KR20020059856A - 에이치아이브이 유사입자의 제조 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 HIV-1의 env, gag, pro 유전자를 발현시키는 알파 바이러스-기재 발현 벡터, 그 RNA 전사물 및 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명은 상기 발현 벡터를 사용하여 HIV-1의 Gag, Env 및/또는 Pro 단백질을 발현시켰으며 상기 재조합 단백질들로 구성된 바이러스-유사입자를 제조하였다. 본 발명의 바이러스-유사입자는 바람직하게는 성숙, 감염성 바이러스 입자이다.

Description

에이치아이브이 유사입자의 제조 {Preparation of HIV-like particles}
HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus-1)은 후천성 면역 결핍증 (Acquired Immunod eficiency Syndrome; 이하 "AIDS")의 병인원이다. HIV-1은 HIV-2와 함께 레트로 바이러스의 렌티비리디(lentiviridae)에 속하며, 감염성 비리온은 두 개의 동일한 단일쇄 (single-stranded)로 이루어진 RNA(+) 게놈을 가지고 있다. HIV-1이 세포에 감염되면, 상기 RNA(+) 게놈이 코딩하는 역전사 효소 (reverse transcriptase)에 의해 RNA가 이중 선형 DNA (double-stranded DNA)로 전환되며, 이 DNA가 숙주 세포의 염색체에 삽입되어 프로바이러스를 형성하게 된다.
HIV-1 게놈 (9.2kb)은 gag, pol, env의 구조 유전자 (structural gene)와 tat, rev, nef, vif, vpu, vpx 등의 부수 유전자 (accessory gene)로 구성되어 있다. 도 1에 HIV-1의 게놈 구조를 도식화하였다.
HIV의 Gag 단백질은 gag-pol의 전장 RNA에서 55 kDa의 전구단백질 (Pr55gag)로 발현된다. 단백질의 N-말단에 미리스토일레이션이 되어 있으며 이에 의해 원형질막의 내측으로 타게팅되어 바이러스 입자를 형성한다. Pr55gag는 pol 유전자에 의해 발현되는 바이러스 프로테이즈(Pro)에 의해 매트릭스 (MA, p17), 캡시드 (CA, p24), 뉴클레오캡시드 (NA, p9) 및 p6의 단백질로 프로세싱되어 성숙화한다 (Gheysen D. et al,Cell,59, 103-112 (1989)). (Bray, M. et al,Proc. Natl. Acad. Sci. USA91, 1256-1260 (1994); Cann, A. J., and J. Karn,AIDS3(Suppl.1), S19-S34 (1989); Ratner, L., W. et al.,Nature313, 277-284(1985); Wain-Hobson, S. et al.,Cell40, 9-17 (1985)).
피막 당단백질(envelope glycoprotein) Env는 스플라이싱된 RNA에서 gp160이라 불리는 전구체로 발현된다. 세포 내에서 숙주 또는 바이러스의 프로테이즈에 의해 N-말단의 gp120과 C-말단의 gp41 단백질로 절단되며, 이렇게 생성된 gp120은 세포막 외부 (external surface domain)에 존재하는 당단백질 서브 유니트를 형성하고 gp41은 막횡단 부위 (transmembrane domain)를 구성하게 된다. 성숙 비리온에서는 gp120과 gp41이 비공유 결합하여 이종이합체 (heterodimer)를 형성하고 있는데 이들은 HIV이 나타내는 감염성, 세포 지향성 (cellular tropism) 및 세포 병리 (cytopathogenicity)에 직접 관여하는 것으로 알려져 있다 (Robey, E. and Axel, R.,Cell60, 697-700 (1990)). 이와 같이 HIV의 Env 단백질은 항원성과 밀접한 관련이 있기 때문에 HIV 백신을 제조하는데 있어서 가장 중요한 연구 대상이다.
프로테이즈 (Pro)는 gag mRNA의 3'에서 리보조말 프레임 쉬프트 (ribosomal frame shift)가 일어나서 만들어지는 전구단백질 (Pr160gag-pol)에서 자가 절단되어 생성된다 (Jacks, T. and Varmus, H. E.Sience,230, 1237-1242 (1985); Jacks, T. et al,Nature (Lodon),331, 280-283 (1988); Sonigo, P. et al,Cell,45, 375-385 (1986)). Pro는 Pr160gag-pol 폴리프로테인의 절단 및 Env의 프로세싱에 관여하며 바이러스 입자의 성숙 (maturation)과 감염 (infectivity)에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다 (Kohl, N. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA.,85, 4686-4690 (1988)).
지금까지 AIDS 백신으로 개발된 것에는 불활화 백신, 약독화 백신, 재조합 생백신, 바이러스 유사입자 백신, 서브유니트 백신 등이 있다. 각 백신 분야에서 그간 시도된 기술을 소개하면 다음과 같다.
"불활화 백신 (Inactivated whole virus vaccine)"은 분리한 바이러스 입자를 화학적 또는 물리적으로 처리하여 감염성을 잃도록 한 것을 말한다. 제조하기 쉽고, 거의 모든 에피토프를 사용할 수 있는 장점이 있는 반면, 바이러스를 완전히 불활화시키지 못한 경우에는 질병을 유발할 위험이 있고, 반대로 완전히 불활화시키기 위해 강력한 처리를 하는 경우에는 에피토프가 파괴되는 단점이 있다. 문헌에 SIV의 감염 시험에 성공한 예가 보고된 적 있으나 (Scott E. J. Nature, 253, 393 (1991); Le Grand R. et al., Nature, 355, 684 (1992); Crange M. P. et al., Nature, 355, 685-686 (1992); Arthur L. O., et al., J virol, 69, 3117-3124 (1995); Neidrig M., et al., Vaccine, 11, 67-74 (1993)), 그 결과가 배양 숙주 세포의 제노-항원 (xeno-antigen)에 의한 것이라는 의문이 제기되고 있으므로 아직 성공 단계에 있는 백신으로 볼 수는 없다.
"약독화 백신 (Live attenuated vaccine)"은, 예를 들어 nef 유전자 또는 nef와 vpr 유전자를 동시에 결핍시킨 것과 같이, HIV 유전자의 일부를 결손시킨 것인데 (Descrosiers RC., AIDS Res Hum Restroviruses, 8, 411-421 (1992); Gibbs J. S. et al., AIDS Res Hum Retroviruses, 10, 607-616(1994); Cranage M. P. et al., Virology, 229, 143-154 (1997); Wyand M. S., et al., Nature Med, 3, 32-36 (1997)), 바이러스가 동물 체내에서 결손된 유전자를 다시 획득하는 경우 병원성을 나타내게 되므로 안정성에 문제가 있는 비교적 개발 초기단계의 기술이라고 할 수 있다.
"재조합 생백신 (Live recombinant vaccine)"은 비병원성 바이러스의 비필수 유전자를 HIV 항원으로 대체시킨 형태의 백신을 말한다. 문헌에 백시니아 바이러스 (Vaccinia virus), 폭스 바이러스 (poxvirus), 카나리폭스 바이러스 (canarypox virus), 아비폭스 바이러스 (avipox virus), 폴리오 바이러스 (polio virus), 인플루엔자 바이러스 (Influenza virus) 등에서 gag, pol 또는 env 등의 유전자를 발현시키거나, HIV의 V3 loop 등을 함유한 항원성 부위를 키메라 단백질 형태로 발현시킨 예들이 보고되어 있다 (Tartaglia J. et al., Virology, 188, 217-232 (1992); Abimiku A., et al., Nature Med, 1, 321-329 (1995); Natuk RJ. et al., AIDS Hum Retroviruses, 9, 395-404 (1993); Li S. et al., J Virol, 67, 6659-6666(1993); Muster T. et al., J Virol 69, 6678-6686 (1995)). 이 기법은 일반적으로 전체 항원의 일부만을 백신으로 사용하기 때문에 좋은 면역원을 제공하는 것이라 볼 수 없고, 종종 구성된 벡터가 불안정하다는 단점이 있다 (Morrow C. D. et al., AIDS Res Hum Retroviruses, 10, S61- S66 (1994); Anderson M. J. et al., AIDS Res Hum Retroviruses, 13, 53-62 (1997)).
천연에서 분리하거나 유전 공학적으로 발현시킨 HIV의 서브유니트를 백신으로 사용하는 "서브유니트 백신 (subunit vaccine)"은 비교적 쉽게 말들 수 있는 장점이 있지만, 이 역시 HIV 항원 결정 부위의 일부 만을 사용하는 것으로서 전체 바이러스 입자와 다른 입체구조 (conformation)를 취한다는 점에서 제한점을 안고 있는 백신이다. 재조합 Env 당단백질 gp120과 gp160이 포유동물 세포나 곤충 세포 등에서 발현된 바 있으나 (Lasky, L. A., et al., Science, 249, 932-935 (1986); Barr, P. J. et al.,Vaccine,5, 90-101 (1987); Hu, S-L. et al.,J. Viol., 61, 3617-3620 (1987); Rusche, J. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 84, 6924-6928 (1987); Berman, P. W., et al., J. Virol., 63, 3489-3498 (1989); Ivey-Hoyle, M., and Rosenberg, M., Mol. Cell. Biol., 10, 6152-6159 (1990); Lasky, L. A. et al., Cell, 50, 975-985 (1987)), CHO 세포에서 발현된 gp120은 침팬지에서의 챌린지 (challenge) 실험에서는 실패하였다 (Berman, P. W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 5200-5204 (1988)).
