ES2245995T3

ES2245995T3 - Pares de colorantes para mediciones de transferencia de energia de fluorescencia-resonancia (fret).

Info

Publication number: ES2245995T3
Application number: ES01996741T
Authority: ES
Inventors: Daniel Belik; Hans-Dieter Josel; Rupert Herrmann; Bernhard Koenig; Francis Mueller
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2000-11-16
Filing date: 2001-11-14
Publication date: 2006-02-01
Anticipated expiration: 2021-11-14
Also published as: ATE300050T1; CA2426479C; JP2004514139A; AU2002221848A1; CA2426479A1; DE50106822D1; EP1337851A1; US6908769B2; EP1337851B1; WO2002041001A1; US20040076979A1; JP3905838B2

Abstract

Método para la determinación de la interacción entre biomoléculas marcadas con un dador y con un aceptor, respectivamente, basado en el principio de la transferencia de energía de fluorescencia-resonancia y para la medición de la fluorescencia resultante, caracterizado porque como dadores de energía se emplean complejos de quelatos metálicos con iones de metales de los grupos VII o VIII de los elementos de transición, que se combinan con fluoróforos de bajo peso molecular, comprendido entre 300 d y 3.000 d, que actúan como aceptores de energía.

Description

Pares de colorantes para mediciones de transferencia de energía de fluorescencia-resonancia (FRET).

La presente invención se refiere a nuevos sistemas de colorantes de transferencia, en especial a determinaciones de transferencia de energía de fluorescencia-resonancia, por ejemplo en combinación con la medición resuelta en el tiempo de la fluorescencia resultante. La invención se refiere además al uso de estos colorantes para marcar biomoléculas y a su utilización para la determinación homogénea de las interacciones entre biomoléculas, por ejemplo después de la detección de un analito.

Para la determinación de biomoléculas se utilizan muy a menudo componentes de fijación que son capaces de unirse específicamente a la biomolécula buscada o analizada. En principio cabe distinguir entre los ensayos heterogéneos y los llamados ensayos homogéneos. Los primeros se caracterizan porque se requieren una o varias operaciones de lavado para la ejecución del ensayo.

En los ensayos llamados heterogéneos, por lo menos una biomolécula está provista de un grupo marcador. Mediante la medición de este grupo marcador se determina finalmente la concentración de la molécula de analito que se desea analizar. Esta determinación solo tiene sentido, obviamente, cuando los componentes de fijación marcados se separan mediante una operación de lavado adecuada antes de realizar la medición.

En los ensayos homogéneos convencionales se eligen las condiciones de ensayo de tal manera, que en función de la concentración de la molécula de analito presente se generen cambios medibles de señales gracias a los efectos de turbidez o gracias a los efectos de dispersión luminosa. Para amplificar las señales generadas se utilizan a menudo en dichos ensayos materiales soporte de tipo partículas.

Solo en los últimos años se ha logrado realizar determinaciones homogéneas, es decir, determinaciones sin tener que intercalar forzosamente una operación de lavado, incluso empleando grupos marcadores. Los desarrollos ulteriores en el ámbito de los inmunoensayos homogéneos se basan en conjunto en la interacción por lo menos de dos moléculas, que solamente tiene lugar cuando se hallan en una proximidad inmediata entre sí. Se han publicado ensayos homogéneos basados en los principios del inmunoensayo llamado "cloned enzyme donor immunoassays" = CEDIA (Microgenics Inc., EE.UU.), de la "polarización de fluorescencia" = FPIA (Syva Co., EE.UU.) o del "Ensayo de proximidad de centelleo" (Amershan, G.B.). En este lugar conviene mencionar además en especial aquellos métodos que se basan en el principio de la transferencia de energía de fluorescencia-resonancia (FRET). Para la transferencia de energía de fluorescencia se requieren siempre por lo menos dos moléculas de colorante. El primer colorante actúa como dador de energía y el segundo colorante actúa como aceptor de energía. La transmisión de energía entre el dador y el aceptor no se realiza de forma radiactiva, es decir, no hay emisión de radiación.

La eficacia de la FRET depende en gran manera de la distancia entre el colorante dador y el aceptor. La FRET solo se realiza con eficacia cuando el dador y el aceptor se hallan muy próximos el uno del otro.

Por lo general, tanto la molécula del dador como la molécula del aceptor se hallan fijadas en cada caso sobre un componente de un par de fijación bioafín. Si las biomoléculas de soporte entran en interacción mutua y se juntan p.ej. para formar un complejo antígeno-anticuerpo, entonces las moléculas de dador y aceptor se hallan también muy próximas entre sí y será posible la FRET.

Los aceptores de energía pueden elegirse de tal manera que repriman la energía emitida por el dador, en este caso se habla de "extintores" (quencher); o bien los aceptores de energía de resonancia de fluorescencia pueden emitir a su vez por sí mismos energía fluorescente, es decir, pueden ser fluorescentes por sí mismos, en este caso se habla de grupos fluoróforos o de "fluoróforos" a secas. Por el estado de la técnica se conoce que los complejos metálicos se toman en consideración no solo como dadores de energía de fluorescencia, sino también como aceptores de energía de fluorescencia.

Tal como se ha mencionado antes, se conocen también grupos fluoróforos como aceptores en sistemas FRET. En calidad de fluoróforos de este tipo se utilizan sobre todo colorantes del grupo de las aloficocianinas (APC). Entre las propiedades conocidas de las APC se cuentan no solo el gran rendimiento cuántico, sino también las excelentes propiedades de extinción (p.ej. EP-076 695).

Sin embargo, las ficobiliproteínas tienen inconvenientes, p.ej. debido a su peso molecular elevado, superior a 100.000 d, no es posible una unión selectiva, es decir, mediante una posición predeterminada de la molécula APC. Esta unión tiene lugar por lo general de forma química y, por tanto, estadística o incluso indirecta mediante sistemas de fijación, por ejemplo mediante el sistema estreptavidina/biotina que los expertos ya conocen. Tendría que mejorarse también la sensibilidad, es decir, el límite inferior de detección, de estos sistemas, p.ej. la detección de concentraciones bajas de moléculas de analitos.

La empresa Wallac, Oy, Turku, Finlandia y la empresa Packard Instrument Company, Meriden, EE.UU., suministran sistemas comerciales que, como marcadores dadores, emplean quelatos de lantánidos y, como marcadores aceptores, emplean colorantes del grupo de las ficobiliproteínas, p.ej. la aloficocianina. Los quelatos de lantánidos poseen un tiempo de vida de luminiscencia del orden de algunos milisegundos, es decir, la emisión del aceptor que se observará será del mismo orden. La energía emitida por los quelatos de lantánido se mide por lo tanto normalmente en un marco temporal comprendido entre los 400 y los 600 microsegundos. Esto significa necesariamente que existen tiempos muertos relativamente largos. La estabilidad de los quelatos de lantánidos se reduce en determinadas condiciones de ensayo, de modo que con la adición de compuestos complejantes, p.ej. EDTA (ácido etilen-diamino-tetra-acético), puede tener lugar una transquelatización.

En el documento US-5 998 146 se describe el uso de complejos quelato de lantánido, en especial complejos de europio y de terbio, combinados con fluoróforos o extintores (quencher). En él se subrayan además las propiedades ventajosas de los complejos de quelato de lantánido de largo tiempo de vida.

