ES2245621T3 - Procesos para un producto alcoholico. - Google Patents

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Abstract

Un proceso para la producción de un producto alcohólico que comprende las fases secuenciales de: (a) proporcionar una pasta que comprende agua y almidón granular, (b) mantener dicha pasta en presencia de una alfa-amilasa ácida y una glucoamilasa a una temperatura de 0ºC a 20ºC por debajo de la temperatura de gelatinización inicial de dicho almidón granular durante un periodo de 5 minutos a 12 horas, (c) mantener dicha pasta en presencia de una alfa-amilasa ácida y una glucoamilasa y una levadura a una temperatura entre 10ºC y 35ºC durante un periodo de 20 a 250 horas para producir etanol y, (d) opcionalmente, recuperar el etanol.

Description

Procesos para un producto alcohólico.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a procesos para la producción de un producto alcohólico de almidón granular que comprenden un pretratamiento a una temperatura elevada inferior a la temperatura de gelatinización inicial del almidón granular seguidos de la sacarificación simultánea y la fermentación.
Antecedentes de la invención
El almidón granular se encuentra en granos, en cereales o en tubérculos de plantas. El almidón granular tiene forma de gránulos microscópicos, los cuales son insolubles en agua a temperatura ambiente. Cuando se calienta una pasta de almidón acuosa, los gránulos se hinchan y, finalmente estallan, dispersando las moléculas de almidón en la solución. Durante este proceso de "gelatinización", hay un aumento espectacular en la viscosidad. Como el nivel de sólidos es del 30-40% en un proceso industrial típico, el almidón tiene que ser adelgazado o "licuado" de modo que se pueda manejar. Esta reducción en la viscosidad generalmente se realiza por la degradación enzimática en un proceso referido como licuefacción. Durante la licuefacción, el almidón de cadena larga se degrada en cadenas ramificadas y lineales más pequeñas de unidades de glucosa (dextrinas) por una alfa-amilasa.
Un proceso convencional de licuefacción enzimática puede llevarse a cabo como un proceso de pasta caliente de tres fases. La pasta se calienta a entre 80-85º y la alfa-amilasa termoestable se añade para iniciar la licuefacción. La pasta entonces se cocina a chorro a una temperatura de entre 105-125ºC para completar la gelatinización de la pasta, se enfría a 60-95ºC y, generalmente, se añade la alfa-amilasa adicional para finalizar la hidrólisis. El proceso de licuefacción generalmente se lleva a cabo a pH entre 5 y 6. Los granos enteros molidos y licuados se conocen como pulpa.puré.
Durante la sacarificación, las dextrinas de la licuefacción se hidrolizan más para producir azúcares de bajo peso molecular DP1-3 que pueden ser metabolizados por levadura. La hidrólisis típicamente se realiza usando glucoamilasas, alternativamente o además de glucoamilasas, pueden usarse alfa-glucosidasas y/o alfa-amilasas ácidas. Una fase de sacarificación completa típicamente dura hasta 72 horas, no obstante, es común solamente hacer una pre-sacarificación de, p. ej., 40-90 minutos a una temperatura superior a 50ºC, seguida de una sacarificación completa durante la fermentación en un proceso conocido como sacarificación y fermentación simultáneas (SSF).
La fermentación, se puede realizar usando una levadura, p. ej., de Saccharomyces spp., que se añade la pulpa. Cuando el producto alcohólico es el etanol recuperado, p. ej. el etanol combustible, potable, o industrial, la fermentación se lleva a cabo, típicamente durante 35-60 horas a una temperatura de típicamente alrededor de 32ºC.
Tras la fermentación, la pulpa se puede destilar para recuperar el etanol. El etanol puede ser utilizado como, p. ej., etanol combustible, etanol potable, y/o etanol industrial.
Quedará claro a partir de la discusión anterior que la hidrólisis de almidón en un proceso convencional de producto alcohólico consume mucha energía debido a los diferentes requisitos de temperatura durante las diferentes fases. Los procesos que comprenden la hidrólisis de almidón granular sin gelatinización se conocen en la técnica, p. ej., de Suresh et al. (1999), Bioprocess Engineering 21:165-168 , Ueda et al, (1975), Stärke 27:123-128 , Hayashida et al. (1988), Applied and Environmental Microbiology 54:1516-1522 y Abe et al. (1988), Carbohydrate Research 175:85-92 . La patente de EE.UU. N.º 4.316.956 proporciona un proceso de fermentación para la conversión de almidón granular a etanol. La patente europea EP0140410B2 proporciona una composición de enzimas para la hidrólisis de almidón. El objeto de la presente invención es proporcionar procesos mejorados para la conversión de almidón granular en productos alcohólicos.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona métodos para producir un producto alcohólico de almidón granular sin una gelatinización previa de dicho almidón. Por consiguiente la invención proporciona un proceso para la producción de un producto alcohólico que comprende las fases secuenciales de: (a) proporcionar una pasta que comprende agua y almidón granular, (b) mantener dicha pasta en presencia de una alfa-amilasa ácida y una glucoamilasa a una temperatura de al menos 45ºC pero por debajo de la temperatura de gelatinización inicial de dicho almidón granular durante un periodo de 5 minutos a 12 horas, (c) mantener dicha pasta en presencia de una alfa-amilasa ácida y una glucoamilasa y una levadura a una temperatura de entre 26ºC y 35ºC durante un periodo de 20 a 250 horas para producir etanol y, (d) recuperar el etanol.
Aunque no se limita a ninguna teoría de operación, la presente invención, en particular, la fase de proceso (b), se cree que resulta en la hinchazón de los gránulos de almidón incluidos en las células vegetales resultando en la ruptura de las paredes celulares y la liberación de los gránulos de almidón de este modo haciendo los gránulos de almidón más accesibles a una hidratación adicional y la acción de las enzimas. Como la hidratación progresa a través de la fase (b), la alfa-amilasa ácida degrada los gránulos del almidón para producir dextrinas que se degradan por la glucoamilasa en glucosa. Este proceso continúa durante la fase (c) en la que la glucosa se fermenta continuamente a etanol por la levadura, de este modo manteniendo la concentración de azúcar fermentable a una concentración relativamente baja durante toda la fermentación. Sin estar limitado a cualquier teoría de operación, se cree que debido a la concentración baja de azúcares presentes durante la fermentación, la producción de glicerol por la levadura se disminuye puesto que hay una necesidad limitada de glicerol para la osmorregulación. En este sentido, la presente invención puede utilizarse para producir un producto alcohólico con un contenido de glicerol y/o de metanol reducido en comparación con los procesos convencionales.
