ES2255181T3 - Antigeno inmunoprotector contra la gripe y su uso en vacunacion. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un antígeno contra la gripe, que consta de un producto de fusión de la menos una parte extracelular de una proteína de membrana de gripe conservada o un fragmento funcional de esta y un portador de entrega, que podría ser un (poli) péptido de entrega o una estructura no peptídica, como son glicanos, miméticos de péptidos y polímeros sintéticos. La invención además se refiere a la vacuna contra la gripe, que consta de al menos un antígeno de la invención, opcionalmente en la presencia de uno o más excipientes. La invención también se refiere al uso del antígeno, un procedimiento para prepara el antígeno y una célula receptora que expresen el antígeno.

Description

Antígeno inmunoprotector contra la gripe y su uso en vacunación.

La presente invención se refiere a nuevos antígenos inmunoprotectores contra la gripe que no existen en la naturaleza. La invención además se refiere al uso de los antígenos para vacunación y a las vacunas que los contienen, así como a los procedimientos para preparar los antígenos.

La gripe está causada por un virus de ARN del grupo mixovirus. Los virus de la gripe se pueden clasificar en tres tipos (A, B y C), según las diferencias antigénicas en la nucleoproteína y en la proteína de la matriz. Los virus de la gripe de los tipos A y B contienen cada uno 8 segmentos de ARN, mientras que el tipo C tiene sólo 7 segmentos de ARN. La gripe de tipo A es la más importante y es muy patogénica para el hombre, así como para animales, por ejemplo, cerdos y caballos. La gripe de tipo B causa la enfermedad en humanos. La gripe de tipo C es menos grave y se ha aislado a partir de humanos y cerdos. El virus se transmite a través del aire, principalmente en gotitas que se expulsan durante la tos y el estornudo. Los virus de la gripe causan una infección del aparato respiratorio que normalmente se acompaña de tos, fiebre alta y mialgia. Aunque una infección de gripe a menudo no supone la muerte del individuo infectado, la morbilidad puede ser grave. Como consecuencia de ello, las gripes epidémicas pueden llevar a pérdidas económicas sustanciales. Además, la infección con el virus de la gripe puede ser más peligrosa para ciertos grupos de individuos, tales como los que han sufrido un ataque al corazón, pacientes con CRD inespecífica o ancianos. Por tanto, es muy deseable una vacuna contra la gripe.

El virus de la gripe A contiene en su membrana dos proteínas muy inmunogénicas, pero muy variables, la hemaglutinina y la neuraminidasa. Debido a la variabilidad de estas dos proteínas, hasta el momento no se ha desarrollado una vacuna contra la gripe de tipo A de amplio espectro y duradera. La vacuna contra la gripe que se usa normalmente tiene que adaptarse casi cada año para seguir la deriva antigénica del virus. En estas circunstancias la vacuna puede proteger aproximadamente al 80% de las personas inmunizadas. Cuando se producen los cambios más drásticos en el virus, conocido como cambio antigénico, la vacuna deja de ser protectora.

El objeto de la presente invención es, por tanto, proporcionar un nuevo antígeno inmunoprotector para su uso en vacunas que no estén basadas en la hemaglutinina y/o la neuraminidasa rápidamente cambiantes y que, por tanto, no tengan las desventajas de estos antígenos conocidos y de las vacunas basadas en ellos.

En la investigación que condujo a la presente invención se encontró que se pueden usar proteínas de membrana del virus de la gripe bien conservadas diferentes a la hemaglutinina y neuraminidasa. La proteína de membrana M2 es particularmente útil para esta aproximación.

El ARNm de M2 está codificado por el segmento 7 del ARN del virus de la gripe A. Está codificada por un ARNm procesado (Lamb y col., 1981). Al igual que la hemaglutinina y la neuraminidasa, la proteína M2 es una proteína integral de membrana del virus de la gripe A. Pero la proteína es mucho más pequeña, sólo 97 aminoácidos de longitud. Al exterior de la superficie de la membrana se exponen 24 aminoácidos del extremo amino terminal, 19 aminoácidos atraviesan la bicapa lipídica, mientras que los restantes 54 restos se localizan en la cara citoplásmica de la membrana (Lamb y col., 1985).

La proteína M2 se expresa de forma abundante en la superficie celular de las células infectadas con la gripe de tipo A (Lamb y col., 1985). La proteína también se encuentra en la membrana de la propia partícula del virus, pero en cantidades mucho más pequeñas, 14 a 68 moléculas de M2 por virión (Zebedee y Lamb, 1988). La proteína M2 se modifica postraduccionalmente mediante la adición de un ácido palmítico a la cisteína de la posición 50 (Sugrue y col., 1990).

La proteína M2 es un homotetrámero compuesto de dos dímeros unidos por puentes disulfuro, que se mantienen juntos mediante interacciones no covalentes (Sugrue y Hay, 1991). Mediante mutagénesis dirigida a sitio, Holsinger y Lamb (1991) demostraron que los restos de cisteína de las posiciones 17 y 19 están implicados en la formación del puente disulfuro. Únicamente la cisteína de la posición 17 está presente en todos los virus analizados, por lo tanto, parece probable que este sea el resto más importante. En la cepa de virus en la que la cisteína 19 también está presente, no se sabe si se forma un segundo puente disulfuro en el mismo dímero (ya unido por Cys 17-Cys 17) o con el otro dímero.

Mediante el alineamiento de las secuencias de las proteínas M2, aisladas a partir de diferentes cepas humanas del virus de la gripe A, se hizo evidente una notable conservación de la parte extracelular de la proteína M2 (tabla 1). Desde la primera cepa del virus de la gripe de tipo A humana aislada en 1933, A/WS/33 (H1N1), hasta el virus más recientemente secuenciado, A/Guangdong/39/89 (H3N2), no se han observado cambios de aminoácidos en el dominio extracelular de la proteína M2. Dos cepas de virus no se ajustan a este patrón conservado, A/PR/8/34 (H1N1), que muestra el cambio de un aminoácido, y A/Fort Monmouth/1/47 (H1N1), que muestra tres aminoácidos diferentes. Estas dos cepas probablemente representan ramas laterales en el árbol evolutivo.

La tabla 1 proporciona una vista general de las secuencias de aminoácidos del dominio extracelular de la proteína M2 de la gripe de tipo A de las cepas de virus A/WSN/33 (Markushin y col. (1988)), A/PR/8/34 (Allen y col. (1980), Winter y Fields (1980)), A/WS/33, A/Fort Warren/1/50, A/Singapur/1/57 y A/Port Chalmers/1/73 (todas descritas por Zebedee y Lamb (1989)), A/Udorn/72 (Lamb y Lai (1981)), A/Leningrado/134/57 (Klimov y col. (1992)), A/Ann Arbor/6/60 (Cox y col. (1988)), A/Bangkok/1/79 (Ortin y col. (1983)), A/Nueva York/83 (Belshe y col. (1988)), A/Fort Monmouth/1/47 (EMBL U02084), A/URSS/90/77 (EMBL X53029) y A/Guangdong/39/89 (EMBL L18999).

1

Los presentes inventores anticiparon que el carácter conservado de este tipo de proteínas de membrana podría convertirlas en buenos candidatos para el desarrollo de vacunas. En principio, ya se conoce la capacidad protectora de los anticuerpos anti-M2. Los datos experimentales demostraron que un anticuerpo monoclonal dirigido contra la parte extracelular de la proteína M2 (14C2) puede disminuir la diseminación del virus, aunque no se reduce la infectividad del virus in vitro (Zebedee y Lamb, 1988). Además, se demostró que el anticuerpo monoclonal (14C2) administrado de forma pasiva podía inhibir la multiplicación viral en los pulmones de ratones (Treanor y col., 1990). Ambas aproximaciones dependen de la administración de anticuerpos anti-M2. Sin embargo, se evita preferiblemente la administración pasiva de anticuerpos monoclonales como medio de defensa contra la infección, debido a la inmunogenicidad de las inmunoglobulinas heterólogas que, tras repetidas administraciones, pueden conducir al aclaramiento de los anticuerpos del organismo y, por tanto, a una reducción de la eficacia del tratamiento. Incluso anticuerpos homólogos pueden producir como respuesta anticuerpos anti-idiotipo. Además, se encontró que humanos infectados con el virus tienen anticuerpos anti-M2, pero éstos no protegen contra la infección, (ni su concentración ni su naturaleza son suficientes para conferir eficacia). Esto hace poco probable que la administración pasiva de anticuerpos anti-M2 sea adecuada para su uso en humanos. También se ha demostrado a partir del intento de desarrollar vacunas para humanos basadas en este antígeno.

Recientemente, se describió (Slepushkin et al., 1995) la protección de ratones contra una infección con virus homólogos o heterólogos. Estos autores utilizaron para las inmunizaciones una formulación de adyuvante incompleto de Freund y un extracto de membrana de células Sf9 que expresaban la proteína M2 completa. Sin embargo, esta aproximación tampoco es adecuada para la vacunación de humanos ya que depende del uso del adyuvante de Freund excepcionalmente potente que está prohibido en humanos.

En resumen, preferiblemente, debe evitarse el uso de anticuerpos para proporcionar protección contra la gripe. Además, no es probable que el tratamiento profiláctico con anticuerpos fuera eficaz en humanos. La inmunización con la proteína M2 completa en humanos como se describe no es realista ya que depende del adyuvante incompleto de Freund que no se puede usar en humanos y está contraindicado en animales superiores.

De este modo, el objeto de la presente invención es proporcionar un antígeno de la gripe alternativo que sea suficientemente inmunoprotector contra un amplio espectro de cepas de la gripe y que no dependa del adyuvante de Freund, de modo que pueda usarse en seres humanos.

Según la invención se ha encontrado ahora que es posible preparar este nuevo antígeno que no existe en la naturaleza. Para esto, se fusiona la parte extracelular de una proteína de membrana conservada del virus de la gripe o un fragmento funcional de la misma con un vehículo presentador, por ejemplo un (poli)péptido. La proteína de membrana conservada del virus de la gripe es, por ejemplo, la parte extracelular bien conservada de la proteína M2. Preferiblemente, la proteína de membrana se fusiona genéticamente con un (poli)péptido presentador como vehículo presentador, el cual estabiliza la parte extracelular y potencia sorprendentemente la inmunogenicidad del producto de fusión obtenido de este modo. Se espera que el (poli)péptido presentador lleve la parte extracelular en su estructura de tipo silvestre, presentando, de este modo, el antígeno en una forma que también se encuentra en el virus y en las células infectadas.

Un "fragmento funcional de la proteína de membrana conservada del virus de la gripe" es un fragmento que, cuando se administra a una dosis inmunoprotectora a miembros de ensayo de una especie, es capaz de provocar una inmunoprotección estadísticamente significativa más elevada que la que se encuentra en miembros control de la misma especie que no han recibido el fragmento funcional.

En una realización de la invención, la parte extracelular de 23 aminoácidos de la proteína M2 se fusiona con el extremo amino terminal de la proteína del núcleo del virus de la hepatitis B humana. De esta manera, se mimetiza la estructura de tipo silvestre de la proteína M2 en partículas virales y en células infectadas, donde el extremo N-terminal libre se extiende en el entorno extracelular.

Los (poli)péptidos presentadores alternativos son dominios C3d múltiples (Dempsey y col., 1996), el fragmento C de la toxina tetánica o las partículas Ty de levadura. Se pretende que los "(poli)péptidos presentadores" abarquen cada extensión de aminoácido (o aminoácidos) que puede presentar la parte extracelular, sustancialmente en una forma de tipo silvestre, hacia el entorno.

De forma alternativa, el vehículo presentador puede ser una estructura no peptídica, tal como glicanos, polietilénglicoles, peptidomiméticos, polímeros sintéticos, etc.

Tras la expresión del nuevo antígeno en una célula aceptora adecuada, se puede usar como tal (dependiendo de la célula aceptora), como parte de un fragmento de membrana o en forma aislada.

La expresión "vehículo presentador" se usa para indicar todos los tipos de moléculas presentadoras, tanto (poli)péptidos como otras.

Estará claro para el experto en la materia que una construcción génica, que comprende la información de codificación del antígeno y del (poli)péptido presentador, no sólo puede usarse para preparar el nuevo antígeno, como se describe anteriormente, sino que también pueden usarse, opcionalmente, en presencia de secuencias reguladoras de la transcripción y/o traducción adecuadas, en una vacuna de ADN o en construcciones para vacuna basadas en vaccinia.

Puede incorporarse al producto de fusión una copia única o múltiples copias de un (poli)péptido presentador. Se usan más copias, preferiblemente 3 o más, del fragmento d de la tercera proteína del complemento (C3d).

En una realización preferida de la invención el producto de fusión puede comprender además un péptido adicional en un sitio interno apropiado (Schödel y col., 1992) o en el extremo C-terminal (Borisova y col., 1989). Se pretende que este péptido adicional aumente además la capacidad protectora del antígeno y pueda, por ejemplo, ser un epítope de la célula T colaboradora o un epítope de la célula T citotóxica.

El antígeno de la invención se puede obtener preparando una construcción génica que comprenda una secuencia codificadora de al menos la parte extracelular de una proteína de membrana conservada del virus de la gripe o un fragmento funcional de la misma y, opcionalmente, la secuencia codificadora de un (poli)péptido presentador unida de forma operativa a la misma, opcionalmente en presencia de secuencias reguladoras adecuadas de la transcripción, traducción y/o secreción, llevando esta construcción génica a una célula aceptora, efectuando la expresión de la construcción génica en la célula aceptora y, opcionalmente, aislando el antígeno a partir de las células aceptoras o de su medio de cultivo.

El requerimiento de las secuencias reguladoras de la transcripción, traducción y/o secreción depende de si el gen tiene que ser integrado en un vector o si la integración en el genoma de la célula aceptora se da en una posición que proporciona de hecho estas señales.

La secuencia codificadora de un (poli)péptido presentador sólo está presente cuando el producto de fusión es una fusión entre el antígeno y una estructura peptídica y si se desea unir directamente las dos estructuras en la construcción de ADN. En todos los demás ejemplos, el vehículo presentador puede añadirse al antígeno de una manera diferente.

La célula aceptora adecuada puede seleccionarse, por ejemplo, entre E. coli, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, levaduras (por ejemplo, Pichia pastoris), células de insecto (por ejemplo, Sf9), células de mamífero (por ejemplo, células Vero) y similares. En el caso de L. lactis, no es necesario aislar el antígeno, sino que se puede usar directamente la bacteria modificada por ingeniería genética para su uso intranasal u oral.

La invención además se refiere a vacunas que comprenden al menos el antígeno de la invención. Este antígeno puede estar en forma aislada, o ser parte, de un fragmento de membrana o expresarse en la célula aceptora. El antígeno de la invención puede usarse junto con excipientes adecuados. El experto en la técnica del diseño de vacunas será capaz de seleccionar excipientes adecuados. Se puede encontrar orientación, por ejemplo, en Methods in molecular medicine: Vaccine Protocols (1996). Eds. Robinson, A., Farrar, G.H. y Wiblin, C.N. Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, EE.UU.

Los antígenos de la invención pueden usarse solos o en combinación con uno o más antígenos diferentes del virus de la gripe, tales como neuraminidasa, hemaglutinina o M2 nativa.

Además, la invención se refiere al uso de los antígenos en la preparación de una vacuna contra la gripe. Las vacunas pueden ser vacunas directas, es decir, vacunas que contengan los productos de fusión, o indirectas, vacunas de ADN. Estas últimas son vacunas que comprenden el ADNc de fusión bajo la regulación de un promotor eucariótico que puede funcionar en el receptor. A continuación, el antígeno real se produce en el receptor de la vacuna.

