DE10236711A1

DE10236711A1 - Polymorphe Mikrosatellitenloci in Genen für die Prädiagnostik

Info

Publication number: DE10236711A1
Application number: DE2002136711
Authority: DE
Inventors: Hermann Prof. Dr. Geldermann; Siegfried Dr. Preuß; Yihua Dr. Han
Original assignee: HOHENHEIM, University of; Universitaet Hohenheim
Current assignee: HOHENHEIM, University of; Universitaet Hohenheim
Priority date: 2002-08-09
Filing date: 2002-08-09
Publication date: 2004-02-26
Also published as: WO2004020664A2; AU2003266268A1; WO2004020664A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Typisierungsverfahren für Gene, die mindestens einen Mikrosatellitenlocus aufweisen, ein Verfahren zur Ermittlung von Markern in Genen, die Mikrosatellitenloci enthalten, bezüglich der Prädisposition von Erkrankungen sowie ein Verfahren zur Prädiagnostik von Erkrankungen, die mit Genen assoziiert sind, welche einen oder mehrere Mikrosatellitenloci aufweisen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Typisierungsverfahren für Gene, die mindestens einen Mikrosatellitenlocus aufweisen, ein Verfahren zur Ermittlung von Markern in Genen, die Mikrosatellitenloci enthalten, bezüglich der Prädisposition von Erkrankungen sowie ein Verfahren zur Prädiagnostik von Erkrankungen, die mit Genen assoziiert sind, welche einen oder mehrere Mikrosatellitenloci aufweisen.
Genanalysen sind meist auf DNA-Varianten innerhalb von Populationen oder Familien gerichtet. Mikrosatelliten sind übliche Kandidaten für solche Untersuchungen. Jedoch wurde angenommen, dass sie im Mittel etwa alle 10 bis 50 kBp in DNA und nur selten innerhalb von Genen auftreten (vgl. bspw. Schlötterer 2000).
Bei vielen Genen, die mit Erkrankungen assoziiert sind, sind keine oder nur wenige Polymorphismen bekannt und diese erlauben meist keine schnelle (d.h. effiziente) Typisierung. Ein Beispiel hierfür sind die unter der Bezeichnung Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSE) zusammengefaßten degenerativen Erkrankungen des Nervensystems bei Mensch und Tier, die durch einen ungewöhnlichen Erregertyp verursacht werden. Erreger derartiger Enzephalopathien, bspw. Scrapie (Schaf, Erkrankung seit über 250 Jahren bekannt), Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE; Rind), Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD; Mensch) oder verwandter Eigen enthalten im wesentlichen keine Nukleinsäuren (weder DNA noch RNA), sondern dürften vielmehr auf Grund ihres Proteinbestandteils infektiösen Charakter haben. Diesem Erregertyp wurde die Bezeichnung „Prion" (proteinaceous infectious particles, Prusiner 1982) gegeben.
Charakteristisch für TSE-Erkrankungen ist eine Inkubationszeit von mehreren Monaten bis einigen Jahren mir einer nachfolgenden klinischen Symptomatik, bspw. Anzeichen von Unruhe, Bewegungsstörungen, wie bspw beim Schaf ein traberartiger Gang auf den Vorderbeinen. Im Falle von Scrapie treten darüber hinaus Sensibilitätsstörungen (starker Juckreiz, der durch Scheuem zu Vliesschäden führt) auf. Die körperliche Verfassung infizierter Tiere oder von CJD-Patienten verschlechtert sich dramatisch, bis diese nach wenigen Wochen nicht mehr in der Lage sind, Nahrung aufzunehmen.
TSE-Erkrankungen sind horizontal von Tier zu Tier übertragbar. Injektion eines Extrakts aus dem Gehirn eines erkrankten Tieres in ein gesundes Tier führt zur Infektion mit nachfolgender Manifestation der typischen klinischen Symptome. Daß Nukleinsäuren keine wesentliche Bedeutung für die Infektion besitzen können, wurde im Falle von Scrapie durch Experimente mit Scrapie-Hirnextrakten nachgewiesen, die infektiös blieben, obwohl sie zuvor mit UV-Licht sowie mit kurzwelliger ionisierender Strahlung behandeh wurden. Hierdurch werden regelmäßig Nucleinsäuren geschädigt oder zerstört (Prusiner 2000). Auf Grund dieser und ähnlicher Experimente wurden anderweitige Hypothesen zur Natur des Krankheitserregen von TSE in den Hintergrund gedrängt, bspw die Virinohypothese (Bruce und Dickinson 1987), die besagt, dass das eigentliche Pathogen eine Nucleinsäure ist, die vom PrP^Sc lediglich eingeschlossen wird. Dies gilt auch für die andere Annahme (z. B. Dron und Manuelidis 1996), dass konventionelle Viren eine Rolle spielen oder ggf. eine veränderte Genexpression ursächlich ist.
Das für das Prior-Protein codierende Gen (PrP-Gen) wurde im Genom aller untersuchten Säuger gefunden. Sein Produkt, das zelluläre Prionprotein (PrP^C), wird insbesondere in Nervenzellen, aber auch in Zellen der Placenta exprimiert. Sog. „Knockout"-Mäuse, bei denen das PrP-Gen genetisch eliminiert oder abgeschaltet war, zeigten dagegen keinen phänotypischen Befund nach Injektion infektiösen Materials (Büeler et al. 1992, 1993). Die Funktion des PrP (bspw. Cu-Transport, Signalübertragung) ist allerdings noch nicht abschließend geklärt.
Die Übertragung von TSE erfolgt vermutlich durch eine Isoform des normalen zelleigenen PrP^C, die als PrP^Sc bezeichnet wird (Prusiner 1998). Die beiden Formen unterscheiden sich in ihrer Konformation, also in der Art ihrer räumlichen Faltung. Fourier-Tiansformations-Infrarot Spektroskopie mit hoch aufgereinigtem PrP^C ließ auf einen hohen Anteil an α-Helix schließen, wohingegen PrP^Sc, also die infektiöse Form, einen großen Anteil an β-Faltblatt- Struktur aufweist (Pan et al. 1993, Caughey et al. 1991, Gasset et al. 1993). Das PrP^Sc kann sich im Wirtstier vermehren, indem es die Konformationsumkehr von PrP^C zu PrP^Sc katalysiert und eine Kaskade mit Dominoeffekt auflöst. Hierdurch entsteht massenhaft agglomerationsfähiges PrP^Sc, das nicht durch Proteinase K abgebaut werden kann (Proteaseresistenz). Im Ergebnis bilden sich amyloidartige Ablagerungen Die Pathogenität der Erreger ist in der Störung und Beeinträchtigung des Nervengewebes begründet.
Insgesamt wurden im Stand der Technik erhebliche Bemühungen unternommen, um Erkenntnisse zum Aufbau und zur Funktion des PrP-Gens bzw PrP-Proteins bei Tier und Mensch zu gewinnen So wurde bspw das PrP-Gen des Schafs 1998 von Lee et al. sequenziert. Die 31412 Bp lange Sequenz ist in GenBank unter der Zugriffsnummer U67922 abgelegt. Das PrP-Gen des Schafs (2) enthält 3 Exons mit Längen von 52, 98 und 4 028 Bp und 2 Introns (2 421 bzw 14 031 Bp). Außerdem umfasst der Datenbankeintrag noch einen Bereich von 5 665 Bp 5'-wärts von Exon 1 und einen 3'-seitigen Bereich von 5117 Bp.
Die 5'-UTR der vom ovinen PrP-Gen codierten mRNA wird von den Exons 1, 2 und 3 kodiert und besteht aus insgesamt 160 Bp (Fig. 3). Der 771 Bp lange DNA-Abschnitt, der translatiert wird (Open Reading Frame, ORF), befindet sich in Exon 3 und kodiert 256 Aminosäuren Exon 3 codiert außerdem noch die Sequenz des 3'-UTR. Die 3'-UTR der ovinen PrP-mRNA ist mit 3246 Bp viel länger als die z. B des Menschen und der Maus (Lee et al. 1998), da sie repetitive Elemente enthält ein BovB (LINE, Long Intenpened Element), ein Bov tA2/-tA3 (SINE, Short Intenpened Element) und das Mariner-Element (Lee et al. 1998).
Das Protein PrP beim Schaf besteht aus 256 Aminosäuren, einschließlich des 24 Aminosäuren umfassenden Signalpeptids. Auffällig sind die 5 Wiederholungen eines meist 8 Aminosäuren umfassenden Motivs (Octapeptid) ab Position 54 (4).
Im Stand der Technik sind mindestens 11 polymorphe Positionen im ovinen PrP-Gen bekannt (Tab. 1). Bei allen untersuchten Tieren wurde stets jeweils nur eine Abweichung vom Wildtyp gefunden, d. h eine mutierte Position Da die Aminosäure Glycin an Position 171 sowohl durch Arginin als auch durch Histidin substituiert sein kann, gibt es insgesamt 12 verschiedene allelische Varianten des ovinen PrP-Gens.
Die Übertragung von TSE gelingt nur, wenn eine Homologie zwischen dem PrP des Spenders und dem PrP des Wirtes vorhanden ist, die Aminosäuresequenzen also eine Mindestübereinstimmung besitzen (Wilkens 1997). Man spricht in diesem Zusammenhang bei Übertragungen zwischen Spezies von „Speziesbarriere" und bei Übertragungen innerhalb einer Spezies von „Polymorphismusbarriere". Die genetische Prädisposition spieh also bei der Übertragung der Erkrankung und deren Pathogenese eine wesentliche Rolle (vgl. auch Manson et al. 2000). Ausgeprägte Auswirkungen von DNA-Varianten innerhalb des PrP-Gens wurden beim Menschen beim Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom (Hsiao et al. 1989) und der erblichen Creutzfeld-Jakob-Krankheit (Palmer et al. 1991) festgestellt.
Drei der 11 polymorphen Positionen im Schaf-PrP (Codon 136: Valin oder Alanin, Codon 154: Histidin oder Arginin und Codon 171: Glutamin oder Histidin oder Arginin) wurden bei Untersuchungen der Assoziationen mit der Scrapie-Inkubationszeit einbezogen (Belt et al. 1995, Hunter et al. 1996). Für die Beschreibung der Haplotypen werden Kombination aus 3 Buchstaben verwendet (z. B. VRQ: Valin (V) an Position 136, Arginin (R) an Position 154 und Glutamin (Q) an Position 171). Da immer nur maximal eine Position gegenüber dem Wildtyp als mutiert gefunden wurde, treten insgesamt 5 Haplotypen mit den folgenden Bezeichnungen auf: VRQ, ARQ (Wildtyp), ARH, AHQ und ARR.
Aufgrund der Genotypisierung von zahlreichen an Scrapie erkrankten Tieren aus verschiedenen Rassen in verschiedenen Ländern wird davon ausgegangen, dass die Haplotypen VRQ und ARQ mit einer erhöhten Empfänglichkeit gegenüber Scrapie einhergehen. Dagegen zeigten Tiere mit dem PrP-Genotyp ARR/ARR, mit Ausnahme eines Falles in Japan, keine Anzeichen einer Scrapie-Erkrankung. Die selteneren Haplotypen AHQ und ARH werden hinsichtlich der Scrapie-Suszeptibilität als einem mittleren Bereich angehörig eingeordnet.
Durch Kombination der 5 oben genannten Haplotypen erhält man 15 verschiedene Genotypen. Die schottische "Scrapie-Information Group" (Dawson et al. 1998) teilte diese 15 Genotypen unter Berücksichtigung der Rasse in 5 verschiedene Risikogruppen (R1 bis R5) ein (Tab. 2).
Die Frequenzen der ORF-Varianten im PrP-Gen bei 15 Rassen wurden von Drögemüller et al. (2001) angegeben Die beobachteten Varianten des PrP-Gens waren stark rassenspezifisch. So kamen z. B. in der Rasse Texel mit Ausnahme von AHQ/AHQ alle 15 Genotypen vor, während in manchen Rassen nur zwei oder drei Genotypen beobachtet wurden In den Rassen Deutsches Weißkopf, Deutsches Schwarzkopf und Bleu du Maine hatten mehr als 50% der Tiere den Genotyp ARR/ARR. In vielen Rassen, wie Merinoland und Gotland, war dieser Genotyp nicht vertreten Der bei diesen Rassen relativ häufig auftretende Genotyp ARQ/AHQ war in den Rassen Deutsches Weißkopf, Deutsches Schwarzkopf und Bleu du Maine nicht zu beobachte.
Während beim Schaf somit immerhin Anhaltspunkte für einen Zusammenhang von Krankheitsinzidenz und ORF-Polymorphismen gefunden werden konnten, erklären diese jedoch nicht vollständig die Scrapie-Verteilung und Rasse-spezifische Unterschiede (O'Doherty et al. 2000). Andererseits konnten im Fall von BSE (Rind) bisher keine (Hunter et al. 1994) bzw. nur geringe (Neibergs et al. 1994) Beziehungen zwischen PrP-Polymorphismen und der BSE-Inzidenz aufgezeigt werden Es wurden keine Aminosäuresubstitutionen im bovinen PrP gefunden, und eine stille Mutation und ein variables Repeat Motiv, das für ein Octapeptid im PrP codiert, sind bisher die einzigen bekannten Veränderlichkeiten im bovinen PrP-Gen.
Wie zuvor dargelegt, ist der Genotyp für das Infektionsrisiko mit TSE von größter Bedeutung. Hieraus ergibt sich die Notwendigkeit, den Genotyp bei Tier und Mensch frühzeitig zu bestimmen, um das Infektionsrisiko abschätzen zu können Im Falle der Tierzucht bildet darüber hinaus die Einteilung der Genotypen in Risikoklassen (Tab. 2) die Basis für Zuchtprogramme. Dabei soll für die Tierzucht unter einer schrittweisen Eliminierung von PrP-Allelen, die mit einer sehr hohen Scrapie-Suszeptibilität assoziert sind, auf Tiere mit dem resistenten Genotyp ARR/ARR gezüchtet werden (Drögemüller und Distl 2001).
Mit der Untersuchung zu der genetischen Prädisposition des Erkrankungsrisikos für Schafe mit bestimmten Genotypen bzw. Haplotypen des auf Chromosom 13 lokalisierten PrP-Gens wurde eine Möglichkeit für züchterische Maßnahmen, wie Selektionsentscheidungen geschaffen Drei eng gekoppelte Polymorphismen in den Codons 136, 154 und 171 mit 5 bekannten Haplotypausprägungen (VRQ, ARQ, AHQ, ARH, ARR) zeigen eine enge Beziehung zur Erkrankungsrate (Inkubationszeit) mit Scrapie (Dawson et al. 1998). Die Untersuchung im PrP-Gen an den entsprechenden Positionen macht jedoch eine aufwendige Sequenzierung erforderlich, deren Kosten in 2001 in Deutschland bei ca. 50 DM pro Tier lagen.

Demnach erfolgt die Genotypisierung bei Tier und Mensch im Stand der Technik durch Sequenzierung, ein Verfahren, das relativ teuer und zeitaufwendig ist. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nunmehr, solche Verfahren zur Verfügung zu stellen, die eine einfachere, schnellere und insbesondere kostengünstigere Genotypisierung bei Mensch und Tier erlauben. Des weiteren ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren anzugeben, die es ermöglichen, in mit Erkrankungen, z.B. TSE, zusammenhängenden Genen Marker für eine Suszeptbilität für derartige Erkrankungen aufzufinden und diese für eine schnelle und kostengünstige Prädiagnostik einzusetzen.

Diese Aufgaben werden durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.

Insbesondere wird unter einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Typisierung eines Gens, das einen oder mehrere polymorphe Mikrosatellitenloci aufweist, in einem Individuum bereitgestellt, umfassend die Schritte:

(a) Amplifizieren mindestens eines DNA-Bereichs des zu typisierenden Gens durch PCR mit entsprechend der Größe des DNA Bereichs ausgewählten Primern, wobei der DNA-Bereich mindestens einen polymorphen Mikrosatellitenlocus enthält und als Matrize eine Probe des Individuums dient, enthaltend eine DNA, die mindestens einen Abschnitt des Gens mit dem/den polymorphen Mikrosatellitenlocus/loci umaßt, und
(b) Ermitteln der Länge des Amplifikats/der Amplifikate von Schritt (a).

Das erfindungsgemäße Genotypisierungsverfahren beruht auf der an sich bekannten Tatsache, daß im Genom von Eukaryoten Abschnitte auftreten, die vergleichsweise kurz sind und aus mehrfach wiederholten Sequenzmotiven bestehen. Die Zahl der Wiederholungen (auch als engt „Repeats" bezeichnet) des Motivs kann sich bei diesen mit "Mikrosatelliten" bezeichneten Abschnitten von Individuum zu Individuum unterscheiden. Mit der Zahl der Wiederholungen ändert sich daher auch die Länge des jeweiligen Mikrosatellitenlocus. Sind bei einer bestimmten Spezies die Anzahl von Sequenzmotivwiederholungen und somit die Länge des Mikrosatellitenlocus zwischen Individuen oder auch Rassen unterschiedlich, wird der Mikrosatellitenlocus als "polymorph" bezeichnet. Um daher Mikrosatellitenloci zur Typisierung einzelner Gene heranzuziehen, ist es daher zunächst zur Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Typisierungsverfahrens erforderlich, daß das zu typisierende, d.h. auf die Zugehörigkeit zu einer Gruppe bezüglich einer bestimmten Eigenschaft hin zu analysierende Gen mindestens einen Mikrosatellitenlocus, vorteilhafterweise mehrere Mikrosatellitenloci aufweist, der/die sich in ihrer Länge zwischen verschiedenen Individuen einer Spezies unterscheidet/unterscheiden, d.h. polymorph ist/sind.

Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Genotypisierungsverfahrens wird somit die Länge und damit indirekt die Anzahl der Wiederholungen des Sequenzmotivs des jeweiligen polymorphen Mikrosatellitenlocus bestimmt. Hierzu wird erfindungsgemäß für jeden Mikrosatellitenlocus ein diesen Locus umfassender Abschnitt bzw. Bereich der das zu typisierende Gen enthaltenden DNA, welcher den zu analysierenden Mikrosatellitenlocus umfaßt, mittels PCR vervielfältigt, d.h. amplifiziert.