La presente invención proporciona una alternativa que consume menos energía que los procesos convencionales que debe emplear cantidades significantes de energía para gelatinizar la pasta de almidón. Otras ventajas de la presente invención incluyen, sin limitación, la capacidad de emplear un pH bajo durante todo el proceso, reduciendo así el riesgo de crecimiento microbiano indeseado, y reduciendo o eliminando la necesidad de equipos costosos para gelatinizar el almidón, tales como, instalaciones de chorro y equipos de la planta de vapor.
Descripción detallada de la invención
El término "producto alcohólico" significa un producto que comprende etanol, p. ej. etanol combustible, etanol potable y etanol industrial.
El término "almidón granular" significa almidón crudo no cocido, es decir, almidón en su forma natural que se encuentra en los cereales, tubérculos o granos. El almidón se forma dentro de células vegetales como gránulos minúsculos insolubles en agua. Cuando se ponen en agua fría, los gránulos de almidón pueden absorber una pequeña cantidad del líquido e hincharse. A temperaturas de hasta 50ºC a 75ºC la hinchazón puede ser reversible. No obstante, con temperaturas más altas se inicia una hinchazón irreversible llamada gelatinización.
El término "temperatura de gelatinización inicial" significa la temperatura más baja en la que la gelatinización del almidón comienza. El almidón calentado en agua se empieza a gelatinizar a entre 50ºC y 75ºC; la temperatura exacta de gelatinización depende del almidón específico, y puede ser determinado fácilmente por el hábil artesano. Así, la temperatura de gelatinización inicial puede variar según las especies de plantas, la variedad particular de las especies de plantas al igual que las condiciones de crecimiento. En el contexto de esta invención la temperatura de gelatinización inicial de un almidón dado es la temperatura a la que la birrefringencia se pierde en el 5% de los gránulos de almidón usando el método descrito por Gorinstein. S. y Lii. C., Starch/Stärke, vol. 44 (12) pp. 461-466 (1992).
La "identidad" del polipéptido significa el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos. La identidad puede ser determinada adecuadamente por los programas de ordenador conocidos en la técnica, tales como, GAP proporcionado en el paquete de programas GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, versión 8, agosto de 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453. Se utilizan los siguientes ajustes para la comparación de secuencias polipeptídicas: la penalización de la creación de GAP de 3.0 y la penalización de la extensión de GAP de 0.1.
El término "alfa-amilasa ácida" significa una alfa-amilasa (E.C. 3.2.1.1) que al añadirse en una cantidad efectiva tiene una actividad a un pH en la gama de 3.0 a 7.0, preferiblemente de 3.5 a 6.0, o más preferiblemente de 4.0-5.0. Cualquier alfa-amilasa ácida adecuada puede utilizarse en la presente invención.
En una forma de realización preferida, la alfa-amilasa ácida es una alfa-amilasa ácida fúngica o una alfa-amilasa ácida bacteriana. Preferiblemente la alfa-amilasa ácida fúngica se obtiene de una cepa de Aspergillus, preferiblemente una cepa de Aspergillus niger o una cepa de una cepa de Aspergillus oryzae. Más preferiblemente la alfa-amilasa ácida es una alfa-amilasa ácida que tiene al menos el 70% de identidad, tal como al menos el 80% o incluso al menos el 90% de identidad con la alfa-amilasa ácida fúngica que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:1 o que tiene al menos al menos al menos el 70% de identidad, tal como al menos el 80% o incluso al menos el 90% de identidad con la alfa-amilasa ácida fúngica que tiene el aminoácido en la secuencia mostrada en SWISPROT No: P10529.
De la manera más preferible la alfa-amilasa ácida es una alfa-amilasa ácida fúngica que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:1 o variantes de la misma que tienen uno o más residuos de aminoácidos que se han delecionado, sustituido y/o insertado en comparación con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:1; las variantes que tienen una actividad alfa-amilasa.
La alfa-amilasa ácida preferida para el uso en la presente invención puede derivarse de una cepa de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, y B. stearothermophilus. También se prefieren las alfa-amilasas ácidas que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 50% de identidad, preferiblemente al menos el 60%, el 70%, el 80%, el 85% o al menos el 90%, p. ej. al menos el 95%, el 97%, el 98%, o al menos el 99% de identidad con las secuencias expuestas en la SEC ID NO:2 o la SEC ID NO:3. Preferiblemente, la alfa-amilasa ácida utilizada para el proceso de la invención es una de las variantes de la alfa-amilasa ácida e híbridos descritos en WO96/23874, WO97/41213, y WO99/19467, tal como la variante de la alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus (BSG alfa-amilasa) que tiene las mutaciones siguientes de delta(181-182) + N193F (también denominadas 1181* + G182* + N193F) en comparación con la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje expuesta en la SEC ID NO:2. La alfa-amilasa ácida bacteriana también puede ser una alfa-amilasa híbrida que comprende los 445 residuos de aminoácidos C-terminales de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis expuestos en la SEC ID NO:3 y los 37 residuos de aminoácidos N-terminales de la alfa-amilasa derivada de Bacillus amyloliquefaciens expuestos en la SEC ID NO:4 que además puede tener las sustituciones G48A + T49I + G107A + H156Y + A181T + N190F + I201F + A209V + Q264S utilizando la numeración en la SEC ID NO:3. También se prefieren las variantes de alfa-amilasa derivadas de Bacillus amyloliquefaciens y que tienen al menos el 50% de identidad, tal como al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, o incluso el 90% de identidad con la secuencia expuesta en la SEC ID NO:4. Especialmente preferidas son las variantes que tienen una o más de las mutaciones H154Y, A181T, N190F, A209V y Q264S y/o la eliminación de dos residuos entre las posiciones 176 y 179, preferiblemente la eliminación de E178 y G179.
Las composiciones comerciales preferidas que comprenden la alfa-amilasa incluyen la micolasa de DSM (Gist Brochades), BAN^{TM}, TERMAMYL^{TM} SC, FUNGAMYL^{TM}, LIQUOZYME^{TM} X y SAN^{TM} SUPER, SAN^{TM} EXTRA L (Novozymes A/S) y Clarase L-40,000, DEX-LO^{TM}, Spezyme FRED, SPEZYME^{TM} AA y SPEZYME^{TM} DELTA AA (Genencor Int.).