백신을 바이러스 입자 형태로 제공하면 서브유니트 형태의 항원을 제공하는 것보다 면역원성이 높고 안정하다. 따라서, 유전자를 포함하고 있지 않은 비감염성 "바이러스-유사입자 (VLP; Virus-like particle)"를 백신으로 사용하는 방법이 최근에 개발되었다. 패캐징 유전자에 변이가 일어난 결과로 게놈 RNA가 없는 VLP를 생산하거나, 재조합 바큘로 바이러스나 백시니아 바이러스를 이용하여 프로세스되지 않은 Gag 단백질로 구성된 VLP를 제조한 것이 그 예이다 ((Gorelink R. J. et al., J Virol, 64, 3207-3211(1990); Gheysen D. E. et al., Cell, 59, 103-112(1989)). 문헌은 (Haffar O. K. et al., Virology, 183, 487-495(1991)) gag-pol 유전자와 env 유전자를 함유한 두 개의 재조합 백시니아 바이러스를 동시에 감염시켜 유전자가 없는 바이러스-유사입자를 생산한 것을 보고하고 있다. 그러나 이러한 슈도-입자 (pseudo-particle)는 체내에서 중화 항체, 신시티움 억제(syncitium-inhibiting), env-CD4 방어 항체 등을 생성하는 데는 성공하였으나, 성숙된 바이러스 입자가 아니며 또한 감염성이 결핍되어 있다는 제한이 있다.
VLP 형태의 백신으로는 이외에도 HIV의 항원기를 함유하도록 작제된 폴리오 바이러스 캡시드, HBV 코어 입자, HBsAg 입자 또는 이스트 레트로트랜스포존 바이러스-유사입자 (yeast retrotransposon virus-like particle) 등의 하이브리드 입자가 있으나, 이들 역시 유사-바이러스 입자에 삽입될 수 있는 항원기 부위가 제한된다는 한계점을 극복하지 못한 것 들이었다 (Grene E. et al., AIDS Res Hum Retroviruses, 13, 41-51(1997); Schlienger K., et al., J Virol, 66, 2570-2576 (1991); Adams S. E. et al., Nature 329, 68-70 (1987); Layton G. T. et al., J Immunol, 151, 1097-1107 (1993); Eckart L. et al., J Gen Virol, 77, 2001-2008 (1996)).
본 발명자들은 새로운 AIDS 백신을 개발하는 시도로서 알파 바이러스 벡터 시스템을 이용하여 감염성 AIDS 백신 및 성숙 바이러스-유사입자 형태의 백신을 제조하게 되었으며, 이를 이용하여 AIDS 질병을 예방하는 방법을 제공하게 되었다.
본 발명은 HIV-1의 gag 및/또는 env 및/또는 pro 유전자를 발현시키는 알파 바이러스 발현 벡터 및 그 RNA 전사물에 관한 것이다.
본 발명은 HIV-1의 gag 및/또는 env 및/또는 pro 유전자를 발현시키는 알파바이러스 발현 벡터 또는 그 RNA 전사물로 일시적 또는 안정적으로 형질 전환된 세포 또는 세포주 및 상기 형질전환체를 사용하여 HIV-1의 Gag, Env, Pro 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 HIV-1의 gag 및/또는 env 및/또는 pro 유전자를 발현시키는 알파 바이러스 발현 벡터를 이용하여 HIV-1의 Gag 또는 Gag와 Env로 구성된 감염성 VLP를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 HIV-1의 gag 및/또는 env 및/또는 pro 유전자를 발현시키는 알파 바이러스 발현 벡터, 그 RNA 전사물 또는 VLP를 포함하는 백신 조성물 및 상기 백신 조성물을 투여하여 질병을 예방하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 HIV-1의 게놈 구조를 나타내는 개요도이다.
도 2는 pSFV 벡터 및 pSFV-helper의 구조를 나타내는 개요도이다.
도 3은 pSFV/gag 발현 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 개요도이다.
도 4는 pSFV/gagpro 발현 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 개요도이다.
도 5는 SFV-helper와 pSFV/gag 또는 SFV-helper와 pSFV/gagpro RNA 전사물을 BHK-21 세포에 트랜스펙션하여 얻은 바이러스 입자를 AIDS 환자 혈청으로 웨스턴 블롯한 결과를 나타내는 사진이다.
도 6은 pSFV-helper와 pSFV/gag 또는 pSFV-helper와 pSFV/gagpro RNA 전사물을 BHK-21 세포에 트랜스펙션한 후 얻은 바이러스 입자를 in vitro 활성화하여 BHK-21 세포에 감염시킨 후 감염된 BHK-21 세포의 용해물을 AIDS 환자 혈청으로 웨스턴 블롯한 결과를 나타내는 사진이다.
도 7은 pSFV/gag 또는 pSFV/gagpro RNA 전사물을 BHK-21 세포에 트랜스펙션 한 후, 세포를 p24 (캡시드)에 대한 폴리클로날 항체로 면역화학 스텐이닝하여 Gag의 발현을 확인한 사진이다.
도 8은 pSFV/gag (A) 또는 pSFV/gagpro (B)의 RNA 전사물을 BHK-21 세포에트랜스펙션 한 후, 그 세포 배양 배지의 상층액으로부터 얻은 VLP를 네가티브 스테이닝하여 전자현미경으로 관찰한 사진이다 (X140,000).
도 9는 pSFV/env 발현 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 개요도이다.
도 10은 pSFV-helper RNA 전사물과 함께 pSFV/env RNA 전사물을 BHK-21 세포에 트랜스펙션 한 후 gp160에 대한 모노클로날 항체로 면역화학 스테인하여 gp160의 발현을 확인한 사진이다.
도 11은 pSFV-helper RNA 전사물 함께 pSFV/env RNA 전사물을 BHK-21 세포에 트랜스펙션한 후 얻은 결손 SFV 입자를 다시 in vitro 활성화하여 BHK-21 세포에 감염시키고, 감염된 BHK-21 세포의 용해물을 AIDS 환자 혈청으로 웨스턴 블롯한 결과를 나타내는 사진이다.
도 12는 pSFV/gag와 pSFV/env RNA 전사물을 동시에 BHK-21 세포에 트랜스펙션 한 후, gp160에 대한 모노클로날 항체 (B) 또는 AIDS 환자 혈청 (C)으로 세포를 면역화학 스테이닝하여 HIV-1 Env와 Gag 단백질이 동시에 발현되었음을 보여주는 사진이다.
도 13은 pSFV/gag RNA 전사물, 또는 pSFV/gag와 pSFV/env RNA 전사물을 동시에 BHK-21 세포에 트랜스펙션하여 각각 VLP를 얻은 후, 이들 입자 안에 패키징된 RNA를 RT-PCR과 PCR 분석한 결과를 나타내는 사진이다.
도 14는 pSFV-helper와 pSFV/gag RNA 전사물, 또는 pSFV-helper와 pSFV/env RNA 전사물을 BHK-21 세포에 코-트랜스펙션시켜 얻어진 각각의 결손 SFV 입자를 in vitro 활성화시켜 COS-1 세포에 재감염시킨 결과, HIV-1의 Gag와 Env로 이루어진VLP가 생성되었음을 보여주는 웨스턴블롯 사진이다.
도 15는 pSFV/pro 발현 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 개요도이다.
도 16은 pSFV/env-gag 발현 벡터의 제조 과정을 나타내는 개요도이다.
도 17은 pSFV/env-gag-pro 발현 벡터의 제조 과정을 나타내는 개요도이다.
도 18은 pSFV/env-gag의 RNA 전사물을 BHK-21 세포에 트랜스펙션 한 후 얻은 VLP 또는 세포 용해물을 AIDS 환자 혈청으로 웨스턴 블롯한 결과를 보여주는 사진이다.
도 19는 pSFV/env-gag-pro의 RNA 전사물을 BHK-21 세포에 트랜스펙션 한 결과 세포에서 HIV-1 의 Gag, Env 및 Pro가 발현되었음을 보여주는 면역세포화학 분석 사진이다.
도 20은 pSFV/CTE 발현 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 개요도이다.
도 21은 pSFV/gagpro-CTE 발현 벡터를 제조하는 과정을 내타내는 개요도이다.
도 22는 pSFV/env-gag-gagpro-CTE 발현 벡터를 제조하는 과정을 나타내는 개요도이다.
도 23은 pSFV/env-gag-gag△pro-CTE 발현 벡터를 만드는 과정으로 gag의 3' 말단에서 일어나는 프레임 쉬프트 염기서열을 제거한 gag△pro를 pSFV/env-gag에 삽입한 것을 나타내는 개요도이다.
본 발명은 HIV-1의 구조 단백질을 발현시키는 알파 바이러스 기재 발현 벡터를 제공한다.
"알파 바이러스"란 당업계에서 통상적으로 알파 바이러스로 분류되는 바이러스 종 및 서브타입을 말하며, 예를 들어, Eastern Equine Encephalitis virus (EEE), Venezuelan Equine Encephalitis virus (VEE), Everglades virus, Mucambo virus, Pixuna virus, Western Encephalitis virus (WEE), Sindbis virus, South African Arbovirus No. 86, Girdwood S.A. virus, Ockelbo virus, Semliki Forest virus, Middleburg virus, Chikungunya virus, O'Nyong-Nyong virus, Ross River virus, Barmah Forest virus, Mayaro virus, Getah virus, Sagiyama virus, Bebaruvirus, Mayaro virus, Una virus, Aura virus, Whataroa virus, Babanki virus, Kyaylagach virus, Highlands J virus, Fort Morgan virus, Ndumu virus, Buggy Creek virus 및 기타 바이러스 학명에 관한 국제 위원회 (International Committee on Taxonomy of Viruses)에서 알파 바이러스로 분류한 것들이 이에 포함된다.
