. Nº: 36, la ID.
SEC. Nº: 37 y la ID. SEC. Nº: 38, y combinaciones de las mismas.
Un objetivo primario de la presente invención es
permitir la identificación de ganado portador de una malformación
vertebral compleja bovina (MVC). Esto se consigue mediante un
procedimiento que detecta la presencia de un marcador genético
asociado con la MVC bovina en un sujeto bovino. Más específicamente,
el marcador genético puede ser el gen bovino SLC35A3 o incluso más
específicamente, polimorfismos específicos en el gen bovino
SLC35A3.
Según se usa en este documento, el término un
"sujeto bovino" se refiere a ganando de cualquier raza. Por lo
tanto, cualquiera de las diversas especies de vacas o bueyes, ya
sean machos o hembras, están incluidas en el término, y se pretende
que tanto los animales adultos como los recién nacidos estén
cubiertos. El término no denota una edad en particular. Un ejemplo
de un sujeto bovino es un miembro de la población de ganado
Holstein-Friesian.
El término "marcador genético" se refiere a
una secuencia de nucleótidos variable (polimórfica) que está
presente en el ADN genómico bovino en un cromosoma y que es
identificable con oligonucleótidos específicos. Dicha secuencia de
nucleótidos variable es, por ejemplo, distinguible mediante una
amplificación de los ácidos nucleicos y la observación de una
diferencia en el tamaño o la secuencia de nucleótidos debida al
polimorfismo. En las formas de realización útiles, dichos
marcadores genéticos pueden identificarse mediante diversas técnicas
conocidas por los expertos en la materia, e incluyen el tipado de
los microsatélites o repeticiones cortas en tándem (STR),
polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción
(RFLP), detección de los sitios de deleción o inserción y ADN
polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD), así como el tipado de
polimorfismos de un único nucleótido (SNP) mediante procedimientos
que incluyen la reacción en cadena de la polimerasa de la longitud
de los fragmentos de restricción, hibridación de oligómeros
específicos de alelos, ensayos de unión específicos de alelos,
minisecuenciación, secuenciación directa, ensayos de
5'-exonucleasa detectada por fluorescencia e
hibridación con sondas PNA y LNA, y otros. Sin embargo, se apreciará
que, según la invención, pueden aplicarse otros marcadores
genéticos y técnicas.
Según se describió anteriormente, la
"malformación vertebral compleja bovina" (MVC) es una
alteración vertebral congénita. Actualmente la enfermedad sólo se
ha detectado en vacas lecheras blancas y negras
Holstein-Friesian (HF); sin embargo, también está
contemplado que puedan estar afectadas otras razas bovinas. La
enfermedad ha sido descrita recientemente por Agerholm y col.,
2000. Consecuentemente, en el presente contexto, MVC y rasgo de
enfermedad de malformación vertebral compleja bovina deben
entenderse como una enfermedad que da como resultado los síntomas
clínicos descritos previamente en este documento, y según refirieron
y definieron Agerholm y col., 2000.
El procedimiento según la invención incluye la
provisión de un material genético bovino. Dicho material incluye
material de ADN bovino que puede ser proporcionado mediante
cualquier procedimiento o medio convencional. El material de ADN
bovino puede, por ejemplo, ser extraído, aislado y purificado a
partir de sangre (por ejemplo, fresca o congelada), muestras
tisulares (por ejemplo, bazo, frotis bucales), muestras de pelo que
contienen células foliculares y semen.
Según se describió previamente, el procedimiento
de la presente invención comprende además una etapa de detectar en
el material genético la presencia o ausencia de un marcador genético
que está ligado con un rasgo de enfermedad de malformación
vertebral compleja bovina.
Con objeto de detectar si el marcador genético
está presente en el material genético pueden aplicarse
procedimientos estándar conocidos por los expertos en la materia,
por ejemplo, mediante el uso de una amplificación de los ácidos
nucleicos. Con objeto de determinar si el marcador genético está
ligado genéticamente con el rasgo de enfermedad de malformación
vertebral compleja puede aplicarse una lod score. Una lod
score, que también se denomina a menudo Z_{máx}, indica la
probabilidad (el logaritmo de la proporción de la verosimilitud) de
que un locus de un marcador genético y un locus de un gen específico
estén ligados a una distancia en particular. Las lod scores
pueden calcularse, por ejemplo, aplicando un programa informático
tal como el programa MLINK del LINKAGE package (Lathrop y col.,
1985). Una lod score de más de 3,0 se considera una evidencia
significativa del ligamiento entre el marcador genético y el rasgo
de la enfermedad de malformación vertebral compleja o el locus del
gen.
En una forma de realización de la invención, el
marcador genético está localizado en el cromosoma bovino BTA3. La
región del cromosoma bovino BTA3 que comprende los marcadores
genéticos que son útiles en el procedimiento de la presente
invención está indicada en la Figura 2.
Consecuentemente, los marcadores genéticos
localizados en el cromosoma bovino BTA3 en la región flanqueada
por, y que incluye, los marcadores de microsatélite polimórficos
BM4129 y BMS1266, pueden ser útiles según la presente invención. En
una forma de realización específica, el al menos un marcador
genético está localizado en la región desde aproximadamente 59,5 cM
hasta aproximadamente 67,9 cM del cromosoma bovino BTA3.
En una forma de realización útil adicional, el
al menos un marcador genético está localizado en el cromosoma
bovino BTA3 en la región flanqueada por, y que incluye, los
marcadores de microsatélite polimórficos INRAA003 y BMS937.
En un aspecto adicional, el al menos un marcador
genético está localizado en el cromosoma bovino BTA3 en la región
flanqueada por, y que incluye, los marcadores de microsatélite
polimórficos INRAA003 e ILSTS029.
En otra forma de realización ventajosa, el al
menos un marcador genético se elige del grupo formado por los
marcadores de microsatélite BM4129, INRAA003, BMS2790, ILSTS029,
INRA123, BM220, HUJ246, BMS862, BMS937, BL1048, BMS2095 y
BMS1266.
Según se describe en los ejemplos, el al menos
un marcador genético puede estar ligado a un gen que cause la
enfermedad de malformación vertebral compleja bovina. Por lo tanto,
en una forma de realización, el al menos un marcador genético está
localizado en el cromosoma bovino BTA3 en la región flanqueada por,
y que incluye, los marcadores de microsatélite polimórficos BM4129
y BMS1266 ligados genéticamente con el rasgo de la enfermedad MVC o
el locus del gen de la MVC, a una lod score de al menos 3,0,
tal como al menos 4,0, incluyendo al menos 5,0, tal como al menos
6,0, incluyendo al menos 7,0 tal como al menos 8,0, incluyendo al
menos 9,0, tal como al menos 10,0, incluyendo al menos 11,0, tal
como al menos 12,0.
La definición específica y el locus de los
anteriores marcadores de microsatélite polimórficos pueden
encontrarse en el mapa genético del USDA (Kappes y col., 1997).
Se apreciará que, con objeto de detectar la
presencia o ausencia en un sujeto bovino de un marcador genético
asociado con la MVC puede aplicarse, según la invención, más de un
marcador genético. Por lo tanto, el al menos un marcador genético
puede ser una combinación de dos o más marcadores genéticos que han
demostrado ser informativos, mediante los cuales puede aumentarse
la precisión de la prueba.
Consecuentemente, según se ejemplifica
adicionalmente a continuación, en una forma de realización útil
pueden usarse en combinación dos o más de los marcadores de
microsatélite INRAA003, BMS2790, ILSTS029, INRA 123, BM220, HUJ246,
BMS862, BMS937.
Según la invención, las secuencias de
nucleótidos de los pares de cebadores para amplificar los anteriores
marcadores de microsatélite se describen en la Tabla 4, a
continuación.