Una glucoamilasa (E.C.3.2.1.3) para ser utilizada en los procesos de la invención pueden derivarse de un microorganismo o de una planta. Se prefieren las glucoamilasas de origen fúngico tales como las glucoamilasas de Aspergillus, en particular la glucoamilasa de A. niger G1 ó G2 (Boel et al. (1984), EMBO J. 3 (5), p. 1097-1102). También se prefieren las variantes de las mismas, tal como se divulga en WO92/00381 y WO00/04136; la glucoamilasa de A. awamori (WO84/02921), A. oryzae (Agrie. Biol. Chem. (1991), 55 (4), p. 941-949), o las variantes o fragmentos las mismas. Las glucoamilasas preferidas incluyen las glucoamilasas derivadas de Aspergillus niger, tal como una glucoamilasa que tiene el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85% o incluso el 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en WO00/04136 y la SEC ID NO: 13. También se prefieren las glucoamilasas derivadas de Aspergillus oryzae, tal como una glucoamilasa que tiene el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85% o incluso el 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:2 de WO00/04136.
Otras glucoamilasas preferidas incluyen las glucoamilasas de Talaromyces, en particular derivadas de Talaromyces emersonii (WO99/28448), de Talaromyces leycettanus (patente EE.UU. n.º Re.32, 153), de Talaromyces duponti, de Talaromyces thermophilus (patente EE.UU. n.º 4,587,215), Clostridium, en particular C. thermoamylolyticum (EP135.138), y C. thermohydrosulfuricum (WO86/01831).
Las composiciones comercialmente disponibles que comprenden la glucoamilasa incluyen AMG 200L; AMG 300 L; SAN^{TM} SUPER, SAN EXTRA L y AMG^{TM} E (de Novozymes A/S); OPTIDEX^{TM} 300 (de Genencor Int.); AMIGASE^{TM} y AMIGASE^{TM} PLUS (de DSM); G-ZYME^{TM} G900, G-ZYME^{TM} y G990 ZR (de Genencor Int.).
Una enzima adicional que puede ser utilizada en los procesos de la invención incluye las xilanasas, las celulasas y las fitasas.
Una xilanasa que se utiliza según la invención puede derivarse de cualquier organismo adecuado, incluyendo los organismos fúngicos y bacterianos, tales como Aspergillus, Disporotrichum, Penicillium, Neurospora, Fusarium y Trichoderma.
Las preparaciones preferidas comercialmente disponibles que comprenden la xilanasa incluyen SHEARZYME®, BIOFEED WHEAT®, CELLUCLAST®, ULTRAFLO®, VISCOZYME® (de Novozymes A/S) y SPEZYME® CP (de Genencor Int.).
La actividad de celulasa (E.C. 3.2.1.4) puede ser una celulasa de origen microbiano, tal como derivable de una cepa de un hongo filamentoso (p. ej., Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Fusarium).
Las preparaciones comercialmente disponibles que comprenden una celulasa que pueden ser utilizadas incluyen CELLUCLAST®, CELLUZYME®, CEREFLO® y ULTRAFLO® (de Novozymes A/S), LAMIN EX^{TM} y SPEZYME® CP (de Genencor Int.) y ROHAMENT® 7069 W (de Röhm GmbH).
Una fitasa utilizada según la invención puede ser cualquier enzima capaz de efectuar la liberación de fosfato inorgánico de ácido fítico (myo-inositol hexakisfosfato) o de cualquier sal del mismo (fitatos). Las fitasas pueden clasificarse según su especificidad en la fase de hidrólisis inicial, a saber, según qué grupo de éster de fosfato se hidrolize primero. La fitasa a utilizar en la invención puede tener cualquier especificidad, p. ej., ser una 3-fitasa (E.C. 3.1.3.8), una 6-fitasa (E.C. 3.1.3.26) o una 5-fitasa (ningún número E.C.).
Las fitasas comercialmente disponibles preferidas según la invención incluyen BIOFEED PHYTASE^{TM}, PHYTASE NOVO^{TM} CT o L (Novozymes A/S), o NATUPHOS^{TM} NG 5000 (DSM).
Otra enzima utilizada en el proceso puede ser una enzima desramificante, tal como una isoamilasa (E.C. 3.2.1.68) o una pululanasas (E.C. 3.2.1.41). Las enlaces de rama isoamilasa hidroliza alfa-1,6-D-glucosídicas en las dextrinas de amilopectina y de limite beta y pueden distinguirse de las pululanasas por la incapacidad de la isoamilasa de atacar el pululano, y por la acción limitada en las dextrinas del límite alfa. La enzima desramificante se puede añadir en cantidades eficaces bien conocidas por el experto en la materia.
En una forma de realización, la invención proporciona un proceso para la producción de etanol, que comprende las fases de: (a) proporcionar una pasta que comprende agua y almidón granular, (b) mantener dicha pasta en presencia de una alfa-amilasa ácida y una glucoamilasa a una temperatura de 0ºC a 20ºC por debajo de la temperatura de gelatinización inicial de dicho almidón granular durante un periodo de 5 minutos a 12 horas, (c) mantener dicha pasta en presencia de una alfa-amilasa ácida, y una glucoamilasa, y una levadura a una temperatura de entre 30ºC y 35ºC durante un periodo de 20 a 200 horas para producir etanol, y, (d) recuperar el etanol. Las fases (a), (b), (c) y (d) se realizan consecutivamente; no obstante, el proceso puede comprender fases adicionales no especificadas en esta descripción que se realizan antes de, entre o después de cualquiera de las fases (a), (b), (c) y (d). En esta forma de realización, la pasta se mantiene en contacto con la alfa-amilasa ácida, la glucoamilasa y la levadura durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la hidrólisis del almidón y la fermentación de los azúcares liberados durante la fase (c), preferiblemente durante un periodo de 25 a 190 horas, preferiblemente de 30 a 180 horas, más preferiblemente de 40 a 170 horas, incluso más preferiblemente de 50 a 160 horas, aún más preferiblemente de 60 a 150 horas, incluso aún más preferiblemente de 70 a 140 horas, y lo más preferiblemente de 80 a 130 horas, tal como de 85 a 110 horas.
Las actividades enzimáticas preferiblemente se pueden dosificar en forma de la composición divulgada abajo.
La alfa-amilasa ácida es preferiblemente una alfa-amilasa ácida bacteriana y/o una alfa-amilasa ácida fúngica y/o una variante de una alfa-amilasa ácida derivada de una fuente bacteriana y/o fúngica.
