ES2247279T3

ES2247279T3 - Fraccion fenolica rica en floricina y su utilizacion como agente cosmetico, alimentario o nutraceutico.

Info

Publication number: ES2247279T3
Application number: ES02290690T
Authority: ES
Inventors: David Gaudout; Denis Megard; Claude Inisan; Christian Esteve; Frederic Lejard
Original assignee: Diana Ingredients SAS
Current assignee: Diana Ingredients SAS
Priority date: 2001-03-23
Filing date: 2002-03-19
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2022-03-19
Also published as: DE60206095D1; DK1243586T3; ATE304538T1; FR2822466B1; US20060073223A1; DE60206095T2; JP2002322067A; FR2822466A1; EP1243586A1; US7041322B2; JP5192110B2; US7427418B2; EP1243586B1; US20030003120A1

Abstract

Fracción procedente de fruta de la familia de las Rosaceae, caracterizada porque comprende al menos 20% de polifenoles que comprenden al menos 10% en peso de floricina con relación a los polifenoles totales.

Description

Fracción fenólica rica en floricina y su utilización como agente cosmético, alimentario o nutracéutico.

La presente invención se refiere a una fracción fenólica de frutas así como al procedimiento de obtención de esta fracción. Este extracto rico en un compuesto antioxidante, la floricina, es utilizable como preparación cosmética, alimenticia o nutracéutica.

Es conocido que los compuestos polifenólicos están bastante difundidos y en cantidad importante en el reino vegetal. En la familia de las Rosaceae en particular, el análisis de los polifenoles de la manzana ha conducido a la identificación de al menos 37 compuestos fenólicos de los cuales los más abundantes son ácido clorogénico, procianidinas B_{1} y B_{2}, epicatequina, floretina, floricina y ácido p-cumárico. Algunos de estos compuestos poseen propiedades fisiológicas tales como propiedades antioxidantes, antimutágenas, antialergicas, anticancerosas, antidiabéticas
y otras.

Otros numerosos productos ricos en polifenoles existen en el mercado, extrayéndose los más corrientes del té verde, de pepitas de uva y de corteza de pino (US A 4698360, EP A 348781, EP A 283349, FR A 1427100, FR A 2092743, FR A 2643073 y FR A 2372823). Se ha descrito ya en la patente EP A 0657169 la extracción de una fracción polifenólica a partir de frutas no maduras (que pesan de 3 a 10 gramos) de la familia de las Rosaceae. La fracción polifenólica así definida se caracteriza por un alto contenido en derivados de la familia de los ácidos hidroxicinámicos (ácido clorogénico, ácido cafeico, ácido p-cumárico), y en moléculas de la familia de los flavonoles (catequina, epicatequina y procianidina). El análisis por cromatografía líquida de alta presión de un extracto procedente del zumo de frutas inmaduras muestra que la floricina representa menos de 7% en peso del conjunto de los compuestos fenólicos y las dihidrocalconas (floricina y floretina) menos de 9%.

Entre los compuestos fenólicos, la floretina y su derivado glicosilado, la floricina son típicos de la manzana y de otras frutas de la familia de las Rosaceae. La floricina se encuentra en particular en cantidad importante en las pepitas, pero está igualmente presente en los zumos y la piel de manzana. La floricina posee una actividad antioxidante que permite una protección cardiovascular similar a la de los estrógenos. Por otra parte, la floricina es capaz de reaccionar sobre la melanogénesis por activación de una cascada de enzimas de las cuales la tirosinasa, permitiendo así una protección aumentada frente a los rayos ultravioletas. La floricina presenta igualmente una acción antidiabética por inhibición competitiva del transporte sanguíneo sodio-dependiente de metabolitos tales como la glucosa, la galactosa y otros. La floricina interviene igualmente en la inhibición del crecimiento de células tumorales por bloqueo de la actividad proteinoquinasa C.

Sin embargo, en la manzana (triturada o zumo), las dihidrocalconas (floretina y floricina) están presentes en cantidad menor con relación a los otros polifenoles. El ácido clorogénico y las procianidinas son los polifenoles mayoritarios de las manzanas, bien sean manzanas "para sidra" o "para comer", la floricina y la floretina no representan nunca más de 5% en peso de los polifenoles totales de manzanas para sidra maduras (análisis de 15 variedades diferentes) (figuras 1 y 2).

En los extractos polifenólicos conocidos, las proporciones entre las diferentes moléculas fenólicas se conservan en relación a las proporciones presentes en las diferentes materias primas, con la excepción de las procianidinas poliméricas que se pierden o se degradan durante la extracción:

Se obtienen entonces clásicamente extractos polifenólicos ricos en ácidos hidroxicinámicos (ácidos cafeico, clorogénico y cumárico) y en flavonoles (catequina, epicatequina y procianidinas), y pobres en dihidrocalconas (floricina y floretina) (véase figura 3).