Los mapas comparativos
(Solinas-Toldo y col., 1995) muestran que la mayoría
del cromosoma bovino BTA3 se corresponde con una parte del
cromosoma humano 1 (HSA1). El cartografiado genético del locus de la
MVC presentado en este documento hace posible usar la información
disponible sobre los genes humanos y concentrar la búsqueda del gen
candidato en genes presentes en el cromosoma humano 1. Esto limitará
en gran medida el número de genes candidatos y facilitará la
búsqueda del gen causante de la MVC.
Los marcadores genéticos de la presente
invención pueden crearse usando diferentes metodologías conocidas
por los expertos en la materia. Por lo tanto, se entenderá que, con
el conocimiento presentado en este documento, las secuencias de
nucleótidos de los anteriormente descritos marcadores de
microsatélite polimórficos del cromosoma bovino BTA3 se han
identificado como genéticamente ligados al locus del gen de la MVC,
y pueden producirse marcadores adicionales a partir de las
secuencias conocidas o de la localización indicada sobre el
cromosoma bovino BTA3 para su uso en el procedimiento de la presente
invención.
Por ejemplo, usando el mapa ilustrado en la
Figura 2, la región de la MVC del cromosoma bovino BTA3 puede ser
microdiseccionada, y los fragmentos clonados en vectores para aislar
los segmentos de ADN, de los que puede comprobarse su ligamiento
con el locus del gen de la MVC. Alternativamente, con las secuencias
de nucleótidos proporcionadas en la Tabla 4, pueden obtenerse
segmentos de ADN aislados a partir de la región de la MVC mediante
una amplificación de los ácidos nucleicos (por ejemplo, reacción en
cadena de la polimerasa) o mediante la secuenciación de los
nucleótidos de la región relevante del cromosoma bovino BTA3
("chromosome walking" o desplazamiento sobre el
cromosoma).
Adicionalmente, la anteriormente descrita
homología entre el cromosoma bovino BTA3 y el cromosoma humano 1
(HSA1) indica que cualquier gen o secuencia tag expresado que esté
cartografiado en esta región análoga en el hombre también estará
cartografiado en la región de la MVC del cromosoma bovino BTA3. Por
lo tanto, los genes o las secuencias conservadas que estén
cartografiadas en el cromosoma humano HSA1 pueden ser analizados
para comprobar su ligamiento con el locus del gen de la MVC usando
procedimientos rutinarios.
El genotipado se basa en el análisis del ADN
genómico, que puede ser proporcionado usando procedimientos estándar
de extracción de ADN, según se describe en este documento. Cuando
el ADN genómico es aislado y purificado, puede usarse una
amplificación de los ácidos nucleicos (por ejemplo, una reacción en
cadena de la polimerasa) para amplificar la región del ADN
correspondiente a cada marcador genético que se va a usar en el
análisis para detectar la presencia en un sujeto bovino de un
marcador genético asociado con la MVC. Consecuentemente, un kit de
diagnóstico para su uso en dicha forma de realización comprende, en
un envase por separado, al menos una secuencia de oligonucleótidos
elegida del grupo formado por la ID. SEC. Nº: 1, la ID. SEC. Nº: 2,
la ID. SEC. Nº: 3, la ID. SEC. Nº: 4, la ID. SEC. Nº: 5, la ID.
SEC. Nº: 6, la ID. SEC. Nº: 7, la ID. SEC. Nº: 8, la ID. SEC. Nº:
9, la ID. SEC. Nº: 10, la ID. SEC. Nº: 11, la ID. SEC. Nº: 12, la
ID. SEC. Nº: 13, la ID. SEC. Nº: 14, la ID. SEC. Nº: 15, la ID.
SEC. Nº: 16, la ID. SEC. Nº: 33, la ID. SEC. Nº: 34, la ID. SEC. Nº:
35, la ID. SEC. Nº: 36, la ID. SEC. Nº: la 37 y la ID. SEC. Nº: 38,
y combinaciones de las mismas.
Habiendo establecido la localización genómica
del gen de la MVC, delimitado por marcadores de microsatélite
polimórficos, se realizó en este documento una investigación para la
identificación del gen estructural y de la mutación causante, que
puede usarse como un marcador genético último de la MVC.
Se identificó el genoma humano que comparte una
homología de secuencia con la región de la MVC, definida como la
región entre los marcadores INRA003 e ILSTS029. El marcador BMS2790
está localizado en este intervalo (Figura 1). Inicialmente se
identificaron 5 clones diferentes a partir de una genoteca bovina de
BAC (RPCI-42, construida y facilitada por P. de
Jonge y colaboradores), cada uno portador de uno de los marcadores
INRA003, ISLTS029 o BMS2790. Usando la información de la secuencia
obtenida a partir de estos clones de BAC se identificó una única
región en el cromosoma humano 1 que contenía una región de homología
con los BAC que contenían el marcador usando el programa BLASTN
sobre bases de datos públicas de secuencias. Esta región abarca
aproximadamente 6 millones de pares de bases, y está localizada
aproximadamente en la posición 107,4-113,5 (Figura
3) (ENSEMBL viewer, The Sanger Centre).
Basándonos en una alineación de homología del
gen SLC35A3 entre Homo sapiens y Canis familiaris, se
diseñaron 2 oligos (SL1F y SL8R) para la amplificación de
prácticamente todo el ADNc del SLC35A3 bovino, incluyendo el codón
de inicio. Se realizó una PCR sobre el ADNc aislado a partir de
muestras de tejido cardíaco recogidas de un animal salvaje, de un
portador de la MVC y de un animal afectado, respectivamente. Para
obtener la secuencia del extremo 3' del gen, el fragmento de la PCR
resultante fue secuenciado y se diseñó un nuevo oligo (SL5F). Para
amplificar el extremo 3' de SLC35A3 se usó SL5F en combinación con
un oligo (bSLCBVIR), diseñado usando la secuencia publicada de una
EST bovina parcial (genbank, dbEST). La secuencia de ADNc (ID. SEC.
Nº: 18) y la secuencia de péptidos traducida (ID. SEC. Nº: 17)
del SLC35A3 bovino se muestran en la Figura 4. La proteína
codificada por el SLC35A3 contiene 326 aminoácidos, y comparte
homología con una familia de proteínas previamente conocidas
implicadas en el transporte de azúcares de nucleótidos desde el
citosol hacia la luz del Golgi. La alineación representada en la
Figura 5 muestra la homología con las proteínas de SLC35A3 descritas
previamente en el hombre (Ishida y col. 1999) y en el perro
(Guillen y col. 1998).
Para detectar los potenciales polimorfismos en
el gen bovino SLC35A3 se realizó una amplificación del gen mediante
PCR usando ADNc aislado a partir de muestras de tejido cardíaco
recogidas de un portador de la MVC y de un animal afectado,
respectivamente. La secuenciación del fragmento aislado del animal
aceptado reveló una secuencia idéntica al tipo natural, excepto
porque el animal afectado era homocigótico para el nucleótido T en
la posición de nucleótido 559, comparada con el animal natural, que
era homocigótico para G en la posición correspondiente (véase la
Figura 4). La secuenciación del ADNc de un animal portador del
defecto de la MVC mostró que este animal era heterocigótico,
teniendo tanto T como G en la posición 559.
El cambio de G a T en la posición 559 afecta a
la secuencia del péptido resultante cambiando una valina en la
posición 180 por una fenilalanina (véase la Figura 4).
La Figura 6 muestra los resultados obtenidos de
la secuenciación de un fragmento de PCR amplificado a partir del
ADN genómico y que contiene la región (desde 544 hasta 572 del ADNc
de SLC35A3, para la numeración véase la Figura 4) que contiene la
mutación G/T. Los cuadros izquierdo y derecho muestran la
secuenciación directa e inversa, respectivamente. La fila superior
(marcada con -/-) muestra el tipo natural resultante, mostrando una
G en la posición polimórfica usando la secuenciación directa y una C
en la posición similar en la otra hebra usando una secuencia
inversa (marcada por asteriscos). La fila inferior +/+ muestra los
resultados de una ternera afectada, mostrando una T en la posición
polimórfica usando la secuenciación directa y una A en la posición
similar en la otra hebra usando una secuencia inversa (marcada por
asteriscos). El heterocigoto (+/-) se muestra en el cuadro central
y, como se esperaba, muestra una mezcla de la señal natural y
afectada, y por lo tanto, tiene tanto una señal T como una G usando
la secuenciación directa y una señal A y una C en la otra
hebra.