La alfa-amilasa ácida se añade en una cantidad efectiva que es una concentración de alfa-amilasa ácida suficiente para su propósito adjudicado de convertir el almidón granular en la pasta de almidón a dextrinas. Preferiblemente, la alfa-amilasa ácida está presente en una cantidad de 10-10000 AFAU/kg de DS, en una cantidad de 500-2500 AFAU/kg de DS, o más preferiblemente en una cantidad de 100-1000 AFAU/kg de DS, tal como aproximadamente 500 AFAU/kg de DS. Cuando se mide en unidades AAU, la actividad de la alfa-amilasa ácida está preferiblemente presente en una cantidad de 5-500000 AAU/kg de DS, en una cantidad de 500-50000 AAU/kg de DS, o más preferiblemente en una cantidad de 100-10000 AAU/kg de DS, tal como 500-1000 AAU/kg de DS.
Las glucoamilasas se añaden en una cantidad efectiva, la cual es una concentración de amilasa de glucoamilasa suficiente para su propósito adjudicado de degradar las dextrinas que resultan del tratamiento de la alfa-amilasa ácida de la pasta de almidón. Preferiblemente, la actividad de la glucoamilasa está presente en una cantidad de 20-200 AGU/kg de DS, preferiblemente de 100-1000 AGU/kg de DS, o más preferiblemente en una cantidad de 200-400 AGU/kg de DS, tal como 250 AGU/kg de DS. Cuando se mide en unidades AGI, la actividad de la glucoamilasa está preferiblemente presente en una cantidad de 10-100000 AGI/kg de DS, 50-50000 AGI/kg de DS, preferiblemente 100-10000 AGI/kg de DS, o más preferiblemente en una cantidad de 200-5000 AGI/kg de DS.
Preferiblemente, las actividades de la alfa-amilasa ácida y de la glucoamilasa están presentes en una proporción de entre 0,3 y 5,0 AFAU/AGU. Más preferiblemente, la proporción entre la actividad de la alfa-amilasa ácida y la actividad de la glucoamilasa es de al menos el 0,35, al menos el 0,40, al menos el 0,50, al menos el 0,60, al menos el 0,7, al menos el 0,8, al menos el 0,9, al menos el 1,0, al menos el 1,1, al menos el 1,2, al menos el 1,3, al menos el 1,4, al menos el 1,5, al menos el 1,6, al menos el 1,7, al menos el 1,8, al menos el 1,85, o incluso al menos el 1,9 de AFAU/AGU. No obstante, la proporción entre la actividad de la alfa-amilasa ácida y la actividad de la glucoamilasa preferiblemente debería ser de menos del 4,5, menos del 4,0, menos del 3,5, menos del 3,0, menos del 2,5, o incluso menos del 2,25 de AFAU/AGU. En AUU/AGI las actividades de la alfa-amilasa ácida y de la glucoamilasa están preferiblemente presentes en una proporción de entre 0,4 y 6,5 AUU/AGI. Más preferiblemente, la proporción entre la actividad de la alfa-amilasa ácida y la actividad de la glucoamilasa es de al menos el 0,45, al menos el 0,50, al menos el 0,60, al menos el 0,7, al menos el 0,8, al menos el 0,9, al menos el 1,0, al menos el 1,1, al menos el 1,2, al menos el 1,3, al menos el 1,4, al menos el 1,5, al menos el 1,6, al menos el 1,7, al menos el 1,8, al menos el 1,9, al menos el 2,0, al menos el 2,1, al menos el 2,2, al menos el 2,3, al menos el 2,4, o incluso al menos el 2,5 de AUU/AGI. No obstante, la proporción entre la actividad de la alfa-amilasa ácida y la actividad de la glucoamilasa es preferiblemente de menos del 6,0, menos del 5,5, menos del 4,5, menos del 4,0, menos del 3,5, o incluso menos del 3,0 de AUU/AGI.
En una forma de realización preferida del primer aspecto de la invención, la fase (b) y/o la fase (c) se realiza en presencia de una actividad enzimática adicional seleccionada de la lista que consiste en xilanasa, celulasa y fitasa. La enzima adicional preferiblemente se añade junto con la alfa-amilasa ácida y la glucoamilasa. Las xilanasas se pueden añadir en cantidades de 1-50000 FXU/kg de DS, preferiblemente de 5-5000 FXU/kg de DS, o más preferiblemente de 10-500 FXU/kg de DS. Las celulasas se pueden añadir en las cantidades de 0,01-500000 EGU/kg de DS, preferiblemente de 0,1-10000 EGU/kg de DS, preferiblemente de 1-5000 EGU/kg de DS, más preferiblemente de 10-500 EGU/kg de DS y lo más preferiblemente de 100-250 EGU/kg de DS. La dosificación de la fitasa puede estar en el rango de 0,5-250000 FYT/kg de DS, particularmente de 1-100000 FYT/kg de DS, preferiblemente en el rango de 5-25000 FYT/kg de DS, preferiblemente de 10-10000 FYT/kg, tal como de 100-1000 FYT/kg de DS.
En una forma de realización preferida, la pasta de almidón comprende agua y el 5-60% de DS (sólidos secos) de almidón granular, preferiblemente el 10-50% de DS de almidón granular, más preferiblemente el 15-40% de DS, especialmente alrededor del 20-25% de DS de almidón granular. El almidón granular a procesar en los procesos de la invención puede obtenerse en particular de tubérculos, raíces, tallos, mazorcas, legumbres, cereales o grano entero. Más específicamente el almidón granular puede obtenerse de granos, mazorcas, trigo, cebada, centeno, millo, sagú, mandioca, tapioca, sorgo, arroz, guisantes, frijol, plátano o patatas. Se prefieren ambos tipos cerosos y no cerosos de maíz y cebada. El almidón granular a procesar puede preferiblemente comprender el grano entero molido o puede ser una calidad de almidón más refinada, preferiblemente más del 90%, 95%, 97% ó 99,5% de almidón puro. La materia prima que comprende el almidón es preferiblemente molida para abrir la estructura y para permitir otro tratamiento. Se pueden utilizar la molienda en seco al igual que la molienda húmeda. Cuando se aplica la molienda húmeda, ésta puede ir precedida por una fase de remojo, o una fase de inmersión. Tanto la molienda seca como la molienda húmeda se conocen bien en la técnica de fabricación de alcohol y se prefieren para los procesos de la invención.
El pH durante la fase (b) y/o (c) está preferiblemente en el rango de 3.0 a 7.0, más preferiblemente de 3.5 a 6.0, o lo más preferiblemente de 4.0-5.0, tal como de 4.3 a 4.6.