Se pretende que las vacunas de la invención sean tanto para el uso en humanos como en animales, por ejemplo, cerdos y caballos, de los que se sabe que se infectan con el virus de la gripe de tipo A.

Se puede adoptar una aproximación similar, como se describe aquí, para la preparación de nuevos antígenos de fusión del virus de la gripe de tipo A para preparar antígenos de fusión similares y vacunas que contengan los antígenos de fusión o el ADN que codifica los antígenos de fusión de los virus de la gripe de tipo B y C.

La invención también se refiere a un procedimiento para preparar los antígenos, que comprende las etapas de:

a) preparar una construcción génica que comprende una secuencia codificadora de al menos la parte extracelular de una proteína de membrana conservada del virus de la gripe o un fragmento funcional de la misma y, al menos, una secuencia codificadora de un (poli)péptido presentador unido de forma operativa a la misma en presencia, opcionalmente, de las secuencias reguladoras adecuadas de la transcripción, traducción y/o secreción,

b) poner esta construcción génica en una célula aceptora adecuada,

c) efectuar la expresión de la construcción génica en la célula aceptora, y

d) opcionalmente, aislar el antígeno a partir de la célula aceptora o de su medio de cultivo.

La invención se ilustrará además mediante el siguiente ejemplo. El ejemplo describe en detalle la preparación de proteínas de fusión de la secuencia de M2 con diversos (poli)péptidos presentadores y el uso de las mismas en inmunización. En lugar de M2 y de los vehículos presentadores descritos aquí, el experto será capaz de elegir otras proteínas de membrana conservadas del virus de la gripe y otros vehículos presentadores.

En el ejemplo se hace referencia a las siguientes figuras:

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 1

Construcción de pATIPM2m1

E1 y E2

= exones primero y segundo de la proteína M2 del virus de la gripe,

M2e

= parte extracelular de la proteína M2,

M2t

= parte transmembranal; y

M2c

= cola citoplásmica.

Línea gruesa

= vector.

(a) retirada del intrón del gen m2,

(b) introducción de un sitio BclI entre la parte extracelular y el dominio transmembranal de la proteína M2,

(c) secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de la parte extracelular de la proteína M2 de A/PR/8/34.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 2

Construcción de pIPM2hB2Mm2s2

ori

= origen de replicación,

cat

= cloranfenicol acetiltransferasa,

bla

= \beta-lactamasa,

lpp

= lipoproteína,

hB2M

= \beta_{2}-microglobulina humana,

ompa-ss

= secuencia señal de la proteína A de la membrana externa de E. coli,

ADNss

= ADN de cadena sencilla,

M2e

= parte extracelular de la proteína M2.

(a): Diagrama de construcción,

(b): Detalles de las secuencias clave.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 3

Construcción de pPLcIPM2HBcm

ori

= origen de replicación,

cat

= cloranfenicol acetiltransferasa,

bla

= \beta-lactamasa,

HBc

= proteína del núcleo del virus de la hepatitis B,

ADNss

= ADN de cadena sencilla,

M2e

= parte extracelular de la proteína M2.

(a) Diagrama de construcción del plásmido,

(b) Secuencia que rodea el sitio de restricción BamHI introducido en el gen del núcleo del virus de la hepatitis B,

(c) Detalles de las secuencias clave.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 4

Análisis de la fracción soluble correspondiente a 150 \mul de cultivo original de la cepa MC1061[pcI857] que contiene los plásmidos pPLc245 (control), pPLcA1 (expresión de HBc) o pPLcIPM2HBcm (expresión de IPM2HBcm), respectivamente, en PAGE al 12,5% con SDS. Tras la electroforesis el gel se tiñó con azul brillante de Coomassie.

PM

= marcador de peso molecular,

NI

= cultivo no inducido,

I

= cultivo inducido.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 5

Análisis de la fracción soluble correspondiente a 150 \mul de cultivo original de la cepa MC1061[pcI857] transformada con pPLc245 (control), pPLcA1 (expresión de HBc) o pPLcIPM2HBcm (expresión de IPM2HBcm), respectivamente, como en la figura 4. Tras la electroforesis, las proteínas relevantes se revelaron mediante un experimento de Western blot. Detección con (A) un anticuerpo monoclonal contra HBc y (B) un anticuerpo monoclonal específico de la parte extracelular de la proteína M2.

PM

= marcador de peso molecular,

NI

= cultivo no inducido,

I

= cultivo inducido.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 6

Secuencia del extremo amino terminal de la proteína M2 comparada con el extremo amino terminal de IPM2HBcm, como se determinó experimentalmente. Secuencia de A/Udorn/72 (Lamb y Zebedee, 1985).

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 7

Fracciones solubles de la cepa MC1061[pcI857] transformada con pPLc245 (control), pPLcA1 (expresión de HBc) o pPLcIPM2HBcm (expresión de IPM2HBcm), respectivamente, analizadas en su estado nativo por medio de una transferencia puntiforme. Detección con (A) un anticuerpo monoclonal contra HBc y (B) un anticuerpo monoclonal específico de la parte extracelular de la proteína M2.

NI

= cultivo no inducido,

I

= cultivo inducido.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 8

Vista general de (A1) temperatura rectal, (A2) peso y (B) supervivencia de los ratones vacunados con IPM2HBcm tras una estimulación letal con 5 DL_{50} de A/PR/8/34 a.r. La significancia estadística se calculó mediante la prueba exacta de Fisher. Los ratones inmunizados con diferentes dosis de antígeno se compararon con el grupo control. Se obtuvieron los siguientes resultados: para 50 \mug de IPM2HBcm, p<0,001; para 10 \mug, p<0,005 y para la dosis de 5 \mug, p<0,05. La figura 8C muestra la supervivencia de los ratones vacunados por vía intraperitoneal con IPM2HBcm e IM2HBcm, respectivamente, tras una estimulación letal con 30 UHA de X-47. La figura 8D muestra la supervivencia de los ratones vacunados por vía intranasal con IPM2HBcm e IM2HBcm, respectivamente, tras una estimulación letal con 30 UHA de X-47.

\newpage

Figura 9

Análisis de las muestras de suero de los cuatro paneles presentados en la figura 8. El suero preinmune (a), el suero tomado después de la primera (b), después de la segunda (c) y después de la tercera (d) inmunización y el suero tomado después de la estimulación (e), se diluyeron inicialmente 1/50. Las etapas de diluciones consecutivas eran de 1/3. La absorbancia representada es un valor corregido obtenido como se describe en Resultados, Análisis de las muestras de suero.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 10

Construcción de pPLcIM2HBcm

ori

= origen de replicación,

cat

= cloranfenicol acetiltransferasa,

bla

= \beta-lactamasa,

M2e

= parte extracelular de la proteína M2,

HBc

= proteína del núcleo del virus de la hepatitis B.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 11

Análisis de la fracción soluble que contiene 5 mg de HBc o I(P)M2HBcm (como se determinó en un ELISA (véase Materiales y procedimientos)), de la cepa MC1061 [pcI857] que contenía, respectivamente, los plásmidos pPLc245 (control), pPLcA1 (expresión de HBc), pPLcIPM2HBcm (expresión de la proteína de fusión IPM2HBcm con la parte extracelular de la proteína M2 derivada de A/PR/8/34) o pPLcIM2HBcm (expresión de IM2HBcm, que contiene la secuencia de M2 más universal) en un gel PAGE al 12,5% con SDS.

PM

= marcador de peso molecular,

NI

= no inducido

I

= cultivo inducido.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 12

Análisis de la fracción soluble que contenía 2,5 \mug de HBc o I(P)M2HBcm (como se determinó en un ELISA (véase Materiales y procedimientos)), de la cepa MC1061 [pcI857] que contenía, respectivamente, los plásmidos pPLc245 (control), pPLcA1 (expresión de HBc), pPLcIPM2HBcm (expresión de IPM2HBcm) o pPLcIM2HBcm (expresión de IM2HBcm) en Western blot (véase Materiales y procedimientos). Detección con (A) un anticuerpo monoclonal dirigido contra HBc y (B) un anticuerpo monoclonal específico de la parte extracelular de la proteína M2.

PM

= marcador de peso molecular,

NI

= no inducido

I

= cultivo inducido.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 13

Vista general de los oligonucleótidos usados para la amplificación por PCR de hbc e i(p)m2hbc."s" o "c" después del nombre de los oligonucleótidos significa el uso de estos cebadores en la orientación sentido (s) o complementaria (c). Las secuencias enmarcadas indican los codones Leu cambiados.

\newpage

Figura 14

Vista general de la construcción de las fusiones de hbc y m2hbc en vectores para L. lactis

ori

= origen de replicación de E. coli,

ori(+)

= origen de replicación de L. lactis,

ermA y ermM = genes de resistencia a eritromicina,

P1

= promotor de L. lactis,

bla

= \beta-lactamasa,

HBc

= proteína del núcleo del virus de la hepatitis B,

M2e

= parte extracelular de la proteína M2,

usp45-ss

= secuencia señal de usp45,

mIL2

= interleucina 2 murina y

mIL6

= interleucina 6 murina.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 15

Análisis de la expresión de la proteína del núcleo de la hepatitis B (HBc) y de la proteína de fusión de M2-HBc en Western blot. Un equivalente de 10^{9} bacterias L. lactis de la cepa MG1363 que contenía, respectivamente, pTREX1 (control), pT1HBc, pT1HBcIL2, pT1HBcIL6 (expresión de HBc sola o en combinación con mIL2 o mIL6, respectivamente), pT1PM2HBc, pT1PM2HBcIL2, pT1PM2HBcIL6 (expresión de IPM2HBcm sola o en combinación con mIL2 o mIL6, respectivamente), pT1M2HBc, pT1M2HBcIL2, pT1M2HBcIL6 (expresión de IM2HBcm sola o en combinación con mIL2 o mIL6, respectivamente), se analizó en un gel PAGE al 12,5% con SDS. El primer anticuerpo, p-anti-HBc (Dako Corporation, Carpinteria, CA., USA) se diluyó 5.000 veces. Los anticuerpos unidos se detectaron con un anticuerpo policlonal anti-IgG de conejo marcado con fosfatasa alcalina diluido 1/2000 (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL., EE.UU.). I(P)M2HBc significa IPM2HBcm o IM2HBcm.

PM

= marcador de peso molecular,

C

= control y

-

= expresión del antígeno solo.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 16

Análisis de la expresión de las proteínas de fusión M2-HBc en Western blot. El equivalente de 2 a 3 x 10^{9} bacterias L. lactis de la cepa MG1363 que contenía, respectivamente, pT1HBc (control), pT1PM2HBc, pT1PM2LHBc (expresión de IPM2HBcm), pT1M2HBc, pT1M2LHBc (expresión de IM2HBcm), se separó en un gel-PAGE al 12,5% con SDS. Las proteínas de fusión se detectaron con una fracción IgG de un anticuerpo policlonal de ratón anti-M2e (véase Materiales y procedimientos). Los anticuerpos unidos se detectaron con un policlonal anti-IgG de ratón (específico de la cadena \gamma) conjugado con fosfatasa alcalina diluido 1/2000 (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL., EE.UU.).

PM

= marcador de peso molecular,

C

= control,

E

= codones de leucina óptimos para su uso en E. coli, y

L

= codones de leucina óptimos para su uso en L. lactis.

Estos son los plásmidos pT1PM2LHBc y pT1M2LHBc, respectivamente. I(P)M2HBc significa IPM2HBcm o IM2HBcm.

\newpage

Figura 17

Vista general de los oligonucleótidos usados para la amplificación por PCR de la parte extracelular de la proteína M2 y C3d. "s" o "c" después del nombre en clave de los oligonucleótidos significa el uso de estos cebadores en la orientación sentido (s) o complementaria (c). Las regiones enmarcadas indican los codones Leu cambiados.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 18

Vista general de la construcción de fusiones m2c3d3 en L. lactis

ori

= origen de replicación de E. coli,

ori(+)

= origen de replicación de L. lactis,

ermA y ermM = genes de resistencia a eritromicina,

P1

= promotor de L. lactis,

bla

= \beta-lactamasa,

M2e

= parte extracelular de la proteína M2,

usp45-ss

= secuencia señal de usp45,

spaX

= secuencia anclaje derivada de la proteína A de Staphylococcus aureus,

Cd3

= fragmento d de la proteína 3 del complemento y

mIL6

= interleucina 6 murina.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 19

Vista general de los oligonucleótidos usados para la amplificación por PCR de ttfc y m2ttfc. "s" o "c" después del nombre de los oligonucleótidos significa el uso de estos cebadores en la orientación sentido (s) o complementaria (c). Las regiones enmarcadas indican los codones Leu cambiados.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 20

Vista general de la construcción de m2ttfc en vectores para L. lactis

ori

= origen de replicación de E. coli,

ori(+)

= origen de replicación de L. lactis,

ermM y erm\mu = genes de resistencia a eritromicina,

P1

= promotor de L. lactis,

bla

= \beta-lactamasa,

TTFC

= fragmento C de la toxina tetánica,

M2e

= parte extracelular de la proteína M2,

usp45-ss

= secuencia señal de usp45,

mIL2

= interleucina 2 murina y

mIL6

= interleucina 6 murina.

\newpage

Figura 21

Análisis de la expresión de la proteína de fusión IPM2TTFC en Western blot. El equivalente de 10^{9} bacterias L. lactis de la cepa MG1363 que contenían, respectivamente pT1TT (control), pT1PM2LTT (expresión de IPM2TT), pT1PM2LTTIL2 (expresión de IPM2TT en combinación con mIL2) o pT1PM2LTTIL6 (expresión de IPM2TT en combinación con mIL6), se analizó en un gel PAGE al 10% con SDS. El primer anticuerpo, una fracción IgG de un anticuerpo policlonal de ratón anti-M2e (véase Materiales y procedimientos) se diluyó 2.500 veces. Los anticuerpos unidos se detectaron con un policlonal anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa de rábano picante diluido 1/2000 (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL., EE.UU.). Se disolvieron 30 mg de 4-cloro-1-naftol (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., EE.UU.), en 10 ml de metanol. A continuación, se añadieron 40 ml de PBS, pH 7,4 y 150 \mul de H_{2}O_{2}.

PM

= marcador de peso molecular,

-

= expresión del antígeno solo,

mIL2

= expresión del antígeno en combinación con mIL2,

mIL6

= expresión del antígeno en combinación con mIL6,

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 22

Conjunto de cebadores usados para la amplificación por PCR de la señal de secreción de la proteína gp67 de baculovirus.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 23

Conjunto de cebadores usados para la amplificación por PCR de la parte extracelular de la proteína M2 durante la construcción de la fusión sgpM2C3d3.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 24

Construcción del vector de transferencia de baculovirus pACsgpM2C3d3

bla

= \beta-lactamasa,

Línea gruesa gris

\\[2.1mm]= región de homología de baculovirus,

C3d

= fragmento d de la proteína 3 del complemento,

M2e

= parte extracelular de la proteína M2,

ori

= origen de replicación,

phP

= promotor de polihedrina de baculovirus y

sgp67

= señal de secreción de la proteína de baculovirus gp67.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 25

Detalle de las secuencias clave de nucleótidos y aminoácidos de la fusión sgpM2C3d3

C3d

= fragmento d de la proteína 3 del complemento,

M2e

= parte extracelular de la proteína M2 y

sgp67

= señal de secreción de la proteína de baculovirus gp67.

