ES2257964B1 - Metodo de preservacion de crustaceos frente a la melanosis. - Google Patents
Metodo de preservacion de crustaceos frente a la melanosis. Download PDFInfo
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Abstract
Método de preservación de crustáceos frente a la melanosis. Método de preservar un crustáceo frente a la melanosis, que consiste en poner en contacto los crustáceos con una solución que contiene una cantidad adecuada de bacterias ácido lácticas y su posterior almacenaje bajo condiciones adecuadas. Uso de bacterias ácido lácticas como agentes inhibidores de la melanosis en crustáceos y los crustáceos tratados con bacterias ácido lácticas para su uso alimenticio.
Description
Método de preservación de crustáceos frente a la
melanosis.
La presente invención se refiere al uso de
bacterias ácido lácticas como agentes inhibidores de la melanosis.
Así como a un método de preservar un crustáceo frente a la
melanosis por el empleo de dichas bacterias y los crustáceos
tratados con éstas para su uso alimenticio.
La melanosis o ennegrecimiento de los
crustáceos, de las frutas y verduras y de los alimentos en general,
es un proceso enzimático inherente a la fisiología de los productos
del reino animal y vegetal, y como tal fenómeno se manifiesta
negativamente, a partir del momento en que el animal muere o cuando
la fruta o verdura se desprotege de su piel, se modifica su aspecto
al cabo de pocos minutos, apareciendo una tonalidad marrón para las
frutas y verduras y negra para el marisco (pardeamiento enzimático
o melanosis). El hecho es que ha ocurrido un proceso de oxidación
de los tejidos.
La melanosis en los crustáceos, se manifiesta
mediante la aparición de manchas oscuras, ennegrecimiento en el
cefalotórax y a lo largo de todo el cuerpo. Dicho ennegrecimiento
ocurre principalmente como consecuencia de la oxidación catalítica,
originada por la presencia del oxigeno del aire, con intervención de
enzimas del tipo fenol-oxidasa (PPO), que acelera
el proceso de oxidación de compuestos orgánicos tipo fenólico, como
la tirosina, aminoácido esencial del que forma parte el elevado
contenido proteínico del marisco, a o-quinonas las
cuales polimerizan espontáneamente para formar un residuo oscuro, de
alto peso molecular.
Varios métodos han sido desarrollados para
prevenir el ennegrecimiento, incluyendo el calor para la inhibición
de la PPO y varios tratamientos químicos tal como alterar el pH de
los alimentos. La inactivación por calor no es un método apropiado
para los alimentos frescos. Igualmente, bajando el pH por adición de
un ácido, como el ácido cítrico, ácido fosfórico como ha sido
descrito por Mc- Cord y Kilara en J. Food Science, 48:
1797-1483 (1983) puede conducir a los mismos
efectos.
La actividad del enzima es elevada en distintas
fases del crecimiento del tejido externo (esqueleto) de los
crustáceos y en la fase post modem. La utilización de
productos químicos como inhibidor de los procesos enzimáticos y no
enzimáticos de oxidación es hasta ahora el método más extendido
capaz de paliar el grave problema que tiene el sector marisquero a
la hora de controlar el "ennegrecimiento" de los
crustáceos.
El ácido bórico fue ampliamente utilizado,
aunque desde hace dos décadas se prohibió su uso por razones
sanitarias. Desde su prohibición, como agente conservador de
crustáceos frente a la melanosis y el deterioro del marisco, han
sido muchos los esfuerzos encaminados a encontrar alternativas de
compuestos químicos, no tóxicos, capaces de inhibir esta actividad
enzimática.
El empleo de los sulfitos en el tratamiento de
la melanosis fue descrito por Zawistowski et al., en Can.
Inst. Food Sci.Tech. J., (1987) 20(3):
162-165. Sin embargo su cantidad está limitada y
regulada dependiendo de la naturaleza del alimento, dado que su
ingestión, inhalación y el contacto con la piel, y en su manejo,
presentan riesgos potenciales para la salud.
La forma usual de aplicación de los sulfitos es
por espolvoreo, inmediatamente después de la captura de los
crustáceos para retardar la aparición de la melanosis. La
dosificación y homogeneidad del aditivo en las muestras es
problemática siendo difícil conseguir de forma manual a bordo. Son
muchos los ejemplos recogidos en la literatura científica de
utilización de sulfitos como inhibidores de melanosis en crustáceos
(Knowles, M.E. Chem. Ind. (London), (1971),
910-911; McWeeny, D.J., et al. J. Sci. Food
Agric., (1974) 25, 735- 746; Wedzicha, B.L. et al. Food
Chem., (1988) 27, 259-71) y así como de patentes
que los utilizan (ES 2.112.798, US 5.882.688, FR 2.696.077, EP
141.875, GB 2.222.509, etc.). No obstante, ninguno de estos métodos
ha resultado ser plenamente satisfactorios.