La pasta se mantiene en contacto con la alfa-amilasa ácida y la glucoamilasa a una temperatura elevada pero por debajo de la temperatura de gelatinización inicial durante un periodo de tiempo efectivo para hacer los gránulos de almidón susceptibles a la degradación enzimática (fase b), preferiblemente durante un periodo de 5 minutos a 12 horas, preferiblemente de 10 minutos a 6 horas, más preferiblemente de 15 minutos a 3 horas, incluso más preferiblemente de 20 minutos a 1 ½ hora, tal como de 30 minutos a 1 ¼ hora, de 40 a 70 minutos, e incluso de 50 a 60 minutos. La temperatura durante la fase (b) siempre debería estar ajustada para estar por debajo de la temperatura de gelatinización inicial del almidón granular particular a procesar, y típicamente será entre 45ºC y 75ºC. Según la invención, la fase (b) se conduce a una temperatura de 0ºC a 20ºC, preferiblemente de 0ºC a 15ºC, más preferiblemente de 0ºC a 10ºC, o incluso más preferiblemente de 0ºC a 5ºC por debajo de la temperatura de gelatinización inicial del almidón particular a procesar. La temperatura real puede ser de 45ºC a 75ºC, pero es preferiblemente de 55ºC a 65ºC. Preferiblemente la temperatura a la cual la fase (b) se conduce es de al menos 45ºC, 46ºC, 47ºC, 48ºC, 49ºC, 50ºC, 51ºC, 52ºC, 53ºC, 54ºC, 55ºC, 56ºC, 57ºC, 58ºC o preferiblemente de al menos 55ºC, y preferiblemente la temperatura es no mayor de 74ºC, 73ºC, 72ºC, 71ºC, 70ºC, 69ºC, 68ºC, 67ºC, 66ºC, 65ºC, 64ºC, 63ºC o preferiblemente no mayor de 62ºC.
Después de someterse al proceso del primer aspecto de la invención al menos el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, o preferiblemente el 99% de los sólidos secos del almidón granular se convierte en etanol.
El etanol puede opcionalmente recuperarse. La recuperación del etanol puede realizarse por cualquier manera convencional tal como p. ej. destilación y puede utilizarse como etanol combustible y/o etanol potable y/o etanol industrial.
En una forma de realización particularmente preferida, el almidón granular a procesar está derivado de cereales molidos en seco o en húmedo, tales como trigo, cebada, centeno, y/o maíz, la pasta de almidón tiene un DS del 20-40 por ciento, la temperatura durante la fase (b) es de entre 50ºC y 60ºC, tal como 55ºC, la duración de la fase (b) es de entre 30 minutos y 75 minutos, tal como 60 minutos y la fase (c) se lleva a cabo durante de 60 a 90 horas. La alfa-amilasa ácida se dosifica a entre 300 y 700 AFAU/kg de DS, tal como 500 AFAU/kg de DS y la glucoamilasa se dosifica a entre 100 a 500 AGU/kg de DS, tal como 250 AGU/kg de DS. La proporción de la alfa-amilasa ácida con la glucoamilasa es de 1,0 a 3,0 AFAU/AGU o preferiblemente de 1,5 a 2,5 AFAU/AGU, tal como aproximadamente 2,0 AFAU/AGU. En AAU/AGI la proporción de la alfa-amilasa ácida con la glucoamilasa es de 1,3 a 4,0 AAU/AGI o preferiblemente de 2,0 a 2,3 AAU/AGI, tal como aproximadamente 2,7 AAU/AGI.
Una composición enzimática que puede ser utilizada en el proceso de la invención, es una composición enzimática que tiene una proporción entre la actividad de la alfa-amilasa ácida y la actividad de la glucoamilasa de al menos el 0,35, al menos el 0,40, al menos el 0,50, al menos el 0,60, al menos el 0,70, al menos el 0,80, al menos el 0,90, al menos el 1,00, al menos el 1,20, al menos el 1,30, al menos el 1,40, al menos el 1,50, al menos el 1,60, al menos el 1,70, al menos el 1,80, o incluso al menos el 1,85 de AFAU/AGU. Preferiblemente dicha composición enzimática tiene una proporción entre la actividad de la alfa-amilasa ácida y la actividad de la glucoamilasa de menos del 5,00, menos del 4,50, menos del 4,00, menos del 3,00, menos del 2,50, o incluso menos del 2,25 de AFAU/AGU. Medida en AAU/AGI, la proporción de la alfa-amilasa ácida con respecto a la glucoamilasa en dicha composición enzimática es de al menos el 0,45, al menos el 0,50, al menos el 0,60, al menos el 0,70, al menos el 0,80, al menos el 0,90, al menos el 1,00, al menos el 1,20, al menos el 1,30, al menos el 1,40, al menos el 1,50, al menos el 1,60, al menos el 1,70, al menos el 1,80, al menos el 1,90, al menos el 2,00, al menos el 2,10, al menos el 2,20, al menos el 2,30, al menos el 2,40 o incluso al menos el 2,50 de AAU/AGI. Preferiblemente dicha composición enzimática tiene una proporción entre la actividad de la alfa- amilasa ácida y la actividad de la glucoamilasa de menos del 6,50, menos del 5,00, menos del 4,50, menos del 4,00, o incluso menos del 3,50 de AAU/AGI.
En una forma de realización preferida, la composición además comprende una actividad enzimática adicional que está presente; dicha actividad enzimática se selecciona de la lista que consiste en celulasa, xilanasa y fitasa.
Materiales y métodos Actividad de alfa-amilasa (KNU)
La actividad amilolítica se puede determinar utilizando almidón de patata como sustrato. Este método se basa en la descomposición de almidón de patata modificado por la enzima, y la reacción va seguida de la mezcla de muestras de la solución de almidón/enzima con una solución de yodo. Inicialmente, se forma un color azul negruzco, pero durante la descomposición del almidón el color azul se hace más débil y gradualmente se convierte en un marrón rojizo, que se compara con un estándar de vidrio coloreado.
Una Unidad Kilo Novo de alfa-amilasa (KNU) se define como la cantidad de enzima que, en condiciones estándar (es decir, a 37ºC +/- 0,05; 0,0003 M de Ca2+; y a pH 5.6) dextriniza 5260 mg de sustancia seca del almidón Merck Amylum solubile.
Una carpeta EB-SM-0009.02/01 que describe este método analítico en más detalle está disponible bajo petición a Novozymes A/S, Dinamarca, la carpeta que por la presente se incluye por referencia.
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Actividad de la alfa-amilasa ácida
Cuando se la utiliza según la presente invención la actividad de cualquier alfa-amilasa ácida se puede medir en AFAU (unidades de alfa-amilasa ácida fúngica). Alternativamente la actividad de la alfa-amilasa ácida se puede medir en AAU (unidades de alfa-amilasa ácida).