Selbstverständlich ist dabei von einer Probe des jeweiligen Individuums auszugehen, die eine entsprechende DNA enthält, die mindestens einen Abschnitt des zu typisierenden Gens mit dem oder den polymorphen Mikrosatellitenlocus oder -loci umfaßt.

Die Amplifikation erfolgt erfindungsgemäß durch PCR (engl. „polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion), wobei entsprechend dem jeweiligen zu vervielfältigenden DNA-Abschnitt bzw. -bereich ausgewählte Primer (kurze DNA-Oligonukleotide als Startermoleküle) eingesetzt werden. Die Technik der PCR ist einem Fachmann wohl bekannt und bspw. in Griffin und Griffin 2001 beschrieben, deren diesbezüglicher Offenbarungsgehalt vollumfänglich in die vorliegende Erfindung eingeschlossen ist. Bei dieser Vorgehensweise dient somit die bereits vorstehend dargelegte Probe des Individuums als Matrize, spezifischerweise die darin enthaltene DNA. Die Amplifikation mittels PCR hat die für diese Methode charakteristischen Vorteile, insbesondere eine hohe Geschwindigkeit und die Tatsache, daß selbst geringste Mengen an Proben-DNA benötigt werden, wobei letztendlich ein einziges den entsprechenden Abschnitt des Gens enthaltendes DNA-Molekül ausreicht.

Ganz allgemein können als Probenquellen sämtliche DNA-haltigen Materialien des jeweiligen Individuums eingesetzt werden. Dazu zählen bspw Blut, Serum, Sekrete, wie Schweiß, Ejakulat usw., Synovialflüssigkeit, Fruchtwasser, Exkremente, Liquor usw. Es können aber auch einzelne Zellen oder Fragmente davon, bspw. einzelne Hautzellen, Haarwurzelzellen, die sich vorzugsweise an ausgerissenen bzw. -gefallenen Haaren befinden, usw verwendet werden.

Der Ausdruck „Gen, das einen oder mehrere Mikrosatellitenloci aufweist" bedeutet, daß der betreffende Abschnitt des Genoms, der das zu typisierende Gen enthält, mindestens einen Mikrosatellitenlocus enthält, wobei dieser Abschnitt insbesondere Exon- und Intron-Bereiche des Gens sowie mit dem Gen zusammenhängende, insbesondere mit diesem vererbte, 5'- und 3'-Bereiche, bspw. solche Bereiche, die an der Regulation des betreffenden Gens beteiligt sind, umfaßt.

Die Größe des amplifizierten DNA-Abschnitts bzw. -bereichs ist erfindungsgemäß nicht besonders eingeschränkt. Für Mikrosatellitenpositionen sind Längen von etwa 50 bis etwa 500 Bp, insbesondere von etwa 50 bis etwa 300 Bp, bevorzugt.

Im Schritt (b) des erfindungsgemäßen Genotypisierungsverfahrens wird die Länge des im Schritt (a) erhaltenen Amplifikats bzw. der Amplifikate festgestellt. Hierzu wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform vorteilhafterweise eine Elektrophorese, d.h. die Auftrennung der Amplifikate mit Hilfe eines elektrischen Feldes, durchgeführt. Als Trennmedium dient dabei vorzugsweise ein Gel, insbesondere Agarose- oder Polyacrylamidgele, deren Herstellung einem Fachmann geläufig ist; vgl. bspw. Maniatis 2001. Besonders bevorzugt ist insbesondere bei einer Länge der Amplifikate von etwa 50 bis etwa 300 Bp, deren Trennung in Gelen, die eine Auftrennung der Fragmente bis hinunter auf wenige oder gar 1 Bp ermöglichen. Derartige Gele werden bspw. auch bei der Sequenzierung von DNA-Molekülen verwendet. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung automatischer Laser-Fluoreszenz-DNA Sequenziergeräte (bspw. A.L.F. von Pharmacia) mit entsprechenden Gelen (bspw. Hydrolink), wobei weiterhin die Verwendung interner und externer Standardfragmente, die im Handel erhältlich sind, oder in einfacher Weise mittels PCR ausgehend von einer bekannten Matrizen-DNA, wie bspw λ-DNA, hergestellt werden können, als Vergleich vorteilhaft ist.

Erfahrungsgemäß ist die Anzahl der Wiederholungen des jeweiligen Sequenzmotivs ein grober Indikator für den Polymorphiegrad des Mikrosatellitenlocus. Selbstverständlich sind Mikosatellitenloci im allgemeinen umso informativer, d.h. ermöglichen die Einteilung der Indivuen in eine möglichst große Anzahl von Subspezies, je mehr verschiedene Mikosatellitenloci-Ausprägungen vorhanden sind, d.h. je mehr die Anzahl der Sequenzmotivwiederholungen im Mikrosatellitenlocus zwischen den einzelnen Individuen schwankt. Demgemäß ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn der bzw. die polymorphe(n) Mikrosatellitenlocus/loci ein Sequenzmotiv aufweist aufweisen, das mindestens dreimal, mehr bevorzugt mindestens viermal, besonders bevorzugt mindestens fünfmal, wiederholt wird. Als Beispiele können polymorphe Mikrosatellitenloci genannt werden, die aus folgenden Konsensussequenzen ausgewählt sind: (ATA)₇, (GA)₇, (GT)₂₈, (AGG)₄, (AC)₅, (TTTGT)₅, (TA)₇, (TC)₅, (TAAA)₁₂, (ATTTT)₁₂, (TTTC)₁₈, (CA)₁₈, (CAGTT)₄, (AGC)₅, (GA)₅, (TTTGT)₄, (TCAGT)₄, (TTCAG)₄, (ACTGA)₃, (ACTGA)₄, (CA)₁₂, (ATC)₄, (T)₂₅, (TTG)_5, (T)₂ ₉, (CAA)₃, (TTCAG)₃, (AGTG)₄, (CAC)₅, (AAAACA)₄, (ACC)₄, (ATCAG)₅, (AC)₃, (CTG)₅, (GTT)₅, (T)₁₅, (CAA)₄ und (AC)₄.

Grundsätzlich läßt sich das erfindungsgemäße Typisierungsverfahren bei allen Genen durchführen, die mindestens einen polymorphen Mikrosatellitenlocus aufweisen. Dessen bzw. deren Sequenz und Position im zu typisierenden Gen kann einerseits bereits bekannt sein. Andererseits kann bzw können der/die polymorphe(n) Mikrosatellitenlocus/loci in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erst ermittelt werden.

Vorzugsweise wird die Identifizierung des/der polymorphen Mikrosatellitenlocus/loci wie folgt durchgeführt:
In einem ersten Schritt (A) wird das zu typisierende Gen nach Mikrosatellitenloci durchmustert, d.h. gescreent. Dazu ist im allgemeinen eine genomische Sequenz des betreffenden Gens erforderlich, die mindestens einen Mikrosatellitenlocus aufweist, Genomische Sequenzinformationen sind bezüglich einer Vielzahl von Genen im Stand der Technik bekannt und insbesondere in den Datenbanken von GenBank und des EMBL unter entsprechenden Zugriffsnummern hinterlegt. Ist bspw. lediglich eine cDNA-Sequenz verfügbar oder auch nur EST-Sequenzen, ist es selbstverständlich einem Fachmann mit Hilfe der gängigen molekularbiologischen Verfahren möglich, die erforderliche genomische Sequenzinformation zu gewinnen; siehe hierzu auch Maniatis et al. 2001. Das Durchmustern der genomischen Sequenz nach Mikrosatellitenloci erfolgt vorzugsweise mit entsprechend ausgelegten Computerprogrammen. Als Beispiele geeigneter Software können die Programme etandem aus dem Programmpaket EMBOSS (von HGMP-RC, London, Sputnik (Abijian 1994) und Software RepeatMasker (Smit und Green, http:://ftp.genome.washington.edu/cgibin/repeatmasker) genannt werden. Andererseits ist es selbst dann, wenn bei einem zu typisierenden Gen einer bestimmten Spezies nur sehr wenig oder auch überhaupt keine Sequenzinformation vorliegt, möglich, auch dieses Gen zu typisieren, bzw. darin befindliche polymorphe Mikrosatellitenloci zu ermitteln, wenn bei einer anderen Spezies die Gensequenz in ausreichendem Maß bekannt ist und auch darin befindliche Mikrosatellitenloci identifiziert wurden In diesem Fall können, mit der Maßgabe, daß eine ausreichende Sequenzhomologie bezüglich des zu typisierenden Gens zwischen den Spezies besteht, bspw. die bei der Spezies, bei dem hinreichend Sequenzinformation zur Verfügung steht, verwendete Primer auch bei der im Zuge der Typisierung des unbekannten Gens der anderen Spezies durchzuführende Amplifikation der entsprechenden DNA-Abschnitte verwendet werden. In diesem Fall ist daher auch die Ermittlung von polymorphen Mikrosatellitenloci in einem Gen, bei dem nur eine unvollständige oder auch überhaupt keine (genomische) Sequenz vorliegt, möglich, ohne dieses Gen nach Mikrosatellitenloci an sich zu durchmustern.

In einem (weiteren) Schritt (B) werden analog zum vorstehenden Schritt (a) des erfindungsgemäßen Genotypisierungsverfahrens die bei der Durchmusterung des Gens erhaltenen Mikrosatellitenloci entsprechende DNA-Bereiche (jeweils ein DNA-Abschnitt bzw. -bereich pro erhaltenem Mikrosatellitenlocus) bei einer Mehrzahl von Individuen des das zu typisierende Gen enthaltenden Organismus durch PCR amplifiziert, d.h. vervielfältigt. Bezüglich der Amplifikation gelten im übrigen die bereits vorstehend für den Schritt (a) des obigen Typisierungsverfahrens dargelegten Ausführungen.

Im nächsten Schritt (C) wird – analog zum Schritt (b) des erfindungsgemäßen Typisierungsverfahrens – die Länge des Amplifikats bzw der Amplifikate ermittelt, die bei jedem Individuum erhalten wurden Für die Längenbestimmung der Amplifikate gelten im übrigen die obigen Ausführungen bezüglich Schritt (6) des erfindungsgemäßen Genotypisierungsverfahrens entsprechend Zusätzlich zur Ermittlung der Länge der erhaltenen Amplifikate bei jedem Individuum oder auch alternativ dazu kann erfindungsgemäß auch eine Sequenzierung des jeweiligen Amplifikats oder auch eines Abschnitts davon, der jedoch mindestens den Mikrosatellitenlocus selbst enthalten muß, durchgeführt werden. Geeignete Sequenzierungsverfahren sind einem Fachmann wohl bekannt und können insbesondere mittels automatisierter Sequenzierungsgeräte (z.B. A.L.F. von Pharmacia) realisiert werden.

Schließlich werden die Längen der Amplifikate zwischen den Individuen bzw die erhaltenen Nukleotidsequenzen miteinander verglichen Somit wird im letzten Schritt (D) der oder die Mikrosatellitenlocus/loci ermittelt, dessen bzw deren Amplifikat(e) eine zwischen den Individuen unterschiedliche Länge aufweist/aufweisen oder dessen bzw. deren Nukleotidsequenz(en) zwischen den Individuen unterschiedlich ist/sind. Diese zwischen den Individuen unterschiedlichen Mikrosatellitenloci (bezüglich denen daher verschiedene Allele existieren) sind somit polymorph. Wie berets vorstehend dargelegt, können mit Hilfe des erfindungsgemäßen Typisierungsverfahrens die unterschiedlichsten Gene typisiert werden Voraussetzung ist lediglich, daß das zu typisierende Gen mindestens einen polymorphen Mikrosatellitenlocus enthält. Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Typisierungsverfahren bei Genen angewandt, die direkt oder indirekt mit der Ausprägung eines nachteiligen oder aber vorteilhaften Merkmals eines Organismus assoziiert sind. Hinsichtlich der nachteiligen Ausprägung eines Merkmals sind hier insbesondere Gene zu nennen, die mit einer Erkrankung oder anderen medzinisch oder wirtschaftlich (bspw bei (Nutz-) Tieren) bedeutsamen Merkmalen assoziiert sind Spezifische Beispiele von derartigen Genen sind PrP (BSE-Erkrankungen, wie Scrapie beim Schaf, BSE beim Rind, Creutzfeld-Jakob-Krankheit beim Menschen), CFTR (zystische Fibrose), Gene, die mit Stoffwechselerkrankungen bei Mensch und Tier assoziiert sind, wie α-Manosidose, Pompe-Krankheit, Zitrullinämie und Bovine Leukozytäre Adhäsionsdefizienz beim Rind (jeweils ein defektes Gen, dessen Varianten auf DNA-Niveau unterscheidbar sind), Stressanfälligkeit (Malignes Hyperthermie Syndrom) beim Schwein (RYR1-Gen, Variante T), Gene, die Milchproteine, Hormone oder Transkriptionsfaktoren kodieren usw Auch bezüglich des Organismus, dessen jeweiliges Gen typisiert werden soll, bestehen erfindungsgemäß keinerlei Einschränkungen, da in allen eukaryotischen Genen Mikrosatellitenloci zu finden sind. Aufgrund wirtschaftlicher bzw wissenschaftlicher Überlegungen sind als bevorzugte Beispiele von Organismen u.a. Mensch, Affe, Pferd, Schaf, Rind, Schwein, Ziege, Maus, Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen, Hund, Katze und Huhn zu nennen.

Aufgrund der Verfügbarkeit vielfältiger Sequenzinformationen und der Bedeutsamkeit bei Populationsstudien, ist ein besonders bevorzugtes Zielgen der erfindungsgemäßen Verfahren das bereits oben beschriebene PrP-Gen, welches mit TSE-Erkrankungen, die bei Menschen sowie anderen Säugerspezies auftreten, in Zusammenhang steht. Insbesondere wird das erfindungsgemäße Genotypisierungsverfahren auf das PrP-Gen des Menschen angewandt, wobei das bzw. die Sequenzmotiv(e) des/der polymorphe(n) Mikrosatellitenlocus/loci aus folgenden Konsensussequenzen ausgewählt sind: (ATA)₇, (GA)₇, (GT)₂₈, (AGG)₄, (AC)₅, (TTTGT)₅, (TA)₇, (TC)₅, (TAAA)₁₂, (ATTTT)₁₂, (TTTC)₁₈ und (CA)₁₈.

Besonders bevorzugt sind die Konsensussequenzen (ATA)₇, (GA)₇, (GT)₂₈, (TAAA)₁₂, (ATTTT)₁₂ und (CA)₁₈.

Weiterhin ist es hinsichtlich des PrP-Gens des Menschen bevorzugt, wenn der/die amplifizierte(n) DNA-Bereich(e) im Schritt (a) des erfindungsgemäßen Genotypisierungsverfahrens die Nukleotide 3621 bis 3641, 25415 bis 25428, 39450 bis 39505, 50315 bis 50326, 58346 bis 58385, 72392 bis 72416, 78300 bis 78313, 92615 bis 92624, 108429 bis 108476, 116907 bis 116966, 125528 bis 125599 und/oder 147980 bis 148015 gemäß GenBank Zugriffsnummer AL133396 umfaßt/umfassen. Insbesondere sind zur erfindungsgemäßen Genotypisierung DNA-Bereiche zur Amplifikation gemäß Schritt (a) bevorzugt, welche die Nukleotide 3621 bis 3641, 25415 bis 25428, 39450 bis 39505, 108429 bis 108476, 116907 bis 116966 und/oder 147980 bis 148015 gemäß GenBank Zugriffsnummer AL133396 umfassen.

Bevorzugte Sequenzmotive des/der polymorphen Mikrosatellitenlocus/loci des PrP-Gens des Rindes weisen die folgenden Konsensussequenzen auf: (CAGTT)₄, (TC)₅, (AGC)₅, (GA)₅, (TTTGT)₄, (TCAGT)₄, (TTCAG)₄, (ACTGA)₃, (AGTGA)₄, (CA)₁₂, (ATC)₄, (T)₂₅, (TTG)₅, (T)₂₉, (CAA)₃, (TTCAG)₃, (AGTG)₄, (CAC)₅, (AAAACA)₄, (ACC)₄, (ATCAG)₅ und (AC)₃.

Besonders bevorzugt sind dabei die Konsensussequenzen (AGC)₅, (TTTGT)₄, (CA)₁₂, (T)₂₅, (T)₂₉, (TTCAG)₃, (AAAACA)₄ und (ATCAG)₅.

Beim PrP-Gen des Rindes werden vorzugsweise DNA-Bereiche amplifiziert, welche die Nukleotide 444 bis 463, 4121 bis 4130, 7615 bis 7629, 19808 bis 19817, 25288 bis 25307, 30633 bis 30652, 32320 bis 32339, 37891 bis 37910, 39943 bis 39957, 44220 bis 44239, 44507 bis 44530, 46259 bis 46278, 48409 bis 48420, 50471 bis 50495, 53219 bis 53233, 54990 bis 55018, 60452 bis 60460, 62703 bis 62717, 64685 bis 64700, 66178 bis 66192, 68762 bis 68785, 68926 bis 68937, 72474 bis 72498 und/oder 74333 bis 74340 gemäß GenBank Zugriffsnummer AJ298878 umfassen. Mehr bevorzugt umfassen die amplifizierten DNA-Bereiche des PrP-Gens des Rindes die Nukleotide 7615 bis 7629, 25288 bis 25307, 44507 bis 44530, 50471 bis 50495, 54990 bis 55018, 62703 bis 62717, 68762 bis 68785 und/oder 72474 bis 72498 gemäß GenBank Zugriffsnummer AJ298878.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich beim zu typisierenden Gen um das PrP-Gen des Schafs. Vorzugsweise weisen dabei die polymorphen Mikrosatellitenloci die folgenden Sequenzmotive (Konsensussequenzen) auf: (CAGTT)₄, (TC)₅, (AGC)₅, (GA)₅, (TTTGT)₄, (TCAGT)₄, (ACTGA)₃, (ACTGA)₄, (CA)₁₂, (CTG)₅, (ATC)₄, (GTT)₅, (TTG)₅, (T)₁₅, (CAA)₃, (CAA)₄, (TTCAG)₃, (AGTG)₅, (CAC)₅, (ACC)₄ und (AC)₄. Besonders bevorzugt sind Mikrosatellitenloci im PrP-Gen des Schafs mit den Konsensussequenzen (GA)₅, (TTTGT)₄, (CA)₁₂, (GTT)₅, (T)₁₅ und (CAA)₄.