Compuesto fenólico	Manzana* en mg/L de zumo o kg	Extracto polifenólico conocido de
	de triturado	manzana (en mg/g polvo)
Ácido cafeico	\varepsilon	21,7
Catequina	\varepsilon a 150	15,1
Ácido clorogénico	60 a 1200	161,0
Procianidinas	500 a 5000	69,6 (B_{1} y B_{2})
Ácido p-cumárico	1 a 150	9,3
Epicatequina	\varepsilon a 1400	41,4
Floricina	6 a 100	32,7

(Continuación)

Compuesto fenólico	Manzana* en mg/L de zumo o kg	Extracto polifenólico conocido de
	de triturado	manzana (en mg/g polvo)
Quercitrina	\varepsilon	1,9
Floretina	5 a 100	9,5
Polifenoles totales
(expresados en equivalente floricina)		483,4
\varepsilon = cantidad no cuantificable
* \begin{minipage}[t]{140mm} Valores recopilados de medidas en 15 variedades de manzanas para sidra y 3 variedades de manzanas para comer en 3 campañas. \end{minipage}

Karadeniz F & Ekski A. Phenolic compounds in apple juice from different varieties.

Report - Scientific Technical Com. Int. Fed. Fruit Juice Producers, (1996), 24, pp 265-275.

Sanoner P., Guyot S., Marnet N. et Drilleau J.F. Polyphenolic profiles of French cider apples varieties. En "Polyphenols, wines and health", symposium, Bordeaux, (14-16 avril 1999).

Sanoner P., Guyot S., Marnet N. Molle D. et Drilleau J.F. Polyphenol profiles of French cider apples varieties. J. Agric. Food Chem. (1999), 47, pp 4847-4853.

Hay muy poco, casi nada, ácido cafeico naturalmente en las manzanas. El ácido cafeico es de hecho probablemente un producto de degradación del ácido clorogénico (Fiedler, 1954, Arzneimittel-Forsch, 4, 41).

La firma solicitante ha puesto a punto nuevas fracciones fenólicas, que constituyen el objetivo de la invención.

La invención tiene igualmente como objetivo el procedimiento de obtención de esta fracción.

Otro objetivo está constituido por las aplicaciones de esta fracción como complemento alimenticio, nutracéutico o como medio de protección contra los rayos ultravioletas y como composición cosmética.

Otros objetivos aparecerán con la lectura de la descripción y de los ejemplos que siguen.

La fracción polifenólica conforme a la invención, comprende al menos 20% en peso de polifenoles y de preferencia 50% de los cuales 10% al menos en peso está compuesto de floricina y de preferencia entre 10 y 70%. Este extracto puede comprender igualmente en su composición ácido clorogénico, epicatequina, procianidina B_{2}, quercitrina, ácido p-cumárico así como floretina.

Una composición particularmente preferida de esta fracción polifenólica es la que contiene en peso:

-: más de 20% de polifenoles totales, preferentemente más de 50%

-: al menos 30% de polifenoles de floricina y de preferencia de 30 a 40% en peso

-: como más 11% de polifenoles de ácido clorogénico y de preferencia entre 2 y 11% en peso

-: como más 4% de polifenoles de epicatequina

-: como más 2% de polifenoles de procianidina B_{2}

-: como más 1,5% de polifenoles de quercitrina

-: como más 0,4% de polifenoles de ácido p-cumárico

-: y menos de 0,2% de polifenoles de ácido cafeico

Otro objetivo de la invención es que el ácido cafeico está presente en proporciones en peso inferiores a 20% del peso de floricina presente. De preferencia, el ácido cafeico representa menos de 1% en peso de los polifenoles totales de los extractos. La proporción de floricina es 9 veces superior en peso a la de la catequina. La cantidad de floricina presente es al menos equivalente en peso a la del ácido clorogénico.

Otro objetivo de la invención se caracteriza porque contiene floretina. Por una hidrólisis ácida controlada, se puede transformar la casi totalidad de la floricina en floretina, menos soluble en agua.

Otro objetivo está caracterizado porque las dihidrocalconas están presentes en proporciones superiores o iguales a 40% en peso con relación a los ácidos hidroxicinámicos.

El procedimiento de extracción que permite la extracción selectiva de una fracción polifenólica rica en dihidrocalconas a partir de manzanas maduras se caracteriza porque comprende las etapas siguientes:

* Las manzanas trituradas son objeto de una o varias extracciones sólido/líquido, en presencia o no de agua añadida.

* A continuación el extracto sólido húmedo obtenido es bien sea secado, bien sea licuado enzimáticamente para obtener un extracto líquido.