알파 바이러스 (Alphavirus)는 토가비리디 (Togaviridae)에 속하는, 피막을 가지고 있는 (+)쇄 (positive-strand) RNA 바이러스로 광범위한 세포 (곤충, 조류, 포유류)에 감염될 수 있다. 바이러스의 RNA 게놈이 그 자체로 감염성이 있고 스스로 RNA 리플리카제를 코딩하기 때문에 RNA 복제와 전사가 효율적으로 이루어지는 시스템이다 (Liljestrom, P. and H. Garoff, Biotechnology, 9, 1356-1361 (1991)).
본 발명의 알파 바이러스는 바람직하게는 "샘리키 포리스트 (SFV: Semliki Forest virus) 바이러스"와 "신드비스 바이러스 (Sindbis virus)"이다. 본 발명의 알파 바이러스 더욱 바람직하게는 "SFV"이다. 본 발명의 구체예에서 사용된 SFV-기재 발현 벡터 pSFV는 SP6 프로모터를 가진 플라스미드에 SFV의 cDNA 게놈을 삽입한 것으로, SP6 폴리머라제를 사용하여 in vitro 전사가 가능하며, 구조 유전자 대신 삽입된 외래 유전자가 26S 서브게노믹 프로모터에 의해 발현 될 수 있도록 변환된 발현 벡터이다.
감염에 의해 재조합 RNA를 세포 내로 도입시키기 위해서는 in vivo 패키징 시스템을 이용할 필요가 있다. pSFV-helper는 SFV의 RNA 복제 시그날과 구조 유전자를 발현시킬 수 있는 정보를 포함하고 있지만, 게노믹 RNA 패캐징 시그날이 결여되어 있는 것으로, pSFV-helper를 재조합 pSFV 벡터와 함께 코-트랜스펙션시키면 SFV 구조 단백질 내에 재조합 RNA만이 패키징된 바이러스 입자가 생성된다. 상기 바이러스 입자는 세포에 감염되어 재조합 유전자를 발현시키지만 재차 바이러스 입자를 형성하지는 못한다. 본 발명의 실시예에서 사용된 pSFV와 pSFV-helper의 구조를 도 2에 나타내었다. 본 발명에서 사용되는 DNA 벡터와 그 RNA 전사물은 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 하나의 측면은 HIV-1의 gag, env 또는 pro 유전자를 26S 서브게노믹 프로모터 하에 각각 삽입하여 Gag, Env 또는 Pro를 발현시키는 알파 바이러스-기재 발현 벡터를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 측면은 HIV-1의 env와 gagpro 유전자 각각을 26S 서브게노믹 프로모터에 삽입하여 Gag, Env와 Pro를 동시에 발현시키는 발현 벡터를 제공하는 것이다. Pro의 발현은 Gag 단백질의 양에 의존하는 것으로 생각되고 있다 (Velissarios K. et al., Virology, 193, 661-671 (1993); Magdeleine H. et al., J Virol. 72, 4819-1824 (1998); Joel G. et al., Virology, 244, 87-96 (1998)). 본 발명에서는 Pro의 발현을 극대화하기 위해 env, gag, pro 유전자를 각각 26S 프로모터에 연결시키거나 또는 env, gag, gagpro 유전자를 각각 26S 프로모터에 연결시킨 발현 벡터 및 gag-pol의 인접부에서 프레임 쉬프트된 코돈 서열을 갖는 벡터를 제작하였다.
본 발명은, HIV-1의 gag 유전자를 발현시키는 알파 바이러스 벡터, 바람직하게는 gag 유전자가 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결된 SFV-기재 발현 벡터를 제공한다. pSFV/gag는 상기 벡터의 예이다 (실시예 1). 본 발명은, HIV-1의gagpro 유전자를 발현시키는 알파 바이러스 벡터, 바람직하게는 gagpro 유전자가 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결된 SFV-기재 발현 벡터를 제공한다. pSFV/gagpro는 상기 벡터의 예이다 (실시예 1). 본 발명은, HIV-1의 env 유전자를 발현시키는 알파 바이러스 벡터, 바람직하게는 env 유전자가 작동 가능하도록 프로모터 하에 연결된 SFV-기재 발현 벡터를 제공한다. pSFV/env는 상기 벡터의 예이다 (실시예 4).
본 발명은, HIV-1의 env와 gag 유전자를 동시에 발현시키는 알파 바이러스 벡터, 바람직하게는 env 유전자가 제 1의 서브 게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되고, gag 유전자가 제2의 서브 게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결된 SFV-기재 발현벡터를 제공한다. pSFV/env-gag는 상기 벡터의 예이다 (실시예 9). 본 발명은, HIV의 pro 유전자를 발현시키는 알파 바이러스 벡터, 바람직하게는 pro 유전자가 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결된 SFV-기재 발현 벡터를 제공한다. pSFV/pro는 상기 벡터의 예이다 (실시예 9).
본 발명은, HIV-1의 env, gag 및 pro 유전자를 동시에 발현시키는 알파 바이러스 벡터, 바람직하게는 env 유전자가 제1의 서브 게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되고, gag 유전자가 제2의 서브 게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되며, pro 유전자가 제3의 서브 게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결된 SFV-기재 발현벡터를 제공한다. pSFV/env-gag-pro는 상기 벡터의 예이다 (실시예 9).
본 발명은, HIV-1의 gagpro 유전자 및 CTE (Constitutive TransportElement) 유전자를 발현시키는 알파 바이러스 벡터, 바람직하게는 gagpro 유전자가 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되고, CTE 유전자가 추가로 연결된 SFV-기재 발현 벡터를 제공한다. pSFV/gagpro-CTE는 상기 벡터의 예이다 (실시예 12).
본 발명은, HIV-1의 env, gag, gagpro 및 CTE 유전자를 발현시키는 알파 바이러스 벡터, 바람직하게는 env 유전자가 제1의 서브 게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되고, gag 유전자가 제2의 서브 게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되며, gagpro 유전자가 제3의 서브 게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되며 CTE 유전자를 추가로 포함하는 SFV-기재 발현벡터를 제공한다. pSFV/env-gag-gagpro-CTE는 상기 벡터의 예이다 (실시예 13). 본 발명은, HIV-1의 env, gag 및 gag mRNA의 3' 말단에서 리보조말 프레임 쉬프트가 일어나지 않아도 Pro 단백질을 생산할 수 있도록 gag와 pro 유전자의 연접부에서 핵산서열의 결손이 일어난 gag△pro 유전자 및 CTE 유전자를 발현시키는 알파 바이러스 벡터, 바람직하게는 env 유전자가 제1의 서브 게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되고, gag 유전자가 제2의 서브 게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되며, gag△pro 유전자가 제3의 서브 게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되고 CTE 유전자를 추가로 포함하는 SFV 기재-발현벡터를 제공한다. pSFV/env-gag-gag△pro-MPMV는 상기 벡터의 예이다 (실시예 14).
본 발명의 벡터는 당업계에 공지되어 있는 유전자 재조합 기술을 기초로 당업자가 발명의 내용에 적합한 변형을 가하여 제조할 수 있다.
본 발명은 상기의 발현 벡터를 사용하여 HIV-1 구조 단백질 Gag, Pro 및/또는 Env (전구 단백질 및 프로세싱 된 서브 유니트)를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 알파 바이러스 벡터는 광범위한 범위의 숙주 세포에서 단백질을 발현시킬 수 있다. 본 발명은 상기의 발현 벡터 또는 그 RNA 전사물을, 숙주 세포, 바람직하게는 동물 세포에서 발현시킴으로써, HIV-1의 Gag, Pro 및/또는 Env 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 동물 세포는 바람직하게는 조류, 포유동물, 파충류, 양서류, 곤충 또는 어류 세포이다. 포유 동물 세포의 예로는 사람, 원숭이, 햄스터, 쥐 및 돼지 세포를 들 수 있다. 특이 바람직한 숙주와 벡터 시스템의 예는 BHK/pSFV와 COS/pSFV이지만 본 발명의 발현 시스템은 이에 제한되지 않는다.
알파 바이러스 발현 벡터 또는 그 RNA 전사물은 통상의 트랜스펙션 방법, 예를 들어 DEAE-Dextran, 칼슘 포스페이트법, 바람직하게는 엘렉트로포레이션에 의해 동물 세포, 예를 들어 BHK-21 세포에 도입할 수 있다. 본 발명을 예시하는 pSFV 벡터의 경우 엘렉트로포레이션에 의하여 매우 높은 수율로 RNA 전사물을 숙주 세포에 도입할 수 있다. 하나 또는 둘 이상의 벡터를 코-트랜스펙션하는데도 상기 방법들이 사용될 수 있다. 엘렉트로포레이션을 포함한 트랜스펙션의 기술은 당업계에 공지되어 있다.
세포의 형질전환은 감염성 바이러스 입자로 감염시키는 경우 그 발현 효율이 증대한다. 본 발명은 헬퍼 바이러스를 사용하여 만든 본 발명에 따른 RNA 전사물을 포함하고 있는 감염성 바이러스 입자를, 숙주 세포에 감염시킴으로서 상기 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 상기의 방법들은 실시예 2 및 실시예 6에 예시되어 있다. 본 발명의 벡터 전사물이나 헬퍼 바이러스를 사용하여 만든 결손 바이러스 입자 (Defective Virus Particle)의 감염에 의하여 생산된 HIV-1 단백질들은 다양한 방법에 의해 분리될 수 있다. 분리 방법으로는 당업계에 공지의 여러 가지 방법, 예를 들어, 이온교환 크로마토그라피, 친화컬럼 크로마토그라피, 겔 퍼미에이션 크로마토그라피 등의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 벡터의 RNA 전사물, 상기 RNA를 포함한 VLP로 일시적으로 형질전환되거나 상기 벡터로 안정적으로 형질전환된 (permanently transformed) 숙주 세포 또는 세포주를 제공한다. 상기 안정하게 형질전환 된 세포주는, 예를 들어 HIV의 cDNA 게놈이 숙주 세포의 염색체에 삽입되기 위해 필요한 사이토메갈로 바이러스 (cytomegalrovirus:CMV) 프로모터와 rev-독립적인 발현을 위한 CTE (constitutive transport element) 유전자, 선택 마커로 항-네오마이신 유전자를 갖춘 동물 세포주 이다. 상기 CTE 유전자는 바람직하게는 MPMV (Mason-Pfizer monkey virus)의 유전자이다.