Bei der erfindungsgemäßen Typisierung des Schaf-PrP-Gens umfassen die gemäß obigem Schritt (a) amplifizierten DNA-Bereiche die Nukleotide 301 bis 320, 590 bis 613, 1033 bis 1047, 2477 bis 2496, 4651 bis 4662, 6627 bis 6641, 9433 bis 9447,11277 bis 11291,16748 bis 16756,18100 bis 18119,19372 bis 19386, 21383 bis 21398, 22853 bis 22867, 25422 bis 25433, 25580 bis 25591 und/oder 30168 bis 30175 gemäß GenBank Zugriffsnummer U67922, sowie sieben weitere genomische DNA-Bereiche, die 5' der in U57922 offenbarten Sequenz gelegen sind und für die kein GenBank-Eintrag exisitiert. Besonders bevorzugt amplifizierte DNA-Bereiche des Schaf-PrP-Gens umfassen die Nukleotide 590 bis 613, 6627 bis 6641, 11277 bis 11291 und/oder 25422 bis 25433 gemäß GenBank-Zugriffsnummer U67922, sowie sieben weitere genomische DNA-Bereiche, die 5' der in U67922 offenbarten Sequenz gelegen sind und für die kein GenBank-Eintrag exisitiert.

Unter dem Gesichtspunkt der Genotypisierung wird somit erfindungsgemäß die Verwendung von Mikrosatelliten zur Typisierung von Genen bereitgestellt. Dabei werden erstmalig insbesondere im PrP-Gen von Mensch, Rind und Schaf Mikrosatelliten bereitgestellt, die sich zwischen den Individuen der einzelnen Spezies unterscheiden, d.h. polymorph sind, also bezüglich dieser Mikrosatellitenloci mehrere verschiedene Allele existieren.

Unter einem weiteren Gesichtspunkt der folgenden Erfindung wird das vorstehend beschriebene Genotypisierungsverfahren in einem Verfahren verwendet, das geeignet ist, Mikrosatelliten Marker für die Prädisposition eines Individuums bezüglich einer Erkrankung zu ermitteln, wobei die Erkrankung mit einem Gen assoziiert ist, das einen oder mehrere polymorphe Mikrosatellitenloci aufweist.

In einem ersten Schritt (i) dieses Identifizierungsverfahrens wird das entsprechende Gen bei einer Mehrzahl von Individuen gemäß dem vorstehend beschriebenen Typisierungsverfahren typisiert. Hinsichtlich besonderer Ausführungsformen dieses Typisierungsverfahrens wird auf die vorstehenden Ausführungen unter dem ersten Gesichtspunkt der Erfindung verwiesen Von jedem der Mehrzahl von Individuen ist dabei bspw. bekannt, daß es die Erkrankung, bspw. vorstehend genannte Erkrankungen, aufweist oder nicht. Zusätzlich oder alternativ dazu kann, bspw. aus im Stand der Technik bekannten Untersuchungen der jeweiligen Erkrankung mit anderen genetischen Markern, bspw. ORF-Polymorphismen, Restriktionsfragmentlängen Polymorphismen usw., von jedem einzelnen Individuum der Mehrzahl von Individuen bekannt sein, daß das jeweilige Individuum einen bestimmten Prädispositionsgrad für die Erkrankung aufweist. Ein spezifisches Beispiel für eine derartige Beziehung zwischen bekannten genetischen Markern und dem Prädispositionsgrad einer Erkrankung kann der vorstehend beschriebene ORF-Polymorphismus im ovinen PrP-Gen genannt werden (vgl. Tab. 1 und 2). Vorzugsweise werden im Schritt (i) mindestens 100, besonders bevorzugt 500 oder mehr Individuen genotypisiert.

In einem weiteren Schritt (ii) des erfindungsgemäßen Identifizierungsverfahrens für Mikrosatelliten Marker werden die Genotyhäufigkeiten für jeden polymorphen Mikrosatellitienlocus bei den Individuen, von denen bekannt ist, daß sie erkrankt sind oder nicht bzw. einen bestimmten Prädispositionsgrad für die Erkrankung aufweisen, bestmmmt.

Schließlich wird im letzten Schritt (iii) festgestellt, bei welchen der polymorphen Mikrosatellitenloci eine aufgrund der im vorherigen Schritt (ii) bestimmten Genotyphäufigkeiten die größte statistische Signifikanz für das Merkmal "krank" bzw. "nicht krank" bzw. für den bekannten bestimmten Prädispositionsgrad besteht. Wird bspw. eine Ausprägung des polymorphen Mikrosatellitenlocus ausschließlich bei gesunden, d.h. an der betreffenden Erkrankung nicht leidenden Individuen gefunden und ist somit die Häufigkeit dieses Genotyps, d.h. dieses Allels, bei nicht erkrankten Individuen erhöht bzw. besonders hoch, wird der betreffende polymorphe Mikrosatellitenlocus als Marker für eine fehlende Prädisposition für die Erkrankung geeignet sein und somit ausgewählt werden. Im Gegensatz dazu wird eine Ausprägung, d.h. ein Allel, eines Mikrosatellitenlocus, welche ausschließlich oder gehäuft bei erkrankten Individuen angetroffen wird als Mikrosatelliten-Marker für eine erhöhte Prädisposition für die betreffende Erkrankung ausgewählt werden. Zwischen diesen Extremen, d.h. ausschließlich bei gesunden oder ausschließlich bei erkrankten Individuen auftretende Ausprägungen, sind selbstverständlich auch Zwischenstufen, die dennoch mit einem bestimmten Prädispositionsgrad korrelieren, möglich. Der bestimmte Prädispositinsgrad kann, wie vorstehend bereits dargelegt, auch erfindungsgemäß aufgrund anderer genetischer Marker, die bekanntermaßen mit einem bestimmten Prädispositionsgrad korrelieren, in Beziehung gebracht werden. Als Beispiel sei hier wiederum der im ovinen PrP-Gen bekannte ORF-Polymorphismus genannt. Beim im Stand. der Technik bekannten ORF-Polymorphismus im ovinen PrP-Gen kann aufgrund der Genotypisierung von zahlreichen an Scrapie erkrankten Schafen verschiedener Rassen und in verschiedenen Ländern davon ausgegangen werden, daß die ORF-Allele (ORF: engt „open reading frame", offenes Leseraster, d.h. Varianten in Protein codierenden Genbereichen) VRQ und ARQ mit einer stark erhöhten Scrapie-Empfänglichkeit verbunden sind. Dagegen zeigten Tiere mit dem Genotyp ARR/ARR eine besonders hohe Scrapie-Resistenz (mit Ausnahme einer Beobachtung in Japan wurde bei Schafen mit dem Genotyp ARR/ARR niemals eine Scrapie-Erkrankung festgestellt). Die anderen beschriebenen ORF-Allele werden bezüglich der Scrapie-Empfänglichkeit dazwischen angeordnet (vgl. Dawson et al. 1998, Bunter et al. 2000).

Desweiteren liegen die vorstehend beschriebenen polymorphen Mikrosatellitenpositionen beim ovinen PrP-Gen im Bereich dieses Gens (mit der Maßgabe, daß das ovine PrP-Gen keine Insertionen gegenüber dem bovinen PrP-Gen in diesem Bereich aufweist, ist der am weitesten 5' gelegene Mikrosatellitenlocus ist nur 29 kBp von Exon 1 entfernt; der am weitestens in 3' gelegene Mikrosatellitenlocus liegt sogar im Exon 3) und ihre Vererbung ist daher sehr eng mit derjenigen der ORF-Varianten gekoppelt. Daher werden sich Kopplungsbrüche derart selten ereignen, daß sie sich innerhalb von Rassen nicht beobachten lassen. Somit kann ausgehend von den statistisch hervorragend abgesicherten ORF-Genotypisierungen in Verbindung mit deren Kopplung mit den polymorphen Mikrosatellitenpositionen im Schaf-PrP-Gen mit Sicherheit auf eine Assoziation der Mikrosatelliten-Varianten mit der Scrapie-Resistenz oder -Suszeptibilität geschlossen werden, die in gleicher Größenordnung wie die zu den ORF-Varianten liegt. Dies wird durch die im nachfolgenden Ausführungsbeispiel 3 gefundene direkte experimentelle Evidenz bestätigt. Das Beispiel des ovinen PrP-Gens läßt sich selbstverständlich auf andere genetische Marker in anderen Genen und anderen Organismen sinngemäß übertragen, was einem Fachmann keinerlei theoretische oder experimentelle Schwierigkeiten bereiten wird.

Bezüglich der Organismen und Gene, bei denen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Ermittlungsverfahrens Mikrosatelliten-Marker identifiziert werden sollen, bestehen daher keinerlei Einschränkungen. Bevorzugte Organismen bzw. Gene sind vorstehend hinsichtlich des Genotypisierungsverfahrens der vorliegenden Erfindung ausführlich dargelegt.

Ein weiterer Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prädiagnostik von Erkrankungen. Die Erkrankungen sind dabei mit einem Gen assoziiert, das mindestens einen polymorphen Mikrosatellitenlocus aufweist. Das Prädiagnostik Verfahren der vorliegenden Erfindung umfaßt zunächst wiederum einen Typisierungsschritt (1), der mit Hilfe des vorstehend definierten Genotypisierungsverfahrens durchgeführt wird. Dabei wird das Gen eines zu untersuchenden Individuums bezüglich eines oder mehrerer Mikrosatellitenlocus/loci, der/die ein Marker für den Prädispositionsgrad bezüglich der jeweiligen Erkrankung ist sind, typisiert. In einem weiteren Schritt (2) wird dann der erhaltene Genotyp mit dem diesem Genotyp zugewiesenen Prädispositionsgrad bezüglich der Erkrankung verglichen.

Bevorzugt werden die Mikrosatelliten-Marker bei diesem Prädiagnostikverfahren mit Hilfe des oben beschriebenen Identifizierungsverfahrens ermittelt. Somit gelten bezüglich der Gene, Organismen usw. die oben unter dem jeweiligen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung dargelegten Ausführungen.

Das erfindungsgemäße Prädiagnostikverfahren wird insbesondere zur TSE-Prädiagnostik eingesetzt, wobei besonders das humane PrP-Gen, das bovine PrP-Gen sowie das ovine PrP-Gen bevorzugt sind Bei der Prädiagnostik des humanen PrP-Gens werden geeigneterweise polymorphe Mikrosatellitenloci eingesetzt, die eines der Sequenzmotive aufweisen, die vorstehend bezüglich des erfindungsgemäßen Typisierungsverfahrens angegeben sind Bevorzugte amplifizierte DNA-Bereiche bei der TSE-Diagnostik beim Menschen sind ebenfalls oben unter dem Gesichtspunkt des erfindungsgemäßen Typisierungsverfahrens angegeben. Im Fall des Rinder-PrP-Gens werden polymorphe Mikrosatellitenloci bevorzugt, welche die vorstehend hinsichtlich des erfindungsgemäßen Typisierungsverfahrens angegebenen Sequenzmotive aufweisen. Dabei bevorzugt amplifizierte DNA-Bereiche umfassen die vorstehend hinsichtlich des Typisierungsverfahrens der vorliegenden Erfindung definierten Positionen. Bei der Scrapie-Prädiagnostik (PrP-Gen des Schafs) werden vorteilhafterweise polymorphe Mikrosatellitenloci mit Sequenzmotiven verwendet, deren Konsensussequenzen ebenfalls vorstehend beim Typisierungsverfahren aufgelistet sind. Hinsichtlich bevorzugter Positionen derartiger Mikrosatellitenloci im Schaf-PrP-Gen, die geeigneterweise bei der zunächst durchgeführten Genotypisierung im erfindungsgemäßen Prädiagnostik-Verfahren amplifiziert werden, wird ebensfalls auf die obigen Ausführungen zum Typisierungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwiesen.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgend beschriebenen Figuren und Tabellen näher erläutert:

1 zeigt die Tertiärstruktur des Prionproteins (aus: Pringle: BSE, Scrapie, CJD and the Prion Protein, http://www.uni-mainz.de/~cfrosch/bc4s/prions.html), wobei in 1a die zelleigene Form (PrP^C) und in 1b die pathogene Form des Proteins bei Scrapie (PrP^Sc) dargestellt ist.

In 2 ist die Exon/Intron-Struktur des ovinen PrP-Gens wiedergegeben. Die verwendten Angaben beziehen sich auf den GenBank Eintrag U67922,

3 stellt den Aufbau des Transkripts des ovinen PrP-Gens dar (aus Geldermann et al. 2002).

4 ist eine Darstellung der ovinen PrP-Primärequenz (Geldermann et al., 2002). Das PrP-Protein des Schafs besteht demnach aus 256 Aminosäuren, einschließlich eines N-terminalen Signalpeptids aus 24 Aminosäuren. Mit ¹⁾ ist eine 5fache Wiederholung (5 × R) eines Motivs aus 8 oder 9 bzw: 5 Aminosäuren (PQGGGGWGQ, (PHGGGWGQ)₃, bzw PHGGG) gekennzeichnet, das im PrP-Protein konserviert ist. Es sind die jeweilige Aminosäure und deren Position der PrP-Allele (²⁾) angegeben (vgl. Tab. 1). Die dunkel markierten Aminosäurevarianten wurden bei Assoziationsanalysen mit der Scrapie-Empfänglichkeit verwendet.

In 5 sind schematisch die Mikrosatellitenloci im ovinen und bovinen Prp-Gen dargestellt. Mikrosatellitenmotive mit ≥ 3 Repeats (Wiederholungen) und > 90% Homologie wurden mit Hilfe des Programms etandem des EMBOSS-Programmpakets identifiziert. Zusätzliche Mikrosatelliten wurden mit Hilfe der Angaben in Lee et al. (1998) (mit ¹) gekennzeichnet), dem Sputnik-Programm (Abajian 1994) (mit ²) gekennzeichnet) oder dem Programm Repeat Masker (mit ³) gekennzeichnet) gefunden. Wurde mit diesen Maßnahmen ein Mikrosatellitenlocus nur in einer Spezies gefunden, wurde die homologe Stelle in der DNA der anderen Spezies ebenfalls abgesucht. Mikrosatellitenloci, die mit Hilfe dieser Methode identifiziert wurden, sind mit ⁴) gekennzeichnet. Die Bezugsskala in der Mitte bezieht sich auf die in GenBank hinterlegten Sequenzen (Rind: Zugriffnummer AJ298878; Schaf: Zugriffsnummer U67922). Die 5' Enden des ovinen und bovinen Exons 3 sind gegeneinander ausgerichtet. Die gepunktete Linie im Schaf-Gen zeigt einen Bereich, bezüglich dessen in GenBank keine Sequenzinformation zur Verfügung steht, wobei nur geschätzte Positionen der Mikrosatellitenloci angegeben sind In beiden Spezies homologe Mikrosatellitenloci werden durch die gleichen Zahlen gekennzeichnet. Die Loci S01 bis S06 und S09 beim Schaf wurden mit Primern untersucht, die für die PrP-Sequenz beim Rind entworfen wurden. Die Primer für die Loci beim Rind R07 und R08 ergaben beim Schaf keine PCR-Produkte. Hinsichtlich weiterer Einzelheiten wird auf die nachstehend beschriebene Tab. 3 verwiesen.

6 zeigt beispielhaft einen Vergleich alleler DNA-Sequenzen ausgewählter polymorpher Mikrosatellitenloci. Die jeweilige Sequenz aus GenBank ist als Referenz (R) jeweils in der ersten Zeile angegeben. In den Allelsequenzen sind die unterschiedlichen Reste markiert. 6A zeigt die Gegenüberstellung alleler DNA-Sequenzen für den Locus S11 im ovinen PrP-Gen. 6B zeigt eine entsprechende Gegenüberstellung für einen weiteren polymorphen Mikrosatellitenlocus im PrP-Gen des Schafs (S15). 6C zeigt eine Gegenüberstellung alleler DNA-Sequenzen des Locus R21 im bovinen PrP-Gen.

7 zeigt ein Diagramm, in welchem die Anzahl von Mikrosatellitenmotiven pro kBp im PrP-Gen des Rindes und des Schafs (schwarze Balken) mit den entsprechenden Werten in anderen Genen (helle Balken) für verschiedene Genbereiche, nämlich Exon, Intron und 5'-Bereich, sowie über den gesamten Genbereich dargestellt sind Auffällig ist die signifikant im ovinen und bovinen PrP-Gen erhöhte Dichte von Repeat-DNAin Exons gegenüber anderen Genen (p < 0,05). Die detaillierten Daten bezüglich der 7 sind in der nachstehend beschriebenen Tab. 6 gegeben.

In 8 ist schematisch das experimentelle Vorgehen zur Identifizierung geeigneter Mikrosatelliten-Marker zur TSE-Diagnostik am Beispiel der Analyse beim Schaf dargestellt.

9 gibt Beispiele zu Elektropherogrammen des Mikrosatellitenlocus S15 wieder. Spur 1 zeigt einen homozygoten, Spur 2 und 3 heterozygote Genotypen.

In 10 finden sich Beispiele zu Elektropherogrammen des Mikrosatellitenlocus S11. Die Spuren 1, 2, 3 und 6 zeigen verschiedene Tiere mit heterozygotem Genotyp, die Spuren 4 und 5 stellen homozygote Genotypen dar.

In 11 sind Beispiele zu Elektropherogrammen des Locus S24 abgebildet. Spur 1 und 2 zeigen homozygote, Spur 3 einen heterozygoten Genotyp. In Spur 4 tritt ein PCR Produkt mit der Länge 152 in Kombination mit dem Allel 147 auf, in Spur 5 ist es zusammen mit den Allelen 144 und 147 zu beobachten.