\newpage

Figura 26

Análisis del baculovirus recombinante AcNPV/sgpM2C3d3 mediante amplificación por PCR del locus de polihedrina (cebador TTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTG y CAACAACGCACAGAATCTAG). Se realizaron reacciones de control con el vector de transferencia parental pACsgpM2C3d3 y con el baculovirus AcNPV de tipo silvestre.

M

= marcadores de tamaño de ADN.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 27

Expresión de M2C3d3 secretada por células de insecto Sf9 infectadas con el baculovirus recombinante AcNPV/sgp
M2C3d3 como se demostró mediante análisis por Western blot (gel-PAGE al 10%) de los sobrenadantes recogidos. Se incluyeron como control sobrenadantes de células pseudoinfectadas, u obtenidos tras la infección con el baculovirus AcNPV de tipo silvestre.

PM

= marcadores de peso molecular.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 28

Vista general de la supervivencia de ratones después de una estimulación letal con 5 DL_{50} de X47a.r.. Los ratones vacunados con 3 x 10 \mug de IM2HBcm se compararon con ratones inmunizados pasivamente (P).

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 29

Vista general de las construcciones de ADN para vacunación

RT

= transcriptasa inversa

PCMV

= promotor de citomegalovirus

bla

= \beta-lactamasa

npt

= resistencia a neomicina.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 30

Expresión en células HEKT analizadas en Western blot. El primer anticuerpo (paM2 (véase Materiales y procedimientos)) se diluyó 2.000 veces. Los anticuerpos anti-M2 unidos se detectaron con un anti-IgG de ratón marcado con fosfatasa alcalina.

PM

= marcador de peso molecular

M2

= proteína M2 expresada en células de insecto

1

= pCDNA3

2

= pCIM2

3

= pCIM2HBcm

4

= pCIP3M2HBcm.

\vskip1.000000\baselineskip

Figura 31

Respuesta de anticuerpos contra la proteína M2 analizada en un ELISA

A. Las placas de microvaloración se recubrieron con periplasma que contenía hB2M o IPM2hB2M, respectivamente (véase Materiales y procedimientos).

B. Placas de microvaloración recubiertas con proteína M2 expresada en células de insecto (véase Materiales y procedimientos).

Se usarán las siguientes abreviaturas:

1 DL_{50}

:dosis letal, la estimulación viral necesaria para matar a la mitad de la población de ratones infectados

BCIP

:5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato

pb

:par (o pares) de bases

FIT

:fosfatasa intestinal de ternera

C3d

:fragmento d de la proteína 3 del complemento

DEA

:dietilamina

UHA

:unidades de hemaglutinina

hB2M

:\beta2-microglobulina humana

HBc

:Proteína del núcleo de la hepatitis B

IM2HBcm

:fragmento de la proteína M2 del virus de la gripe de tipo A universal fusionado con HBc

IPM2hB2Mm

:fragmento de la proteína M2 del virus de la gripe de tipo A (de A/PR/8/34) fusionada con hB2M

IPM2HBc

:fragmento del virus de la gripe de tipo A (de A/PR/8/34), fusionado con HBc, que contiene cuatro {}\hskip0,1cmaminoácidos adicionales entre la primera metionina y el inicio de la parte extracelular de la proteína {}\hskip0,1cmM2

IPM2HBcm

:fragmento de la proteína M2 del virus de la gripe de tipo A (de A/PR/8/34) fusionado con HBc

IPTG

:isopropil-\beta-D-tiogalactósido

a.r.

:adaptado a ratón

M2C3d3

:fragmento M2 del virus de la gripe universal fusionado con tres copias de C3d

cM2C3d3

:forma citoplásmica de M2C3d3

sM2C3d3

:forma secretada de M2C3d3

sM2C3d3X

:forma de M2C3d3 unida covalentemente a la pared celular

MES

:ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico

MPLA

:monofosforil lípido A

NBT

azul de nitrotetrazolio

OmpA-ss

:secuencia señal de la proteína A de la membrana externa

PCR

:reacción en cadena de la polimerasa

SDS-PAGE

:electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato sódico

TDM

:dicorinomicolato de trehalosa

phP

promotor de polihedrina de baculovirus

sgp67

señal de secreción de la proteína gp67 de baculovirus.

Ejemplo

Introducción

Este ejemplo muestra la preparación de diversos antígenos de fusión basados en la proteína M2 del virus de la gripe de tipo A. El fragmento M2 se fusionó con el extremo amino terminal de diversos vehículos presentadores.

Materiales y procedimientos 1. Cepas bacterianas y plásmidos

Todos los plásmidos, hechos para la expresión en Escherichia coli, se realizaron en la cepa MC 1061 (hsdR mcrB araD139\Delta(araABC-leu)7697 \DeltalacX74 galU galK rpsL thi (Casadaban y Cohen, 1980)) por su elevada eficacia de transformación. La primera transformación tras la mutagénesis se realizó en WK6\lambdamutS (\Delta(lac-proAB), galE, strA, mutS::Tn10/lacI^{q}, Z\DeltaM15, proA^{+}B^{+}; Zell y Fritz, 1987). Los estudios de expresión de la \beta2-microglobulina humana y sus derivados se realizaron en la cepa C3000 de E. coli ((Hfr, sup^{-}, thi(\lambda^{-})). Los estudios de expresión de la proteína del núcleo del virus de la hepatitis B se llevaron a cabo en MC1061 [pcI857]. pcI857 se describió en Remaut y col., 1983b. Un derivado de este plásmido, pcI857K1 se describió en Steidler y col., 1994.

El plásmido p714 (Parker y Wiley, 1989) fue amablemente cedido por el Dr. Parker y el plásmido pPLcA1 (Nassal, 1988) por el Dr. M. Nassal. El plásmido pPLc245 se describió en Remaut y col., 1983a.

Para las construcciones y expresiones en Lactococcus lactis se usó la cepa MG1363 (Gasson, 1983). El vector para la expresión constitutiva en L. lactis, pTREX1 (Wells y Schofield, 1996) fue generosamente cedido por el doctor K. Schofield. El plásmido pL2MIL2, para la expresión de interleucina 2, se describe en Steidler y col., 1995. Un plásmido análogo para la expresión de interleucina 6, pL2MIL6, se describe en Steidler y col., 1996.

El vector pSG5.C3d.YL (Dempsey y col., 1996) ha sido cedido por el Dr. Fearon.

El vector de transferencia de baculovirus pACGP67A (Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.) contiene un segmento modificado del genoma de baculovirus, incluyendo el promotor de polihedrina seguido por la señal de secreción derivada de la proteína gp67 de baculovirus y un sitio de clonación para la inserción de la secuencia de un gen extraño. Se construye para permitir su integración en el genoma de baculovirus (o una versión modificada del mismo) mediante recombinación homóloga. El baculovirus recombinante resultante es capaz de expresar el gen de interés a partir del promotor de polihedrina como una proteína secretada mediante la escisión de la señal de secreción de gp67.

2. Virus

El virus de la gripe A/PR/8/34 (H1N1) se adaptó a ratones mediante varios pases por el pulmón. Tras la adaptación, el virus se cultivó en huevos (Kendal y col., 1982) y se purificó en un gradiente de glucosa. Se determinó el valor [(unidades de hemaglutinina (UHA) (Hirst, 1941; Kendal y col, 1982)] y la letalidad en ratones. Para A/PR/8/34 a.r., 1 DL_{50} corresponde a 10 UHA presentes en 50 \mul.

La cepa del virus de la gripe X-47 (H3N2) (Baez y col., 1980) se usó en experimentos de estimulación heteróloga. Esta cepa se adaptó a ratones mediante varios pases por el pulmón.

3. Animales

Se adquirieron ratones Balb/c hembras de Charles River Wiga (Sulzfeld, Alemania). Se usaron ratones de 6 a 7 semanas de edad.

4. Anticuerpos

El anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra la proteína del núcleo del virus de la hepatitis B fue amablemente cedido por el Dr. Sc. H. Claeys (Bloedtransfusiecentrum, Leuven).

Un anticuerpo monoclonal de ratón específico de la \beta_{2}-microglobulina humana se adquirió en Boehringer (Mannheim, Alemania).

Los anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina específicos de IgG de ratón o de IgG de ratón (específicos de la cadena g) se compraron en Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo., EE.UU.).

5. Medios de cultivo

E. coli se cultivó en medio LB (triptona al 1%, extracto de levadura al 0,5% y NaCl al 0,5%) a menos que se mencione lo contrario. El medio mínimo M9 (Millar, 1972), suplementado con casaminoácidos al 0,2%, se usó en experimentos en los que la proteína expresada se secretaba al medio de cultivo y tenía que ser purificada.

El medio de cultivo M17 (Difco Laboratories, Detroit, MI, EE.UU.) suplementado con glucosa al 0,5% (GM 17) se usó para cultivar L. lactis. La eritromicina se usó a una concentración de 5 \mug/ml (medio GM17E). L. lactis se cultivó a 28ºC sin agitación.

Los hibridomas y las células de mieloma se cultivaron en RPMI 1640 (Gibco BRL, Bethesda, Md., EE.UU.) suplementado con 10% de suero de ternera fetal, L-glutamina a 0,3 mg/ml, piruvato sódico 0,4 mM, penicilina a 100 U/ml y estreptomicina a 100 ng/ml.

Las células de insecto Sf9 se cultivaron en medio TC100 (Gibco BRL, Bethesda, MD, EE.UU.) suplementado con el 10% de suero de ternera fetal, penicilina a 100 U/ml y estreptomicina a 100 ng/ml.

6. Adyuvantes

Para la primera inmunización se usó adyuvante Ribi (Riba Immunochem Research Inc., Hamilton, MT, USA). Una dosis completa de adyuvante Ribi contiene 50 \mug de MPLA (monofosforil lípido A), 50 \mug de TDM (dicorinomicolato de trehalosa), escualeno al 2% y Tween 80 al 0,01%.

Para la segunda y tercera inmunización se usó MPLA solo o mezclado con una cantidad igual de péptido adyuvante (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., EE.UU.).

7. Manipulaciones del ADN

Las enzimas de restricción, ADN polimerasas, polinucleótido quinasa de T4 y ADN ligasa de T4 (Boehringer, Mannheim, Alemania; Gibco BRL, Bethesda, Md., EE.UU., o New England Biolabs, Beverly, MA., EE.UU.) se usaron como recomiendan los fabricantes. Con fines analíticos, se extrajo el ADN plasmídico según Birnboim y Doly (1979). Con fines preparativos, se aisló el ADN plasmídico según Kahn y col. (1979). Los fragmentos de restricción del ADN se aislaron mediante el procedimiento de Geneclean según Vogelstein y Gillespie (1979) y Struhl (1985). Los materiales necesarios se adquirieron en Bio 101 (La Jolla, CA., EE.UU.). Para el aislamiento del ADN plasmídico a partir de L. lactis es necesario un pretratamiento de la bacteria para debilitar la pared celular. El sedimento bacteriano se resuspendió en 50 \mul de TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8 - EDTA 1 mM). A continuación, se añadieron otros 50 \mul de TE suplementados con lisozima a 10 mg/ml (Boehringer, Mannheim, Alemania) y mutanolisina a 200 U/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., EE.UU.). Esta mezcla se incubó durante 10 min a 37ºC y a continuación, se puso en hielo durante 5 min. Los tratamientos adicionales fueron idénticos a los usados para el aislamiento del plásmido a partir de E. coli.

Para todas las construcciones en L. lactis se usó ADN plasmídico purificado (Qiagen, Hilden, Alemania). Los fragmentos de ADN se purificaron a partir de geles de agarosa usando Qiaex II (Qiagen, Hilden, Alemania).

8. Amplificación por PCR

Todas las reacciones de PCR se realizaron siguiendo un protocolo básico. En cada reacción se usaron aproximadamente 50 ng de molde puro y 50 pmol de oligonucleótidos sentido y complementario (Life Technologies, Paisley, Reino Unido). Se añadieron dos unidades de ADN polimerasa Vent® (New England Biolabs, Beverly, MA., EE.UU.) después de calentar las muestras a 94ºC. La temperatura de hibridación (T_{a}) se fijó, según la composición del cebador, a aproximadamente 7ºC por debajo de la temperatura de fusión (T_{m}). Los mejores resultados de estas amplificaciones por PCR se obtuvieron a 60ºC. La síntesis de hbc y de los genes de fusión imp2hbc e im2hbc se llevó a cabo durante 45 segundos a 72ºC. La síntesis de la secuencia, que codifica la parte extracelular de la proteína M2 (cm2 y sm2), se dejó durante 20 segundos a 72ºC. Se realizaron un total de treinta ciclos de amplificación. Las reacciones control no contenían oligonucleótidos. Se usaron tres concentraciones diferentes de MgSO_{4}, 2, 3 y 4 mM. Para una clonación adicional se usó la reacción de PCR que producía una cantidad significativa del fragmento esperado en las condiciones más rigurosas (mínima concentración de Mg^{2+} y máxima T_{m}).

El fragmento C3d3 se amplificó a partir de pSG5.C3d.YL con los oligonucleótidos C3ds y C3dc usando ADN polimerasa Pwo (Boehringer, Mannheim, Alemania). La temperatura de hibridación se fijó a 60ºC y se realizó la síntesis durante 2 min a 72ºC.

La amplificación de la señal de secreción de gp67 de baculovirus se hizo con polimerasa Taq (Boehringer Mannheim, Alemania) a partir de pACGP67A usando los cebadores GP67s y GP67c. Se realizaron un total de 25 ciclos con síntesis a 72ºC durante 1 min.

9. Ligamiento

Los ligamientos para L. lactis se realizaron con ADN ligasa de T4 Ready-To-Go^{TM} (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Tras la incubación durante 1 h a 20ºC, la mezcla se extrajo con fenol (Life Technologies, Paisley, Reino Unido) y cloroformo/alcohol isoamílico (24/1). El ADN se precipitó con see-DNA (Amersham International, Buckinghamshire, Reino Unido). El sedimento completo resuspendido se usó para electroporación (Wells y col., 1993).

10. Medios de purificación de proteínas

Todos los medios de cromatografía se adquirieron de Pharmacia Biotech (Uppsala, Suecia), excepto la celulosa CF11, que se adquirió de Whatman International Ltd. (Maidstone, Reino Unido).

11. Gel de proteínas

Las muestras de proteínas se analizaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) según Laemmli, 1970. Después de la electroforesis, las proteínas se fijaron con ácido tricloroacético al 10% y se tiñeron con azul brillante de Coomassie R-250 al 0,05% en solución de desteñido. El exceso de colorante se eliminó incubando el gel en solución de desteñido (metanol al 30% - ácido acético al 7%). El gel se sumergió en etanol al 4% antes de secarlo entre dos hojas de celofán permeable.

12. Inmunotransferencia (Western blot) y transferencia puntiforme

Para la caracterización inmunológica, las proteínas se transfirieron por electroforesis desde un gel de SDS-PAGE a una membrana de nitrocelulosa (diámetro de poro de 0,45 \mum, Schleicher & Schuell, Dassal, Alemania) y un aparato de transferencia en seco (Plexi-labo, Gent, Bélgica). El filtro se bloqueó durante al menos 2 h en PBS pH 7,4 (tampón fosfato 14,5 mM pH 7,4 - NaCl 150 mM) con leche descremada en polvo al 2,5% y Tritón X-100 al 0,1% (tampón de bloqueo). La incubación con el anticuerpo primario, diluido en tampón de bloqueo, se realizó a temperatura ambiente durante 30 a 60 min. El exceso de anticuerpo sin unir se eliminó lavando tres veces con tampón de bloqueo. Los anticuerpos unidos se detectaron con un anticuerpo de la especificidad apropiada, conjugado con fosfatasa alcalina. Posteriormente, Los filtros se lavaron dos veces con PBS pH 7,4 - Tritón X-100 al 0,1%. Se realizó una tercera etapa de lavado con tampón del sustrato (Tris-HCl 100 mM, pH 9,5 - NaCl 100 mM - MgCl_{2} 5 mM). A continuación, el filtro se incubó en el tampón del sustrato con 165 \mug/ml de azul de nitrotetrazolio (NBT) y 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (BCIP) a 165 \mug/ml hasta que apareció una señal clara. Finalmente, se lavó la transferencia vigorosamente con agua corriente y se secó.