* El extracto sólido seco se somete a nuevas extracciones durante un tiempo comprendido entre 10 minutos y 2 horas con un disolvente orgánico polar, de preferencia un alcohol alifático de C_{1}-C_{4}, puro o en mezcla con agua para obtener un extracto orgánico.

* Este se evapora en seco a una temperatura inferior o igual a 60ºC de preferencia bajo presión reducida.

* A continuación este residuo se recupera con agua antes de ser retirada varias veces, de preferencia 4 veces, con un disolvente no miscible en agua, de preferencia acetato de etilo o acetato de metilo o de propilo.

* Las disoluciones orgánicas obtenidas se mezclan y se evaporan en seco a una temperatura inferior a 60ºC, preferentemente inferior a 50ºC, para obtener la fracción polifenólica objeto de la presente invención.

* Por otra vía, el extracto sólido húmedo se mezcla con agua en presencia de una mezcla enzimática durante un tiempo comprendido entre 1 y 4 horas a una temperatura comprendida entre 30 y 50ºC, preferentemente entre 40 y 45ºC, para obtener un extracto líquido.

* Este extracto líquido se clarificó por centrifugación o por filtración, después por ultrafiltración.

* El extracto se carga en una columna cromatográfica rellena de una resina adsorbente de tipo estireno-divinilbenceno. La resina se lava con agua acidificada para eliminar las impurezas y los azucares residuales. Los polifenoles se eluyen a continuación con un disolución hidroalcohólica que contiene entre 40 y 70% de etanol preferentemente entre 50 y 60% en peso. Otros alcoholes alifáticos de C_{1}-C_{4}, pueden utilizarse tales como metanol o butanol.

* Si es necesario, se introduce una etapa de desencerado en el curso del procedimiento.

* El producto obtenido por extracción se recupera una última vez con agua antes de secarse de preferencia por atomización o liofilización para obtener un polvo beige que contiene al menos 20% en peso de polifenoles, preferentemente más de 50% de polifenoles, y de los cuales 10% en peso y preferentemente entre 10 y 70% de los polifenoles son dihidrocalconas, preferentemente floricina.

Las fracciones se obtienen por el procedimiento anteriormente descrito de preferencia a partir de manzanas maduras de la familia de las Rosaceae y en particular de la especie Malus sylvestris Mill.

Este extracto de manzanas comestibles que posee las características enunciadas, obtenido según el procedimiento anteriormente descrito, se utiliza como complemento alimenticio o nutracéutico.

La fracción fenólica rica en dihidrocalconas según la invención presenta propiedades como agente de protección frente a los rayos ultravioletas.

La fracción fenólica rica en dihidrocalconas según la invención presenta propiedades como agente antioxidante.

La invención tiene igualmente por objetivo una composición cosmética que comprende, entre otras, la fracción polifenólica rica en dihidrocalconas anteriormente descrita.

Las composiciones según la invención pueden ingerirse o aplicarse en la piel. Según el modo de administración, la composición según la invención puede presentarse bajo todas las formas habitualmente utilizadas en cosmética.

Las composiciones según la invención pueden especialmente presentarse en forma de cápsulas, leches, lociones, cremas, geles o bebidas.

Las composiciones nutracéuticas, alimenticias o cosméticas de la presente invención están formuladas clásicamente según las aplicaciones a las cuales están destinadas.

Los ejemplos siguientes ilustran la invención sin limitarla.

Ejemplo 1 Protocolo nº 1 de extracción de la fracción polifenólica de manzana

Se sometieron manzanas de la especie Malus sylvestris Mill. al tratamiento de extracción siguiente:

* las manzanas se trituraron y el triturado se agitó en presencia de alrededor de 20% de agua.

* el triturado fue el objeto de extracciones sólido/líquido sucesivas para eliminar las fracciones líquidas ricas en azúcar.

* el extracto sólido aún húmedo de la segunda etapa se secó, después se trató durante un tiempo de 2 horas con una mezcla metanol/agua en proporciones 90/10 en peso.

* el extracto orgánico se evaporó en seco a una temperatura de alrededor de 50ºC, bajo presión reducida.

* el residuo de evaporación se recuperó con agua, después la disolución acuosa obtenida se retiró 4 veces, con acetato de etilo, disolvente no miscible en agua.

* las disoluciones orgánicas obtenidas se mezclaron y se evaporaron a una temperatura de alrededor de 45ºC para obtener un extracto seco.

* el extracto seco se recuperó una última vez con agua para un secado final, de preferencia por atomización o liofilización, y obtener un polvo fino de color beige parcialmente soluble en agua.