Se realizó un genotipado de 39 terneras
afectadas por la MVC, secuenciando un producto amplificado mediante
PCR a partir de ADN genómico (véanse la Figura 6 y el ejemplo 6).
Todos estos animales eran homocigóticos para el alelo T, lo que
confirmaba los resultados iniciales.
Dado que las terneras afectadas por la MVC sólo
se han referido en pedigríes que contienen el ampliamente usado
toro BELL, se investigó si el alelo T estaba presente en animales no
relacionados con BELL. Aprovechando la base de datos danesa de
ganado, se identificaron y muestrearon 496 animales de la raza
Holstein sin BELL en su pedigrí. El genotipado de estos animales se
realizó secuenciando un producto amplificado mediante PCR a partir
de ADN genómico (véanse la Figura 6 y el ejemplo 6). Ninguno de
estos animales contenía el alelo T, lo que sugiere que este alelo
se encuentra exclusivamente en la línea de animales estrechamente
relacionada con BELL.
Mediante la secuenciación también se genotiparon
más de 326 animales no relacionados (al menos para las tres últimas
generaciones) de 12 razas diferentes. Todos estos animales eran
homocigóticos para el alelo de tipo natural (alelo G) demostrando
de nuevo la ausencia del alelo relacionado con la MVC (el alelo T)
en la población general de ganado.
Con objeto de tipar eficazmente el polimorfismo
G/T se desarrolló un ensayo de PCR específico de alelo usando una
polimerasa de ADN BIOLASE Diamond DNA de Bioline. Esta polimerasa
requiere un emparejamiento perfecto del extremo 3' del cebador con
la plantilla, y un emparejamiento incorrecto en esta posición dará
como resultado una amplificación nula (o muy débil). De esta forma
es posible distinguir entre los animales del tipo natural, los
portadores o los enfermos identificando la presencia o la ausencia
de los productos de la PCR específica de alelo (Figura 7). La parte
izquierda de la Figura 7 muestra los productos de la PCR específica
de alelo de la hebra codificante. Como se esperaba, los animales de
tipo natural muestran una amplificación con el cebador específico
para G pero no con el cebador específico para T. Los portadores
muestran una amplificación de ambos cebadores específicos para G y
T, mientras que los animales enfermos sólo muestran una
amplificación del cebador específico para T. La parte izquierda
muestra los productos de la PCR específica de alelo de la hebra no
codificante, y como se esperaba, los patrones son los mismos que en
la hebra codificante. Los animales de tipo natural son
homocigóticos C, los portadores son heterocigóticos C/A y los
animales enfermos son homocigóticos A.
A partir de los resultados descritos
anteriormente tras usar una metodología de gen candidato se
identificó un gen bovino que es homólogo del gen humano SLC35A3 que
codifica para un transportador de
UDP-N-acetilglucosamina. En este
gen se identificó un polimorfismo G/T que altera la secuencia de
aminoácidos de la proteína. Todas las terneras afectadas analizadas
(39) son homocigóticas para el alelo T (T/T) y los portadores
conocidos (108) son todos heterocigóticos para el polimorfismo
(G/T). El análisis de más de 500 animales de la raza Holstein,
elegidos por no estar relacionados con Bell, fracasó al identificar
cualquier animal portador del alelo T. Se analizaron más de 1500
animales con Bell en el pedigrí sin encontrar ningún animal no
afectado que fuera homocigótico para el alelo T. Adicionalmente, se
analizaron 300 cabezas de ganado elegidas entre 12 razas diferentes
sin detectar el alelo T en ninguno de estos animales. Considerados
en conjunto, los hallazgos descritos en la presente solicitud
demuestran que el alelo T está presente en una única copia en los
animales que son portadores de la MVC y en dos copias en los
animales afectados por la MVC. La detección del alelo T en la
posición 559 (numeración de la Figura 4) es por lo tanto diagnóstica
de la MVC e ideal para la detección de portadores del defecto de la
MVC.
Dado que el polimorfismo G/T ha sido
identificado como el causante de la MVC, cualquier marcador genético
estrechamente acoplado a este polimorfismo puede ser diagnóstico de
la MVC en una población bovina. Consecuentemente, la presente
invención describe un procedimiento para identificar sujetos bovinos
afectados por la MVC o portadores de la MVC mediante la
determinación de la presencia del polimorfismo G/T en la posición
559 del gen bovino SLC35A3, ya sea indirectamente analizando
cualquier marcador genético, tal como los microsatélites descritos
en este documento, acoplados al gen bovino SLC35A3, o directamente
analizando la secuencia del gen bovino SLC35A3, por ejemplo, según
se describió anteriormente y con más detalle en los ejemplos.
En el ámbito de la presente invención está por
tanto un procedimiento para detectar y/o cuantificar la presencia
de un marcador genético asociado con la MVC bovina en un sujeto
bovino con objeto de ser capaces de identificar los sujetos bovinos
afectados por la MVC o los portadores de la MVC. Las etapas del
procedimiento comprenden:
- a)
- proporcionar un material genético bovino, y
- b)
- detectar, en dicho material genético, la presencia o ausencia de al menos un marcador genético que está ligado a un rasgo de una enfermedad de malformación vertebral compleja bovina.
El al menos un marcador genético está ligado a
un gen causante de la enfermedad de MVC bovina, siendo identificado
dicho gen en este documento como el gen bovino SLC35A3 que codifica
para la proteína bovina SLC35A3, proteína que comprende una
secuencia de aminoácidos según se muestra en la ID. SEC. Nº: 17.
Más específicamente, la presente invención se
refiere a un procedimiento para detectar la MVC bovina, en el que
el marcador genético es un único polimorfismo de nucleótido en una
posición equivalente al nucleótido 559 de la ID. SEC. Nº: 18,
siendo dicho único polimorfismo de nucleótido un polimorfismo
G/T.
La presente solicitud describe adicionalmente un
ensayo eficaz para el genotipado del presente polimorfismo usando
una PCR específica de alelo. Este es sólo uno de la batería de
procedimientos para el tipado de SNP, otros procedimientos que
podrían emplearse incluyen, pero no se limitan a, minisecuenciación,
extensión con cebadores, pirosecuenciación,
PCR-RFLP, amplificación en círculo específica de
alelo, extensión con cebadores seguida de una espectrometría de
masas MALDI-TOF, así como un intervalo de otros
procedimientos enzimáticos y basados en hibridación.
Se ha demostrado que existe un fenotipo
semejante a la MVC en ratones mutados en el gen lunatic
fringe (Evrad y col., 1998). De forma similar a las terneras
afectadas por la MVC, los ratones homocigóticos para una mutación
anuladora en el lunatic fringe muestran una segmentación y
una configuración alteradas del somito, con un eje corporal
acortado, fusiones en las vértebras y en las costillas, y vértebras
incompletamente formadas (Evrad y col., 1998). El fringe
parece participar en la definición de la formación de los límites y
la configuración del somito modelando la actividad de los
receptores Notch (Klein y Arias, 1998; Moloney y col., 2000,
Bruckner y col., 2000). La actividad moduladora de los Notch parece
estar mediada por una actividad de transferasa de
N-acetilglucosaminilo de fringe, que en Golgi
inicia la elongación de los residuos de fucosa unidos por O fijados
a las repeticiones de secuencias de tipo EGF de Notch (Moloney y
col., 2000; Bruckner y col., 2000).