El análisis de la transferencia puntiforme (dot blot) se realizó de forma similar a la inmunotransferencia, excepto que las proteínas no se transfirieron por electroforesis, sino filtrando las muestras a través de una membrana de nitrocelulosa.

13. ELISA

En cada ELISA se usó una solución de caseína al 0,1% para bloquear y para hacer las diluciones de los anticuerpos usados. La solución madre de caseína (2,5%) se preparó como sigue: se disolvieron 6,25 g de caseína en polvo en 200 ml de NaOH 300 mM agitando durante una noche a 37ºC. A continuación se ajustó el pH a 7 añadiendo HCl 2N. El volumen final se llevó a 250 ml (boletín de Nunc nº 7, diciembre 1989). Se añadió azida sódica (0,02%) como conservante.

Se desarrollaron diferentes ELISA para determinar la concentración de las proteínas de fusión de la proteína del núcleo del virus de la hepatitis B o de la \beta2-microglobulina humana. Se cubrieron las placas de microvaloración (maxisorp F96 tipo II Nunc A/S, Roskilde, Dinamarca) durante 1,5 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4ºC con diluciones seriadas de 1/2 de las muestras que contenían IPM2HBcm o IPM2hB2Mm. En la misma placa, se usaron como patrones diluciones seriadas 1/2 de HBc o hB2M purificadas, respectivamente, comenzando desde 2 \mug/ml. Entre cada etapa de incubación, las placas se lavaron dos veces con agua corriente y una vez con PBS, pH 7,4 - Tritón X-100 al 0,05%, excepto que tras el bloqueo, las placas no se lavaron. Las placas de microvaloración se bloquearon con solución de caseína al 0,1% durante 2 h a temperatura ambiente o a 4ºC durante la noche. Como anticuerpo primario usamos un anticuerpo de ratón anti-HBc o anti-hB2N, respectivamente. Los anticuerpos unidos se detectaron con un anticuerpo anti-IgG de ratón (específico de la cadena \gamma) marcado con fosfatasa alcalina. La incubación con la solución de anticuerpo se realizó a temperatura ambiente durante 1,5 h. Finalmente, las placas de microvaloración se incubaron durante 1 h con tampón del sustrato (dietanolamina al 10% - MgCl_{2} 0,5 mM - NaN_{3} al 0,02%, pH 9,8) que contenía p-nitrofenilfosfato a 1 mg/ml. La absorbancia se midió a 405 nm y se usó la longitud de onda de 490 nm para la normalización.

14. Preparación del policlonal anti-M2

Todos los ratones, que se habían inmunizado con IPM2HBcm y que habían sobrevivido a la estimulación letal con el virus de la gripe de tipo A, A/PR/8/34 a.r. (véase resultados, inmunización) se anestesiaron con 250 \mul de tribromoetanol a 25 mg/ml (inyectado por vía i.p.) y se tomaron muestras de sangre mediante punción cardiaca. El suero se aisló como se describe más adelante en este documento. El suero completo daba un fondo alto en Western blot, por tanto se preparó una fracción IgG. El suero completo se filtró a través de un filtro de 0,45 \mum (Millipore Millex-HV, Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) y se diluyó 10 veces en tampón de carga (PBS - EDTA 10 mM, pH 8). Esta mezcla se cargó en una columna de Proteína G Sepharose 4 Fast Flow equilibrada (\Phi = 1 cm, h = 8 cm). Las moléculas de IgG unidas se eluyeron con glicina-HCl 100 mM, pH 2,7. Se recogieron fracciones de 1 ml en tubos que contenían 50 \mul de Tris-HCl 1 M pH 9,5 para llevarlo a un pH neutro.

La cantidad de anticuerpos anti-M2 en las fracciones mezcladas del pico era de 2,6 \mug/ml. Esto se determinó en un ELISA, comparable a la detección de anticuerpos anti-M2 en el suero de ratones inmunizados. Se usó como patrón un monoclonal de ratón anti \beta2-microglobulina humana (Cymbus Bioscience, Southampton, Reino Unido).

15. Preparación del suero

Se tomaron cinco muestras de sangre de cada ratón: el suero preinmune (a), el suero tomado después de la primera (b), después de la segunda (c) y después de la tercera (d) inmunización, y el suero tomado tras la estimulación (e). Esta sangre se incubó durante 30 min a 37ºC. A continuación, las muestras se colocaron en hielo durante al menos 1 hora y se centrifugaron dos veces durante 5 min a 16.000 g en una microcentrífuga. Se aisló el suero.

Se mezclaron volúmenes iguales de sueros obtenidos de diferentes ratones para el análisis de la producción de anticuerpos.

16. RT-PCR

Se incubó el líquido alantoico de A/Ann Arbor/6/60 (215 UHA) en tampón AMV (Boehringer, Mannheim, Alemania) a 65ºC durante 30 min. Se uso una dilución 1/20 de esta mezcla para la reacción de la transcriptasa inversa (RT). A esta mezcla de ARNv (ARN genómico viral) se añadieron oligonucleótidos 50 \mumol (RT-NTRNA7), DTT 10 mM y dNTP 2,5 mM. Tras una incubación de 10 min a 70ºC, se añadieron 20 unidades de transcriptasa inversa AMV (Boehringer, Mannheim, Alemania) y 40 unidades de inhibidor de ARNasa (Boehringer, Mannheim, Alemania) La reacción de RT se hizo a 42ºC durante 1 h. Se usó una dilución 1/3 de esta mezcla de reacción para la reacción de PCR como se describió anteriormente.

17. Transfección y expresión

Se pusieron células HEKT en una placa de 6 pocillos a 2 x 10^{5} células/pocillo y se cultivaron durante 24 h. Se añadieron a las células 2 \mug de ADNp con reactivo de Transfección FuGene TM 6 (Boehringer, Mannheim, Alemania). Las células se lisaron 48 h después de la transfección en 100 \mul de PBS, pH 7,4 - EDTA 5mM - Nonidet P40 al 0,5%. Tras 5 min de centrifugación a 10.000 g, se aisló la fracción soluble. El sedimento se resuspendió en 100 \mul de PBS, pH 7,4.

18. Vacunación con ADN

Se usó ADN plasmídico a una concentración de 1 \mug/\mul. Se dieron tres inyecciones intramusculares a intervalos de tres semanas. El suero se tomó dos semanas después de cada inmunización, se mezcló y se analizó la respuesta anticorpal contra la parte extracelular de la proteína M2 en un ELISA (véase Materiales y procedimientos mencionado anteriormente).

19. ELISA II

Las placas de microvaloración se cubrieron con 1 \mug/ml de M2, expresada en células de insecto Sf9 (Black y col., 1993a, b). El resto del procedimiento se realizó como se describe en la sección anterior de Materiales y procedimientos.

20. Lista de plásmidos 20.1E. coli

pATIPM2m1: plásmido que contiene el gen m2 ininterrumpido de A/PR/8/34.

pIPM2hB2Mm2s2: plásmido para la expresión de IPM2hB2Mm, con el extremo amino terminal correcto de M2.

pPLcIPM2HBc: plásmido de expresión para IPM2HBc, con cuatro aminoácidos entre la metionina de inicio y el extremo amino terminal de M2e.

pPLcIPM2HBcm: plásmido de expresión para IPM2HBcm, con el extremo amino terminal correcto de M2e. La secuencia de M2 deriva de A/PR/8/34.

pPLcIM2HBcm: plásmido de expresión para IM2HBcm, con el extremo amino terminal correcto de la M2 universal.

20.2L. lactis

pT1TT: plásmido para la expresión de TTFC.

pT1PM2LTT: expresión de IPM2TT, con codones de leucina adaptados para L. lactis. La secuencia de M2e deriva de A/PR/8/34.

pT1PM2LTTIL2: expresión de IPM2TT, con codones de leucina adaptados, en combinación con mIL2.

pT1PM2LTTIL6: plásmido para la expresión de IPM2TT, con codones de leucina adaptados, en combinación con mIL6.

pT1HBc: plásmido para la expresión de HBc.

pT1HBcIL2: expresión de HBc en combinación con mIL2.

pT1HBcIL6: expresión de HBc en combinación con mIL6.

pT1PM2HBc: plásmido para la expresión de IPM2HBcm. La secuencia de M2e deriva de A/PR/8/34.

pT1PM2HBcIL2: expresión de IPM2HBcm en combinación con mIL2.

pT1PM2HBcIL6: expresión de IPM2HBcm en combinación con mIL6.

pT1M2HBc: plásmido para la expresión de IM2HBcm, con la secuencia universal de M2e.

pT1M2HBcIL2: expresión de IM2HBcm en combinación con mIL2.

pT1M2HBcIL6: expresión de IM2HBcm en combinación con mIL6.

pT1PM2LHBc: plásmido para la expresión de IPM2HBcm, con codones de leucina adaptados para L. lactis.

pT1PM2LHBcIL2: expresión de IPM2HBcm, con codones de leucina adaptados, en combinación con mIL2.

pT1PM2LHBcIL6: plásmido para la expresión de IPM2HBc, con codones de leucina adaptados, en combinación con mIL6.

pT1M2LHBc: expresión de IM2HBcm, con codones de leucina adaptados para L. lactis

pT1M2LHHcIL2: expresión de IM2HBcm, con codones de leucina adaptados, en combinación con mIL2.

pT1M2LHBcIL6: expresión de IM2HBcm, con codones de leucina adaptados, en combinación con mIL6.

pT1cM2L: plásmido para la expresión de la forma citoplásmica de M2e, con codones de leucina adaptados para L. lactis.

pT1cM2LC3d: expresión de cM2LC3d, con codones de leucina adaptados.

pT1cM2LC3d3: expresión de cM2LC3d3 (con tres dominios C3d consecutivos), con codones de leucina adaptados.

pT1sM2LX: plásmido para la expresión de la forma secretada y anclada de M2e, con codones de leucina adaptados para L. lactis.

pT1sM2LC3d: expresión de sM2LC3d, con codones de leucina adaptados.

pT1sM2LC3d3: expresión de sM2LC3d3 (con tres dominios C3d consecutivos), con codones de leucina adaptados.

20.3

pUCM2: plásmido que contiene el gen m2 ininterrumpido de A/Ann Arbor/6/60.

pCDNA3: vector básico para la expresión génica eucariótica.

pCIM2: plásmido usado para vacunaciones con ADN, lleva el gen m2 ininterrumpido de A/Ann Arbor/6/60.

pCIM2HBcm: plásmido usado para vacunaciones con ADN, lleva im2hbcm.

pCIP3M2HBCm: plásmido usado para vacunaciones con ADN, contiene tres veces el dominio extracelular de la proteína M2 fusionado genéticamente con la proteína del núcleo del virus de la hepatitis B. La proteína de fusión, IP3M2HBcm comienza con el extremo amino terminal corecto de M2e. La secuencia de M2 deriva de A/PR/8/34.

Sección experimental 1. Construcción de pATIPM2m

El segmento 7 de ARN del virus de la gripe de tipo A, A/PR/8/34 (H1N1), se clonó mediante un procedimiento como el descrito para el segmento 4 de ARN en Min Jou y col., 1980. El plásmido resultante se denominó pATIPMA y está disponible en el mercado (catálogo de LMBP de 1992, nº 1774).

El ARNm de la proteína M2 no es una transcripción colineal del segmento 7 de ARN. De hecho, tiene que eliminarse un intrón de 689 nucleótidos (Lamb y col., 1981).

En el plásmido pATIPMA, StuI corta detrás del primer nucleótido del segundo exón (véase la figura 1a). Este nucleótido se incluyó en los oligonucleótidos sintéticos que se usaron para codificar el primer exón. El primer exón sintético, que codifica el extremo amino terminal de la proteína M2 madura, se diseñó para contener la secuencia GATC protuberante de cadena sencilla en su extremo 5'. Esto nos permitía hacer la conexión con un sitio BamHI anterior en el vector pATIPMA y sustituir el primer exón original.

Además se optimizó el uso de codones para la expresión en E. coli.

A continuación, introdujimos mediante mutagénesis dirigida a sitio (Stanssens y col., 1989) un sitio BclI en la unión entre la parte extracelular y la región de anclaje a membrana de la proteína M2 (véase la figura 1b). No se cambió la secuencia de aminoácidos de la parte extracelular. El plásmido resultante, pATIPM2m1, lleva el gen m2 ininterrumpido de A/PR/8/34.

2. Construcción de IPM2hB2Mm

Parker y Wiley (1989) expresaron la \beta2-microglobulina humana en el periplasma de E. coli haciendo uso del plásmido p714. Este plásmido contiene la región codificadora de la \beta2-microglobulina precedida de la secuencia señal de la proteína A de la membrana externa de E. coli (OmpA-ss) (véase la figura 2a). La secuencia señal de OmpA es necesaria para la traslocación de la proteína, a la cual se fusiona esta secuencia, al periplasma. La secuencia señal se escinde después del transporte. En el plásmido p714, la \beta2-microglobulina humana está bajo el control tanto del promotor de la lipoproteína (lpp) como del de lacUV5. La adición de IPTG 1mM a un cultivo en fase semilogarítmica lleva a la producción de \beta2-microglobulina.

La secuencia codificadora de la parte extracelular de la proteína M2, aislada como un fragmento BamHI-BclI a partir de pATIPM2m1, se insertó entre la secuencia señal de ompA y la \beta2-microglobulina humana (para detalles véase la figura 2a). Debido a la construcción, había 9 nucleótidos adicionales entre el extremo de la secuencia señal de ompA y el inicio del fragmento m2, que tenían que ser eliminados (véase la figura 2b). Esto se hizo mediante mutagénesis por hibridación imperfecta según Nakamaye y Eckstein, 1986. Como resultado se obtuvo el plásmido pIPM2hB2Mm2s2.

3. Localización de IPM2hB2Mm

Un precultivo recién cultivado de C3000 que contenía p714 o pIPM2hB2Mm2s2 se diluyó 1/100 en LB con ampicilina. Como se describió anteriormente, los genes hb2m e imp2hb2mm están bajo el control del promotor lacUV5. Cuando los cultivos alcanzaron una densidad de aproximadamente 5,5 x 10^{8} bacterias/ml, se dividieron en dos y una mitad de cada cultivo se incubó con IPTG 1mM. Después de 3 h de inducción, se recogieron las bacterias y se fraccionaron. El periplasma de las bacterias se aisló mediante choque osmótico (Neu y Heppel, 1965). El resto de las bacterias se sonicaron (Vibra cell, Sonics & Materials Inc., Danbury, Conn., EE.UU.) y se centrifugaron durante 10 min a 16.000 g para aislar el citoplasma. Las diferentes muestras se analizaron en un gel PAGE al 15% con SDS. La B2M humana y la proteína de fusión IPM2hB2Mm se transportaron al periplasma, mientras que los precursores, que seguían conteniendo la secuencia señal, permanecían asociados a las bacterias. La determinación del extremo amino terminal de la IPM2hB2Mm madura (por cortesía del Dr. J. Vandekerckhove) mediante degradación de Edman automática en un secuenciador en fase gaseosa modelo 470A acoplado a un analizador en líneavde feniltiohidantoína de aminoácidos modelo 120A (Applied Biosystems, Foster City, CA., EE.UU.), demostró que la secuencia señal OmpA se escindió correctamente.