La composición en polifenoles de este extracto, se midió por cromatografía líquida de alta presión la concentración de cada molécula en relación a su estándar puro fue la siguiente (figura 4).

En cada extracto se midieron así las concentraciones de:

Compuestos fenólicos	Extracto polifenólico según la invención (en mg/g)
Polifenoles totales	492,1
(expresados en equivalente floricina)
Floricina	196,2
Ácido clorogénico	55,0
Epicatequina	20,8
Procianidina B_{2}	11,3
Quercitrina	7,9
Ácido p-cumárico	2,3
Ácido cafeico	<1

Se constató que la fracción fenólica obtenida por este procedimiento de extracción era particularmente rica en floricina. Presenta la característica de ser pobre en ácidos de la familia de los ácidos hidroxicinámicos, y más particularmente en ácido clorogénico. Es igualmente pobre en ácidos de la familia de los flavonoles (catequinas, epicatequinas, procianidinas B_{1}, B_{2}...), lo que conduce a un perfil fenólico original totalmente diferente de los descritos para la manzana, y totalmente diferente de un perfil fenólico obtenido por un procedimiento clásico a partir de

\hbox{manzanas maduras.}

El polvo obtenido tituló 55% de polifenoles totales en peso por el método colorimétrico de Folin-Ciocalteu, utilizando el ácido clorogénico como estándar. Este método utiliza el reactivo de Folin-Ciocalteu (referencia 9001, Merck). Brevemente, este reactivo está constituido de una mezcla de ácido fosfotúngstico y de ácido fosfomolíbdico, que se reduce durante la oxidación de los fenoles en una mezcla de óxidos azules de tungsteno y de molibdeno. El color desarrollado es proporcional a la cantidad de compuestos fenólicos presentes.

Por método cromatográfico e integración del perfil obtenido por cromatografía líquida de alta presión, tituló entre 49 y 67% de polifenoles totales en peso según que se exprese el valor en equivalente floricina y equivalente ácido clorogénico respectivamente.

Ejemplo 2 Protocolo nº 2 de extracción de la fracción polifenólica de manzana

* el triturado fue objeto de extracciones sólido/líquido sucesivas para eliminar las fracciones líquidas ricas en azúcar.

* el extracto sólido húmedo se mezcló con agua en presencia de una mezcla enzimática rica en actividades pectolíticas, hemicelulásicas y celulásicas durante alrededor de 2 horas a una temperatura de alrededor de 45ºC para obtener un extracto líquido.

* el extracto líquido se clarificó por centrifugación o por filtración, después por ultrafiltración.

* el extracto líquido límpido se cargó a continuación en una columna cromatográfica rellena de una resina adsorbente de tipo estireno-divinilbenceno.

* la resina se lavó con agua acidificada para eliminar las impurezas y los azucares residuales.

* los polifenoles se eluyeron a continuación con una disolución hidro-alcohólica que contenía 60% en peso de etanol.

* la disolución polifenólica obtenida se concentró, después se secó por atomización o liofilización para obtener un polvo fino beige.

La composición en polifenoles de este extracto, se midió por cromatografía liquida de alta presión la concentración de cada molécula en relación a su estándar puro fue la siguiente (figura 5):

\vskip1.000000\baselineskip

Compuestos fenólicos	Extracto polifenólico según la invención (en mg/g)
Polifenoles totales	293,2
(expresados en equivalentes floricina)
Floricina	36,7
Ácido clorogénico	7,5
Epicatequina	1,0
Procianidina B_{2}	E
Quercitrina	3,8
Ácido p-cumárico	1,2
Ácido cafeico	1,7

\vskip1.000000\baselineskip

El polvo obtenido tituló 50% de polifenoles totales en peso por el método colorimétrico de Folin-Ciocalteu, utilizando el ácido clorogénico como estándar.

Se constató que la fracción fenólica obtenida por este procedimiento de extracción era particularmente rica en floricina. Como el extracto del ejemplo 1, esta fracción presenta la característica de ser pobre en ácidos de la familia de los ácidos hidroxicinámicos y más particularmente en ácido clorogénico. Presenta igualmente la característica de ser pobre en flavonoles (catequinas, epicatequinas, procianidinas B_{1}, B_{2}...), lo que conduce a un perfil fenólico original totalmente diferente de los descritos para la manzana, y totalmente diferente de un perfil fenólico obtenido por un procedimiento clásico a partir de manzanas maduras.

Contrariamente al ejemplo 1, una pequeña cantidad de ácido cafeico está presente, no presentando más que 4% en peso de la cantidad de floricina presente.

Por integración del perfil obtenido por cromatografía líquida de alta presión, tituló entre 29 y 40% en peso de polifenoles totales según que se exprese el valor en equivalente floricina y en equivalente ácido clorogénico respectivamente.