본 발명은 상기의 발현 벡터 및 숙주 세포를 이용하여 감염성 HIVLP을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 HIV-1의 gag 유전자를 알파 바이러스 리플리콘의 서브 게노믹 프로모터 하에 삽입한 후 상기 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하여 HIV-1의 Gag로 구성된 미성숙 바이러스-유사입자 (HIVLP)를 제조하는 방법을 제공한다. HIV의 경우 프로테이즈에 의해 절단되지 않은 Gag는 성숙 입자를 형성하지 못하고 미성숙 VLP를 형성한다. "바이러스-유사입자 (VLP)"란 야생형 바이러스와 동일하지는 않으나 유사한 물리 화학적 성질을 갖는 입자를 말한다. "미성숙 바이러스-유사입자 (immature VLP)"란 야생의 비리온이 되기 위해 필요한 프로세싱을완전히 거치지 못한 바이러스로서 입자적 구조를 형성하는 것을 말한다. "리플리콘 (replicon)"이란 유전자 복제에 필수적인 유전자를 함유하고 있는 유전체를 말하며 외래유전자를 결합시켜 바이러스를 증식시키고 외래 유전자를 발현하는 발현 벡터로 사용될 수 있다.
HIV는 Gag만으로도 바이러스 입자를 형성하지만 이것은 미성숙 형태이며 감염성 (infectivity)를 갖고 있지 않다. HIV에 대한 중화항체의 에피토프는 피막 단백질에 위치하는 것으로 알려져 있으며 이 부분이 가장 다양한 아미노산 서열(variable sequence)을 지니고 있다. 그러므로 Gag만으로 이루어진 재조합 바이러스 입자에 env 단백질를 삽입하는 것은 HIV 백신을 만들기 위한 중요한 기법 중의 하나라고 할 수 있다. 본 발명은 HIV-1의 gag 유전자를 함유한 상기의 발현 벡터 및 env 유전자를 함유한 상기의 발현 벡터를 코-트랜스펙션하여 하나의 숙주 세포에서 두 단백질을 동시에 발현시키므로서 HIV-1의 Gag와 Env 단백질로 구성된 미성숙 바이러스 입자 (HIVLP)를 제조하는 방법을 제공한다.
코-트랜스펙션에 의한 VLP의 제조는 번거로우며 효율 또한 떨어진다. 그러므로 본 발명에서는 하나의 벡터에 두가지 혹은 세가지의 목적 유전자를 클로닝한 재조합 플라스미드를 사용하여 간편하고 경제적이며 효율적으로 VLP를 생산, 회수할 수 있도록 하였다. 따라서 본 발명은 알파 바이러스 리플리콘에 HIV-1의 gag와 env유전자를 각각의 프로모터 하에 클로닝 한 후 이 벡터를 세포에 트랜스펙션하여 HIV-1의 Gag와 Env 단백질로 구성된 미성숙 바이러스 입자 (HIVLP)를 제조하는 방법을 제공한다.
HIV 바이러스는 어셈블 또는 버딩 과정 중 혹은 그 후에 프로테이즈에 의해 Gag가 절단되며 잘려진 구조 단백들이 다시 재결합하므로써 완전한 성숙입자를 구성한다. Gag단백질 만으로 이루어진 VLP은 그 크기와 모양 등에서 천연의 HIVLP와 많은 차이가 있고 또한 Gag와 Env로 이루어진 VLP도 프로테이즈에 의해 프로세싱 되지 않는 한 성숙 바이러스 입자를 형성하지 못한다. 효과적인 면역 반응을 유도하기 위해 천연에 존재하는 HIV와 가장 유사한 형태의 면역원을 제공하는 것이 중요하며 따라서 성숙 VLP를 제조하는 것은 HIV 백신으로 가장 강력한 수단을 제공하는 것이 된다. 본 발명에서는 HIV-1 의 Gag와 Pro 단백질을 동시에 발현시키거나 Gag, Env 및 Pro 단백질을 동시에 발현시키므로써 HIV의 성숙 VLP를 제조하는 방법을 개발하게 되었다. "성숙 바이러스-유사입자 (mature VLP)"란 HIV의 경우 Pro에 의해 HIV의 구조 단백질들이 완전히 프로세싱된 VLP로서 그 형태나 크기가 야생형 HIV와 실질적으로 유사한 바이러스 입자를 말한다.
본 발명은 나아가 면역반응을 일으키기에 충분한 양의 상기 발현 벡터, 상기 벡터의 RNA 전사물 또는 상기 VLP를 포함하는 AIDS 예방용 백신 조성물 및 이를 투여하여 AIDS 질병을 예방하는 방법을 제공한다. 상기 VLP에는 성숙 및 미성숙 VLP, 감염성 및 비감염성 VLP가 모두 포함된다. VLP를 백신으로 사용하는 경우 HIV가 갖는 입체 구조를 제공할 수 있기 때문에 뛰어난 면역 반응을 유도할 수 있다. 다음의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것이다. 따라서, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의하여 제한되어서는 안된다.
<실시예 1>
pSFV/gag 및 pSFV/gagpro 발현 벡터의 제조
Gag 단백질은 HIV-1의 gagpol의 전장 RNA에서 발현되는 비리온의 주된 구성요소이다. Gag 단백질은 그 자체만으로도 다른 바이러스 단백질 없이 바이러스 유사입자 (VLP)를 어셈블할 수 있다고 알려져 있다. Gag 단백질은 pol 유전자에 의해 발현되는 바이러스 프로테이즈에 의해 매트릭스 (MA, p17), 캡시드 (CA, p24), 뉴클레오캡시드 (NA, p9) 및 p6의 단백질로 프로세싱되어 성숙입자 (mature particle)를 형성한다 (Gheysen D. et al,Cell,59, 103-112 (1989)). 본 발명에서는 HIV-1의 gag 유전자를 알파 바이러스 리플리콘에 삽입하여 Gag를 발현시키는 발현 벡터를 제조하였다.
HIV clade E 유전자를 (Genbank accession number U51188, Journal of Virologly, 1996) 주형으로 사용하였다. pSFV/gag를 만들기 위해 Gag의 전장 유전자에 해당하는 HIV-1의 염기서열 (832-2328 bp)를 하기의 프라이머1 및 프라이머2를 사용하여 PCR로 증폭하였다. Gag와 더불어 프로테이즈 (Pro)를 발현시키기 위하여 pSFV/gagpro를 제작하였다. HIV-1의 gag, 프레임 쉬프트 부위 및 프로테이즈 부위를 포함한 전장 유전자 (832-2577 bp)을 프라이머1 및 프라이머3을 사용하여 PCR로 증폭하였다. 주형으로 HIV-1 clade E 전장 유전자를 지니고 있는 pUHD(100ng/㎕)에 2.5mM dNTP (Boehringer Mannheim, Germany) 4㎕, 센스 프라이머 (100pmol/㎕) 1㎕, 안티센스 프라이머 (100pmol/㎕) 1㎕,Taqpolymerase 10X 버퍼5㎕, D.W. 37㎕를 넣어 혼합액을 만든후 98℃에서 5분동안 변성시킨 후 Taq polymerase 1㎕를 첨가한 뒤 94℃에서 1분, 55℃에서 2분, 72℃에서 3분으로 유지시키는 일련의 반응을 30회 반복하였다.
프라이머1: 센스 (서열 1)
5'-GCGGATCCCGGGATGGGTGCGAGAGCGTCAATATTAAGT-3'
프라이머2: 안티센스 (서열 2)
5'-CGCGGATCCCTGTTACTGTGACAAGGGGTCGTTGCCAAA-3
프라이서3: 안티센스 (서열 3)
5'-CGCGGATCCCTGCAGTTAAAGTACAACCAATCTGAGTCAACA-3'
상기 증폭된 유전자를 각각 pSFV의 BamHI 부위에 삽입하여 pSFV/gag (도 3) 및 pSFV/gagpro (도 4)를 만들었다.