4. Purificación de IPM2hB2Mm

La proteína de fusión IPM2hB2Mm podía expresarse eficazmente en el periplasma de E. coli. Mientras que realizar un choque osmótico es un procedimiento crítico, especialmente en volúmenes grandes, Steidler y col. (1994) describieron previamente un elegante sistema basado en la expresión controlada de la proteína Kil para liberar proteínas periplásmicas al medio de cultivo.

El gen kil está presente en un plásmido compatible bajo el promotor P_{L} estrechamente regulado, el promotor complementario del fago \lambda (Remaut y col., 1981). El plásmido pcI857K1 también lleva el represor sensible a temperatura del promotor P_{L}, cI857. La proteína de fusión IPM2hB2Mm se sintetizó tras la inducción con IPTG 1 mM y al final de la fase de producción el cultivo se cambió de 28ºC a 42ºC para inducir a Kil.

Se llevó a cabo una fermentación (fermentador BioFlo IV, New Brunswick Scientific Co., Edison, N.J., EE.UU.) usando el procedimiento de inducción convencional descrito anteriormente. El cultivo se centrifugó en una centrífuga contífuga 17RS (Heraeus Instruments, Hanau, Alemania) a 11.000 g y se aisló el medio de cultivo. La concentración de cloruro sódico del medio de cultivo se ajustó a 300 mM y se tamponó con MES 20 mM (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico), pH 6,5. Esta solución se cargó en una columna de DEAE Sephacel (\Phi = 5 cm, h = 6,5 cm) equilibrada con MES 20 mM, pH 6,5 - NaCl 300 mM. En estas condiciones, IPM2hB2Mm no se unía a la matriz. La concentración de sulfato amónico del flujo a través se llevó a 0,8 M con una solución de (NH_{4})_{2}SO_{4} 3,8 M, pH 7. Se cargó la mezcla en una columna de Fenil Sepharose (\Phi = 5 cm, h = 17 cm) equilibrada en Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,8 M. Un gradiente de concentración decreciente de sulfato amónico que empezaba en 0,8 M e iba hasta 0, no liberaba la proteína de fusión unida. Esto se consiguió eluyendo la columna con un gradiente de pH desde Tris-HCl 20 mM, pH 7,5 a NaAc 5 mM, pH 5,5. Las fracciones del pico se mezclaron y se diluyeron diez veces en dietilamina (DEA) 20 mM, pH 8,5.

La mezcla completa se cargó en una columna de Sepharose Q (\Phi = 0,8 cm, h = 2,3 cm) equilibrada con DEA 20 mM, pH 8,5. La proteína se eluyó de la columna con un gradiente de sal de 0 a 1 M. Las fracciones del pico se mezclaron y se cargaron en una columna de filtración en gel Sephacryl S-100 (\Phi = 1,5 cm, h = 47 cm). Sólo se observó un pico con el peso molecular esperado de aproximadamente 15 kDa. Este IPM2hB2Mm purificado se usó para inmunizar ratones para la preparación de hibridomas que secreten anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína M2.

5. Producción de anticuerpos monoclonales contra la proteína M2

Se inmunizaron ratones Balb/c tres veces con 2,5 \mug de IPM2hB2Mm purificada. Para la primera inyección se usó una dosis completa de adyuvante Ribi. La segunda y tercera inmunización se realizaron en presencia de 50 mg de MPLA. Las inyecciones se dieron con un intervalo de tres semanas. Tres días después de la última inmunización, se aislaron las células de bazo y se fusionaron con células de mieloma SP2/0-AG14 usando procedimientos convencionales (Köhler y Milstein, 1975). La reactividad de los sobrenadantes de diferentes clones celulares productores de inmunoglobulinas contra la proteína de fusión IPM2HBcm (descrita adicionalmente) se analizó en ELISA y Western blot. La proteína del núcleo del virus de la hepatitis B solo se usó como control para eliminar clones falsos positivos. Se determinó el isotipo del anticuerpo (Isostrip, Boehringer, Mannheim, Alemania). Se obtuvieron dos subtipos diferentes de inmunoglobulina que reconocían la parte extracelular de la proteína M2, una IgM y otra IgG2a. Especialmente se usó el anticuerpo IgG2a en experimentos adicionales.

6. Expresión de HBc e IPM2HBcm

La expresión de proteínas bajo el control del promotor P_{L} se realizó cambiando un cultivo en crecimiento exponencial de 28ºC a 42ºC (Remaut y col., 1981). Un precultivo saturado de MC1061 [pcI857] que contenía el plásmido pPLc245 (control), pPLcA1 (portador del gen hbc) o pPLcIPM2HBcm (que contenía el gen de fusión ipm2hbc), respectivamente, se diluyó 1/100 en medio LB (kanamicina a 50 \mug/ml y ampicilina a 100 \mug/ml) y se cultivó durante aproximadamente 4 h a 28ºC con agitación. Cuando los cultivos alcanzaron una densidad de 4,5 x 10^{8} a 5,5 x 10^{8} bacterias/ml, se dividieron y una mitad se incubó durante 4 h a 28ºC y la otra mitad se cambió a 42ºC. Las bacterias se concentraron mediante centrifugación (2 min a 16.000 g en una microcentrífuga).

Se eliminó el medio de cultivo y se resuspendieron las bacterias en tampón TE (Tris-HCl 10 mM - EDTA 1 mM, pH 7,6). Las bacterias se lisaron por sonicación (Vibra cell, Sonics & Materials Inc., Danbury, Conn. EE.UU.) y los restos bacterianos se sedimentaron durante 10 min a 16.000 g en una microcentrífuga. Se aisló el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en tampón TE. Las muestras se analizaron en un gel PAGE al 12,5% con SDS, en Western blot o en una transferencia puntiforme (dot blot).

7. Producción a gran escala de IPM2HBcm

La cepa MC1061 [pcI857, pPLcIPM2HBcm] se cultivó en un fermentador BioFlo IV (New Brunswick Scientific Co., Edison, N.J., EE.UU.). Cuando el cultivo alcanzó una densidad de 5,5 x 10^{8} células/ml, la temperatura se elevó a 42ºC. Después de tres horas de incubación, el cultivo se centrifugó en una centrífuga contífuga 17RS (Heraeus Instruments, Hanau, Alemania) a 11.000 g. Se recogieron las bacterias y se resuspendieron en un volumen (en ml) de tampón (Tris-HCl 50 mM, pH 8 - NaCl 150 mM - glicerol al 5% con un comprimido de una combinación de inhibidores de proteasas (Complete^{TM}; Boehringer, Mannheim, Alemania) por cada 25 ml) que correspondía a dos veces el peso (en g) de las bacterias sedimentadas. Esta suspensión se trató con lisozima a 1 mg/ml (recién disuelta en Tris-HCl 25 mM, pH 8) durante media hora en hielo. Posteriormente, las bacterias se lisaron con Triton X-100 al 0,2% en presencia de EDTA 25 mM, pH 8. Después de 30 min de incubación en hielo, los lisados se centrifugaron durante 1 h en un rotor Sorvall SS-34 (Du Pont Company, Wilmington, DE, EE.UU.) a 48.000 g. El sobrenadante se retiró y se usó para la purificación de IPM2HBcm.

8. Inmunización con IPM2HBcm

Se inyectaron ratones Balb/c tres veces por vía intraperitoneal con IPM2HBcm purificada en presencia de adyuvante. Los ratones control recibieron sólo tampón PBS, pH 7,4 y adyuvante. Para la primera inmunización se usó media dosis de adyuvante Ribi. En la segunda y tercera inyección se usaron 25 \mug de MPLA y 25 \mug de MDP.

Los ratones se inmunizaron tres veces por vía intranasal aplicando una ligera anestesia con éter, tras lo cual se pusieron en las fosas nasales 50 microlitos de solución de antígeno en tampón PBS (que contenía 10 microgramos de IPM2HBcm o de IM2HBcm sin ningún adyuvante).

9. Expresión en L. lactis

Las colonias individuales de la cepa MG 1363 de L. lactis que contenía el plásmido pT1HBc, pT1PM2HBc o pT1M2HBc, respectivamente, o los derivados con mIL2 (pT1HBcIL2, pT1PM2HBcIL2 y pT1M2HBcIL2) o mIL6 (pT1HBcIL6, pT1PM2HBcIL6 y pT1M2HBcIL6) se inocularon cada una en 10 ml de GM17E. Como control se usó MG1363 [pTREX1]. Las bacterias se cultivaron durante aproximadamente 16 h a 28ºC. Las células se recogieron mediante centrifugación a 2.000 g durante 20 min (Sorvall 11 RT6000 D). Se aisló el medio de cultivo y las bacterias se resuspendieron en 250 \mul de TE. Tras la resuspensión, se añadieron 250 \mul más de TE suplementado con lisozima a 10 mg/ml y mutanolisina a 200 U/ml. Esta mezcla se incubó durante 10 min a 37ºC y después, se puso en hielo durante 5 min. A continuación, se añadieron 500 \mul de tampón de muestra de Laemmli (Tris-HCl 100 mM, pH 6,8 - SDS al 5% - \beta-mercaptoetanol 1,2 M - azul de bromofenol al 0,008% - glicerol al 16%) y se hirvieron las muestras durante 5 min. Se analizó un equivalente de 1 ml de volumen de cultivo original, o 10^{9} bacterias en un gel PAGE al 12,5% con SDS. La producción de mIL2 y mIL6 en el sobrenadante del cultivo se evaluó en un bioensayo basado en la proliferación de células CTLL2 (mIL2, Gillis y col., 1978) o la proliferación de un hibridoma de células B, 7TD1 (mIL6, Van Snick y col., 1986).

10. Inmunización pasiva

Se usó la preparación purificada de partículas IM2HBcm para inmunizar ratones Balb/c hembras de 7 semanas de edad. Se inmunizaron un total de 40 ratones con 10 pg de IM2HBcm. Un grupo control de 40 ratones sólo recibió el tampón. Se dieron un total de tres inyecciones combinadas con el adyuvante apropiado a intervalos de tres semanas (véase Materiales y procedimientos). Dos semanas después de la tercera inmunización, se sangraron 28 ratones de cada grupo y se aisló el suero (véase Material y procedimientos). Este suero se administró por vía intraperitoneal a ratones vírgenes, 24 h antes de la infección. Este proceso se denomina inmunización pasiva. Veinte ratones recibieron 800 \mul de suero de ratones inmunizados con IM2HBcm y otros 12 ratones recibieron suero del grupo control. Estos 24 ratones, y los 24 ratones inmunizados restantes, se estimularon con 5 DL_{50} de X47 a.r. tres semanas después de la tercera inmunización. El virus se administró por vía intranasal en un volumen total de 50 \mul tras la anestesia con éter. La morbilidad se siguió midiendo la temperatura rectal y el peso cada dos días.

11. Construcciones para vacunaciones con ADN (Figura 29)

El vector de expresión de mamíferos, pCDNA3 (Invitrogen, Leek, Países Bajos), que lleva el promotor de citomegalovirus se usó para hacer los diferentes vectores para vacunación con ADN.

El gen m2 ininterrrumpido se aisló mediante RT-PCR a partir del virus de la gripe de tipo A A/Ann Arbor/6/60 (véase Materiales y procedimientos). El fragmento amplificado se cortó con BglII y XbaI y se insertó en pUC19 abierto con BglII y XbaI. Este plásmido se denominó pUCM2. Se determinó la secuencia del gen m2 y se demostró que corresponde con la forma adaptada al frío del gen. El gen m2 se aisló a partir de pUCM2 como un fragmento EcoRI-XbaI de 321 pb y se insertó en el plásmido pCDNA3 abierto con EcoRI y XbaI. Esto dio como resultado el plásmido pCIM2.

También se insertaron en pCDNA3 dos genes de fusión, ip3m2hbcm e im2hbcm. El gen im2hbcm se amplificó mediante PCR a partir de pPLcIM2HBcm. Este fragmento se cortó con SpeI y se fosforiló con polinucleótido quinasa de T4. Este fragmento de 630 pb se insertó en pCDNA3 abierto con EcoRV y XbaI. El plásmido resultante se denominó pCIM2HBcm.

Durante la construcción de pPLcIPM2HBcm (véase la figura 3a), se obtuvieron también plásmidos con dos y tres fragmentos M2e insertados. Estos plásmidos se denominaron pPLcIP2M2HBc y pPLcIP3M2HBc, respectivamente. El gen ip3m2hbcm se amplificó mediante PCR a partir de pPLcIP3M2HBc. Este fragmento se cortó con SpeI, se fosforiló con la polinucleótido quinasa de T4 y se insertó en pCDNA3 abierto con EcoRV y XbaI. Este plásmido se denominó pCIP3M2HBcm.

El ADN plasmídico se aisló con un kit EndoFree Plasmid Giga (Qiagen, Hilden, Alemania). La concentración de ADNp se determinó mediante análisis espectrofotométrico.

12. Expresión en células HEKT

Los plásmidos pCDNA3, pCIM2, pCIM2HBcm y pCIP3M2HBcm se transfectaron en células HEKT (véase Materiales y procedimientos). Las células se lisaron 48 h después de la transfección y se analizaron en un experimento de Western blot.

13. Análisis del suero

Dos semanas después de cada inmunización se tomaron muestras de suero y se analizaron en un ELISA. En el panel A de la figura 31 se comparan los dos vectores que pueden expresar las proteínas de fusión de HBc con el vector control. El ELISA se realizó como se describe en Materiales y procedimientos.

Resultados 1. Construcción de IPM2HBcm

El plásmido pPLcA1 (véase la figura 3a) contiene el gen de la proteína del núcleo del virus de la hepatitis B (hbc) bajo el control del promotor de P_{L} del bacteriofago \lambda (cedido por el Dr. Nassal). El fragmento NcoI-XbaI de 346 pb, aislado a partir de pPLcA1, se insertó en pMa581 abierto con NcoI y XbaI, un derivado de pMa58. Este plásmido se denominó pMaHBc. En el extremo 5' de la proteína del núcleo del virus de la hepatitis B, directamente a continuación del codon de inicio, introdujimos un sitio BamHI mediante mutagénesis dirigida a sitio (Stanssens
y col., 1989), colocado correctamente en la fase de lectura abierta de HBc (para detalles véanse las figuras 3a y b). El plásmido resultante se denominó pMaHBcm. La información que codifica la parte extracelular de la proteína M2 se clonó como un fragmento BamHI-BclI de 72 pb, derivado a partir de pATIPM2m1, en pMaHBcm abierto con BamHI, dando como resultado el vector pIPM2HBc. A continuación se sustituyó el gen hbc en el vector de expresión pPLcA1 por el fragmento NcoI-XbaI de 418 pb de m2hbc, creando pPLcIPM2HBc. Debido a la construcción, se presentaron cuatro aminoácidos extra entre la primera metionina y el inicio de la parte extracelular de la proteína M2 y tuvieron que ser eliminados (véase la figura 3c). Esto se hizo mediante mutagénesis por hibridación imperfecta (Deng y Nickolov, 1992). El plásmido resultante se denominó pPLcIPM2HBcm (véanse las figuras 3a y c).