Adicionalmente, dado que el gen bovino SLC35A3
es homólogo del gen humano SLC35A3, es obvio, con la información
proporcionada en este documento, analizar la secuencia codificante
del gen humano SLC35A3 para buscar mutaciones causales y
diagnósticas cuando se estudian defectos en el desarrollo humano,
especialmente los que implican la segmentación y la configuración
del somito.
Se esperaría que el efecto de una mutación en el
transportador de N-acetilglucosaminilo localizado en
Golgi (SLC35A3) que afecte al transporte de
N-acetilglucosamina desde el citosol hacia la luz de
Golgi privara a la familia fringe de proteínas de su
sustrato. Esto afectaría a la capacidad de fringe para
modular la actividad de Notch y causaría así un defecto de
segmentación como en la MVC. Además parece muy probable que la
mutación en SLC35A3, aparte de ser diagnóstica de la MVC, también
sea la mutación que provoca este generalizado defecto genético.
La invención se describe con más detalle en los
siguientes ejemplos:
Este ejemplo ilustra la localización del locus
del gen de la MVC en el cromosoma bovino BTA3. Adicionalmente, esa
forma de realización describe la identificación de marcadores
ligados al locus del gen de la MVC, y por lo tanto la
caracterización de la región de la MVC del cromosoma bovino
BTA3.
Con objeto de cartografiar el locus responsable
de la MVC, se obtuvieron muestras de animales que participaban en
un estudio de reproducción. En resumen, para el estudio de
reproducción se eligieron aproximadamente 300 vacas y novillos
descendientes del toro T Burma y se inseminaron con el semen
del toro KOL Nixon. Se eligieron trece terneras afectadas en
función del examen postmortem, según describen Agerholm y
col., 2000. Estas 13 terneras, así como sus progenitores, en total
28 animales, se usaron en la exploración inicial del genoma. Las
terneras estaban separadas por 4 generaciones de su antecesor común,
el toro de pura raza Carlin-M Ivanhoe
Bell.
Se realizó la exploración del genoma, cubriendo
los 29 autosomas, usando una batería de marcadores de microsatélite
escogidos del mapa genómico del USDA (Kappes y col., 1997). Los
marcadores se eligieron con una distancia sucesiva por parejas de
entre 10 y 20 cM. En las zonas de duda debido a la baja
informabilidad del marcador, se incluyeron y tiparon nuevos
marcadores. Se usó un total de 194. Se realizaron reacciones de PCR
por duplicado en un volumen de 5 \mul en un robot de PCR ABI 877
(Applied Biosystems), que contenía 12 ng de ADN genómico, 1x de
tampón para PCR, 0,4 U de AmpliTaq Gold (Applied Biosystems), 20
pmol de cada cebador y MgCl_{2} 2,0 mM. Todos los marcadores se
analizaron en las mismas condiciones de touchdown PCR:
incubación a 94°C durante 12 minutos para activar la enzima, 35
ciclos a 94°C, 30 s; Ta, 45 s; 72°C, 20 s, finalizando con una
extensión final a 72°C durante 10 min. En los primeros diez ciclos
la Ta disminuyó antes de 67°C hasta 58°C, un grado por cada ciclo,
y en los 25 ciclos restantes la Ta se fijó a 58°C. Los productos de
la PCR se agruparon, y se analizaron de 5 a 9 marcadores diferentes
en cada carril en un ABI 377 (Applied Biosystems), y los geles
fueron analizados con el programa informático adjunto. Los alelos
fueron asignados con el programa Genotyper (Versión 2.1, Applied
Biosystems).
Para tres marcadores se calcularon lod
scores de dos puntos usando el programa MLINK del LINKAGE
package (Lathrop y col., 1985). Debido a la estructura del pedigrí
(Figura 1) con múltiples lazos de endogamia, el pedigrí se dividió
en trece pequeñas familias, una para cada ternera afectada
incluyendo el semental (KOL Nixon), la madre y el semental
abuelo materno (T Burma). Se aceptó que la enfermedad se
heredaba recesivamente con una penetrancia completa del
genotipo.
Se encontró un ligamiento significativo para los
tres marcadores. La lod score (Z) más alta se observó con
BMS2790 e ILSTS029 con una Z=10,35 a 8=0. Adicionalmente, el cercano
marcador INRA003 también estaba significativamente ligado al locus
de la MVC (Tabla 3).
| Marcador | Fracción de recombinación (\theta) | Lod score (Z) |
| BMS2790 | 0,00 | 10,35 |
| INRA003 | 0,03 | 6,44 |
| ILSTS029 | 0,00 | 10,35 |
Los anteriores resultados localizan el locus de
la MVC en BTA3 (Figura 2) según el mapa genético del USDA (Kappes y
col., 1997).
Once terneras eran homocigóticas para el
intervalo definido por INRA003, BMS2790, ILSTS029, BMS862 y HUJ246,
mientras que BMS2790 e ILSTS029 solos eran homocigóticos en las
trece terneras, según se esquematiza en la Figura 1. Fue posible
construir los haplotipos de estos marcadores, lo que nos permitió
deducir el haplotipo más probable de la MVC (Figura 1). Los
haplotipos están definidos por el tamaño de los alelos del marcador,
que están numerados desde 1 hasta N, en la que 1 define el alelo
más corto del marcador amplificado y N define el alelo más largo.
La longitud real de los alelos asociados con la MVC en Bell es como
sigue:
INRA003 (alelo nº 3): 176 pares de bases
BMS2790 (alelo nº 3): 118 pares de bases
ILSTS029 (alelo nº 2): 164 pares de bases
BMS862 (alelo nº 1): 130 pares de bases
HUJ246 (alelo nº 3): 262 pares de bases
La longitud real de los alelos dependerá de los
cebadores usados para amplificar el marcador, y la longitud de los
fragmentos mostrados anteriormente se basa en usar los cebadores
descritos en la 4.
Adicionalmente, se incluyeron en el estudio
diecisiete terneras adicionales afectadas muestreadas como parte
del programa de vigilancia danés de defectos genéticos. Todos los
animales afectados tenían el toro de pura raza Bell como
antecesor común. Se extrajo ADN a partir de muestras de sangre o de
semen usando procedimientos estándar.
Las 17 terneras y sus madres fueron genotipadas
con los 8 marcadores INRA003, BMS2790, ILSTS029, BM220, INRA123,
BMS862, BMS937 y HUJ246 que abarcaban la región del BTA3 desde
aproximadamente 59,5 cM hasta 67,9 cM, y dado que se aceptó que el
gen de la MVC en las 17 terneras adicionales, al igual que en el
estudio de reproducción inicial, procedía del toro antecesor común
Bell, se esperaba que existiera una región similar de
identidad por descendencia (IBD) en todas las terneras afectadas.
Esto también resultó ser el caso: en 17 de las 17 terneras, el
segmento del cromosoma definido por INRA003 y BMS2790 era
homocigótico, compartiendo los mismos alelos que los animales del
estudio de reproducción. En dos de los diecinueve animales se
observó heterocigocidad en los locus de ILSTS029 y BMS862 explicada
por eventos de recombinación simple entre BMS2790 e ILSTS029. Por
lo tanto, basándonos en los resultados combinados del genotipado,
hemos averiguado que el defecto genético de la MVC está localizado
más probablemente en un intervalo de menos de 6 cM, flanqueado por
los marcadores INRA003 e ILSTS029 según se ilustra en la Figura 2 y
se denomina "región de la MVC".