In den 9 bis 11 werden einige Beispiele von Amplifikaten zu den Loci S15, S11 und S24 als Ergebnis der Fragmentlängenanalyse der Mikrosatelliten dargestellt. Alle homozygoten Genotypen zeigten gut ausgebildete Peaks ohne Slippage-Erscheinung. Bei den Heterozygotbeobachtungen waren die beiden allelen PCR-Produkte auch bei 2 Bp Abstand eindeutig getrennt (s. 10, Spuren 1, 3 und 6). Irreführende Nebenprodukte wurden auf keinem Gel festgestellt.

Eine Besonderheit war bei Locus S24 zu beobachten. Bei 25 Merinolandschafen trat ein Fragment mit der Länge 152 auf, entweder in Kombination mit 144 oder 147 (11, Spur 4) oder in 15 Beobachtungen mit beiden anderen Allelen gleichzeitig (11, Spur 5). Um die Natur dieser 3 Allele zu klären, wurden sie nach vorausgegangener Klonierung sequenziert. Die mit dem A.L.F. gemessenen Fragmentlängen waren jedesmal 2 Bp kürzer als die durch Sequenzierung bestimmten (Tab. 16).

12 ist ein Alignment der 3 sequenzierten S24-Allele mit einem Ausschnitt des entsprechenden Datenbankeintrags in GenBank. Der Mikrosatellit der Datenbanksequenz besteht aus 4 Wiederholungen des Motivs CAA. Das 147 Bp lange Allel von Schaf S102 entspricht bis auf eine Punktmutation von A nach C dem Datenbankeintrag. Durch diese Mutation enthält das Allel 147 bei gleicher Länge wie die Datenbanksequenz eine Wiederholung des Motivs CAA mehr. Der Mikrosatellit des Allels 144 von Schaf 33 besteht nur aus 3 Wiederholungen des Motivs, wodurch dieses Fragment 3 Bp kürzer ist als das GenBank-Allel. Außerdem tritt an Position 57 (bezogen auf die GenBank-Sequenz) ein SNP von C nach T auf. Das Allel mit der Fragmentlänge 152 (Schaf 311) ist hinsichtlich des Mikrosatellliten identisch mit Allel 147. Zwischen Position 29 und 30 befindet sich jedoch ein 5 Bp langer Insert. Außerdem tritt an Position 103 ein A statt einem T auf.

Auf die im Anhang beigefügten Tabellen 1 bis 24 wird an den entsprechenden Stellen der vorliegenden Beschreibung bezog genommen. In diesen Tabellen werden die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Prinzipien und die gemäß den nachfolgenden Ausführungsbeispielen erhaltenen Ergebnisse widergegeben.

In der Tab. 1 sind die im PrP-Gen des Schafs gefundenen Aminosäure-Polymorphismen zusammengefasst (nach Hunter 2000, ergänzt).

Tab. 2 stellt die Risikoeinteilung (Risk) aufgrund der Aminosäure-Polymorphismen in den Positionen 136, 154 und 171 des Schaf-PrP dar, wie sie von der „Scrapie-Information-Group" (Dawson et al. 1998) vorgenommen wurde.

In der Tab. 3A sind die Daten von 24 Mikosatellitenloci mit 3 oder mehr Motivwiederholungen dargestellt, die im bovinen PrP-Gen gefunden wurden Tab. 3B zeigt die entsprechenden Daten der 23 aufgefundenen Mikrosatellitenloci im PrP-Gen des Schafs. 9 für die bovine DNA spezifische Primerpaare wurden auch mit Schaf-DNA als Matrize getestet, um den bisher nicht publizierten Bereich der Schaf-Sequenz (etwa 44 kBp) zu analysieren Mittels dieser Vorgehensweise konnten im Schaf-PrP-Gen 7 Mikrosatellitenloci identifiziert werden Im DNA-Bereich, in welchem sowohl für Schaf als auch für Rind Sequenzinformationen in GenBank zur Verfügung stehen, wurden bei 13 von 16 der im Schaf untersuchten Loci homologe Mikrosatellitenmotive in der bovinen DNA-Sequenz gefunden Diese Motive umfaßten 4-5 Wiederholungen, in den meisten Fällen allerdings mit unterschiedlichen Sequenzen Mononukleotidrepeats, die im Intron 1 und 2 des Rinder-Gens sowie im Intron 2 des Schaf-Gens gefunden wurden, zeigten 15 und mehr Wiederholungen.

Die Tab. 4 zeigt eine Zusammenstellung der Ergebnisse einer Analyse alleler PrP-Mikrosatelliten-DNA Varianten im bovinen (Tab. 4A) und ovinen (Tab. 4B) PrP-Gen Es wurden bei etwa 30% der analysieren Loci allele Varianten erhalten Wie in Tab. 4 zusammengefaßt, zeigten beim Rind 4 der 8 variablen Mikrosatellitenloci 2 Allele, und 2 Loci waren hoch variant (6 bzw. 10 Allele). Die Daten für das Schaf-Gen in Tab. 4B zeigen einen Locus mit 2 Allelen, 2 Loci mit 3 Allelen und 3 Loci mit 4 und mehr Allelen Einige der Varianten wurden nur in einer Rasse gefunden (9 von 31 Allelen beim Riad und 2 von 22 Allelen beim Schaf), während die anderen Varianten in mehr als einer Rasse auftreten Die DNA-Sequenzen alleler Fragmente zeigten Unterschiede in verschiedenen Positionen, zuwerfen sogar innerhalb eines bestimmten Allels (vgl. Tab. 4 und 6). Neben polymorphes Repeatanzahlen und SNPs in Mikrosatellitenmotiven wurden variable Stellen (SNPs sowie Insertionen und Deletionen) ebenfalls in den die Mikrosatellitenrepeats flankierenden, nicht repetitiven Sequenzen gefunden Bei 7 von 12 Loci entsprach keines der sequenzierten Allele den in GenBank hinterlegten DNA-Sequenzen Bei 2 polymorphen Loci war keine Datenbanksequenzinformation verfügbar. Beispiele sequenzierter Allele von 3 der Mikrosatellitenloci sind in 6A dargestellt und zeigen eine Veränderlichkeit der Fragmentlängen, die aus der veränderlichen Anzahl von Wiederholungen des Mikrosatellitenmotivs resultieren In Fällen mit zusammengesetzten Mikrosatellitensequenzen war die Anzahl der Wiederholungen in jedem Motiv unabhängig voneinander veränderlich (6B). Oftmals wurde jedoch festgestellt, daß die flankierenden Bereiche der Repeat Motive veränderlich waren (6B und 6C) und SNPs, Insertionen und Deletionen enthielten Dies führt zu den komplexen Unterschieden in einigen der Allele, was in Tab. 4 zusammengefaßt ist. Wie weiter in Tab. 4 dargestellt, wurden die Fragmentlängen der Allele mit dem A.L.F. DNA-Sequenziergerät gemessen und mit der Nukleotidanzahl der analysierten DNA-Sequenzen verglichen In 35 von 41 Fällen ergab die Fragementlängenanalyse mit dem A.L.F.-Gerät 1-3 Nukleotide kürzere Werte (in 15 Fällen 1 Nukleotid, in 16 Fällen 2 Nukleotide und in 4 Fallen 3 Nukleotide weniger) als die mittels Sequenzierung erhaltenen Ergebnisse. Diese Abweichungen sind wahrscheinlich auf Sekundärstrukturbildungen aufgrund der Repeats in den Mikrosatelliten-DNA-Fragmenten zurückzuführen, welche die Mobilität der jeweiligen Spezies beeinflussen Für die Typisierung von Genen spielt diese Abweichung von der tatsächlichen Länge keine Rolle, da die mittels Elektrophorese gemessene Fragmentlänge bei jedem gegebenen Genotyp konstant ist und sich somit für jedes Allel bei Verwendung des gleichen Elektrophoresesystems ein chrakteristischer Wert ergibt.

Tab. 5 stellt die als polymorph festgestellten Mikrosatellitenloci beim bovinen (Tab. 5A) und ovinen (Tab. 5B) PrP-Gen zusammen Bei 6 der polymorhen Mikrosatellitenloci des Rindes sowie bei alles 6 polymorphen Mikrosatellitenloci des Schafs wurde eine Frequenz des häufigsten Allels von < 0,95 festgestellt. Insgesamt wurde ein Heterozygotiegrad von > 0,10 bei 11 der insgesamt in beiden Spezies gefundenen 14 polymorphen Loci beobachtet.

In Tab. 6 sind Vergleichsdaten der Mikrosatellitenloci von bovinen und ovinen Genen dargestellt. Danach können nicht nur im PrP-Gen von Schaf und Rind sondern auch in anderen Genen dieser Spezies Mikrosatellitenloci lokalisiert werden. Im Mittel wurden 1,12 Mikrosatellitenloci pro 1 kBp DNA in den 8 analysierten Genen erhalten Die Ergebnisse gemäß Tab. 6 sind in der vorstehend beschriebenen 7 graphisch dargestellt.

Tab. 7 zeigt die im humanen PrP-Gen ermittelten Mikrosatellitenloci, von denen 5 mehr als 1 Allel in 18 untersuchten gesunden Freiwilligen zeigten. Bei diesen lag die Frequenz des vorherrchernden Allels bei < 0,95. Der beobachtete Grad der Heterozygozität schwankte zwischen 0,11 und 0,83. Des weiteren sind die PCR-Bedingungen bezgl. Anlagerungstemperatur und MgCl₂-Konzentration sowie die verwendeten Primer angegeben.

In Tab. 8 sind die Anzahl der im nachstehenden Ausführungsbeispiel 3 untersuchten Schafe und deren ORF-Genotypen dargestellt.

In Tab. 9 sind die PCR-Ansätze zur Amplifikation der Mikrosatellitenloci S11, S24 und S15 im PrP-Gen des Schafs angegeben, Tab.10 gibt das dabei ausgeführte PCR-Programm wider und Tab.11 zeigt die Sequenzen der verwendeten Primer.

In der Tab. 12 sind die Laufbedingungen bei der Elektrophorese angegeben, die zur Trennung der Mikrosatellitenloci-Amplifikate durchgeführt wurde.

In den Tab. 13 bis 15 sind Angaben zur Sequenzierung von klonierten PCR-Produkten zusammengefasst, die sich bei der Amplifikation des Mikrosatellitenlocus S24 des PrP-Gens des Schafs ergaben.

In der Tab. 16 sind die mittels Elektrophorese bzw. Sequenzierung erhaltenen Ergebnisse der Fragmentlängenanalyse des Mikrosatellitenlocus S24 des Schaf-PrP-Gens angegeben (vgl. auch die vorstehend beschriebenen 9 bis 11).

Die Allelhäufigkeiten und -Frequenzen der polymorphen Mikrosatellitenloci im PrP-Genbereich zu den 8 untersuchten Schafrassen werden in der Tab. 17 dargestellt. Für Locus S11 wurde die allele Fragmentlänge 152 als häufigstes Allel festgestellt mit geringster Allelfrequenz 0,54 in der Rasse Suffolk und höchster Frequenz 0,93 in den Rassen Merinoland und Schwarzkopf. Eine weitere hohe Allelfrequenz konnte in der Rasse Suffolk für die allele Fragmentlänge 158 mit 0,45 ermittelt werden Alle weiteren Frequenzen zu diesem Locus lagen für die einzelnen Rassen zwischen 0,007 (4 Beobachtungen zu Fragmentlänge 154 für Rasse Merinoland) und 0,149 (26 Beobachtungen zu Fragmentlänge 158 für Milchschaf).

Von den 5 allelen Fragmentlängen zu Locus S11 wurden nur die Fragmentlängen 150 und 152 in allen 8 Rassen detektiert Die Fragmentlänge 154 zeigte sich nur in der Rasse Merinoland.

Die Auszählung der allelen Fragmentlängen zu Locus S24 erfolgte in vereinfachter Form Zu diesem Locus wurden Fragmentlängen detektiert, die nicht eindeutig dem Locus (3er Repeat) zuzuordnen waren, bzw. die über Sequenzierung einer Interpretation zugänglich gemacht werden sollen. Es handelt sich um die Fragmentlänge 146 (6 Beobachtungen über alle Rassen) codiert zu 147 und die Fragmentlänge 152 (25 Beobachtungen in der Rasse Merinoland, die nur in Kombination mit 144 bzw. 147 auftrat und in 15 Beobachtungen als 3. Peak detektiert wurde (11). Diese Fragmentlänge wunde als Information negiert. Die analysierten Fragmentlängen 144 und 147 wurden in allen Rassen festgestellt, wobei Fragment 144 in den Rassen Dorper, Isle de France, Merinoland, Schwarzkopf und Texel mit Frequenzen zwischen 0,61 und 0,885 am häufigsten vertreten war und Fragment 147 in den Rassen Gotland, Milchschaf und Suffolk als häufigstes Allel mit Frequenzen zwischen 0,53 und 0,75 vorkam.

Der Mikrosatellitenlocus S15 zeigte 3 allele Fragmentlängen mit dem häufigsten Fragment 179 in allen Rassen und Frequenzen zwischen 0,57 (Rasse Gotland) und 0,98 (Rasse Dorper). Die Fragmentlänge 182 war in allen Rassen mit geringen Frequenzen zwischen 0,008 (1 Beobachtung zu Rasse Suffolk) und 0,192 (33 Beobachtungen zu Rasse Milchschaf) vertreten. Noch seltener zeigte sich das Fragment 173, das in 4 Rassen fehlte und mit Frequenzen zwischen 0,016 (2 Beobachtungen zu Rasse Suffolk) und 0,286 (4 Beobachtungen zu Rasse Gotland) vorkam.

Häufigkeiten und Frequenzen zu den Aminosäurevarianten der PrP-Genotypen sind in Tab. 18 aufgelistet. Für die allelen Ausprägungen an Codon 136 (Kennzeichnung ORF1) konnten für die Aminosäure Alanin (A) für die einzelnen Rassen Frequenzen zwischen 0,885 und 1,0 festgestellt werden. Die Aminosäure Valin (V), in der Literatur mit hohem Risiko für Scrapieanfälligkeit bei Tieren mit dieser Ausprägung angegeben, konnte nur mit geringen Frequenzen bis 0,115 (Rasse Isle de France) beobachtet werden, wobei in den Rassen Gotland und Milchschaf kein Tier mit dieser Variante auftrat.

Die allele Variante Histidin (H) war an Codon 154 (Kennzeichnung ORF2) in sehr geringer Anzahl vertreten (höchste Frequenz 0,258 in Milchschaf). Diese Aminosäureausprägung fehlte in allen Rassen, ausser Milchschaf (46 Beobachtungen), Merinoland (40 Beobachtungen) und Texel (1 Beobachtung). Die Aminosäure Arginin (R) wurde an dieser Position mit Frequenzen über 0,74 festgestellt.

An Codon 171 (Kennzeichnung ORF3) konnten für die 8 Rassen 3 allele Ausprägungen festgestellt werden. Die Aminosäure Histidin (H) trat in sehr geringer Frequenz auf mit Ausnahme der Rasse Texel, Frequenz 0,21 (30 Beobachtungen). Diese Aminosäureausprägung konnte mit einer Beobachtung nur noch in der Rasse Merinoland festgestellt werden. Die Ausprägungen Glutamin (Q) und Arginin (R) waren in den Rassen mit sehr unterschiedlichen Frequenzen vertreten Glutamin in der Rasse Gotland mit 20 Beobachtungen (100%), Arginin in der Rasse Schwarzkopf mit 70 Beobachtungen (80%).

Die beobachteten Heterozygotiegrade (D.C.: direct count estimate) und die unverzerrten Heterozygotieschätzwerte (unb: unbiased estimate) der 3 Mikrosatellitenloci und 3 ORF-Loci einschließlich der mittleren Hetrozygotiegrade werden in Tab. 19 dargestellt.

Für den Mikrosatellitenlocus S11 konnte der geringste beobachtete Heterozygotiegrad bei der Rasse Dorper mit 0,13 und der höchste bei der Rasse Suffolk mit 0,50 festgestellt werden. Bei dem Mikrosatellitenlocus S24 war der geringste beobachtete Heterozygotiegrad 0,231 bei der Rasse Isle de France und der höchste bei der Rasse Suffolk mit 0,594 zu erkennen. Zu dem Mikrosatellitenlocus S15 lagen die Werte zwischen 0,044 bei der Rasse Dorper und 0,714 bei der Rasse Gotland. Der geringste mittlere beobachtete Heterozygotiegrad mit 0,157 wunde bei der Rasse Schwarzkopf und der höchste bei der Rasse Gotland mit 0,571 festgestellt. Die Beobachtungswerte zeigten bei allen Rassen geringe, nicht signifikante Abweichungen zu den Erwartungswerten.

Im unteren Teil der Tab. 19 werden die Heterozygotiegrade der ORF-Loci gezeigt. Der höchste Heterozygotiegrad beim Locus ORF1 war bei der Rasse Isle de France zu beobachten mit 0,231. Zu ORF2 wurden bei der Rasse Milchschaf 0,315 und zu ORF3 bei der Rasse Texel 0,662 jeweils die höchsten Heterozygotiegrade festgestellt. Häufig traten nur homozygote Tiere bei den ORF-Loci in den einzelnen Rassen auf (Gotland und Milchschaf bei ORF1, Dorper, Gotland Ile de France, Schwarzkopf und Suffolk bei ORF2 und Gotland bei ORF3).

Der Locus S11 ist mit 5 Allelen der am höchsten polymorphe Locus in der Untersuchung. Bei der Prüfung der Genotyphäufigkeiten der Miknosatellitenloci auf Gleichgewichtssituation (Hardy-Weinberg-Gleichgewicht) in den untersuchten Rassen (Tab. 20) konnten keine Abweichungen festgestellt werden.

Bei dem Locus S24 mit den Allelen 144 und 147 waren die heterozygoten Tiere in allen Rassen überrepräsentiert. Der Genotyp 144/147 trat über die Rassen gerechnet mit 23 Beobachtungen (267 beobachtet, 244 erwartet) zu häufig auf. Dies führte jedoch in keiner Rasse zu einer signifikanten Abweichung der Genotyphäufigkeiten von einer Gleichgewichtssituation.