2. Expresión de la proteína de fusión

Los plásmidos pPLc245 (control), pPLcA1 (gen hbc) y pPLcIPM2HBcm (gen ipm2hbc) se transformaron en MC1061 [pcI857]. Tras el cultivo e inducción, las bacterias se lisaron mediante sonicación. Los lisados se centrifugaron y se cargó una alícuota de los sobrenadantes en un gel PAGE al 12,5% con SDS (véase la figura 4). Las mismas fracciones también se analizaron por inmunotrasferencia. Se usaron dos anticuerpos monoclonales: un anticuerpo específico de la proteína del núcleo del virus de la hepatitis B y un anticuerpo monoclonal (IgG2a) dirigido contra la parte extracelular de la proteína M2.

El anticuerpo monoclonal contra la proteína del núcleo del virus de la hepatitis B reveló dos bandas diferentes (véase la figura 5A), una que correspondía a la proteína del núcleo del virus de la hepatitis B y otra a la proteína de fusión. La última proteína tiene una movilidad más baja, que corresponde a la inserción del dominio extracelular de la proteína M2. La presencia del fragmento M2 se confirmó usando el anticuerpo específico de la parte extracelular de la proteína M2 (véase la figura 5B).

La secuencia de aminoácidos del extremo N-terminal de IPM2HBcm (Dr. J. Vandekerckhove) se determinó mediante degradación de Edman automática en un secuenciador de fase gaseosa modelo 470A acoplado a un analizador en línea de feniltiohidantoína de aminoácidos modelo 120A (Applied Biosystems, Foster City, CA., EE.UU.). Este análisis reveló la secuencia N-terminal Ser-Leu-Leu que es exactamente la misma que la secuencia amino terminal de la proteína M2 del virus de la gripe de tipo A (figura 6). El primer aminoácido, metionina, se eliminó en E. coli. De este modo, el extremo amino terminal de la proteína de fusión corresponde con el de la proteína M2 de tipo silvestre (tabla 1; Lamb y col., 1985).

La proteína del núcleo del virus de la hepatitis B, también cuando se expresaba en E. coli, se asocia espontáneamente para formar partículas, indistinguibles de las partículas del núcleo viral que circulan en la sangre de pacientes infectados con el virus de la hepatitis B (Cohen y Richmond, 1982). Clarke y colaboradores (1987) demostraron que un péptido insertado en el extremo amino terminal de la proteína del núcleo del virus de la hepatitis B podía detectarse en la superficie de la partícula.

Las fotografías de microscopía electrónica (Dr. G. Engler) mostraron que la proteína de fusión IPM2HBcm era capaz de formar partículas similares. Para investigar si la inserción de la parte extracelular de la proteína M2 tenía como resultado la localización superficial de este fragmento, se cargaron fracciones solubles que contenían HBc o IPM2HBcm en una membrana de nitrocelulosa en una transferencia puntiforme. Las transferencias puntiformes se trataron con un anticuerpo monoclonal dirigido contra HBc o contra M2. La figura 7 muestra claramente una señal en la fracción soluble de pPLcIPM2HBcm, cuando se revelaba con el anticuerpo dirigido contra la proteína M2 (panel B). Puesto que la fracción soluble se cargó en un estado nativo en la membrana de nitrocelulosa, concluimos que el epítope está localizado en la superficie de la partícula del núcleo del virus de la hepatitis B.

3. Purificación de IPM2HBcm

Los lisados bacterianos se prepararon como se describe en Materiales y procedimientos. La concentración de Tris-HCl, pH 8 y NaCl se ajustó a 20 mM y 50 mM, respectivamente. Esta mezcla se cargó en una columna de DEAE Sepharose (\Phi = 2,5 cm, h = 5,5 cm) equilibrada con Tris-HCl 20 mM, pH 8 - NaCl 50 mM. La proteína de fusión no era retenida por la columna. Al flujo a través de la columna se añadió (NH_{4})_{2}SO_{4} 3,8 M, pH 7 a una concentración final de 1,2 M. Esta mezcla se incubó con agitación en la cámara fría durante 16 h. El precipitado se eliminó en una columna de celulosa CF11 (\Phi = 2,5 cm, h = 3,5 cm). La columna se eluyó con PBS, pH 7,4. Los aproximadamente 50 ml de eluido se concentraron en un Centiprep 30 (Amicon Corporation, Danvers, I11., EE.UU.) hasta 5 ml y se cargaron en una columna de Sephacryl S-300 (\Phi = 2,5 cm, h = 91 cm), que se equilibró con PBS, pH 7,4. Las fracciones del pico se mezclaron y la concentración de IPM2HBcm se determinó en un ELISA. Se analizó el contenido de LPS (LAL Coatest® Endotoxin adquirido de Endosafe Inc., Charleston, SC., EE.UU.) y era suficientemente bajo (5 a 9 ng/50 \mug de IPM2HBcm) como para no interferir con la inmunización.

4. Inmunización

La preparación purificada de partículas de IPM2HBcm se usó para inmunizar ratones Balb/c hembras de 7 semanas de edad. Se evaluaron cuatro grupos diferentes de 12 ratones. El primer grupo recibió 50 \mug de IPM2HBcm, el segundo 10 \mug, el tercero 5 \mug y el cuarto, un grupo control, sólo recibió tampón con adyuvante. Se dieron un total de tres inyecciones con el adyuvante apropiado. Las inyecciones se administraron a intervalos de tres semanas. Tres semanas después de la última inoculación, los ratones se estimularon con 5 DL_{50} de A/PR/8/34 a.r.. El virus se administró por vía intranasal en un volumen total de 50 \mul tras la anestesia con éter. La morbilidad se siguió midiendo la temperatura rectal (figura 8 A1) y el peso (figura 8 A2) cada dos días.

Todos los ratones inmunizados con IPM2HBcm mostraron un grado significativo de protección contra la estimulación posterior con el virus de la gripe. Dependiendo de la dosis administrada, 9 a 11 ratones de los 12 sobrevivieron a la infección con el virus de la gripe, frente a sólo 2 de los 11 del grupo control (véase la figura 8B).

5. Análisis de las muestras de suero

Se tomaron muestras de sangre un día antes de la primera inyección (sangrado a) y dos semanas después de cada inyección (sangrados b, c y d). Tres semanas después de la estimulación, cuando los ratones se habían recuperado suficientemente de la infección con el virus de la gripe, se tomó una última muestra de sangre (e). El suero se analizó en un ELISA (véase Materiales y procedimientos) para identificar anticuerpos IgG dirigidos contra la parte extracelular de la proteína M2. Para ello, hicimos uso de la otra proteína de fusión, IPM2hB2Mm. Una mitad de la placa de microvaloración se cubrió con \beta2-microglobulina humana, la otra mitad se cubrió con la proteína de fusión IPM2hB2Mm, ambas como sobrenadante de cultivo sin purificar. La concentración de IPM2hB2Mm usada fue 1 \mug/ml. Se usó la misma concentración de proteína total en ambas preparaciones. Por tanto, tuvo que ajustarse el contenido de hB2M en el sobrenadante del cultivo de bacterias que expresan hB2M a 1 \mug/ml añadiendo hB2M purificada (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., EE.UU.). Se cargaron diluciones seriadas (1/3) de las diferentes muestras de suero, comenzando desde 1/50 en los pocillos cubiertos con la hB2M e IPM2hB2Mm. El ELISA se desarrolló como se describe en Materiales y procedimientos.

Para obtener el valor de la reactividad específica contra la parte extracelular de la proteína M2, la absorbancia de hB2M a una dilución determinada se restó de la absorbancia de IPM2hB2Mm a la dilución correspondiente. La figura 9 demuestra claramente una elevada respuesta anticorpal contra la parte extracelular de la proteína M2 en los ratones que recibieron tres inyecciones con la vacuna. El valor en el suero se incrementaba adicionalmente tras la estimulación.

6. Construcción de IM2HBcm

El objetivo de la presente invención es hacer una vacuna universal contra los virus de la gripe de tipo A. En los estudios de vacunación descritos anteriormente, demostramos protección contra el virus de la gripe del que derivaba la secuencia original de M2, A/PR/8/34 (protección homóloga). La parte extracelular de la proteína M2 de este virus difiere de la mayoría de los demás virus secuenciados hasta la fecha sólo en un aminoácido (véase la tabla 1). Por tanto, se hizo una construcción en la que la glicina de la posición 20 se cambió por ácido aspártico.

Para ello, hicimos uso de un vector intermedio en la construcción de pPLcIPM2HBcm, pMaIPM2HBc2 (véase la figura 3a). El plásmido pMaIPM2HBc2 ya no contiene el fragmento m2 mutado (deleción de 12 nucleótidos extra) que comienza en el primer codon maduro de la proteína M2. Por tanto, este fragmento se aisló a partir de pPLcIPM2HBcm cortando con SgrAI y EcoRI. Este fragmento SrgAI-EcoRI de 499 pb se clonó en el vector pMaIPM2HBc2 abierto con SgrAI y EcoRI, que dio como resultado la construcción de pMaIPM2HBc3 (véase la figura 10).

Mediante mutagénesis dirigida a sitio según Deng y Nickoloff (1992) la secuencia de la parte extracelular de la proteína M2 se cambió por la secuencia M2 más universal (Gly20 \rightarrow Asp). El nuevo plásmido se denominó pIM2HBcm. La secuencia se determinó en un secuenciador modelo 373A (Applied Biosystems, Foster city, CA., EE.UU.) y se demostró que contenía la mutación deseada. El fragmento M2 mutado se aisló a partir de pIM2HBcm como un fragmento SgrAI-EcoRI de 499 pb y se reintrodujo en el vector de expresión pPLcIPM2HBcm, abierto con SgrAI y EcoRI, para crear pPLcIM2HBcm.

7. Expresión de IM2HBcm

La cepa MC1061 [pcI857] que contenía respectivamente pPLc245, pPLcA1, pPLcIPM2HBcm o pPLcIM2HBcm se cultivó como se describe en la sección experimental. Las bacterias se recogieron y se lisaron por sonicación. Se aisló la fracción soluble y se determinó en un ELISA la concentración de proteína del núcleo del virus de la hepatitis B o de las proteínas de fusión derivadas. Una fracción soluble que contenía 5 \mug de HBc o I(P)M2HBcm se analizó en un gel PAGE al 12,5% con SDS (véase la figura 11). También se analizaron las mismas fracciones en Western blot (véase la figura 12). Las proteínas de interés se detectaron con un anticuerpo dirigido contra la proteína del núcleo del virus de la hepatitis B o con el anticuerpo monoclonal específico de la parte extracelular de la proteína M2. Puede concluirse que la nueva proteína de fusión, IM2HBcm, se expresa tan eficazmente como IPM2HBcm. Además, el cambio de aminoácido en la parte extracelular de la proteína M2 (Gly20 \rightarrow Asp) no tiene efecto sobre la unión del anticuerpo monoclonal anti-M2.

8. Inmunización contra la estimulación heteróloga

Para analizar la eficacia de IPM2HBcm e IM2HBcm para proteger a los ratones frente a la estimulación heteróloga con el virus de la gripe se usó un procedimiento similar al descrito en el punto 4. Para la inmunización se usaron 10 microgramos de IPM2HBcm o IM2HBcm (purificada de forma idéntica a IPM2HBcm). Los ratones se estimularon con 30 UHA de X-47.

Todos los ratones inmunizados mostraron un grado significativo de protección contra la estimulación heteróloga. Ocho (en el caso de IPM2HBcm, p<0,05) o 12 (en el caso de IM2HBcm, p<0,0001) ratones de 12 sobrevivieron a la infección con el virus de la gripe, frente a sólo 2 de 11 en el grupo control (figura 8C).

Para analizar el efecto de la administración intranasal, se siguió el mismo procedimiento, pero en lugar de la inyección intraperitoneal el antígeno se administró por vía intranasal. También en este caso, es evidente la protección: 12 (en el caso de IPM2HBcm, p<0,0001) u 11 (en el caso de IM2HBcm, p<0,001) ratones de 12 sobrevivieron a la infección con el virus de la gripe, frente a sólo 2 de 11 en el grupo control (figura 8D).

9. Construcción de vectores para la expresión de proteínas de fusión M2-HBc en L. lactis

El plásmido pTREX1 (Wells y Schofield, 1996) se usó para expresar en Lactococcus lactis la proteína del núcleo del virus de la hepatitis B y dos proteínas de fusión M2-HBc, IPM2HBcm e IM2HBcm. Este plásmido tiene un promotor cromosómico constitutivo de L. lactis, P1, que continúa con la región de iniciación de la traducción del gen 10 del bacteriófago T7 de E. coli (Wells y Schofield, 1996). El terminador de la transcripción deriva de la ARN polimerasa de T7. El plásmido pTREX1 también lleva dos genes de resistencia a eritromicina.

El plásmido de expresión, pTREX1, se cortó con SphI, dejando una extensión 3'CATG que se retiraron con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa. Los nucleótidos retirados se incluyeron en el enlazador sentido para la amplificación por PCR de los diferentes genes. A continuación el vector linearizado se cortó con BamHI y se trató con FIT (fosfatasa intestinal de ternera, Boehringer, Mannheim, Alemania).

Los genes hbc, ipm2hbc e im2hbc se amplificaron mediante PCR (véase Materiales y procedimientos). El enlazador complementario (HBcc) fue idéntico en todas las amplificaciones y proporcionó un sitio SpeI y un sitio BclI tras el codon de terminación (véase la figura 13). Para la amplificación de ipm2hbc e im2hbc se pudo usar el mismo oligonucleótido sentido (M2s), ya que la mutación Gly \rightarrow Asp en la parte extracelular de la proteína M2 se localiza aún más allá del extremo 3'.

La amplificación de hbc a partir de pPLcA1 sólo era posible tras la linearización con ScaI. Para una clonación adicional, se usó la reacción de amplificación que producía una cantidad suficiente de fragmento, en las condiciones más rigurosas. El fragmento amplificado, hbc, ipm2hbc o im2hbc se cortó con BclI, se fosforiló con la polinucleótido quinasa de T4 y se insertó en pTREX1 abierto con SphI y BamHI (véase la figura 14). Los nuevos plásmidos se denominaron respectivamente, pT1HBc, pT1PM2HBc (en el que la parte extracelular de la proteína M2 deriva del virus A/PR/8/34) y pT1M2HBc (en el que la secuencia de la parte extracelular de la proteína M2 corresponde con el tipo presente en casi todos los tipos de virus de la gripe de tipo A secuenciados hasta la fecha). La secuencia del fragmento insertado se determinó en un secuenciador modelo 373A (Applied Biosystems, Forter City, CA., EE.UU.) y se mostró que era correcta.

Con el fin de usar Lactococcus lactis como vehículo de distribución mejorado de la vacuna, se insertaron dos citoquinas murinas, interleucina 2 (mIL2) e interleucina 6 (mIL6) como segundos cistrones en el mismo operón que el antígeno. De esa forma, pudimos obtener bacterias que expresaban el antígeno, por ejemplo, IM2HBcm, junto con interleucina 2 ó 6 murina secretada. Para obtener la secreción de las interleucinas al medio de cultivo, se fusionaron en fase con el péptido señal de secreción de usp45 de lactococcus (van Asseldonk y col., 1990). Los plásmidos pT1HBc, pT1PM2HBc y pT1M2HBc se cortaron con SpeI y se trataron con FIP. El gen de la interleucina 2 murina se aisló como un fragmento XbaI-SpeI de 572 pb a partir del plásmido pL2MIL2 (Steidler y col., 1995). Este fragmento se insertó en pT1HBc, pT1PM2HBc y pT1M2HBc abiertos con SpeI, dando lugar a pT1HBcIL2, pT1PM2HBcIL2 y pT1M2HBcIL2, respectivamente. De forma análoga, se aisló el gen de la interleucina 6 murina como un fragmento XbaI-SpeI de 687 pb a partir de pL2MIL6 (Steidler y col., 1996) y se insertó en los vectores pT1HBc, pT1PM2HBc y pT1M2HBc abiertos con SpeI para crear pT1HBcIL6, pT1PM2HBcIL6 y pT1M2HBcIL6, respec-
tivamente.