Blomberg y col., Clinical Chemistry 45(6), 855 y sig., 1999, describen el uso de complejos de europio y de terbio como dadores y un colorante de rodamina como aceptor en un nuevo par FRET. Se indica que la sensibilidad de detección de la subunidad \betahCG (subunidad \beta de la gonadotropina corional humana) es de 0,45 \mug/l. Por consiguiente, los ensayos FRET basados en complejos quelato de europio o de terbio no conllevan ninguna mejora sustancial en lo referente a la sensibilidad del ensayo.

El uso de complejos de rutenio para la medición de fluorescencia resuelta en el tiempo se describe p.ej. en el documento EP-A2-439 036, en ella se emplea la lumacina como dador de energía y el complejo de rutenio como aceptor de energía.

Joun y col., Analytical Biochemistry 232, 24-30, 1995, emplean complejos fluorescentes de rutenio como dadores de energía en determinaciones homogéneas, basadas en el principio FRET. Como aceptor de energía de resonancia se emplea el colorante conocido con el nombre trivial de "azul reactivo" (Reactive Blue). El azul reactivo reprime la fluorescencia emitida por el complejo de rutenio, de modo se realiza una cuantificación basada en la señal reprimida de fluorescencia, dicha señal sale originariamente del complejo de rutenio.

En el documento WO 00/47693 se describe también el uso de complejos de quelato de rutenio como dadores de energía de fluorescencia combinados con extintores (quencher). Como dador de energía se emplea un complejo de rutenio conocido con el nombre trivial de "Fair Oaks Red™". Este colorante se fija sobre un anticuerpo contra la albúmina de suero humano. El antígeno, la albúmina de suero humano, se marca con un colorante no luminiscente, conocido como "Light-Green Yellowish". Al igual que en Joun y col. (lugar citado), se determina la concentración de analito (albúmina de suero humano) a fin de cuentas a través del grado de represión de la señal.

Para la detección de biomoléculas es necesario en muchos casos que puedan detectarse también cantidades pequeñas de la molécula de analito a analizar. Para caracterizar la sensibilidad de un sistema de medición se recurre a menudo al concepto de límite inferior de detección. Cuando más bajo es este límite inferior, tanto más sensible será el sistema de detección.

Sigue habiendo todavía una gran necesidad de mejora en lo tocante a la sencillez de la fijación de los colorantes FRET sobre las biomoléculas y, sobre todo, en lo referente a la sensibilidad del ensayo. Los procedimientos de ensayo homogéneos más sensibles se basan en mediciones FRET podrían utilizarse en la práctica de forma más amplia y versátil y, por ello, son muy deseables.

Es, pues, un cometido de la presente invención la búsqueda de nuevos pares FRET y eventualmente la descripción de los mismos, que permitan superar los inconvenientes ya conocidos del estado de la técnica, p.ej. en lo que concierne al límite inferior de detección.

Ahora se ha encontrado de modo sorprendente que pueden utilizarse con gran ventaja complejos de quelatos metálicos, basados en iones metálicos de los grupos VII y VIII de los elementos de transición, como dadores de energía en combinación con fluoróforos de bajo peso molecular como aceptores de energía, por ejemplo para métodos sensibles de determinación de la interacción entre biomoléculas, basados en el principio FRET.

Breve descripción de la invención

La invención se refiere a métodos de determinación de la interacción entre biomoléculas marcadas con un dador y con un aceptor, respectivamente, basados en el principio de la transferencia de energía de fluorescencia y en la medición de la fluorescencia resultante, que están caracterizados porque se emplean complejos quelatos metálicos
- basados en iones de metales de los grupos VII y VIII de los elementos de transición - como dadores de energía, combi-
nados con fluoróforos de peso molecular bajo, situado entre 300 y 3.000 d, que actúan como aceptores de energía.

Se ha encontrado de modo sorprendente que los fluoróforos de bajo peso molecular, en especial los del grupo de los colorantes de las rodaminas, xantenos, cianinas y oxazinas, son especialmente indicados para mediciones FRET, en especial en combinación con complejos quelatos metálicos basados en iones metálicos de los grupos VII y VIII de los elementos de transición, en especial dadores del tipo quelatos de rutenio, para poder montar ensayos mejorados de la FRET.

Los pares FRET de la invención son idóneos en especial para la medición resuelta en el tiempo ("time resolved") de la energía resultante (TR-FRET).

Las combinaciones de colorantes de la invención son indicadas también para los métodos de determinación de las interacciones entre biomoléculas marcadas con un dador y con un aceptor, respectivamente, que se basan en el principio de la modulación de fluorescencia.

Los nuevos pares FRET pueden utilizarse por tanto de modo muy ventajoso para estudiar las interacciones de biomoléculas, en especial cuando las biomoléculas marcadas con componentes FRET están muy próximas en el espacio y después de la interacción pueden estar más separadas entre sí o bien en el caso inverso, cuando a raíz de estas interacciones, p.ej. con formación de un complejo entre los componentes de un par de unión bioafín, dichos componentes se llevan a una proximidad muy estrecha entre sí.

La invención mejora y amplía la posibilidad de detección de un gran número de moléculas de analitos, en especial en los procedimientos de ensayo llamados homogéneos, y por ello abarca además un kit de ensayo para la detección de un analito en una muestra que contiene por lo menos una biomolécula marcada con un complejo del tipo quelato metálico, basado en iones metálicos de los grupos VII y VIII de los elementos de transición, en especial un complejo del tipo quelato de rutenio, así como una biomolécula marcada con un aceptor fluoróforo de bajo peso molecular.

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere de modo fundamental a métodos para la determinación de la interacción entre biomoléculas marcadas con un dador y con un aceptor, respectivamente, basados en el principio de la transferencia de energía de fluorescencia y para la medición de la fluorescencia resultante, caracterizados porque se utilizan como dadores de energía complejos de tipo quelato metálico - basados en iones de metales de los grupos VII y VIII de los elementos de transición - en combinación con fluoróforos de peso molecular bajo, comprendido entre 300 y 3000 d, como aceptores de energía.

Se entiende por "interacción" en el sentido de la invención los cambios de distancia entre las moléculas que pueden detectarse mediante una medición FRET. Para detectar esta interacción es necesario que tanto el dador de la FRET como el aceptor de la FRET estén fijados sobre una biomolécula o sobre el componente oportuno de un par de unión y que la interacción conduzca a un cambio de la distancia entre el dador y el aceptor.

En una forma preferida de ejecución, cada uno de los componentes de un par de fijación bioafín está marcado con el dador o bien con el aceptor. Con la formación del complejo de fijación entre los componentes de un par de fijación bioafín se acercan mucho entre sí el dador y el aceptor, de modo que ya es posible la FRET.

Los ejemplos conocidos de pares de fijación bioafines son en especial las secuencias de ácidos nucleicos complementarios entre sí (DNA, RNA o ácidos nucleicos peptídicos), ligandos y receptores, antígenos o haptenos y anticuerpos, o lectinas y azúcar. En condiciones idóneas, los componentes de estos pares de unión se aproximan para formar complejos.

Se recurre con preferencia al grado de formación de un complejo para determinar la concentración de una molécula de analito. Para ello se eligen las condiciones de reacción como el experto ya sabe de tal manera que, en función de la concentración de analito, tenga lugar un incremento o una disminución de señal, dependiendo en cada caso del formato del ensayo.

Una forma de ejecución igualmente preferida de una interacción en el sentido de la invención está presente cuando el dador y el aceptor están presentes originariamente en condiciones que permite la FRET, pero la FRET se interrumpe p.ej. por la actividad enzimática entre el puesto de fijación del dador o del aceptor.