Ejemplo 3 Protocolo nº 3 de extracción de la fracción polifenólica de manzana

El extracto polifenólico rico en floricina según la invención puede modificarse antes de la etapa de secado final. El procedimiento consiste en una hidrólisis ácida controlada en presencia de ácido mineral (diluido a un pH de alrededor de 3) de la floricina (floretina 2'-\beta-glucósido) en floretina. El polvo obtenido después del secado es poco soluble en el agua (muy baja solubilidad de la floretina) pero presenta una actividad antioxidante interesan-
te.

Ejemplo 4 Actividad antioxidante (o antirradical) de la fracción polifenólica rica en floricina según la invención

La medida de la actividad antirradical de los extractos polifenólicos se realizó por el método del DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidracil) descrito por Brand-Williams et al. (1959) y Lu et Foo (2000) ligeramente modificado. Brand-Williams W., Cuvelier M.E. & Berset C. (1995) Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. Lebensmittel-Wissenschaft und Technologie, 28, pp 25-30. Lu Y. & Foo L.Y. (2000) Antioxidant and radical scavenging activities of polyphenols from apple pomace. Food Chemistry, 68, pp 81-85.

El principio es medir la cantidad residual de DPPHº, radical coloreado estable en las condiciones operatorias y cuya concentración disminuye durante una incubación en presencia de extractos antioxidantes en condiciones estandarizadas. En efecto, los extractos que presentan una actividad antioxidante reducen el radical DPPHº en DPPH_{2}. La actividad antioxidante se expresa en relación a la actividad de una molécula de referencia, el trolox (análogo hidrosoluble de la vitamina E).

Se disolvieron con cuidado 6 mg de DPPHº en 100 mL de una disolución acuosa de metanol de 75% de volumen. En paralelo, una cantidad precisa de muestra a analizar y 18 mg de Trolox se disolvieron en 25 mL de disolución metanólica de 75%. Se incubaron 2 mL de disolución de DPPHºcon 25 \muL de disolución a medir a una temperatura de 37 \pm 0,5ºC en frascos herméticos durante 6 horas. La disminución de la intensidad colorante de la disolución se midió a un longitud de onda de 515 nm a t = 0 minutos, t = 5 minutos y t = 6 horas. La actividad se expresó en mmoles equivalente trolox/kg de producto después de 6 horas de incubación.

El método del DPPH se empleó para determinar la actividad antioxidante de estos productos:

\bullet: Plasma sanguíneo

\bullet: Vino tinto

\bullet: Extracto concentrado de vino tinto con 5% de polifenoles totales

\bullet: Polvo de vino tinto con 55% de polifenoles totales

\bullet: Zumo de manzana

\bullet: Extracto de saúco con 40% de polifenoles totales (DO 280 nm)

\bullet: Extracto de arándanos con 30% de polifenoles totales (DO 280 nm)

\bullet: Extracto polifenólico con 50% de polifenoles totales rico en floricina según el procedimiento de la invención

\bullet: Extracto polifenólico con 90% de polifenoles totales rico en floricina según el procedimiento de la invención

\bullet: Extracto polifenólico con 90% de polifenoles totales rico en floretina según el procedimiento de la invención

\newpage

Producto	Capacidad antioxidante
	(mmoles equivalente de trolox/kg de producto)
Plasma sanguíneo (referencia biológica)	20-25
Vino tinto	15-25
Extracto concentrado de vino tinto con 5% de polifenoles totales	680-700
Zumo de manzana	5-20
Extracto de saúco con 40% de polifenoles totales en peso	2900-3000
Extracto de arándanos con 30% de polifenoles totales en peso	3500-3600
Extracto polifenólico con 50% en peso de polifenoles totales rico	4000-4500
en floricina según el procedimiento de la invención
Extracto polifenólico con 90% en peso de polifenoles totales rico	6000-6500
en floricina según el procedimiento de la invención
Extracto polifenólico con 90% en peso de polifenoles totales rico	5800-6300
en floretina según el procedimiento de la invención

Al igual que los resultados anteriores, los extractos fenólicos extraídos de la manzana Malus sylvestris Mill. según el procedimiento de la invención poseen una actividad antirradical o antioxidante ampliamente superior a la de los productos conocidos por su actividad antioxidante ensayados en referencia.

Ejemplo 5 Efectos antirradicales de las fracciones polifenólicas en polvo

La genotoxicidad de una sustancia se define como la capacidad de esta para generar lesiones sobre el ADN genómico o plasmídico. Los agentes genotóxicos pueden ser de naturaleza exógena (rayos ultravioletas, radiaciones ionizantes, sustancias químicas...) o de naturaleza endógena (radicales libres producidos por el metabolismo celular...).