Labuza y cols. en Cereal Foods World, (1989)
34(4):353 describe el uso de proteasas especialmente ficina,
en el control enzimático en el pardeamiento de ciertos alimentos.
Este autor atribuye este efecto al ataque sobre la PPO de esta
proteasa.
La patente americana US 4.981.708 describe la
utilización de una proteasa libre como inhibidor del pardeamiento
de alimentos. En éste método, alimentos que son susceptibles de
pardeamiento, incluyendo por ejemplo, ciertos crustáceos, frutos,
vegetales, y bebidas, incluido jugos de frutos y vinos, son tratados
con extracto de una cantidad suficiente de
proteasa-libre inhibiendo la reacción de
pardeamiento. El extracto de la proteasa-libre que
se extrae del latex (ficus) es tan efectiva como el bisulfito
sódico.
Debido a que el fenómeno de la melanosis se
manifiesta a las pocas horas cuando no se tratan los crustáceos con
agentes antimelanósicos tradicionales, se ocasionan graves
problemas de tipo económico al sector pesquero y a los
comercializadores del marisco por la depreciación de su valor en el
mercado.
Es por tanto deseable contar con un tratamiento
de la melanosis o pardeamiento de alimentos y en especial de
crustáceos que minimice los problemas e inconvenientes de los
productos anteriores.
Los inventores sorprendentemente han encontrado
que las bacterias ácido lácticas (BAL) pueden ser empleadas como
agentes inhibidores de la melanosis en crustáceos. Por lo tanto, de
acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, ésta se
refiere un método de preservación de crustáceos frente a la
melanosis por su tratamiento con bacterias ácido lácticas.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente
invención, ésta se refiere al uso de bacterias ácido lácticas como
agentes inhibidores de la melanosis en crustáceos.
De acuerdo con una realización preferida las
bacterias ácido lácticas empleadas son de los géneros
Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc y
Pediococcus. Estas bacterias se han utilizado durante muchos
años, en fermentaciones, en las que forman parte de cultivos mixtos
naturales junto con otras bacterias, levaduras y mohos utilizadas
para la producción de diversos alimentos humanos o animales tales
como productos lácteos (quesos, mantequilla, yogurt, leches ácidas,
etc.), vegetales fermentados (encurtidos, aceitunas, etc.),
embutidos, panes ácidos, encurtidos y ensilados.
De acuerdo con una realización preferida, se
emplean como starters microbianos Lactobacillus helveticus,
Lactobacillus lactis, Carnobacterium piscícola,
Lactobacillus plantarun, y Pediococcus acidilacti.
Las bacterias ácido lácticas son bacterias
cocoides o bacilares inmóviles, de forma bacilar, o esférica,
unidas. En preparaciones para el microscopio aparecen aisladas o
formando cadenas de cocos o de bacilos. Los hábitat son muy
variados; flora normal de la superficie de material vegetal (frutas
y verduras), alimentos ricos en azúcares, leche y derivados.
Obtienen energía exclusivamente por fermentación de azúcares y
requieren una gran cantidad de factores nutritivos (aminoácido,
bases nitrogenadas, algunas vitaminas), teniendo unas posibilidades
anabólicas muy limitadas lo que contribuyen a reducir el
rendimiento de su crecimiento.
Toleran bien concentraciones relativamente altas
de ácidos y valores de pH más bajos que el resto de las bacterias
por lo que pueden desplazarlas de los hábitats que colonizan.
Incapaces de respirar por que no pueden
sintetizar compuestos porfirínicos, y, por tanto, formar una cadena
de trasporte de electrones. Carecen de ciclo de Krebs funcional y,
son incapaces de sintetizar ATP por respiración, lo que es un
reflejo de su incapacidad para sintetizar citocromos.
La catalasa (enzima que destruye el
H_{2}O_{2}.) necesita un grupo porfirínico y, por tanto, este
tipo de bacterias no tienen esta enzima, lo que permite la
identificación del grupo. La tolerancia al oxígeno puede conseguirse
por que acumulan gran cantidad de manganeso (Mn^{2+}) que actúa
como una superóxido dismutasa.
Todos estos organismos debido a la limitada
capacidad biosintética, tienen requerimientos nutricionales altos,
necesitando factores de crecimiento, vitaminas del grupo B,
aminoácidos. Como consecuencia, las BAL se cultivan en medios que
contienen peptona, extracto de levadura u otros hidrolizados de
materiales vegetales o animales, con un glúcido fermentable que
proporcione una fuente de energía.