Se entiende por transferencia de energía de fluorescencia la transición de energía de un colorante dador a un colorante aceptor, pero el dador propiamente dicho emite la menor cantidad posible de energía fluorescente medible. Debido a la proximidad espacial con el segundo colorante idóneo, el aceptor, tiene lugar a continuación una transferencia de energía denominada no radiactiva, es decir exenta de radiación, al aceptor (Van der Meer y col., Resonance Energy Transfer, editorial VCH, 1994). Si el segundo colorante es un fluoróforo o un luminóforo, entonces se podrá recurrir a la detección de la luz emitida por esta molécula en una longitud de onda determinada para efectuar una determinación cualitativa e incluso cuantitativa.

En muchos sistemas de ensayo, basados en este principio de la FRET, se excita el grupo luminóforo que actúa como dador y, por absorción de un fotón, pasa de un estado base a un estado excitado. Si la molécula excitada del dador se halla en una proximidad suficiente de una molécula idónea de receptor, entonces el estado excitado puede transferirse del dador al aceptor. Esta transferencia de energía provoca una disminución de la fluorescencia o la luminiscencia del dador y, en el caso de que el aceptor sea luminiscente por sí mismo, un aumento de la luminiscencia del aceptor. En el caso de que el aceptor sea un extintor (quencher), entonces este no mostrará por sí mismo fluorescencia alguna.

La eficiencia de la transmisión de energía depende en gran manera de la distancia entre la molécula del dador y la del aceptor. La distancia repercute en una 6ª potencia en la disminución de la señal. Debido a esta incidencia drástica de la distancia entre el dador y el aceptor pueden utilizarse pares FRET (se habla también de sistemas FRET) para estudiar el número de moléculas de dador y de aceptor que se hallan en la proximidad inmediata entre sí. Seguidamente se utiliza esta propiedad para determinar p.ej. la presencia de un analito, por ejemplo mediante la puesta en contacto con un componente específico. Por el estado de la técnica se conoce un gran número de posibilidades de aplicación de los sistemas FRET. Se remite al respecto en especial a los documentos WO 00/47693, EP 76 695; Hemmilä, Chemical Analysis 117, John Wiley & Sons, Inc., 135-139, 1991; así como Van der Meer y col., Resonance Energy Transfer, editorial VCH (1994), ya citado.

Una forma preferida de ejecución de los sistemas FRET son aquellos métodos de detección que sirven además para la medición demorada en el tiempo de la señal de un sistema FRET. Los trabajos y procedimientos básicos para la determinación de las señales FRET resueltas en el tiempo se describen en el estado de la técnica. El principio de las mediciones FRET resueltas en el tiempo se basa fundamentalmente en el hecho de que se elige un intervalo de medición de tal manera que no se detecten fluorescencia de fondo molestas, que pueden ser debidas p.ej. a sustancias molestas de la muestra, sino que se mida la fluorescencia generada o reprimida por la transmisión de
energía.

La fluorescencia resultante del sistema TR-FRET se determina con dispositivos de medición diseñados al efecto.

Tales sistemas de detección resueltos en el tiempo (time ressolved) utilizan como foco luminoso excitador p.ej. diodos láser de pulsos, diodos emisores de luz (LED) o láser de colorante de pulsos. La medición se realiza después del correspondiente retraso temporal, es decir, después de la extinción de las señales molestas de fondo. La estructura de principio de un dispositivo de medición de este tipo se representa en la figura 1. Los sistemas de medición que pueden adquirirse en el comercio y se basan p.ej. en lámparas flash de xenón, p.ej. lámparas Victor™ de Wallac Oy, no son idóneos para una determinación sensible de la fluorescencia retardada en el tiempo en un intervalo de pocos \mus, que sería necesaria para los pares FRET de la invención, son idóneos solamente para sistemas FRET de un tiempo de vida de 10 \mus.

La detección puede realizarse también, con preferencia, con la técnica de la modulación de fases. En ella se modula la intensidad de la luz excitadora con alta frecuencia, por consiguiente se modula también la intensidad de emisión. Debido al tiempo de vida, la emisión de fluorescencia se desplaza de fase y se desmodula. En este lugar se remite explícitamente a las informaciones relativas a los sistemas correspondientes (WO 00/47693; French y col., SPIE BiOS en Proc. SPIE v. 3259, 209-218, 1998; y French y col., SPIE BiOS en Proc. SPIE v. 3603, 272-280, 1999). El experto encontrará en ellas los datos necesarios para utilizar con éxito las combinaciones de colorantes de la invención incluso en los sistemas de modulación de fluorescencia. A continuación se abordará fundamentalmente solo la TR-FRET, pero el experto comprenderá fácilmente que puede recurrir también a la técnica de modulación de fases para medir los pares FRET de la invención.

Los sistemas de FRET basados en complejos metálicos como dadores de energía y en colorantes del grupo de las ficobiliproteínas como aceptores de energía ya son conocidos por el estado de la técnica (EP 76 695; Hemmilä, Chemical Analysis 117, John Wiley & Sons, Inc., 135-139, 1991). Los sistemas comerciales consolidados (p.ej. de Wallac OY, o Cis Bio-Packard) emplean un par FRET que consta por un lado de un quelato de lantánido como complejo metálico y por otro lado de una ficobiliproteína.

Las propiedades ventajosas de los complejos de quelato de lantánido, en especial los complejos de europio o de terbio, ya son conocidos y pueden utilizarse no solo en combinación con extintores (quencher), sino también en combinación con fluoróforos. La combinación de tales complejos de quelato de lantánido con fluoróforos de peso molecular bajo no parece aportar ninguna mejora sustancial a la sensibilidad (US-5 998 146 y Blomberg y col., lugar citado).

Los complejos de rutenio se emplean de por sí como fluoróforos o luminóforos en especial en la luminiscencia de electroquímica. Los complejos de quelatos de rutenio son conocidos p.ej. por los documentos EP 178 450 y EP
772 616. En ellos se describen también los métodos preferidos de fijación de estos complejos sobre biomoléculas. En ellos no se discute el uso como dadores de energía en sistemas FRET.

Las aloficocianinas poseen propiedades sobresalientes, p.ej. coeficientes de extinción extraordinariamente elevados (en torno a 700.000 L/M cm) e igualmente coeficientes de emisión extraordinariamente altos. Estos son requisitos ideales de idoneidad para aceptores fluoróforos en sistemas FRET. Estos colorantes se conocen además por ser fácilmente solubles en agua y estables.

El término "fluoróforos de bajo peso molecular" abarca los colorantes fluoróforos que tienen un peso molecular comprendido entre 300 y 3.000 d. Tales grupos fluoróforos de bajo peso molecular, p.ej. xantenos, cianinas, rodaminas y oxazinas, presentan inconvenientes importantes con respecto a las APC en lo tocante a características importantes. Por ejemplo, los coeficientes de extinción son netamente inferiores y se sitúan en torno a 100.000 L/M cm. Es también conocido que hay que reseñar fijaciones no específicas, debidas a las propiedades hidrófobas de estos cromóforos, como inconvenientes potenciales de estos colorantes como aceptores en sistemas FRET.