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Unidades de alfa-amilasa ácida (AAU)
La actividad de la alfa-amilasa ácida se puede medir en AAU (unidades de alfa-amilasa ácida), lo que es un método absoluto. Una unidad de amilasa ácida (AAU) es la cantidad de enzimas que convierten 1 g de almidón (100% de materia seca) por hora en condiciones estandarizadas en un producto que tiene una transmisión a 620 nm después de la reacción con una solución de yodo de fuerza conocida igual a la de una referencia de color.
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Condiciones estándar/condiciones de reacción
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El almidón debería ser almidón Lintner, el cual es un almidón de ebullición fino que se utiliza en el laboratorio como indicador colorimétrico. El almidón Lintner se obtiene por el tratamiento con ácido clorhídrico diluido de almidón nativo de modo que retiene la capacidad de colorearse de azul con yodo. Más detalles se pueden encontrar en EP0140410B2, cuya divulgación se incluye por la presente por referencia.
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Actividad de la alfa-amilasa ácida (AFAU)
La actividad de la alfa-amilasa ácida se puede medir en AFAU (unidades de alfa-amilasa ácida fúngica), las cuales se determinan en relación a un estándar enzimático. 1 FAU se define como la cantidad de enzima que degrada 5,260 mg de materia seca de almidón por hora en las condiciones estándar mencionadas abajo.
La alfa-amilasa ácida, una endo-alfa-amilasa (1,4-alfa-D-glucan-glucanohidrolasa, E.C. 3,2,1,1) hidroliza enlaces alfa-1,4-glucosídicos en las regiones internas de la molécula de almidón para formar dextrinas y oligosacáridos con diferentes longitudes de cadena. La intensidad del color formado con yodo es directamente proporcional a la concentración de almidón. La actividad de amilasa se determina utilizando la colorimetría inversa como una reducción en la concentración de almidón en las condiciones analíticas especificadas.
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Condiciones estándar/condiciones de reacción
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Una carpeta EB-SM-0259.02/01 que describe este método analítico en más detalle está disponible bajo petición a Novozymes A/S, Dinamarca, cuya carpeta se incluye por la presente por referencia.
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Actividad de la glucoamilasa
La actividad de la glucoamilasa se puede medir en unidades de AGI o en unidades de amiloglucosidasa (AGU).
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Actividad de la glucoamilasa (AGI)
La glucoamilasa (equivalente a la amiloglucosidasa) convierte el almidón en glucosa. La cantidad de glucosa se determina aquí por el método de la glucosa oxidasa para la determinación de la actividad. El método descrito en la sección 76-11 Starch-Glucoamylase Method with Subsequent Measurement of Glucose with Glucose Oxidase en "Approved methods of the American Association of Cereal Chemists". Vol. 1-2 AACC, de American Association of Cereal Chemists, (2000); ISBN: 1-891127-12-8.
Una unidad de glucoamilasa (AGI) es la cantidad de enzima que formará 1 micromol de glucosa por minuto en las condiciones estándar del método.
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Condiciones estándar/condiciones de reacción
5 
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El almidón debería ser almidón Lintner, lo que es un almidón de ebullición fino utilizado en el laboratorio como indicador colorimétrico. El almidón Lintner se obtiene por el tratamiento con ácido clorhídrico diluido de almidón nativo de modo que retenga la capacidad de colorearse de azul con yodo.
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Actividad de la glucoamilasa (AGU)
La Unidad Novo de Glucoamilasa (AGU) se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 micromol de maltosa por minuto en las condiciones estándar a 37ºC, pH 4,3, sustrato: maltosa 23,2 mM, tampón: acetato 0,1 M, tiempo de reacción 5 minutos.
Se puede utilizar un sistema autoanalizador. La mutarotasa se añade al reactivo de glucosa dehidrogenasa de modo que cualquier alfa-D-glucosa presente se convierte en beta-D-glucosa. La glucosa dehidrogenasa reacciona específicamente con beta-D-glucosa en la reacción mencionada anteriormente, formando NADH que se determina utilizando un fotómetro a 340 nm como una medida de la concentración original de glucosa.
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7 
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Una carpeta (EB-SM-0131.02/01) que describe este método analítico en más detalle está disponible bajo petición a Novozymes A/S, Dinamarca, cuya carpeta se incluye por la presente por referencia.
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Actividad xilanolítica
La actividad xilanolítica se puede expresar en unidades FXU, determinadas a pH 6,0 con remazol-xilano (4-0 metil-D-glucurono-D-xilano teñido con el azul brillante Remazol Brilliant Blue R, Fluka) como sustrato.
Una muestra de xilanasa se incuba con el sustrato de remazol-xilano. Los antecedentes del sustrato teñido no-degradado se precipita por etanol. El color azul restante en el sobrenadante (como determinado espectrofotométricamente a 585 nm) es proporcional a la actividad de xilanasa, y las unidades de xilanasa entonces se determinan relativamente a un estándar enzimático en condiciones de reacción estándares, es decir, a 50,0ºC, pH 6,0, y tiempo de reacción de 30 minutos.
Una carpeta EB-SM-352.02/01 que describe este método analítico en más detalle está disponible bajo petición a Novozymes A/S, Dinamarca, la carpeta que por la presente se incluye por referencia.
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Actividad celulítica
La actividad celulítica se puede medir en unidades de endoglucanasa (EGU), determinadas a pH 6,0 con carboximetilcelulosa (CMC) como sustrato. Una solución de sustrato se prepara que contiene 34,0 g/l CMC (Hércules 7 LFD) en 0,1 M tampón de fosfato a pH 6.0. La muestra de la enzima para ser analizada se disuelve en el mismo tampón. 5 ml de solución de sustrato y 0,15 ml de solución de la enzima se mezcla y se transfiere a un viscosímetro de vibración (p. ej. MIVI 3000 de Sofraser Francia), se termostatiza a 40ºC durante 30 minutos. Un EGU se defina como la cantidad de enzima que reduce la viscosidad a la mitad en estas condiciones. La cantidad de muestra de la enzima debería ser ajustada para proporcionar 0,01-0,02 EGU/ml en la mezcla de reacción. El estándar de arco se define como 880 EGU/g.
Una carpeta EB-SM-0275.02/01 que describe este método analítico en más detalle está disponible bajo petición a Novozymes A/S, Dinamarca, la carpeta que por la presente se incluye por referencia.