Las secuencias de los cebadores para los 8
marcadores aplicados INRA003, BMS2790, ILSTS029, BM220, INRA123,
BMS862, BMS937 y HUJ246 están representadas en la Tabla 4, a
continuación.
| Marcador genético | Secuencia de cebadores | ID. SEC. Nº |
| INRA003 | D: CTG GAG GTG TGT GAG CCC CAT TTA | ID. SEC. Nº: 1 |
| I: CTA AGA GTC GAA GGT GTG ACT AGG | ID. SEC. Nº: 2 | |
| BMS2790 | D: MG ACA AGG ACT TTC AGC CC | ID. SEC. Nº: 3 |
| I: AAA GAG TCG GAC ATT ACT GAG C | ID. SEC. Nº: 4 | |
| ILSTS029 | D: TGT TTT GAT GGA ACA CAG CC | ID. SEC. Nº: 5 |
| I: TGG ATT TAG ACC AGG GTT GG | ID. SEC. Nº: 6 | |
| INRA123 | D: TCT AGA GGA TCC CCG CTG AC | ID. SEC. Nº: 7 |
| I: AGA GAG CAA CTC CAC TGT GC | ID. SEC. Nº: 8 | |
| BM220 | D: TTT TCT ACT GCC CM CAA AGT G | ID. SEC. Nº: 9 |
| I: TAG GTA CCA TAG CCT AGC CAA G | ID. SEC. Nº: 10 | |
| HUJ246 | D: ACT CCA GTT TTC TTT CCT GGG | ID. SEC. Nº: 11 |
| I: TGC CAT GTA GTA GCT GTG TGC | ID. SEC. Nº: 12 | |
| BMS862 | D: TAT AAT GCC CTC TAG ATC CAC TCA | ID. SEC. Nº: 13 |
| I: ATG GM AM TM GAT GTG GTA TGT G | ID. SEC. Nº: 14 | |
| BMS937 | D: GTA GCC ATG GAG ACT GGA CTG | ID. SEC. Nº: 15 |
| I: CAT TAT CCC CTG TCA CAC ACC | ID. SEC. Nº: 16 |
\vskip1.000000\baselineskip
Se estableció una prueba diagnóstica para
determinar a los portadores bovinos de la MVC determinando si los
descendientes de Bell eran portadores del haplotipo asociado
con la enfermedad.
La prueba se basaba en los 8 marcadores de
microsatélite INRA003, BMS2790, ILSTS029, BM220, INRA123, BMS862,
BMS937 y HUJ246, y confiaba en el reconocimiento de los alelos o el
haplotipo específicos de la enfermedad (véase la Figura 1) en
animales descendientes de Bell.
Se determinó así que los animales eran
portadores si habían heredado los alelos asociados con la enfermedad
en la región definida por los marcadores INRA003, BMS2790, ILSTS029
y BM220 de Bell o de animales descendientes de Bell.
Si los animales no habían heredado el haplotipo asociado con la
enfermedad de Bell o de animales descendientes de
Bell, se determinó que no eran portadores. En los casos en
los que el haplotipo de Bell se había dividido por
recombinación, los animales se designaron como indeterminables. Los
cuatro marcadores adicionales sólo se usaron cuando la información
contenida en los marcadores de prueba había disminuido debido a la
incapacidad para distinguir entre la herencia materna y
paterna.
Al igual que en todas las pruebas diagnósticas
genéticas basadas en marcadores de ADN ligados, la prueba de la MVC
adolece del inconveniente de que un evento de recombinación doble
(un evento en cada lado del gen causante, entre el gen y los
marcadores flanqueantes) no puede ser detectado. En el presente
caso, este evento será extremadamente raro debido al fuerte
ligamiento entre los marcadores y el gen de la MVC, y se estima que
la fiabilidad de la prueba es mayor del 99%.
Se diseccionaron apenas 5 gramos de tejido
cardíaco de terneras nacidas muertas en las 3 horas de su
suministro, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se
almacenaron a -80°C. Se usaron 250 mg de tejido para el aislamiento
del ARN. El ARN se aisló usando el Kit RNA Isolation de Stratagene
(cat. 200345).
Se sintetizó ADNc mezclando 2,5 \mug del ARN
total con 1 \mul de oligo (dT)_{12-18}
(500 \mug/ml), 1 \mul de mezcla de dNTP 10 mM y H_{2}O para
dar un volumen final de 12 \mul. La mezcla resultante se calentó
a 65°C durante 5 min, se enfrió en hielo y se rotó brevemente. Tras
la adición de 4 \mul de 5 x de tampón de la primera hebra, de 2
\mul de DTT 0,1 M y 1 \mul de H_{2}O, el contenido se mezcló y
se incubó a 42°C durante 2 min, tras lo cual se añadió 1 \mul
(200 U) de Superscript II (GibcoBRL® Lifetechnologies) y la
incubación se dejó continuar a 42°C durante 1,5 horas. La reacción
se inactivó a 70°C durante 15 min. Para eliminar el ARN, se incubó
el ADNc a 37°C durante 20 min con 1 U de RNase H (Roche Molecular
Biochemicals).
Basándonos en una alineación de homología del
gen SLC35A3 entre Homo sapiens y Canis familiaris, se
diseñaron 2 oligos (SL1F y SL8R) para la amplificación de
prácticamente todo el ADNc del SLC35A3 bovino, incluyendo el codón
de inicio. Para obtener el extremo 3' del gen, el fragmento de la
PCR resultante fue secuenciado y se diseñó un nuevo oligo (SL5F).
Para amplificar el extremo 3' de SLC35A3 se usó SL5F en combinación
con un oligo (bSLCBVIR), basado en una secuencia publicada de una
EST bovina.
Se aplicaron las mismas condiciones de PCR para
ambos conjuntos de cebadores.
Las reacciones de PCR se realizaron en un
GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems) en un volumen final
de 10 \mul consistente en 1 \mul de tampón de reacción 10 x
NH_{4}, 0,5 \mul de MgCl_{2} 50 mM, 0,8 \mul de dNTP (2,5
mM de cada uno), 5,65 \mul de H_{2}O, 1 \mul de cebador
directo e inverso (5 pmol de cada uno) y 0,05 \mul de 5 U/\mul
de polimerasa de ADN BIOTAQ (Bioline).
La reacción de touchdown PCR consistió en
una etapa inicial de activación por calentamiento a 95°C durante 2
min seguida de 10 ciclos de desnaturalización durante 30 s a 95°C,
apareamiento a 62°C durante 30 s (descensos de 0,5°C) y elongación
durante 20 s a 72°C, más 30 ciclos adicionales con una etapa de
desnaturalización durante 30 s a 95°C, una temperatura de
apareamiento de 57°C durante 30 s y una etapa de elongación a 72°C
durante 30 s.
Se usaron los siguientes cebadores para
amplificar el ADNc completo de SLC35A3:
SL1F: 5'-GGA GGC AAA TGA AGA
TAA AAC-3' (ID. SEC. Nº: 19)
SL8R: 5'-CTA TGC TTT AGT GGG
ATT-3' (ID. SEC. Nº: 20)
SL5F: 5'-GAG TTG CTT TTG TAC
AGT GG-3' (ID. SEC. Nº: 21)
bSLCBVIR: 5'-ACT GGC TAC TAT CTA
GCA CAG GA-3' (ID. SEC. Nº: 22)
La secuencia del ADNc completa se obtuvo
aplicando estos cebadores en cuatro ciclos separados de reacciones
de secuenciación, usando los productos de la PCR purificados como
plantilla. Los productos de la PCR se purificaron usando
SPIN-X® (Corning Incorporated) a partir de un gel de
agarosa Seakem al 0,8%.
Las reacciones del ciclo de secuenciación se
llevaron a cabo en un GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems)
e incluyeron una etapa inicial a 96°C durante 2 min seguida de 99
ciclos de 96°C durante 10 s, 55°C durante 5 s y 60°C durante 4 min.
Los productos de la secuenciación se precipitaron con dos volúmenes
de etanol y 1/10 volumen de NaAc 3 M (pH 5,5), se lavaron con
etanol al 70%, se resuspendieron en 5 \mul de tampón de carga y
se analizaron en geles de secuenciación de acrilamida al 4% usando
un secuenciador automático AB1377.
La secuencia del ADNc del SLC35A3 bovino se
muestra en la Figura 4 (ID. SEC. Nº: 18).