El pequeño tamaño de las colonias es atribuible,
en primer lugar, a los bajos rendimientos de crecimiento debido a
su metabolismo fermentativo. Algunas especies pueden producir
colonias grandes cuando se cultivan en medios que contienen
sacarosa, como resultado de la síntesis masiva de polisacáridos
extracelulares como los dextranos y levanos, correspondiendo gran
parte del volumen de la colonia a estos azúcares. Otra
característica fisiológica distintiva de estas bacterias, es su
elevada tolerancia a los ácidos, consecuencia necesaria de su modo
de metabolismo. Aunque las bacterias cocoides del ácido láctico
pueden iniciar su crecimiento a pH neutros e incluso alcalinos, la
mayoría de las formas bacilares no pueden crecer en medios con pH
inicial menor a 6. El crecimiento de las BAL puede continuar hasta
que el pH ha bajado a 4.5 o incluso menor. La capacidad de las BAL
para producir y tolerar una concentración relativamente elevada de
ácido láctico tiene un gran valor selectivo, ya que les permite
eliminar la competencia de la mayoría de las otras bacterias, en
ambientes ricos en nutrientes. Como resultado de su extrema
especialización fisiológica, las BAL están confinadas a unos cuantos
ambientes naturales característicos. Algunas viven en asociación
con plantas y crecen a expensas de los nutrientes liberados tras la
muerte y descomposición de los tejidos vegetales.
S. Orla Jensen, en "Le clasication des
bacterias lactiques". Lait 4. pag 468-474,
señaló que las BAL podían dividirse en dos subgrupos bioquímicos,
que se distinguen por los productos formados a partir de la
glucosa. Los homofermentadores convierten la glucosa casi
cuantitativamente en ácido láctico, y los heterofermentadores la
convierten en una mezcla equimolecular de ácido láctico, etanol,
ácido acético y CO_{2}.
Los homofermentadores desamilan la glucosa por
la vía de Embden-Meyerhof. Sin embargo los
heterofermentadores no pueden utilizar esta ruta ya que carecen de
la enzima fructosa difosfato aldolasa, por lo tanto estos organismos
desamilan la glucosa por la vía de las pentosas fosfato.
Es conocido, que los ácidos orgánicos inhiben
las reacciones enzimáticas bajo ciertos rangos de pH. La
polifenoloxidasa como cualquier otra enzima tienes unos valores de
pH bajo los que actúa eficazmente, otros en los que cataliza con
menos eficiencia y, finalmente, en ciertos rangos la reacción es
prácticamente inexistente.
La tirosinasa (polifenoloxidasa) es conocida por
ser una enzima clave en la síntesis de melanina en plantas,
microorganismos y células mamarias, y por poseer cobre en su
estructura. Muchos compuestos como el ácido kójico y la arbutina,
son inhibidores de la tirosinasa.
Es conocido el papel de ciertos metabolitos
producidos por las BAL, por ejemplo:
(i) ácido láctico: puede ser sintetizado como
L(+), D(-), y bajo forma racémica. La forma D(-) no se metaboliza
por los humanos, por lo que no es recomendado su ingesta, sobre
todo en niños y en adolescentes. El ácido láctico, al igual que
otros ácidos orgánicos, producen a nivel de la membrana
citoplasmática de los microorganismos desajustes en el potencial de
membrana e inhibe los procesos de transporte.
(ii) peróxido de hidrógeno: las BAL no poseen
catalasas, por lo que no pueden desdoblar el peróxido de hidrógeno,
excretándolo al medio. Esta molécula es un fuerte oxidante,
produciendo oxidaciones en los lípidos y proteínas de la
membrana.
(iii) dióxido de carbono: es producido por las
BAL heterofermentativas, creando un ambiente anaerobio en el medio,
lo cual podría dañar a ciertas bacterias aerobias. También produce
descenso del pH a ambos lados de la membrana citoplasmática.
(iv) diacetilo: es en producto del metabolismo
del ácido cítrico, y es el responsable del sabor característico de
algunos alimentos como mantequillas y otros productos lácteos
fermentados siendo producido por ciertas bacterias de los géneros
Leuconostoc, Lactococcus, Pediococcus y
Lactobacillus. Dicha producción es inhibida cuando existen
hexosas metabolizables en el medio. Las bacterias Gram-, los hongos
y las levaduras son más sensibles que las Gram+ al diacetilo. AI
parecer su mecanismo de acción esta basado en interferencias en la
utilización del aminoácido arginina por parte de estos
microorganismos.
(v) reuterina: es producida por Lactobacillus
reuteri en un medio con una mezcla de glucosa y glicerol ó
gliceraldehido. Tiene un espectro antimicrobiano general afectando
a virus, hongos, protozoos y bacterias. Esta actividad se produce,
al inhibir la ribonucleótido reductasa.
En Enzyme and microbiological Technology, 1999,
pag 87-107, se indica que el medio empleado para el
crecimiento de las BAL es determinante para la cantidad de ácido
láctico que será producido.
Las BAL tienen la capacidad de soportar pH de 5
e inferiores, lo que les confiere una ventaja selectiva sobre
otras bacterias. La temperatura óptima de crecimiento está entre 20
y 45ºC. Muchas de ellas son consideradas beneficiosas para el
consumo humano, pero otras pueden llegar a ser tóxicas como algunos
streptococos. BAL tienen complejos requerimientos nutricionales,
por su limitada capacidad de sintetizar vitaminas del grupo B, y
aminoácidos.