10. Expresión de HBc y M2HBc en L. lactis

La cepa MG1363 de Lactococcus lactis (Gasson, 1983) que contenía los plásmidos para la expresión del antígeno solo (pT1HBc, pT1PM2HBc y pT1M2HBc) o en combinación con la interleucina 2 de ratón (pT1HBcIL2, pT1PM2HBcIL2 y pT1M2HBcIL2) o interleucina 6 de ratón (pT1HBcIL6, pT1PM2HBcIL6 y pT1M2HBcIL6) se cultivaron como se describe en Materiales y procedimientos. Se usó MG1363 [pTREX1] como control.

Se analizó un equivalente de 10^{9} bacterias en PAGE al 12,5% con SDS. La expresión de la proteína del núcleo del virus de la hepatitis B y de las proteínas de fusión M2-HBc se analizó mediante Western blot (véase la figura 15) realizada como se describe en Materiales y procedimientos. La expresión de IM2HBc en MG1363 [pT1M2HBcIL6] no era tan elevada como en las otras construcciones. Seleccionando diferentes colonias se pudo aislar un clon con niveles de expresión comparables.

La producción y secreción de interleucinas en el medio de cultivo se analizó en un ensayo biológico. La actividad biológica de mIL2 se valoró mediante la proliferación de una línea de células T, CTLL2 (Gillis y col., 1978) comparada con un patrón de IL2 humana. La actividad biológica de mIL6 se midió mediante la proliferación de un hibridoma de células B, 7TD1 (Van Snick y col., 1986). La tabla 2 proporciona una vista general del nivel de interleucina 2 y 6
por ml de medio de cultivo producido por los diferentes plásmidos de expresión. Los sobrenadantes de los cultivos que producían IL6 no inducían proliferación en un ensayo de mIL2 y viceversa.

TABLA 2

Plásmido	producción de mIL2	producción de mIL6
pT1HBcIL2	410 ng/ml	-
pT1PM2HBcIL2	481 ng/ml	-
pT1M2HBcIL2	359 ng/ml	-
pT1HBcIL6	-	1020 ng/ml
pT1PM2HBcIL6	-	772 ng/ml
pT1M2HBcIL6	-	802 ng/ml

11. Adaptación de la secuencia codificadora de M2e para la expresión en L. lactis

Puesto que las dos proteínas de fusión, IPM2HBcm e IM2HBcm apenas podían detectarse en Western blot, procedimos a aumentar la producción de estas dos proteínas de fusión adaptando el uso de codones de la parte extracelular de la proteína M2 en L. lactis (van de Guchte y col., 1992).

En el extremo 5' de la parte extracelular de la proteína M2 observamos dos codones consecutivos de leucina (CUG CUG) que eran óptimos para la expresión en E. coli (68%), pero deficientes para la traducción en L. lactis (8%, porcentajes descritos en van de Guchte y col., 1992). Por tanto, estos codones se cambiaron por UUA. Los genes para ipm2hbc e im2hbc se amplificaron mediante PCR a partir de pPLcIPM2HBcm o pPLcIM2HBcm, respectivamente, con un nuevo cebador sentido, M2Ls, que contenía los dos codones de leucina cambiados (véase la figura 13). Como cebador complementario usamos de nuevo HBcc (véase la figura 13). La clonación de los genes fue análoga a la representada en la figura 14. Los vectores creados de este modo se denominaron pT1PM2LHBc y pT1M2LHBc.

El nivel de expresión de las proteínas M2HBc mutadas, comparado con el de las proteínas de fusión original se analizó en Western blot (véase la figura 16). El nivel de expresión de las proteínas de fusión M2HBc con los codones de leucina adaptados para L. lactis, era de hecho superior. Se concluyó que la adaptación del uso de codones a la maquinaria de traducción de L. lactis, tenia un efecto positivo sobre el nivel de proteína producida. De forma similar a la descrita anteriormente, el gen de la interleucina 6 murina se insertó en pT1PM2LHBc y en pT1M2LHBc, dando lugar a pT1PM2LHBcIL6 y pT1M2LHBcIL6, respectivamente.

12. Construcción de M2C3d en Lactococcus lactis

Una segunda proteína vehículo, C3d, es también una molécula atractiva para la presentación de la parte extracelular de la proteína M2. Dempsey y col. (1996) demostraron que la unión de un antígeno a tres moléculas consecutivas de C3d era mucho más eficaz para producir una respuesta anticorpal elevada que el antígeno administrado con adyuvante completo de Freund.

La secuencia universal de la parte extracelular de la proteína M2, con los codones de leucina adaptados, se usó para hacer una fusión con el extremo amino terminal de la primera molécula C3d. Se construyeron las secuencias codificadoras de tres proteínas de fusión diferentes. En el primer ejemplo, la proteína de fusión M2C3d3 se expresa en el citoplasma de L. lactis (cM2C3d3), similar a las proteínas de fusión M2HBc. En el segundo caso, la proteína M2C3d3 se secreta en el medio de cultivo haciendo una fusión en fase con la secuencia señal de usp45 (sM2C3d3), y la última construcción, que es un derivado de la forma secretada además contiene, una secuencia de anclaje (spaX) tras la última molécula C3d para unir covalentemente la proteína de fusión a la pared celular (sM2C3d3X).

El fragmento C3d3 amplificado se subclonó en primer lugar en un derivado de pUC18, concretamente pUCB/S. pUC18 se linearizó con HindII y se insertó un enlazador BglII. A continuación, el plásmido resultante se abrió con SmaI y se insertó un enlazador SpeI, dando como resultado el plásmido pUCB/S (véase la figura 18). Se amplificaron tres copias sucesivas de C3d a partir de pSG5.C3d3.YL (cedido por el Dr. D. Fearon) mediante PCR con los oligonucleótidos C3ds y C3dc (véase la figura 17). Este fragmento amplificado se cortó con BglII y SpeI. El fragmento BglII-SpeI resultante de 2830 pb se clonó en el vector pUCB/S abierto con BglII y SpeI (véase la figura 18). Los genes cm2 y sm2 se amplificaron mediante PCR. Para la amplificación de cm2 se usó el oligonucleótido sentido M2Ls (véase la figura 13) y el enlazador complementario M2Cc que, para nuestros propósitos, portaba un sitio BamHI en la fase de lectura correcta (véase al figura 17). Se usó el mismo enlazador complementario para la amplificación de sm2. El oligonucleótido sentido para la amplificación de sm2, M2LSs, comenzaba en el primer codon de la proteína M2 madura.

Para la síntesis de la forma citoplásmica de M2C3d3, la información que codifica la parte extracelular de la proteína M2 se insertó en pTREX1 de forma análoga a la del gen m2hbc descrita anteriormente (véase la figura 18). El fragmento cm2 amplificado se cortó con BamHI (77 pb), se fosforiló con la polinucleótido quinasa de T4 y se insertó en pTREX1 abierto con SphI y BamHI, creando pT1cM2L. Para la síntesis de las formas secretada y anclada de M2C3d3, la información que codifica la parte extracelular de la proteína M2 se insertó en pT1NX. El vector pT1NX lleva la secuencia señal de usp45 (usp45-ss) y la secuencia de anclaje derivada de la proteína A de Staphylococcus aureus (spaX). El plásmido pT1NX se cortó con NaeI, colocado correctamente en el extremo de la usp45-ss, y con BamHI. El fragmento amplificado, sm2, se cortó con BamHI y se fosforiló con la polinucleótido quinasa de T4. Este fragmento sm2 de 73 pb se insertó en pT1NX abierto con NaeI y BamHI, dando como resultado el plásmido pT1sM2LX (véase la figura 18). A continuación, puede insertarse en el sitio BamHI en el extremo de la secuencia de cm2 o sm2 un único fragmento C3d, aislado de pUCC3d. Después, puede insertarse una o dos copias adicionales de C3d.

13. Construcción de M2TTFC en Lactococcus lactis

También se puede usar una tercera proteína vehículo, el fragmento C de la toxina tetánica (TTFC). TTFC ya ha sido expresado en L. lactis bajo el control del promotor P1, pT1TT (Wells y Schofield, 1996). El L. lactis que expresaba TTFC en combinación con mIL2 o mIL6 para provocar la producción de anticuerpos, se usó con éxito en experimentos de inmunización (Patente de GB 9521568.7). Como control positivo para el análisis de la respuesta anticorpal en los presentes experimentos de inmunización con L. lactis que expresaba I(P)M2HBcm, se hizo una fusión entre la parte extracelular de la proteína M2 y el extremo amino terminal de TTFC.

El gen ttfc se amplificó mediante PCR (véase Materiales y procedimientos) a partir de pT1TT. El oligonucleótido sentido (TTFCs) proporcionó un sitio BamHI, colocado en la fase de lectura correcta, antes del segundo codon de ttfc que corresponde a treonina. El enlazador complementario (TTFCc) proporcionó un sitio SpeI y un sitio BamHI después del codon de terminación (véase la figura 19). La reacción de amplificación que producía una cantidad suficiente de fragmento, en las condiciones más rigurosas, se usó para una clonación adicional (véase Materiales y procedimientos). El fragmento ttfc amplificado se cortó con BamHI, se fosforiló con la polinucleótido quinasa de T4 y se insertó en pATIPM2ml abierto con BclI (véase la figura 20). La construcción plasmídica se denominó pATIPM2TT. A partir de este plásmido, el gen m2ttfc se amplificó mediante PCR (véase Materiales y procedimientos) con M2Ls y TTFCc (véase la figura 19). El fragmento m2ttfc amplificado se cortó con BamHI, se fosforiló con la polinucleótido quinasa de T4 y se insertó en pTREX1 abierto con SphI y BamHI (véase la figura 20). El nuevo plásmido se denominó pT1PM2LTT. En esta construcción, la parte extracelular de la proteína M2 deriva del virus A/PR/8/34, con los dos codones de leucina adaptados para su uso en L. lactis. La secuencia del fragmento insertado se determinó en un secuenciador modelo 373A (Applied Biosystems, Foster City, CA., EE.UU.) y se demostró que era correcta.

Los genes de interleucina murina, mIL2 y mIL6, se insertaron en el mismo operón que m2ttfc. El gen de la interleucina 2 murina se aisló como un fragmento XbaI-SpeI de 572 pb a partir del plásmido pL2MIL2 (Steidler y col., 1995). Este fragmento se insertó en pT1PM2LTT abierto con SpeI, dando lugar a pT1PM2LTTIL2 (véase la figura 20). De forma análoga, se aisló el gen de la interleucina 6 murina como un fragmento XbaI-SpeI de 687 pb a partir de pL2MIL6 (Steidler y col., 1996) y se insertó en el vector pT1PM2LTT abierto con SpeI para crear pT1PM2LTTIL6 (véase la figura 20).

14. Expresión de TTFC y M2TTFC en L. lactis

La cepa MG1363 de Lactococcus lactis (Gasson, 1983) que contenía los plásmidos para la expresión del antígeno solo (pT1PM2LTT) o en combinación con la interleucina 2 de ratón (pT1PM2LTTIL2) o interleucina 6 de ratón (pT1PM2LTTIL6) se cultivaron como se describe en Materiales y procedimientos. Se usó MG1363 [pT1TT] como control. Se analizó un equivalente de 10^{9} bacterias en PAGE al 10% con SDS. La expresión de la proteína de fusión IPM2TTFC se analizó mediante Western blot (véase la figura 21) realizada como se describe en Materiales y procedimientos. La producción y secreción de interleucinas en el medio de cultivo se analizó mediante un ensayo biológico. L. lactis [pT1PM2LTTIL2] producía aproximadamente 500 ng/ml de mIL2 y L. lactis [pT1PM2LTTIL6] aproximadamente 1 \mug/ml de mIL6. Estos resultados son comparables con los niveles de expresión obtenidos con I(P)M2HBcm en combinación con las dos interleucinas.

15. Construcción de pACsgpM2C3d3 y generación del baculovirus recombinante correspondiente

La secuencia amplificada de la señal de secreción de gp67 de baculovirus se cortó con SpeI y HindIII, y a continuación se subclonó en el fragmento SpeI-HindIII del vector pUCC3d, dando como resultado pUCsgp. Tras la digestión de pUCsgp con HindIII y NaeI, la señal de secreción de gp67 se ligó con un fragmento de M2e tratado con HindIII (secuencia universal) obtenido a partir de una amplificación por PCR (cebadores M2Ss y UM2ECc). Esta construcción, denominada como pUCsgpM2, se digirió con BamHI y posteriormente se recircularizó mediante ligamiento con el fragmento BglII-BamHI de pUCC3d3 que contenía 3 fragmentos C3d consecutivos, produciendo pUCsgpM2C3d3.

El último fragmento se escindió tras el ligamiento del fragmento BamHI (desfosforilado)-EcoRI de pUCC3d, el fragmento BglII (desfosforilado)-EcoRI de pUCC3d y el fragmento BglII-BamHI de pUCC3d. A continuación, el fragmento SpeI de pUCsgpM2C3d3, que contenía la secuencia de fusión sgpM2C3d3, se insertó detrás del promotor de polihedrina por intercambio con el fragmento SpeI-XbaI del vector de transferencia de baculovirus pACGP67A. El vector de transferencia resultante, denominado pACsgpM2C3d3, se usó entonces para generar el baculovirus AcNPV/sgpM2C3d3 recombinante mediante cotransfección con fosfato de calcio de células de insecto Sf9 con ADN del baculovirus BaculoGold (Pharmingen, San Diego, CA, EE.UU.), siguiendo el procedimiento descrito en King y Possee (1992). La presencia de la secuencia de fusión sgpM2C3d3 detrás del promotor de polihedrina en el genoma del correspondiente baculovirus AcNPV/sgpM2C3d3 recombinante se confirmó mediante análisis por PCR.

16. Expresión de M2C3d3 secretada por células de insecto Sf9

Se inocularon células de insecto Sf9 en fase logarítmica con el baculovirus AcNPV/sgpM2C3d3 recombinante a una alta multiplicidad de infección (>10). Posteriormente, las células se transfirieron a medio TC100 sin suero y se incubaron adicionalmente durante 48 h antes de recoger el sobrenadante. Las proteínas se precipitaron añadiendo un volumen igual de acetona (preequilibrada a -20ºC) y posteriormente, se analizaron mediante Western blot.

En una construcción preferida, tres o más copias de la proteína C3d están precedidas del dominio extracelular de la proteína M2.

17. Inmunización pasiva

En la figura 28 se muestra la supervivencia. En ambos grupos control sólo un ratón de 12 sobrevivió a la estimulación letal con virus de la gripe, mientras que 11 de 12 ratones inmunizados con 3 x 10 pg de IM2HBcm o todos los ratones inmunizados pasivamente estaban protegidos. Este experimento demuestra que los anticuerpos anti-M2 producidos durante la vacunación eran los responsables de la protección observada.

18. Vacunación con ADN

La tabla 3 muestra los resultados de un experimento de vacunación con ADN en el que se comparó la supervivencia ante una estimulación letal (5 DL_{50}) con X47 a.r. de 12 ratones inyectados con 3 x 100 mg de pCIM2 con un grupo control inyectado tres veces con 100 mg de pCDNA3. Se pudo demostrar una protección parcial frente a una estimulación heteróloga con el virus de la gripe (antígeno inmunizante = M2 universal, estimulación = M2 derivada de A/PR/8/34).