Ahora se ha encontrado de modo sorprendente que los pares FRET de la invención, compuestos por un lado de un completo de tipo quelato metálico con iones de metales de los grupos VII y VIII de los elementos de transición, con preferencia de renio, osmio, iridio o rutenio, con preferencia especial de rutenio, y por otro lado de un fluoróforo de bajo peso molecular, presentan grandes ventajas en los sistemas FRET, en especial en lo que respecta a la sensibilidad.

Se ha observado que las combinaciones de colorantes descritas en esta invención conducen de modo sorprendente a sistemas de ensayo muy sensibles e incluso a una mejora de su límite inferior de detección, p.ej. para procedimientos de medición basados en el principio de la medición retardada en el tiempo de los sistemas FRET.

Se ha encontrado además que son especialmente indicados aquellos colorantes de los grupos de colorantes ya mencionados anteriormente que tienen un máximo de absorción en un intervalo de longitudes de onda comprendido entre 600 nm y 750 nm. Una forma preferida de ejecución de la presente invención constituye, pues, un método para la determinación de la interacción entre biomoléculas marcadas con un dador y con un aceptor, respectivamente, basado en el principio de la transferencia de energía de fluorescencia y p.ej. para la medición retardada en el tiempo de la fluorescencia resultante, dicho método está caracterizado por el uso combinado de complejos de tipo quelato metálico, ya descritos antes, y de fluoróforos de bajo peso molecular que tienen un máximo de absorción entre 600 nm y 750 nm.

Si se emplea como dador en un sistema FRET un complejo de rutenio, p.ej. como el descrito en el documento EP-178 450 o EP 772 616, entonces una molécula especialmente idónea de aceptor tendrá un máximo de absorción en una longitud de onda comprendida entre 600 nm y 750 nm y con preferencia muy especial una longitud de onda comprendida entre 630 y 700 nm.

En una forma de ejecución especialmente preferida de la invención, la molécula fluorófora de bajo peso molecular se caracteriza además porque tiene un peso molecular inferior a 2000 d o con preferencia inferior a 1500 d o con preferencia especial inferior a 1000 d. El peso molecular de 1000 d se refiere p.ej. al componente colorante como tal, es decir, p.ej. no se refiere a estructuras adicionales de engarce ni a otros productos de unión. Con mayor preferencia, el fluoróforo de bajo peso molecular tiene por lo menos un peso molecular de 300 d, con preferencia especial por lo menos de 350 d.

Han demostrado ser especialmente indicados los colorantes del grupo de sustancia de los xantenos, cianinas, rodaminas y oxazinas. En una forma especialmente preferida de ejecución de la invención, el colorante fluoróforo de bajo peso molecular se elige por tanto entre el grupo formado por los xantenos, las cianinas, las rodaminas y las
oxazinas.

Los colorantes del grupo de las rodaminas se describen con detalle en el documento EP-567 622. En él se describe además las medidas que pueden adoptarse para obtener colorantes de rodamina, cuyo máximo de absorción se desplaza en dirección a la luz de longitud de onda más larga. Como fluoróforos de bajo peso molecular son preferidos en especial los fluoróforos del grupo de las rodaminas de la siguiente fórmula general (fórmula I).

Fórmula I: rodamina

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en la que R1 y R13 son iguales o distintos y significan: hidrógeno, alquilo de 1 a 20 átomos de carbono, unidades polioxihidrocarbilo, fenilo, fenilalquilo de 1 a 3 átomos de carbono en el resto alquilo, dichos restos alquilo y/o fenilo pueden estar sustituidos por uno o varios grupos hidroxi, halógeno, sulfo, carboxi o alcoxicarbonilo, dicho alcoxi puede tener de 1 a 4 átomos de carbono; R7 significa un resto alquilo de 1 a 20 átomos de carbono, con preferencia de 1 a 7 átomos de carbono, sustituido por lo menos por un halógeno; o significa un resto fenilo que está sustituido por un grupo carboxi o alcoxicarbonilo que se halla en posición orto con respecto al sistema pentacíclico y por lo menos por 1 halógeno, dicho alcoxi puede tener de 1 a 4 átomos de carbono; o significa un grupo carboxialquilo o un grupo carboximetilenoxi-alquiloxi;

los dos enlaces marcados con líneas de trazo discontinuo significan que los átomos de carbono unidos mediante un enlace marcado con trazo discontinuo están unidos entre sí mediante un enlace sencillo o doble; los restos R14, R15 y las demás posiciones no marcadas con símbolos específicos en el armazón pentacíclico pueden estar sustituidos por grupos alquilo de 1 a 20 átomos de carbono; X- es un contra-ion; y por lo menos uno de los restos R1, R7 y/o R13 está unido a una biomolécula.

Son muy especialmente preferidas aquellas rodaminas, en las que el resto R7 es un grupo que atrae fuertemente los electrones. Tales grupos que atraen electrones de R7 son con preferencia los restos polihalogenocarboxifenilo y perfluoralquilo. Son preferidos en especial los restos tetraclorocarboxifenilo y los restos polihalogenofenilo en la posición de R7. Estos presentan una estabilidad especialmente buena en amplios intervalos del pH. El ajuste fino de la longitud de onda en los colorantes de rodamina puede realizarse con la introducción de dobles enlaces y además con sustituyentes metilo en los restos R2, 3, 11, 12, 5 y/o 9. La unión con la biomolécula se realiza con preferencia a través del resto R1 o del resto R13. Pueden optimizarse además las longitudes del engarce en lo referente a la realización del ensayo.

También el carácter hidrófilo de tales colorantes de rodamina pentacíclica puede modificarse dentro de amplios márgenes mediante la sustitución de los correspondientes grupos hidrófilos. Se utilizan con preferencia grupos ácido sulfónico que pueden introducirse fundamentalmente en cualquier posición. Si la introducción del grupo ácido sulfónico se realiza en una de las posiciones R1 o R3, entonces la otra posición estará sustituida con preferencia por carboxialquilo.

En otra forma preferida de ejecución se utilizan como aceptores de energía de fluorescencia-resonancia oxazinas de la siguiente fórmula general.

Fórmula II: oxazinas

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en la que R1, R4, R5, R6, R7 y R10 significan hidrógeno, alquilo, hidroxi, halógeno, carboxilo, sulfonilo o amino y R2 y R3 significan hidrógeno, alquilo, alcoxi, unidades polioxihidroxicarbonilo, fenilo o fenilalquilo, que pueden estar sustituidos por hidroxi, sulfonilo, carboxi, amino o alcoxicarbonilo; R2 con R1 o bien R3 con R4 pueden formar un eslabón saturado o insaturado C4 o C5 y

R8 y R9 significan hidrógeno, alquilo, alcoxi, unidades polioxihidroxicarbonilo, fenilo, fenilalquilo, que pueden estar sustituidos por hidroxi, sulfonilo, carboxi, amino, alcoxicarbonilo; R2 con R1 o bien R3 con R4 pueden formar un eslabón saturado o insaturado C4 o C5 y

por lo menos uno de los restos R2, R3, R8 o R9 constituye un resto que no forma eslabón y está unido a una biomolécula; por lo menos uno de los restos R2, R3, R8 y R9 constituye un resto que forma eslabón y puede estar eventualmente sustituido por alquilo.

Las oxazinas y su unión a la biomolécula se describen en el documento EP-747 447. Se remite en este punto a la descripción de los colorantes oxazina que se da en este documento y a las formas preferidas de los mismos. Son preferidos en especial los colorantes oxazina, en los que R3 y R4 y/o R7 y R8 forman una estructura cíclica, porque con ello se mejora sustancialmente el rendimiento cuántico. El "ajuste fino" de la longitud de onda de absorción y del carácter hidrófilo puede realizarse del modo recién descrito para la rodamina.