Los efectos antirradicales de las fracciones polifenólicas ricas en floricina obtenidas según el procedimiento de la invención se miden in vitro por el ensayo "3D" (Damageg DNA Detection, Analytical Biochemistry, (1995),

\hbox{pp 37-42).}

El principio se basa en la reparación de las lesiones del ADN, utilizándose el ADN lesionado como marcador de eficacia protectora de las moléculas a ensayar frente a los radicales libres OHº: la disminución de las lesiones observadas en el ADN está correlacionado con la retención de los radicales libres. En el curso de la etapa de regeneración, un marcador (nucleótido marcado con biotina) se incorpora al ADN y esta incorporación, reflejo cuantitativo del número de lesiones reparadas, es a continuación revelada por quimioluminiscencia.

Este ensayo efectuado en ADN plasmídico permite la detección de agentes genotóxicos en la etapa precoz del proceso lesión-mutación-cancerización. Las moléculas o mezclas presentan propiedades antioxidantes o antirradicales, y así pueden proteger una célula humana de los daños oxidativos debidos a las especies oxigenadas reactivas (EOR) que pueden así ser detectadas.

El protocolo es el siguiente:

- El ADN diana se adsorbe sobre pocillos sensibilizados, después se incuba con agentes genotóxicos en presencia o no del extracto polifenólico a ensayar (solubilizado en una disolución de etanol al 2% o en DMSO) o en presencia de catequina (control). En este ensayo, el radical OHº producido por escisión homolítica del agua oxigenada se utiliza como agente genotóxico que lesiona el ADN. El agua oxigenada se añade en los pocillos que se irradian a continuación con rayos UVB (700 J/m^{2}). Además, se añade un control positivo de reparación que consiste en un ADN plasmídico pre-dañado con rayos ultravioletas C.

- Una etapa de lavado con agua ultrapura, después con una disolución de dioxano al 20% en agua ultrapura durante 5 minutos a 30ºC bajo agitación suave permite eliminar las interacciones no específicas entre la muestra y el ensayo, debidas a la presencia de macromoléculas tales como las proteínas que pueden interferir sobre la señal de reparación.

- Una etapa de reparación se realiza en presencia de extractos celulares purificados (que contienen las enzimas activas de las diferentes vías de reparación de las lesiones del ADN) y de nucleótidos modificados (dUTP) acoplados a la biotina. La reparación de las lesiones implica una fase de escisión de las lesiones, después una resintesis del fragmento de ADN o de bases escindidas. En el curso de la etapa de síntesis reparadora, los nucleótidos modificados se incorporan así al ADN.

- Una etapa de reconocimiento de los sitios de fijación de los nucleótidos sobre el ADN por fijación sobre la biotina llevada por los nucleótidos, de una molécula de avidina acoplada a una molécula de peroxidasa.

- Una etapa de revelado de la reacción por adición de un sustrato quimioluminescente de la peroxidasa. La señal luminosa observada y leída en el luminómetro es proporcional a la cantidad de lesiones reparadas. Un efecto dosis se observa en el límite de 1 a 15 lesiones por 6 kilobases y esto, para la mayor parte de las lesiones.

El porcentaje de protección observado en presencia de EOR se calcula como el descenso relativo del efecto lesionante debido a las especies OHº, siendo:

RLU oxidante - RLU (oxidante + muestra)/RLU oxidante

con RLU = relative light units (unidades arbitrarias de cantidad de luz).

El porcentaje de protección específica se corrige del porcentaje de inhibición no específico medido en las muestras pre-lesionadas con UVC. Es el reflejo de la actividad antirradical debida solamente a los extractos añadidos.

IC50 es la concentración en mg/mL de producto ensayado que da 50% de actividad protectora del agente genotóxico OHº. Cuanto más baja es, mejor es el producto ensayado frente a la actividad antioxidante.

Producto ensayado	Concentración	Protección específica	IC50
	(en mg/mL)	(en %)	(en mg/mL)
Catequina (molécula de referencia)	1,00	65	0,24
	0,25	52
	0,06	28
	0,016	16
Epicatequina (molécula de referencia)	1	83	0,06
	0,25	71
	0,10	59
	0,010	37
Extracto fenólico con 50% de polifenoles totales rico en	0,10	75	0,05
floricina según el procedimiento de la invención
	0,01	41
	0,001	17
	0,0001	5
Extracto fenólico con 90% de polifenoles totales rico en	0,10	95	0,005
floricina según el procedimiento de la invención
	0,01	64
	0,001	27
	0,0001	7
Extracto fenólico con 90% de polifenoles totales rico en	0,10	60	0,075
floretina según el procedimiento de la invención
	0,01	23
	0,001	10
	0,0001	1

Las tres muestras presentan un efecto protector frente a la formación de lesiones sobre el ADN por los radicales OHº. Presentan así una excelente actividad antirradical, superior a la de la epicatequina y muy superior a la de la catequina, las dos moléculas de referencia reconocidas por su buena capacidad antirradical. Un efecto dosis-respuesta es visible.