<실시예2>
pSFV-helper 와 pSFV/gag 또는 pSFV-helper 와 pSFV/gagpro를 이용한 VLP의제조
HIV-1의 프로테이즈 (Pro)는 비리온의 버딩(budding) 중 혹은 버딩 후에 활성화되어 Gag 또는 Gag-pol 폴리프로테인을 절단함으로써 구조 단백질을 프로세싱하는데 관여한다. 본 실험에서는 pSFV-helper와 함께 실시예 1에서 제조한 pSFV/gag 또는 pSFV/gagpro를 숙주 세포에서 발현시켰다.
pSFV/gag 또는 pSFV/gagpro를 제한효소 PvuⅠ으로 처리하여 선상 DNA로 만든 후 P/C처리하였다. 상기 DNA 10㎕, 10× SP6 버퍼 (TaKaRa) 5㎕, 10mM m7G(5')ppp(5')G(BM) 5㎕, 100mM DTT 2.5㎕, rNTP mix (10mM ATP, 10mM CTP, 10mM UTP, 5mM GTP, BM) 5㎕, RNasin(BM) 2㎕, SP6 RNA 폴리머라제 (TaKaRa) 1.5㎕, D.W. 19㎕로 혼합액을 만든 후, 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. mRNA 전사물 (pSFV-helper RNA 전사물 25㎕에 각각 상기 pSFV/gag 또는 pSFV/gagpro RNA 전사물 50㎕)를 PBS (Phosphate buffered saline, 1.37mM Sodium Chloride, 0.02mM Potassium Chloride, 0.1mM Phosphate buffer/ml) 버퍼에 부유시킨 BHK-21 세포 (107cells/㎖) 800㎕에 넣은 후, 0.4㎝ 엘렉트로포레이션 큐벳에서 830V/25㎌로 2번 펄스를 주었다 (Bio-Rad Gene Pulser). 트랜스펙션 48시간 후에 상층액을 3500rpm에서, 15분 동안 원심분리 한 뒤, 다시 초고속 원심분리 (SW41 rotor, 2hr, 30,000rpm, 4℃, BECKMAN)하여 바이러스 입자를 얻었다. 이 펠렛을 TNE (50mM Tris-HCl (pH7.4), 100mM NaCl, 0.5mM EDTA) 버퍼에 부유시켜 -70℃에서 보관하였다. 상층액에서 수집한 결손 VLP (defective VLP)를 SDS-PAGE 한 후, AIDS 환자 혈청 (patient human serum)을 사용하여 웨스턴 블롯하였다 (도 5) (래인 M: 음성 대조군; 래인 1: pSFV-helper와 pSFV/lacZ로부터 생성된 VLP; 래인 2: pSFV-helper와 pSFV/gag로부터 생성된 VLP; 래인 3: pSFV-helper와 pSFV/gagpro로부터 생성된 VLP).
도 5의 래인 2에서 Gag 단백질이 검출되었다. 이는 BHK-21의 세포질 내에 들어간 pSFV/gag RNA 전사물에 의해 Gag 단백질이 발현되었고, 상기 Gag 단백질로 이루어진 HIVLP가 SFVLP 입자와 함께 세포 상층액으로 방출되었음을 나타내는 것이다. Gag 단백질과 Pro를 함께 발현시키기 위해 작제된 pSFV/gagpro 발현 시스템의 웨스턴 블롯에서는 pSFV/gag의 경우에 비해 적은 양의 Gag 단백질이 검출되었다 (도 5, 래인 3). 도 5, 래인 3의 Gag 단백질 시그날이 약한 것은 Gag 단백질의 발현량이 적거나, gagpro 유전자에서 발현된 Pro에 의해 Gag 단백질이 프로세싱되었기 때문인 것으로 해석된다.
TNE 버퍼에 부유되어 있는 바이러스 입자 100㎕에 키모트립신 (10㎎/㎖) 5㎕, 50mM CaCl25㎕를 넣고 얼음에서 30분동안 반응신킨 후 아프로티닌 (2㎎/㎖) 45㎕넣어 상기 VLP를 활성화시켰다. 상기 활성화된 입자를 70% 단일층의 (monolayered) BHK-21 세포에 감염시키고 1시간 30분 후에 새 배지를 넣은 후 2일간 배양하였다. 2일 후에 세포 용해 버퍼 (cell lysis buffer: 1% NP40 (Nonidet P-40), 50mM Tris-HCl(pH7.6), 150mM NaCl, 2mM EDTA, 1㎍/㎖ PMSF) 200㎕로 1시간반응시키고 원심분리(12000rpm, 4℃, 5분)하여 얻은 상층액에 샘플 버퍼를 넣고 5분 동안 끓인 후 12% SDS-PAGE에 전기영동하였다. 전기영동한 겔을 PVDF 웨스턴 블로팅 멤브레인 (BM)으로 15V, 7mA에서 2시간 트랜스퍼한 후 특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 하였다. 사용된 1차 항체는 AIDS 환자 혈청, 2차항체는 비오틴화된 항-사람 IgG이다. 블롯은 AB 용액과 반응시킨 후 DAB 용액으로 발색시켰다 (도 6) (래인 1: pSFVgag로부터 얻어진 VLP로 감염시킨 BHK-21 세포; 래인 2: pSFVgagpro로부터 얻어진 VLP로 감염시킨 BHK-21 세포). 55 kDa의 밴드는, 재감염 결과 BHK-21 세포의 세포질에서 Gag 단백질이 생성되었음을 나타내는 것이다. 따라서, pSFV/gag 또는 pSFV/gagpro로부터 얻어진 VLP가 gag 유전자를 가진 감염성 VLP임을 알 수 있다.
<실시예 3>
pSFV/gag 또는 pSFV/gagpro를 이용한 VLP의 제조
위 실시예 2에서 만들어진 VLP에는 SFV의 코어로 된 VLP (SFVLPgag 또는 SFVLPgagpro)와 HIV-1 코어를 가진 VLP (HIVLPgag 또는 SFVLPgagpro)가 혼합되어 있으므로 HIV-1 코어로 이루어진 VLP만을 발현시키고자, 실시예 1에서 작제된 pSFV/gag 와 pSFV/gagpro를 각각 in vitro 전사하여 pSFV-helper RNA 전사물 없이 BHK-21 세포에, 상기 실시예 2의 방법으로 각각 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션된세포는 4℃에서 -20℃의 차거운 100% MtOH로 4-6분간 고정시키고 1% 젤라틴에서 1시간 블로킹한 후 HIV의 p24(capsid)에 대한 폴리클로날 항체 (토끼)로 면역화학적 스테이닝하였다. 2차 항체는 비오틴화된 항-토끼 IgG이다. 상기 실험 결과 형질전환된 BHK-21 세포에서 Gag 단백질이 발현되었음을 확인할 수 있었다 (도 7) (A: 음성대조군, 트랜스펙션되지 않은 BHK-21 세포; B: pSFV/gag로 형질전환된 BHK-21 세포; C: pSFV/gagpro로 형질전환된 BHK-21 세포).
세포질 내에서의 Gag 단백질 검출에 이어, 실시예 2의 방법에 따라 세포 배양 배지 상층액에서 VLP를 분리하여 이들을 EM으로 관찰하였다 (도 8) (A: pSFV/gag로부터 얻어진 VLP; B: pSFV/gagpro로부터 얻어진 VLP). pSFV/gag 또는 pSFV/gagpro RNA 전사물을 pSFV-helper 전사물 없이 발현시킨 경우 HIV-1의 Gag만으로 이루어진 미성숙, 감염성 VLP (HIVLPgag)가 생성됨을 알 수 있었다.
<실시예4>
pSFV/env 발현 벡터의 제조
HIV-1의 gp160 유전자를 증폭하기 위하여 HIV clade E 유전자를 (Genbank accession number U51188, Journal of Virologly, 1996) 주형으로 하고 프라이머4 및 프라이머5를 사용하여 염기 서열 (6264-8879 bp)를 PCR로 증폭하였다.
프라이머 4: 센스 (서열 4)
5'-CGCGCCTCGAGCGGGATCCCATGAGAGTGAAGGGGACACGGA-3'
프라이머 5: 안티센스 (서열 5)
5'-AATGGATCCTATAGCAAAGCCCTTTCCAAGCCC-3'
주형 HIV-1 clade E 전장 유전자를 지니고 있는 pUHD(100ng/㎕)에 2.5mM dNTP (Boehringer Mannheim, Germany) 4㎕, 센스 프라이머 (100pmol/㎕) 1㎕, 안티센스 프라이머 (100pmol/㎕) 1㎕,Taqpolymerase 10X 버퍼 5㎕, D.W. 37㎕를 넣어 혼합액을 만든 후 98℃에서 5분 가온한 후 Taq 폴리머라제 1㎕를 첨가한 뒤 94℃에서 1분, 55℃에서 2분, 72℃에서 3분으로 유지시키는 일련의 반응을 30회 반복하였다. 증폭된 유전자를 pSFV 벡터의 BamHI site에 삽입하여 pSFV/env 발현 벡터를 제작하였다 (도 9).
<실시예 5>
SFV-helper 및 pSFV/env를 이용한 VLP의 제조
HIV-1의 Env 만으로는 VLP를 형성하지 못하므로 pSFV-helper와 pSFV/env를 이용하여 VLP를 제조하였다. 실시예 4에서 제조된 pSFV/env 발현 벡터를 제한효소SphⅠ으로 처리하여 선상 DNA로 만든후 P/C처리하였다. 이 DNA 10㎕, 10× SP6 버퍼 (TaKaRa) 5㎕, 10mM m7G(5')ppp(5')G(BM) 5㎕, 100mM DTT 2.5㎕, rNTP mix (10mM ATP, 10mM CTP, 10mM UTP, 5mM GTP, BM) 5㎕, RNasin(BM) 2㎕, SP6 RNA 폴리머라제 (TaKaRa) 1.5㎕, D.W. 19㎕)로 혼합액을 만든후 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. mRNA 전사물 (pSFV/helper RNA 전사물 25㎕ 및 pSFV/env RNA 전사물 50㎕)를 PBS에 부유시킨 BHK-21 세포에 상기 실시예 2의 방법으로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 48시간 후에 상층액을 3500rpm에서, 15분 동안 원심분리한 뒤 초고속 원심분리 (SW41 rotor, 2hr, 30,000rpm, 4℃, BECKMAN)하여 바이러스 입자를 얻었다. 이 펠렛은 TNE (50mM Tris-HCl (pH7.4), 100mM NaCl, 0.5mM EDTA) 버퍼에 부유시켜 -70℃에서 보관하였다. 트랜스펙션 된 세포는 4℃에서 -20℃의 차거운 100% MtOH로 4-6분간 고정하고 1% 젤라틴에서 1시간 블로킹한 후 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 면역화학적 스테이닝하였다 (도 10) (A: 음성대조군, 트랜스펙션되지 않은 BHK 세포; B: pSFV/env로 트랜스펙션된 BHK 세포). 1차 항체로 gp160에 대한 모노클로날 항체 (1㎎/㎖), 2차 항체로 비오틴화된 항-마우스 IgG (5㎕/㎖)를 사용하였으며 AB 용액 (avidin5㎕, biotin5㎕/PBS 1㎖, VECTOR)에 30분동안 반응시킨후 DAB (3,3´-diaminobezidine) 용액 (VECTOR)으로 발색시켰다. pSFV/env로 트랜스펙션된 세포에서 Env 단백질이 발현되었다.