Otros colorantes preferidos se eligen entre los grupos de las cianinas (véase Mujumdar y col., Bioconjugate Chem. 7, 356-362, 1996) o de los xantenos (EP 1 054 039).

Para determinar la sensibilidad, que puede lograrse de un par FRET a investigar, en función del ensayo, del analito, del reactivo de fijación y de detección, son imaginables y viables muchas configuraciones de ensayo. Sin embargo, a tales sistemas les falta al parecer la posibilidad de compararse entre sí y de transferir sus datos a otros sistemas.

De modo conveniente se recurre al sistema biotina-estreptavidina como sistema estándar para la determinación del límite inferior de detección (LID). La biotina de bajo peso molecular se fija firmemente sobre la estreptavidina. Este par de fijación muy afín permite una determinación reproducible y comparable de sensibilidades, que pueden lograrse con diferentes pares FRET.

Es preferido el uso del sistema biotina-estreptavidina para determinar el límite inferior de detección para un par FRET a estudiar. Para ello se fija el complejo dador de energía FRET sobre la estreptavidina, del modo descrito por ejemplo en el ejemplo 1b). El colorante aceptor de bajo peso molecular se une con el diamino-dioxa-octano (DADOO) que actúa como engarce de la biotina (ver ejemplo 1d) y 1e)). La determinación de la sensibilidad se realiza con preferencia del modo descrito en el ejemplo 3.

Los pares FRET de la invención pueden elegirse con el procedimiento descrito antes de tal manera que se mejore el límite inferior de detección. Son preferidos aquellos pares de FRET formados por iones metálicos de los grupos VII y VIII de los elementos de transición como dadores y por aceptores de pesos moleculares bajos, que en las condiciones definidas antes presentan un límite de detección de <3,0x10^{-13} M. Los pares FRET preferidos tienen un límite inferior de detección de <2x10^{-13} M, los pares FRET especialmente preferidos tienen un límite inferior de detección de <1x10^{-13} M.

Por consiguiente, la invención se refiere también a un procedimiento mejorado para la determinación de la interacción entre biomoléculas marcadas con un dador y con un aceptor, respectivamente, basado en el principio de la transferencia de energía de fluorescencia-resonancia y para la medición de la fluorescencia resultante, caracterizado porque como dadores de energía se emplean complejos de tipo quelato metálico con iones de metales de los grupos VII y VIII de los elementos de transición, en combinación con fluoróforos de peso molecular bajo, comprendido entre 300 d y 3.000 d, que actúan como aceptores de energía.

Una forma preferida de ejecución de la invención se refiere a un ensayo homogéneo de mejor sensibilidad para determinar la interacción entre biomoléculas marcadas con un dador y con un aceptor, respectivamente, basado en el principio de la transferencia de energía de resonancia-fluorescencia y para medir la fluorescencia resultante, caracterizado porque los complejos de quelato metálico con iones de metales de los grupos VII o VIII de los elementos de transición actúan como dadores de energía en combinación con fluoróforos de peso molecular bajo, comprendido entre 300 d y 3000 d, que actúan como aceptores de energía.

Para el experto es, pues, muy fácil, elegir para su propia finalidad la combinación óptima de dador y aceptor basándose en la presente invención.

Se utilizan con preferencia especial los pares FRET sensibles, novedosos, de esta invención para determinar las interacciones moleculares. Son ejemplos de tales interacciones en especial las reacciones de hibridación de ácidos nucleicos, la fijación de biomoléculas sobre los receptores correspondientes y las interacciones entre antígenos o haptenos y anticuerpos, o bien otros pares de fijación bioafines, p.ej. la lectina y el azúcar.

Sin embargo, los pares FRET pueden utilizarse también p.ej. para facilitar las mediciones de la distancia que separa la molécula del dador de la molécula del aceptor. Los cambios en tales distancias entre moléculas pueden utilizarse p.ej. para documentar una actividad enzimática. El uso de complejos de quelato metálico como dadores de energía en combinación con fluoróforos de bajo peso molecular como aceptores de energía para determinar las interacciones entre biomoléculas constituye, pues, una forma también especialmente preferida de ejecución de esta invención.

Una ventaja especial de los complejos de rutenio es que tienen un tiempo de vida entre 50 ns y 10 \mus, que durante la medición permite una alta velocidad de repetición y un tiempo muerto corto. Se entiende por tiempo de vida el tiempo que transcurre hasta que se ha emitido de nuevo la mitad de la energía de un sistema FRET. El tiempo de vida corto de los pares de colorantes de la invención cuando se emplean complejos de rutenio como dadores es especialmente ventajoso porque puede medirse repetitivamente, es decir varias veces. Si se emplean como dadores p.ej. complejos de quelato de europio, entonces lo habitual es elegir un marco de medición dentro del intervalo temporal de 300 \mus a 1 ms, aunque por lo general se mide durante un período de unos 200 \mus. Esta forma de proceder viene condicionada por el largo tiempo de vida de los complejos de europio excitados, de modo que los marcos de medición más cortos serían desventajosos. A diferencia de ellos se obtienen ventajas sustanciales para los pares de colorantes de la invención en los que se emplean p.ej. complejos de rutenio como dadores. Los complejos de rutenio tienen por lo general un tiempo de vida de 50 ns a 10 \mus. Dado que los fluoróforos de bajo peso molecular tienen un tiempo de vida muy corto, el tiempo de vida del complejo de quelato metálico resulta decisivo para elegir el marco temporal óptimo para detectar los pares FRET de la invención. Un solo ciclo de medición puede terminarse en 100 \mus o menos y los ciclos de medición pueden repetirse varias veces. Esto se traduce en una mejora notable de la sensibilidad. Deberá darse por tanto una preferencia especial a los pares de colorantes FRET con complejos de rutenio como dadores, que tienen tiempos de vida de 50 nm a 10 \mus. Han demostrado ser muy especialmente preferidos los pares que tienen un tiempo de vida de 100 ns a 8 \mus.

Es preferido el uso de los pares FRET de la invención para determinar p.ej. la presencia o la concentración de una biomolécula. Se fija con preferencia especial un componente del par FRET sobre un componente de fijación de dicha biomolécula, mientras que el segundo componente del par FRET está unido o se une directa o indirectamente sobre dicha biomolécula. Un sistema sencillo de este tipo emplea p.ej. un antígeno marcado con un quelato metálico y un anticuerpo marcado con fluoróforo (o a la inversa). Los modelos y ejemplos correspondientes se detallan en la sección del método.

Tal como se ha mencionado en la introducción, una ventaja especial de los sistemas FRET, en especial de los sistemas TR-FRET, consiste en que se puede realizar la determinación de las interacciones entre las biomoléculas sin operaciones de lavado, es decir, en procedimientos de determinación denominados homogéneos. Son, pues, especialmente preferidos los procedimientos de determinación homogéneos en los que se emplean las combinaciones de colorantes de la invención.