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Actividad de fitasa
La actividad de fitasa se mide en unidades FYT, siendo un FYT la cantidad de enzima que libera 1 micromol de ortofosfato inorgánico por min. En las condiciones siguientes: pH 5.5; temperatura 37ºC; sustrato: fitato de sodio (C6 H6 O24 P6 Na12) a una concentración de 0,0050 mol/l.
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Actividad proteolítica (AU)
La actividad proteolítica se puede determinar con hemoglobina desnaturalizada como sustrato. En el método de Anson de la hemoglobina para la determinación de la actividad proteolítica se digiere hemoglobina desnaturalizada, y la hemoglobina no digerida se precipita con ácido tricloroacético (ATC). La cantidad de producto soluble de ATC se determina con el reactivo de fenol, lo que da un color azul con la tirosina y el triptófano.
Una unidad de Anson (AU) se define como la cantidad de enzima que en condiciones estándar (es decir, 25ºC, pH 7,5 y 10 min de tiempo de reacción) digiere la hemoglobina a un nivel inicial de tal manera que haya liberada por minuto una cantidad de producto soluble de ATC que da el mismo color con el reactivo de fenol como un miliequivalente de tirosina.
Una carpeta AF 4/5 que describe el método analítico en más detalle está disponible bajo petición a Novozymes A/S, Dinamarca, cuya carpeta se incluye por la presente por referencia.
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Preparación de enzimas
Se utilizaron las preparaciones de enzimas siguientes:
Alfa-amilasa bacteriana; Una preparación de enzimas que comprende un polipéptido con actividad alfa-amilasa (E.C. 3.2.1.1) derivada de B. stearothermophilus y que tiene la secuencia de aminoácidos divulgada como la SEC. N.º:4 en WO99/19467. Actividad: 120 KNU/g (densidad = 1,20-1,25 g/mL).
Una alfa-amilasa fúngica ácida preferida; una preparación de enzimas derivada de Aspergillus niger que comprende alfa-amilasas ácidas fúngicas y algunas glucoamilasas. Actividades: 114 AFAU/g, 25 AGU/g (densidad = 1,2 g/mL).
Glucoamilasa; una preparación de enzimas derivada de Aspergillus niger que comprende glucoamilasas y algunas alfa-amilasas ácidas fúngicas. Actividad: 363 AGU/g, 86 AFAU/g (densidad = 1,2 g/mL).
Una preparación de enzimas que comprende xilanasa y actividades de celulasa derivadas de Trichoderma y Aspergillus. Actividad: 140 FXU/g + 350 EGU/g (densidad = 1,2 g/mL).
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Ejemplo 1
Un proceso de etanol convencional que utiliza una pre-licuefacción tradicional llamada cocción sin presión (NPC) se compara con el proceso de la invención. Los procesos tradicionales de cocción discontinua sin presión para la producción de alcohol potable se describen en la publicación de Novozymes N.º 2001-10782-01 titulada "Use of Novozymes enzymes in alcohol production" (el uso de enzimas de Novozymes en la producción de alcohol).
Un pasta al 20% de D.S. de grano de cebada molido se hizo en agua del grifo a temperatura ambiente (RT).
El pretratamiento de NPC del proceso de etanol convencional se realizó en cubos de 6 x 1 litros con agitación. Se añadió la alfa-amilasa bacteriana y las tinas se colocaron en un baño de agua a 65ºC. Cuando la temperatura en el puré ha alcanzado 55ºC el calentamiento se incrementó para calentar el puré a 90ºC durante 60 minutos. La temperatura entonces se ajustó a 32ºC y 3 x 250 g del puré se repartió en matraces de tapón azul de 500 mL con bloqueos de aire. Se añado en todos los matraces 0,25 g de levadura seca de panadería (correspondiente a 5-10 millones de células vitales/g de puré). Las actividades enzimáticas se añadieron según la tabla abajo y se pesó cada matraz. Los matraces se colocaron en un baño de agua con agitación a 32ºC durante 72 horas. A las 48 y 72 horas los matraces se pesaron y se midió una pérdida de peso de CO_{2} para controlar el progreso de la fermentación. La relación utilizada entre la cantidad de la pérdida de CO_{2} y el peso de etanol fue: pérdida de CO_{2} (g) x 1,045 = EtOH (g).
Para el proceso de la invención se acondicionaron matraces de fermentación de tapón azul de 500 mL cada uno con 250 g de pasta con bloqueos de aire. Utilizando 6,0 N de HCl el pH fue ajustado a 4,5 y la glucoamilasa y la alfa-amilasa ácida se dosificaron según la tabla 1. Los matraces se mantuvieron a 55ºC durante 60 minutos. La temperatura entonces se ajustó a 32ºC y la fermentación se realizó y se observó como se describe anteriormente.
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TABLA 1 Cebada, la pérdida de peso (g) tras 48 y 72 horas. La actividad del ácido de alfa-amilasa bacteriana (KNU), la alfa-amilasa ácida (AFAU) y la la glucoamilasa (AGU) se añadió según la tabla
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Ejemplo 2
Este ejemplo ilustra el uso de una composición enzimática de la invención que consiste en actividad de alfa amilasa ácida, glucoamilasa, celulasa y xilanasa.
Una pasta al 20% de D.S. del grano de cebada molido se hizo en agua del grifo RT. Para cada tratamiento se repartieron 2 x 250 g en matraces de tapón azul de 500 mi. Utilizando 6 N de HCl el pH se ajustó a 4.5. Las actividades enzimáticas se añadieron según las tablas 2 y 3, y un pretratamiento correspondiente a la fase (b) de la invención se llevó a cabo durante una hora a 55ºC en un baño de agua con agitación. La temperatura se ajustó a 32ºC y se realizó y observó una fermentación de 0,25 g de de levadura seca de panadería como se describe anteriormente.
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TABLA 2 La cebada, la pérdida de peso (g) a 48 y 72 horas. La actividad de la alfa-amilasa ácida (AFAU), la glucoamilasa (AGU), la celulasa (EGU) y la xilanasa (FXU) fue añadida según la tabla
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Ejemplo 3
Este ejemplo ilustra el proceso de la invención utilizando varias materias primas. Una pasta al 20% de D.S. de grano molido o harina de maíz se hizo en agua del grifo RT. Para cada tratamiento se repartieron 2 x 250 g en matraces de tapón azul de 500 ml. Utilizando 6 N de HCl el pH se ajustó a 4,5. Las enzimas se dosificaron según las tablas 3, 4 y 5, y un pretratamiento se llevó a cabo durante una hora a 55ºC en un baño de agua con agitación. Los matraces se enfriaron a 32ºC y se añadieron 0,25 g de levadura seca de panadería. Los matraces se colocaron al baño de agua a 32ºC durante 72 horas (90 horas para el trigo).