Las concentraciones que dan 50% de efectos protectores son bajas: hace falta alrededor de 5 veces menos extracto polifenólico con 50% que de catequina para el mismo nivel de protección, y alrededor de 50 veces menos extracto con 90% de polifenoles ricos en floricina. Bajas concentraciones de extractos polifenólicos tal como están descritos en la invención son suficientes para efectuar una disminución neta del efecto lesionante de los radicales libres. Las fracciones polifenólicas según la invención son pues agentes antirradicales potentes que protegen in vitro al ADN de los efectos genotóxicos del radical OHº.

Ejemplo 6 Efectos antioxidantes de las fracciones polifenólicas en polvo

Los efectos antioxidantes de las fracciones polifenólicas ricas en floricina obtenidas según el procedimiento de la invención se miden en el ADN plasmídico según el principio del ensayo "3D" descrito anteriormente. La metodología es la misma con la sola diferencia de que, en este ensayo, el agente genotóxico que lesiona al ADN es el oxígeno en estado singulete ^{1}O_{2} producido por iluminación del azul de metileno.

El principio se basa en la reparación de las lesiones del ADN, siendo el ADN lesionado utilizado como marcador de la eficacia protectora de moléculas diversas frente al oxígeno en estado singulete ^{1}O_{2}.

El azul de metileno así iluminado y diluido con 4 ng/mL en agua ultrapura se introdujo en los pocillos que se irradian a continuación con luz blanca (2 x 75 W) durante 20 minutos. La molécula de referencia utilizada es la silimarina o silibinina (SIGMA), mezcla de flavono-lignanos antihepatotóxico extraído y purificado del Silybum marianum bien conocido por su actividad detoxificante frente al oxígeno.

Los resultados fueron los siguientes:

Producto ensayado	Concentración	Protección específica
	(en mg/mL)	(en %)
Silimarina	1	74,6
	0,1	0
Extracto fenólico con 50% de polifenoles totales rico	1	85,8
en floricina según el procedimiento de la invención	0,1	0
Extracto fenólico con 90% de polifenoles totales rico	1	90
en floricina según el procedimiento de la invención	0,1	81
Zumo concentrado de "manzanas industriales" que	100	80,3
titulan 1,59 mg PPT/g (polifenoles expresados en	10	77,1
equivalente floricina)	1	0

PPT: Polifenoles totales

Los extractos obtenidos según la invención presentan una actividad antioxidante de alrededor de 100 veces superior a la del concentrado de zumo de manzana (que tiene una actividad no despreciable).

Su actividad es comparable a la de la silimarina para el extracto fenólico con 50% en peso de polifenoles totales rico en floricina y diez veces superior al de la silimarina para el extracto fenólico con 90% en peso de polifenoles totales rico en floricina según el procedimiento de la invención.

Las fracciones polifenólicas según la invención son pues antirradicales potentes que pueden jugar un papel importante en la protección del organismo sometido a la acción de especies oxigenadas reactivas formadas por el metabolismo celular.

Ejemplo 7 Efecto fotogenoprotector de las fracciones polifenólicas en polvo

El papel protector antiultravioletas de las fracciones polifenólicas ricas en floricina según la invención se midió en el ADN plasmídico según el principio del ensayo "3D" in vitro descrito anteriormente.

El principio se basa en la medida de la cantidad de lesiones que sufre el ADN, siendo utilizado el ADN lesionado como marcador de la eficacia protectora de moléculas a ensayar frente a los ultravioletas.

Los productos potencialmente fotoprotectores a ensayar se diluyeron en etanol puro o agua ultrapura, después se colocaron en una placa transparente a los ultravioletas. Esta placa se superpuso a continuación a la que contenía el ADN plasmídico adsorbido. El conjunto se irradió con rayos ultravioletas B a una potencia de 50 KJ/m^{2}. El producto de referencia utilizado es un producto comercial reconocido por su acción protectora frente a los ultravioletas, Parsol MCX de la sociedad Roche.

Una inhibición no específica (en ausencia de ultravioletas) de la señal de reparación no es posible en este ensayo, ya que en ningún momento el producto del ensayo está en contacto directo con el ADN adsorbido.

IC50 es la concentración en mg/mL de producto ensayado que da 50% de actividad protectora de los ultravioletas B. Cuanto más baja es, mejor es el producto ensayado frente a la actividad antioxidante.