Der Locus S15 zeigte bei 3 auftretenden Allelen mit den seltenen Allelen 173 und 182 keine Abweichung vom Hardy-Weinberg-Equilibrium (HWE) in einer der Rassen.

Hinsichtlich der Prüfung der Genotypbeobachtungen der ORF-Loci konnte zu dem Locus ORF1 (Codon mit den Aminosäure-Varianten A (Alanin) und V (Valin)) in keiner Rasse eine Abweichung vom HWE festgestellt werden (Tab. 21). Her traten auch nur in den Rassen Dorper und Texel nennenswerte V Beobachtungen auf, wobei nur ein Schaf der Rasse Texel homozygot mit V/V erkannt wurde. Beim Locus ORF2 (Codon 154 mit den Aminosäure-Varianten H (Histidin) und R (Arginin) mit sehr geringem H-Anteil beobachtet in den Rassen Merinoland, Milchschaf und Texel (1 Beobachtung) zeigte sich ebenfalls keine signifikante Abweichung vom HWE. Eine Unterrepräsentation der Heterozygoten konnte bei Milchschaf erkannt werden.

Der ORF3-Locus (Codon 171 mit Aminosäure-Varianten H, R und Q (Glutamin) zeigte in der Rasse Merinoland eine signifikante Abweichung (P < 0,05) vom HWE mit bedeutsamer Unterrepräsentation des Typs Q/R (14 Beobachtungen zu wenig). In der Rasse Suffolk trat dieser Typ mit 6 Beobachtungen (nicht signifikant abweichend vom HWE) zu häufig auf.

Die seltene Ausprägung H (Histidin) war fast ausschließlich in der Rasse Texel vertreten und zeigte keine Auffälligkeit in den Frequenzen.

In den Tab. 22 bis 24 ist die Assoziation der Mikrosatellitenloci zu den Scrapie-Risikogruppen dargestellt (zur Definition der Risikogruppen (Merkmal Risk) vgl. Tab. 2)

Bei der Varianzanalyse mit Modell 1 (Signifikanzen und Bestimmtheitsmaße; vgl. hierzu die diesbezüglichen Ausführungen im nachstehenden 3. Ausführungsbeispiel) zu Rassen mit Tierzahlen > 60 ergab sich folgendes. In der Rasse Merino konnte über die Mikrosatellitenloci nur ein Anteil von 7,6 % an der phänotypischen Varianz des Merkmals Risk (Tab. 22) erklärt werden, wobei die Loci S11 und S15 keinen Anteil beitrugen. In Tab. 8 ist zu erkennen, dass die Rasse Merinoland bezüglich der Risikoeinteilung hauptsächlich in den Stufen 3 und 4 anzutreffen war (90,5 % der Beobachtungen) und somit eine geringe phänotypische Varianz bezüglich des untersuchten Merkmals zeigte.

Für die Rasse Milchschaf, Suffolk und Texel konnten dagegen Bestimmtheitsmaße für Modell 1 mit Weiten > 75 % ermittelt werden, wobei in allen Rassen S24 mit hohem Signifikanzlevel Anteil an der Varianz des Merkmals Risk hatte.

Schließlich ergaben sich folgende Schätzwerte zu Merkmal Risk aus der Analyse mit Modell 1 zu den berücksichtigten Mikrosatellitenloci. Die Analysen zu den einzelnen Rassen (Tab. 23) ergaben für den Locus S24 für Tiere mit Genotyp 147/147 im Vergleich zu Tieren mit dem Genotyp 144/144 eine eindeutige Erhöhung des Merkmals Risk mit höchster Differenzierung in der Rasse Suffolk bei den beiden Homozygottypen mit einer erwarteten Trennschärfe von ca. 2,7 in der Risikodifferenz. Bei dem Locus S11 zeigte sich ein höhrerer Merkmalswert Risk bei Tieren mit dem Allel 150, besonders gut zu erkennen bei der Rasse Texel. Hierzu lagen jedoch nur Heterozygotbeobachtungen vor.

Der Locus S15 zeigt zu den einzelnen Rassen uneinheitliche Assoziationsgrößen für die verschiedenen Genotypen. Auffällig war eine Risikoerhöhung in der Rasse Texel, feststellbar für Tiere, die mit dem Allel 173 auftraten.

In Tab. 24 sind die untersuchten Mikrosatellitenloci innerhalb ORF-Genotypen aufgelistet, wobei innerhalb dieser Klassen die Mikrosatellitenloci in der Sortierreihenfolge S24, S11, S15 nach Genotyp erfolgte. Innerhalb dem mit geringstem Erkrankungsrisiko assoziierten ORF-Typ ARR/ARR mit 76 Beobachtungen in 6 Rassen zeigten alle Tiere die gleiche Genotypkombination der 3 Mikrosatellitenloci S24, S11, S15 mit 144/144, 152/152 und 179/179. Diese Homozygotausprägung an den drei Loci kam im gesamten Datenmaterial mit 188 Beobachtungen vor mit anteilsmäßig abnehmender Tendenz bis zur Risikostufe 4 mit 47 Beobachtungen (20% von 233 Beobachtungen in dieser Stufe). In Risikostufe 5 war diese Genotypkombination nicht vertreten Die Risikostufe 2 konnte mit 16 Beobachtungen in den Rassen Merinoland und Milchschaf ermittelt werden, einmal wurde sie in der Rasse Texel beobachtet.

Dies deutet darauf hin, dass die Aminosäureausprägung H (Histidin) an Codon 154 vorwiegend in diesen beiden Rassen manifestiert ist, was auch in dem ORF-Typ ARQ/AHQ in Risikoklasse 3 mit 53 Beobachtungen eine Bestätigung fand Die restlichen zwei ORF-Typen mit H an Position 154 (AHQ/ARH, AHQ/VRQ waren in den vorliegenden Daten nicht vertreten. Auffällig war das seltene Auftreten des Genotyps 144/144 in S24 mit nur 4 aus 70 Beobachtungen zu ORF-Typen mit H an Position 154. Der ORF-Typ ARR/ARQ Risikostufe 3 mit 165 Beobachtungen festgestellt in allen Rassen war nach ARQ/ARQ am zweithäufigsten vertreten mit 29% von 573 Gesamtbeobachtungen (alle Beobachtungen mit Informationen zu allen 3 Mikrosatellitenloci und zum ORF-Genotyp). Zu diesem ORF-Typ konnte noch ein hoher Anteil der Genotypkombination der Mikrosatelliten mit 144/144, 152/152, 179/179 mit 62 Beobachtungen (37,6%) festgestellt werden. Innerhalb dieses Typs traten auch erstmals zu Locus Sil die Allele 150, 154 und zu Locus S15 das Allel 182 jeweils in sehr geringer Frequenz auf. Der ORF-Typ ARR/ARH, Risikostufe 3 mit 10 Beobachtungen zeigt an Codon 171 die seltene Ausprägung H (Histidin). ORF-Typen mit dieser Aminosäure wurden in den vorliegenden Daten bis auf eine Ausnahme in der Rasse Merino nur in der Rasse Texel festgestellt (s. auch ORF-Typen ARH/ARH und ARQ/ARH in Risikostufe 4 und ARH/VRQ in Risikostufe 5). Insgesamt zeigten 24 Tiere diese Ausprägung wobei eine eindeutige Zuordnung zu bestimmten Genotypen der Mikrosatellitenloci nicht festgestellt werden konnte. Der ORF-Typ ARQ/AHQ Stufe 3 (s. auch ARR/AHQ und AHQ/AHQ nur vertreten in den Rassen Merinoland und Milchschaf war bis auf die oben erwähnte Besonderheit nicht weiter auffällig. Der ORF-Typ ARQ/ARQ (Wildtyp) Risikostufe 4 mit 209 Beobachtungen (36,5% des gesamten Datenmaterials) vertreten in alles Rassen, zeigte bezüglich S24 eine starke Häufung des Genotyps 147/147 mit 34% der Beobachtungen innerhalb dieses Typs. Dieser Genotyp war in den Risikostufen 1 bis 3 nur mit 4% vertreten. Zu Locus S11 war eine bedeutsam höhere Frequenz des Allels 150 mit 7% innerhalb dieses ORF-Typs gegenüber 2% innerhalb der Risikostufen 1 bis 3 feststellbar. Der Locus S15 zeigte eine signifikante Erhöhung der Frequenz des Allels 182 mit 12,7% der Beobachtungen gegenüber dem geringen Auftreten von 2,3% innerhalb der Risikostufen 1 bis 3.

Die Allele 150 zu Locus S11 und 182 zu Locus S15 traten in den nachfolgenden Risikostufen mit V (Valin) an Position 136 mit noch höheren Anteilen auf (28% Anteil für Allel 150 und 26% Anteil für Allel 182). Der Locus S24 zeigte in der höchsten Risikostufe jedoch keine Auffälligkeit bezüglich der Frequenzen der Mikrosatellitengenotypen.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert:

Ausführungsbeispiel 1:

Materialien und Methoden

Analise von Mikrosatelitenmotiven: Genomische DNA-Sequenzen der das PrP-Protein codierenden Gene sind in GenBank (Zugriffsnummern: U67922 für Schaf und AJ298878 beim Rind) verfügbar und wurden auf Mikrosatellitenmotive unter Verwendung der Software etandem des EMBOSS-Programmpakets (HGMP-RC, London) abgesucht. das Motivgrößenfenster betrug 2 bis 25 Nukleotide und nur solche Mikrosatellitenmotive mit mindestens 3 Wiederholungen (Repeats) und 90% Homologie wurden ausgewertet. Weitere Mikrosatellitenloci wurden mittels des Sputnik-Programms (Abajian 1994), dem Programm RepeatMasker (Smit und Green, zugänglich unter http://fdp.genome.washington.edu/cgibin/RepeatMasker) und der bei Lee et al. (1998) angegebenen Informationen gefunden Wurde ein Mikrsatellitenmotiv nur in einer Spezies identifiziert, wurde die DNA-Sequenz der anderen Spezies durch eine Gegenüberstellung verglichen und der homologe Bereich hinsichtlich des gleichen Mikrosatellitenmotivs überprüft. Alle Sequenzgegenüberstellungen wurden mit dem Programm GeneDoc durchgeführt, das unter der URL http://www psc.ecu/biomed/genedoc zugänglich ist.

Tiere und Proben: Blutproben wurden von 11 Schafrassen (3 Tiere pro Rasse: Awassi, Changthangi, Dorper, Hu, Merinoland, Milchschaf, Gotland, Schwarzkopf, Shkodrane, Texel, White Karaman) und 8 Rinderrassen (4 Tiere pro Rasse: Busa, Holstein-Schwarzbunte, Jersey, Südanatolisches Rotvieh, Simmental, Nanjing-Rind, Nguni, Yerli Kara) gesammelt.

Herstellung genomischer DNA: DNA wurde aus EDTA stabillisiertem Blut durch Chlorophorm-Phenol Extraktion oder unter Verwendung von Isolienrugskits (NucleonBAcc2, Pharmacia, Freiburg, oder Nucleo Spin Blood Quick Pure, Macherey-Nagel, Düren) isoliert. Die Qualität der DNA wurde mittels Elektrophorese in 1% Agarose-Gelen und durch photometrischen Test bei 260/280 nm überprüft. Das erhaltene DNA-Material wurde in sterilem TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) bei –80 °C gelagert.

Primer: Die Primersequenzen wurden unter Verwendung der Primer 3-Software (Rozen und Skletsky 1998) konstruiert und von Roth (Karlsruhe) syntethisiert, wobei pro Locus ein fluoreszierender Primer bereitgestellt wurde.

PCR: E3 wurde ein Standard Protokoll {anfängliche Denaturierung für 5 min bei 94 °C gefolgt von 30 Zyklen jeweils mit 1 min bei 55 °C, 1 min bei 72 °C und 1 min bei 94 °C, und eine letzte Extension für 15 min bei 72 °C) verwendet, wobei die Reaktion in einem Volumen von 20 μl durchgeführt wurde mit 0,15 mM Primer, 200 mM von jedem dNTP, 100 ng genomischer DNA, 1,5 mM MgCl₂ und 0,5 Einheiten Taq Polymerase (bezogen von Rotte, Karlsruhe). Die Effizienz und Spezifität der PCR wurde durch Veränderung der MgCl₂-Konzentration (von 1,5 bis 4,5 mM) zusammen mit der Anlagerungstemperatur (48-65 °C) in einem Gradienten-Thermocycler optimiert. Die Primer und weitere PCR-Bedingungen, die für die Fragment-Analyse gemäß Ausführungsbeispiel 1 verwendet wurden, sind in der Tab. 3 angegeben.

Fragmentlängenanalyse: Unter Verwendung eines automatischen Laser-Fluorreszenz-DNA-Sequenziergeräts (A.L.F. Pharmacia) mit 5% Hydrolink Gelen wurden die PCR-Produkte (jeweils 0,5 μl) zusammen mit internen (99-198 Nukleotide) und externen (80-353 Nukleotiden) Standard-Fragmenten (hergestellt durch PCR mit λ-DNA als Matrize) analysiert. Vor dem Beladen des Gels wurden die Fragmente denaturiert (2 min bei 90 °C und dann Eiskühlung). Die Elektrophorese wurde in 0,6 % TBE-Puffer bei 1500 Volt, 45 mA und 50 °C durchgeführt. Die Datenanalyse wurde mittels der AlleleLinks-Software (Pharmacia, Freiburg) durchgeführt.

Klonierung von PCR-Produkten: Zur Sequenzierung separater Allele wurden 0,067 pmol gereinigtes PCR-Produkt mit dem End-Conversionsmix (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) behandelt und in den mit EcoRV verdauten pT7-Blue-Vektor mit stumpfen Enden ligiert. Es wurde eine Hitzeschocktransformation von NovaBlue-E.coli-Wirtszellen gemäß den Anweisungen des Herstellen durchgeführt. Positive Klone wurden mittels Blau-Weiß-Screening identifiziert und hinsichtlich der korrekten Insertgrößen durch Vektor-PCR (stromaufwärtiger Primer. 5'-TAATACGACTCACTATAGGG3'; stromabwärtiger Primer. 5'-TTGTAAAACGACGGCCAGTG3') und eine Elektrophorese auf einem 1,5% Agarosegel überprüft.

Insertpräparation und DNA-Sequenzierung: Matrizen-DNA wurde ausgehend von den weißen Klonen durch Vektor-PCR erzeugt und mit dem Cycle Pure KIT (Peglab, Erlangen) gereinigt. Beide DNA-Stränge wurden von MWG-Biotech (Ebersberg) sequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden unter Verwendung der Programme Chromas (http://www:technelysium.com.au) und GeneDoc (http://www:psc.edu/biomed/genedoc) analysiert. Die Ergebnisse wurden mittels Sequenzierung verifiziert, die mit dem Thermo Sequenase Primer Cycle Kit (Pharmacia, Freiburg) durchgeführt und dem A.L.F. DNA Sequenziergerät analysiert und mit dem A.L.F. Win Softwarepaket (Pharmacia, Freiburg) ausgewertet.

Gemäß dem vorliegenden Ausführungsbeispiel 1 konnten 24 Mikrosatellitenloci im bovinen und 23 im ovinen PrP-Gen identifiziert werden Aus den Resultaten, die in den 5 bis 7 und den Tabellen 3 bis 6 dargestellt sind, können folgende Schlüsse gezogen werden:

Anzazahl von Mikrosatellitenloci in genomischer DNA: Es wurden im Mittel 1 Mikrosatellitenlocus pro 0,9 kBp DNA innerhalb der codierenden Genbereiche und den flankierenden Regionen erhalten Diese Frequenz wurde auch für andere codierende Gene beobachtet und ist wesentlich großer als im Stand der Technik dokumentiert (vgL bspw Schlötterer 2000). Diese überrasehende Differenz kann daraus resukieren, daß im Stand der Technik die Informationen über Mikrosatellitenpositionen in DNA meist durch ein Screening von Bibliotheken genomischer DNA-Elemente mit Mikrosatellitenmotiven erhalten werden und daher die Anzahl von Repeatmotiven im Genom unterschätzt wurde.

Funktion von Mikrosatelliten in codierenden Genen: Wiederholte Motive innerhalb von Genen sind seit langem bekannt. Mikrosatellitenloci innerhalb von Exons deuten auf sich wiederholende Codons hin. Regulatorische DNA-Sequenzen können sogar ein Muster von Mikrosatelliten mit noch höherer Dichte aufweisen, da bspw. Response-Elemente oft wiederholte Nukleotide einschließen und Varianten bei der Genregulation funktionell bedeutsam werden (Wales et aL 1990, Tripathi und Brahmachari 1991, 1995). Bei einigen Mikrosatelliten wurde eine Beteiligung bei humanen genetischen Eben berichtet (O'Hara 2000, Nadir et al. 1996, Murata 2001) und gelegentlich verschlechterten sich die beobachteten Symptome mit einer Erhöhung der Anzahl von Wiederholungen (engl. "repeat expansion"). Christopher et al. (2000) beschreiben einen Fall von "repeat expansion" in einer transkribierten nicht codierenden Sequenz, die eine Dysfunktion der Genexpression hervorruft. Daher ist anzunehmen, daß die im PrP-Gen gefundenen Mikrosatellitenmotive für die Genexpression bedeutsam sind und die Varianten Loci anzeigen, die mit der Auslösung der PrP-Akkumulation in infizierten Zellen zusammenhängen.

Ewolutionsstabilität von Mikrosatellitenmotiven: Die hohe intragene Variabilität, die durch Mikrosatellitenloci hervorgerufen wird, kann die Evolution eukaryotischer Gene stimulieren. Es wunde festgestellt, daß Mikrosatelliten im PrP-Gen von Mensch und Maus stark unterschiedlich sind (Li et al. 1996). Überraschenderweise wurden in der vorliegenden Erfindung jedoch in den nah miteinander verwandten Spezies Rind und Schaf ähnliche Positionen der Mikrsatellitenloci gefunden, die trotz einer allelen Variabilität innerhalb der Spezies stabil waren. Diese Variabilität führt zu Genen, die bezüglich mehr als einem Locus polymorph sind ("Heteroallele", wodurch neue Allele durch intragene Rekombination erzeugt werden können. In diesen Fällen können Varianten von einzelnen Loci, die sich während der Evolution als erfolgreich erwiesen haben, rekombiniert werden, was dann neue funktionelle, möglicherweise überlegene Allele ergibt.