Los filtros se prehibridaron en una disolución
de hibridación (6 x SSC (52,6 g de NaCl, 26,46 g de citrato sódico
por litro), 5 x Denhardt (2 g de ficoll (tipo 400, Pharmacia), 5 g
de polivinilpirrolidona, 5 g de albúmina sérica bovina (Fracción V,
Sigma), 0,5% de SDS y 50 \mug/ml de ADN-MC) a 65°C
durante 3 horas con rotación. Entonces se incubaron 100 pi de
oligonucleótido marcado en el extremo 5' con los filtros durante 16
horas a 65°C. Para el marcaje final se combinaron 5 pmol de
oligonucleótido con 5 \mul (50 \muCi) de
gamma-^{32}P-ATP (actividad
específica > 5000 Ci/mmol), 2 \mul de tampón de cinasa 10 x, 11
\mul de H_{2}O y 1 \mul (10 U) de cinasa de polinucleótido T4
(New England Biolabs Inc.), y la mezcla se incubó a 37°C durante
1,5 horas seguido de 5 min de ebullición para inactivar por calor la
enzima. La sonda marcada se precipitó con NaAc/etanol usando
procedimientos estándar, y tras un lavado con etanol al 70%, la
sonda se redisolvió en 100 \mul de H_{2}O. Tras la hibridación,
los filtros se lavaron una vez con disolución de lavado I (2 x SSC,
0,2% de SDS) y dos veces a 65°C con disolución de lavado II (0,1 x
SSC, 0,5% de SDS), y se expusieron a una película Kodak BIOMAXTM MS
durante 2 días a -80°C.
Se usaron los siguientes oligonucleótidos
marcados en el extremo 5' para identificar los clones ILSTS029 y
INRA003 positivos en BAC:
ILSTS029 oligo: 5'-CAC ACC GCT
GTA CAG GM MA GTG TGC CAA CCC TGG TCT AM TCC AAA ATC CAT TAT CTT CCA
AGT ACA T-3' (ID. SEC. Nº: 23)
INRA003 oligo: 5'-CGT CCC CTA
TGC GCT TAC TAC ATA CAC TCA MT GGA MT GGG AAA ACT GGA GGT GTG TGA
GCC CCA TTT A-3' (ID. SEC. Nº: 24)
Se prepararon grupos de BAC a partir de la
genoteca de BAC y se cribaron mediante PCR. Las reacciones de PCR
se realizaron en un GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems) en
un volumen final de 10 \mul consistente en 1 \mul de tampón de
reacción 10 x NH_{4}, 0,5 \mul de MgCl_{2} 50 mM, 0,8 \mul
de dNTP (2,5 mM de cada uno), 5,65 \mul de H_{2}O, 1 \mul de
cebador directo e inverso (5 pmol de cada uno) y 0,05 \mul de 5
U/\mul de polimerasa de ADN BIOTAQ (Bioline).
Se usaron los siguientes cebadores para
identificar mediante PCR los clones de BMS2790 que contenían los
BAC:
BMS2790D: 5'-AAG ACA AGG ACT TTC
AGC CC-3' (ID. SEC. Nº: 25)
BMS279OI: 5'-AAA GAG TCG GAC ATT
ACT GAG C-3' (ID. SEC. Nº: 26)
La reacción de touchdown PCR consistió en
una etapa inicial de activación por calentamiento a 95°C durante 2
min seguida de 10 ciclos de desnaturalización durante 30 s a 95°C,
apareamiento a 70°C durante 30 s (descensos de 0,5°C) y elongación
durante 20 s a 72°C, más 30 ciclos adicionales con una etapa de
desnaturalización a 95°C durante 30 s, una temperatura de
apareamiento de 65°C durante 30 s y una etapa de elongación a 72°C
durante 20 s.
El ADN de los BAC se preparó según el Qiagens
Large Construct Kit, y se usó aproximadamente 1 \mug de ADN de
BAC como plantilla para el ciclo de secuenciación realizado con el
BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Kit (PE Applied Biosystems).
Las reacciones del ciclo de secuenciación se realizaron en un
volumen final de 6 \mul que contenía 1 \mul de mezcla Big
Dye^{TM} Terminator, 1 \mul de cebador (5 pmol), 1 \mul de
tampón de reacción y 2 \mul de H_{2}O. Las reacciones del ciclo
de secuenciación se llevaron a cabo en un GeneAmp® PCR System 9700
(Applied Biosystems) e incluyeron una etapa inicial a 96°C durante 2
min seguida de 130 ciclos de 96°C durante 10 s, 55°C durante 5 s y
60°C durante 4 min. Los productos de la secuenciación se
precipitaron con dos volúmenes de etanol y 1/10 volumen de NaAc 3 M
(pH 5,5), se lavaron con etanol al 70%, se resuspendieron en 2
\mul de tampón de carga y se analizaron en geles de secuenciación
de acrilamida al 4% usando un secuenciador automático AB1377.
Cebadores de secuenciación:
T7: 5'-TTA TAC GAC TCA CTA TAG
GG-3' (ID. SEC. Nº: 27)
SP6: 5'-ATT TAG GTG ACA CTA
TAG-3' (ID. SEC. Nº: 28)
INRA003D: 5'-CTG GAG GTG TGT GAG
CCC CAT TTA-3' (ID. SEC. Nº: 29)
INRA003I: 5 ''-CTA AGA GTC GAA
GGT GTG ACT AGG-3' (ID. SEC. Nº: 30)
Se realizaron reacciones de PCR (2 \mul de
plantilla purificada/muestra de ADN genómico, 2 \mul de tampón 10
x PCR, 2 \mul de MgCl_{2} 25 mM, 3,3 \mul de cada dNTP 0,2 mM
(Ultrapure dNTP, 27-2033-01;
Amersham Pharmacia Biotech), 6 pmol de cebador (directo: CBFEX1,
5'-GGC CCT CAG ATT CTC-3' (ID. SEC.
Nº: 31); inverso: CBTEXR, 5'-GTT GAA TGT TTC
TTA-3') (ID. SEC. Nº: 32), 0,165 U de polimerasa Taq
(Biotaq, M95801 B; Bioline), dH_{2}O hasta el volumen total) sin
aceite en placas de 96 pocillos usando un Primus HT (MWG Biotech
AG). Condiciones de los ciclos: 95°C 120 s, 35x [95°C 60 s, 60°C 30
s, 72°C 110 s]. La limpieza tras la reacción se realizó mediante
filtración en gel (Millipore Filtration System) con Sephadex
G-50 Superfine
(17-0041-01, Amersham Pharmacia
Biotech) llevada a cabo según las recomendaciones del fabricante,
usando 50 \mul de dH_{2}O para la elución final de la muestra.
Las reacciones de secuenciación directa e inversa se realizaron con
los mismos cebadores usados para la generación del producto de la
PCR (2 \mul del producto de la PCR, 8 \mul de mezcla de
secuencias sean, 0,6 \mul de 6 pmol de cebador (véase
anteriormente), dH_{2}O hasta 20 \mul; DYEnamic ET Dye
Terminator Cycle Sequencing Kit (US81095). Después del termociclado
(30 x [95°C 20 s, 55°C 15 s, 60°C 70 s]) las muestras se limpiaron
mediante filtración en gel esencialmente según se describió
anteriormente y se analizaron con un MegaBACE1000 (Amersham
Pharmacia Biotech) usando una matriz de LPA de lectura larga y las
siguientes condiciones de secuenciación: inyección de 90 s a 3 kV y
tiempo de análisis de 35 a 9 kV.
Se diseñaron cebadores a partir de la secuencia
de ADNc y los cuatro cebadores específicos de alelo enseñaron para
tener la base de 3' en la posición de la mutación.