TNE 버퍼에 부유되어 있는 바이러스 입자 100㎕에 키모트립신 (10㎎/㎖) 5㎕, 50mM CaCl25㎕를 넣고 얼음에서 30분 동안 반응시킨 후 아프로티닌 (2㎎/㎖)45㎕넣어 VLP를 활성화시켰다. 상기 입자를 바이러스 70% 단일층의 (monolayered) BHK-21 세포에 감염시키고 1시간 30분 후에 새 배지를 넣고 2일간 배양하였다. 2일 후에 세포 용해 버퍼 (cell lysis buffer: 1% NP40, 50mM Tris-HCl(pH7.6), 150mM NaCl, 2mM EDTA, 1㎍/㎖ PMSF) 200㎕로 1시간 반응시킨 후 원심분리(12000rpm, 4℃, 5분)하여 얻은 상층액에 샘플버퍼를 넣고 5분 동안 끓인 후 12% SDS-PAGE에 전기영동하였다. 전기영동한 겔을 PVDF 웨스턴 블로팅 멤브레인 (BM)으로 15V, 7mA에서 2시간 트랜스퍼한 후 특이적 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 하였다. 사용된 1차 항체는 AIDS 환자 혈청, 2차 항체는 비오틴화된 항-사람 IgG이고, 블롯은 AB 용액과 반응시킨 후 DAB 용액으로 발색시켰다 (도 11) (래인 1: 음성대조군, BHK-21 세포; 래인 2: VLP로 감염시킨 BHK-21 세포). VLP를 수거하여 이를 in vitro 활성화시킨 후 BHK-21 세포에 감염시킨 결과 BHK-21세포의 세포질에서 Env 단백질이 생성되었으므로 감염성 SFVLPenv가 생성되었음을 알 수 있다.
<실시예6>
pSFV/gag 및 pSFV/env를 이용한 VLP의 제조
HIV의 gag 유전자만을 발현시킨 경우에 미성숙 VLP가 어셈블된다는 사실 및 HIV의 중화항체를 형성하는 데 Env 단백질이 중요한 역할을 한다는 사실이 알려져있다 (Gheysen D. et al., Cell, 59, 103-112 (1989); Lasky, L. A. et al., Science, 249, 932-935 (1986); Lasky,L. A. et al., Cell, 50, 975-985 91987)). 따라서, Gag로 이루어진 입자에 Env를 삽입하기 위해 실시예 1에서 제조된 pSFV/gag와 실시예 4에서 제조된 pSFV/env의 RNA 전사물을 동시에 트랜스펙션하는 실험을 수행하였다.
pSFV/gag와 pSFV/env를 상기 실시예 2에 기술된 방법에 따라 각각in vitro전사하여 (pSFV-helper없이) BHK-21 세포에 코-트랜스펙션시키고 48시간 동안 배양한 후에 Gag와 Env를 모두 인식하는 AIDS 환자 혈청 및 Env를 인식하는 gp160에 대한 모노클로날 항체로 세포를 임뮤노스테이닝하였다. 환자 혈청으로 스테이닝 한 경우 (도 12의 C)가 gp160에 대한 모노클로날 항체로 스테이닝 한 경우 (도 12의 B)보다 더 많이 스테이닝 된 것으로 보아 세포에서 HIV-1의 Gag 및 Env가 모두 발현되었음을 알 수 있었다 (도 12) (A: 음성대조군; B: gp160에 대한 모노클로날 항체; C: AIDS 환자 혈청). 이 결과로부터 HIV-1의 Gag와 Env로 이루어진 HIVLP가 만들어지고 있음을 알 수 있다.
<실시예7>
VLP 내에 패키징된 RNA의 분석
pSFV/gag RNA 전사물 만을 발현시켜 얻어진 실시예 3의 VLP나 pSFV/gag와pSFV/env의 RNA 전사물을 동시에 트랜스펙션하여 얻어진 실시예 6의 VLP들이 핵산을 포함하고 있는지를 알아보기 위해, 상기의 VLP를 10% 슈크로스 쿠션에 통과시켰다. 다른 RNA나 DNA의 오염을 막기 위해서 1 mg RNase A와 70 U RNase-free DNase I 으로 상온에서 한시간 동안 MgSO4-아세테이트 버퍼 상태에서 반응을 시켰다. RNA 분리 키트 (Viral RNA purification kit; Viogene)을 이용하여 RNA를 분리하여 RT-PCR과 PCR을 수행하였다. gag 유전자를 위해서는 650 bp 정도의 p24 유전자를 증폭하고, env 유전자를 위해서는 350 bp 정도의 gp41의 일부분을 증폭시켰다.
4㎕의 5배 농축된 수퍼스크립트 II 역전사 버퍼 (250 mM Tris-HCl[pH 8.5], 375 mM KCl, 15 mM MgCl2), 2㎕의 0.1 M DTT, 4㎕의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트 버퍼 (dNTP; 25 mM ; TaKaRa) 및 프라이머를 넣은 후 총 20㎕로하여 42 ℃에서 2분 동안 방치하였다. 상기 용액에 1㎕의 수퍼스키립트 II 역전사 효소 ( Molony Murine Leukemia Virus의 pol 유전자에서 유래한 역전사효소 (Gibco BRL))를 넣어 42 ℃에서 50분동안 반응시켜 cDNA를 만들었다. gag RNA에 대해서는 1㎕의 100 pmol의 프라이머 6을, env RNA를 위해서는 프라이머 7을 사용하였다.
프라이머 6: 안티센스 (서열 6)
5'-CCCAAGCTTTTAGCATGCTGTCATCATTTC-3´
프라이머 7: 안티센스 (서열 7)
5'-GGTTCTGCAGAAGCTTCCTTGTTATTTCAAACCA-3´
생성된 RNA/DNA 하이브리드를 변성시킨 후 70 ℃에서 15분 동안 역전사효소의 활성을 억제시켰다. 이렇게 생성된 cDNA를 Z tag DNA 폴리머라제 (TaKaRa)와 프라이머를 사용하여 증폭하였다 (프라이머 8 과 프라이머 6, gag RNA 검색; 프라이머 9와 프라이머 7, env RNA 검색).
프라이머 8: 센스 (서열 8)
5'-CCCAAGCTTCATCAGGCCTTATCACCT-3´
프라이머 9: 센스 (서열9)
5'-TCCCCCGGGAAGCTTGCGCAGCAGCATCTGTTG-3´
주형으로 상기의 RT-PCR에서 생성된 cDNA 10㎕, 2.5mM dNTP (Boehringer Mannheim, Germany) 4㎕, 센스 프라이머 (100pmol/㎕) 1㎕, 안티센스 프라이머 (100pmol/㎕) 1㎕, Z taq polymerase 10X 버퍼 5㎕, D.W. 28㎕, Z taq polymerase(TaKaRa) 1㎕를 넣어 혼합액을 만든 후 94 ℃에서 5분 동안의 변성 후에 94 ℃에서 1분, 55 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분의 일련의 반응을 35회 실시하고 72 ℃에서 7분 동안 반응시켰다. 증폭된 산물은 아가로스 겔에 전기영동 한 후 UVillumination으로 관찰하였다.
p24 유전자는 pSFV/gag RNA 전사물만을 발현시켜 얻어진 HIVLP나 pSFV/gag와 pSFV/env의 RNA 전사물을 동시에 트랜스펙션시켜 얻어진 HIVLP 모두에서 증폭되었다 (도 13의 래인 1 및 2). 그러나, gp41 유전자는 어느 VLP에서도 증폭되지 않았다 (도 13의 래인 1 내지 3). 상기 결과는 오직 gag 유전자를 가진 RNA만이 VLP에 패키징되어 버딩된다는 것을 나타내는 것이다. (래인 1: pSFV/gag로부터 얻어진 VLP; 래인 2와 3: pSFV/gag와 pSFV/env의 코-트랜스펙션에 의한 VLP; 래인 1과 2는 p24 프라이머를 사용하여 증폭한 것이고, 래인 3은 p41 프라이머를 사용하여 증폭한 것이다. 650 bp는 gag 유전자 부위를, 350 bp는 env 유전자 부위를 나타낸다).
<실시예 8>
결손 SFVLP의 감염에 의한 성숙 VLP의 생산
상기 실시예 2 및 실시예 5에서 얻어진 VLP들을 in vitro에서 활성화시켜 COS-1 세포에 감염시킨 후 VLP의 생산 여부를 확인하였다. 감염된 COS-1 세포 용해물과 상층액에서 얻은 VLP를 AIDS 환자 혈청과 p24에 대한 폴리클로날 항체 (토끼)와 p24에 대한 모노클로날 항체로 웨스턴블롯 하였다 (도 14). (A: AIDS 환자 혈청; B: p24에 대한 폴리클로날 항체; C: p24에 대한 모노클로날 항체; 음성대조군 (래인 1, 4, 7, 10, 13); SFVLPgag로 감염 (래인 2, 5, 8, 11, 14); SFVLPgag와 SFVLPenv로 동시 감염 (래인 3, 6, 9, 12, 15); 세포 용해물 (래인 1, 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12); VLP (래인 4, 5, 6, 13, 14, 15)).