Las BAL pueden usar los glúcidos fermentándolos
hasta un solo producto final (homofermentadores) o varios productos
finales (heterofermentadores). En los homofermentadores el producto
principal y casi único, es el ácido láctico, mientras que los
heterofermentadores sintetizan ácido láctico, etanol, dióxido de
carbono (CO_{2}), y acetatos. La cantidad de etanol y acetato
formado depende del potencial redox del medio. Todas las BAL
pueden usar la vía de las pentosas fosfatos, es decir llevar a cabo
una heterofermentación, excepto lactobacilos del tipo I
como por ejemplo Lactobacillus delbrueckii. Una mezcla de
ácidos se produce por homofermentadores como los lactococos,
cuando disminuye la concentración de glucosa en el medio, y durante
el crecimiento en otros azúcares como Lactobacilus lactis en
maltosa, lactosa y galactosa, o cuando aumenta el pH y disminuye la
temperatura.
Por ejemplo, Lactobacilus amylophilus
crece a 15ºC y 45ºC, pero la mayor producción la lleva a 25 y 37ºC.
Para Lactobacilus casei y Lactobacilus paracasei
entre 37 y 44ºC, lo cual es contradictorio, ya que estas bacterias
crecen a 15ºC y no a 45ºC. Lactobacilus lactis y
Lactobacilus rhamnosus exhibieron las mayores
productividades a 33-35ºC y a
41-45ºC.
Dada la competencia que las BAL pueden ejercer
con bacterias del género Pseudomonas, Proteus,
Flavobacterium, Enterobacter, Shewanella etc.
estas bacterias serian desplazadas del medio por las condiciones
tan extremas en las que pueden vivir las bacterias lácticas.
Ciertas aminas se forman en el marisco después
de su captura, aún conservando a bajas temperaturas, debido a que
bacterias de los géneros anteriormente mencionados, producen la
descarboxilación de aminoácidos libres. La formación de aminas como
la histamina, putrescina y cadaverina, es paralela al crecimiento
de estos microorganismos, produciendo malos olores, basificación
del medio y produciendo en algunos consumidores reacciones
alérgicas.
De acuerdo con un tercer aspecto de la presente
invención, ésta se refiere al uso de bacterias ácido lácticas en la
eliminación de otras bacterias que producen la formación de
ciertas aminas biogénicas, no deseables en crustáceos.
\newpage
De acuerdo con un cuarto aspecto de la
invención, ésta se refiere a los crustáceos tratados con starters
microbianos consistentes en BAL.
De acuerdo con una realización de la presente
invención, el uso de bacterias ácido lácticas como Lactobacillus
helveticus, Lactobacillus lactis, Carnobacterium
piscicola, Lactobacillus plantarun, y Pediococcus
acidllacti, produce la inhibición de manera drástica de la
aparición de la melanosis en los crustáceos,
post-mortem, una vez tratados por
inmersión.
Otros aspectos y ventajas del tratamiento por
inmersión de los crustáceos con soluciones de bacterias ácido
lácticas son:
- (i)
- distribución homogénea del agente antimelanósico en los crustáceos por inmersión en la solución que contiene las BAL.
- (ii)
- el método de la inmersión en la disolución establece el control de la concentración efectiva del agente antimelanósico beneficioso en la parte comestibles de los crustáceos.
- (iii)
- una vez que se instalan las bacterias ácido lácticas en los crustáceos, su acción sobre el enzima (PPO-Cu), sustrato proteínico, etc., perdura una vez que cesa el proceso de tratamiento por inmersión de los crustáceos.
Una vez que los crustáceos se sacan del
contenedor que contiene la solución de bacterias ácido lácticas,
las propiedades organolépticas (el aspecto, presencia, color,
sabor) prácticamente no se alteran, lo que proporciona notables
ventajas sobre los métodos tradicionales de espolvoreo de los
sulfitos, (productos agresivos) los cuales permanecen en contacto
con los crustáceos durante semanas, meses, provocando decoloración
del esqueleto externo, sequedad, mal sabor etc.,
De acuerdo con una realización preferida, la
concentración de bacterias ácido lácticas empleada está entre
aproximadamente 80 UFC/ml y 140 UFC/ml. De modo más preferido,
entre 100 UFC/ml y 110 UFC/ml, siendo aún más preferido entre 106
UFC/ml y 108 UFC/ml.
Los medios de cultivo adecuados para la
realización del método de acuerdo con la presente invención, son
aquellos medios selectivos de bacterias lácticas, en el cual las
bacterias crecen satisfactoriamente. Entre los medios más adecuados
se encuentran:
- Medio Esencial Mínimo (MEM): Cloruro sódico (NaCl) (0.7%) y D(+) glucosa (2%), peptona (5%), sulfato de magnesio heptahidratado (0,005%). pH inicial entre 6-6.3.