TABLA 3

vector	ratones supervivientes/número total
pCDNA3 (control)	1/12
pCIM2 (gen m2 completo)	7/12

19. Expresión en células HEKT

El nivel de expresión de la proteína M2 completa en la fracción soluble y en el sedimento es demasiado bajo para ser detectado, (véase la figura 30). Es posible que la expresión se mantenga baja debido a la actividad como canal iónico de la proteína M2, que puede ser tóxica para las células HEKT. Sin embargo, las dos proteínas de fusión, IM2HBcm e IP3M2HBcm, se expresan bien. Este experimento demuestra que los vectores usados en los estudios de vacunación con ADN pueden expresar la proteína, excepto, quizás, pCIM2.

20. Análisis del suero

Se pudo demostrar una respuesta anticorpal específica dirigida contra la parte extracelular de la proteína M2, aunque esta respuesta es baja. En el panel B de la figura 31, se compara pCIM2 con el vector control. En este ELISA se usó como recubrimiento la proteína M2 expresada en células de insecto (véase Materiales y procedimientos). Se pudo demostrar una respuesta anti-M2 específica, especialmente tras la tercera inmunización. La mayor respuesta anti-M2 con pCIM2 puede deberse a epítopes adicionales localizados en el dominio citoplásmico de la proteína M2.

Discusión

El presente documento describe varios sistemas de presentación al sistema inmune de la parte extracelular altamente conservada de la proteína M2 del virus de la gripe de tipo A. El fragmento M2 se fusionó con el extremo amino terminal de la proteína vehículo con el fin de mantener el extremo N-terminal del dominio M2 libre y, de esta forma, mimetizar la estructura de la proteína M2 de tipo silvestre. La primera proteína de fusión, M2 unida a la \beta2-microglobulina humana (IPM2hB2Mm), se usó para producir anticuerpos monoclonales. Una segunda proteína de fusión, M2 unida a la proteína del núcleo del virus de la hepatitis B (IPM2HBcm), se usó para los estudios de vacunación. Ambas proteínas también pudieron usarse en la detección de una respuesta anticorpal específica contra la parte extracelular de la proteína M2, ya que tiene que hacerse una corrección de los anticuerpos dirigidos contra la proteína vehículo que se producen también durante el procedimiento de inmunización.

Los estudios de vacunación con IPM2HBcm mostraron que la dosis administrada en el intervalo usado, aparentemente, no era un parámetro muy crítico para la obtención de protección, ya que dosis que oscilaban de 5 a 50 \mug protegían a los ratones, aunque los ratones inmunizados seguían mostrando una alta morbilidad. Esto pudo deberse a la alta dosis de virus (5 DL_{50}) que se usó en la estimulación con el fin de obtener un claro resultado en el grado de protección. En una infección con el virus de la gripe natural, el número de partículas virales infectivas es mucho más bajo, de modo que puede asumirse que la morbilidad disminuiría en consecuencia.

El análisis del suero de los ratones inmunizados demostró una respuesta anticorpal sustancial contra la parte extracelular de la proteína M2, especialmente tras la estimulación viral. Esta última respuesta elevada puede ser debida a la distinta forma de administración, intraperitoneal frente a intranasal. O puede explicarse según un mecanismo de defensa más completo contra el virus entrante.

Slepushkin y col. (1995) describieron una estrategia de vacunación para la estimulación homóloga y heteróloga con el virus, basada en un extracto de membrana que contenía la proteína M2 completa natural. Pero usaron un adyuvante muy potente, el adyuvante incompleto de Freund, que no es apropiado para uso médico.

Por el contrario, las fusiones del dominio extracelular de M2 de la invención descritas aquí, pueden obtenerse en forma pura (al menos al 95% de pureza) y puede administrarse en combinación con adyuvantes seguros. Se obtuvo un alto grado de protección, a pesar del hecho de que la estimulación era bastante fuerte. En vista de la secuencia casi invariable del dominio extracelular de M2 (véase la tabla 1 que muestra una vista general de las secuencias de aminoácidos del dominio extracelular de la proteína M2 del virus de la gripe de tipo A) puede esperarse que la protección alcanzada será similar frente a todas las cepas del virus de la gripe de tipo A humanas conocidas hasta ahora.

La vacuna puede mejorarse adicionalmente mediante la inclusión en la proteína de fusión de un epítope de una célula T cooperadora específica de la gripe, así como un epítope de una CTL, por ejemplo, internamente o unido al extremo C-terminal de la proteína del núcleo del virus de la hepatitis B. También son posibles otras vías de inmunización, por ejemplo, intraperitoneal frente a intranasal.

Además del organismo gram negativo E. coli, también se usó para la expresión de las proteínas de fusión M2HBcm L. lactis, un organismo gram positivo. En L. lactis no es necesario purificar la proteína de fusión expresada. La bacteria puede administrarse directamente por vía intranasal u oral.

También se describe una tercera proteína vehículo prometedora, concretamente el fragmento d de la tercera proteína del complemento (C3d) (Dempsey y col., 1996). En una construcción preferida, tres copias de la proteína C3d están precedidas por el dominio extracelular de la proteína M2. Esta proteína de fusión M2C3d3 puede expresarse en una forma intracelular, anclada a la pared celular o secretada al medio de cultivo, mediante la fusión génica de secuencias reguladoras apropiadas.

Bibliografía

Allen y col. (1980) Virology 107, 548-551

Baez y col. (1980) J. Infect. dis. 141, 362-365

Belshe y col. (1988) J. Virol. 62, 1508-1512

Birnboim y Doly (1979) N.A.R. 7, 1513-1523

Black y col. (1993a) J. Gen. Virol. 74, 143-146

Black y col. (1993b) J. Gen. Virol. 74, 1673-1677

Borisova y col. (1989) FEBS Lett. 259, 121-124

Casadaban y Cohen (1980) J. Mol. Biol.. 138, 179-207

Clarke y col. (1987) Nature 330, 381-384

Cohen y Richmond (1982) Nature 296, 677-678

Cox y col. (1988) Virology 167, 554-567

Dempsey y col. (1996) Science 271, 348-350

Deng y Nickolov (1992) Anal. Biochem. 200, 81-88

Gasson (1983) J. Bact. 154, 1-9

Gillis y col. (1978) J. Immunol. 120, 2027-2032

Hirst (1941) Science 94, 22-23

Holsinger y Lamb (1991) Virology 183, 32-43

Kahn y col. (1979) Methods Enzymol. 68, 268-280

Kendal y col. (1982) Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. pág. B7 - BI 2, BI 7 - B1 9

King y Possee (1992) The Baculovirus Expression System. Chapman y Hall, University Press, Cambridge, Reino Unido

Klimov y col. (1992) Virology 186, 795-797

Köhler y Milstein (1975) Nature 256, 495-497

Laemmli (1970) Nature 227, 680-685

Lamb y Lai (1981) Virology 112, 746-751

Lamb y col. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 4170-4174

Lamb y col. (1985) Cell 40, 627-633

Levi y Arnon (1996) Vaccine 14, 85-92

Markushin y col. (1988) Virus Res. 10, 263-272

Miller (1972) Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pág. 431

Min Jou y col. (1980) Cell 19, 683-696

Nakamaye y Eckstein (1986) N.A.R. 14, 9679-9698

Nassal (1988) Gene 66, 279-294

Neu y Heppel (1965) J. Biol. Chem. 240, 3685-3692

Ortin y col. (1983) Gene 23, 233-239

Parker y Wiley (1989) Gene 83, 117-124

Remaut y col. (1981) Gene 15, 81-93

Remaut y col. (1983a) N.A.R. 11, 4677-4688

Remaut y col. (1983b) Gene 22, 103-113

Schöder y col. (1992) J. Virol. 66, 106-114

Slepushkin y col. (1995) Vaccine 13, 1399-1402

Stanssens y col. (1989) N.A.R. 17, 4441-4454

Steidler y col. (1994) Biotechn. Bioeng. 44, 1074-1082

Steidler y col. (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61, 1627-1629

Steidler y col. (1996) NATO ASI Series H 98 pág. 63-79. eds. Bozoglu, T.F. y Ray, B. Springer, Berlin

Struhl (1985) Biotechniques 3, 452-453

Sugrue y col. (1990) Virology 179, 51-56

Sugrue y Hay (1991) Virology 180, 617-624

Treanor y col. (1990) J. Virol. 64, 1375-1377

Van Asseldonk y col. (1990) Gene 95, 155-160

Van de Guchte y col. (1992) FEMS Microbiol. Rev. 88, 73-92

Van Snick y col. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9679

Vogelstein y Gillespie (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 615-619

Wells y col. (1993) J. Appl. Bact. 74, 629-636

Wells y Schofield (1996) NATO ASi Series H 98 pág. 37-62. eds. Bozoglu, T.F. y Ray, B. Springer, Berlin

Winter y Fields (1980) N.A.R. 8, 1965-1974

Zebedee y Lamb (1988) J. Virol. 62, 2762-2772

Zebedee y Lamb (1989) N.A.R. 17, 2870

Zell y Fritz (1987) EMBO J. 6, 1809-1815

<110> Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnol

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Antígeno inmunoprotector contra la gripe y su uso en vacunación

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> VIB-08-WM/M2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/EP98/05106

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 05-08-1998

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> virus de la gripe

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys}

\sac{Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> virus de la gripe

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys}

\sac{Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> virus de la gripe

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Lys Asn Glu Trp Glu Cys}

\sac{Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttactgttt tcgtaacagt tttg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caacaacgca cagaatctag

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatccgtctc tgctgaccga agttgaaacc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcagagacga ctggcttcaa ctttgg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggttcaagt gatcatctcg c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la gripe

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

3

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> virus de la gripe

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys}

\sac{Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcaggcct tccagcg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcaggccc tgcagcgtac tcc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctcagatct tctgca

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggagtctaga ag

\hfill

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgtagcgca ggcctctctg ctgaccg

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatccatat ccatggc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cggtcagcag agacatgggt aatcc

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagaccgtt cagctggata ttacgg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> virus de la gripe

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgtctctgc tgaccgaagt tgaa

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> virus de la gripe

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PROT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: extremo aminoterminal de la proteína de fusión IPM2HBcm

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggatcacttg aatcgttaca tctgcaccc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagaccgtt cagctggata ttcagg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catggatatg gatccttata aagaatt

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgtctctg ctgaccgaag ttg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgtcttta ttaaccgaag ttgaaaccc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtgatcaac tagttcacta acattgagat tcccgagat

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggatcccc acttgaatcg ttacatatgc acc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctttattaa ccgaagttga aacccctatc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgcgcccac ccgacgagat ctcggatcta ccccc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcactagttc aaggatccga tccgaactct tcagatcc

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgggatccga caccaattcc attttcttat tctaa

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggatccac tagtttaatc atttg

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgtcttta ttaaccgaag ttgaaaccc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctactagta aatcagtcac accaa

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgaagcttgc cggcaaaggc agaatgcgcc gcc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctctgctga ccgaagttga aac

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgaagcttac tagttcacgg atccccactt gaatcgttgc atctgcaccc

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtagatatt gaaagatg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtctagatt actccagctc tatgctgaca aaa

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgagatctat gagtcttcta accgaggtcg aaacgcctat cagaaacgaa tgggggt

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgtcttta ttaaccgaag ttgaaaccc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtgatcaac tagttcacta acattgagat cccgagat

\hfill

38

Claims (31)

1. Un antígeno de la gripe que comprende un producto de fusión de

(i) una parte extracelular inmunogénica de una proteína de membrana M2 de la gripe del virus de la gripe A, y

(ii) un vehículo presentador.

2. Un antígeno de la gripe según la reivindicación 1 en el que dicho producto de fusión comprende una parte extracelular inmunogénica de una proteína de membrana M2 de la gripe del virus de la gripe A.

3. Un antígeno de la gripe según la reivindicación 2 que comprende la secuencia de aminoácido presentada en la SEQ ID NO.: 1, 2 ó 3.

4. El antígeno de la gripe según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el vehículo presentador es un (poli)péptido presentador.

5. El antígeno de la gripe según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el vehículo presentador es una estructura no peptídica, tal como glicanos, peptido-miméticos, polímeros sintéticos.

6. El antígeno de la gripe según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que además comprende un dominio adicional para potenciar la inmunogenicidad del antígeno de respuesta inmune celular.

7. El antígeno de la gripe según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el (poli)péptido presentador se selecciona entre la proteína del núcleo de la hepatitis B, los dominios C3d y el fragmento C de la toxina tetánica.

8. El antígeno de la gripe según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho vehículo presentador no altera la estructura terciaria de dicha parte de la proteína.

9. El antígeno de la gripe según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el antígeno consiste en células de Lactococci que expresan el producto de fusión en o dentro de su membrana celular.

10. El antígeno de la gripe según la reivindicación 9, en el que dichas células liberan dicho producto de fusión.

11. El antígeno de la gripe según la reivindicación 6, en el que el dominio adicional es un epítopo de una célula colaboradora T o un epítopo de la célula T citotóxica específica del virus de la gripe.

12. Una construcción génica que codifica un antígeno según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. El antígeno de la gripe según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que se puede obtener preparando una construcción génica según la reivindicación 12, que comprende una primera secuencia codificadora que codifica una parte extracelular inmunogénica de una proteína de membrana de la gripe, como se define en cualquiera de la reivindi-
caciones 1 a 3, y una segunda secuencia codificadora de un (poli)péptido presentador unido de forma operativa a ésta.

14. El antígeno de la gripe según la reivindicación 13, en el que la construcción génica además comprende secuencias reguladoras adecuadas de la transcripción y/o traducción.

15. El antígeno de la gripe según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 ó 14 para su uso en la preparación de una vacuna contra la gripe para humanos y/o animales.

16. El antígeno de la gripe según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 ó 14 para su uso en la preparación de una vacuna contra la gripe A para humanos y/o animales.

17. Una vacuna contra la gripe, que comprende un antígeno según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11 ó 14.

18. Una vacuna según la reivindicación 17, que además comprende un excipiente.

19. La vacuna según la reivindicación 17, en la que el antígeno está en forma aislada.

20. La vacuna según la reivindicación 17, en la que el antígeno es parte de un fragmento de membrana.

21. La vacuna según la reivindicación 17, en la que el antígeno se ancla a la membrana de una célula aceptora que expresa el antígeno.

22. La vacuna según la reivindicación 17, en la que el antígeno consiste en células de Lactococci que expresan el producto de fusión en o sobre su envoltura celular.

23. La vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22, que además comprende otro antígeno de la gripe.

24. La vacuna según la reivindicación 23, en la que dicho otro antígeno de la gripe se selecciona entre hemaglutinina, neuraminidasa, nucleoproteína y/o M2 nativa.

25. Una vacuna de ADN que comprende una construcción génica según la reivindicación 12.

26. Una vacuna basada en vaccinia que comprende una construcción génica según la reivindicación 12.

27. El uso de un antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 ó 13 a 16 para la preparación de una vacuna contra la gripe.

28. El uso de una construcción génica según la reivindicación 12 para la preparación de una vacuna basada en ADN o basada en vaccinia contra la gripe.

29. Procedimiento de preparación de un antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 ó 13 a 16, que comprende las etapas de:

(a) preparar una construcción génica según la reivindicación 12,

(b) llevar esta construcción génica a una célula aceptora adecuada,

(c) llevar a cabo la expresión de la construcción génica en la célula aceptora, y

(d) opcionalmente, aislar el antígeno a partir de la célula aceptora o de su medio de cultivo.

30. Una célula aceptora, que expresa un antígeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 ó 13 a 17.

31. La célula aceptora según la reivindicación 30, en el que la célula es una célula de Lactococcus.