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TABLA 3 Centeno, la pérdida de peso (g) tras 48 horas y 72 horas. La actividad de la alfa-amilasa ácida (AFAU), y de la glucoamilasa (AGU) se añadió según la tabla
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TABLA 4 Harina de maíz amarilla, la pérdida de peso (g) tras 48 horas y 72 horas. La actividad de la alfa-amilasa ácida (AFAU), y de la glucoamilasa (AGU) se añadió según la tabla
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TABLA 5 Trigo, las pérdidas de peso (g) tras 48 horas y 90 horas. La actividad de la alfa-amilasa ácida (AFAU), y de la glucoamilasa (AGU) se añadió según la tabla
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Ejemplo 4
Este ejemplo ilustra un proceso de la invención utilizando trigo. Una pasta al 20% de D.S. de trigo molido se realizó en agua del grifo RT. Para cada tratamiento se repartieron 2 x 250 g de pasta en matraces de tapón azul de 500 mL. El pH se ajustó a 4.5 usando 6 N de HCI. Las actividades enzimáticas se dosificaron según la tabla 6, y los matraces se incubaron durante una hora a 55ºC en un baño de agua con agitación. Los matraces se enfriaron a 32ºC y se añadieron 0,25 g de levadura seca de panadería. Los matraces se colocaron en un baño de agua a 32ºC durante 72 horas. Los datos de pérdida de peso se registraron. Tras 50 y 72,5 horas los matraces se pesaron y la pérdida de peso de CO_{2} se midió para controlar el progreso de la fermentación. La relación utilizada entre la cantidad de pérdida de CO_{2} y el peso de etanol fue: pérdida de CO_{2} (g) x 1,045 = EtOH (g).
Tras 100 horas se extrajeron muestras de HPLC y el contenido de etanol, metanol y glicerol se registró.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 6 Trigo; la pérdida de peso (g) tras 50 horas y 72,5 horas. La glucoamilasa (AGU), la alfa-amilasa ácida (AFAU) y la alfa-amilasa bacteriana (KNU) se añadieron según la tabla
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector y no forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad por eventuales errores u omisiones.
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<110> Novozymes A/S
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<120> PROCESOS DE PRODUCTO ALCOHÓLICO
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<130> 10391.204-WO
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<160> 4
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<170> PatentIn versión 3.2
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<210> 1
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<211> 484
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<212> PRT
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<213> Aspergillus niger 
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<400> 1
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18
19 
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<210> 2
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<211> 514
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<212> PRT
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<213> Bacillus stearothermophilus 
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<400> 2
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21
22 
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<210> 3
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<211> 483
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<212> PRT
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<213> Bacillus licheniformis 
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<400> 3
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24
25 
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<210> 4
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<211> 480
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<212> PRT
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<213> Aspergillus amyloliquefaciens 
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<400> 4
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27
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Claims (20)

1. Proceso que comprende las fases secuenciales de:
(a)
proporcionar una pasta comprendiendo agua y almidón granular,
(b)
mantener dicha pasta en presencia de una alfa-amilasa ácida y una glucoamilasa a una temperatura de al menos 45ºC pero por debajo de la temperatura de gelatinización inicial de dicho almidón granular durante un periodo de 5 minutos a 12 horas,
(c)
mantener dicha pasta en presencia de una alfa-amilasa ácida y una glucoamilasa y una levadura a una temperatura entre 26ºC y 35ºC durante un periodo de 20 a 250 horas para producir etanol y,
(d)
recuperar el etanol.
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2. Proceso según la reivindicación 1, donde el producto es etanol combustible, etanol potable y/o etanol industrial.
3. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde las actividades de la alfa-amilasa ácida y la glucoamilasa se añaden a la fase (b) y/o (c) en una proporción de entre 0,30 y 5,00 Unidades de Alfa-amilasa Ácida Fúngica (AFAU) por Unidad de Glucoamilasa (AGU)(AFAU/AGU).
4. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la alfa-amilasa ácida es una alfa-amilasa ácida fúngica.
5. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la alfa-amilasa ácida fúngica se obtiene de una cepa de Aspergillus.
6. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la alfa-amilasa ácida es una alfa-amilasa ácida teniendo una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad con la SEC ID NO:1.
7. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la alfa-amilasa ácida es una alfa-amilasa ácida bacteriana.
8. Proceso según la reivindicación 7, donde la alfa-amilasa ácida deriva de una cepa de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, y B. stearothermophilus.
9. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 7 y 8, donde la alfa-amilasa ácida es una alfa-amilasa ácida teniendo una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50% de identidad con unas secuencias seleccionadas del grupo que consiste en la SEC ID NO:2 y la SEC ID NO:3.
10. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, donde la alfa-amilasa ácida bacteriana está derivada de una cepa de Bacillus stearothermophilus, teniendo las mutaciones 1181* + G182* + N193F en comparación con la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje expuesta en la SEC ID NO:2.
11. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde la actividad de la alfa-amilasa ácida está presente en una cantidad de 50-500 AFAU/Kg de sólidos secos (DS).
12. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la actividad de la glucoamilasa está presente en una cantidad de 20-200 AGU/Kg de DS.
13. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la proporción entre la actividad de la alfa-amilasa ácida y la actividad de la glucoamilasa está entre 0.35 y 5.00 AFAU/AGU.
14. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde la fase (b) y/o la fase (c) se realiza en presencia de una actividad enzimática seleccionada de la lista que consiste en xilanasa, celulasa y fitasa.
15. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde la pasta de almidón tiene un 5-60% de almidón granular de DS, preferiblemente un 10-50% de almidón granular de DS, más preferiblemente un 20-40% de DS, especialmente alrededor de un 30% de almidón granular de DS.
16. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15; donde el pH durante la fase (b) y/o (c) está en el rango de 3.0 a 7.0, preferiblemente de 3.5 a 6.0, o más preferiblemente de 4.0-5.0, así como de 4.3 a 4.6.
17. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde el almidón granular se obtiene a partir de tubérculos, raíces, tallos, frutos, semillas o del grano entero.
18. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde el almidón granular se obtiene a partir de maíz, mazorcas, trigo, cebada, centeno, milo, sagú, yuca, mandioca, tapioca, sorgo, arroz o patatas.
19. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, donde el almidón granular se obtiene a partir de cereales.
20. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, donde el almidón granular se obtiene a partir de la molienda en seco o molienda húmeda del grano entero.
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