- Medio Pobre (MP): Cloruro sódico (NaCl) (0.7%) y D(+) glucosa (5%), pH inicial entre 6 y 6.5.
- Medio MRS: caldo citrato diamónico comercia; extracto de carne en polvo, extracto de levadura, D(+) Glucosa, sulfato magnésico, sulfato de manganeso (II), peptona bacteriológica, fosfato dipotasio, acetato sódico, y tween 80. Este medio tiene un pH inicial de 6,2 aproximadamente.
De acuerdo con una realización preferida de la
presente invención, se emplea como caldo de cultivo un medio
seleccionado entre Medio Esencial Mínimo, Medio Pobre, MRS y el
medio de cultivo sintetizado por ellas mismas, utilizando glucosa
como solución nutritiva. En una realización más preferida el medio
de cultivo es Medio Pobre.
De acuerdo con una realización preferida, el
tiempo establecido de inmersión de los crustáceos en la solución de
bacterias ácido lácticas es de entre 5 y 120 minutos. En una
realización más preferida el tiempo de inmersión es de entre 10 y 60
minutos. Según una realización aún más preferida el tiempo de
inmersión es de entre 15 y 45 minutos, siendo especialmente
preferido un tiempo de inmersión de aproximadamente 30 minutos.
De acuerdo con una realización preferida, la
temperatura a la que se lleva a cabo el tratamiento de los
crustáceos está comprendida entre 0ºC y 35ºC. De acuerdo con una
realización más preferida, la temperatura de tratamiento es de
3ºC.
Una vez tratados los crustáceos en las
condiciones fijadas, los crustáceos se refrigeran para
posteriormente ser distribuidos para su consumo en fresco, o bien
se congelan si su consumo se dilata en el tiempo. La suspensión
microscópica de las bacterias ácido lácticas en el medio de cultivo
es apta para repetir varios ciclos de tratamiento de los crustáceos
por inmersión. Esta forma de proceder se puede extrapolar
indefinidamente siempre que se mantenga prácticamente la
concentración de las bacterias ácido lácticas para que no se
resienta el proceso de melanización y la calidad de los crustáceos.
La posibilidad de realización de estos ciclos de tratamiento por
inmersión, hace que el proceso de utilización de la las bacterias
ácido lácticas como inhibidor de melanosis sea tecnológicamente
rentable.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Las descripciones en el resumen de esta
solicitud se incorporan aquí como referencia. Para los expertos en
la materia, otros objetos, ventajas y características de la
invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de
la práctica de la invención.
Fig. 1 Representación de la actividad enzimática
de la enzima Polifenol Oxidasa de Parapenaeus longirostis,
mediante diferentes curvas de absorbancia (A) y pH en función del
tiempo (t).
Se observa en la gráfica que a medida que el pH
del medio es más ácido la absorbancia es menor y por consiguiente
se desarrolla menos color, que es el objetivo que se persigue con
la producción de ácido láctico producido por las bacterias
lácticas, en nuestro caso Lactobacilus helveticus.
Fig. 2. Se representa comparativamente el
porcentaje de actividad de inhibición de la PPO del crustáceo
Parapenaeus longirostris, a la que no se le efectúa ningún
tratamiento (barra con rayas inclinadas), frente a muestras tratadas
con las bacterias Lactobacillus lactis (I),
Carnobacterium piscicola (II), Lactobacillus
plantarum (III), Lactobacillus helveticus (IV) y
Pediococus acidilactici (V), en medios en medio pobre
(barra con cuadrícula) y en medio esencial mínimo (barra con rayas
horizontales).
Fig. 3. Representación gráfica de la medida de
la absorbancia (A) frente al tiempo (t) de la velocidad de
aparición de Dopacromo.
Los siguientes modos de realización se
proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean
limitativos de la presente invención.
Ejemplo
1
Uno de los factores esenciales de actuación de
las BAL es la competencia con otras bacterias que aceleran el
proceso de melanosis. Para el estudio microbiológico se utiliza el
sistema de tiras API, el cual es un sistema de identificación
estandarizado, que utiliza distintos tests bioquímicos
miniaturizados y una base de datos. Consta de diez microtubos que
contienen sustratos deshidratados. Estos test se inoculan con una
suspensión bacteriana, que reconstituye los medios. Durante la
incubación, se producen cambios de color espontáneo o revelado por
adición de reactivos.
Después de una incubación de
18-24 horas a 35-37ºC, la lectura de
reacciones se visualiza contrastando lista de perfiles, o con un
software de identificación.