Los dos componentes del par de colorantes de la invención, por un lado el dador de quelato metálico (metal de los elementos de transición del grupo VII o del grupo VIII) y por otro lado el fluoróforo de bajo peso molecular pueden fijarse sobre la biomolécula de modo de por sí conocido, p.ej. del modo descrito en EP 178 450 y en EP 772 616 ("complejos metálicos hidrófilos") o bien en EP 567 622 o en EP 747 447. Los productos de esta fijación se disuelven bien en agua y son muy estables en las condiciones de transporte y almacenaje. Son, pues, idóneos de modo excelente para formar kits de ensayo o de reactivos que permiten la detección de un analito en una muestra, dicho kit de reactivos contiene por lo menos una biomolécula marcada con un complejo de quelato metálico y por lo menos otra biomolécula que está marcada con un fluoróforo de bajo peso molecular.

Una forma preferida de ejecución de la invención es un reactivo o una combinación de reactivos para determinar la interacción entre los componentes de un par de fijación bioafín, caracterizado porque un componente del par de fijación bioafín está marcado con un complejo de quelato metálico de iones de metales del grupo VII o VIII de los elementos de transición y el otro componente de este par de fijación bioafín está marcado con un fluoróforo de bajo peso molecular, dicho PM está comprendido entre 300 y 3.000 d.

Otra forma preferida de ejecución de la invención es un kit de reactivos que, además de las biomoléculas marcadas con los componentes FRET, contiene también otros reactivos útiles, que facilitan la ejecución de la determinación del analito y pueden ser por ejemplo determinados tampones o reactivos de control.

Los ejemplos siguientes, las publicaciones citadas, el protocolo de secuencias, las fórmulas y la figura ilustran la invención con mayor detalle, cuyo alcance se desprende de las reivindicaciones. Los procedimientos descritos deberán tomarse como ejemplos, que incluso después de introducir modificaciones describen el objeto de la invención.

Figuras

Figura 1

Esquema del dispositivo de medición

Representación esquemática de los aparatos de medición empleados en el marco de esta invención para la medición de la fluorescencia resuelta en el tiempo. Estos dispositivos de medición y su utilización se describen e ilustran con mayor exactitud en los ejemplos siguientes.

Ejemplos Abreviaturas empleadas

DADOO = 1,8-diamino-3,6-dioxaoctano

bato = ácido batofenantrolina-disulfónico

bpi = ácido 2,2'-bipiridil-4-metil-4'-butilcarboxílico

APC = aloficocianina

HA = hemaglutinina humana

péptido-HA = YPYDVPDYA

OSu = O-succinimida

estrept. = estreptavidina

Ru = rutenio

Eu = europio

Ejemplo 1 Síntesis y marcadores de biomoléculas a) Síntesis del Ru(bato)_{2}bpi-OSu

Se disuelven 50 mg (3x10^{-5} moles) de Ru(bato)_{2}bpi en DMF, se les añaden 12 mg (6x10^{-5} moles) de EDC (clorhidrato de la N-(3-dimetilamino-propil)-N'-etilcarbodiimida) y 7 mg (6 x 10^{-5} moles) de NHS (N-hidroxisuccinimida) y se agitan a temperatura ambiente durante una noche. Con la adición de acetona precipita el producto de la reacción. Se separa este precipitado por filtración y se seca con vacío. La purificación se realiza por cromatografía HPLC. El producto final se analiza por EM-MALDI: se ajusta a la fórmula III.

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Fórmula III: Ru(bato)_{2}bpi-OSu

3

b) Síntesis de estreptavidina-Ru(bato)_{2}bpi

Se disuelven 10 mg (1,9 x 10^{-7} moles) de estreptavidina en 1 ml de una solución 0,1 N de NaHCO_{3} y se les añaden por goteo 2 mg (1,3 x 10^{-6} moles) de Ru(bato)_{2}bpiOSu (disueltos en 0,5 ml de una solución acuosa 0,1 N de NaHCO_{3}). Se agita a temperatura ambiente durante 1 hora y se cromatografía la mezcla a través de una columna Sephadex LH20 (eluyente: una solución 0,1 N de NaHCO_{3}). Se dializan las fracciones de producto, es decir, las fracciones que contienen estreptavidina marcada (proteína de densidad óptica (O.D.) = 280 nm), frente al H_{2}O durante una noche y después se liofilizan.

Se determina el grado de marcado por comparación de la absorción a 280 nm (proteína) y 460 nm (complejo de Ru^{2+}) y se determinan 3,6 complejos de Ru^{2+} por estreptavidina. Los conjugados de rutenio-estreptavidina que tienen en promedio de 3 a 5 complejos de Ru^{2+} por cada molécula de estreptavidina son idóneos para la determinación de la sensibilidad.

c) Fijación del Ru(bato)_{2}bpi sobre el anticuerpo monoclonal mAb-anti-HA

A 300 \mul (3 mg) de anticuerpo mAB-anti-HA se les añade por goteo 1 mg (0,65 x 10^{-6} moles) de Ru(bato)_{2}bpiOSu (disuelto en 1,0 ml de una solución acuosa 0,1 N de NaHCO_{3}). Se agita a temperatura ambiente durante 1 hora y se cromatografía la mezcla a través de una columna LH20 (eluyente: una solución 0,1 N de NaHCO_{3}). Se reúnen las fracciones de producto, es decir, las fracciones que contienen el anticuerpo marcado (O.D. = 280 nm) y se congelan en forma de soluciones 0,1 N de NaHCO_{3}.

En el ensayo presente se fijan en promedio 7 complejos de rutenio por anticuerpo.

d) Obtención de la biotina-JA286

Se disuelven 10,2 mg (3x10^{-5} moles) de biotina-DADOO y 17,2 mg (3 x 10^{-5} moles) de JA 286 en 1 ml de DMF, se les añaden 15 \mul de trietilamina y se enfrían a 0ºC. Después de añadir 5 \mul de DECP (cianofosfonato de dietilo) se agita la mezcla a 0ºC durante 1 hora y después a temperatura ambiente durante una noche. Se concentra a sequedad y se purifica el producto en bruto por cromatografía HPLC. Se caracteriza el producto final por EM-MALDI: se ajusta a la fórmula IV.

Fórmula IV: biotina-JA286

4

e) Síntesis de la biotina-JA198

Se disuelven 5 mg (5,3 x 10^{-6} moles) de JA198-OSu y 2 mg (5,3 x 10^{-6} moles) de biotina-DADOO en 800 \mul de tampón fosfato, pH 7,5, y se agita en exclusión de la luz a temperatura ambiente durante una noche. A continuación se purifica la mezcla por cromatografía HPLC. Se verifica el producto por EM-ESI: se ajusta a la fórmula
V.

Fórmula V: biotina-JA198

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5

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f) Fijación del JA133 sobre el péptido sintético HA

Se disuelven 5 mg (4,5 x 10^{-6} moles) de péptido HA (YPYDVPYA = SEQ ID NO: 1) en 1 ml de acetonitrilo/tampón fosfato de pH 7,5 (1:1) y con agitación se les añade una solución de 4 mg (4,5 x 10^{-6} moles) de JA133-OSu y 500 \mul de acetonitrilo. Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante una noche.

Después de concentrar a sequedad con vacío se realiza una purificación por HPLC. Se identifica el producto por EM-ESI: se ajusta a la fórmula VI.

Fórmula VI: péptido HA-JA133

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6

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Ejemplo 2 Dispositivo de medición y su descripción

El aparato de medición empleado en el marco de la presente invención para determinar la fluorescencia resuelta en el tiempo se describe a continuación y se ilustra mediante un esquema (figura 1).