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencias de los cebadores:
T_directo: 5'-CAG TGG CCC TCA
GAT TCT CAA GAG CTT AAT TCT MG GAA CTT TCA GCT GGC TCA CAA TTT GTA
GGT CTC ATG GCA T-3' (ID. SEC. Nº: 33)
G_directo: 5'-CAC MT TTG TAG
GTC TCA TGG CAG-3' (ID. SEC. Nº: 34)
A_inverso: 5'-GCC ACT GGA AAA
ACA TGC TGT GAG AAA-3' (ID. SEC. Nº: 35)
C_inverso_lig*: 5'-aat gct
act act att agt aga att gat gcc acc ttt tca gct cgc gcc cca aat gaa
aat ata gct aaa cag gtt att gac cat ttg cga aat gta tct aat ggt caa
act ttt ttC TGG AAA AAC ATG CTG TGA GM C -3' (ID. SEC. Nº: 36)
Directo: 5'-GGC CCT CAG ATT CTC
MG AGC-3' (ID. SEC. Nº: 37)
Inverso: 5'-CGA TGA AAA AGG AAC
CAA MG GG-3' (ID. SEC. Nº: 38)
El cebador C_inverso_lig contiene una secuencia
de ligamiento del fago M13 (mostrada en letras minúsculas). Este
ligador se añadió para obtener un producto de la PCR más largo con
objeto de ser capaces de multiplicar las cebadores C y A en una
reacción de PCR. La base de 3' en la posición de la mutación se
muestra en negrita. Los cebadores C y G son específicos para el
alelo de tipo natural, mientras que los cebadores T y A son
específicos para la mutación.
\vskip1.000000\baselineskip
Pares de cebadores:
Múltiples y específicos de C y A: Directo +
A_inverso + C_inverso_lig (hebra menor)
Reacción específica de T: T_directo + Inverso
(hebra mayor)
Reacción específica de G: G_directo + Inverso
(hebra mayor)
\vskip1.000000\baselineskip
Condiciones de la AS-PCR:
Cada reacción de PCR se llevó a cabo en un
volumen de 10 \mul que contenía 20-100 ng de ADN
genómico, 0,025 unidades/\mul de polimerasa de ADN BIOLASE
Diamond, dNTP 0,75 mM, MgCl_{2} 3 mM, 0,25 pmol/\mul de cebador
(0,125 pmol/\mul de los dos cebadores inmersos en la múltiple) en
tampón 1 x NH_{4} (Bloline). La PCR se llevó a cabo en un
GeneAmp® PCR System 9700 (PE Applied Biosystems) en las siguientes
condiciones: 95°C durante 4 min, 35 ciclos de 94°C durante 30 s,
62°C (56°C para la reacción de T y G) en rampa 80% durante 30 s y
72°C durante 30 s seguida de una extensión final a 72°C durante 7
min y un almacenamiento a 4°C. A la PCR le siguió una
electroforesis en un gel de agarosa al 2% a 200 V durante 30
min.
Los resultados del análisis mediante PCR
específica de alelo de dos tipos naturales, dos portadores y dos
animales enfermos se muestran en la Figura 7.
La Figura 1 muestra el pedigrí usado para
localizar el locus de la malformación vertebral compleja bovina
(MVC) y los haplotipos de cinco marcadores de microsatélite en el
cromosoma bovino 3. Los haplotipos más probables de la MVC están en
negrita. Los cuadrados negros representan las terneras afectadas.
Las líneas dobles entre el semental y las madres indican un lazo de
endogamia. N se refiere al número de animales. Los genotipos de las
trece madres diferentes no se muestran por razones de
simplicidad.
La Figura 2 muestra el mapa genético del
cromosoma bovino 3. Las cifras en los lados se refieren a las
distancias genéticas dadas en centiMorgan (cM) a lo largo del
cromosoma. Se indica localización más probable del locus de la
malformación vertebral compleja bovina (MVC).
La Figura 3 muestra la distancia relativa en
cM entre los 3 marcadores de microsatélite ILSTS029, BMS2790 y
INRA003 (mostrados en la línea denominada marcadores Contig en el
Cr. bovino 3) en el cromosoma bovino 3 según esquematiza el U.S.
Meat Animal Research Center (Kappes y col. 1997). Los BAC que
contienen estos 3 marcadores se aislaron bien mediante hibridación
con filtros de réplica de alta densidad (ILSTS029 y INRA003), o
bien mediante cribado mediante PCR de la genoteca bovina de BAC
RPCI-42 (BMS2790). Los BAC se muestran con barras
negras y están anotados según el número de placa/número de pocillo.
Estos BAC se sometieron a una secuenciación de los extremos usando
los cebadores SP6 y T7, o a una secuenciación usando los cebadores
que se extendían desde el microsatélite. Las secuencias resultantes
fueron blasteadas frente al cromosoma humano 1 usando el
Ensemble Server en el Sanger Centre. Los números de acceso de la
búsqueda BLAST se muestran como números bajo el cromosoma humano 1
y la distancia relativa entre los aciertos se da en MB. Los genes
elegidos en la región se muestran en recuadros.
La Figura 4 muestra la secuencia de ADNc y la
traducción del gen SLC35A3 (ID. SEC. Nº: 18) y la secuencia de
aminoácidos codificada (ID. SEC. Nº: 17). El nucleótido polimórfico
en la posición 559 y la valina-180 afectada se
indican en negrita.
La Figura 5 muestra una comparación de la
secuencia de aminoácidos deducida de vaca SLC35A3 con las secuencias
humana (AB021981) (Ishida y col. 1999) y canina (AF057365) (Guillen
y col. 1998). Los puntos indican los residuos que se emparejan con
la secuencia de Bos taurus. Los guiones indican huecos que
han sido introducidos para optimizar la alineación.
La Figura 6 muestra los resultados obtenidos
de secuenciar la región (desde el nucleótido 544 hasta el 572 del
SLC35A3, véase la Figura 4), mostrando el polimorfismo G/T en la
posición 559 en la determinación del estado de MVC mediante
secuenciación. Los cuadros izquierdo y derecho muestran la
secuenciación directa e inversa, respectivamente. La fila superior
(-I-) muestra la secuenciación de un animal de equipo natural, la
fila central muestra la secuenciación de un (heterocigoto), y la
fila inferior muestra la secuenciación de un animal afectado.
La Figura 7 es una imagen que muestra los
productos de la PCR específica de alelo de dos animales de tipo
natural, dos portadores y los animales enfermos. Anotaciones: WT:
tipo natural, C: portador, S: enfermo, neg: control negativo, M:
marcador (escalera de tamaño). Las flechas muestran los productos de
la PCR específica de alelo: C: 220 pb, A: 98 pb, T:
340 pb y G: 288 pb.
1. Agerholm JS, Bendixen, C.,
Andersen O., Arnbjerg, J. (2000) LK meddelelser
octubre de 2000.
2. Barendse W, Vaiman D,
Kemp SJ, Sugimoto Y, Armitage SM,
Williams JL, Sun HS, Eggen A, Agaba M,
Aleyasin SA, Band M, Bishop MD, Buitkamp
J, Byrne K, Collins F, Cooper L,
Coppettiers W, Denys B, Drinkwater RD,
Easterday K, Elduque C, Ennis S, Erhardt
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10. Moloney, D. J., Panin, V. M.,
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map of human and cattle. Genomics 27,
489-496.