도 14의 A와 B에서, gag 유전자를 함유한 결손 SFVLP로 감염시킨 경우 세포내 (래인 2, 8)와 그 상층액의 VLP (래인 5)에서 Gag 단백질이 검출되었다. gag와 env 유전자를 각각 함유하고 있는 SFV 리플리콘을 동시에 감염시킨 경우에는 세포내 (래인 3, 9)와 그 상층액에서 얻은 VLP (래인 6)에서 Gag와 Env의 단백질이 모두 검출되었다. 따라서, Gag와 Env 단백질들이 한 세포에서 동시에 발현되는 경우 이 두 단백질로 구성된 VLP가 생성됨을 확인할 수 있었다.
도 14의 C에서 p24에 대한 모노클로날 항체 (Biogenesis, Cat. No. 4999-8607)로 웨스턴 블롯한 결과 Gag의 전구체인 Pr55 및 p24가 검출되었다. 이는 COS-1 세포 내에서 HIV-1의 프로테이즈가 발현되지 않아도 Gag의 전구체가 프로세싱 되어 성숙 HIVLP를 생성함을 의미하는 것으로서 COS-1 세포에 Gag 단백질을 프로세싱 할 수 있는 활성이 있는 것으로 생각된다.
<실시예 9>
pSFV/env-gag와 pSFV/env-gag-pro 발현 벡터의 제작
26S 서브프로모터를 지닌 pro (2268-2606 bp) 유전자를 클로닝하기 위해pSFV/pro를 제작하였다. 프라이머 10 및 프라이머 11을 사용하여 주형으로 HIV-1 clade E 전장 유전자를 지니고 있는 pUHD(100ng/㎕)에 2.5mM dNTP (Boehringer Mannheim, Germany) 4㎕, 센스 프라이머 (100pmol/㎕) 1㎕, 안티센스 프라이머 (100pmol/㎕) 1㎕,Taqpolymerase 10X 버퍼 5㎕, D.W. 37㎕를 넣어 혼합액을 만든후 98℃에서 5분후 Taq polymerase 1㎕를 첨가한 뒤 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 30초로 유지시키는 일련의 반응을 40회 반복하였다.
프라이며 10: 센스 (서열 10)
5'-CCAAGATCTATGACAGCCTCCTCCTTTAGTTTC-3'
프라이머 11: 안티센스 (서열 11)
5'-CAACCCGGGTCGCGATTAAGTGTCAATAGGACTAAT-3'
프라이머 양 말단에 장착한 EcoRV와 SmaI 부위를 이용하여 pSFV의 멀티클로닝 부위인 SmaI site에 상기 반응에서 증폭된 유전자를 삽입하였다 (도 15).
pSFV/env-gag 벡터는 상기 실시예 1에서 제조한 pSFV/gag를 주형으로 26S 서브게노믹 프로모터에 대한 프라이머 12 (센스), gag에 대한 프라이머 2 (안티센스)를 사용하여 26S gag 유전자를 증폭한 뒤 pSFV/env의 SmaI site에 삽입함으로써 제조하였다 (도 16).
프라이머 12: 센스 (서열 12)
5'-CCGGATATCACCTCTACGGCGGTCCTA-3'
프라이머 13: 안티센스 (서열13)
5'-CGCCCGGGTTACTGTGACAAGGGGTCGTTGCCAAA-3'
상기에서 제조한 pSFV/pro를 주형으로, 서브게노믹 프로모터 프라이머(서열 12)와 pro의 안티센스 프라이머(서열 11)를 사용하여 26Spro 유전자를 증폭하고 이를 상기 pSFV/env-gag의 SmaI site에 삽입하여 pSFV/env-gag-pro를 제작하였다 (도 17). 여기서 증폭된 pro gene은 실시예 1의 gagpro의 pro 유전자보다 N-말단 서열은 줄어들고 C-말단 서열을 더 포함하고 있다. 이것은 자가-프로세싱하는데 필요한 서열을 포함하여 pro 유전자를 증폭한 것이다 (Viviane V. et al., J. Gen. Virol. 73, 639-651 (1992)). 본 발명의 pSFV/env-gag-pro 벡터는 부다페스트 조약 하의 기탁기관인 Korean Culture Center of Microorganisms에 기탁번호 KCCM-10233으로 기탁되었다.
<실시예 10>
pSFV/env-gag의 발현에 의한 VLP의 생산
Gag에 Env가 삽입된 VLP를 만들기 위해 HIV의 두 구조 단백질이 각각의 프로모터 하에 하나의 벡터에 연속적으로 클로닝된 실시예 9의 발현 벡터 pSFV/env-gag를 세포에 감염시켰다. pSFV/env-gag의 RNA 전사물을 BHK-21 세포에 트랜스펙션하여 48시간 후 그 세포 용해물 또는 배지 상층액에서 얻은 VLP를 AIDS 환자 혈청으로 ECL (enhanced chemiluminescent substrate) 방법을 이용하여 웨스턴 블롯 하였다 (도 18) (래인 1: 음성대조군; 래인 2,3: 세포 용해물; 래인 4,5: 세포 상층액). VLP에서 Gag와 Env 두 단백질이 모두 발견되었는 바, 두 개의 서브게노믹 프로모터 하에 env와 gag 유전자를 각각 연결하여 클로닝하였을 때 이들 두 단백질이 세포에서 모두 발현되며, 상호 결합하여 바이러스 입자를 형성함을 알 수 있다. 도 18에서 배지 상층액의 Gag 단백질 크기가 작게 보이는 것은 혈청 성분인 65kDa의 알부민에 의해 밀려서 전기영동되었기 때문이다.
<실시예 11>
pSFV/env-gag-pro의 발현에 의한 성숙 VLP의 제조
상기 실시예 9에서 제조된 pSFV/env-gag-pro 벡터를 숙주세포에서 발현시켜 바이러스 코어 단백질이 프로세싱된 성숙 VLP를 제조하였다. pSFV/env-gag-pro의 RNA 전사물을 BHK-21 세포에 트랜스펙션시킨 후 48시간 뒤에 세포를 AIDS 환자 혈청, gp160에 대한 모노클로날 항체, p24에 대한 폴리클로날 항체 및 프로테이즈에대한 폴리클로날 항체 (양)로 면역세포화학 스텐인하였다 (도 19) (A: 음성대조군; B: 환자 혈청; C: gp160에 대한 모노클로날 항체; D: p24에 대한 폴리클로날 항체; E: 프로테이즈에 대한 폴리클로날 항체). 이들 항체 모두가 각 항원을 인식하였으므로, 각각의 26S 서브게노믹 프로모터로부터 Gag 와 Env 및 Pro가 모두 발현되었음을 알 수 있다. 위 실험은 나아가 알파 바이러스 발현 벡터의 26S 서브게노믹 프로모터에 연속으로 연결된 3개 이상의 외래 유전자가 모두 발현될 수 있음을 보여주는 결과이기도 하다.
<실시예 12>
pSFV/env-gag-gagpro-CTE 발현 벡터의 제조
pSFV/CTE 벡터를 제조하기 위해서 pGEM 7fz(-)/MPMV를 주형으로 하기의 프라이머 14와 프라이머 15를 사용하여 증폭한 후, pSFV의 BamHI과 SmaI 자리에 삽입하였다 (도 20). 상기 벡터에 실시예 1에서 제조한 pSFV/gagpro의 gagpro를 BamHI 처리하여 pSFV/CTE의 BamHI자리에 삽입하여 pSFV/gagpro-CTE를 제조하였다 (도 21). pSFV/gagpro-CTE 벡터는 pSFV/gagpro 서열 뒤에 메이슨-파이자 멍키 바이러스의 CTE 유전자를 삽입한 것이다.
상기pSFV/gagpro-CTE를 주형으로 하여, 26S 서브게노믹 프로모터를 포함한 gagpro 전장 유전자와 CTE 유전자를 PCR로 증폭하여 실시예 9에서 제작된pSFV/env-gag 플라스미드의 SmaI site에 삽입하여 pSFV/env-gag-gagpro-CTE 발현벡터를 제조하였다 (도 22). 증폭반응은 프라이머 12 및 프라이머 15를 사용하여 주형 pSFV/gagpro-CTE 1㎕에 2.5mM dNTP (Boehringer Mannheim, Germany) 4㎕, 센스 프라이머 (100pmol/㎕) 1㎕, 안티센스 프라이머 (100pmol/㎕) 1㎕,Taqpolymerase 10X 버퍼 5㎕, D.W. 37㎕를 넣어 혼합액을 만든 후 98℃에서 5분후 Taq polymerase 1㎕를 첨가한 뒤 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분로 유지시키는 일련의 반응을 40회 반복하였다. 본 발명의 pSFV/env-gag-gagpro-CTE 벡터는 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 Korean Culture Center of Microorganisms에 기탁번호 KCCM-10234로 기탁되었다.
프라이머 14 센스 (서열 14)
5'-AATGGATCCCCTCCCCTGTGAGCTAGACT-3'
프라이머 15 안티센스 (서열 15)
5'-AATGATATCAGATCTCCAAGACATCATCCGGGCAA-3'
<실시예 13>
pSFV/env-gag-gag△pro-CTE 발현 벡터의 제조
gag△pro는 gagpro의 리보조말 프레임 쉬프트 시그날에서 보존된 서열인 다섯 개의 T를 제거한 것이다. 이 gag△pro를 만들기 위해 우선 상기 실시예 1의 pSFV/gag를 주형으로 하여, 26S 서브게노믹 프로모터 및 프레임 쉬프트가 되기 바로 전의 gag 유전자(832-2113)를 프라이머 12와 하기의 프라이머 16을 사용하여 PCR로 증폭한후 pGEMT 벡터(Promega)에 삽입하였다.