El foco luminoso pulsante (1) - láser de nitrógeno o láser de colorante - excitan con pulsos luminosas de una longitud de onda apropiada (13) el marcador dador de la muestra a medir (3), la amplitud del pulso luminoso t = 0,7 ns es mucho más corta que el tiempo de extinción de uno de los marcadores fluorescentes. Por transmisión de la energía se excita seguidamente el marcador aceptor hasta la fluorescencia. Se lleva esta radiación de fluorescencia (14) con una óptica (4, 6) a través de un filtro óptico (filtro de cantos/ filtro de paso de cinta) (5), que permite el paso de la longitud de onda de emisión del marcador aceptor, hasta el fotocátodo de un fotomultiplicador (7). Los fotones individuales detectados generan pulsos de corriente, que se amplifican (8), se normalizan (9) y se cuentan digitalmente (10) (método de recuento de fotones). Mediante una placa de cuarzo (2) se desvía una porción de la luz excitada (15) a un fotodiodo (11), que controla un disparador de puerta (12) que, después de un período de retardo ajustable - con preferencia de 1 \mus -, pone en marcha el contador (10) y después de un tiempo de abertura ajustable del marco de medición - con preferencia 100 \mus -, interrumpe de nuevo el proceso de recuento. El período de retardo se elige de tal manera que durante el mismo se extingan prácticamente por completo los efectos de luz dispersa y la fluorescencia de fondo. De este modo, el número de pulsos de corriente contados es proporcional a la intensidad de fluorescencia del marcador, que se mide por separado del fondo. La ejecución de las mediciones correspondiente se describe con detalle en los ejemplos 3 y 4 para dos nuevos pares TR-FRET. Otros pares nuevos de FRET, descritos en el ejemplo 5, se miden de modo similar, o bien los sistemas APC-europio del ejemplo 5 se cuantifican con aparatos y métodos conocidos por el estado de la
técnica.

Ejemplo 3 Ejecución de una medición de sensibilidad de un sistema FRET con complejo Ru^{2+} como dador y con JA-286 como aceptor fluoróforo

Se añaden por pipeteo a la cubeta de medición 400 \mul de una solución (fosfato de Na 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2) sobre estreptavidina 100 nM marcada con el complejo de Ru^{+2} y biotina-DADOO-JA-286 300 nM.

La medición se realiza con el aparato descrito en el ejemplo 2 y representado esquemáticamente en la figura 1. El dador se excita con un láser de colorante a 460 nm. La duración del pulso luminoso es = 1 ns. La fluorescencia del sistema se detecta por la técnica de recuento de fotones con una combinación de un filtro óptico de cantos KV550 + RG645 con el fotomultiplicador según el montaje experimental descrito.

El tiempo de retraso se ajusta a 1 \mus y el marco de medición es de 100 \mus. El fondo se determina en una medición separada del tampón en las mismas condiciones. La sensibilidad (límite inferior de detección) se indica mediante una concentración límite que se determina por la ecuación siguiente:

c_{0} = \frac{2B}{S} c_{S}

en la que c_{0} es la concentración límite en [M], B es el fondo o base en [cuentas], S es la señal en [cuentas] y c_{S} es la concentración de la muestra en [M].

Ejemplo 4 Ejecución de una medición de sensibilidad de un sistema FRET con un complejo de Ru^{2+} como dador y con JA-133 como aceptor para una reacción de antígeno-anticuerpo

Los componentes de la FRET son en este ejemplo el complejo de Ru^{2+} del ejemplo 1a) como dador y el JA-133 como aceptor. Se marca con el dador un anticuerpo monoclonal contra HA, del modo descrito en 1c). El "antígeno" (péptido HA) se marca con el aceptor con arreglo al ejemplo 1f). Con la reacción antígeno-anticuerpo se lleva el par dador-aceptor a una proximidad suficiente para que la FRET sea posible y medible.

Después de una incubación a temperatura ambiente de 10 minutos se añaden a la cubeta de medición por pipeteo 400 \mul de una solución (fosfato de Na 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2) sobre anti-Ha 10 nM marcado con un complejo de Ru^{2+} y sobre HA-JA-133 100 nM.

La medición se realiza con el aparato descrito en el ejemplo 2. Se excita el dador a 460 nm con un láser de colorante de 460 nm. La duración del pulso luminoso es = 1 ns. Se detecta la fluorescencia del sistema por la combinación de un filtro óptico de cantos KV550 + RG630 con un fotomultiplicador según la descripción del montaje experimental para la técnica de recuento de fotones.

Se ajusta el tiempo de retardo a 1 \mus y el marcado de medición es de 100 \mus. Se determina el fondo por una medición separada del tampón en las mismas condiciones. La sensibilidad se indica mediante una concentración límite c_{0} en [moles/litro], de igual modo que en el ejemplo 1.

La sensibilidad de este sistema es de 7,2x10^{-14} M en HA.

Ejemplo 5 Preparación de algunos nuevos pares FRET y comparación con pares FRET del estado de la técnica a) Par TR-FRET 1: estreptavidina-Ru(bato)2bpi/biotina-APC

La estreptavidina marcada del ejemplo 1b) se utiliza en una concentración de 100 nM; la APC-biotina (producto comercial: APC-XL-Biotin de Europa Bioproducts Ltd., Cambridge, G.B.) en una concentración de 300 nM. La longitud de onda de excitación (\lambda_{EX}) se sitúa en 460 nm; la longitud de onda de emisión o de medición (\lambda_{EM}) se sitúa en 634 nm. Con este par de colorantes y reactivos se halla un límite inferior de detección de 4,1x10^{-13} moles/litro
(\approx M).

b) Par TR-FRET 2: estreptavidina-Ru(bato)2bpi/biotina-JA 198

7

c) Par TR-FRET 3: estreptavidina-Ru(bato)2bpi/biotina-JA 286

8

d) Par TR-FRET 4: estreptavidina-Ru(bato)2bpi/HA-JA 133

9

e) + f) Otros pares FRET recurriendo a productos comerciales

Para los pares FRET 5 y 6 de la tabla 1 se utilizan productos comerciales, como son los derivados de estreptavidina marcados con europio de la empresa Wallac Oy (Strept-Eu-0062: AD0062 Streptavidin-W1024; Strept-Eu0060: AD0060 Streptavidin-W8044); como aceptor se utiliza la biotina-APC descrita en el ejemplo 5a) y que es un producto comercial.

TABLA 1 Límite inferior de detección de algunos pares FRET investigados

nº	Sistema	Concentración	\lambda_{EX}	\lambda_{EM}	límite inferior de
		[\muM]	[nm]	[nm]	detección (LID)
		estrept./ biotina			[moles/ litro]
1	estrept.-Ru(bato)_{2}bpi/ biotina-APC	0,100/0,300	460	634	4,1x10^{-13}
2	estrept.-Ru(bato)_{2}bpi/ biotina-JA 198	0,150/0,150	460	660	2,6x10^{-13}
3	estrept.-Ru(bato)_{2}bpi/ biotina-JA 286	0,100/0,300	460	703	7,4x10^{-14}
4	anti-HA-Ru(bato)_{2}bpi/ biotina-HA-JA 133	0,100/0,100	460	631	7,2x10^{-14}
5^{(#)}	estrept.-EU0062/biotina-APC	0,030/0,090	337	660	2,5x10^{-11}
6^{(#)}	estrept.-EU0060/biotina-APC	0,030/0,090	337	660	7,3x10^{-12}

La sensibilidad se mide con:

Un retraso de 1 \mus y un marco de medición de 100 \mus; se determina con arreglo a la fórmula

c_{0} = \frac{2B}{S} c_{S}

\hskip0,5cm

[M],

en la que c_{0} es la concentración límite en [M]; c_{S} es la concentración utilizada en [M]; B es el fondo o base (del tampón) en [cuentas]; S es la señal en [cuentas].