Zusammenhang zwischen Struktur und Polymorphismus von Mikrosatellitenloci: Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß Mikrosatelliten mit einer hohen Anzahl von Wiederholungen einen größeren Polymorphismus aufweisen, als diejenigen Loci mit weniger Wiederholungen. Beispielsweise waren nur 4 von 25 Mikrosatellitenloci mit 4 oder weniger Wiederholungen polymorph, im Vergleich zu 10 von 18 Mikrosatellitenloci mit 5 und mehr Wiederholungen Diese Erhöhung des Polymorphismus mit der Anzahl von Wiederholungen unterstreicht im Stand der Technik beschriebene Ergebnise (vgl. bspw Schlötterer 2000).

Allelverteilung. Es wurden Mikrosatellitensequenzen in genetisch unterschiedlichen Rassenvon Rind und Schaf untersucht, um soviele Allele wie möglich zu identifizieren. Bei 32 Rindern (aus 8 verschiedenen Rassen) wurden 8 polymorphe Loci (von 24 untersuchten Loci) identifiziert. Die Anzahl polymorpher Mikrosatellitenloci (6 von 23), die beim Schaf (33 Individuen aus 11 Rassen) gefunden wurden, war ähnlich der Anzahl beim Rind, allerdings wurden beim Schaf mehr Allele gefunden, die gleichnmäßig zwischen den Rassen verteilt waren Diese Ergebnisse korrespondieren mit ORF-Daten, bei denen nur eine Variante im Oktapeptid-Motiv und ein stiller SNP im bovinen PrP-ORF festgestellt wurde, während beim ovinen PrP-ORF 11 Aminosäuresubstitutionen bekannt sind. Die Variabilität des ORF- Polymorphismus ist jedoch selbst beim Schaf begrenzt, da die Aminosäuresubstitutionen der relevanten Codons (136, 154 und 171) nur in 5 verschiedenen Haplotypen auftreten Die in der vorliegenden Erfindung dargestellten Mikrosatellitenallele stellen im Vergleich dazu sehr viel mehr Haplotypea bereit und eignen sich daher hervorragend zur Typisierung einzelner Individuen bezüglich des PrP-Gens.

Verwendung von Mikrosatelliten-Markern in Verbindung mit ORF-Varianten: Beim Rind sind nur wenige polymorphe Stellen im PrP-Gen für dessen Typisierung verfügbar (Bunter 2000). Da keine informative Marker im PrP-Gen im Stand der Technik bekannt sind, konnte bisher keine detaillierte Untersuchung des Zuammenhangs zwischen BSE-Diposition und der Genvariabilität durchgeführt werden Die neuen Mikrosatellitenloci werden daher zur weiteren genetischen Untersuchung von BSE verwendbar sein, insbesondere sind sie zur Prädiagnostik bezüglich dieser Erkrankung verwendbar. Beim Schaf wurden 3 der polymorphen Mikrosatellitenloci zusammen mit den ORF-Varianten verwendet, um mehr als 600 Tiere verschiedener Rassen zu untersuchen, was im nachfolgenden Ausführungsbeispiel 3 beschrieben ist.

Zusammenfassend wurden im vorliegenden Ausführungsbeispiel 1 Mikrosatellitenloci innerhalb von Genen unter Verwendung von GenBank-Sequenzen des bovinen und ovinen PrP-Gens analysiert. Diese Vorgehensweise dient der Durchmusterung einer größeren Anzahl polymorpher DNA-Marker pro Gen. Diese Vorgehensweise wurde anhand des PrP-Gens durchgeführt, kann jedoch auf andere eukariotische Gene zwanglos überragen werden. Bei der Betrachtung von Mikrosatelliten mit mindestens 3 Wiederholungen, wurden 24 Loci im bovinen und 23 im ovinen PrP-Gen identifiziert. Etwa 30% der Loci waren innerhalb der Spezies polymorph. Von 32 Rindern aus 8 genetisch verschiedenen Rassen traten 4 polymorphe Mikrosatelliten in 2, 1 Mikrosatellit mit 3, 1 Mikrosatellit mit 4, 1 Mikrosatellit mit 6 Allelen und 1 Mikrosatellit mit 10 Allelen auf. Die Daten von 33 Schafen aus 11 genetisch verschiedenen Rassen zeigten einen Locus mit 2 Allelen, 2 Loci mit 3 Allelen und 3 Loci mit 4 und mehr Allelen Es wurde festgestellt, daß Mikrosatellitenloci mit mindestens 5 Wiederholungen einen höheren Polymorphiegrad aufweisen, als diejenigen mit 4 oder weniger Wiederholungen Beim Rind wurden 9 der 31 Allele nur in einer Rasse gefunden, beim Schaf waren es 2 von 22 Allelen. Häufigkeiten des vorherrschenden Allels von < 0,95 wurden bei 6 Mikrosatellitenloci im Rind sowie bei 6 Mikrosatellitenloci am Schaf beobachtet. In 35 von 41 Vergleichen ergab die Fragementlängenanalyse mit einem automatischen DNA Sequenziergerät eine um 1 bis 3 Nukleotide kürzere Länge als mit der Sequenzierung. Die Abweichungen der gemessenen molekularen Größe können mit Sekundärstrukturen erklärt werden, die durch Mikrosatellitenmotive gebadet werden, welche die elektrophoretische Mobilität des Fragments beeinflussen Allele DNA-Fragmente unterschieden sich nicht nur in den Mikrosatellitenloci sondern auch in deren flankierenden Bereichen. Im Mittel trat ein Mikrosatellitenlocus in 8 Genen von Rind und Schaf etwa alle 0,9 kBp auf, wobei in PrP-Exons die Dichte der Mikrosatellitenloci höher ist. Mikrosatellitenloci innerhalb von Genen können funktionell bei der Expression bedeutsam sein und können daher mit der PrP-Akkumulation in TSE-infizierten Zellen zusammenhängen Die intragene Variabilität, die durch Mikrosatellitenloci hervorgerufen wird, kann die Evolution eurokariotischer Gene stimulieren Die erfindungsgemäßen intragenen polymorphen Mikrosatellitenloci erlauben insbesondere den Einsatz in der Prädiagnostik.

Ausführungsbeispiel 2:

Die im Ausführungsbeispiel 1 dargelegten Verfahren wurden ebenfalls auf das humane PrP-Gen angewandt. Dabei wurden 12 Mikrosatellitenloci identifiziert, bei 5 davon trat bei 18 gesunden Personen mehr als 1 Allel auf (Tab. 71. Somit können auch beim Menschen polymorphe Mikrosatellitenloci zur Typisierung des PrP-Gens verwendet werden, um Allele aus denen sich eine TSE-Prädisposition des Trägen ergibt, zu diagnostizieren. Die Träger bestimmter Allele können dann beispielsweise ihre Lebensgewohnheiten, insbesondere Essgewohnheiten, auf die Prädisposition einstellen.

Ausführungsbeispiel 3:

Es wurden 3 der im Ausführungsbeispiel 1 gefundenen Mikrosatellitenloci im Bereich des Prionprotein codierenden Gens (PrP-Gen) auf Polymorphie in verschiedenen Schafrassen geprüft. Für die Untersuchung des Probenmaterials wurde das in 8 dargestellte erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt. Zusätzlich wurden die Beziehungen der Genotypen dieser Loci zu den in Voruntersuchungen ermittelten ORF-Genotypen analysiert. Dabei handelt es sich um die Ausprägung dreier variabler Positionen im Opean Reading Frame (ORF) des PrP-Gens, die in vielen Untersuchungen eine enge Beziehung zur Anfälligkeit für Scrapie gezeigt haben. Aus diesen ORF-Genotypen wurde von Dawson 1998 eine Venchlüsselung bezüglich des Erkrankungsrisikos abgeleitet.

Das erhobene Datenmaterial umfasste 8 Schafrassen mit 623 Tieren aus 47 Herden, für die Blutproben gesammelt worden waren. Bei 573 Schafen konnten alle 3 Mikrosatellitenloci eindeutig typisiert werden.

Materialien und Methoden

Tiere, Proben und Voruntersuchungen: In den Versuch wurden 623 Schafe aus acht verschiedenen Rassen und zwei Kreuzungsgruppen einbezogen (Tab. 8). Von allen Schafen waren Blutproben beschafft und aus diesen gDNA isoliert worden. Aus der gDNA waren für den ORF des PrP-Gens die Genotypen bestimmt worden (Tab. 8). Nach dem Ergebnis der ORF-Genotypisierung wurden die Schafe in Risikoklassen (Tab. 2) bezüglich der Erkrankungswahrscheinlichkeit für Scrapie eingeteilt.

Labormaterial: Für die Experimente wurden die nachfolgend aufgeführten Chemikalien oder Reagenzien bzw das nachfolgend aufgeführte Material eingesetzt:
Agarose, Sea Kem^® LF, FMC Bioprodukts, Rockland, Maryland, USA
Alconox, Aldrich, Deisenhofen
Ammoniumpersulfat (APS), Pharmacia, Freiburg
Ampicillin, Serva, Heidelberg
Bacto-agar, Difco, Detroit, USA
Bindesilan, Pharmacia, Freiburg
Borsäure, Merck, Darmstadt
Cellulose-Nitrat Filter SM 113 (Porengröße 0,45 μm), Sartorius, Göttingen
Desoxynukleotid Triphosphat (dNTP-Mix, PEQLAB, Erlangen
Dextranblau, Pharmacia, Freiburg
DNA-Längenstandard, Gene Ruler^TM 100 Bp DNA Ladder Plus, MBI Fermentas, St. Leon-Rotte
Essigsäure, Merck, Darmstadt
Ethanol, Merck, Darmstadt
Ethidiumbromid, Serva, Heidelberg
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Merck, Darmstadt
Ficoll 400TM, Pharmacia, Freiburg
Formamid, Sigma, Deisenhofen
H₂O (steril) ROTI^®SOLV HPLC Roth, Karlsruhe
Harnstoff, Gibco, Eggenstein
Hydrolink Long Ranger Gel Solution, Serva, Heidelberg
IPTG, Roth, Karlsruhe
Isopropanol, Roth, Karlsruhe
Kaliumchlorid, Merck, Darmstadt
Kimwipes, Kimberly-Clark, Koblenz
N,N,N',N',-tetramethylethylendiamed (TEMED), Serva, Heidelberg
Perfectly Blunt Cloning Kit für pT7Blue, Novagen, Schwalbach
Pipettenspitzen, Rotte, Karlsruhe
QIAquick Gel Extraction Kit and PCR Purification Kit, QIAGEN, Hilden
Reaktionsgefäße (0,2 ml), PEQLAB, Erlangen
(0,5 ml, 1,5 ml, 2 ml), Eppendorf, Hamburg
Sodiumdodecylsulfat (SDS), Sigma, Deisenhofen
Taq-DNA-Polymerase mit 10fach Reaktionspuffer und MgCl₂, Eppendorf, Hamburg
Terazakiplatten (MikroSample plate 60 wells), Pharmacia, Freiburg
Tetracycline, Serva, Heidelberg
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris), Merck, Darmstadt
Tryptone, Difco, Detroit
Yeast extract, Difco, Detroit
X-Gal, Roth, Karlsruhe

Für die Herstellung der folgenden Lösungen und Puffer wurde Aqua bidest. (hergestellt durch Ultrafiltration, < 16 MΩ⋅cm ) verwendet. Die Aufbewahrung erfolgte, wenn nicht anders angegeben, bei +4 °C.
APS-Stammlösung: 10 % (w/v) in H₂O gelöst; –20 °C
Bindesilan-Stammlösung: 40 ml Ethanol; 98%ig (v/v); 150 μl Bindesilan; RT
Bindesilan-Lösung: 800 μl Bindesilan-Stammlösung, 200 μl Essigsäure; 10%ig (v/v); RT
Hydrolinkgellösung (5%): 6 ml 50%iges Hydrolink 25,2 g Harnstoff; 3,6 ml 10 × TBE; ad 60 ml H₂O; 200 μl APS (10 %); 50 μl TEMED
Ladepuffer: 50 ml Formamid; 5 g Mischionenaustauscher, 6 mg/ml Dextranblau; 1ml EDTA (1M); pH 8,3; –20 °C
10 × TBE-Puffer: 1 M Tris-HCl 830 mM Borsäure; 10 mM EDTA; pH 8,2; RT
Stoppuffer: 250 mM EDTA; 10 % (w/v) Ficoll 400TM; 1 % (w/v) SDS; 0,05 % (w/v) Bromphenolblau
Ethidiumbromid Lösung: 500 μg Ethidiumbromid/ml H₂0 LB-Medium 10 g Trypton; 5 g Yeast Extrakt 5 g NaCl; 14 g Agar; ad 1 l H₂O; autoclaved
Ampicilin: 50 mg/m1 H₂O; –20 °C
IPTG: 0,2 M IPTG; –20 °C
Tetracyclin: 5 mg/ml Ethanol; –20 °C
X-gal: 10 % X-gal in Dimethylformamid; –20 °C

Als Geräte oder Vorrichtungen kamen zum Einsatz:
DNA-Sequenzierautomat: A.L.F. (Automated Laser Fluorescence) DNA-Sequenzer mit ALTWin und AlleleLinks Software, Pharmacia, Freiburg
Elektrophoresekammern: DNA-Sub-CellTM (15 × 15 cm), BioRad, München
Pipetten: Eppendorf „Research", Hamburg Gilson, „Pipetman", Villien-le-Bel, Frankreich
Reinstwasseranlage: Barnstead E-Pure, Barnstead, Dubuque, USA
Thermocycler: PTG-200 mit Gradientenfunktion, MJ Research, Watertown, USA
Zentrifugen: J6 B-Zentrifuge, Beckman, München;
Tischzentrifuge Biofuge A (Rotor 1386), Heraeus Sepatech, Osterode

Amplifikation der Mikrosatelliten durch PCR: In den eigenen Untersuchungen wurden PCR-Ansätze (Tab. 9), ein PCR-Programm (Tab. 10) und Primer (Tab. 11) benutzt, die in Vorarbeiten für die Loci etabliert worden waren.

Agarosegel-Elektrophorese von PCR-Produkten: Zur Herstellung der Agarosegele wurden 2 g Agarose und 100 ml 1×TAE-Puffer in der Mikrowelle bis zum Lösen der Agarose erhitzt, mit 20 μl Ethidiumbromid versetzt und in die Gelkammer gegossen. Der Slotformer wurde sofort danach eingesetzt. Ca. 30 min später wurde er entfernt und das Gel in die Elektrophoresekammer gelegt, welche mit 1×TAE Puffer gefüllt war. 5 μl PCR-Produkte wurden mit 2 μl Stopppuffer gemischt und in die Taschen pipettiert. Der Auftrennungsvorgang dauerte ca. 40 min. Danach wurde das Gel unter UV-Licht betrachtet. Das Ergebnis wurde durch Vergleich mit dem Macker abgelesen.

Fragmentlängen-Analyse mit dem A.L.F.-DNA-Sequenzierautomaten: Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte in 5%igen Hydrolinkgelen mit Hilfe des A.L.F.-Sequenzierautomaten. Die Steuerung der Elektrophoreseläufe wurde über das Programm "ALFWin Instrument Control", die anschließende Auswertung mit der Software "AlleleLinks" durchgeführt Der Sequenzierautomat besteht aus einer Elektrophorese- und einer Detektionseinheit. Diese enthielt einen Laser und 40 Photodioden, die über den einzelnen Gelspuren angeordnet sind Da die Vorwärtsprimer der PCR und damit auch die Amplifikate fluoreszenzmarkiert waren, wurden diese angeregt, wenn sie in Höhe des Lasen vorbei wanderten. Dies führte zu einem elektrischen Signal in den Photodioden, das digitalisiert und im angeschlossenen Computer gespeichert wurde. Die Berechnung der Fragmentlängen der einzelnen Allele erfolgte auf Basis der internen (99/198 Bp) bzw. externen (zusätzlich 80/160 Bp) Längenstandards, wobei das Programm AlleleLinks die Zeit Messwerte in Bp umrechnete und eine Darstellung der Fluoreszenzsignale als Pherogramm ermöglichte (9–11).

Bei der Herstellung der Hydrolink-Gele wurde nach den Angaben des A.L.F: Herstellers Pharmacia, Freiburg, verfahren. Nach einer Reinigung der Glasplatten mit dem fluoreszenzfreien Spülmittel Alconox, H₂O und 98%igem Ethanol mit anschließender Lufttrocknung wurde der obere Bereich mit Bindesilan bestrichen, um die Geltaschen zu befestigen. Danach wurden die Platten mit Abstandshaltern und Lichtkopplern zu einer Gelkammer zusammengebaut. Für die Gellösung wurden 60 ml filtrierte (Membran mit 0,45 μm-Poren) und entgaste (6 min) Long Ranger Hydrolink Gellösung mit 200 μl APS und 50 μl TEMED versetzt. Die gut gemischte Lösung wurde mithilfe einer 60-ml-Spritze luftblasenfrei zwischen die Glasplatten gegossen. Ein Kamm, der in die Gelkammer geschoben wurde, diente zum Ausformen der Geltaschen. Nach ca. 90 min war das Gel bei RT polymerisiert und konnte in den Sequenzierautomaten eingebaut werden. Nachdem das Gel 50 °C erreicht hatte, wurde der Kamm vorsichtig entfernt. Nach dem Einbau des Gels wurde 0,6 × TBE-Puffer in die Elektrodenbehälter gegeben und das Gel mit Probenmaterial beladen. Die Gele wurden dreimal verwendet und die Geltaschen zwischendurch mit TBE-Puffer ausgespült. Beim ersten Mal wurden präzisere Ergebnisse erzielt als bei den folgenden zwei Läufen

Zur Probenvorbereitung und -auftragung wurden in einer Terazakiplatte je nach PCR-Ausbeute 0,1–4 μl DNA mit 1 μl einer Mischung aus Längenstandards und Stopppuffer vermischt (Star wurde 1 μl DNA eingesetzt). Die Proben wurden dann für 2 min bei 80 °C denaturiert und anschließend auf Eis gestellt. Nach Auspülen der Geltaschen mit TBE-Puffer wurden die vorbereiteten Proben hineinpipettiert.