La extracción de la flora bacteriana del marisco
se realizó, usando agua de peptona tamponada, esterilizada en
autoclave 121ºC durante 20 minutos, con un 0.01% de Tritón
X-100 en un agitador magnético, a 37ºC durante 12
horas. En ese tiempo las bacterias se despegan de su huésped, y
pasan a la solución de agua peptonada. A continuación, se procedió
al aislamiento de las cepas que habitan en el medio líquido,
pasando a utilizar un medio sólido, general, no específico, donde
cualquier bacteria, puede crecer. Este medio es el TSA (Triptona
Soja Agar). Se realizaron en placas de petri, siembras "por
agotamiento", con triplicado, se incubaron a 37ºC durante 24
horas. Al día siguiente se pudo observar como han crecido en las
placas decenas de colonias, en la mayoría de los casos entre 3 y 4
colonias distintas, por lo que cabe de esperar que en el marisco de
forma natural en descomposición, estén instaladas predominantemente
este mismo número de bacterias.
Los crustáceos, una vez capturados, y después de
quince días de almacenamiento en frigorífico a la temperatura de
0-5ºC no presenta melanosis y durante un tiempo
indefinido (de 1 a 10 meses) a la temperatura de -18ºC, cuando
fueron tratados con starters microbianos como Lactobacillus
helveticus, Lactobacillus Lactis, Carnobacterium
piscicola, Lactobacillus plantarun, y Pediococcus
acidilacti.
Ejemplo
2
Los estudios se basan todos ellos en el
crustáceo Parapenaeus longirostris, conocido como "gamba
blanca de Huelva". Este artrópodo tiene cutícula y apariencia
con tonalidades claras, por lo que los efectos de la melanosis será
más acusada. Los ejemplares siempre fueron frescos y sin tratamiento
químico, ni otro de cualquier naturaleza anterior a nuestros
ensayos.
Se encargaron al Centro Español de Cultivos Tipo
las bacterias Lactobacillus helveticus, CECT 4305 T. Estas
cepas se presentan liofilizadas en pequeñas ampollas, a las que se
le añadió 0,3 mililitros del medio MRS, y resuspendió con pipeta
Pasteur, y se inocularon con 200 ml del mismo medio contenido en
matraz aforado. Este caldo se incubó durante 24 horas a 37ºC, y al
cabo de este tiempo, se obtuvieron concentraciones de
Lactobacillus helveticus de 100 a 1000 millones de células
por mililitro en un medio que alcanza un pH entre 4,20 y 4, 50.
Se tomaron muestras de cefalotorax, lugar donde
la enzima es más abundante, se pesó el extracto del tejido tomado y
se procedió a su homogenización con nitrógeno líquido y con 3
mililitros de los distintos tampones utilizados. Se centrifugó a
13240 gs durante 30 minutos y se desechó el precipitado, separando
la fase soluble donde se encuentra la enzima. A continuación se
preparó una solución de tripsina al 5% en agua destilada, y una
solución de DL- Dopa 25 mM en tampón fosfato pH 6,5.
Se midió la absorbancia producida en el
espectrofotómetro a la longitud de onda (\lambda de 390
manómetros), cada 2 minutos, durante 20 minutos, de máxima
actividad de la PPO. Los resultados se recogen en la Tabla 1.
| pH=4 | pH= 5 | pH=6 | |||
| Tiempo | Absorbancia | Tiempo | Absorbancia | Tiempo | Absorbancia |
| 0 | 0,000 | 0 | 0,005 | 0 | 0,007 |
| 2 | 0,000 | 2 | 0,015 | 2 | 0,022 |
| 4 | 0,000 | 4 | 0,023 | 4 | 0,038 |
| 6 | 0,000 | 6 | 0,031 | 6 | 0,057 |
| 8 | 0,000 | 8 | 0,039 | 8 | 0,073 |
| pH=7 | pH=8 | pH=9 | |||
| Tiempo | Absorbancia | Tiempo | Absorbancia | Tiempo | Absorbancia |
| 0 | 0,021 | 0 | 0,022 | 0 | 0,051 |
| 2 | 0,044 | 2 | 0,042 | 2 | 0,091 |
| 4 | 0,066 | 4 | 0,061 | 4 | 0,145 |
| 6 | 0,086 | 6 | 0,084 | 6 | 0,206 |
| 8 | 0,108 | 8 | 0,106 | 8 | 0,269 |
Se observó que a partir de los 8 minutos la
reacción enzimática dejaba de ser lineal. El estudio de esta zona,
en la que la reacción de formación de producto con respecto al
tiempo es lineal nos permite calcular la pendiente de la recta que
representa la cinética de la reacción, y que nos sirve para
cuantificar la actividad enzimática.
- 1.
- pH= 4. No existe reacción. La pendiente es igual a 0.
- 2.
- pH= 5. Y = 0.0042x + 0.058.
- 3.
- pH= 6. Y = 0.0084x + 0.011.
- 4.
- pH= 7. Y= 0.0108x + 0.0002.
- 5.
- pH= 8. Y= 0.0106x + 0.001.
- 6.
- pH= 9. Y= 0.0276x + 0.089.