Los resultados fueron los siguientes:

	Concentración	Protección específica	IC50
	(en mg/mL)	(en %)	(en mg/mL)
Parsol MCX (Roche)	1	64,9	0,03
	0,1	69,1
	0,01	39,2
Extracto fenólico con 50% en peso de polifenoles totales	1	49,7	1,00
rico en floricina según el procedimiento de la invención	0,1	23,0
	0,01	0
Extracto fenólico con 90% en peso de polifenoles totales	1	70,1	0,40
rico en floricina según el procedimiento de la invención	0,1	38,4
	0,01	21,6
	0,001	13,6
Zumo concentrado de “manzanas industriales” que titulan	100	59,0	33
a 1,59 mg PPT/g (polifenoles expresados en equivalente	10	44,5
floricina)	1	21,0
	0,1	40,2
	0,01	37,9

Los extractos polifenólicos, aunque menos fotoprotectores que el Parsol, presentan sin embargo una acción anti-ultravioletas B importante.

Se puede pues concluir que los extractos polifenólicos tales como los descritos en la presente invención tienen un efecto fotogenoprotector importante frente a los ultravioletas B, entre 30 y 80 veces superior al de un zumo concentrado de manzana industrial conocido.

Claims

1. Fracción procedente de fruta de la familia de las Rosaceae, caracterizada porque comprende al menos 20% de polifenoles que comprenden al menos 10% en peso de floricina con relación a los polifenoles totales.

2. Fracción según la reivindicación 1, caracterizada porque contiene de 10 a 70% en peso de floricina con relación a los polifenoles totales.

3. Fracción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque contiene ácido clorogénico.

4. Fracción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, cuya relación en peso de floricina con relación al peso del ácido clorogénico es superior o igual a 1.

5. Fracción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque contiene epicatequina.

6. Fracción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque contiene procianidina B_{2}.

7. Fracción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, cuya relación en peso de floricina con relación al peso de epicatequina es superior a 9.

8. Fracción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque contiene quercitrina.

9. Fracción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque contiene ácido p-cumárico.

10. Fracción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque contiene ácido cafeico en cantidades tales que la relación en peso de floricina con relación al peso de ácido cafeico es superior a 4.

11. Fracción según la reivindicación 10, cuya proporción en peso de ácido cafeico representa menos de 1% de los polifenoles totales.

12. Fracción según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, caracterizada porque contiene floretina.

13. Fracción según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, caracterizada porque las dihidrocalconas (floricina y floretina) están presentes en proporciones superiores o iguales a 40% en peso con relación a los ácidos hidroxicinámicos (ácido cafeico, ácido clorogénico, ácido p-cumárico).

14. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque contiene al menos 20% en peso de polifenoles totales de los cuales 10% al menos de floricina, ácido clorogénico, epicatequina, procianidina B_{2}, quercitrina, ácido p-cumárico y ácido cafeico.

15. Fracción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque contiene más de 50% en peso de polifenoles totales.

16. Fracción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizada porque se presenta en forma de polvo.

17. Fracción según la reivindicación 16, caracterizada porque contiene al menos 10% de floricina por gramo de polvo.

18. Fracción según la reivindicación 16, caracterizada porque contiene de 10 a 70% de floricina por gramo de polvo.

19. Procedimiento de preparación de una fracción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque se procede, a partir de manzanas trituradas, a una o varias extracciones sólido/líquido, el extracto sólido se seca a continuación, después se procede a nuevas extracciones con disolventes orgánicos para obtener la fracción polifenólica.

20. Procedimiento de preparación de una fracción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque se procede, a partir de manzanas trituradas, a una o varias extracciones sólido/líquido, el extracto sólido se licua enzimáticamente a continuación para obtener un extracto líquido que se trata por cromatografía para obtener la fracción polifenólica.

21. Procedimiento de preparación de una fracción según una de las reivindicaciones 19 ó 20, caracterizado porque se procede sobre el extracto sólido a una etapa de desencerado.

22. Procedimiento de preparación de una fracción según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque se procede a un secado final.

23. Procedimiento según una de las reivindicaciones 19 a 22, caracterizado porque se procede a una extracción de manzanas maduras.

24. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, caracterizado porque se procede a una extracción de la manzana Malus sylvestris Mill.

25. Fracción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizada porque es susceptible de obtenerse por el procedimiento tal como está definido en una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24.

26. Composición alimenticia o nutracéutica que comprende una composición tal como está definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 25.

27. Utilización de la fracción tal como está definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 25 como agente de protección frente a los rayos ultravioletas.

28. Utilización de la fracción tal como está definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 25 como agente antioxidante.

29. Composición cosmética caracterizada porque contiene una fracción tal como está definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y 25.