(#): marco de medición: 400 \mus, tal como se describe en el estado de la técnica para los complejos de Eu-APC.

De la tabla 1 se desprende claramente que los nuevos pares FRET son por lo menos equiparables a los sistemas conocidos del estado de la técnica, cuando no superiores. El par FRET nº 3 de la invención tiene un LID de 7,4 x 10^{-14}, que se sitúa claramente por debajo de los LID de los ejemplos 5 y 6 correspondientes al estado de la técnica.

Lista de referencias

EP 178 450

EP 567 622

EP 747 447

EP 076 695

EP 772 616

EP 439 036

EP 1 054 039

US-5 998 146

WO 00/47693

Blomberg y col., Clinical Chemistry 45, 855 sig., 1999

French y col., SPIE BIOS en SPIE v. 3259, 209-218, 1998

French y col., SPIE BIOS en SPIE v. 3603, 272-280, 1999

Hemmilä, Chemical Analysis 117, John Wiley & Sons, 135-139, 1991

Joun y col., Analytical Biochemistry 232, 24-30, 1995

Mujumdar y col., Bioconjugate Chem. 7, 356-362, 1996

Van der Meer y col., Resonance Energy Transfer, VCH, 1994.

<110> Roche Diagnostics GmbH, F. Hoffmann-La Roche AG

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<120> Nuevos pares de colorantes para mediciones de transferencia de energía de resonancia-fluorescencia

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<130> Case 19054 WO

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip0.400000\baselineskip

<150> EP 00 124995.2

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2000-11-16

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<160> 1

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<170> PatentIn ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: péptido HA

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<400> 1

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\sa{Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala}

Claims

1. Método para la determinación de la interacción entre biomoléculas marcadas con un dador y con un aceptor, respectivamente, basado en el principio de la transferencia de energía de fluorescencia-resonancia y para la medición de la fluorescencia resultante, caracterizado porque como dadores de energía se emplean complejos de quelatos metálicos con iones de metales de los grupos VII o VIII de los elementos de transición, que se combinan con fluoróforos de bajo peso molecular, comprendido entre 300 d y 3.000 d, que actúan como aceptores de energía.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque los fluoróforos de bajo peso molecular presentan un máximo de absorción comprendido entre 600 nm y 750 nm.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque los fluoróforos de bajo peso molecular tienen un peso molecular de < 2000 d.

4. Método según una de las reivindicaciones de 1 a 3, caracterizado porque los fluoróforos se eligen entre el grupo que abarca los xantenos, las cianinas, las rodaminas y las oxazinas.

5. Método según una de las reivindicaciones de 1 a 4, caracterizado porque se emplea como fluoróforo una rodamina de la siguiente fórmula general I

10

en la que R1 y R13 son iguales o distintos y significan: hidrógeno, alquilo de 1 a 20 átomos de carbono, unidades polioxihidrocarbilo, fenilo, fenilalquilo de 1 a 3 átomos de carbono en el resto alquilo, dichos restos alquilo y/o fenilo pueden estar sustituidos por uno o varios grupos hidroxi, halógeno, sulfo, carboxi o alcoxicarbonilo, dicho alcoxi puede tener de 1 a 4 átomos de carbono;

R7 significa un resto alquilo de 1 a 20 átomos de carbono, con preferencia de 1 a 7 átomos de carbono, sustituido por lo menos por un halógeno; o significa un resto fenilo que está sustituido por un grupo carboxi o alcoxicarbonilo que se halla en posición orto con respecto al sistema pentacíclico y por lo menos por 1 halógeno, dicho alcoxi puede tener de 1 a 4 átomos de carbono; o significa un grupo carboxialquilo o un grupo carboximetilenoxi-alquiloxi;

los dos enlaces marcados con líneas de trazo discontinuo significan que los átomos de carbono unidos mediante un enlace marcado con trazo discontinuo están unidos entre sí mediante un enlace sencillo o doble;

los restos R14, R15 y las demás posiciones no marcadas con símbolos específicos en el armazón pentacíclico pueden estar sustituidos por grupos alquilo de 1 a 20 átomos de carbono; X- es un contra-ion; y por lo menos uno de los restos R1, R7 y/o R13 está unido a una biomolécula.

6. Método según la reivindicación 5, caracterizado porque el sustituyente R7 es un grupo que atrae electrones.

7. Método según una de las reivindicaciones de 1 a 4, caracterizado porque se emplea como fluoróforo una oxazina de la siguiente fórmula general II

11

en la que R1, R4, R5, R6, R7 y R10 significan hidrógeno, alquilo, hidroxi, halógeno, carboxilo, sulfonilo o amino y

R2 y R3 significan hidrógeno, alquilo, alcoxi, unidades polioxihidroxicarbonilo, fenilo o fenilalquilo, que pueden estar sustituidos por hidroxi, sulfonilo, carboxi, amino o alcoxicarbonilo; R2 con R1 o bien R3 con R4 pueden formar un eslabón saturado o insaturado C4 o C5 y

8. Método según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el complejo de quelato metálico es un complejo de rutenio.

9. Método según una de las reivindicaciones de 1 a 8, caracterizado porque la medición de la fluorescencia se realiza de modo resuelto en el tiempo.

10. Método según una de las reivindicaciones de 1 a 8, caracterizado porque la medición de la fluorescencia se realiza mediante una técnica de modulación de fases.

11. Uso de complejos de quelato metálico, formado con iones de metales del grupo VII o VIII de los elementos de transición, en calidad de dadores de energía de resonancia-fluorescencia, en combinación con fluoróforos de bajo peso molecular, cuyo peso molecular se sitúa entre 300 d y 3.000 d, en un procedimiento para la detección de la interacción por lo menos entre dos biomoléculas de una muestra.

12. Uso según la reivindicación 11, caracterizado porque el procedimiento se lleva a cabo por el principio de un ensayo de fijación homogénea.

13. Kit de reactivos para la detección de un analito en una muestra, caracterizado porque contiene por lo menos una biomolécula marcada con un complejo de quelato metálico con iones de metales de los grupos VII o VIII de los elementos de transición así como por lo menos otra biomolécula marcada que contiene un fluoróforo de bajo peso molecular, dicho peso molecular está comprendido entre 300 d y 3.000 d.

14. Combinación de reactivos para la determinación de la interacción entre los componentes de un par de fijación bioafín, caracterizada porque un componente del par de fijación bioafín está marcado con un complejo de quelato metálico, con iones de metales de los grupos VII o VIII de los elementos de transición, y el otro componente del par de fijación bioafín está marcado con un fluoróforo de bajo peso molecular, dicho peso molecular se sitúa entre 300 d y 3.000 d.

15. Procedimiento para la determinación de la interacción de biomoléculas marcadas con un dador y con un aceptor, respectivamente, basado en el principio de la transferencia de energía de resonancia-fluorescencia y para la medición de la fluorescencia resultante, caracterizado porque como dadores de energía se emplean en él complejos de quelato metálico con iones de metales de los grupos VII o VIII de los elementos de transición y como aceptores de energía se emplean fluoróforos de bajo peso molecular, dicho peso molecular está comprendido entre 300 d y 3.000 d.