Aplicando la ecuación de la Actividad Enzimática
Específica:
Act. \ Enz. \
Esp. = \frac{Abs. \cdot Vol. \ Tampón \ extracción \ (ml)}{Vol. \
muestra \ (ml) \cdot (min) \cdot peso \ fresco} \ e^{-1} \ \cdot \
d^{-1}
e = coeficiente de extinción molar
3600 M^{-1} \cdot
cm^{-1}
d = camino óptico = 1
cm
obtenemos los siguientes resultados:
Para pH 4, no existe actividad enzimática.
Para pH 5, tenemos una actividad enzimática
específica de 3,80 x 10 elevado a la menos 6 micromoles/min x gramo
peso fresco.
Para pH 6, 7,60 x 10 elevado a menos 6
micromoles/min x gramo peso fresco
Para pH 7, 9,76 x 10 elevado a menos 6
micromoles/min x gramo peso fresco
Para pH 8, 9,58 x 10 elevado a la menos 6
micromoles/min x gramo peso fresco.
Para pH=9, 24,95 x 10 elevado a la menos 6
micromoles/min x gramo peso fresco.
Para el desarrollo de la actividad enzimática
"in situ" se utilizaron los siguientes tampones:
Para pH de 4 y 5 usamos el sistema tamponado
acético/acetato.
Para pH de 6 y 7 usamos el sistema tamponado
fosfato potásico monobásico/fosfato potásico dibásico.
Para pH de 8 y 9 usamos el sistema tamponado con
Tris.
Todos los medios se emplean a la concentración
de 0,1 molar.
Si representamos los datos obtenidos veremos
como existe una zona lineal en la que la variación de la
absorbancia es prácticamente constante, es en esta zona donde
calculamos la pendiente y con ella la actividad específica de la
PPO, aplicando la ecuación de la Actividad Enzimática
Específica.
La actividad de la fenoloxidasa (PPO) se expresa
como moles de DL-DOPA transformados por minuto y
por mg a 475 nm, a diferentes pH y a temperatura ambiente en las
condiciones descritas. La oxidación de la DOPA a DOPACROMO,
catalizada por la PPO conlleva un apreciable cambio de color que es
lo que medimos en el espectrofotómetro a 475 nm.
De una muestra de cabeza de gamba se obtuvo el
extracto, el cual fue incubado con tripsina 1% durante 15 minutos
en agitación y se midió a lo largo del tiempo la variación de
absorbancia a 475 nm frente a DL-DOP.
Los valores presentados en la Tabla 2 son la
media de 3 ensayos \pm la desviación estándar (SD), los cuales
representamos gráficamente y obtenemos la actividad enzimática
específica de la zona lineal de la Figura 3
| Tiempo (minutos) | Absorbancia | Tiempo (minutos) | Absorbancia |
| 0 | 0,000\pm0.000 | 12 | 0,522\pm0.021 |
| 2 | 0,160\pm0.053 | 14 | 0,538\pm0.031 |
| 4 | 0,274\pm0.044 | 16 | 0,576\pm0.045 |
| 6 | 0,340\pm0.036 | 18 | 0,611\pm0.050 |
| 8 | 0,399\pm0.022 | 20 | 0,633\pm0.038 |
| 10 | 0,467\pm0.024 | 22 | 0,655\pm0.035 |
zona lineal en la que la variación de la
absorbancia es prácticamente constante, es en esta zona donde
calculamos la pendiente y con ella la actividad específica de la
PPO, aplicando la siguiente fórmula:
Pendiente de la recta=0.0339,
R2=0,994
Actividad \
\text{específica}=30,65 \ x \ 10^{-6} \ \mu
moles.min-1.mg-1
Se ensayaron medios de cultivo diferentes,
selectivos de bacterias lácticas, en el cual las bacterias crecen
satisfactoriamente tales como Medio Esencial Mínimo (MEM), Medio
MRS y Medio Pobre (MP).
Cuando se incubaron estos microorganismos a
37ºC, en estos medios, al cabo de 24 horas se obtuvieron
concentraciones entre 100 y 1.000 millones de bacterias por
mililitro de medio, siendo el nuevo pH entre 3.5 y 4.0, de lo que
se deduce que el metabolismo bacteriano ha sido el que ha generado
esa bajada drástica de pH.
Tanto MEM como MRS, proporcionaron medios
adecuados para el desarrollo del cultivo, sin embargo el medio MP
es el que otorgó una mayor inhibición enzimática y ausencia de
ennegrecimiento del marisco, y con propiedades organolépticas de
los crustáceos excelentes.