증폭은 주형으로 pSFV/gag 1㎕에 2.5mM dNTP (Boehringer Mannheim, Germany) 4㎕, 센스 프라이머 (100pmol/㎕) 1㎕, 안티센스 프라이머 (100pmol/㎕) 1㎕,Taqpolymerase 10X 버퍼 5㎕, D.W. 37㎕를 넣어 혼합액을 만든후 98℃에서 5분후 Taq 폴리머라제 1㎕를 첨가한 뒤 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분로 유지시키는 일련의 반응을 40회 반복하였다. 또한 상기 실시예12의 pSFV/gagpro-CTE를 주형으로 하여 프레임 쉬프트 시그날의 보존 서열을 배제한 pro의 전장 유전자를 프라이머 17과 프라이머 15를 사용하여 PCR로 증폭한 후 pGEMT vector에 삽입하였다.
프라이머 16 안티센스 (서열 16)
5'-AATAGGCCTGTCTTTCAGTGCAGTCTT-3'
프라이머 17 센스 (서열 17)
5'-CACAGGCCTATAGGGAAAATCTGGCCTTC-3'
두 유전자는 StuI 제한 효소로 처리하여 연결하였고 이 과정중에 아미노산 Asn (Asparagine)이 Tyr (Tyrosine)으로 치환되었으며, 5개의 T를 제거함으로써 Phe(Phenylalanine) 아미노산 2개가 제거되었다. 완성된 gag△pro는 EcoRV 제한효소를 처리하여 pSFV/env-gag의 SmaI 부위에 삽입하여 pSFV/env-gag-gag△pro-CTE 발현 벡터를 제조하였다 (도 23).
(서열 18) F F R E
CAG GCT AATTT TTT AGG GAA Gag-pol의 프레임 쉬프트 부위
Q A N
(서열 19)
CAG GCC TAT AGG GAA Gag△pro의 변형부위
Q A Y R E
알파 바이러스 시스템을 이용하여 HIV-1의 백신, 특히 원래의 HIV 항원과 유사한 형태를 갖는 (성숙) HIV 유사 입자를 제조하는 방법을 제공한다.

Claims (45)

  1. HIV-1의 gag 유전자 (832-2328 bp)가 서브게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결된 알파 바이러스-기재 발현 벡터
  2. 제 1항에 있어서, HIV-1의 gag 유전자 (832-2328 bp)가 26S 서브게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결된 셈리키 포리스트 바이러스(SFV)-기재 발현 벡터
  3. 제 2항에 있어서, pSFV/gag 발현 벡터
  4. HIV-1의 gagpro 유전자 (832-2577 bp)가 서브 게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결된 알파 바이러스-기재 발현 벡터
  5. 제 4 항에 있어서, HIV-1의 gagpro 유전자 (832-2577 bp)가 26S 서브게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결된 셈리키 포리스트 바이러스(SFV)-기재 발현 벡터
  6. 제 5항에 있어서, pSFV/gagpro 발현 벡터
  7. HIV-1의 env 유전자 (6264-8879 bp)가 서브 게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결된 알파 바이러스-기재 발현 벡터
  8. 제 7항에 있어서, HIV-1의 env 유전자 (6264-8879 bp)가 26S 서브 게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결된 셈리키 포리스트 바이러스(SFV)-기재 발현 벡터
  9. 제 8항에 있어서, pSFV/env 발현 벡터
  10. HIV-1의 pro 유전자 (2268-2606 bp)가 서브게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결된 알파 바이러스-기재 발현 벡터
  11. 제 10항에 있어서, HIV-1의 pro 유전자 (2268-2606 bp)가 26S 서브게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결된 셈리키 포리스트 바이러스(SFV)-기재 발현 벡터
  12. 제 11항에 있어서, pSFV/pro 발현 벡터
  13. HIV-1의 env 유전자 (6264-8879 bp)가 제 1의 서브게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되고, HIV-1의 gag 유전자 (832-2328 bp)가 제 2의 서브게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결된 알파 바이러스-기재 발현 벡터
  14. 제 13항에 있어서, HIV-1의 env 유전자 (6264-8879 bp)가 제 1의 26S 서브게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되고, HIV-1의 gag 유전자 (832-2328 bp)가 제 2의 26S 서브게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결된 셈리키 포리스트 바이러스(SFV)-기재 발현 벡터
  15. 제 14항에 있어서, pSFV/env-gag 발현 벡터
  16. HIV-1의 env 유전자 (6264-8879 bp)가 제 1의 서브게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되고, HIV-1의 gag 유전자 (832-2328 bp)가 제 2의 서브게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되며, HIV-1의 pro 유전자 (2268-2606 bp)가 제 3의 서브게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결된 알파 바이러스-기재 발현 벡터
  17. 제 16항에 있어서, HIV-1의 env 유전자 (6264-8879 bp)가 제 1의 26S 서브게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되고, HIV-1의 gag 유전자 (832-2328 bp)가 제 2의 26S 서브게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되며, HIV-1의 pro 유전자 (2268-2606 bp)가 작동 가능하도록 연결된 셈리키 포리스트 바이러스(SFV)-기재 발현 벡터
  18. 제 17항에 있어서, pSFV/env-gag-pro 발현 벡터
  19. HIV-1의 env 유전자 (6264-8879 bp)가 제 1의 서브게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되고, HIV-1의 gag 유전자 (832-2328 bp)가 제 2의 서브게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되며, HIV-1의 gagpro 유전자 (832-2577 bp)가 제 3의 서브게모믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결된 알파 바이러스-기재 발현 벡터
  20. 제 19항에 있어서, HIV-1의 env 유전자 (6264-8879 bp)가 제 1의 26S 서브게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되고, HIV-1의 gag 유전자 (832-2328 bp)가 제 2의 26S 서브게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결되며, HIV-1의 gagpro 유전자 (832-2577 bp)가 제 3의 26S 서브게노믹 프로모터 하에 작동 가능하도록 연결된 셈리키 포리스트 바이러스 기재(SFV)-발현 벡터
  21. 제 20항에 있어서, pSFV/env-gag-gagpro 발현 벡터
  22. 제 19항 내지 제 21항에 있어서, CTE (constitutive transport element) 유전자를 추가로 포함하는 발현 벡터
  23. 제 22항에 있어서, CTE 유전자가 메이슨-파이저 몽키 바이러스로부터 기원하는 것인 발현 벡터
  24. 제 1항 내지 제 23항의 발현 벡터 또는 그 RNA 전사물을 동물 세포에 도입하여 발현시키는 것을 특징으로 하는 HIV-1 단백질의 제조 방법
  25. 제 24항에 있어서, Gag를 발현시키는 것을 특징으로 하는 방법
  26. 제 24항에 있어서, Env를 발현시키는 것을 특징으로 하는 방법
  27. 제 24항에 있어서, Pro를 발현시키는 것을 특징으로 하는 방법
  28. 제 24항에 있어서, Gag와 Env를 동시에 발현시키는 것을 특징으로 하는 방법
  29. 제 24항에 있어서, Gag와 Pro를 동시에 발현시키는 것을 특징으로 하는 방법
  30. 제 24항에 있어서, Gag, Env 및 Pro를 동시에 발현시키는 것을 특징으로 하는 방법
  31. 제 24항 내지 제 30항에 있어서, 동물 세포가 BHK 세포 또는 COS 세포인 것을 특징으로 하는 방법
  32. 제 31항에 있어서, 동물 세포가 트랜스펙션에 의해 일시적으로 형질 전환된 것인 동물 세포
  33. 제 31항에 있어서, 동물 세포가 안정적으로 형질 전환된 (stably transformed) 동물 세포
  34. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 하나의 발현 벡터를 동물 세포에 도입하여 발현시키므로서 HIV-1의 Gag로 구성된 바이러스-유사입자 (VLP)를 제조하는 방법
  35. 제 13항 내지 제23항의 발현 벡터 중 어느 하나의 발현 벡터를 동물 세포에 도입하여 발현시키므로써 HIV-1의 Gag 및 Env로 구성된 바이러스-유사입자(VLP)를 제조하는 방법
  36. 제 35항에 있어서, 성숙 바이러스-유사입자(VLP)를 제조하는 방법
  37. 제 35항 또는 제 항에 있어서, 바이러스-유사입자(VLP)가 감염성인 것을 특징으로 하는 방법
  38. 제 35항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 동물 세포가 BHK 세포 또는COS 세포인 방법
  39. 면역 반응을 일으키기에 충분한 양의 제 1항 내지 제 23항의 발현 벡터 또는 그 RNA 전사물의 어느 하나 또는 그 둘 이상의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 AIDS 백신 조성물
  40. 면역 반응을 일으키기에 충분한 양의 제 34항 내지 제 38항의 방법에 의해 제조된 바이러스-유사 입자 중의 어느 하나 또는 그 둘 이상의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 AIDS 백신 조성물
  41. 제 40항에 있어서, 바이러스-유사입자가 Gag와 Env로 구성된 것을 특징으로 하는 백신 조성물
  42. 제 41항에 있어서, 바이러스-유사입자가 성숙 바이러스 유사 입자인 것을 특징으로 하는 백신 조성물
  43. 제 40항 내지 제 43항에 있어서, 바이러스-유사입자가 감염성인 것을 특징으로 하는 백신 조성물
  44. 기탁번호 KCCM-10233으로 기탁된 벡터
  45. 기탁번호 KCCM-10234로 기탁된 벡터
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