Die Laufbedingungen für die Elektrophorese wurden unter Verwendung der ALFWin Instrument Control Software eingegeben und sind in Tab. 12 aufgelistet.

Klonierung: Bei den Fragmentlängenanalysen traten beim Locus 524 unerwartete Fragmente auf. Um zu analysieren, ob im PCR-Produkt auch der DNA-Abschnitt des erwarteten Mikrosatelliten vorliegt, wurden einzelne Abschnitte der DNA-Moleküle sequenziert. Zu diesem Zweck erfolgte zuvor eine Klonierung mit dem "Perfectly Blunt Cloning Kit" in folgenden experimentellen Schritten:

– Herstellung der PCR-Produkte (Locus S24) der ausgewählten Tiere (ca. 10 ng in 100 μl Lösung).
– Reinigung der PCR-Produkte mit PCR-Purification-Kit um ca. 50 μl PCR-Produkt-Lösung zu erhalten.
– Prüfung der DNA-Produkte auf Agarosegel hinsichtlich ihrer Qualität (saubere Banden ohne Nebenprodukte) und Quantität.
– End-Convenion-Reaktion: Inkubation von 2 μl kondeasiertem PCR-Produkt als Template in 2 μl Wasser und 5 μl End-Conversion Mix. 30 min bei RT ruhen lassen. Inaktivierung der Mischung ca. 5 min bei 75 °C, Abkühlung 2 min auf Eis, abschließende Zentrifugation.
– Ligation in den Vektor: 1 μl pT7Blue Blunt Vektor und 1 μl T4 DNA-Ligase wurden eingesetzt, vorsichtig gemischt und danach 1-2 h inkubiert.
– Transformation in E. coli: 2 μl Mischung wurden in das aufgetaute "Nova Blue Single cells"-Aliquot pipettiert, danach vorsichtig gemischt und als Suspension 5 min auf Eis gelagert. Danach wurde die Suspension 35 s auf Wärmeblöcken mit einer Temperatur von 42 °C erwärmt und dann für 2 min auf Eis gelegt. 300 μl SOC-Medium wurden dazupipettiert und auf Agarplatten ausgestrichen. Die Platten wurden 24 h bei 38 °C im Wärmeschrank inkubiert.
– Selektion der rekombinanten Klone mittels Blue-White-Screening: Die Ligationsstelle des Vektors befand sich im LacZ-Gen, das in Gegenwart von IPTG eine Blaufärbung der Kolonie bewirkte. Beim Einbau rekombinanter DNA wurde die Gensequenz unterbrochen, und die betroffenen Kolonien blieben weiß. Diese weißen Kolonien wurden mit Pipettenspitzen gepickt und in 50 μl Wasser suspendiert. Die Pipettenspitzen wurden auf eine beschriftete Platte getupft, um jeweils eine Reservekolonie herzustellen.

Sequenzierung von DNA-Inserts der rekombinanten Vektormoleküle: Die Bakterienzell-Suspensionen wurden für 15 min auf 99 °C erhitzt, um die Bakterien abzutöten, danach zentrifugiert und gevortext. Dann erfolgte eine PCR bei der die DNA im Reaktionsprodukt als Matrize und die Primer T7 und U19 benutzt wurden (Tab. 13 bis 15).

Die PCR-Produkte wurden mit Hilfe der Agarosegelelektrophorese geprüft. Die Klone, deren PCR-Produkte die erwartete Länge aufwiesen, wurden mit dem fluoreszenzmarkierten Primerpaar für den Locus S24 (Tab. 11) amplifiziert und die Produkte auf dem A.L.F. dargestellt. Ein Klon, dessen Fragmentlänge mit der bei der Genotypisierung gemessenen Länge von 152 Bp übereinstimmte, wurde für die Sequenzierung ausgewählt.

Ein 100 μl-PCR-Ansatz wurde mit den Primern T7 und U19 hergestellt, um eine ausreichende Menge an Template für die Sequenzierreaktion zu bekommen. Die Länge und die Konzentration der PCR-Produkte wurde noch einmal auf einem Agarosegel geprüft. Es folgte die Aufreinigung der PCR-Produkte mit dem "PCR-Purification Kit". Danach wurden die Proben sequenziert.

Statistische Auswertung: Für die Frequenzanalyse der Mikrosatelliten und ORF-Daten wurde das Programmpaket BIOSYS-1, Version 17 (Swofford und Selander 1989) verwendet.

Für die Mikrosatellitenloci und PrP-Genloci wurden bei kodominantem Erbgang die Allelfrequenzen nach folgender Formel berechnet:

mit:
p_i: Frequenz des i-ten Allels,
A_iA_i, A_iA_j: Häufigkeit des Genotyps mit den Allelen i bzw. j,
i, j: Indizes der Allele,
k: Anzahl der Allele eines Locus,
N: Anzahl der untersuchten Individuen.

Die erwarteten Heterozygotiegrade einer Population für einen Locus mit k Allelen wurden mit Hilfe des unverzerrten Schätzen (unbiased estimate, NEI 1978) nach folgender Formel berechnet:

mit:
h_l: Erwarteter Heterozygotiegrad des Locus l,
p_i: Frequenz des i-ten Allels,
N: Zahl der untersuchten Individuen.

Abweichungen der Genotyphäufigkeiten vom Hardy-Weinberg-Gleichgewicht wurden mit dem gepoolten χ²-Test geprüft. Aufgrund geringer Beobachtungszahlen zu einzelnen Genotypen (N < 5) mit dem Problem der Signifikanzüberschätzung bei geringen Genotyperwartungswerten im χ²-Test werden im Poolverfahren drei Genotypenklassen (i, ii, iii) gebildet:

i Homozygote Genotypen mit dem häufigsten Allel,
ii alle heterozygoten Genotypen mit dem häufigsten Allel,
iii alle homo- und heterozygoten Genotypen ohne das häufigste Allel.

Multifaktorielles Varianzanalysemodell mit Berücksichtigung der 3 untersuchten Mikrosatellitenloci (Statistikpaket SAS, V 6.12, GLM-Prozedur)
Yijkl = μ + S11i + S24j + S15k + eijkl (Modell 1)
mit:
Y_ijkl: Merkmalwert (Risikoklasse für Scrapieerkrankung) des Tieres ijkl,
μ: Populationsdurchschnitt,
S11_i: fixer Effekt des i-ten S11-Genotyps,
S24_j: fixer Effekt des j-ten S24-Genotyps,
S15_k: fixer Effekt des k-ten S15-Genotyps,
e_ijkl: Restfehler.
(nachfolgend werden die zu den Allelen genannten Fragmentlängen ohne die Längeneinheit Bp angegeben).

Im Ausführungsbeispiel 3 wurden drei der im Ausführungsbeispiel 1 erhaltenen informativen polymorphen Mikrosatelliten, nämlich S11, S15 und S24, in Schafrassen Baden-Württembergs genauer analysiert und auf ihre Assoziation mit den drei für die Scrapie-Empfänglichkeit bedeutsämen ORF-Varianten hin untersucht.

Um für große Tierzahlen ein kostengünstiges Verfahren entwickeln zu können, wurde der PrP-Genbereich auf polymorphe Mikrosatellitenloci gescreent (vgl. 1. Auführungsbeispiel). Aus 6 geeigneten Mikrosatelliten wurde eine Auswahl von 3 gut zu amplifizierenden Loci getroffen, für die mit großer Wahrscheinlichkeit ein kodominanter Erbgang anzunehmen war. Es wurde der Polymophiegrad dieser Loci innerhalb von Schafrassen Baden-Württembergs untersucht, um auf der Grundlage einer Prüfung der Beziehungen zu den aus Voruntersuchungen ermittelten ORF-Genotypen und den daraus abgeleiteten Rissklassen mit Hilfe der gefundenen polymorphen Mikrosatellitenloci Aussagen über- die Scrapie-Erkrankungsanfälligkeit treffen zu können.

Bei der Analyse der Genotypen traten keine Nebenprodukte, keine Slippage-Effekte und keine bevorzugte Amplifikationen auf. Bis auf zwei Ausnahmen konnten alle Fragmentlängen eindeutig jeweils einem locusspezifischen Allel zugeordnet werden.

Die erste Ausnahme bildete die Fragmentlänge 146 beim Locus S24, die in insgesamt 6 Fällen bei den Rassen Schwarzkopf, Gotland und Suffolk auftrat. Die Eindeutigkeit der verschiedenen Fragmentlängen 146 und 147 wurde zum einen durch Wiederholung des PCR- Auftrag auf verschiedenen Gelen sicher gestellt, als auch durch Anordnung von Tieren mit Allel 146 und 147 in aufeinander folgenden Spuren eines Geles. Dabei könnte eine Fragmentlängendifferenz um den präzisen Wert 1, bei gleichzertiger interner Markerausrichtung nicht auf Spureffekte zurückgeführt werden. Ob es sich bei Fragment 146 um ein sehr seltenes zusätzliches Allel handelt, lässt sich nur durch Sequenzierung nachweisen Dieses könnte z. B. durch eine Deletion einer Base außerhalb des eigentlichen Mikrosatellitenbereichs aus dem Allel mit der Fragmentlänge 147 entstanden sein.

Die zweite Ausnahme betraf die Fragmentlänge 152, die bei 25 Merinoschafen beobachtet wurde. Dieses Allel trat niemals homozygot sondern nur in Kombination mit dem Allel 144, dem Allel 147 oder diesen beiden Allelen zusammen auf. In den 15 Fällen, in denen 3 Peaks gleichzeitig beobachtet wurden, hatten diese stets vergleichbare Amplituden. Durch Klonierung und anschließende Sequenzierung des Allels 152 wurde gezeigt, dass dieses hinsichtlich der Mikrosatellitensequenz mit dem Allel 147 identisch ist (12). Es unterscheidet sich jedoch durch einen 5 Bp langen, 5'-seitig vom Mikrosatelliten gelegenen Insert. Durch weitere Experimente sollte geprüft werden, welche Ursachen zum Auftreten von drei anscheinend "allelen" Fragmenten pro Tier geführt haben.

Die Informationsgehalte der 3 Mikrosatellitenloci zeigten für 4 der 8 betrachteten Rassen (Gotland, Suffolk, Milchschaf und Texel) mittlere Heterozygotiegrade > 0,35 (Tab. 19). Für die Rassen Dorper, Merinoland, Ile de France und Schwarzkopf lagen die Werte zwischen 0,16 und 0,23. Für die ORF-Loci lagen die Informationgehalte durchweg geringer und zeigten für die mittleren Heterozygotiegrade Werte zwischen 0,0 für Gotland und 0,29 für die Rasse Texel. Diese verhältnismässig geringen Informationsgehalte korrespondierten mit geringen Beobachtungszahlen von Tieren mit hohem Erkrankungsrisiko. Mit anderen Worten, Genotypen mit geringem Risiko haben sich in den Populationen durchgesetzt, ohne dass die mit hohem Risiko behafteten ganz verschwunden sind. Dies kann darauf zurückruführen sein, dass ungünstige PrP-Genotypen auch günstige Funktionen in der Entwicklung eines Tieres bewirken, z. B. Fruchtbarkeit oder Resistenz gegen andere Erreger.

Die Prüfung der Genotyphäufigkeiten auf Gleichgewichtssituation ergab beim χ²-Test nur für den Locus ORF3 und nur für die Rasse Merinoland eine signifikante Abweichung vom HWE mit der Irrtumswahrscheinlichkeit p < 0,05. Dabei kann die auffällige Überrepräsentation der homozygoten Tiere vermutlich mit durchschnittlich höherem Inzuchtkoeffizient erklärt werden, wobei jedoch zur Prüfung ausreichende Verwandtschaftsdaten nicht vorlagen.

Die varianzanalytischen Ergebnisse mit Modell 1 (Tab. 22) mit Berücksichtigung der 3 Mikrosatellitenloci als fixe Faktoren zeigten eine nahezu einheitliche Zuordnung positiver bzw. negativer Effekte zu einzelnen Genotypen in den verschiedenen getrennt untersuchten Schafrassen. Die Differenzen der geschätzten Mittelwerte zeigten jedoch bedeutsame Unterschiede. In allen 4 analysierten Rassen mit Tierzahlen > 60 übernahm der Locus S24 den höchsten Anteil an der erklärten Varianz mit Signifikanzlevel p < 0,001 (F-Test, Tab. 22). Dieser Locus zeigte einheitlich den Homozygottyp 144/144 mit geringerem Erkrankungsrisiko als den Homozygottyp 147/147 (Tab. 23). Die Unterscheidung dieser beiden Genotypen bezüglich des erwarteten Erkrankungsschlüsselwertes variierte von 0,5 in der Rasse Merino bis 2,8 in der Rasse Suffolk. Die bezüglich dieses Locus heterozygoten Tiere lagen in der Risikoeinschätzung jeweils annähernd in der Mitte zwischen den Homozygottypen. Der große Unterschied in der geschätzten Mittelwertsdifferenz war mit großer Wahrscheinlichkeit auf rassenspezifische ORF-Ausprägungen und auf unterschiedliche Assoziationsgrössen der Genotypen des Mikrosatellitenlocus zu diesem untersuchten Merkmal zurückzuführen.

Der Locus S11 zeigte in der Varianzanalyse nur in den Rassen Milchschaf und Texel einen bedeutsamen Einfluss auf das über ORF-Haplotypen konstruierte Merkmal mit ausgeprägter Risikoerhöhung für Tiere mit dem Allel 150 in der Rasse Texel. Dieses Allel war in der Rasse Milchschaf für eine Prüfung nicht ausreichend häufig vertreten, dagegen zeigte sich in dieser Rasse ein um den Schlüsselwert 1 höheres Risiko für Tiere mit dem Allel 156 gegenüber Tieren mit dem Allel 158 an diesem Locus.

Zu dem Locus S15 konnte nur in der Rasse Texel eine bedeutsame Risikoerhöhung für Tiere mit dem Allel 173 erkannt werden. Korrespondierend dazu war der Informationsgehalt zu diesem Locus in den Rassen Merinoland, Milchschaf und Suffolk sehr gering.

Aufgrund der hier festgestellten Assoziation zum gegebenen Risk-Code könnte eine Selektion von Schafen nach Mikrosatellitengenotypen mit den Ausprägungen 144/144 zu S24, 152/<156>, <150> zu S11 und 179/<173> zu S15 mit Aussicht auf Minimierung des Scrapieerkrankungsrisikos empfohlen werden (o gibt auszuschliessende Allele an). Diese Auswahl würde im vorliegenden Datenmaterial jedoch 47 ORF-Wildtypbeobachtungen (ARQ/ARQ mit Risk 4 einschließen Dies ist ein Indiz dafür, dass ein oder zwei weitere informative Mikrosatelliten zu einem Ausschlussverfahren auf genetischem Niveau beitragen sollten, wenn die Aussagefähigkeit einer Genotypkombination aus Mikrosatellitenloci ausschließlich auf der Basis der ORF-Risikoverschlüsselung geprüft wird.

Die Ergebnisse des Auführungsbeispiels 3 kennen demnach wie folgt zusammengefasst werden:
Die ORF-Genotypen zeigten in den Schafrassen nur geringe Informationsgehalte mit Werten zwischen 0,0 und 0,29 für die mittleren Heterozygotiegrade, was über die Rassen betrachtet einen Wert von 0,164 ergab. Dennoch konnten für das Gesamtmaterial 13 von insgesamt 15 in der Literatur angegebenen ORF-Genotypausprägungen gefunden werden, mit ca. 65% der Beobachtungen zu den Genotypen ARQ/ARQ (Wildtyp) und ARR/ARQ. Die seltene Ausprägung V (Valin) an Codon 136 mit hoher Scrapieerkrankungsanfälligkeit war in dieser Untersuchung nur mit einer Allelfrequenz von knapp 3% über die Rassen betrachtet vertreten.

Für die 3 untersuchten Mikrosatellitenloci konnten in den einzelnen Rassen mittlere Heterozygotiegrade von 0,16 bis 0,57 mit einem Mittelwert von 0,31 über die Rassen ermittelt werden, wobei der Locus S24 in allen Rassen außer Gotland den höchsten Informationsgehalt zeigte.

Die innerhalb ORF-Typisierung sortierten Mikrosatellitengenotypen zeigten in der Risikostufe 1 eine einheitliche Ausprägung mit der Genotypkombination 144/144, 152/152 und 179/179 für die Loci S24, S11 und S15. In den höheren Risikoklassen traten jeweils mehrere Genotypkombinationen auf. In diesen Klassen war eine diskrete Zuordnung bestimmter Mikrosatellitengenotypen zu den ORF-Genotypen nicht möglich, dennoch ließen sich eindeutige Häufungen bestimmter Allele in den Risikoabstufungen feststellen.

In der varianzanalytischen Prüfung der Assoziationen der Genotypen zu dem aus den ORF-Typen konstruierten Risikomerkmal konnten hoch signifikante Beziehungen festgestellt werden. In den Auswertungen zu den Rassen mit mehr als 60 Beobachtungen hatte der Locus S24 ausnahmslos den höchsten Anteil an der erklärten Varianz Die Schätzwerte wiesen den Homozygottyp 144/144 in jeder Rasse mit hochsignifikant geringerem Erkrankungsrisiko aus als den Typ 147/147, während die heterozygoten Tiere in den Schätzwerten dazwischen lagen.

Für eine hohe Präzisierung der Aussage zur Erkrankungsanfälligkeit für Scrapie wäre nach dem vorliegenden Ausführungsbeispiel die Einbeziehung weiterer informativer Mikrosatellitenloci sowie eine Assoziationsstudie mit erkrankten und nicht erkrankten Schafen wünschenswert.