Se tomó una solución salina de cloruro sódico
0,7% y D(+) glucosa (2%), peptona (5%), sulfato de magnesio
heptahidratado (0,005%), pH inicial 6.2. y se inoculó con bacterias
ácido lácticas de Lactobacillus helveticus y se incubaron a
37ºC, observándose un crecimiento lento de dichas bacterias. A las
76 horas la disolución presentó concentraciones deseadas para
nuestro ensayo, concretamente de 10 a 100 millones de bacterias por
mililitro de medio. El pH inicial del medio era de 5,82, mientras
que a las 76 horas de incubación de las bacterias el pH es de 3.3,
en todos los ensayos. El medio es inodoro e incoloro, no
apreciándose mal sabor. El marisco se trató a temperaturas de
refrigeración, concretamente a 3ºC, a diferentes tiempos de
residencia; 10, 20, 30, 60 y 120 minutos por inmersión en el medio
bacteriogénico descrito. Una vez extraído los crustáceos de la
disolución se procede a repetir ciclos de inmersión hasta cinco
veces consecutivas. A continuación se procedió a estudiar la
evolución de la melanosis, observando que a las 24 horas el marisco
tratado permanece inalterado, a temperatura ambiente
18-20ºC, mientras que en el marisco control
(marisco sin ningún tratamiento) ya se observan principios de
melanosis en cabeza e incluso en las patas. Después de 12 días de
permanecer los crustáceos en el refrigerador a
3-5ºC no se apreció aparición de melanosis. La
Figura 3 representa el tanto por ciento de inhibición de las
bacterias ensayadas en diferentes medios de cultivo como Medio
Pobre (MP) y Medio Esencial Mínimo (MEM).
Claims (17)
1. Un método de preservar un crustáceo frente a
la melanosis, caracterizado porque comprende los pasos de
poner en contacto los crustáceos con una solución que contiene una
cantidad adecuada de bacterias ácido lácticas y su posterior
almacenaje bajo condiciones adecuadas.
2. El método de acuerdo con la reivindicación
anterior, caracterizado porque las bacterias empleadas son
de los géneros Lactobacillus, Lactococcus,
Leuconostoc y Pediococcus.
3. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 2, caracterizado porque las
bacterias son del tipo Lactobacillus helveticus,
Lactobacillus lactis, Crnobacterium piscícola,
Lactobacillus plantarun, y Pediococcus acidilacti.
4. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 3, caracterizado porque las
bacterias se suspenden en un medio de cultivo adecuado.
5. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 4, caracterizado porque
dicho medio de cultivo se selecciona entre medio esencial mínimo
(MEM), medio pobre (MP), medio MRS y el medio de cultivo sintetizado
por ellas mismas, utilizando glucosa como solución nutritiva.
6. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 5, caracterizado porque
dicho medio de cultivo es el medio pobre (MP).
7. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 6, caracterizado porque la
concentración de bacterias ácido lácticas es de entre 80 UFC/ml y
140 UFC/ml.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 7, caracterizado porque la
concentración de bacterias ácido lácticas es de entre 100 UFC/ml y
110 UFC/ml.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 8, caracterizado porque la
concentración de bacterias ácido lácticas es de entre 106 UFC/ml y
108 UFC/ml
10. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 9, caracterizado porque el
tiempo de inmersión es de entre 5 y 120 minutos.
11. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 10, caracterizado porque el
tiempo de inmersión es de entre 10 y 60 minutos.
12. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 11, caracterizado porque los
crustáceos son tratados a la temperatura de entre 0ºC y 35ºC.
13. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 1 a 12, caracterizado porque los
crustáceos son tratados a la temperatura de 3ºC.
14. Uso de bacterias ácido lácticas (BAL) como
agentes inhibidores de la melanosis de crustáceos.
15. El uso de acuerdo con la reivindicación
anterior caracterizado porque las bacterias empleadas son
de los géneros Lactobacillus, Lactococcus,
Leuconostoc y Pediococcus.
16. El uso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones anteriores 14 a 15, caracterizado porque
las bacterias son del tipo Lactobacillus helveticus,
Lactobacillus lactis, Carnobacterium piscícola,
Lactobacillus plantarun, y Pediococcus acidilacti.
17. Los crustáceos tratados con bacterias ácido
lácticas como agentes inhibidores de melanosis para su uso
alimenticio.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2065858B1 (es) * | 1993-08-04 | 1995-11-01 | Inst Recerca I Tecnologia Agroalimentaries | Nueva cepa de lactobacillus plantarum con efecto preventivo contra la aparicion de la mancha negra en los productos carnicos crudos curados |
| FR2830018B1 (fr) * | 2001-09-21 | 2003-11-07 | Patrice Daniel | Nouvelles bacteries lactiques du genre lactococcus lactis et leur application a la conservation de produits alimentaires |
| JP4236087B2 (ja) * | 2002-11-06 | 2009-03-11 | 日本水産株式会社 | 抗菌作用および抗酸化作用を有する乳酸菌培養液で処理された魚介類 |
-
2005
- 2005-01-28 ES ES200500165A patent/ES2257964B1/es active Active
-
2006
- 2006-01-27 WO PCT/ES2006/000039 patent/WO2006082267A1/es not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2257964A1 (es) | 2006-08-01 |
| WO2006082267A1 (es) | 2006-08-10 |
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