<110> Danmarks Jordbrugsforskning
| \hskip0,47cm Ministeriet for Fodevarer, Landbrug og Fiskeri |
| \hskip0,47cm Blichers Alle |
| \hskip0,47cm P.O. Box 50 |
| \hskip0,47cm B830 Tjele |
| \hskip1,32cm Dinamarca |
| \hskip0,47cm Kvaegavlsforeningen Dansire |
| \hskip0,47cm Ebeltoftvej 16 |
| \hskip0,47cm Assentoft |
| \hskip0,47cm 8900 Randers |
| \hskip0,47cm Dinamarca |
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Prueba genética para la
identificación de portadores de malformaciones vertebrales complejas
en el ganado
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 25652
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggaggtgt gtgagcccca ttta
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaagagtcg aaggtgtgac tagg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagacaagga ctttcagccc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagagtcgg acattactga gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgttttgatg gaacacagcc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggatttaga ccagggttgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptctagaggat ccccgctgac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de ADN
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<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagagagcaac tccactgtgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de ADN
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<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttttctactg cccaacaaag tg
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaggtaccat agcctagcca ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactccagttt tctttcctgg g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de ADN
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<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgccatgtag tagctgtgtg c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptataatgccc tctagatcca ctca
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggaaaaat aagatgtggt atgtg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtagccatgg agactggact g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcattatcccc tgtcacacac c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 326
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Proteína bovina SLC35A3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1217
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> ADNc bovino SLC35A3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggaggcaaat gaagataaaa c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctatgcttta gtgggatt
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagttgcttt tgrtacagtgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactggctact atctagcaca gga
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagacaagga ctttcagccc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaagagtcgg acattactga gc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttatacgact cactataggg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatttaggtga cactatag
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggaggtgt gtgagcccca ttta
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaagagtcg aaggtgtgac tagg
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccctcaga ttctc
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgttgaatgtt tctta
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacaatttgt aggtctcatg gcag
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccactggaa aaacatgctg tgagaaa
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccctcaga ttctcaagag c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgatgaaaaa ggaaccaaaa ggg
\hfill23
Claims (28)
1. Un procedimiento para detectar in
vitro una malformación vertebral compleja bovina (MVC) en un
sujeto bovino, en el que se identifica la presencia de al menos un
marcador genético localizado en el cromosoma bovino BTA3, en la
región flanqueada por, y que incluye, los marcadores de
microsatélite polimórficos BM4129 y BMS 1266 asociados con la
malformación vertebral compleja bovina (MVC), en el que el al menos
un marcador genético está ligado al gen bovino SLC35A3,
comprendiendo dicho procedimiento detectar, en el material genético
bovino, la presencia o ausencia de al menos un marcador genético
que está ligado a un rasgo de una enfermedad de una malformación
vertebral compleja bovina.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el al menos un marcador genético está localizado en la
región desde aproximadamente 59,5 cM hasta aproximadamente 67,9
cM.
3. Un procedimiento según la reivindicación 2,
en el que el al menos un marcador genético está localizado en la
región flanqueada por, y que incluye, los marcadores de
microsatélite polimórficos INRAA003 y BMS937.
4. Un procedimiento según la reivindicación 3,
en el que el al menos un marcador genético está localizado en la
región flanqueada por, y que incluye, los marcadores de
microsatélite polimórficos INRAA003 e ILSTS029.
5. Un procedimiento según la reivindicación 2,
en el que el al menos un marcador genético es el marcador de
microsatélite INRAA003.
6. Un procedimiento según la reivindicación 2,
en el que el al menos un marcador genético es el marcador de
microsatélite BMS2790.
7. Un procedimiento según la reivindicación 2,
en el que el al menos un marcador genético es el marcador de
microsatélite ILSTS029.
8. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el al menos un marcador genético es el marcador de
microsatélite INRA123.
9. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el al menos un marcador genético es el marcador de
microsatélite BM220.
10. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el al menos un marcador genético es el marcador de
microsatélite HUJ246.
11. Un procedimiento según la reivindicación 1
en el que el al menos un marcador genético es el marcador de
microsatélite BMS862.
12. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el al menos un marcador genético es el marcador de
microsatélite BMS937.
13. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el gen bovino SLC35A3 codifica para la proteína bovina
SLC35A3 que comprende una secuencia de aminoácidos según se muestra
en la ID. SEC. Nº: 17.
14. Un procedimiento según la reivindicación
13, en el que la proteína bovina SLC35A3 está codificada por una
secuencia de ADNc que comprende la secuencia de nucleótidos de la
ID. SEC. Nº: 18.
15. Un procedimiento según la reivindicación
14, en el que el marcador genético es un polimorfismo de un único
nucleótido en una posición equivalente al nucleótido 559 de la ID.
SEC. Nº: 18.
16. Un procedimiento según la reivindicación
15, en el que el polimorfismo de un único nucleótido es un
polimorfismo G/T.
17. Un procedimiento según la reivindicación
16, en el que la detección del polimorfismo G/T se realiza mediante
una técnica elegida del grupo formado por PCR específica de alelos,
minisecuenciación, extensión con cebadores, pirosecuenciación,
PCR-RFLP, amplificación en círculo específica de
alelo y extensión con cebadores seguida de una espectrometría de
masas MALDI-TOF.
18. Un procedimiento según la reivindicación 1
en el que dicho al menos un marcador genético está ligado
genéticamente a un gen o rasgo de enfermedad que cause la enfermedad
de malformación vertebral compleja bovina con una lod score
de al menos 3,0, tal como al menos 4,0, incluyendo al menos 5,0, tal
como al menos 6,0, incluyendo al menos 7,0 tal como al menos 8,0,
incluyendo al menos 9,0, tal como al menos 10,0, incluyendo al
menos 11,0, tal como al menos 12,0.
\vskip1.000000\baselineskip
19. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el al menos un marcador genético es una combinación de
marcadores genéticos.
20. Un procedimiento según la reivindicación 5,
en el que el par de cebadores para amplificar el marcador de
microsatélite INRAA003 es la ID. SEC. Nº: 1 y la ID. SEC. Nº: 2.
21. Un procedimiento según la reivindicación 6,
en el que el par de cebadores para amplificar el marcador de
microsatélite BMS2790 es la ID. SEC. Nº: 3 y la ID. SEC. Nº: 4.
22. Un procedimiento según la reivindicación 7,
en el que el par de cebadores para amplificar el marcador de
microsatélite ILSTS029 es la ID. SEC. Nº: 5 y la ID. SEC. Nº: 6.
23. Un procedimiento según la reivindicación 8,
en el que el par de cebadores para amplificar el marcador de
microsatélite INRA123 es la ID. SEC. Nº: 7 y la ID. SEC. Nº: 8
24. Un procedimiento según la reivindicación 9,
en el que el par de cebadores para amplificar el marcador de
microsatélite BM220 es la ID. SEC. Nº: 9 y la ID. SEC. Nº: 10.
25. Un procedimiento según la reivindicación
10, en el que el par de cebadores para amplificar el marcador de
microsatélite HUJ246 es la ID. SEC.: 11 y la ID. SEC. Nº: 12.
26. Un procedimiento según la reivindicación
11, en el que el par de cebadores para amplificar el marcador de
microsatélite BMS862 es la ID. SEC. Nº: 13 y la ID. SEC. Nº: 14.
27. Un procedimiento según la reivindicación
12, en el que el par de cebadores para amplificar el marcador de
microsatélite BMS937 es la ID. SEC. Nº: 15 y la ID. SEC. Nº: 16.
28. Un kit de diagnóstico para su uso para
detectar la presencia en un sujeto bovino de al menos un marcador
genético asociado con la malformación vertebral compleja bovina
(MVC), que comprende al menos una secuencia de oligonucleótidos
elegida del grupo formado por la ID. SEC. Nº: 1, la ID. SEC. Nº: 2,
la ID. SEC. Nº: 3, la ID. SEC. Nº: 4, la ID. SEC. Nº: 5, la ID. SEC.
Nº: 6, la ID. SEC. Nº: 7, la ID. SEC. Nº: 8, la ID. SEC. Nº: 9, la
ID. SEC. Nº: 10, la ID. SEC. Nº: 11, la ID. SEC. Nº: 12, la ID. SEC.
Nº: 13, la ID. SEC. Nº: 14, la ID. SEC. Nº: 15, la ID. SEC. Nº: 16,
la ID. SEC. Nº: 33, la ID. SEC. Nº: 34, la ID. SEC. Nº: 35, la ID.
SEC. Nº: 36, la ID. SEC. Nº: 37 y la ID. SEC. Nº: 38, y
combinaciones de las mismas.
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