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Abkürzungen

Im Rahmen der vorliegenden Patentanmeldung wurden die folgenden Abkürzungen verwendet:
A.L.F. Automated Laser Fluorescence (Sequenzierautomat)
APS Ammoniumpersulfat
BovB DNA-Repeat-Familie aus der Klasse SINE (Short Intenpersed Elements)
Bov-tA2/-tA3 DNA-Repeats aus der Familie BovA, Klasse SINE (Short Interspersed Elements)
Bp Basenpaare
BSE Bovine Spongiforme Enzephalopathie
CJD Creutzfeldt-Jakob-Krankheit
DNA Desoxyribonukleinsäure
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
gDNA genomische DNA
HWE Hardy-Weinberg-Equlibrium
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopysnosid
LacZ-Gen Gen der β-Galactosidase
mRNA Messenger-RNA
MS Mikrosatellit
ORF Open reading frame
PCR Polymerasekettenreaktion
PrP Prionprotein
PrP-Gen Prionprotein codierendes Gen
RNA Ribonukleinsäure
RT Raumtemperatur
Taq DNA-Polymerase von dem Bakterium Thermus aqaticus
TBE Puffer aus TRIS, Borsäure und EDTA
TEMED N,N,N',N',-Tetramethylethylendiamid
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
TSE Transmissible Spongiforme Enzephalopathie
UTR Untranslated Region Anhang Tab. 1: Aminosäure-Polymorphismen im PrP-Gen des Schafs (nach Hunter (2000), ergänzt)

Tab. 2: PrP-Genotypeneinteilung in Risikogruppen beim Schaf (Merkmal Risk; Dawson et al 1998)

Tab. 3A: Mikrosatellitenloci im bovinen PrP-Gen

Tab. 3B: Mikrosatellitenloci im ovinen PrP-Gen

Anmerkungen zu den Tabellen 4A und 4B:
^a R: GenBank-Referenz; bovine Motive werden für Loci ohne GenBank-Information beim Schaf verwendet (S01 bis S06); A, B, usw: gefundene Allele.
^b GenBank Zugriffsnummer
^c mit dem A.L.F.-Sequenziergerät ermittelte Fragmentlängen
^d aufgrund der Ergebnisse der DNA-Sequenzierung berechnete Fragmentlängen
^e (R): Mikrosatellitensequenz identisch mit GenBank
^f –: keine Sequenzdaten; k.D.: keine Differenz im Vergleich mit der DNA-Sequenz in GenBank; Del.: Deletion; Ins.: Insertion; SNP: Einzelnukleotidpolymorphismus; *: Es sind nicht alle Varianten angegeben oder zusätzliche Varianten sind nicht sicher
^g Die Rassen sind angegeben, falls ein Allel nur in einer Rasse gefunden wurde. Für einen Locus beträgt die Summe der Allele weniger als 2n Tiere, wenn nicht alle Proben eine spezifische PCR Amplifikation erlaubten. Tab. 5: Polymorphiewerte der untersuchten PrP-Mikrosatellitenloci

Tab. 8: Anzahl untersuchter Schafe und deren ORF-Genotypen

Tab. 9: PCR-Ansätze für die Loci S11, S24 und S15

Tab. 10: PCR-Programm für die Loci S11, S24 und S15

Tab. 11 Primer für die Loci S11, 524 und S15

Tab. 12: Laufbedingungen für die Elektrophorese

Tab. 13: PCR-Programm zur Sequenzierung der DNA-Inserts

Tab. 14: PCR-Ansatz zur Sequenzierung der DNA-Inserts

Tab. 15: Primer für die Sequenzierung der DNA-Inserts

Tab. 16: Fragmentlängen des Locus S24

Tab. 20: Beobachtete und erwartete Genotypfrequenzen zu den Mikrosatellitenloci der untersuchten Schafrassen mit Prüfung auf HWE

Tab. 20: Beobachtete und erwartete Genotypfrequenzen zu den Mikrosatellitenloci der untersuchten Schafrassen mit Prüfung auf HWE (Fortsetzung

Tab. 21: Beobachtete und erwartete Genotyphäufigkeiten zu den ORF-Loci der untersuchten Schafrassen mit Prüfung auf HWE

Tab. 21: Beobachtete und erwartete Genotyphäufigkeiten zu den ORF Loci der untersuchten Schafrassen mit Prüfung auf HWE (Fortsetzung)

Tab. 22: F-Werte, Signifikanzen und Bestimmtheitsmaße für Merkmal Risk zu 4 analsierten Rassen mit Beobachtungen > 60 (Auswertung gemäß Modell 1)

Tab. 23: Beziehungen zwischen Mikrsatellitenloci und dem Merkmal Risk (vgl. Tab. 2; Auswertung getrennt nach Rassen gemäß Modell 1)

Tab. 24: Beobachtungszahlen der Mikrosatellitenkombinationen innerhalb ORF-Typ

Claims

Verfahren zur Typisierung eines Gens, das einen oder mehrere polymorphe Mikrosatellitenloci aufweist, in einem Individuum, umfassend die Schritte: (a) Amplifizieren mindestens eines DNA-Bereichs des zu typisierenden Gens durch PCR mit entsprechend der Große des DNA-Bereichs ausgewählten Primern, wobei der DNA-Bereich mindestens einen polymorphen Mikrosatellitenlocus umfasst und als Matrize eine Probe des Individuums dient, enthaltend eine DNA, die mindestens einen Abschnitt des Gens mit dem/den polymorphen Mikrosatellitenlocus/loci umfasst, und (b) Ermitteln der Länge des Amplifikats/der Amplifikate von Schritt (a).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt (6) eine Elektrophorese der Amplifikate umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der DNA-Bereich eine Länge von etwa 50 bis etwa 500 Bp aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei vor Schritt (a) das Ermitteln des/der polymorphen Mikrosatellitenlocus/loci im zu typisierenden Gen durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Ermitteln des/der polymorphen Mikrosatellitenlocus/loci die Schritte: (A) Screenen des zu typisierenden Gens nach Mikrosatellitenloci, (B) Amplifizieren jeweils eines DNA-Bereichs durch PCR mit entsprechend der Große des DNA-Bereichs ausgewählten Primern, wobei der DNA Bereich den im Schritt (A) aufgefundenen Mikrosatellitenlocus enthält, pro aufgefundenen Mikrosatellitenlocus bei einer Mehrzahl von Individuen des das zu typisierende Gen enthaltenden Organismus, (C) Ermitteln der Länge des Amplifikats/der Amplifikate und/oder der Nukleotidsequenz des/der Mikrosatellitenlocus/loci in dem/den Amplifikat(en) von Schritt (B) bei jedem Individuum und (D) Ermitteln des oder der Mikrosatellitenlocus/loci, dessen bzw. deren Amplifikat(e) eine zwischen den Individuen unterschiedliche Länge aufweist/aufweisen oder dessen bzw. deren Nukleotidsequenz(en) zwischen den Individuen unterschiedlich ist/sind.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Schritt (C) eine Elektrophorese der Amplifikate umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei der DNA-Bereich eine Länge von etwa 50 bis etwa 500 Bp aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der/die polymorphe(n) Mikrosatellitenlocus/loci ein Sequenzmotiv aufweist/aufweisen, das mindestens 3 mal wiederholt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der/die polymorphe(n) Mikrosatellitenlocus/loci ein oder mehrere Sequenzmotive) aufweist/aufweisen, das/die aus der Gruppe, bestehend aus den Konsensussequenzen (ATA)₇, (GA)₇, (GT)₂₈, (AGG)₄, (AC)₅, (TTTGT)₅, (TA)₇, (TC)₇, (TAAA)₁₂, (ATTTT)₁₂, (TTTC)₁₈, (CA)₁₈, (CAGTT)₄, (AGC)₅, (GA)₅, (TTTGT)₄, (TCAGT)₄, (TTCAG)₄, (ACTGA)₃, (ACTGA)₄, (CA)₁₂, (ATC)₄, (T)₂₅, (TTG)₅, (T)₂₉, (CAA)₃, (TTCAG)₃, (AGTG)₄, (CAC)₅, (AAAACA)₄, (ACC)₄, (ATCAG)₅, (AC)₃, (CTG)₅, (GTT)₅, (T)₁₅, (CAA)₄ und (AC)₄, ausgewählt ist/sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei es sich um ein Gen von Mensch, Affe, Pferd, Schaf, Rind, Schwein, Ziege, Maus, Ratte, Kaninchen, Meerschweinchen, Hund, Katze oder Huhn handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das zu typisierende Gen aus der Gruppe, bestehend aus Genen, die mit einer Erkrankung assoziiert sind, und Genen die für Milchproteine, Homone oder Transkriptionsfaktoren kodieren, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Gen aus der Gruppe, bestehend aus PrP, CFTR, RYR1 und Genen, die mit Stoffwechselerkrankungen bei Mensch und Tier, assoziiert sind, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich um das PrP-Gen des Menschen handelt und das/die Sequenzmotiv(e) des/der polymorphe(n) Mikrosatellitenlocus/loci aus der Gruppe, bestehend aus den Konsensussequenzen (ATA)₇, (GA)₇, (GT)₂₈, (AGG)₄, (AC)₅, (TTTGT)₅, (TA)₇, (TC)₅, (TAAA)₁₂, (ATTTT)₁₂, (TTTC)₁₈ und (CA)₁₈, awgewählt ist/sind.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Konsensussequenz (ATA)₇, (GA)₇, (TAAA)₁₂, (ATTTT)₁₂ oder (CA)₁₈ ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der/die amplifizierte(n) DNA-Bereich(e) des PrP-Gens des Menschen die Nukleotide 3621 bis 3641, 25415 bis 25428, 39450 bis 39505, 50315 bis 50326, 58346 bis 58385, 72392 bis 72416, 78300 bis 78313, 92615 bis 92624, 108429 bis 108476, 116907 bis 116966, 125528 bis 125599 und/oder 147980 bis 148015 gemäß GenBank-Zugriffsnummer AL133396 umfasst umfassen.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der/die amplifizierte(n) DNA-Bereich(e) des PrP-Gens des Menschen die Nukleotide 3621 bis 3641, 25415 bis 25428, 108429 bis 108476, 116907 bis 116966 und/oder 147980 bis 148015 gemäß GenBank Zugriffsnummer AL133396 umfasst umfassen.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich um das PrP-Gen des Rindes handelt und das/die Sequenzmotive) des/der polymorphen Mikrosatellitenlocus/loci aus der Gruppe, bestehend aus den Konsensussequenzen (CAGTT)₄, (TC)₅, (AGC)₅, (GA)₅, (TTTGT)₄, (TCAGT)₄, (TTCAG)₄, (ACTGA)₃, (ACTGA)₄, (CA)₁₂, (ATC)₄, (T)₂₅, (TTG)₅, (T)₂₉, (CAA)₃, (TTCAG)₃, (AGTG)₄, (CAC)₅, (AAAACA)₄, (ACC)₄, (ATCAG)₅ und (AC)₃, ausgewählt ist/sind.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Konsensussequenz (AGC)₅, (TTTGT)₄, (CA)₁₂, (T)₂₅, (T)₂₉, (TTCAG)₃, (AAAACA)₄ oder (ATCAG)₅ ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der/die amplifizierte(n) DNA-Bereich(e) des PrP-Gens des Rindes die Nukleotide 444 bis 463, 4121 bis 4130, 7615 bis 7629, 19808 bis 19817, 25288 bis 25307, 30633 bis 30652, 32320 bis 32339, 37891 bis 37910, 39943 bis 39957, 44220 bis 44239, 44507 bis 44530, 46259 bis 46278, 48409 bis 48420, 50471 bis 50495, 53219 bis 53233, 54990 bis 55018, 60452 bis 60460, 62703 bis 62717, 64685 bis 64700, 66178 bis 66192, 68762 bis 68785, 68926 bis 68937, 72474 bis 72498 und/oder 74333 bis 74340 gemäß GenBank Zugriffsnummer AJ298878 umfasst/umfassen.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei der/die amplifizierte(n) DNA-Bereich(e) des PrP-Gens des Rindes die Nukleotide 7615 bis 7629, 25288 bis 25307, 44507 bis 44530, 50471 bis 50495, 54990 bis 55018, 62703 bis 62717, 68762 bis 68785 und/oder 72474 bis 72498 gemäß GenBank-Zugriffsnummer AJ298878 umfasst/umfassen.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich um das PrP-Gen des Schafs handelt und das/die Sequenzmotiv(e) des/der polymorphen Mikrosatellitenlocus/loci aus der Gruppe, bestehend aus den Konsensussequenzen (CAGTT)₄, (TC)₅, (AGC)₅, (GA)₅, (TTTGT)₄, (TCAGT)₄, (ACTGA)₃, (ACTGA)₄, (CA)₁₂, (CTG)5, (ATC)₄, (GTT)₅, (TTG)₅, (T)₁₅, (CAA)₄, (CAA)₄,(TTCAG)₃, (AGTG)₄, (CAC)₅, (ACC)₄ und (AC)₄, ausgewählt ist/sind.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Konsensussequenz (GA)₅, (TTTGT)₄, (CA)₁₂, (GTT)₅, (T)₁₅ oder (CAA)₄ ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der/die amplifizierte(n) DNA-Bereich(e) des PrP-Gens des Schafs die Nukleotide 301 bis 320, 590 bis 613,1033 bis 1047, 2477 bis 2496, 4651 bis 4662, 6627 bis 6641, 9433 bis 9447,11277 bis 11291,16748 bis 16756, 18100 bis 18119, 19372 bis 19386, 21383 bis 21398, 22853 bis 22867, 25422 bis 25433, 25580 bis 25591 und/oder 30168 bis 30175 gemäß GenBank Zugriffsnummer U67922 umfasst/umfassen.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei der/die amplifizierte(n) DNA-Bereich(e) des PrP-Gens des Schafs die Nukleotide 590 bis 613, 6627 bis 6641, 11277 bis 11291 und/oder 25422 bis 25433 gemäß GenBank-Zugriffsnummer U67922 umfasst/umfassen.
Verfahren zur Ermittlung von Mikrosatelliten-Markern für die Prädisposition einer Erkrankung, die mit einem Gen assoziiert ist, das einen oder mehrere polymorphe Mikrosatellitenloci aufweist, umfassend die Schritte: (i) Typisieren des Gens bei einer Mehrzahl von Individuen, von denen bekannt ist, dass sie die Erkrankung aufweisen oder nicht aufweisen, und/oder von denen anhand eines bekannten Markers bekannt ist, dass sie einen bestimmten Prädispositionsgrad für die Erkrankung aufweisen, durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, (ii) Bestimmten der Genotyphäufigkeiten für jeden polymorphen Mikrosatellitenlocus bei den erkrankten/nicht erkrankten bzw einen bestimmten Prädispositionsgrad aufweisenden Individuen und (iii) Auswählen des/der polymorphen Mikrosatellitenlocus/loci als Macker, bei dem/denen eine aufgrund der gemäß Schritt (ii) bestimmten Genotyphäufigkeiten die größte statistische Signifikanz für die Merkmale „krank"/„nicht krank" bzw für den bestimmten Prädispositionsgrad besteht.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei es sich um ein Gen von Mensch, Schaf, Rind, Schwein, Ziege, Maus, Ratte, Kaninchen oder Huhn handelt und das Typisieren im Schritt (i) gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 24 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, wobei das Gen aus der Gruppe, bestehend aus PrP, CFTR, RYR1 und Genen, die mit Stoffwechselerkrankungen bei Mensch und Tier, assoziiert sind, ausgewählt ist und das Typisieren in den Schritten (i) und (ii) gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 24 durchgeführt wird.
Verfahren zur Prädiagnostik einer Erkrankung, die mit einem Gen assoziiert ist, das einen oder mehrere polymorphe Mikrosatellitenloci aufweist, umfassend die Schritte: (1) Typisieren des Gens eines zu untersuchenden Individuums bezüglich eines oder mehrerer Mikrosatellitenlocus/loci, der/die ein Marker für den Prädispositionsgrad bezüglich der Erkrankung ist sind, durch das Verfahren nach einerm der Ansprüche 1 bis 24 und (2) Vergleichen des erhaltenen Genotyps mit der diesem Genotyp zugewiesenen Prädispositionsgrad bezüglich der Erkrankung.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei der Mikrosatelliten Macker durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 27 ermittelt wurde.
Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, wobei es sich um ein Gen von Mensch, Schaf, Rind, Schwein, Ziege, Maus, Ratte, Kaninchen oder Huhn handelt und das Typisieren im Schritt (1) gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 24 durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 28 bis 30, wobei das Gen aus der Gruppe, bestehend aus PrP, CFTR, RYR1 und Genen, die mit Stoffwechselerkrankungen bei Mensch und Tier, assoziiert sind, ausgewählt ist und das Typisieren im Schritt (1) gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 24 durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei es sich um das PrP-Gen des Menschen handelt und der/die polymorphe(n) Mikrosatellitenlocus/loci ein Sequenzmotiv aufweist/aufweisen, das aus der Gruppe, bestehend aus den Konsensussequenzen (ATA)₇, (GA)₇, (TAAA)₁₂, (ATTTT)₁₂, und (CA)₁₈, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei wobei es sich um das PrP-Gen des Rindes handelt und der/die polymorphe(n) Mikrosatellitenlocus/loci ein Sequenzmotiv aufweist/aufweisen, das aus der Gruppe, bestehend aus den Konsensussequenzen (AGC)₅, (TTTGT)₄, (CA)₁₂, (T)₂₅, (T)₂₉, (TTCAG)₃, (TTCAG)₃, (AAAACA)₄ und (ATCAG)₅, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei es sich um das PrP-Gen des Schafs handelt und der/die polymorphe(n) Mikrosatellitenlocus/loci ein Sequenzmotiv aufweist/aufweisen, das aus der Gruppe, bestehend aus den Konsensussequenzen (GA)₅, (TTTGT)₄, (CA)₁₂, (GTT)₅, (T)₁₅ und (CAA)₄, ausgewählt ist.
Verwendung von Mikrosatellitenloci zur Typisierung von Genen.
Verwendung von Mikrosatellitenloci zur Ermittlung von Markern in Genen, die mit einer Erkrankung assoziiert sind.
Verwendung von Mikrosatellitenloci zur Prädiagnostik von Genen, die mit einer Erkrankung assoziiert sind.